KR20010093804A

KR20010093804A - 심근증 유전자 치료

Info

Publication number: KR20010093804A
Application number: KR1020017007014A
Authority: KR
Inventors: 모리시타류이치; 타니야마요시아키; 오기하라토시오
Original assignee: 무라야마 마사노리; 메드진 바이오사이언스 가부시키가이샤
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-10-05
Publication date: 2001-10-29
Also published as: US6989374B1; DE60038869D1; CN1293922C; AU775965B2; CN1337884A; WO2001026694A1; ATE395087T1; CN101085363A; EP1136083B1; EP1136083A1; EP1136083A4; CA2354029A1; JP3865632B2; CA2354029C; AU7556900A

Abstract

손상을 받은 심근내에, 센다이바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 HGF 유전자를, 에코 사용하에서 비침습적으로 투여함으로써, 심근층의 혈관신생 촉진과 선유화 억제를 꾀하고, 심기능을 회복시킬 수 있다.

Description

심근증 유전자 치료{Gene therapy for cardiomyopathy}

최근의 눈부신 의료기술 향상에도 불구하고 순환기영역에 있어서는, 아직 많은 문제가 미해결 상태로, 그 중 하나 중요한 과제로서, 심근장애의 문제를 들 수 있다.

심근장애란 심근의 기질적 및 기능적 이상에 기인하는 질환의 총칭으로, 예를 들면 심근증의 경우, 고혈압, 대사이상증, 허혈 등의 기초질환에서 속발하는 2차성 심근증과, 명확한 기초질환 없이 발증하는 돌발성 심근증(ICM)으로 분류된다. ICM 중, 유전자 레벨에서의 병인해명이 가장 진행되고 있는 것은 비대형심근증(HCM)이다. HCM에서는 환자의 반수 이상에서 상염색체성 우성 유전형식에 따르는 명확한 가족력이 인정된다. 이러한 다발가계를 대상으로 한 연쇄해석이 행해져, 지금까지 5개의 원인 유전자좌가 동정(同定)되어, 그 중 4좌에서는 원인 유전자 자체가 특정되어 있다.

또한, 확장형 심근증(DCM)의 증예(症例)의 대부분은 고발예(孤發例)이지만, 약 20%에는 가족력이 인정된다. 이러한 다발가계를 대상으로 한 연쇄해석으로부터, 7종의 원인 유전자좌(단, 원인 유전자는 불명)가 특정되어 있다.

그러나, 심근장애에 관해서는, 이와 같이 원인 유전자의 특정과 발증기구의 해명에 대한 연구가 행해지고 있는 상황으로, 유전자 치료를 위한 구체적인 움직임은 현재까지 행해지고 있지 않다.

한편으로, 최근 분자생물학의 비약적 향상에 의해, 유전자 도입법에 의한 세포기능의 부활화(賦活化)가 가능해져, 여러 혼성(incorporation)이 행해져 왔다. 특히, 심장으로의 유전자 도입법에 대해서는, 정맥내 주입법 (J.Clin.Invest.,90,626-630(l992)), 직접 주입법(Circulation,82,2217-2221(1990) , Circulation,90,2414-2424(1994)) 또는, 플라스미드를 그대로 사용하는 관동맥내 확산주입법(J.Thorac,Cardiovasc.Surg.,109,716-720(1995)) 등 몇 가지의 보고가 있기는 하지만, 비침습적이고 구체적인 치료법으로 이어지는 것은 아니었다.

본 발명은, HGF 유전자를 비침습적으로 투여하여 심근장애(myocardiopathy)를 치료하는 유전자치료법 및 그것에 사용하는 치료제에 관한 것이다. 구체적으로는, HGF 유전자를 심근내에 비침습적으로 투여함으로 된 심근장애 유전자 치료법, 특히, 에코 사용하에서 HGF 유전자를 장애 심근부위에 주입하여, 보다 효율적으로 심근증 등의 심질환 및 협심증, 심부전을 치료하는 심근장애 유전자 치료법 및 그것에 사용하는 치료제에 관한 것이다. 또한, HGF 유전자 이외의 다른 유전자에도 적용 가능한 유전자 치료법으로서, 에코 사용하에서 장애 조직부위에 비침습적으로 유전자를 투여함으로 된 유전자 치료법 및 그것에 사용하는 치료제에 관한 것이다.

