CN105264071B - 用于治疗缺血组织的sdf-1递送 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过向受试者的心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区直接给药或在其中局部表达有效量的基质细胞衍生因子‑1(SDF‑1)来治疗所述受试者的心肌病的方法，所述量可使以下至少一项参数得到功能改善：左心室容积、左心室面积、左心室内径、心脏功能、6分钟步行试验、或者纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。本发明还提供了治疗受试者的严重肢体缺血的方法，即将编码人SDF‑1的DNA质粒通过直接注射入患肢来给药。

Description

用于治疗缺血组织的SDF-1递送

相关申请的交叉引用

本专利申请要求2013年3月15日提交的、美国临时专利申请61/794,742的权益，其全文以引用方式并入本文。

技术领域

本专利申请涉及用于治疗心肌病的SDF-1递送的方法和组合物、以及SDF-1递送的方法和组合物用于治疗缺血性心肌病的用途。本专利申请还涉及用于治疗严重肢体缺血的SDF-1递送的方法和组合物。

背景技术

局部缺血是指人体局部血流完全被阻断或显著降低，导致缺氧症、酶作用物供应减少以及代谢物积累的病症。虽然局部缺血范围取决于血管阻塞的严重程度、持续时间、组织对局部缺血的敏感性和侧支血管的发展范围，但局部缺血器官或组织中通常会发生功能障碍，长时间局部缺血会导致受影响组织发生萎缩、变性、细胞凋亡和坏死。

缺血性心肌病会影响冠状动脉，造成心肌缺血；其中，随冠状动脉阻塞时间的增长，缺血性心肌细胞损伤的范围从可逆性细胞损伤发展到不可逆性细胞损伤。

严重肢体缺血(CLI)代表下肢动脉粥样硬化性周围血管疾病(PVD)的最晚期，并且与较高比率的心血管发病率、死亡率和大截肢术相关。美国每年估计有125,000名至250,000名患者患有CLI，且该数字预计会随人群年龄增长而增大。PVD患病率会随年龄增长而显著增加，65岁及以上的美国人中约20％受该疾病的影响。针对CLI患者的现行医疗标准包括下肢血管再生，可采用开放外周外科手术、血管内介入法或下肢截肢术(即，当血管再生失败或不可行时)。CLI患者的1年死亡率是25％，截肢的CLI患者的1年死亡率可以高达45％。尽管在血管和外科手术方面有先进技术，还是有相当大比例的CLI患者不适合接受血管再生。这些患者中，只有20％至30％的CLI患者正在接受治疗，30％的患者将需要进行大截肢术，23％的患者将在3个月内死亡。

疏通阻塞的血管或刺激血管生成的基因治疗策略正处于积极研究阶段。在一项计划让6位CLI患者进行大截肢术的试验中，在截肢前3至5天指定患者接受NV1FGF，一种表达成纤维细胞生长因子1(FGF1)的非病毒基因治疗。将NV1FGF以0.4mg至4mg的剂量在8个肌内部位进行给药。该试验证明在所有剂量下在离注射部位多达3cm处均有FGF1的转基因表达以及散布进血管的质粒迅速降解。在美国(TALISMAN202)进行的II期双盲安慰剂对照多中心试验中，指定71位CLI患者接受安慰剂，或接受在受影响的腿部通过8次肌内注射来递送2mg至16mg NV1FGF的5种治疗方案中的1种。此次试验证明，肌内注射高达16mg的NV1FGF是安全的并且耐受性良好。在同时接受NV1FGF和安慰剂治疗的患者中，TcPO2的主要终点在基准线上有所增加，但在接受NV1FGF治疗的患者中，溃疡愈合得以改善。相似地，Nikol等人在对125位患者进行的双盲随机安慰剂对照研究中证明，NV1FGF显著降低了所有截肢和大截肢的风险(降低了2倍)，并且有降低死亡风险的趋势。这些临床试验证明了与我们提出的临床研究中所采用疗法相似的裸质粒DNA疗法的安全窗。

发明内容

本专利申请涉及治疗受试者的心肌病的方法。心肌病可包括，例如，与肺栓塞、静脉血栓、心肌梗塞、短暂性脑缺血发作、周围血管疾病、动脉粥样硬化和/或其他心肌损伤或血管疾病有关的心肌病。该方法包括向受试者心肌组织中的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区直接给药或局部表达有效量的SDF-1，使如下至少一项参数得到功能性改善：左心室容积、左心室面积、左心室内径、心脏功能、6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。

在本专利申请的一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，使如下至少一项参数得到功能性改善：左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动记分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积、左心室舒张末期容积、6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，可以改善左心室收缩末期容积。在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，可以改善左心室射血分数。

在本专利申请的某些方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，左心室收缩末期容积提高至少约10％。在本专利申请的其他方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，左心室收缩末期容积提高至少约15％。在本专利申请的其他方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，左心室收缩末期容积提高至少约10％，左心室射血分数提高至少约10％，室壁运动记分指数提高至少约5％，6分钟步行距离增加至少约30米，NYHA心功能分级提高至少一个等级。在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，左心室射血分数提高至少约10％。

在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，基于血管密度或通过心肌灌注显像(例如SPECT或PET)进行测量，衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的血管发生可大幅提高至少约20％，同时总静息评分、总负荷评分和/或总评分差提高至少约10％。SDF-1可通过如下方式给药：在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射包含SDF-1表达质粒的溶液，并且在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区表达SDF-1。SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区以有效量表达，从而提高左心室收缩末期容积。

在本专利申请的一方面，SDF-1质粒可通过向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区多次注射溶液进行给药，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒溶液。在一个例子中，SDF-1质粒可以向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射至少约10次进行给药。在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的每次注射给药量可以为至少约0.2ml。SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区表达大于约三天。

在一个示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射量可以为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本专利申请的另一方面，通过向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射SDF-1质粒，可以改善心脏的至少一项功能参数，其中在至少约10个注射部位的每部位注射量为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。

在另一个例子中，向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够改善心脏至少一项功能参数的SDF-1质粒量大于约4mg。向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够改善心脏至少一项功能参数的SDF-1质粒溶液量为至少约10ml。

在本专利申请的另一方面，接受SDF-1给药的受试者可以是大型哺乳动物，诸如人类或猪。可以采用导管插入术，诸如冠状动脉内导管插入术或心室内导管插入术，向受试者给药SDF-1质粒。在SDF-1质粒给药前，可以对受试者的心肌组织进行成像，进而确定衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的面积；然后SDF-1质粒可以向通过成像确定的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药。成像可包括超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影、电解剖标测或荧光透视法中的至少一项。

本专利申请还涉及治疗大型哺乳动物心肌梗塞的方法，该方法采用导管插入术，诸如冠状动脉内导管插入术或心室内导管插入术，将SDF-1质粒在哺乳动物心肌的梗塞周围区内给药。采用导管插入术给药的SDF-1可在梗塞周围区以有效量表达，使如下至少一项参数得到功能性改善：左心室容积、左心室面积、左心室内径、心脏功能、6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。

在本专利申请的一方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使如下至少一项参数得到功能性改善：左心室收缩末期容积、左心室射血分数、室壁运动记分指数、左心室舒张末期长度、左心室收缩末期长度、左心室舒张末期面积、左心室收缩末期面积、左心室舒张末期容量、6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。

在本专利申请的另一方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，提高左心室收缩末期容积。在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，提高左心室射血分数。

在本专利申请的某些方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使左心室收缩末期容积提高至少约10％。在本专利申请的其他方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使左心室收缩末期容积提高至少约15％。在本专利申请的其他方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使左心室收缩末期容积提高至少约10％，左心室射血分数提高至少约10％，室壁运动记分指数提高至少约5％，6分钟步行距离增加至少约30米，或NYHA心功能分级提高至少一个等级。在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药有效量的SDF-1，使左心室射血分数提高至少约10％。

在本专利申请的另一方面，在梗塞周围区给药有效量的SDF-1，基于血管密度，梗塞周围区的血管发生大幅提高至少约20％。

在本专利申请的一方面，SDF-1质粒可通过向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区多次注射溶液进行给药，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒溶液。在一个例子中，SDF-1质粒可以向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射至少约10次进行给药。向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的每次注射给药量可以为至少约0.2ml。SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区表达大于约三天。

在一个示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射量可以为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本专利申请的另一方面，通过向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射SDF-1质粒，可以改善心脏的至少一项功能参数，其中在至少约10个注射部位的每部位注射量为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。

在另一个例子中，向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够改善心脏至少一项功能参数的SDF-1质粒量大于约4mg。向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够改善心脏至少一项功能参数的SDF-1质粒溶液量为至少约10ml。

本专利申请还涉及大型哺乳动物患心肌梗塞后改善其左心室收缩末期容积的方法。该方法包括采用心室内导管插入术将SDF-1质粒向哺乳动物梗塞周围区给药。SDF-1可在梗塞周围区以有效量表达，从而在左心室收缩末期容积方面实现功能改善。

在本专利申请的某些方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，左心室收缩末期容积提高至少约10％。在本专利申请的其他方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使左心室收缩末期容积提高至少约15％。在本专利申请的其他方面，向梗塞周围区给药的有效量的SDF-1，使左心室收缩末期容积提高至少约10％，左心室射血分数提高至少约10％，室壁运动记分指数提高至少约5％，6分钟步行距离增加至少约30米，或NYHA心功能分级提高至少一个等级。

在本专利申请的一方面，SDF-1质粒可通过向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区多次注射溶液进行给药，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。在一个例子中，SDF-1质粒可以向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射至少约10次进行给药。向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的每次注射给药量可以为至少约0.2ml。SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区表达大于约三天。

在一个示例性应用中，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射量可以为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本专利申请的另一方面，通过在心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射SDF-1质粒，心脏的左心室收缩末期容积可提高约10％，其中在至少约10个注射部位的每部位注射量为至少约0.2ml，并且每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。

在另一个例子中，向心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够提高左心室收缩末期容积的SDF-1质粒量大于约4mg。向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的能够提高心脏的左心室收缩末期容积的SDF-1质粒溶液量为至少约10ml。

本专利申请还涉及治疗受试者严重肢体缺血的方法。该方法包括通过在缺血肢体中直接注射来将ACRX-100(也称为JVS-100)和无菌生物制品(由核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒、编码人类SDF-1 cDNA的裸DNA质粒以及5％葡萄糖构成)给药。优选地，在肌肉组织中直接注射，例如，在大腿(股四头肌)和/或小腿(主要为腓肠肌)中使用多个注射部位进行注射。这种质粒的序列示出如下：

ACRX-100(亦称JVS-100)中所用质粒的序列

AGATCTCCTAGGGAGTCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACGTAAGTACCGCCTATAGAGTCTATAGGCCCACCCCCTTGGCTTCTTATGCATGCTATACTGTTTTTGGCTTGGGGTCTATACACCCCCGCTTCCTCATGTTATAGGTGATGGTATAGCTTAGCCTATAGGTGTGGGTTATTGACCATTATTGACCACTCCCCTATTGGTGACGATACTTTCCATTACTAATCCATAACATGGCTCTTTGCCACAACTCTCTTTATTGGCTATATGCCAATACACTGTCCTTCAGAGACTGACACGGACTCTGTATTTTTACAGGATGGGGTCTCATTTATTATTTACAAATTCACATATACAACACCACCGTCCCCAGTGCCCGCAGTTTTTATTAAACATAACGTGGGATCTCCACGCGAATCTCGGGTACGTGTTCCGGACATGGGCTCTTCTCCGGTAGCGGCGGAGCTTCTACATCCGAGCCCTGCTCCCATGCCTCCAGCGACTCATGGTCGCTCGGCAGCTCCTTGCTCCTAACAGTGGAGGCCAGACTTAGGCACAGCACGATGCCCACCACCACCAGTGTGCCGCACAAGGCCGTGGCGGTAGGGTATGTGTCTGAAAATGAGCTCGGGGAGCGGGCTTGCACCGCTGACGCATTTGGAAGACTTAAGGCAGCGGCAGAAGAAGATGCAGGCAGCTGAGTTGTTGTGTTCTGATAAGAGTCAGAGGTAACTCCCGTTGCGGTGCTGTTAACGGTGGAGGGCAGTGTAGTCTGAGCAGTACTCGTTGCTGCCGCGCGCGCCACCAGACATAATAGCTGACAGACTAACAGACTGTTCCTTTCCATGGGTCTTTTCTGCAGTCACCGTCCTTGCCATCGGTGACCACTAGTGGCTCGCATCTCTCCTTCACGCGCCCGCCGCCCTACCTGAGGCCGCCATCCACGCCGGTTGAGTCGCGTTCTGCCGCCTCCCGCCTGTGGTGCCTCCTGAACTGCGTCCGCCGTCTAGGTAAGTTTAAAGCTCAGGTCGAGACCGGGCCTTTGTCCGGCGCTCCCTTGGAGCCTACCTAGACTCAGCCGGCTCTCCACGCTTTGCCTGACCCTGCTTGCTCAACTCTACGTCTTTGTTTCGTTTTCTGTTCTGCGCCGTTACAGATCGGTACCAAGCTTGCCACCACCATGAACGCCAAGGTCGTGGTCGTGCTGGTCCTCGTGCTGACCGCGCTCTGCCTCAGCGACGGGAAGCCCGTCAGCCTGAGCTACAGATGCCCATGCCGATTCTTCGAAAGCCATGTTGCCAGAGCCAACGTCAAGCATCTCAAAATTCTCAACACCCCAAACTGTGCCCTTCAGATTGTAGCCCGGCTGAAGAACAACAACAGACAAGTGTGCATTGACCCGAAGCTAAAGTGGATTCAGGAGTACCTGGAGAAAGCCTTAAACAAGTAATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCACCTAAATGCTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGGGCCGCGGTGGCCATCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGAATTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCTCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAGGTAGCCGGATCAAGCGTATGCAGCCGCCGCATTGCATCAGCCATGATGGATACTTTCTCGGCAGGAGCAAGGTGAGATGACAGGAGATCCTGCCCCGGCACTTCGCCCAATAGCAGCCAGTCCCTTCCCGCTTCAGTGACAACGTCGAGCACAGCTGCGCAAGGAACGCCCGTCGTGGCCAGCCACGATAGCCGCGCTGCCTCGTCTTGCAGTTCATTCAGGGCACCGGACAGGTCGGTCTTGACAAAAAGAACCGGGCGCCCCTGCGCTGACAGCCGGAACACGGCGGCATCAGAGCAGCCGATTGTCTGTTGTGCCCAGTCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCCAAGCGGCCGGAGAACCTGCGTGCAATCCATCTTGTTCAATCATGCGAAACGATCCTCATCCTGTCTCTTGATC(SEQ ID NO:6)

附图说明

在结合附图阅读下列说明之后，本专利申请的上述特征和其他特征对于本专利申请所涉及领域的技术人员而言将是显而易见的。

图1是一个图表，该图表说明猪模型中针对不同数量和体积的DNA的荧光素酶表达；

图2是一个图表，该图表说明利用注射SDF-1后30天充血性心力衰竭的猪模型，针对不同数量的SDF-1质粒的左心室收缩末期容积变化％；

图3是一个图表，该图表说明利用注射SDF-1后30天充血性心力衰竭的猪模型，针对不同数量的SDF-1质粒的左心室射血分数变化％；

图4是一个图表，该图表说明利用注射SDF-1后30天充血性心力衰竭的猪模型，针对不同数量的SDF-1质粒的室壁运动记分指数变化％；

图5是一个图表，该图表说明利用注射SDF-1后90天充血性心力衰竭的猪模型，针对不同数量的SDF-1质粒的左心室收缩末期容积变化％；以及

图6是一个图表，该图表说明利用注射SDF-1后30天充血性心力衰竭的猪模型，针对不同数量的SDF-1质粒的血管密度变化％。

图7是SDF-1质粒载体的示意图。

图8是一个图像，该图像显示在猪心脏很大一部分上的质粒表达。

图9是一个图表，该图表说明基线处以及初始注射后30天左心室收缩末期容积。所有组显示左心室收缩末期容积在30天的类似增长。对于所有数据点，N＝3。数据表示为平均值±SEM。

