WO2004089400A1

WO2004089400A1 - 心筋症治療剤

Info

Publication number: WO2004089400A1
Application number: PCT/JP2003/004164
Authority: WO
Inventors: Yasuhiko Tabata; Masashi Komeda
Original assignee: Yasuhiko Tabata; Masashi Komeda
Priority date: 2003-04-01
Filing date: 2003-04-01
Publication date: 2004-10-21
Also published as: US20070010436A1; AU2003221120A1; US20090022802A1

Abstract

　心筋症の治療に有用な組成物を提供する。　ＨＧＦ及びゼラチンヒドロゲルを含み、ＨＧＦが徐放される、心筋症治療剤。

Description

明細書

心筋症治療剤技術分野

本発明は、 HGF及びゼラチンヒドロゲルを含み、 HGFが徐放される、心筋症治療剤に関する。背景技術

HGF (hepatcyte growth factor：肝細胞増殖因子）は、 1 984年に中村らにより、成熟ラット初代培養肝細胞に対する増殖因子として肝再生中のラット血液から部分精製された増殖因子であり、その遺伝子はクローニングされている (Biochem Biophys Res Co匪 un， 122, 1450(1984) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 83, 6489 (1986) FEBSLetter, 22, 311 (1987) 、 Nature, 342, 440 (1989) 、 Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 87,3200 (1990))。

その後の研究によって、 HGFは、インビトロ（in vitro) において肝再生因子として障害肝の修復再生に働く増殖促進作用だけでなく、さまざまな標的細胞に対する遊走^進、形態形成誘導、抗アポトーシスなどの極めて多岐にわたる性質を有すること、それによつて臓器 ·組織の再生'維持因子として重要な役割を果たしていること、さらに、心臓に関しては、血管新生の促進、再還流傷害の防止、線維化の抑制などの心血管保護作用を有していること、それによつて虚血性疾患や動脈疾患の治療または予防に大きな役割を果たしていることが明らかとなってきた（Symp. .Soc. Exp. BioL., 47, cell behavior, 227-234 (1993), Proc. Natl. Acad. Sci, USA. , 90, 1937-1941 (1993) , Circulation, 97, 381- 390 (1998)) 。

このように HGFは、血管新生作用を始めとする種々の機能を有している。そのため HGFを医薬品として活用するために色々な試みがなされてきた。

しかし、 HGFの血中における半減期は数分から 1 0分と短いことから、その血中濃度を維持することは困難であり、また、患部への HGF移行が十分でないという問題であった。したがって、 HGFを単に水溶液の形で投与すると、投与部位から急速に拡散され、その後排泄されてしまい、 H G Fの十分な生理活性効果を得ることは難しかった。

H G Fの遺伝子を用いる心筋症の治療法も開発されている。この治療法は、遺伝子を主に筋肉内に投与し、筋肉内の細胞に遺伝子を取り込ませ、それによつて遺伝子導入細胞から導入遺伝子の発現産生物であるタンパク質を分泌させるものである。この方法の特徴は、細胞を用いる徐放化、すなわち、血管新生誘導因子の徐放化を細胞に行わせる点にある。しかしながら、その遺伝子発現効率は、低く、さらに、遺伝子発現のレベルや期間などを制御することができないという欠点がある。また、遺伝子が導入されたことによる未知の作用発現も未だ解決されていない問題である。

要するに、上記のような問題点を解決するポイントは、血管新生誘導因子の徐放化にある。遺伝子を用いて細胞から細胞増殖因子を分泌させ、その徐放効果を得ようとする理由は、血管新生誘導因子を水溶液の形態で投与した場合には、血管新生誘導因子の作用発現は、全く認められないこと、及び、血管新生誘導因子自身を徐放化することができないことにある。

しかし、本発明のように、細胞増殖因子を徐放化することができれば、遺伝子を用いる方法を選択する意味はなく、上記のような問点を解決することができる。

インビポ（in vivo) における有効性を高めることができる唯一の方法は、ポリマー担体に H G Fを含浸させ、長時間にわたる H G Fの徐放を可能にすることである。近年、種々の担体マトリックスと併用した場合には、塩基性線維芽細胞増殖因子、骨誘導タンパク質および形質転換増殖因子などいくつかの増殖因子が、 in vivo において予測される生理活性を示すことがいくつかの試験で示された ( Downs, E · C · et al .， 1992、 Miyamoto et al . , 1992 Gombotx, W. R. et al .， 1993)。しかし、 in vivo における H G Fの徐放に関する報告は全くない。生理的に過剰な用量で H G F溶液を注射すると、予測される生理作用を誘導することができるという研究結果がいくつかあるのみである。

また、実験動物においては、 H G Fが、アンギオテンシン I I のブロックを介して心筋の線維化を抑制すること (Taniyama T. et al .， Ci rculat i on (2000) 102: 246-252)、これとは反対に、心不全患者における H G F産生の障害を、ァンギオテンシン変換酵素阻害剤の投与によって解消することができることも知られている (Yasuda S. et al.， Hyper tens ion(1999) 33: 1374-1378) ₀