본 발명은, 지금까지 유효한 치료법이 발견되지 않았던 심근장애의 비침습적인 치료법 및 그것에 사용하는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 즉 본 발명은, HGF 유전자를 비침습적으로 투여하여 심근장애를 치료하는 유전자 치료법 및 그것에 사용하는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로는, HGF 유전자를 심근내에 비침습적으로 투여함으로 된 심근장애 유전자 치료법, 특히, 에코 사용하에서 HGF 유전자를 장애 심근부위에 주입하여, 보다 효율적으로 심근증 등의 심질환 또는 협심증, 심부전을 치료하는 심근장애 유전자 치료법 및 그것에 사용하는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, HGF 유전자 이외의 다른 유전자에도 적용 가능한 유전자 치료법으로서, 에코 사용하에서 장애 조직부위에 비침습적으로 유전자를 투여함으로 된 유전자 치료법 및 그것에 사용하는 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자 등은 예의 검토한 결과, 유전자로서 HGF 유전자를 사용하여, 비침습적으로 직접 환부 심근층에 주입함으로써 유효한 효과가 얻어지는 것을 발견하였다. 즉 본 발명자 등은, 환부를 절개 혹은 개흉(開胸)하지 않고, 에코 사용하에서 시각적으로 환부 심근층에 HGF 유전자를 주입하는 것이 효과적인 것을 발견하였다.

상기 치료법은 비침습적인 치료법이기 때문에, 병의 상태에 따라 얼마든지 상기 유전자를 투여하는 것이 가능하며, 따라서 효과적인 심근장애의 치료를 행할 수 있다.

이와 같이, 본 발명자 등은 에코 사용하에 시각적으로 직접 환부조직에 유전자를 투여함으로써 효과적인 치료를 행할 수 있음을 처음으로 발견한 것으로, 각종 장기 특이적인 질환의 유전자 치료가 본 발명의 방법으로 가능함을 명백히했다.

예를 들면, HGF 유전자를 사용하는 경우, 본 발명의 방법에 의해, 각종 장기특이적인 질환, 예를 들면 폐선유증 또는, 간경변, 간선유증 등의 치료를 행하는 것도 가능하다. 또한, HGF 유전자 이외의 다른 유전자 치료용 유전자도, 상기 본 발명의 방법에 의해 효과적인 치료를 행할 수 있다.

즉, 본 발명의 요지는 이하와 같다.

(1) HGF 유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 비침습적 투여를 위한 심근장애 치료제,

(2) 상기(1)에 있어서, HGF 유전자를 심근내에 투여하기 위한 치료제,

(3) 상기(1) 또는 (2)에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 치료제,

(4) 상기(2) 또는 (3)에 있어서, 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 투여하기 위한 치료제,

(5) 상기(1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 적어도 각 주 1회로 8회 투여하기 위한 치료제,

(6) 상기(1) 내지 (5) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자로서 적어도 10 ㎍을 사용하는 치료제,

(7) 상기(1) 내지 (6) 중 어느 하나에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는 심부전인 치료제,

(8) 장애의 치료에 유효한 유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 에코 사용하에서 장애 조직부위에 상기 유전자를 비침습적으로 투여하기 위한 유전자 치료제,

(9) 상기(8)에 있어서, 조직 장애부위가 심근인 치료제,

(10) 상기(8) 또는 (9)에 있어서, 유전자가 HGF 유전자인 치료제,

(11) HGF 유전자를 비침습적으로 인간을 포함한 포유동물의 심근내에 투여하는 것을 포함하는 심근장애 유전자 치료법,

(12) 상기(11)에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 치료법,

(13) 상기(11) 또는 (12)에 있어서, HGF 유전자를, 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 투여하는 치료법,

(14) 상기(11) 내지 (13) 중 어느 하나에 있어서, HGF 유전자를 적어도 각 주 1회로 8회 투여하는 치료법,

(15) 상기(11) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는 심부전인 치료법,

(16) 에코 사용하에서 장애 조직부위에 비침습적으로 장애 치료에 유효한 유전자를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료법,

(17) 상기(16)에 있어서, 장애조직이 심근인 치료법,

(18) 상기(16) 또는 (17)에 있어서, 유전자가 HGF 유전자인 치료법,

(19) 비침습적 투여용 심근장애 치료제의 제조를 위한 HGF 유전자의 사용,

(20) 상기(19)에 있어서, HGF 유전자가 센다이 ·바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 사용,

(21) 상기(19) 또는 (20)에 있어서, 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 HGF 유전자를 투여하기 위한 치료제인 사용,

(22) 상기(19) 내지 (21) 중 어느 하나에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는 심부전인 사용,

(23) 에코 사용하에서 장애조직 부위에 비침습적으로 장애 치료에 유효한 유전자를 투여하기 위한 유전자 치료제 제조를 위한 유전자의 사용,

(24) 상기(23)에 있어서, 장애조직이 심근인 사용,

(25) 상기(23) 또는 (24)에 있어서, 유전자가 HGF 유전자인 사용.