图10是一个图表，该图表说明基线处以及初始注射后30天的左心室射血分数。所有组显示左心室射血分数没有提高。对于所有数据点，N＝3。数据表示为平均值±SEM。

图11是注射后3天缺血大鼠腿中的荧光素酶表达图象(A)和在啮齿动物HLI模型中ACRX-100载体表达的时间进程图表(B)。

图12是注射ACL-01110L荧光素酶质粒DNA后3天兔子后肢肌肉的生物发光图像。

图13是兔子后肢内ACL-01110L给药参数图表。

图14是兔子缺血后肢在基线处的血管造影照片和评分的例子(A和C)以及注射ACRX-100后30天的血管造影照片和评分的例子(B和D)。

图15是注射ACRX-100后30天和60天血管造影评分的百分比变化图表，所述评分根据每组的对照归一化。

图16是强心剂注射后ACRX-100生物分布图。

图17是缺血性损伤后SDF-1表达和CXCR4表达的关系图。CXCR4是SDF-1的主要受体。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语和科学术语都具有本申请所属领域的技术人员公知的相同含义。除非另外指明，否则本文全部公开内容通篇提及的所有专利、专利申请、已公开申请和公布、Genbank序列、网站和其他已公开的材料全文以引用方式并入。在本文中存在对术语的多个定义的情况下，此部分中的定义优先。除非另有规定，否则本文使用的所有技术术语都具有本申请所属领域的普通技术人员公知的相同含义。分子生物学术语的公知定义可参见(例如)Rieger et al.,Glossary of Genetics:Classicaland Molecular,5th edition,SpringerVerlag:New York,1991(Rieger等人，《经典和分子遗传学词汇》，第5版，斯普林格出版社，纽约，1991年)；以及Lewin,Genes V,OxfordUniversity Press:New York,1994(Lewin，《基因5》，牛津大学出版社，纽约，1994年)。

本文描述了涉及常规分子生物学技术的方法。此类技术通常是本领域已知的，并且在方法学文献中有详细的描述，诸如，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2nded.,vol.1-3,ed.Sambrook et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1989；(《分子克隆实验指南》，第2版，第1-3卷，Sambrook等人编辑，冷泉港实验室出版社，纽约冷泉港，1989年)；以及Current Protocols in MolecularBiology,ed.Ausubel et al.,Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York,1992(《最新分子生物学实验方法汇编》，Ausubel等人编辑，格林出版和威利国际科学出版公司，纽约，1992年)(定期更新)。核酸的化学合成方法在，例如，Beaucage andCarruthers,Tetra.Letts.22:1859-1862,1981(Beaucage和Carruthers，《四面体通讯》，第22卷，第1859-1862页，1981年)，以及Matteucci et al.,J.Am.Chern.Soc.103:3185,1981(Matteucci等人，《美国化学会志》，第103卷，第3185页，1981年)中有所论述。核酸的化学合成可在，例如，市售的自动化寡核苷酸合成仪中进行。免疫学方法(例如，抗原特异性抗体的制备、免疫沉淀法和免疫印迹法)在，例如Current Protocols in Immunology,ed.Coliganet al.,John Wiley&Sons,New York,1991(《新编免疫学实验指南》，Coligan等人编辑，约翰威立父子出版社，纽约，1991年)；以及Methods of Immunological Analysis,ed.Masseyeff et al.,John Wiley&Sons,New York,1992(《免疫学分析方法》，Masseyeff等人编辑，约翰威立父子出版社，纽约，1992年)中有所描述。基因转移和基因治疗的常规方法也可适用于本专利申请。参见，例如，Gene Therapy:Principles and Applications,ed.T.Blackenstein,Springer Verlag,1999(《基因治疗：原理与应用》，T.Blackenstein编辑，施普林格出版社，1999年)；Gene Therapy Protocols(Methods in MolecularMedicine),ed.P.D.Robbins,Humana Press,1997(《基因治疗方案(分子医学方法)》，P.D.Robbins编辑，胡马纳出版社，1997年)；以及Retro-vectors for Human GeneTherapy,ed.C.P.Hodgson,Springer Verlag,1996(《人类基因治疗逆转录载体》，C.P.Hodgson编辑，施普林格出版社，1996年)。

在参考URL或其他此类标识符或位址的情况下，应理解此类标识符可改变并且互联网上的具体信息可不断变化，但是等效的信息可以通过搜索互联网找到。对此类标识符的参考证明此类信息的可获得性和公众传播性。

本文所用的ACRX-100为无菌生物制品，其由核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒、编码人类SDF-1 cDNA的裸DNA质粒以及5％葡萄糖构成。(在本专利申请中，ACRX-100也可称为JVS-100)。

本文所用的“核酸”指多核苷酸，该多核苷酸包含至少两个共价连接的核苷酸或核苷酸类似物亚基。核酸可以是脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或DNA类似物或RNA类似物。核苷酸类似物为可商购获得的，并且制备包含此类核苷酸类似物的多核苷酸的方法是已知的(Lin et al.(1994)Nucl.Acids Res.22:5220-5234(Lin等人，1994年，《核酸研究》，第22卷，第5220-5234页)；Jellinek et al.(1995)Biochemistry 34:11363-11372(Jellinek等人，1995年，《生物化学》，第34卷，第11363-11372页)；Pagratis et al.(1997)Nature Biotechnol.15:68-73(Pagratis等人，1997年，《自然生物技术》，第15卷，第68-73页))。核酸可以为单链、双链或其混合物。就本文而言，除非另外指明，否则核酸均为双链，或可从上下文清楚得知。

本文所用的“DNA”意在包括所有类型和尺寸的DNA分子，包括eDNA、质粒以及包括修饰核苷酸和核苷酸类似物的DNA。

本文所用的“核苷酸”包括核苷一磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸。核苷酸还包括修饰核苷酸，诸如(但不限于)硫代磷酸核苷酸、氮杂嘌呤核苷酸以及其他核苷酸类似物。

本文所用的术语“受试者”或“患者”指可引入DNA大分子的动物。该术语包括高等生物，诸如哺乳动物和鸟类，包括人类、灵长类动物、啮齿类动物、牛、猪、兔子、山羊、绵羊、小鼠、大鼠、豚鼠、猫、狗、马、鸡以及其他动物。

本文所用的“大型哺乳动物”指典型的成年体重为至少10kg的哺乳动物。这类大型哺乳动物可以包括(例如)人类、灵长类动物、狗、猪和牛，并且意在排除小型哺乳动物，诸如小鼠、大鼠、豚鼠及其他啮齿类动物。

本文所用的“向受试者给药”是指将一种或多种递送药剂和/或大核酸分子共同或单独引入或施加于受试者使得存在于受试者体内的靶细胞最终与药剂和/或大核酸分子接触的程序。

本文所用的可与“转导”互换使用的“递送”指将外源性核酸分子转移至细胞中使得它们位于细胞内的过程。核酸递送与核酸表达是截然不同的过程。

本文所用的“多克隆位点(MCS)”指质粒中的核酸区域，该质粒包含多个限制性酶位点，任何一个限制性酶位点均可与标准重组技术结合用于消化载体。“限制性酶消化”指采用只能在核酸分子的特定位置发挥功能的酶来催化分解核酸分子。许多这类限制性酶均是可商购获得的。本领域内的技术人员广泛了解这类酶的使用。通常，使用在MCS内部进行切割的限制性酶对载体进行线性化或片段化，以使外源性序列能够连接到所述载体上。

本文所用的“复制起点”(通常称为“ori”)是指起始复制的特定核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以采用自主复制序列(ARS)。

本文所用的“选择性标记或可筛选标记”赋予细胞可识别的变化使得易于识别包含表达载体的细胞。通常，选择性标记是赋予允许选择的特性的标记。阳性选择性标记是指有该标记时允许对其进行选择的标记，而阴性选择性标记是指有该标记时阻止对其进行选择的标记。抗药性标记是阳性选择性标记的一个例子。

通常，包括药物选择标记有助于克隆和鉴定转化体，例如，赋予新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博莱霉素和组氨醇抗性的基因是有用的选择性标记。除了赋予允许根据条件的实施来区分转化体的表型的标记外，也可考虑其他类型的标记，包括可筛选标记，诸如基于热量分析的GFP。或者，可以使用可筛选酶，诸如单纯性疱疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。本领域内的技术人员还应了解如何可能性地与FACS分析结合使用免疫标记。只要所用标记能够与编码基因产物的核酸同时表达，则认为该标记不重要。选择性标记和可筛选标记的另外例子是本领域内的技术人员所熟知的。

术语“转染”用于指细胞摄入外来DNA。当外源DNA已被引入细胞膜内部时，则细胞已被“转染”。许多转染技术在本领域是众所周知的。参见例如，Graham et al.,Virology52:456(1973)(Graham等人，《病毒学》，第52卷，第456页，1973年)；Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(1989)(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，1989年)；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)(Davis等人，《分子生物学基本方法》，1986年)；Chu et al.,Gene 13:197(1981)(Chu等人，《基因》，第13卷，第197页，1981年)。这些技术可用于将一个或多个外源DNA部分，诸如核苷酸整合载体及其他核酸分子，引入适当的宿主细胞。该术语包括化学介导转染程序、电介导转染程序和病毒介导转染程序。

本文所用的“表达”指核酸被翻译成肽或被转录成RNA的过程，该RNA例如可以被翻译成肽、多肽或蛋白质。如果核酸来源于基因组DNA，并且选择了适当的真核宿主细胞或生物体，则表达可以包括mRNA剪接。对于将在宿主细胞内表达的异源核酸，开始时必须将其递送至细胞内，然后一旦进入所述细胞，最终存在于细胞核内。

本文所用的“基因治疗”涉及将异源DNA转移至正在探寻治疗或诊断方式的疾病或病症的哺乳动物的细胞，特别是人类的细胞。DNA以异源DNA得以表达从而制造所编码的治疗产品的方式引入所选定的靶细胞。或者，异源DNA可以某种方式介导编码治疗产品的DNA的表达；它可以编码以某种方式直接或间接地介导治疗产品的表达的产品，诸如肽或RNA。基因治疗也可以用于提供编码基因产物的核酸来替换缺陷基因或补充其所引入的哺乳动物或细胞产生的基因产物。因此，所引入的核酸可以编码治疗化合物，诸如其生长因子抑制剂，或肿瘤坏死因子或其抑制剂，诸如在哺乳动物宿主体内非正常产生或在其治疗有效剂量下或治疗有效时间时不产生的受体。在引入患病宿主细胞之前，可以对编码治疗产品的异源DNA进行修饰以便提高或以其他方式改变产品或其表达。

本文所用的“异源核酸序列”通常为编码由细胞在体内非正常产生的RNA和蛋白质的DNA，该DNA在所述细胞内表达，或者介导或编码通过影响转录、翻译或其他可调节生物化学过程而改变内源DNA表达的介导因子。异源核酸序列也可以称为外来DNA。异源DNA在本文涵盖本领域内的技术人员认为或视为对于该DNA在其中表达的细胞来说为异源或外来的任何DNA。异源DNA的例子包括但不限于：编码可追踪标记蛋白诸如赋予抗药性的蛋白质的DNA；编码治疗有效物质诸如抗癌剂、酶和激素的DNA；以及编码其他类型蛋白质诸如抗体的DNA。可以在已引入异源DNA的细胞表面上分泌或表达由异源DNA编码的抗体。

本文所用的术语“心肌病”指由于任何原因所出现的心肌(即实际的心肌)功能退化。患心肌病的受试者常常会伴有心律失常、心脏性猝死或由于心力衰竭而导致住院治疗或死亡的危险。

本文所用的术语“缺血性心肌病”为由于对心肌的供氧不足而导致的心肌无力，其中冠状动脉疾病是最常见的原因。

本文所用的术语“缺血性心脏病”指由于无供血或供血相对不足而引起的心肌受损或心肌工作效率低的任何病症；缺血性心脏病通常由动脉粥样硬化所引起，其包括心绞痛、急性心肌梗塞、慢性缺血性心脏病以及猝死。

本文所用的术语“心肌梗塞”指由于心肌(心肌层)某区域供血受阻而引起该区域的损伤或死亡。

本文所用的术语“6分钟步行试验”或“6MWT”指测量患者在6分钟时间内在平坦的硬表面上可以快速行走的距离(6MWD)的试验。该试验评估了锻炼期间所涉及的所有系统，包括肺部系统和心血管系统、体循环、外周循环、血液、神经肌肉单位和肌肉代谢，的整体反应和综合反应。该试验不提供有关运动期间涉及的各不同器官和系统的功能或运动限制机理的具体信息，最大的心肺运动试验可能会提供上述具体信息。自定步速6MWT评估了功能能力的次高水平。(参见，例如，AM J Respir Crit Care Med,Vol.166.Pp 111-117(2002)(《美国呼吸道与危重症监护医学杂志》，第166卷，第111-117页，2002年))

本文所用的“纽约心脏协会(NYHA)心功能分级”指对心力衰竭程度的分级。该分级根据患者在身体活动中的受限程度将患者划分到四个类别中的一类；所述限制/症状与正常呼吸以及呼吸急促和/或心绞痛的不同程度相关：

本专利申请涉及治疗导致受试者心肌功能减弱和/或受损的心肌病的组合物和方法。用本文的组合物和方法治疗的心肌病可以包括与肺栓塞、静脉血栓、心肌梗塞、短暂性脑缺血发作、周围血管疾病、动脉粥样硬化、缺血性心脏病和/或其他心肌损伤或血管疾病有关的心肌病。治疗心肌病的方法可以包括对衰弱的心肌组织、缺血心肌组织和/或细胞凋亡心肌组织诸如患心肌梗塞后的心脏梗塞周围区进行局部给药(或局部递送)有效量的基质细胞衍生因子-1(SDF-1)，使以下至少一项参数得到功能改善：左心室容积、左心室面积、左心室内径、心脏功能、6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。

使用模仿人类心力衰竭的心力衰竭猪模型发现：缺血心肌组织功能改善取决于向缺血心肌组织给药的SDF-1的量、剂量和/或递送，并且可以对向缺血心肌组织给药的SDF-1的量、剂量和/或递送进行优化，从而使心肌功能参数，诸如左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能实质上得到改善。如下文所讨论，在某些方面，对向缺血心肌组织给药的SDF-1的量、浓度和体积可以进行控制和/或优化，以实质上改善功能参数(例如，左心室容积、左心室面积、左心室内径、心脏功能、6分钟步行试验(6MWT)和/或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级)，同时减轻不良副作用。

在一个例子中，可对存在由缺血性心肌病诸如心肌梗塞所引起的心脏功能参数(诸如左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能)的退化或恶化的大型哺乳动物(例如：猪或人类)心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区进行直接或局部SDF-1给药。功能参数退化或恶化可以包括例如通过使用(例如)超声心动描记术测得的左心室收缩末期容积增加、左心室射血分数减少、室壁运动记分指数增加、左心室舒张末期长度增加、左心室收缩末期长度增加、左心室舒张末期面积增加(例如，二尖瓣水平和乳头肌止点水平)、左心室收缩末期面积增加(例如，二尖瓣水平和乳头肌止点水平)或左心室舒张末期容积增加。

在本专利申请的一方面，对大型哺乳动物心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的SDF-1给药量可以是有效量，该量可改善心肌的至少一项功能参数，诸如通过使用(例如)超声心动描记术测得的左心室收缩末期容积减少、左心室射血分数增加、室壁运动记分指数减少、左心室舒张末期长度减少、左心室收缩末期长度减少、左心室舒张末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌止点水平)减少、左心室收缩末期面积(例如，二尖瓣水平和乳头肌止点水平)减少或左心室舒张末期容积减少，以及改善受试者6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。

在本专利申请的另一方面，对患心肌病的大型哺乳动物心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的SDF-1给药量可以是给药后30天通过超声心动描记术测得的有效量，该量可提高哺乳动物左心室收缩末期容积至少约10％，并且更具体地讲，至少约15％。改善的百分率是相对于接受治疗的每位受试者而言的，并且以在治疗干预或治疗之前或期间测得的相应参数为基础。

在本专利申请的其他方面，对患心肌病的大型哺乳动物心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的SDF-1给药量可以是给药后30天通过超声心动描记术测得的有效量，该量可提高左心室收缩末期容积至少约10％，提高左心室射血分数至少约10％，以及提高室壁运动记分指数约5％。

在本专利申请的另一方面，对患心肌病的大型哺乳动物心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的SDF-1给药量可以是基于血管密度或通过SPECT显像测得的心肌灌注增加，使衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区血管发生提高至少20％的有效量。已证明使血管发生提高20％临床意义重大(Losordo Circulation 2002；105:2012(Losordo，《循环》，2002年，第105卷，第2012页))。

在本专利申请的另一方面，对患心肌病的大型哺乳动物心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的SDF-1给药量可以有效增加6分钟步行距离至少约30米，或提高NYHA分级至少1级。

本文所述的SDF-1可以在发生SDF-1下调后对组织受损(例如，心肌梗塞)的心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区进行约数小时、数天、数星期或数月的给药。对细胞进行SDF-1给药的时间可以包括紧随心肌病(例如，心肌梗塞)发病后至缺血性疾病或组织受损发生后约数天、数星期或数月的时间。