도면의 간단한 설명

도1은, 심근증 햄스터의 심장에 HVJ를 사용하여 리포터유전자인 루시페라아제를 도입하여, 루시페라아제 활성값이 높은 값을 나타냄으로써, 에코 사용하에서 유전자도입이 가능함이 증명된 결과를 나타내는 그래프이다.

도2는, 심장에 있어서의 모세혈관 밀도를 ALP 염색으로 측정하여, HGF 유전자와 대조군을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도3은, 심장의 혈류량을 레이저 ·도플러 ·이메져(laser Doppler imager:LDI)스코어로 평가하여, HGF 유전자군과 대조군, 비처리군을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도4는, 심근에 있어서의 선유화(線維化)의 분포밀도를 매손(Masson)염색으로 측정하여, HGF 유전자와 대조군을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 발명에서 사용되는 HGF 유전자란, HGF를 발현할 수 있는 유전자를 말하며, 해당 유전자에는, 발현되는 폴리펩티드가 HGF와 실질적으로 동일한 효과를 갖는 한, 그 유전자 배열의 일부가 결실 또는 다른 염기에 의해 치환되어 있거나, 다른 염기배열이 일부 삽입되어 있거나, 5'말단 및/또는 3'말단에 염기가 결합한 것과 같은 유전자도 포함된다. 이러한 유전자로서는, 예를 들면 Nature,342,44O(1989),특허제2777678호 공보,Biochem.Biophys.Res.Commun.,163,967 (l989),Biochem.Biophys.Res.Commum,172,321(1990) 등에 기재의 HGF 유전자가 예시되고, 이들 유전자를 본 발명에서 사용할 수 있다.

여기서 HGF 유전자(HCF를 코드화 하는 cDNA)의 염기서열은, 상기 문헌에 기재되어 있는 것 이외에, Genbank 등의 데이터 베이스에도 등록되어 있다. 따라서 이들 서열정보를 토대로 적당한 DNA 부분을 PCR의 프라이머로서 사용하여, 예를 들면 간장이나 백혈구 유래의 mRMA에 대하여 RT-FCR 반응을 행하는 것 등에 의해, HGF의 cDNA를 클로닝할 수 있다. 이들 클로닝은, 예를들어, Molecular Cloning 2nd Edt., Co1d Spring Harbor Laboratory Press(1989) 등의 기본서에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있다. 또한 HGF 유전자의 개변 등도, 상기 기본서에 따라 당업자라면 용이하게 행할 수 있다.

이어서, 본 발명의 유전자 치료에 있어서 사용되는 유전자 도입방법, 도입형태 및 도입량 등에 대해 기술한다.

HGF 유전자를 유효 성분으로 하는 유전자 치료제를 환자에게 투여하는 경우, 그 투여형태로서는 비 바이러스 벡터를 사용하는 경우와, 바이러스 벡터를 사용하는 경우의 둘로 크게 나뉘고, 실험안내서 등에 그 조제법, 투여법이 자세히 해설되어 있다(별책 실험의학, 유전자 치료의 기초기술, 요도샤, 1996, 별책 실험의학, 유전자 도입&발현해석 실험법, 요도샤, 1997, 일본 유전자 치료학회편 유전자 치료개발 핸드북, N ·T ·S, 1999). 이하, 구체적으로 설명한다.

A. 비 바이러스 벡터를 사용하는 경우

관용의 유전자 발현벡터에 목적으로 하는 유전자가 삽입된 재조합 발현벡터를 사용하여, 이하와 같은 수법에 의해 목적 유전자를 세포나 조직에 도입할 수 있다.

세포로의 유전자 도입법으로서는, 리포펙션법(lipofection method), 인산-칼슘공침법, DEAE-덱스트란법, 미소유리관(micro glass tubes)을 사용한 DNA의 직접 주입법 등을 들 수 있다.

또한, 조직으로의 유전자 도입법으로서는, 내포형 리포솜(internal type liposome)에 의한 유전자 도입법, 정전기형 리포솜(electrostatic type liposome)에 의한 유전자 도입법, HVJ-리포솜법, 개량형 HVJ-리포솜법(HVJ-AVE 리포솜법), 리셉터 개재성 유전자 도입법, 입자총(particle gun)으로 담체(금속입자)와 함께 DNA 분자를 세포에 이입하는 방법, naked-DNA의 직접 도입법, 정전하 중합체에 의한 도입법 등 그 중 어느 하나의 방법에 제공함으로써, 재조합 발현벡터를 세포내에 함입시키는 것이 가능하다.

이 중 HVJ-리포솜은, 지질2중막으로 만들어진 리포솜 속에 DNA를 봉입하고, 또한 이 리포솜과 불활화한 센다이바이러스(Hemagglutinating virus of Japan :HVJ)를 더 융합시킨 것이다. 해당 HVJ-리포솜법은 종래의 리포솜법과 비교하여, 세포막과의 융합활성이 매우 높은 것을 특징으로 하는 것으로, 바람직한 도입형태이다. HVJ-리포솜의 조제법에 대해서는 문헌(실험의학 별책, 유전자 치료의 기초기술, 요도샤, 1996, 유전자 도입&발현해석 실험법, 요도샤, 1997, J.Clin.Invest.93,1458-1464(1994), Am.J.Physiol.271,R1212-1220(1996)) 등에 자세히 기술되어 있기 때문에, 그것들을 참조하기 바란다. 또한 HVJ 리포솜법이란, 예를 들면 Molecular Medicine,30,1440-1448(l993), 실험의학, 12,1822-1826 (1994), 단백질 ·핵산 ·효소, 42,1806-18l3(1997) 등에 기재한 방법으로, 바람직하게는 Circulation,92(Suppl.II),479-482(1995)에 기재한 방법을 들 수 있다.

또한, HVJ로서는 Z주(ATCC로부터 입수 가능)가 바람직하지만, 기본적으로는 다른 HVJ주(예를 들면 ATCC VR-907이나 ATCC VR-105 등)도 사용할 수 있다.

더욱이, naked-DNA의 직접 도입법은, 상기 수법 중 가장 간편한 수법으로, 이 관점에서 바람직한 도입법이다.

여기서 사용되는 발현벡터로서는, 생체내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터라면 어떤 발현벡터이더라도 좋지만, 예를 들면 pCAGGS(Gene 108,193-200(1991))나, pBK-CMV, pcDNA3.1, pZeoSV(인비트로겐사, 스트라타진사) 등의 발현벡터를 들 수 있다.

B. 바이러스 벡터를 사용하는 경우

바이러스 벡터로서는, 재조합 아데노바이러스, 레트로바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용하는 방법이 대표적인 것이다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 무독화한 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노수반 바이러스(adeno-associated virs), 헤르페스 바이러스(herpes virus), 백신 바이러스(vaccinia virus), 폭스바이러스(poxvirus), 폴리오바이러스(poliovirus), 신드비스 바이러스(Sindbis virus), 센다이 바이러스(sendai virus), SV40, 면역부전증 바이러스(HIV) 등의 DNA 바이러스 또는 RNA 바이러스에 목적으로 하는 유전자를 도입하여, 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 세포내에 유전자를 도입하는 것이 가능하다.

상기 바이러스 벡터 중, 아데노바이러스의 감염효율이 다른 바이러스 벡터를 사용한 경우 보다도 훨씬 높은 것이 알려져 있고, 이 관점에서는, 아데노바이러스 벡터계를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 유전자 치료제의 환자로의 도입법으로서는, 유전자 치료제를 직접 체내에 도입하는 in vivo법 및 인간으로부터 어떤 종류의 세포를 떼어 내어 체외에서 유전자 치료제를 상기 세포에 도입하여, 그 세포를 체내로 되돌리는 ex vivo법이 있다(닛케이 사이언스, 1994년 4월호, 20-45페이지, 월간약사, 36(1),. 23-48(1994), 실험의학 증간, 12(15),(1994), 일본 유전자치료 학회편 유전자 치료 개발연구 핸드북, N ·T ·S, l999). 본 발명에서는, in vivo법이 바람직하다.