根据本专利申请用于对心肌组织梗塞周围区的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区进行给药的SDF-1可以具有与天然的哺乳动物SDF-1氨基酸序列基本上类似的氨基酸序列。许多不同哺乳动物(包括人类、小鼠和大鼠)的SDF-1蛋白的氨基酸序列均为已知的。人类的SDF-1氨基酸序列和大鼠的SDF-1氨基酸序列具有至少约92％的同一性(例如，约97％的同一性)。SDF-1可以包含两种亚型，SDF-1α和SDF-1β，除非另外指明，否则两者在本文中均称为SDF-1。

SDF-1可以具有和SEQ ID NO:1基本上相同的氨基酸序列。过表达的SDF-1也可以具有与前述哺乳动物SDF-1蛋白质之一基本上类似的氨基酸序列。例如，过表达的SDF-1可以具有与SEQ ID NO:2基本上类似的氨基酸序列。基本上包含SEQ ID NO:1的SEQ ID NO:2是人类SDF-1的氨基酸序列，并且由GenBank登录号NP954637标识。过表达的SDF-1也可以具有与SEQ ID NO:3基本上相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:3包含大鼠SDF的氨基酸序列，并且由GenBank登录号AAF01066标识。

根据本专利申请的SDF-1也可以是哺乳动物SDF-1的变体，诸如哺乳动物SDF-1的片段、类似物和衍生物。这类变体包括，例如，天然SDF-1基因的天然存在的等位基因变体(即，编码天然存在的哺乳动物SDF-1多肽的天然存在的核酸)编码的多肽、天然SDF-1基因的选择性剪接形式编码的多肽、天然SDF-1基因的同源物或直系同源物编码的多肽以及天然SDF-1基因的非天然存在的变体编码的多肽。

SDF-1变体具有与天然SDF-1多肽存在一个或多个氨基酸差异的肽序列。这类变体的肽序列的特征可为SDF-1变体的一个或多个氨基酸的缺失、添加或置换。氨基酸插入优选为约1至4个连续氨基酸，并且氨基酸缺失优选为约1至10个连续氨基酸。变体SDF-1多肽基本上维持天然SDF-1的功能活性。可通过表达特征为沉默变化或保守变化的核酸分子来得到SDF-1多肽变体的例子。SDF-1变体的一个例子列于美国专利No.7,405,195中，该专利全文以引用方式并入本文。

对应于一个或多个特定基序和/或结构域或对应于任意尺寸的SDF-1多肽片段在本专利申请的范围内。分离的SDF-1的肽基部分可以通过筛选由编码此类肽的核酸相应片段重组生成的肽来获得。例如，可以将SDF-1多肽任意分成所需长度的片段并且所述片段不重叠，或优选分成所需长度的重叠片段。可以通过重组生成所述片段，并且对其进行测试以确定可用作天然CXCR-4多肽激动剂的肽基片段。

SDF-1多肽变体还可包括SDF-1多肽的重组形式。在某些实施例中，除SDF-1多肽外的重组多肽，由可与编码哺乳动物SDF-1的基因的核酸序列具有至少70％序列同一性的核酸编码。

SDF-1变体可以包括组成性表达天然SDF-1功能活性的蛋白质的激动形式。其他SDF-1变体可以包括例如，由于改变蛋白酶靶序列的突变而抗蛋白水解裂解的变体。肽的氨基酸序列的变化是否产生具有天然SDF-1的一种或多种功能活性的变体可以通过测试变体的天然SDF-1功能活性容易地确定。

编码SDF-1蛋白的SDF-1核酸可以是天然或非天然核酸，并且可以是RNA形式或DNA形式(例如，eDNA、基因组DNA和合成DNA)。DNA可以是双链或单链的，并且如果是单链DNA，则可能是编码链(有义链)DNA或非编码链(反义链)。编码SDF-1的核酸编码序列可以基本上类似于SDF-1基因的核苷酸序列，诸如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5中所示的核苷酸序列。SEQID NO:4和SEQ ID NO:5分别包含人类SDF-1的核酸序列和大鼠SDF-1的核酸序列，并且基本上类似于GenBank登录号NM199168和GenBank登录号AF189724的核酸序列。

SDF-1的核酸编码序列还可为由于遗传密码的冗余或简并而不同的编码序列，该编码序列编码与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3相同的多肽。

其他编码SDF-1的核酸分子是天然SDF-1的变体，诸如编码天然SDF-1的片段、类似物和衍生物的核酸分子。这类变体可为，例如，天然SDF-1基因的天然存在的等位基因变体、天然SDF-1基因的同源物或直系同源物、或天然SDF-1基因的非天然存在变体。这些变体的核苷酸序列与天然SDF-1基因有一个或多个碱基不同。例如，此类变体的核苷酸序列的特征可为天然SDF-1基因的一个或多个核苷酸的缺失、添加或置换。核酸插入优选为约1至10个连续核苷酸，核酸缺失优选为约1至10个连续核苷酸。

在其他应用中，可通过进行核苷酸置换来产生表现出结构实质性变化的变体SDF-1，所述核苷酸置换引起所编码多肽中不太保守的变化。此类核苷酸置换的例子为引起以下的变化的例子：(a)多肽主链的结构；(b)多肽的电荷或疏水性；或(c)庞大的氨基酸侧链。通常预计使蛋白特性发生最大变化的核苷酸置换为引起密码子发生非保守变化的核苷酸置换。可能使蛋白结构发生巨大变化的密码子变化的例子为引起下列置换的密码子变化：(a)亲水残基(例如，丝氨酸或苏氨酸)置换为疏水残基(例如，亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸或丙氨酸)；(b)半胱氨酸或脯氨酸置换为任何其他残基；(c)具有带正电侧链的残基(例如赖氨酸、精氨酸或组氨酸)置换为带负电残基(例如，谷氨酰胺或天冬酰胺)；或(d)具有庞大侧链的残基(例如，苯丙氨酸)置换为不具有侧链的残基(例如，甘氨酸)。

天然SDF-1基因的天然存在的等位基因变体是从哺乳动物组织分离出来的核酸，其与天然SDF-1基因具有至少70％的序列同一性，并编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。天然SDF-1基因的同源物是从其他物种分离的核酸，其与天然基因具有至少70％的序列同一性，并编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。可以搜索公共和/或专有核酸数据库确定与天然SDF-1基因具有高百分比(例如，70％或更高)序列同一性的其他核酸分子。

非天然存在的SDF-1基因变体为自然中不存在(例如，由人工制造)的核酸，其与天然SDF-1基因具有至少70％的序列同一性，并编码与天然SDF-1多肽具有结构相似性的多肽。非天然存在的SDF-1基因变体的例子为编码天然SDF-1蛋白的片段的变体，在严格条件下与天然SDF-1基因或天然SDF-1基因的互补序列杂交的变体，以及与天然SDF-1基因或天然SDF-1基因的互补序列共有至少65％的序列同一性的变体。

在某些实施例中，编码天然SDF-1基因的片段的核酸为编码天然SDF-1的氨基酸残基的核酸。对编码天然SDF-1的片段的核酸进行编码或与其杂交的较短寡核苷酸可用作探针、引物或反义分子。对编码天然SDF-1的片段的核酸进行编码或与其杂交的较长多核苷酸还可用于本专利申请的多个方面。编码天然SDF-1的片段的核酸可以通过酶消化(例如，使用限制性酶)或化学降解全长的天然SDF-1基因或其变体来制备。

本文还可使用在严格条件下与上述核酸中的一种进行杂交的核酸。例如，此类核酸可为在低严格性条件下、中等严格性条件下或高严格性条件下与上述核酸中的一种进行杂交的核酸。

在某些实施例中也可使用编码SDF-1融合蛋白的核酸分子。此类核酸可以通过下列方式制得：制备构建体(例如，表达载体)，其在被引入合适的靶细胞中时表达SDF-1融合蛋白。例如，此类构建体可以通过下列方式制得：将编码框内融合的SDF-1蛋白的第一个多核苷酸与编码另一种蛋白的第二个多核苷酸连接，使构建体在合适表达系统中的表达产生融合蛋白。

可以在碱基部分、糖部分或磷酸主链上对编码SDF-1的核酸进行修饰，例如，以提高分子和杂交的稳定性等。本文所述核酸可另外包括其他附加基团，诸如肽(例如，用于在体内靶向靶细胞受体)，或促进跨细胞膜转运的介质和引发杂交的裂解剂。为此，核酸可与另一个分子(例如，肽)、引发杂交的交联剂、转运介质和引发杂交的裂解剂等偶联。

通过将SDF-1蛋白供给心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区，或将引起、增加和/或上调SDF-1(即，SDF-1介质)的表达的介质引入心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞，可以将SDF-1递送至心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区。细胞表达的SDF-1蛋白可以是经遗传修饰的细胞的表达产物。

引起、增加和/或上调SDF-1表达的介质可以包括如本文所述的天然或合成核酸，这些核酸并入重组核酸构建体，通常是能够引入心肌组织细胞并且在其中复制的DNA构建体。这种构建体可包括一个复制系统和多个序列，这些序列能够在给定细胞内转录和翻译多肽编码序列。

将介质引入靶细胞的一种方法涉及采用基因治疗。在本专利申请的某些实施例中，可以采用基因治疗由体内心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区细胞表达SDF-1蛋白。

在本专利申请的一方面，基因治疗可以采用载体，所述载体包括编码SDF-1蛋白的核苷酸。“载体”(有时称为基因递送或基因转移“运载体”)指大分子或多种分子的复合物，所述分子包含在体外或体内递送至靶细胞的多核苷酸。待递送的多核苷酸可包含基因治疗中所关注的编码序列。载体包括，例如，病毒载体(例如，腺病毒('Ad')、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒)、非病毒载体、脂质体和其他含脂复合物以及其他能够介导多核苷酸递送至靶细胞的大分子复合物。

载体还可包括进一步调节基因递送和/或基因表达或以其他方式向靶细胞提供有利特性的其他组分或功能。此类其他组分包括，例如，影响与细胞结合或靶向的组分(包括介导细胞类型结合或组织特异性结合的组分)；影响细胞摄入载体核酸的组分；影响摄入后多核苷酸在细胞内的定位的组分(例如，介导核定位的介质)；以及影响多核苷酸的表达的组分。此类组分还可包括标记，诸如可检测标记和/或选择性标记，这些标记可用于检测或选择已摄入由载体递送的核酸并且对其进行表达的细胞。此类组分可以作为载体(诸如，使用具有介导结合和摄入的组分或功能的某些病毒载体)的自然特征提供，或者可以修饰载体来提供这些功能。

选择性标记可以是阳性、阴性或双功能的。阳性选择性标记允许选择带有所述标记的细胞，而阴性选择性标记允许选择性清除带有所述标记的细胞。描述了各种此类标记基因，包括双功能(即，阳性/阴性)标记(参见，如Lupton,S.,WO 92/08796,published May29,1992(Lupton,S，WO 92/08796，1992年5月29日公布)；以及Lupton,S.,WO 94/28143,published Dec.8,1994(Lupton,S，WO 94/28143，1994年12月8日公布))。此类标记基因可提供补充的控制措施，这在基因治疗的环境中可为有利的。大量的此类载体是本领域已知的并且通常是可获得的。

可用于本文的载体包括病毒载体、脂质载体及其他非病毒载体，这些载体能够将核苷酸递送至心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞中。所述载体可以是靶向性载体，尤其是优先与心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞结合的靶向性载体。用于本文方法中的病毒载体可包括对于心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞具有低毒性，并且以组织特异性的方式诱导产生治疗有效量SDF-1蛋白的病毒载体。

病毒载体的例子为来源于腺病毒(Ad)或腺相关病毒(AAV)的病毒载体。人类和非人类病毒载体皆可使用，并且重组病毒载体在人体内可以是复制缺陷型。当载体是腺病毒时，该载体可以包括多核苷酸，该多核苷酸具有有效连接至编码SDF-1蛋白的基因的启动子，并且该载体在人体内是复制缺陷型。

可根据本专利申请的方法使用的其他病毒载体包括单纯性疱疹病毒(HSV)载体。缺失一个或多个立即早期基因(IE)的HSV载体是有利的，因为通常情况下这些载体无细胞毒性，在靶细胞中保持类似潜伏的状态，并提供高效的靶细胞转导。重组HSV载体可以包括约30kb的异源核酸。

逆转录病毒，诸如C型逆转录病毒和慢病毒，还可用于本专利申请的某些实施例中。例如，逆转录病毒载体可以鼠白血病病毒(MLV)为基础。参见，例如，Hu and Pathak,Pharmacal.Rev.52:493-511,2000(Hu和Pathak，《药理学评论》，第52卷，第493-511页，2000年)；以及Pong et al.,Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.17:1-60,2000(Pong等人，《医药载体系统评论综述》，第17卷，第1-60页，2000年)。基于MLV的载体可含有达8kb的异源(治疗)DNA来代替病毒基因。异源DNA可以包括组织特异性启动子和SDF-1核酸。在将DNA递送至伤口附近细胞的方法中，它还可以编码结合至组织特异性受体的配体。

可使用的额外逆转录病毒载体为复制缺陷型慢病毒载体，包括人类免疫缺陷(HIV)型载体。参见，例如，Vigna and Naldini,J.Gene Med.5:308-316,2000(Vigna和Naldini，《基因医学杂志》，第5卷，第308-316页，2000年)；和Miyoshi et al.,J.Viral.72:8150-8157,1998(Miyoshi等人，《病毒期刊》，第72卷，第8150-8157页，1998年)。慢病毒载体的优势在于它们能够感染活跃分裂细胞和不分裂细胞。它们还高效转导人上皮细胞。

本文的方法中使用的慢病毒载体可以来源于人类和非人类(包括SIV)慢病毒。慢病毒载体的例子包括载体传播所需的核酸序列以及有效连接至SDF-1基因的组织特异性启动子。此前者可以包括病毒LTR、引物结合位点、多嘌呤序列、附着位点以及衣壳化位点。

慢病毒载体可以装入任何合适的慢病毒衣壳内。将一种颗粒蛋白用来自不同病毒的另一种颗粒蛋白代替称为“假型”。载体衣壳可包含来自其他病毒的病毒包膜蛋白，包括鼠白血病病毒(MLV)或水泡性口膜炎病毒(VSV)。使用VSV G蛋白会产生高载体滴度，并且使载体病毒颗粒的稳定性变大。

本文也可以使用甲病毒载体，诸如用塞姆利基森林病毒(SFV)和辛德毕斯病毒(SIN)制备的载体。甲病毒的使用在Lundstrom,K.,Intervirology 43:247-257,2000(Lundstrom,K，《国际病毒学》，第43卷，第247-257页，2000年)和Perri et al.,Journal ofVirology 74:9802-9807,2000(Perri等人，《病毒学期刊》，第74卷，第9802-9807页，2000年)中有所描述。

重组的复制缺陷型甲病毒载体是有利的，因为它们能够进行高水平的异源(治疗)基因表达，并且可以感染广泛范围的靶细胞。通过在其病毒粒子表面上展示功能性异源配体或结合结构域(其允许选择性地结合到表达同类结合配偶体的靶细胞)，甲病毒复制子可以靶向特定细胞类型。甲病毒复制子可具有潜伏期，因此在靶细胞中进行长期异源核酸表达。复制子还可以在靶细胞中表现瞬时异源核酸表达。

在多个适用于本专利申请方法的病毒载体中，一种以上的启动子可以包括在载体内，从而允许载体表达一种以上的异源基因。此外，载体可以包括序列，该序列编码信号肽或促进由靶细胞表达SDF-1基因产物的其他部分。

为了结合两个病毒载体系统的有利特性，可以利用杂交病毒载体将SDF-1核酸递送至靶组织。用于构建杂交载体的标准技术是本领域的技术人员所熟知的。此类技术可见于例如Sambrook,et al.,In Molecular Cloning:A laboratory manual.Cold SpringHarbor,N.Y.(Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，冷泉港，纽约)或探讨重组DNA技术的许多实验室手册。包含AAV和腺病毒ITR组合的腺病毒衣壳中的双链AAV基因组可以用来转导细胞。在另一个变型中，可以将AAV载体置于“无病毒基因”、“依赖辅助病毒”或“高容量”的腺病毒载体中。腺病毒/AAV杂交载体在Lieber et al.,J.Viral.73:9314-9324,1999(Lieber等人，《病毒期刊》，第73卷，第9314-9324页，1999年)中有所论述。逆转录病毒/腺病毒杂交载体在Zheng et al.,Nature Biotechnol.18:176-186,2000(Zheng等人，《自然生物技术》，第18卷，第176-186页，2000年)中有所论述。包含在腺病毒中的逆转录病毒基因组可以整合到靶细胞基因组中，并实现稳定的SDF-1基因表达。

还设想了其他有利于SDF-1基因的表达和载体克隆的核苷酸序列元件。例如，启动子上游的增强子或编码区下游的终止子的存在例如能够促进表达。

根据本专利申请的另一方面，组织特异性启动子可与SDF-1基因融合。通过将这种组织特异性启动子融合在腺病毒构建体中，将转基因表达限于特定的组织。可利用本文所述的重组腺病毒系统确定由组织特异性启动子提供的基因表达效率和特异性程度。

除了基于病毒载体的方法外，还可以采用非病毒方法将SDF-1核酸引入靶细胞。在Nishikawa and Huang,Human Gene Ther.12:861-870,2001(Nishikawa和Huang，《人类基因治疗》，第12卷，第861-870页，2001年)中给出了对基因递送的非病毒方法的综述。根据本发明的非病毒基因递送方法的例子采用了质粒DNA将SDF-1核酸引入细胞中。基于质粒的基因递送法是本领域众所周知的。在一个例子中，质粒载体可具有如在图7中示意性示出的结构。图7的质粒载体包括SDF-1αcDNA(RNA)序列上游的CMV增强子和CMV启动子。

任选地，可以设计合成的基因转移分子来与质粒SDF-1 DNA形成多分子聚集体。这些聚集体可设计成结合到心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞。阳离子两亲物，包括脂多胺和阳离子脂质，可用于将受体依赖性SDF-1核酸转入靶细胞(例如，心肌细胞)内。此外，预先形成的阳离子脂质体或阳离子脂质可以与质粒DNA混合产生细胞转染复合物。涉及阳离子脂质制剂的方法在Feigner et al.,Ann.N.Y.Acad.Sci.772:126-139,1995(Feigner等人，《纽约科学院年鉴》，第772卷，第126-139页，1995年)和Lasic andTempleton,Adv.Drug Delivery Rev.20:221-266,1996(Lasic和Templeton，《先进药物递送综述》，第20卷，第221-266页，1996年)中进行了概述。对于基因递送，还可以将DNA连接到两亲阳离子肽(Fominaya et al.,J.Gene Med.2:455-464,2000(Fominaya等人，《基因医学期刊》，第2卷，第455-464页，2000年)。

本文可以采用涉及病毒型组分和非病毒型组分两者的方法。例如，用于治疗性基因递送的基于爱泼斯坦-巴尔二氏病毒(EBV)的质粒在Cui et al.,Gene Therapy 8:1508-1513,2001(Cui等人，《基因治疗》，第8卷，第1508-1513页，2001年)中有所描述。此外，涉及连接到腺病毒的DNA/配体/聚阳离子附属物的方法在Curiel,D.T.,Nat.Immun.13:141-164,1994(Curiel,D.T，《自然-免疫学》，第13卷，第141-164页，1994年)中有所描述。

另外，通过采用电穿孔技术转染靶细胞可将SDF-1核酸引入靶细胞中。电穿孔技术是众所周知的，并且可以用来促进采用质粒DNA进行的细胞转染。

对SDF-1的表达进行编码的载体可以采用注射用制剂的形式递送到靶细胞，该注射用制剂含有药学上可接受的载体，诸如，生理盐水(根据需要)。也可以根据本发明使用其他药用载体、制剂和剂量。

在本发明的一方面，载体可包括SDF-1质粒，诸如图7中所示。在优选的实施例中，SDF-1质粒包括SEQ ID NO:6的核苷酸序列。SDF-1质粒可通过如下方式递送至心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的细胞：将SDF-1质粒载体以有效量直接注入心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区中，该量将改善至少一项心肌功能参数，诸如左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能以及改善受试者的6分钟步行试验(6MWT)或纽约心脏协会(NYHA)心功能分级。通过将载体直接注入心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区或这些区域周围，可以相当有效地靶向载体转染，并且使重组载体的损失最小化。这种类型的注入使所需数量的细胞能够局部转染，特别是在心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区周围转染，从而使基因转移的治疗功效最大化，并且使病毒蛋白所致炎症反应的可能性最小化。

在本专利申请的一方面，SDF-1质粒可通过在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射多次表达SDF-1的质粒DNA的溶液进行给药，每次注射包含约0.33mg/ml至约5mg/ml的SDF-1质粒/溶液。在一个例子中，SDF-1质粒可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区进行至少约10次注射、至少约15次注射、或至少约20次注射进行给药。在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区多次注入SDF-1质粒允许衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的更大面积和/或更多数量细胞得到治疗。

在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的每次注射给药量可以为至少约0.2ml。包括向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的SDF-1质粒的量在内、能够提高心脏的至少一项功能参数的总溶液量为至少约10mL。

在一个例子中，SDF-1质粒可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射至少约10次进行给药。在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的每次注射给药量可以为至少约0.2ml。SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区表达大于约三天。

例如，包含SDF-1表达质粒的溶液的每次注射量可以为至少约0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。在本专利申请的另一方面，可通过在心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区注射SDF-1质粒来改善心脏的至少一项功能参数，其中在至少约10个注射部位的每部位注射量为至少约0.2ml，每次注射的SDF-1质粒浓度为约0.33mg/ml至约5mg/ml。

在充血性心力衰竭猪模型中发现：向心力衰竭猪模型中注入浓度低于约0.33mg/ml或者大于约5mg/mL的SDF-1质粒溶液，并且每个注射部位的注射量低于约0.2ml，所治疗的心脏的左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能的功能改善程度很小(如果有的话)。

在本专利申请的另一方面，向衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药能够改善心脏的至少一项功能参数的SDF-1质粒的量在每次治疗干预中大于约4mg并且小于约100mg。通过本文的治疗干预来给药的SDF-1质粒量指在通过被设计用于实现或得到一定治疗效果的治疗程序中向受试者提供的SDF-1质粒总给药量。该量可包括在特定治疗干预的单次注射中的SDF-1质粒总给药量，或者某个治疗干预多次注射的SDF-1质粒总给药量。在充血性心力衰竭猪模型中发现：通过向所述心脏直接注入SDF-1质粒来将约4mg的SDF-1质粒DNA给药，所治疗的心脏的左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能并没有得到功能改善。此外，通过向所述心脏直接注入SDF-1质粒来将约100mg的SDF-1质粒DNA给药，所治疗的心脏的左心室容积、左心室面积、左心室内径或心脏功能并没有得到功能改善。

在本专利申请的某些方面，在用SDF-1质粒载体转染超过约三天后，可以在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区内按治疗有效量或剂量表达SDF-1。按治疗有效剂量或量表达SDF-1超过三天可以对衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区提供治疗效果。有利的是，用SDF-1质粒载体按治疗有效剂量转染少于约90天后，SDF-1可在衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区内表达，以减轻潜在的慢性和/或细胞毒性效应，该潜在的慢性和/或细胞毒性效应可能会抑制将SDF-1给药至受试者的治疗功效。

应当理解，任何一个动物或人类的SDF-1质粒的给药量、体积、浓度和/或剂量取决于多个因素，包括受试者的身形、体表面积、年龄、待给药的特定组合物、性别、给药时间和途径、总体健康状况以及其他同时给药的药物。本领域的技术人员采用如下所述的实验方法可以容易地确定SDF-1质粒的上述规定量、体积、浓度和/或剂量的具体变化。

在本专利申请的另一方面，可采用导管插入术，诸如心室内导管插入术或心肌内导管插入术，通过直接注射对SDF-1质粒进行给药。在一个例子中，将可偏转引导导管装置推进到左心室，逆行穿过主动脉瓣。一旦将该装置置入左心室之后，就可将SDF-1质粒注射到左心室的梗塞周围区(包括室间隔和外侧面)范围。通常，可在约60秒的时间内注射1.0ml的SDF-1质粒溶液。正接受治疗的受试者可接受至少约10次注射(例如总共约15次至约20次注射)。

在将SDF-1质粒给药之前，可对受试者的心肌组织进行成像，以便在将SDF-1质粒给药之前确定衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的范围。通过成像确定衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区，可以更精确将SDF-1质粒插入(intervention)和靶向至衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区。用于确定心肌组织衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的成像技术可包括任何已知的心脏成像技术。此类成像技术可包括，例如，超声心动描记术、磁共振成像、冠状动脉造影、电解剖标测或荧光透视法中的至少一种。应当理解，也可采用能够确定衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区的其他成像技术。

此外，可在心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区引入除SDF-1核酸以外的其他药剂(例如SDF-1质粒)，促进SDF-1由衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区细胞的表达。例如，提高编码SDF-1的基因的转录、提高编码SDF-1的mRNA的翻译、和/或减少编码SDF-1的mRNA降解的药剂可用于提高SDF-1蛋白水平。通过在编码SDF-1的基因上游引入外源启动子，可提高细胞内的基因转录效率。也可以使用能够促进异源基因表达的增强子元件。

其他药剂可以包括其他蛋白质、趋化因子和细胞因子，在将其给药于靶细胞时，可上调心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区对SDF-1的表达。此类药剂可以包括，例如：胰岛素样生长因子(IGF)-1，该药剂在给药于间充质干细胞(MSC)时，显示出上调SDF-1的表达(Circ.Res.2008,Nov 21；103(11):1300-98(《循环研究》，2008年，11月21日，第103卷，第11期，第1300-1398页)；音猬因子(Shh)，该药剂在给药于成体成纤维细胞时，显示出上调SDF-1的表达(Nature Medicine,Volume 11,Number 11,Nov.23(《自然医学》，第11卷，第11期，11月23日)；转化生长因子β(TGF-β)，该药剂在给药于人体腹膜间皮细胞(HPMC)时，显示出上调SDF-1的表达；IL-lβ、PDGF、VEGF、TNF-a和PTH，这药剂在给药于主要人成骨细胞(HOB)、混合型骨髓基质细胞(BMSC)和人成骨样细胞系时，显示出上调SDF-1的表达(Bone,2006,Apr；38(4):497-508(《骨》，2006年4月，第38卷，第4期，第497-508页))；胸腺肽β4，该药剂在给药于骨髓细胞(BMC)时，显示出上调表达(Curr.Pharm.Des.2007；13(31):3245-51(《当今药物设计》，2007年，第13卷，第31期，第3245-3251页))；以及缺氧诱导因子1α(HIF-1)，该药剂在给药于骨髓来源祖细胞时，显示出上调SDF-1的表达(Cardiovasc.Res.2008,E.Pub.(《心血管研究》，2008年，电子版))。这些药剂在存在或给药能够相对于特定细胞因子而言上调SDF-1表达的这种细胞的情况下，可用于治疗特殊心肌病。

促使提高和/或上调SDF-1表达的SDF-1蛋白或药剂，可单独或以药物组合物形式给药于心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区。药物组合物可将SDF-1或药剂局部释放至需要治疗的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区细胞。根据本专利申请的药物组合物通常包含一定量的SDF-1或药剂，并且混合有可接受的药物稀释剂或赋形剂，例如无菌水溶液，从而根据预期用途提供一定范围的最终浓度。制备技术通常是本领域公知的，如Remington's Pharmaceutical Sciences,16th Ed.Mack Publishing Company,1980(《雷氏药学大全》，第16版，Mack出版公司，1980年)所示例，该文献以引用的方式并入本文。此外，对于人类给药，制剂应符合美国食品药品监督管理局(FDA)生物标准办公室要求的无菌、热原性、一般安全性和纯度标准。

药物组合物可为单位剂量可注射形式(例如溶液剂、混悬剂和/或乳剂)。可用于注射的药物制剂的例子包括无菌水溶液或分散体、以及复原成无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。载体可以是溶剂或分散介质，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等等)、葡萄糖、盐水、或磷酸盐缓冲盐水、其合适的混合物和植物油。

可以保持适当的流动性，例如使用卵磷脂之类的包衣，在分散情况下保持所需的粒度，以及使用表面活化剂。也可以使用非水载体作为化合物组合物的溶剂体系，诸如棉籽油、芝麻油、橄榄油、豆油、玉米油、向日葵油或花生油，以及肉豆蔻酸异丙酯等酯类。

此外，可添加能够提高组合物稳定性、无菌性和等渗性的各种添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。可通过如下物质来确保微生物活动的预防：各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、酚、山梨酸等等。在很多情况下，可能需要包括等渗剂，例如糖类、氯化钠等等。为了实现可注射药物形式的长时间吸收，可使用一些延缓吸收药剂，例如单硬脂酸铝和明胶。然而，根据本文所述的方法，所使用的任何载体、稀释剂或添加剂必须与所述化合物相容。

可根据需要将在实施本文所述方法中所用的化合物与不同量的其他成分一起掺入到所需量的适当溶剂中，从而制备无菌可注射溶液。

可以使用药用“缓释”胶囊或“持续释放”化合物或制剂，且它们是普遍适用的。缓释制剂通常设计用于在延长时间内提供恒定药物浓度，且可以用于递送SDF-1或药剂。通常，在心肌组织的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区附近植入缓释制剂。

持续释放制剂的例子包括含有SDF-1或药剂的固态疏水聚合物的半透性基质，所述基质的形式为有形物质，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯；水凝胶，例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚乙烯醇；聚交酯，例如美国专利No.3,773,919；L-谷氨酸与γ-苄基-L-谷氨酸酯的共聚物；不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯；可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，诸如LUPRON DEPOT(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射的微球)；以及聚D-(-)-3-羟基丁酸。

虽然一些聚合物，诸如乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够释放分子超过100天，但某些水凝胶释放蛋白质的时间更短。SDF-1或药剂在用胶囊密封时，能够在人体内长时间保留，并且可能因为在37℃下暴露于水分而变性或凝聚，从而降低生物活性和/或改变免疫原性。根据所涉及的机理，采取合理的策略保持其稳定性。例如，如果凝聚机理涉及到通过巯基-二硫键互换在分子间形成S-S键，则可以通过修饰巯基残基、冻干酸性溶液、控制含水量、使用适当的添加剂、形成特殊的聚合物基质组合物来实现稳定性。

在某些实施例中，脂质体和/或纳米粒子也可与SDF-1或药剂一起使用。本领域内的技术人员通常熟知脂质体的形成与用途，如下所概述。

脂质体由磷脂形成，所述磷脂分散在水介质中并自发形成多层的同心双层囊泡(也称为“多层囊泡(MLV)”)。通常MLV的直径为25nm至4μm。超声处理MLV导致形成直径在200至

范围内的小单层囊泡(SUV)，并在核心中含有水溶液。

磷脂在分散在水中时可形成除脂质体以外的多种结构，具体取决于脂质与水的摩尔比。在较低比率下，脂质体是优选的结构。脂质体的物理特性取决于pH值、离子强度和二价阳离子的存在。脂质体对离子和极性物质具有低渗透性，但在高温下会发生相变，这会显著改变其渗透性。相变包括从紧密堆积的有序结构(称为凝胶状态)转变至松散堆积的不太有序的结构(称为流体状态)。这一情况发生在特征相变温度下，并导致其对离子、糖类和药物的渗透性增加。

脂质体通过四种不同机制与细胞相互作用：网状内皮系统的吞噬细胞，诸如巨噬细胞和嗜中性粒细胞的内吞作用；通过非特异性弱疏水或静电力、或通过与细胞表面组分的特异性相互作用吸附至细胞表面；通过将脂质体的双分子脂膜嵌入质膜，与浆细胞膜融合，同时释放脂质体内容物进入细胞质；以及通过运输脂质体脂质至细胞膜或亚细胞膜、或反向传输，与脂质体内容物没有任何关联。脂质体成分的变化可改变起作用的为何种机理，但可能有不止一种机理同时起作用。

纳米胶囊通常可以稳定且可重现的方式俘获化合物。为了避免细胞内聚合物超载产生的副作用，应使用能够在体内降解的聚合物来设计这种超细粒子(粒径为约0.1μm)。能够满足这些要求的可生物降解的聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子预计可以用于所述方法，并且这些粒子易于制取。

为了由本专利申请的化合物制备药物组合物，药学上可接受的载体可以为任何形式(例如固体、液体、凝胶等等)。固体载体可以是还可用作稀释剂、矫味剂、粘合剂、防腐剂和/或胶囊包封材料的一种或多种物质。

严重肢体缺血

本专利申请还涉及治疗受试者严重肢体缺血的方法。该方法包括通过使用多个注射部位向大腿(股四头肌)和小腿(主要是腓肠肌)直接肌内注射来进行JVS-100给药。JVS-100是无菌生物制品，其由编码人类SDF-1cDNA的裸DNA质粒(具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒)和5％葡萄糖构成。