제제형태로서는, 상기의 각 투여형태에 맞는 여러 제제형태(예를 들면 액제 등)를 취할 수 있다. 유효 성분인 유전자를 함유하는 주사제로 된 경우, 해당 주사제는 일반적인 방법에 의해 조제할 수 있으며, 예를 들면, 적절한 용제(PBS 등의 완충액, 생리식염수, 멸균수 등)에 용해한 후, 필요에 따라 필터 등으로 여과멸균하고, 이어서 무균적인 용기에 충전함으로써 조제할 수 있다. 해당 주사제에는 필요에 따라 관용의 담체 등을 가하더라도 좋다. 또한, HVJ-리포솜 등의 리포솜에 있어서는, 현탁제, 동결제, 원심분리 농축동결제 등의 리포솜 제제의 형태로 할 수 있다.

본 발명에서 도입되는 HGF 유전자 이외에, 내인성 심근 보호인자나 심근세포에 있어서의 재생인자를 병용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 심근세포 장애시에 고도로 발현되는 TGF-β나 열쇼크 단백(HSP) 등의 인자는, 심근장애를 경감하여 심근수복에 관여하는 것이 보고되어 있기 때문에, 이들 유전자를 사용할 수도 있다. 또한, EGF 등의 증식인자는, 조직의 여러 세포장애를 수복하는 것이 보고되어 있어, 이들 유전자를 사용하는 것도 가능하다. 더 나아가서는, 이들 심근 보호인자나 재생인자 이외에도, 심근보호나 재생에 관여하는 인자도 사용할 수 있다.

본 발명에서는, 이와 같이 HGF 유전자를 단독으로 또는 다른 유전자와 조합시켜 심장의 심근세포에 도입하고, 고도로 발현시켜, 손상을 받은 심근세포 등에 필요한 목적 단백을 공급할 수 있다. 그리고 이것에 의해, 손상을 받은 심근세포 등의 부활화를 꾀하여 심근세포 등을 수복 재생시켜, 심근장애에 빠진 심기능의 회복정상화를 가능하게 한다. 따라서 본 발명의 유전자 치료제는, 중증의 심근증 환자에게 적용이 가능하고, 심장이식 이외에는 치료의 수단이 없는 환자의 구제도 가능해졌다.

또한, 본 발명의 치료제는, 중증의 심근증 환자 뿐만 아니라, 진행중인 경도의 심근증 환자에게도 사용할 수 있다. 또한, 협심증이나 심부전 등의 심근장애 환자에게도 사용할 수 있다.

본 발명의 유전자 치료제는, 치료목적의 질환, 증상 등에 따른 적당한 투여방법·투여부위가 선택된다. 투여부위로서는, 심근내(장애 심근부위)로의 투여가 바람직하다. 또한 투여방법으로서는, 비경구적으로 투여하는 것이 바람직하다.

비경구적인 투여방법의 바람직한 것으로서, 예를 들면, 비침습적인 카테테르 또는 비침습적인 주사기 등에 의한 투여방법을 들 수 있다. 더욱 바람직하게는, 에코 사용하에서의 비침습적인 카테테르 또는 주사기 등에 의한 투여방법을 들 수 있다. 비침습적인 카테테르를 사용하는 투여방법으로서는, 예를 들면, 심근내에 직접 HGF 유전자를 주입하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 치료제 투여량으로서는, 환자의 증상 등에 따라 다르지만, HGF 유전자로서 성인 환자당 O.OOOl mg∼1OO mg, 바람직하게는 O.OO1∼lO mg 정도의 투여량을 들 수 있다.

또한 HVJ-리포솜의 형태를 취하는 경우는, HGF 유전자로서 성인 환자당 약 l∼4000 ㎍의 범위, 바람직하게는 약 l0∼400 ㎍의 범위에서 투여량이 선택된다.

본 발명의 치료제는, 수일 내지 수주간에 1회 투여하는 것이 적합하고, 바람직하게는 각 주 l회의 투여를 들 수 있다.