严重肢体缺血(CLI)代表下肢动脉粥样硬化性周围血管疾病(PVD)的最晚期，并且与较高比率的心血管发病率、死亡率和大截肢术相关。美国每年估计有125,000名至250,000名患者患有CLI，且该数字预计会随人群年龄增长而增大。PVD患病率会随年龄增长而显著增加，65岁及以上的美国人中约20％受该疾病的影响。针对CLI患者的现行医疗标准包括下肢血管再生，可采用开放外周外科手术、血管内介入法或下肢截肢术(例如当血管再生失败或不可行时)。CLI患者的1年死亡率是25％，截肢的CLI患者的1年死亡率可以高达45％。尽管在血管和外科手术方面有先进技术，还是有相当大比例的CLI患者不适合接受血管再生。在这些患者中，30％的患者将需要进行大截肢术，而23％的患者将在3个月内死亡。疏通阻塞的血管或刺激血管生成的策略正处于积极研究阶段。

Jeffrey Isner医生在1994年对一位71岁、患有严重PVD和脚趾坏疽的患者首次进行评估的治疗性血管生成，是利用血管再生或血管生长因子治疗CLI的一项策略。将编码这些生长因子的基因注射到缺血组织中，以促进新生血管形成，尝试通过各种作用机制增大局部缺血组织的灌注。在这项研究中，通过球囊血管形成术将人类质粒phVEGF165施加至腘动脉末梢。功能参数和血管造影参数在12个星期内得到改善，并且只有患肢出现了蜘蛛痣和浮肿，说明该治疗对局部血管生成有效。这一开创性实验表明，尝试在缺血组织中提高血管生长因子的表达的实验性CLI疗法，可能有利于为手术结果不理想的患者提供血管生成的可能性，进而恢复肢体功能和保护肢体。最新研究表明，刺激血管生成的趋化因子可能是用于保持和恢复严重肢体缺血患者肢体功能的治疗方法的关键组分。

非病毒性基因递送，或用于在特异性位点表达治疗蛋白的裸质粒DNA的应用，是一种在局部缺血患者中临床测试超过15年的简单递送方法。与病毒载体疗法递送相比，非病毒性基因递送的安全性同样引人注目，因为这一方法不会因为递送病毒载体而产生显著的炎症反应。大量临床前文献和临床文献证明了治疗基因的非病毒性递送对于严重肢体缺血、心肌病和伤口愈合等疾病模型的安全性和有效性。具体而言，编码成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、肝细胞生长因子(HGF)的质粒DNA已用于治疗CLI患者，尝试增大不良或受损脉管系统所影响区域的侧支血流量。重要的是，已证明了非病毒性FGF和VEGF基因疗法临床使用的安全性，目前为止没有报道过重大的安全问题。在I期和II期的多项研究中，患有不可重建的严重PVD并伴随有静息痛或组织坏死的患者已接受非病毒性FGF(NV1FGF)的肌内注射治疗。已采用裸质粒DNA将NV1FGF按递增单剂量(最大剂量16mg)和重复剂量(2次，最大剂量8mg)注射入局部缺血的大腿和小腿。NV1FGF耐药性良好。在对38名患者进行6个月追踪之后，观察到疼痛范围和缺血性溃疡区域明显减少，并且与基线值相比，TcP0₂增大。目前正在进行检查裸质粒DNA治疗CLI的应用的大规模III期试验，诸如评估有皮肤病变的CLI患者中NV1FGF的疗效和安全性的多中心双盲安慰剂对照试验，即TAMARIS试验，该试验将选定490名患者接受安慰剂或NV1FGF肌内注射。

迄今为止，这些非病毒基因疗法没有出现安全问题，并且根据II期临床数据，NVIFGF似乎能为患有CLI的受试者提供有益效果。这一结果，结合我们之前采用ACRX-100治疗缺血性心力衰竭证明提高血管发生和心脏功能而没有安全问题的临床前工作，引导我们假设ACRX-100将具有安全性，能够提高血管发生，并最终为严重肢体缺血患者提供临床有益效果。

经确定，在损伤后多个组织中SDF-1上调并表达4-5天的时间。多个研究团队已证明了SDF-1疗法对广泛范围的疾病的治疗潜力，包括缺血性肌病、周围性血管疾病、伤口愈合、严重肢体缺血和糖尿病。SDF-1是干细胞和祖细胞的强趋化剂，能够促进组织保存和血管发育。这些报告共同指出一种保守通路和作用机理，SDF-1通过该该保守通路和作用机理可在组织受损之后促进修复并恢复功能。这促使发明人为治疗缺血性心血管疾病开发了ACRX-100(葡萄糖溶液中的一种非病毒性、编码SDF-1的裸DNA质粒)。在GLP安全性和毒理学研究中，在心力衰竭猪模型中ACRX-100在最多至30mg时显示功能有益效果，并且在最多至100mg时显示安全性。发明人目前正在参与使用ACRX-100治疗缺血性心力衰竭患者的多中心、非盲、剂量递增的I期临床试验。

发明人的研究表明，ACRX-100显著增加心脏的血管发生，这与多个研究团队的研究结果相一致。这些研究提出重建严重肢体缺血中慢性损伤组织的干细胞归巢，可以重新开始组织修复并有可能提高血流量。本公司接着证明，与对照治疗动物相比，在兔子的缺血后肢直接肌内注射ACRX-100能够促进组织的血管再生，因此提出ACRX-100有望成为治疗严重肢体缺血(CLI)的备选治疗药物。美国每年估计有125,000名至250,000名患者患有CLI，且该数字预计会随人群年龄增长而增大。针对CLI患者的现行医疗标准包括下肢血管再生，可采用开放外周外科手术、血管内介入法或下肢截肢术(例如：当血管再生失败或不可行时)。CLI患者的1年死亡率是25％，截肢的CLI患者的1年死亡率可以高达45％。尽管在血管和外科手术方面有先进技术，还是有相当大比例的CLI患者不适合接受血管再生。

具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒包括编码人类SDF-1 cDNA的裸DNA质粒。ACRX-100是无菌生物制品，其由具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒和5％葡萄糖构成。

具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒是一种设计用于在哺乳动物组织中表达人类SDF-1的裸DNA质粒。质粒骨架由ColE1起点和卡那霉素抗性标记组成。通过CMV增强子/启动子、CMV内含子A和RU5翻译增强子驱动SDF-1转基因的表达。通过结合牛生长激素多聚腺苷酸信号序列确保高效的聚腺苷酸化。这与心力衰竭患者治疗所采用的质粒和制剂相同。发明人目前正在开发用于治疗严重肢体缺血患者的ACRX-100。ACRX-100配制用于直接肌内注射。计划给药方案包括单剂量给药或多剂量给药，使用多个注射部位在大腿(股四头肌)和小腿(主要是腓肠肌)进行给药。

SDF-1(亦称CXCL12)是响应于组织损伤而快速上调的天然存在的趋化因子。SDF-1诱导刺激大量防护性抗炎通路，引起促炎介质(诸如MMP-9和IL-8)的下调，并可通过抑制半胱天冬酶介导的Akt激活来防止细胞凋亡。而且，SDF-1是一种针对组织损伤部位的较强的内源性器官特异性及骨髓衍生的干细胞和祖细胞的趋化剂，可促进组织保存和血管发育。以往研究表明，在组织损伤部位，SDF-1表达增加，然而该表达持续时间不到一周，因此诱导性干细胞归巢响应会迅速消失。尽管短时SDF-1表达减少了组织修复的可能性，但却表明，通过治疗性干预延长或重新引入SDF-1刺激干细胞归巢过程的能力，可能有益于组织损伤的患者。根据该假设，Penn博士的实验室已证明，心肌梗死症状数月后，通过注射过表达SDF-1的心肌成纤维细胞重新引入SDF-1，可导致骨髓衍生的具有内源器官特异性的干细胞重新归巢至心脏，在受损组织内生长新的血管，并且心功能增加超过80％。心肌梗死八周后注射过表达SDF-1的骨骼肌成肌细胞也可显著增强心功能。此外，SDF-1可通过向损伤组织补充循环干细胞，形成新血管，对受损区域增加灌注，从而增强心功能。急性心肌梗塞后，将过表达MSC的SDF-1递送到大鼠体内时，心功能增强240％，证明上述效果以及显著的心肌保存作用。为应对缺血性损伤，该生物反应已被保存在大量器官系统中。

发明人所观察到的SDF-1治疗的有益效果已通过其他独立实验室最近的研究得到验证。当通过急性心肌梗塞大鼠体内的嵌入纳米纤维蛋白、心肌梗塞小鼠体内的纤维胶进行的重组蛋白，或在急性心肌梗塞小鼠体内直接心肌内注射蛋白来递送SDF-1时，SDF-1可增强缺血性心肌病中的心功能。注入心肌梗塞边界区的SDF-1编码质粒已显示可促使循环干细胞进入心肌梗塞边界区。相似地，使用由患者自身肌肉生长的成肌细胞或肌肉干细胞并通过基因工程改造以过表达SDF-1的再生细胞疗法已表明具有治疗心力衰竭的临床前期疗效，目前正在对患者进行临床试验，以修复缺血性损伤的组织，并在再生(REGEN)试验中增强其功能。总之，多个实验室发布的数据表明，不考虑递送方法，SDF-1的过表达在缺血性病因的疾病中具有功能有益效果。

通过再生由血流不畅损坏的脉管系统，在缺血肌中重新刺激SDF-1表达，对CLI具有较高的治疗潜力。这就有可能修复和保持正在退化的肢体的功能。已显示血管结构重新生长，以提高使用VEGF或干细胞进行的多个临床试验的保肢率。Yamaguchi等人报道，施用EPC后，SDF-1蛋白的局部递送增强了缺血后肢新血管的形成，表明SDF-1增强了EPC诱导的血管发生。相似地，Hiasa等人表明，通过VEGF/eNOS相关通路，SDF-1基因转移增强了体内局部缺血诱发的血管发生和血管生成。

最近通过对从慢性CLI膝关节截肢患者身上获得的骨骼肌进行分析，确认了这些观察结果。SDF-1及其受体CXCR4的表达分别在骨骼肌纤维和微血管中得到增强。这表明SDF-1/CXCR4修复轴线已在缺血腿肌中长期上调，尝试刺激微血管生长，进行自然愈合，然而水平较低不足以进行愈合。通过使用ACRX-100基因治疗增强该信号，我们可以协同建立已在受损组织中开始的治愈过程。因此，对于下一代治疗性新血管形成，ACRX-100代表一种新型趋化因子疗法。

主细胞库和大批量质粒产生概述

采用专用试剂和材料，在300L的规模下，完成用于心力衰竭I期临床试验的药品的制造。对于我们提出的I期/II期CLI试验，我们将能利用通过运用合格的主细胞库和流线型药品制造并使用预先确立的质量测试服务所获得的经验。所有介质的配制使用常见的无动物源性成分和USP级或质量更佳的无菌水。基于各自的分析证书发布用于细菌裂解的所有缓冲液以便制造。在不采用核糖核酸酶的情况下，通过气泡装置完成大规模裂解。采用USP级或等效试剂在Aldevron制造所有色谱缓冲液，满足内部规范后将其发布。在环境可控洁净室中实行所有无菌操作。洁净室设施包括：用于更衣的前厅(等级10,000，ISO 7)，有两个门和一个通向主要洁净室(等级10,000)的传递窗；内部有等级1000(ISO 6)的房间，配备用于最终灌装的等级100(ISO 5)生物安全罩。指定规程以便使用、维护、清洁(每个批次后)和环境监测。大批量质粒溶液是通过过滤器灭菌，必要时，调整浓度，储存在-75+5℃下，以最终分配到药品小瓶中。

制造过程的最后一步是在无菌散装容器中对无菌溶液进行无菌稀释。因此，在早期开发中，规定药物是无菌的。

药品制造概要

将大批量质粒转移到配备ISO 5生物安全柜(BSC)的等级ISO 6洁净室。根据制造商分析证书，所有接触材料均为预先灭菌、无热源的一次性材料，且已发布投入使用。在BSC中进行处理。首先使用USP葡萄糖(5％)将大批量质粒溶液稀释到最终的目标浓度以进行注射。混合后，手动用移液管将无菌质粒溶液吸取到最终的预先灭菌血清小瓶中。产品在-75+5℃下冷冻储存。将在IND中提供介质组分和下游试剂以及质量信息的详尽列表。

稳定性

稳定性研究已表明从制造之时起，临床前批次ACRX-100在-20℃下可保持稳定长达一年。临床等级ACRX-100(批次24370D-F)目前处于加速(5±3℃)和标准(-20±4℃)稳定性(表1)，预计结果将超出临床前稳定性结果。结果将记录在IND中。以下试验将作为稳定性试验的一部分进行：外观、特性(琼脂糖凝胶电泳)、浓度(A260/A280)、均匀性(密度测定法)、效能和pH。分别在发布时、发布6个月后及以后每年进行无菌测试。

X＝所有条件，无菌保存；Y＝无菌

ACRX-100非临床药理学和毒理学

最近“趋化因子药物”已引起广泛关注，因为其能够在组织损伤部位刺激并补充干细胞。ACRX-100是通过人体细胞内的基因表达递送人类趋化因子SDF-1的基因治疗药剂。ACRX-100产生的活性蛋白SDF-1已经显示可通过补充CXCR4-阳性干细胞改善暂时性远端缺血性受损心肌层的心功能并提高受伤上皮细胞的愈合率。SDF-1已在急性CLI患者中显示促血管形成活性，并在慢性CLI患者体内下调，表明旨在更新慢性CLI中SDF-1表达的疗法可通过向成人脉管系统补充骨髓来源细胞以增强血管发生。

已使用在ACRX-100药品中配制、具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒在缺血心血管疾病和后肢缺血的动物模型中进行试验。通过向心力衰竭猪模型的心脏中施用ACRX-100以测试其疗效、安全和生物分布，并建立100mg的无可见有害作用水平(NOAEL)。用低于心力衰竭非临床和临床研究的剂量给药的ACRX-100相同制剂目前正在进行评估，以确定CLI中得到的潜在疗效。在后肢缺血兔子中已采用ACRX-100进行单剂量疗效、毒理学和生物分布的研究。该研究证明，ACRX-100具有治疗严重肢体缺血的治疗潜能，向兔子缺血后肢肌内注射ACRX-100没有产生任何毒性症状或组织病理学变化。此外，使用单剂量后，在治疗后60天核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒基本已从除缺血肢体之外的所有器官清除。计划在后肢缺血兔子模型中进行重复剂量疗效和安全性(毒理学和生物分布)研究，以支持CLI患者可使用高达3剂量的ACRX-100。

以下实例仅用于说明，并非旨在限制本文附加权利要求的范围。

实例1

基质细胞衍生因子-1或SDF-1是天然存在的趋化因子，为应对组织损伤，趋化因子的表达迅速上调。SDF-1诱导刺激大量防护性抗炎通路，引起促炎介质(诸如MMP-9和IL-8)的下调，可防止细胞凋亡。而且，SDF-1是一种骨髓来源的干细胞和祖细胞针对组织损伤部位的器官特异性强趋化剂，可促进组织保存和血管发育。根据增加的SDF-1表达可增强缺血动物模型的心功能的观察结果，我们重点研究非病毒性裸DNA SDF-1编码质粒，治疗缺血性心血管疾病。在开发过程期间，根据如下所述的细胞培养和小动物研究结果对质粒进行优化。根据其在心脏组织中表达转基因的能力及持续改善缺血性心肌病临床前动物模型的心功能的能力，选择核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒。通过CMV增强子/启动子、CMV内含子A和RU5翻译增强子驱动具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒中SDF-1转基因的表达。药品JVS-100(原名为ACRX-100)由5％葡萄糖中的核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒构成。

心力衰竭大鼠模型的初步研究表明，心肌梗塞后四周直接将质粒注入大鼠心脏梗塞边界区之后，ACL-01110S(具有SEQ ID NO:6核苷酸序列的质粒的SDF-1表达前体)增强了心功能。注射后，疗效持续至少8-10周，这与ACL-01110S治疗动物体内的血管发生增加有关。对ACL-01110S进行修饰以优化其表达谱。