투여횟수는 환자의 증상에 따라 적절히 선택된다. 치료목적에 따라서 복수회가 적합하고, 바람직하게는 8회 투여하는 것을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 에코 사용하에서 장애 조직부위에 장애의 치료에 유효한 유전자를 비침습적으로 투여하는 것을 포함하는, 신규한 유전자 치료법 및그것에 사용하는 치료제도 제공된다. 즉, 본 발명에 있어서는, 에코 사용하에서 시각적으로 직접 환부조직에 유전자를 투여함으로써, 효과적인 치료를 행할 수 있는 것을 처음으로 발견했다. 해당 치료법에서는, 유전자를 비침습적으로 투여하기 때문에, 병의 상태에 따라 목적으로 하는 유전자를 여러번 투여하는 것이 가능하다고 하는, 종래에 없는 이점을 갖는다. 이러한 본 발명의 유전자 치료법은, HGF 유전자에 한정되지 않고, 유전자 치료용의 모든 유전자에 적용 가능하다. 상기 유전자 치료법은, 특히, 장애 심근부위에 대해 적용된 경우에 효과적이다. 그 때에 투여되는 유전자로서는, HGF 유전자나 TGF-β유전자, HSP 유전자, VEGF 유전자, FGF 유전자, EGF 유전자 등을 들 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 조금도 한정되지는 않는다.

실험재료 및 방법

실험동물

심근증 햄스터(Bio14.6)는 오리엔탈효모로부터 구입했다.

HGF 유전자

인간 HGF 유전자는, 인간의 HGF cDNA(특허 제2777678호)를 일반적인 방법에 의해 클로닝하여, 이것을 발현벡터 pcDNA(인비트로겐사제)에 삽입한 것을 사용했다.

실험방법

1. 에코 사용하에서 심근증 햄스터의 심장에 HVJ 리포솜을 사용하여 리포터유전자인 루시페라아제를 도입하여, 일주일 후에 그 활성을 조사했다. 대조군은 PBS 만을 에코 사용하에서 도입했다. 루시페라아제 활성을 루미노미터(LamatLB95O7(BERTHOLO사))로 측정했다.

2. 에코카르디오그램(echocardiogram)(MD500, YOKOKAWA-GE)의 조작하, 심근증 햄스터(12주 연령)의 심장 복부측 심근에 HVJ-리포솜제제를 주입하여, 이하 l)∼3)의 검토를 행했다.

l) 심근내의 모세혈관 밀도를 ALP 염색으로 측정하여, HGF 유전자와 대조군의 경우를 비교했다.

2) HVJ-리포솜제제가 투여된 심장의 혈류량을, 레이저 ·도플러 ·이메져(LDI) 스코어로 평가하여, HCF 유전자와 대조군의 경우를 비교했다.

3) 심근의 매손(Masson)염색을 행하여, 컴퓨터 해석에 의해 선유화의 분포밀도를 측정하여, HGF 유전자와 대조군의 경우를 비교했다.

참조예 1

HVJ 리포솜제제의 제작

10 mg의 건조지질(포스파티딜세린, 포스파티딜콜린, 콜레스테롤의 1:4, 8:2의 혼합물)과, HGF 유전자(100 ㎍) -HMGl(high mobility group 1 nuclear protein, 25 ㎍)을 함유하는 등장액(137 μM NaC1, 5.4 μM KCl, 10 μM Tris-HC1; pH7.6) 200 ㎕를 혼합하여, 격하게 교반하고 초음파를 투과시켜 리포솜을 형성시켰다. 정제 센다이바이러스(Z주)를 3분간 UV 조사(110erg/㎟/sec)했다. 리포솜 현탁액과 센다이바이러스(HVJ)를 혼합하여 4℃에서 10분간, 이어서 37℃에서 30분간 가온했다. 유리(遊離)의 HVJ를 제거하여, HVJ 리포솜제제를 취득했다.

참고예 2

루시페라아제 활성의 측정

햄스터(1군 6마리)에 루시페라아제 유전자 10 ㎍의 리포솜제제를 투여하여, 일주일 후에 루시페라아제 활성을 측정했다. 결과를 도1에 나타낸다.

도1에 나타내어지는 바와 같이, 심장에 있어서의 루시페라아제는 높은 값을 나타내, 에코 사용하에서 유전자 도입이 가능함이 증명되었다.