心肌梗塞大鼠模型中质粒的剂量依赖性表达

为确定每次注射的质粒剂量，以提供大鼠心脏组织的最大表达，逐步扩大ACL-00011L荧光素酶质粒剂量(10、50、100、500μg)，注入梗塞大鼠心脏内。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术，将左前降支(LAD)永久结扎，并向心肌梗塞处注射100μL溶于PBS中的ACL-00011L质粒。通过非侵入性生物荧光成像(马萨诸塞州霍普金顿的精诺真公司(Xenogen,Hopkinton,MA))在各剂量组(n＝3)中测量了基线及注射1、2、3、4、5天后的全身荧光素酶表达。表达峰值增加至高达100μg的剂量，高于此剂量达到饱和。根据剂量响应曲线，确定100μg的剂量足以实现大鼠心脏中质粒的最大表达。ACL-00011L表达载体骨架上的荧光素酶基因，该载体骨架相当于用于构造表达SDF-1的ACL-00011S的载体骨架。

缺血性心力衰竭大鼠模型心脏载体表达对比

对若干SDF-1备选质粒中表达荧光素酶的等价物在心肌梗塞(MI)大鼠模型的心脏组织中的表达进行了测试。在驱动表达的启动子和增强子元件的存在方面，备选质粒有所相同。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术，将左前降支(LAD)永久结扎，关闭胸部。四周后，重新打开胸部，将表达荧光素酶的质粒直接注射到(每次注射100μl，其中含100μg)4个心肌梗塞处。注射1、2、4、6、8和10天后(之后每3-4天)，对大鼠进行麻醉，注射荧光素，并用全身Xenogen荧光素酶成像系统进行成像。

所测试的两个CMV驱动的质粒ACL-00011L和ACL-01110L在注射24小时内产生可检测的荧光素酶表达，注射2天后，首次达到表达高峰。

ACL-01110L表达高峰是ACL-00011L的7倍，时间比后者延长10天(注射后，持续时间长达16天)。相比之下，ACL-00021L(αMHC驱动的质粒)显示无初始高峰，而是注射后25天，在较低水平进行表达。这些结果支持先前的研究，表明CMV驱动的质粒可用于心脏中的局部瞬时蛋白表达，并且可通过包含增强子元件来调节治疗性蛋白表达的时间表。

心肌梗塞大鼠模型中SDF-1质粒的疗效

在心肌梗塞大鼠模型中测试编码SDF-1的质粒，确定是否能获得功能性心脏疗效。对Lewis大鼠进行正中胸骨切开术，在紧接第一个分叉点远端将LAD永久结扎。四周后，重新打开胸部，将三个SDF-1表达质粒(ACL-01110S、ACL-00011S或ACL-00021S)中的一个或生理盐水注射至(每100μl注射含100μg)4个心肌梗塞处。

在基线处(注射前)以及注射2、4、8周后，麻醉大鼠，用M型超声心动描记术成像。由受过培训的超声波检验师在对随机分组不知情的情况下对LVEF、缩短分数和LV内径进行测量。

与生理盐水对照组相比，通过观察，两个CMV驱动的质粒ACL-01110S和ACL-00011S均有较强的增强心功能的趋势。ACL-01110S注射后持续8周，四周时缩短分数在统计上显著增加。相比之下，αMHC驱动的质粒ACL-00021S和生理盐水之间未观察到功能差异。此外，与对照组相比，ACL-01110S和ACL-00011S治疗动物的大血管密度显著增加(ACL-01110S：21±1.8血管/mm²；ACL-00011S：17±1.5血管/mm²；生理盐水：6±0.7血管/mm²，两质粒与生理盐水相比p<0.001)，并且梗塞面积减少(ACL-01110S：16.9±2.8％；ACL-00011S：17.8±2.6％；生理盐水：23.8±4.5％)。重点是，用ACL-01110S进行治疗可最大程度增强心功能和血管发生，并最大程度地减少梗塞面积。

总之，与生理盐水治疗相比，在缺血性心力衰竭大鼠模型中，由CMV启动子驱动的两种SDF-1编码质粒均可获得功能性心脏疗效，增加血管发生，并减少梗塞面积。在所有测试参数中，ACL-01110S疗效最显著。

具有核苷酸序列SEQ ID NO:6和ACL-01010Sk的质粒在H9C2细胞中的转染率

使用未用转染试剂进行的H9C2心肌细胞的体外转染(即将裸质粒DNA加入培养中的细胞)，来估算发明人主质粒载体的GFP形式的体外转染效率，该质粒包含核苷酸序列SEQID NO：6和ACL-01010Sk。体外培养H9C2细胞，将不同含量的pDNA(0.5μg、2.0μg、4.0μg、5.0μg)添加到5％的葡萄糖中。通过具有核苷酸序列SEQ ID NO:6(ACL-01110G)或ACL-01010Sk(ACL-01010G)的质粒骨架构造GFP载体。转染3天后，通过FACS评估GFP荧光性以估算转染效率。5％葡萄糖中ACL-01110G和ACL-01010G载体的转染效率在1.08％至3.01％的范围内。在测试的每种含量的pDNA中，两个载体具有类似的体外转染效率。我们可以得到结论，本研究中观察到的1-3％的转染效率，与之前研究得出的相似水平体外转染效率的结论相符。具体地说，JVS-100将转染数量有限但充足的心脏细胞，以产生治疗量的SDF-1。

实例2

猪心肌层中的质粒表达

选择左前降支(LAD)猪的闭塞/再灌注心肌梗塞模型作为合适的大动物模型，以测试ACRX-100的疗效与安全性。在这个模型中，心肌梗塞与治疗之间有4周的恢复期，以留有时间进行心脏重塑，并模拟慢性缺血性心力衰竭。

手术步骤

麻醉约克夏猪，注入肝素延长活化凝血时间(ACT)至300秒以上，然后将其仰卧。为了确定左心室轮廓，在前侧位、后侧位以及斜侧位进行了左心室造影。

将荧光素酶质粒递送至猪心肌层

将偏转型引导导管装置逆行越过主动脉瓣引入左心室，移除导丝，再将LV心内膜针注射导管通过所述引导导管引入LV腔。将给定量和浓度的荧光素酶质粒在4个部位注射到心脏间隔或侧壁中。对质粒浓度(0.5、2、或4mg/mL)与部位注射量(0.2、0.5、1.0ml)的五种组合进行测试。0.5mg/mL的质粒在USP级葡萄糖内缓冲，所有其他物质在USP级磷酸盐缓冲盐水中缓冲。每次注射时，将针插入心内膜，并以0.8-1.5毫升/分的速率注射基因溶液。注射后，将针固定15秒，然后取出。完成所有注射后，移除所有器械，缝合切口，使动物康复。

心肌组织的提取

注射后第三天，将所述动物送去尸检。动物安乐死后，移除其心脏、称重，并灌注乳酸林格氏液直到将血液清除干净。打开左心室，确定注射部位。在各个注射部位周围取下1cm见方的组织方块。从离任一注射部位较远的心脏后壁切取四(4)个方块，作为阴性对照。组织样品冷冻于液氮并在-20℃至-70℃下储存。

荧光素酶表达评估

解冻组织样品，将其放入5mL玻璃管中。加入裂解缓冲液(0.5-1.0ml)，利用Polytron均质机(型号：PT1200)于冰上破坏组织。用离心机分离组织匀浆，并利用Bio-rad去垢剂相容性(DC)蛋白质检测和已知量的牛血清蛋白(BSA)的标准曲线测定每份组织样品上清液的蛋白质浓度。

利用荧光素酶检测试剂盒(普洛麦格公司(Promega))测定组织样品匀浆(1-10μl)。

实验结果如图1所示。数据表明，载体表达随注射量和DNA浓度的增加而增加。

实例3-通过SDF-1质粒治疗患有缺血性心肌病的猪模型而改善其心功能

心肌梗塞的诱导

麻醉约克夏猪，注入肝素延长活化凝血时间(ACT)至250秒以上，然后将其仰卧。利用引导导管将球囊导管引至LAD，位置低于LAD的第一个主分支。然后向球囊充气至足够的压力以确保动脉完全阻塞，且保持动脉充胀90-120分钟。利用荧光镜检查球囊是否完全膨胀和收缩。然后移除球囊，缝合切口，使动物康复。

选择标准

心肌梗塞后一个月，利用超声心动描记术对每头猪的心功能进行评估。如果LVEF低于40％且LVESV大于56.7ml，则选择将该猪用于本研究。

手术步骤

麻醉所选的每头猪，注入肝素延长活化凝血时间(ACT)至300秒以上，然后将其仰卧。为了确定左心室轮廓，在前侧位、后侧位以及斜侧位进行了左心室造影。

将核苷酸序列为SEQ ID NO:6的SDF-1质粒递送至心肌层

将每头猪随机分配至下述3个处死时间点之一：治疗3天、30天或90天后；并随机分配至四个治疗组之一：对照组(注射20次，仅缓冲液)、低剂量组(注射15次，0.5mg/ml)、中剂量组(注射15次，2.0mg/ml)或高剂量组(注射20次，5.0mg/ml)。利用USP级葡萄糖缓冲所有质粒。注射步骤如下所述。

将偏转型引导导管装置逆行越过主动脉瓣引入左心室，移除导丝，再将左心室心内膜针注射导管通过所述引导导管引入左心室腔。将剂量随机分配的SDF-1质粒或缓冲液装入已连接至导管的1mL注射器。每次注射量为1.0ml。每次注射时，将针插入心内膜，并且在60秒内注射溶液。注射后，将针固定15秒，然后取出。完成注射后，移除所有器械，缝合切口，动物康复。

动物处死后，从心脏和其他主要器官切取组织作为样品，并快速将其冷冻用于PCR和组织病理分析。

心功能评估

注射0天、30天、60天、90天后(或直至处死)，利用标准二维超声心动描记术对各个动物的心功能进行评估。在独立核心实验室内对左心室容积、面积和室壁运动记分进行测定。下表1显示了所测量的疗效参数。

表1：超声心动图参数

图2-图5显示了SDF-1质粒对功能改善的影响。图2-图4表明，与对照实验相比，低剂量和中剂量SDF-1质粒可以在注射30天后增加LVESV、LVEF和室壁运动记分指数；而高剂量则未产生有益效果。图5表明，低剂量和中剂量的强心作用持续90天，与对照组相比，这两种剂量效果在病理性重塑时有明显衰减，即LVESV小幅度增加。

血管发生评估

对于三十天处死的动物，利用从各个福尔马林固定心脏上割取的7至9份组织样品对其左心室血管密度进行评估。提取基因组DNA，并通过微柱体纯化程序(凯杰公司(Qiagen))将其从福尔马林固定组织样品中进行高效纯化。利用定量PCR分析检测经SDF-1处理的动物和对照动物的样品是否存在质粒DNA。使用每一动物中发现含有至少比背景高4倍的质粒DNA拷贝(对照组动物除外)的三至五份组织样品制备玻片，并使用同工凝集素进行免疫染色。在每个组织的20-40个随机区域，确定横断面并对血管进行计数。将每个区域的血管数转换为血管数/mm²，并且得出每一动物的平均值。对于每种剂量，报告所有接受该剂量的动物的平均血管数/mm²。

图6表明，与对照实验组相比，在注射两种能改善心功能的剂量30天后，血管密度明显增加。相比之下，未改善心功能的高剂量则未使血管密度明显增加。该数据提供了SDF-1质粒在动物患有缺血性心肌病的情况下改善心功能的推定生物学机制。

生物分布数据

在患有心肌梗塞的猪模型的关键疗效和毒理学研究中，在注射3天、30天、90天后，测量心肌组织和非心肌组织中JVS-100的分布情况。对每个时间点的心肌组织，JVS-100质粒的平均浓度随剂量的增加而增加。注射每一剂量3天、30天和90天后观察JVS-100质粒的清除率，在第90天心肌组织中JVS-100的清除率约为99.999999％。JVS-100分布于有较高血流量的非心脏器官(例如心脏、肾脏、肝脏和肺脏)中，最高浓度出现在注射3天后。JVS-100主要存在于肾脏，与质粒的肾清除率一致。第30天持续水平较低，且90天后在非心肌组织中基本检测不到JVS-100。

结论

在对单个心内膜心肌注射7.5mg和30mg剂量的JVS-100后，其治疗很大程度上提高了患有缺血性心力衰竭的猪的血管密度，增强了其心功能。所测试的最高剂量(100mg)JVS-100表明血管生成呈增加的趋势，但未显示心脏功能得到改善。任何剂量的JVS-100都不与毒性症状、临床病理参数或组织病理学的不良影响有关。JVS-100主要分布于心脏，治疗90天后约99.999999％会从心肌组织清除。JVS100分布于有较高血流量的非心脏器官(如心脏、肾脏、肝脏和肺脏)中，注射3天后在肾脏中浓度最高。注射90天后，体内基本检测不到JVS-100，只有少量已注射剂量滞留在非心肌组织。根据这些发现，JVS-100对患有心肌梗塞的猪模型无可见有害作用水平(NOAEL)为100mg，通过心内膜心肌注射给药。

实例4-基于猪的探索性研究：对患有慢性心肌梗塞的猪经动脉注射LUC

方法

利用经动脉导管向先前患有LAD闭塞/再灌注心肌梗塞且EF大于40％的猪注射核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒。对LAD和LCX进行两次注射，注射量为2.5ml，注射总时间为125-130秒。再次向LCX注射3.0ml，注射总时间为150秒，以质粒混合作为对照。

处死和组织提取

注射三天后，对所述动物实施安乐死。动物安乐死后，取出其心脏，排干血液，置于冰凉刀板上，并由尸检技术员或者病理学家进行解剖。切开右心室提取隔膜中未经注射的心肌层。从心脏裁切下右心室，将其置于冷停跳液。每一部分都使用新解剖刀片。

接着，切开左心室，整个左心室从尖部到底部切成6部分。左心室均匀分成3片。切完后，每份切片能摆平。将每份切片(3份左心室切片、1份右心室切片和1份胸肌切片)放入置于湿冰上的具有冷停跳液且单独标识的容器中，然后送至荧光素酶分析。

荧光素酶成像

将所有收集的组织浸于荧光素中，利用Xenogen成像系统进行成像，确定质粒表达。

结果

图8显示了心脏代表性影像。色斑代表荧光素酶表达的区域。这些斑点显示相对光单位(RLU)大于10⁶个单位，超出背景2个数量级。这一数据表明，导管输送了足够质粒实现心脏大部分的大量质粒表达。

实例5-临床研究实例

注射递增剂量JVS-100以治疗患有缺血性心肌病的受试者体内的HF。通过记录所有不良事件(AE)以追踪每一剂量的安全性，主要安全性研究终点是30天时主要心肌不良事件的数量。将对每个组的受试者注射单剂量JVS-100。在所有组中，通过标准超声心动图测量对心功能的影响、单光子发射计算机断层照相(SPECT)成像测量心肌灌注情况、纽约心脏协会(NYHA)心功能分级、6分钟步行距离和生命质量对治疗效果进行评估。

所有受试者在患有心肌梗塞前已有收缩功能障碍病史，目前通过最新的适龄癌症筛查并未检出癌症。所有受试者均在就诊时通过心肌超声心动图进行筛检。还进行了例如SPECT灌注成像的基线测试。对每个受试者，利用心内膜针导管在其心肌梗塞边缘区部位注射十五(15)次1ml JVS-100。将对三组受试者(A、B、C)进行研究。如表2所示，通过增加每个注射部位的DNA数量来使剂量递增，同时保持注射部位数量为恒定的15且注射量为1ml。注射约18小时后对受试者进行监控，注射3天和7天后定期对其进行观察以确保无安全性问题。患者接受注射后要留院18小时以保证完成所有所需血液采集(即，心肌酶水平、血浆SDF-1蛋白水平)。在30天(1个月)、120天(4个月)和360天(12个月)对所有受试者进行后续跟踪以便评估安全性和心功能。主要安全性终点是治疗递送后一个月内出现主要不良心脏事件(MACE)。在整个研究阶段对每个受试者进行不良事件追踪。将测量以下安全性与疗效终点：

安全性：

·注射30天后主要不良心脏事件(MACE)数量

·12个月后续追踪期间的不良事件

·实验室血液分析(心肌酶、CBC、ANA)

·SDF-1血浆水平

·身体评估

·超声心动描记术

·AICD监测

·ECG

疗效：

·LVESV、LVEDV、LVEF和室壁运动记分指数基线变化

·NYHA心功能分级和生命质量基线变化

·SPECT显像确定的灌注基线变化

·6分钟步行试验距离基线变化

表2：临床给药计划

组	受试者数量	DNA量/部位	注射量/部位	注射部位数	DNA总剂量
						A组	4	0.33mg	1.0ml	15	5mg
B组	6	1.0mg	1.0ml	15	15mg

C组

6

2.0mg

1.0ml

15

30mg

基于临床前数据，递送JVS-100四个月后心功能和症状会得到改善，而且这种情况会持续到12个月。注射JVS-100四个月后，预计与基线值相比，6分钟步行距离会约大于30米，生命质量分数会提高约10％和/或NYHA心功能分级大约会提高一级。相似地，预计与基线值相比，LVESV、LVEF和/或WMSI有大约10％的相对改善。

实例6-对患有慢性心力衰竭的猪注射核苷酸序列为SEQ ID NO:6或ACL-01010Sk 的质粒后利用超声心动描记术对其心功能进行评估

目的

本研究旨在通过心肌膜导管对缺血性心力衰竭的猪模型递送核苷酸序列为SEQID NO:6和ACL-01010Sk的SDF-1质粒后，比较其心肌做出的功能性反应。

本研究比较了核苷酸序列为SEQ ID NO:6和ACL-01010Sk的质粒对猪缺血性心力衰竭模型在改善心功能方面的疗效。在本研究中，质粒通过心室内针注射导管进行递送。通过超声心动描记术测量所述疗法对心室重塑(即，左心室容积)和心功能(即，左心室射血分数(LVEF))的影响来评估疗效。

方法

简单地说，经90分钟球囊血管形成术形成LAD闭塞，使雄性约克夏猪患心肌梗塞。选择梗塞30天后经M型超声心动描记术测量的射血分数小于40％的猪。从三组猪中随机选择一组，采用心室内针注射导管递送系统向其注射磷酸盐缓冲盐水(PBS，对照组)、核苷酸序列为SEQ ID NO:6的质粒或溶于PBS的ACL-01010Sk(表3)。

表3：初步研究设计：针对猪慢性心力衰竭的SDF-1疗法

分别记录了注射前以及注射后第30天和第60天的超声心动图。下表4定义了本报告中涉及到的各变量。

表4：各变量的定义

变量名称	定义
		LVESV	在胸骨旁长轴位测量的收缩末期容积
LVEDV	在胸骨旁长轴位测量的舒张末期容积

LVEF	(LVEDV-LVESV)/LVEDV*100％

结果

下表5中给出了超声心动描记术核心实验室所报告的本报告(n＝9)中全部入选动物首次注射时(心肌梗塞30天后)的基线超声特征。

表5：基线特性

参数	第1组的基线值	第2组的基线值	第3组的基线值
				LVESV	78±18ml	67±2ml	86±31ml
LVEDV	132±30ml	114±11ml	130±36ml
				LVEF	41±1％	41±5％	34±10％

表5给出了首次注射后第0天和第30天的LVESV、LVEF和LVEDV。PBS动物对照组表明，该心力衰竭模型的LVESV和LVEDV增大，而LVEF未提高。与对照组相比，治疗组的心容积未降低，LVEF未增大。初始注射后第60天进行测量，也获得了类似结果。

实例7

对通过心肌梗塞猪模型中基于导管的经心内膜递送SDF-1来增加梗塞周围区干细胞归巢的策略进行了研究，以确定该策略是否能够改善左心室灌注和功能。该导管技术方法已经成功地用于人类血管生成生长因子的细胞移植和递送中。

选用了雌性德国长白猪(30kg)。经一晚上禁食后，对动物进行麻醉、插管。

使动物在仰卧位，在其股动脉中放置7F导鞘。将一个整体交换球囊送至LAD末梢。采用2个大气压对球囊充气，在1分钟内通过气囊导管将琼脂糖小球缓慢注射到LAD末梢。1分钟后，对球囊排气，采用血管造影术对左前降支末梢的闭塞进行记录。诱导形成心肌梗塞后，监测动物3-4h，直至其心律和血压稳定。移除动脉鞘，对动物肌内注射卡洛芬(4mg/kg)，然后摘除呼吸器。心肌梗塞形成2周后，对动物进行麻醉。使动物仰卧，采用一根8F股鞘对左心室进行电机械标测。获得左心室完整标测图后，通过注射导管分18次注射(100ml生理盐水中含5μg SDF-1)向梗塞区和梗塞周围区域递送人类SDF-1(新泽西州罗基希尔的派普泰克公司(Peprotec,Rocky-Hill,NJ))。采用每次注射量5μg，以针对报告的导管注射效率进行调整。只有当导管尖端与左心室室壁垂直，循环稳定性小于2mm并且注射针突起至心肌层内引发室性异位额外跳动时，才能进行缓慢注射，每次注射时间在20s以上。对于对照动物，采用假注射进行相同实验步骤。超声心动描记术不包括介入后的心包积液。

有二十(20)只动物完成了本研究方案：8只对照动物和12只SDF-1治疗的动物。由于技术问题，只能对6只对照动物进行心肌灌注显像评估。所有动物的梗塞位置均在前间壁。

采用四唑染色测定左心室梗塞面积比，对照组为8.9±2.6％，SDF-1治疗组为8.9±1.2％。两组的左心室肌容积类似(分别为83±14ml和95±10ml，p＝ns)。

免疫荧光染色分析显示，与对照动物相比，接受SDF-1治疗动物的梗死周围面积内明显存在更多vWF阳性血管(349±17/mm²比276±21/mm²，p<0.05)。与对照动物相比，接受SDF-1治疗动物的梗死周围面积经观察存在重度胶原损失(32±5％比61±6％，p<0.005)。梗死周围面积内，两组中炎性细胞(中性粒细胞和巨噬细胞)的数量类似(332±51/mm²比303±55/mm²，p＝ns)。全心肌灌注没有改变后续SPECT检测的基线数据，而且组间不存在差异。组间最终梗死面积类似，与四唑染色分析的结果一致。心肌灌注的分段分析显示，尖段和前间壁段的示踪剂摄取出现减少，在心肌区段间存在显著差异。然而，在基线和后续检测中发现的示踪剂摄取在对照动物和接受SDF-1治疗动物间几乎一致。两组间舒张末期容积和收缩末期容积不存在差异。然而，对照动物心搏量增加，而接受SDF-1治疗动物心搏量稍降低。两组间差异显著。

相似地，对照动物的射血分数增加，而接受SDF-1治疗动物的射血分数降低。两组间的差异表现出较强的趋势(p＝0.05)。局部收缩，心室机械功能的另一个参数，在对照动物中无变化。然而，接受SDF-1治疗动物的局部收缩显著减少，这使两组间产生了显著差异。组间及组内在单极电压上不存在显著差异。基线射血分数和搏出量与基线局部收缩之间存在显著关联(EF和LS：r＝0.71，SV和LS：r＝0.59)。后续分析的数值也得出了类似结果(EF和LS：r＝0.49，SV和LS：＝0.46)。局部收缩的变化与射血分数(r＝0.52)和搏出量(r＝0.46)的变化存在显著关联。但局部收缩和舒张末期容积之间(基线r＝-0.03，后续分析r＝0.12)，以及射血分数与舒张末期容积之间(基线r＝-0.04，后续分析r＝0.05)都不存在关联。EEM数据的分段分析显示前间壁段的单极电压和局部收缩减少，且各心肌区段在基线上存在显著差异。两组间各心肌区段单极电压值在基线和后续分析中的分布状况均类似。对照组的分段局部收缩未发生变化。然而，SDF-1治疗组的分段局部收缩减少，主要是由于左心室侧段和后段减少。另外，SDF-1的作用与后续分析和基线存在明显的交互作用。

上述研究证明，单独使用SDF-1蛋白不足以产生功能性强心作用。

实例8-后肢缺血大鼠模型中ACRX-100载体时相表达

目的

本研究旨在确定对后肢缺血啮齿动物模型进行直接肌内注射后，ACRX-100载体表达的持续时间。

方法

ACRX-100(批号：25637)由Aldevron LLC(北达科他州法戈(Fargo,ND))制造。将雄性Lewis大鼠麻醉，在其大腿内侧从腹股沟韧带纵向切开至膝关节，将股动脉暴露，然后结扎并移除。使动物恢复10天，然后麻醉，直接注射1.0、2.0或4mg/ml的ACL-01110L(带有荧光素酶cDNA的载体骨架)，沿后肢在4个部位注射，每个部位注射量为0.2ml。对于荧光素酶表达，通常在第1、2、3、8、10和14天使用Xenogen成像系统的冷却耦合装置相机对载体表达进行测量。使用2％异氟烷麻醉动物，然后腹腔内注射荧光素，注射浓度为125mg/kg动物体重。10分钟后，在1分钟的曝光时间内获得实时影像，从而确定荧光素酶表达的全身化学荧光状况。数据测定为总光通量(像素每秒)。

结果

与先前研究类似，CMV驱动的质粒ACL-01110L在第三天出现峰值表达(图11)。14天后观察到最低表达。

结论

缺血性大鼠后肢中的ACRX-100表达在第3天达到峰值，并持续表达至14天，这与大鼠心脏组织测量的表达模式以及以前发表的CMV启动子驱动的载体表达的研究一致。数据显示，在未来评估ACRX-100重复剂量疗效的研究中，2周的给药间隔是合理的。在使用裸质粒DNA驱动治疗药物基因表达(FGF、HGF、VEGF、HIF1)的基于CMV的载体治疗缺血性疾病的几个临床试验中，其所报告的给药方案也与上述给药间隔具有相关性。

实例9-兔后肢ACRX-100给药的体内特征

目的

本研究的目是在兔后肢肌肉直接注射后3天确定注射量效果、pDNA浓度和配方对ACRX-100pDNA表达的影响。

方法

麻醉体重在3.0-4.0kg的白色新西兰雄性兔，并注射荧光素酶质粒ACL-01110L。在其大腿内侧从腹股沟韧带纵向切开至膝关节，将股动脉暴露。以0.1ml每秒的注射率注射5％葡萄糖稀释的0.5-1.0ml质粒ACL-01110L四次或八次到各兔腿部内收肌(2次注射)、股薄肌(1次注射)和半腱肌(1次注射)中。根据图13，将注射分成6组。通过尼龙缝线对各注射部位进行标识以便于未来识别；然后将伤口缝合。采用压迫绷带将各兔后肢包裹约15分钟。注射后三天，处死动物，将包含注射部位的后肢肌肉切除，在荧光素(15mg/ml)中浸泡7分钟，使用IVIS Xenogen设备进行生物发光造影(图12)。一分钟曝光后，评估总光通量(像素每秒)。

结果

注射部位的宏观评估显示无炎症出现，所有动物在所有剂量下质粒DNA耐受良好。如图13所示，所有递送剂量下均观察到表达，其中表达随pDNA浓度的增加而增加。当浓度为2mg/ml且总DNA剂量为4mg时，表达趋于稳定(第4组-第6组)。较高的注射量或注射部位数目并没有提高表达，这说明pDNA浓度是充分肌细胞转染中的一项重要因素。

结论

本研究证明，注射后3天，ACRX-100载体的荧光素酶形式能够在兔后肢肌肉中表达足够用于检测的量的基因产物。此外，本研究还证明，兔后肢内的裸质粒DNA表达随pDNA浓度(最高至2mg/ml)而增加。本研究说明，在4-8个注射部位每次注射0.5-1.0ml 0.5-2.0mg/ml的pDNA应该能在兔后肢产生SDF-1。

实例10-ACRX-100的完整疗效、安全性和生物分布研究

此前在猪心力衰竭模型中进行直接导管介导心脏注射之后，在“GLP猪疗效、毒性和生物分布研究”中已经确定ACRX-100的疗效、安全性和生物分布(汇总于实例3中)。ACRX-100具有在缺血性猪心脏直接注射高达100mg剂量的可接受安全范围。这项研究被认为支持CLI的规划临床研究，但不模拟正在研究的具体临床适应症。

关于ACRX-100的疗效、安全性和生物分布，支持CLI患者1期临床试验的最终非临床评估采用后肢缺血的兔模型。该模型给出的实验环境模拟了CLI患者的计划1期临床试验。检验ACRX-100递增单剂量毒性和生物分布的安全性和疗效研究已经在兔HLI模型上进行，而且下文对此进行了概括。根据这些结果，我们建议在兔模型上对ACRX-100的重复剂量疗效、毒性和生物分布进行评估，这在临床前提交的6.3部分中概括。

兔HLI中ACRX-100的单剂量安全性和疗效

目的

本研究旨在评估后肢缺血兔模型使用单剂量试验制品ACRX-100后的疗效、安全性和生物分布。

方法

对新西兰白兔(n＝5/组；每组包括2-3雄兔/雌兔)进行单侧股动脉结扎，结扎后第十天对缺血性肢进行8次0.5ml剂量的直接肌内注射，注射药物为4、8或16mg的ACRX-100或4mg的对照(荧光素酶)质粒(表6)。

表6：HLI兔模型中ACRX-100的安全性和疗效研究设计

在注射后第60天对安全终点进行评估，评估范围涵盖后肢(注射部位)、对侧后肢、心脏、肺脏、肝脏、大脑、脾脏、淋巴结、肾脏和卵巢的组织病理学和生物分布。对组织切片，按指示对固定的苏木精和伊红染色的石蜡切片进行肉眼和显微镜检查。注射后60天对所有组进行临床病理学评估。与对照组相比，在治疗后30天和60天根据血管造影分数的变化百分率(％)对疗效进行测量。在注射后60天，切除腓肠肌并按重量差异进行评估。对第1组和第4组动物，进行肺脏、肝脏、脾脏、淋巴结、肾脏、大脑、睾丸和卵巢的生物分布评估。

结果

血管造影分析

在第0天(注射前)以及注射后30(±2)天和60(±2)天进行血管造影，并以数字格式记录(图14)。对缺血性肢体的侧支血管发育进行血管造影定量分析，分析采用网格直径为5mm的格网叠置片。按单盲模式计算出大腿内侧面上的网格交叉点总数以及对照不透明动脉交叉出的交叉点总数。用不透明动脉交叉出的交叉点数除以大腿内侧栅格交叉点总数计算各底片的血管造影分数。

疗效

血管造影数据结果发现给药当天所有动物的状况类似。在给药后60天期间，对照动物的血管密度出现减少趋势。注射载体的对照动物显示血流减少，与其相比，ACRX-100治疗动物在这两个时间点在1mg/mL(第2组)和2mg/mL(第3组)组中都显示血流得到改善。重要的是，低剂量组和中剂量组在第30天观察到改善，且中剂量组在第60天保持显著优势(p<0.05)(图15)。注射后60天，还观察到第4组(4mg/ml)动物得到改善。在猪心力衰竭研究中的5mg/ml动物上观察到血管发生增加的类似趋势。

病理

死亡率

除第1组动物(505)外，所有动物在计划尸检时均是存活的。在后续血管造影的30天中，动物505死亡。将动物送去尸检。死亡原因被认为与麻醉剂有关，而不是由于向动物施用测试制品造成的。

动物观察

许多动物的临床结果仅限于对伤疤区域和稀疏皮毛的观察。这些结果是在执行这些程序的动物中得到的一般观察结果。另外，在第2组的一只动物(510)中发现食欲不振、活动减少或粪便少甚至无粪便；在第4组的两只动物(519和520)中发现后肢出现自伤。观察到动物519和520自伤很可能是由于这些动物后肢受伤失去知觉而引起的。

整个研究期间，在受伤后的最开始3-4周，动物体重初始减轻。研究结束时，动物体重恢复到基线水平。认为体重减轻是多次手术的结果。

宏观观察

两种性别中都不存在与测试制品有关的宏观观察结果。极少的宏观观察结果被认为是偶然的且与治疗无关。

微观观察

在后肢正常区域、后肢缺血性区域的注射部位和非注射部位对侧肢，对几个骨肌切片进行检查。使用苏木精、伊红和马松三色染色对组织切片进行检查。缺血性区域采样的组织切片不定地且非一致地包含缺血面积。缺血区域的主要特征是：最小至中等的纤维化和最小至中等的新毛细血管形成(新血管形成)，至较小程度的亚急性/慢性炎症、出血和肌纤维退化/坏死及/或肌纤维再生。纤维化和新血管形成的区域通常沿肌肉的筋膜面。偶尔会观察到异物(缝合材料)，它们通常被细微肉芽肿炎性反应包围。还会观察到罕有肌纤维矿化。

其余的显微镜检查的组织(大脑、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、卵巢和脾脏)，不存在与测试制品有关的微观结果。极少其他的微观观察结果为兔的常见背景观察结果或为偶然，因此认为与治疗无关。

血液学和血凝

注射后60天治疗组内各性别的血液学和血凝参数不存在生物学相关差异。

临床化学

相对于LUC质粒对照1组，ACRX-100治疗的第2、3和4组的磷含量相继降低，无论是雄性(降低6％至36％)还是雌性(降低％7至30％)。相对于LUC质粒对照组，ACRX-100治疗第3组和第4组动物的钙含量轻微增加，无论是雄性(增加4％至7％)还是雌性(增加％7至9％)。钙和磷含量的所有均值和单个值始终在预期的病史对照范围内。这些变化都不是不良事件。为了更好地评估这些观察结果的准确性，我们将在6.3节中描述的重复剂量安全性与疗效研究中对这些数值进行评估。任一性别中均未观察到化学参数发生其他变化。