실시예 1

심근증 햄스터의 HGF 유전자에 의한 치료

12주 연령의 심근증 햄스터(1군 6마리)의 심장 복부측 심근에 리포솜제제를 주입했다. 대조군으로서는, 대조군 벡터가 들어간 리포솜제제를 동일하게 12주 연령의 심근증 햄스터(1군 6마리)에 주입한 군을 설치하고, 미처리군으로서 무처치의 심근증 햄스터(1군 6마리)를 얻었다. 그 후, 각 주에 리포솜제제를 총 8회 주입했다. 8주 후, 20주 연령의 심근증 햄스터의 심장 심근내의 모세혈관 밀도를 ALP 염색으로 측정하여, 혈류량을 LDI 스코어로 평가했다. 또한, 햄스터를 안락사시킨 후, 심장을 적출하여 매손(Masson)염색 후에, 컴퓨터에 의한 해석으로 선유화의 분포밀도를 측정했다.

ALP 염색에 의해, HGF 유전자 치료군에서는 현저히 혈관신생에 의한 모세관 밀도의 상승이 보였다. 이 결과를 도2에 나타낸다.

LDI 스코어는, 대조군을 100%로 하자, HGF 유전자 치료군에서는 163 ±7%으로, 현저히 혈류량이 증대되어 있었다. 이 결과를 도3에 나타낸다.

매손(Masson)염색의 해석에서는, HGF 유전자 치료군에서 현저한 선유화 분포밀도의 감소가 보였다. 이 결과를 도4에 나타낸다.

본 발명의 HGF 유전자를 유효 성분으로 하는 심근장애 치료제는, 환부심근의 혈관신생을 재촉하여, 환부의 혈류량을 증대시킴과 동시에, 심근의 섬유화를 억제, 경감시켜, 심기능을 회복시킬 수 있다. 또한 본 발명의 치료제는, 에코 사용하에 시각적으로 환부심근층에, 비침습적이고 또한 정확하게 주입할 수 있다. 따라서 이들 효과에 의해, 본 발명의 치료제는 심근장애를 보다 효과적으로 치료할 수 있는 것이다.

Claims

간 실질세포 증식인자(HGF) 유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 비침습적 투여를 위한 심근장애 치료제.
제1항에 있어서, HCF 유전자를 심근내에 투여하기 위한 치료제.
제1항 또는 제2항에 있어서, HGF 유전자가 센다이바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 치료제.
제2항 또는 제3항에 있어서, 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 투여하기 위한 치료제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 각 주 l회 이상으로 8회 투여하기 위한 치료제.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자로서 10 ㎍ 이상을 사용하는 치료제.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는심부전인 치료제.
장애의 치료에 유효한 유전자를 유효 성분으로서 함유하는, 에코 사용하에서 장애 조직부위에 상기 유전자를 비침습적으로 투여하기 위한 유전자 치료제.
제8항에 있어서, 조직 장애부위가 심근인 치료제.
제8항 또는 제9항에 있어서, 유전자가 HGF 유전자인 치료제.
HGF 유전자를 비침습적으로 인간을 포함한 포유동물의 심근내에 투여하는 것을 포함하는, 심근장애의 유전자 치료법.
제11항에 있어서, HGF 유전자가 센다이바이러스(HVJ)-리포솜의 형태에 있는 치료법.
제11항 또는 제12항에 있어서, HGF 유전자를 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 투여하는 치료법.
제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, HGF 유전자를 각 주 l회 이상 8회 투여하는 치료법.
제11항 내지 제14항 중의 어느 한 항에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는 심부전인 치료법.
에코 사용하에서 장애 조직부위에 비침습적으로 장애 치료에 유효한 유전자를 투여하는 것을 포함하는 유전자 치료법.
제16항에 있어서, 장애조직이 심근인 치료법.
제16항 또는 제17항에 있어서, 유전자가 HGF 유전자인 치료법.
비침습적 투여용 심근장애 치료제의 제조를 위한 HGF 유전자의 사용.
제19항에 있어서, HGF 유전자가 센다이바이러스(HVJ)-리포솜의 형태인 사용.
제19항 또는 제20에 있어서, 에코 사용하에서 장애 심근부위에 비침습적으로 HGF 유전자를 투여하기 위한 치료제인 사용.
제19항 내지 제21항의 어느 한 항에 있어서, 심근장애가 심근증, 협심증 또는 심부전인 사용.
에코 사용하에서 장애 조직부위에 비침습적으로 장애 치료에 유효한 유전자를 투여하기 위한 유전자 치료제 제조를 위한 유전자의 사용.
제23항에 있어서, 장애조직이 심근인 사용.
제23항 또는 제24항에 있어서. 유전자가 HGF 유전자인 사용.