生物分布

在该兔CLI研究中，通过第1组(1mg/mL荧光素酶质粒)和第4组(4mg/mL ACRX-100)动物注射后60天时进行定量PCR，来评估生物分布情况。结果见下表7。如预期，所有对照组的组织中均未检测到ACRX-100载体。在高剂量组中，几乎都是在注射部位检测到ACRX-100，在非注射器官上仅检测到微量ACRX-100。注射60天后，在兔后肢上观察到的ACRX-100质粒DNA的清除率(表7)与在猪心力衰竭安全性研究中观察到的心脏注射部位的ACRX-100清除率一致(表3，图16)。另外，在兔CLI研究中持续水平更低，本研究中注射60天后检测到的最高拷贝数(133,360拷贝数/μg宿主DNA)低于心血管研究中注射90天时检测到的最高拷贝数(>1×10⁶拷贝数/μg宿主DNA)。这一数据表明ACRX-100正在从兔的注射器官和非注射器官清除出来，这与在猪心力衰竭研究中证实的情况类似，事实上，目前兔研究中所注射部位的持续性小于在猪心力衰竭模型中观察到的持续性。

表7：注射60天后HLI兔组织中的ACRX-100生物分布

结论

所有注射ACRX-100的动物组别都表明注射60天后，缺血后肢血流量增加。为动物注射1mg/mL(低剂量)或者2mg/mL(中剂量)单肌内剂量ACRX-100，结果显示注射30天和60天后，血流量提高，而对于注射载体的对照动物，其血流量减少。重要的是，经观察第30天情况得到改善，第60天得到显著改善(p<0.05)。这些数据与猪心力衰竭研究结果一致，其中，ACRX-100注射(0.5-5.0mg/mL)导致血管发生增加。我们的数据表明血管发生受每次注射递送的产品浓度影响显著，而与递送至目标组织的总ACRX-100量无关。这些结果显示，CLI患者可能受益于单剂量ACRX-100。

我们的数据显示，ACRX-100正在从兔的注射器官和非注射器官清除出来，这与猪心力衰竭研究中所证实的情况类似。因为ACRX-100的清除率与心血管的研究相同，所以我们认为猪心力衰竭安全性研究中的其他生物分布研究结果同样适用于CLI研究。也就是说，在研究结束时ACRX-100的表达最少，低于治疗量，而且同化可能性小于自发突变率。

实例11

ACRX-100建议重复剂量对兔后肢缺血模型的安全性与疗效研究

这项新提出的研究将评估ACRX-100重复剂量对实例10中所述兔后肢缺血模型的安全性与疗效。如下文所讨论的，若肌内注射3剂量ACRX-100，则对CLI患者最多可支持3种疗法。

ACRX-100重复剂量对兔HLI的安全性与疗效

目的

该项研究旨在确定ACRX-100重复剂量对兔后肢缺血模型的安全性与疗效。

基本原理

目前对严重肢体缺血进行的临床调查显示，所有非病毒基因疗法均通过重复剂量进行非病毒治疗(HGF、PDGF)，包括已证明对II期研究具有疗效的NV1FGF。迄今为止，临床前安全性与疗效研究证明，对心脏单剂量注射(20个注射部位)高达100mg，或对后肢单剂量注射(8个注射部位)高达16mg的ACRX-100都是安全的。因此，我们建议在0、2和4周时以重复剂量递送ACRX-100，作为对CLI患者1期试验的一部分。与单剂量相比，ACRX-100重复剂量还具有其他优势。受到损伤后，SDF-1受体CXCR4无限上调；但是，在发生急性缺血事件(图17)或注射后，SDF-1仅短暂性上调。受到损伤后，在多延迟时间点递送SDF-1利用了CXCR4表达在损伤组织内增强的局部表达，并增加了SDF-1表达部位的干细胞归巢。在CLI内，重复注射可协同增加缺血肢体内的血管发生、侧支血管生长和伤口愈合。对猪心脏注射100mg后观察得到的安全性表明，较低剂量给药方案具有相似的安全性结果。

为了对ACRX-100重复剂量对上述研究中所用的相同兔后肢缺血模型的临床前安全性与疗效进行评定，我们提出如下详述的方案。除注射量以外，重复剂量计划与I/II期试验中所提出的重复剂量组计划(如实例12所述)在各方面都相同。在兔内使用0.5mL，而非在人体内使用的1mL，这是由于与兔后肢相比，人类大腿/小腿中骨骼肌的面积更大。

方法

新西兰白兔(n＝5/组雄兔和雌兔)将会接受与上述实例10中相同的单侧股动脉结扎(第-10天)。结扎后10天(第0天)，每一动物将接受3剂量(间隔15天)1mg/mL对照荧光素酶质粒(第1组和第2组)或ACRX-100(第3组和第4组)，通过向缺血肢体直接肌内注射16次(每次0.5mL)进行递送(表8)。在最终注射后3天(第33天)和30天(第60天)，对安全性终点进行评估，包括组织病理学(严重和正常)、后肢生物分布(注射部位)、对侧后肢、心脏、肺、肝脏、大脑、脾脏、淋巴结、肾脏和卵巢。在各组织切片上，对固定苏木精的伊红染色的石蜡切片进行肉眼检查和显微镜检查。在后肢局部缺血前(第-10天)、每次给药前(第0、15和30天)、给药后3天(第3、18和33天)、最终给药后7天(第37天)以及最终给药后30天(第60天)或到处死为止，对各组进行临床化学和病理评估。每天进行两次笼侧观察；每周进行一次详细的临床检查。与第一次注射后30天(所有组)和60天(组2和4)的对照组相比，根据血管造影分数相对基线的变化百分比衡量疗效。

将从肺、肝脏、脾脏、淋巴结、肾脏、大脑、睾丸和卵巢中采集生物分布样品，并通过在下列两个处死时间点的qPCR进行评估：最终给药后3天(第33天)和最终给药后30天(第60天)。

在该研究中选择用ACRX-100首次治疗后60天的持续时间，以使疗效时间点与实例10中所报告的单剂量治疗研究一致。由于该时间点为最终给药后30天，因此预计生物分布结果将在注射部位具有ACRX-100拷贝(大约10³-10⁵拷贝数/μg宿主DNA)，而根据实例8中所报告心力衰竭猪的安全性与疗效研究结果具有有限数量ACRX-100拷贝(<10³拷贝数/μg宿主DNA)。提出的这项研究结果将在IND中报告。假设该项研究与猪心力衰竭安全性与疗效研究具有相似的安全性结果，则上述研究证明应在CLI患者中进行ACRX-100重复给药。

表8：提出的重复给药研究设计

实例12

提出的临床研究

发明人已经完成各项研究，表明ACRX-100在心力衰竭与CLI临床前模型中是安全有效的。这些已经完成并提出的临床前研究结果支持我们所提出的I/II期临床试验；上述试验评估了用ACRX-100治疗CLI患者的安全性与疗效。

结合66位患者，提出的I/II期研究将探讨利用ACRX-100治疗Rutherford 5级CLI患者的安全性与初始疗效。通过记录所有不良事件(AE)与计量标准血液实验室数值(例如：全血细胞计数、血浆SDF-1水平)在各组中监测安全性，其中主要安全性终点为入选后30天(第1组和第2组)或60天(第3、4和5组)主要AE的数目。

在研究的I期部分中(第1至4组)，患者将在大腿和小腿内接受8或16次ACRX-100注射，要么为单剂量给药(第1组和第2组)，要么为在4周内间隔一定时间重复给药(第3组和第4组)(表9)。剂量增加涉及注射数从8个注射(第1组)翻倍为16个注射(第2组)、从单剂量(第2组)变到3个重复给药时间间隔(第3组)以及每次给药注射数从8(第3组)翻倍至16(第4组)。假设重复给药比单剂量给药疗效更佳，则第3组和第4组将按照2：1随机接受治疗或安慰剂(5％葡萄糖注射液)，以检测初步疗效；而第1组和第2组将只接受活性药物。在所有组内，将在首次给药后12个月内通过评估下列终点进行疗效评价。1)大截肢术；2)伤口完全愈合的发生率；3)生存率；如下偏离基线的变化：4)溃疡愈合指数的变化率；5)经皮氧(TcPO2)；6)静息痛。

在试验的II期部分(第5组)，30位患者将按照2：1的比例随机接受ACRX-100(采用第3组或第4组中更有效的给药方案)或载体(5％葡萄糖溶液)(表9)。通过采用与I期相同的终点衡量安全性与疗效，其中主要疗效终点为无大截肢存活率。研究的I期与II期部分初期的所有剂量增加将只会发生在如下所述DSMC审查之后。

如果I/II期试验结果表明ACRX-100对改善CLI有效(DSMC推荐)，则在下列情况下可免费对最初随机分配到对照组中的患者提供ACRX-100治疗：

1.该患者完成试验后续计划。

2.现场主要研究者确定患者仍然可从治疗中获益。

如接受治疗，将按照(至少)涵盖所述安全终点的计划对患者进行跟踪。

表9：提出的I/II期临床给药方案

所有入选患者将接受CLI的正常护理标准，包括药物治疗(止痛药物)和伤口治疗(清创、使用抗生素控制感染等)(如有必要)。然而，根据入选/排除标准，由于入选患者必须为血管再生弱势对象，且必须在入选之前6周内未进行任何血管再生术，所以不能通过外科手术或介入技术治疗患者。他们为血管再生弱势对象的一个原因是，多动脉堵塞引起缺血，且所述动脉无法全部重新打开或分流。这使诸如ACRX-100的促血管生成疗法有吸引力，因为上述疗法有可能从遍及缺血腿部的血管处产生新血管；该新血管可大面积恢复血流，从而改善症状、肢体功能与疗效。

若不进行治疗，上述患者会预后不良。作为血管再生弱势对象的CLI患者(也称“不可重建疾病”患者)在6个月内截肢的可能性为40％。此外，他们一年的死亡率为25％；与无CLI患者相比，心血管死亡的风险会增加3到5倍。

提出的I/II期研究概要见表11。在多达15个临床中心，将有六十六(66)位患不愈合性溃疡(Rutherford 5级)的患者相继入选。各位患者将接受ACRX-100直接肌内注射，并在首次给药后12个月内随访。将利用27号针头递送ACRX-100，注射范围为膝盖以上的大腿与小腿。将收集安全性与疗效终点，如表11中所概述。在非盲部分(第1组和第2组)，将利用描述性统计比较各给药组的连续疗效变量。在适当的情况下，通过描述性统计收集和定性评估或定量概括安全参数。在该项研究的随机部分(第3至5组)，将通过与I期中相同的方法于入选后0、2和4周时在8或16个注射部位递送ACRX-100或载体对照。将对所有疗效变量进行比较各治疗组和对照组的统计，其中统计显著性限定为低于0.05的p值。

研究逻辑如下。入选之前，所有患者必须对参与该项研究签署知情同意书。在计划的首次注射ACRX-100之前，将会在2周内对患者进行筛选，并通过测试确定研究资格，包括ABI和Rutherford等级(表11)。在筛选期间，将进行进一步安全性测试(CMP、PT/PTT)，并确定疗效终点的基线值(TcPO2、生活质量和溃疡大小)。当受试者进入诊所准备进行注射时，将会考虑入选。在非盲部分(第1组和第2组)，连续前来就诊的患者将会入选，并且所有人将接受ACRX-100治疗。在随机部分(第3至5组)，各患者将被随机分配，并且临床中心在注射程序之前会告知随机性。所有患者在首次注射后1周、2周、4周、5周、3个月、6个月和12个月内将接受随访，以对安全性与疗效进行评定(表11)。在第1至4组，前三位患者中每一位的入选将间隔至少7天。在第1至4组中最后一名患者的最后一次给药后，各受试者接受ACRX-100给药后7天内所收集的所有安全性数据将由独立DSMC进行审查。DSMC将会负责安全监督、判决不良事件和审查任何满足停止规则的受试者数据。委员会将由医疗监听员(无投票权)和至少3位其他委员组成。在研究的I期部分以及II期研究初期，DSMC必须建议下次剂量的增加量。

在提交CLI IND之前，国家主要研究者和医疗监听员将制定一系列停止规则；满足规则时，将要求暂时停止试验入选，等待DSMC进行数据审查。

所提出的临床给药的正当理由

提出的临床剂量基于非临床单剂量安全性与疗效研究结果(见实例11)。如下表10所示，提出的人体起始剂量为1mg/mL DNA，每个注射部位1mL，共8mg。起始剂量基于兔单剂量安全性与疗效CLI研究结果。人体起始剂量与单剂量兔研究中有效剂量的浓度和注射数相同。此外，人体起始剂量为在单剂量兔研究中测试的DNA最大总剂量的一半(4mg/mL，8个部位各0.5mL，共16mg)。在I期研究中各部位的高注射量1.0mL，为非临床研究中注射量0.5mL的两倍，这是因为与兔后肢相比，人体下肢的肌肉重量大得多。

表10：ACRX-100的人体剂量与动物剂量

上文实例3中所述猪临床前GLP安全性与疗效心力衰竭研究数据也支持提出的CLI1期剂量。相比于心力衰竭猪的安全性研究中的100mg NOAEL，提出的1期CLI起始剂量8mg总DNA提供超过10倍的安全系数。1期CLI研究中所提出的ACRX-100最大量(16mg×3剂)小于按照心力衰竭猪的疗效与安全性研究中单剂量NOAEL规定的总DNA量(100mg)的一半。

最后，1期CLI试验中所采用的每次注射量(1ml)与猪心力衰竭研究和已发表的若干CLI临床研究中的注射量一致。

成功完成I/II期研究后，后续II期研究或具有关键作用的III期研究将设计用于证明ACRX-100在Rutherford 5级CLI患者目标人群中一次或多次给药的安全性与疗效。

根据本申请的上述说明，本领域的技术人员将会认识到各种改进、变更和修改。本领域技术内的此类改进、变更和修改旨在由所附权利要求书涵盖。本文所引用的所有专利、专利申请和出版物均全文以引用方式并入。

所公开的选定序列：

SEQ ID NO:1

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SEQ ID NO:2

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SEQ ID NO:3

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SEQ ID NO:4

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SEQ ID NO:5

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Claims (21)

1.一种SDF-1质粒，包括由SEQ ID NO:6的序列组成的多核苷酸。

2.一种制剂，包括根据权利要求1所述的SDF-1质粒和药学上可接受的载体。

3.根据权利要求2所述的制剂，其中所述制剂为可注射的。

4.根据权利要求3所述的可注射制剂，其中所述药学上可接受的载体为5％葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的可注射制剂，包括0.33mg/ml至5mg/ml所述SDF-1质粒。

6.根据权利要求5所述的可注射制剂，包括2mg/ml所述SDF-1质粒。

7.根据权利要求5所述的可注射制剂，包括1mg/ml所述SDF-1质粒。

8.根据权利要求2至7中任一项所述的制剂在制备用于治疗患者的缺血病症的药物中的用途，其中所述缺血病症是缺血性心肌病或严重肢体缺血。

9.根据权利要求8所述的用途，其中所述缺血病症为缺血性心肌病。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述治疗包括将所述SDF-1制剂向所述患者心脏的衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药。

11.根据权利要求10所述的用途，其中向所述患者心脏的所述衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药的SDF-1质粒的量大于4mg。

12.根据权利要求10或11所述的用途，其中通过直接注射将所述制剂向所述患者心脏的所述衰弱区域、缺血区域和/或梗塞周围区给药。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述制剂通过至少10次注射来给药，并且每次注射量为至少0.2ml。

14.根据权利要求13所述的用途，其中给药的所述制剂总量为至少10ml。

15.根据权利要求9所述的用途，其中所述制剂通过导管来给药。

16.根据权利要求15所述的用途，其中所述导管为心室内导管或心肌内导管。

17.根据权利要求8所述的用途，其中所述缺血病症为严重肢体缺血。

18.根据权利要求17所述的用途，其中通过直接肌内注射将所述制剂向所述患者的患肢给药。

19.根据权利要求18所述的用途，其中所述制剂通过5至20次注射来给药，并且每次注射量为至少1.0ml。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述给药的SDF-1质粒量为5至20mg。

21.根据权利要求18-20中任一项所述的用途，其中所述给药重复最多至三次，并且所述给药每次间隔两周时间。

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