一方、拡張型心筋症は、心筋の線維化とそれに伴う心筋細胞の変性 (肥大、萎縮）を特徴とする難治性の疾患であるが、現在まで有効な処置法は見つかつていない。

本発明者らは、拡張型心筋症の処置剤について、鋭意検討を行ったところ、驚くべきことに、田畑らの開発したゼラチンハイドロゲルを用いた; HGF徐放性製剤による処置が、拡張型心筋症モデルラットの心臓疾患に対する顕著な治療的効果を有することを見出し、本発明を完成させたものである。発明の開示

本発明の目的は、 HGF及びゼラチンヒドロゲルを含み、 HGFが徐放される、心筋症治療剤を提供することにある。

本発明で使用されるゼラチンとは、以下の物性：

(1) コラーゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、

( 2 ) 分子量が、 SDS— PAGEの非還元条件下で約 1 0〜約 20万ダルトンであり、

(3) 水溶液中のジ一タ電位が、約一 1 5〜約一 2 OmVである

を有するゼラチンであり、市販のゼラチンとは異なるものである。

市販のゼラチンとして例えば、シグマ社製タイプ Aゼラチン、和光社製ゼラチンかあるが、水溶液中のジ一夕電位が以下のように異なっている。

シグマ社製タイプ Aゼラチン：約 0〜約 5 mV

和光社製ゼラチン：約— 5〜約一 2mV

ジ一夕電位は、物質（ゼラチン）の静電的な荷電の程度を表す尺度であり、本発明における HGFと静電的複合体を形成するゼラチンの指標としては好適なものと考えられる。

本発明のゼラチンは牛を始めとする各種の動物種の皮膚 ·腱などの部分あるいはコラーゲンあるいはコラーゲンとして用いられている物質からアルカリ加水分解して得られるものである。好ましくは、ゥシの骨由来の I型コラーゲンをアル力リ処理して調製した酸性ゼラチンであり、新田ゼラチン社の試料等電点 ( IEP) 5. 0 として入手することもできる。なお、酸処理して調製した塩基性ゼラチンは同じく新田ゼラチン社の試料 IEP9. 0 として入手することができるが、ジ一夕電位は以下のように大きく相違する。

酸性ゼラチン（新田ゼラチン社試料 IEP5. 0)：約— 1 5〜約一 2 O mV 塩基性ゼラチン（新田ゼラチン社試料 IEP9. 0)：約 + 1 2〜約 + 1 5 mV 本発明で使用されるゼラチンヒドロゲルとは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤と縮合させて得られるヒドロゲルのことである。化学的架橋剤としては、例えばダルタルアルデヒド、例えば E D C等の水溶性カルポジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、縮合剤を用いることができる。好ましいものとしては、ダルタルアルデヒドを用いることが挙げられる。

また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても架橋化することもできる。ゼラチンヒドロゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、また、球状、粒子状のものは注射投与も可能である。

円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンヒドロゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添加し、所望の形状の铸型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールァミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、 P H 2 . 5以下の水溶液を添加する。得られたゼラチンヒドロゲルは、蒸留水、エタノール、 2—プロパノール、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。

球状、粒子状のゼラチンヒドロゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、 EYELA niiniD. スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにォリーブ油等の油を加えて 200〜600 r pm程度の速度で攪拌し、 W/0型ェマルジヨンとし、これに架橋剤水溶液を添加するか、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中こて前乳化（例えば、ポルテックスミキサー Advantec TME-2K ホモジナイザー、 polytron PT10-35 等を用いて）しておいたものをォリーブ油中に滴下し、微粒子化した

WZO型ェマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンヒドロゲルを回収した後、アセトン、酢酸ェチル等で洗浄し、さらに 2—プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンヒドロゲル粒子は、 2— プロパノール、 Twe e n 80を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。

ゼラチンヒドロゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、 1分以内程度が好ましい）等を行ってもよい。尚、前乳化することによって、粒子サイズが 20 以下の微粒子状のゼラチンヒドロゲルを得ることができる。

得られるゼラチンヒドロゲル粒子の平均粒径は、 l〜 1000 mであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。

球状、粒子状のゼラチンヒドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。

上記の方法と同様の装置にオリ一ブ油を入れ、 200〜600 r p孤程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下して WZO型ェマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸ェチル等を加えて攪拌し、遠心分離によりゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸ェチル等、次いで 2—プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を 0. l %Twe e n 80を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに撹絆しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて 0. l%Twe e n 80を含む 10 OmM グリシン水溶液又は 0. 1 %Twe e n 80を含む 0. 004N H C 1等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンヒドロゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンヒドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。

この徐放のメカニズムは、血管形成誘導因子が、ハイド口ゲル内のゼラチンに物理的に固定化されていることに基づく。この状態では、因子は、ハイド口ゲルから放出されない。ハイド口ゲルが分解されることによって、ゼラチン分子が、水可溶性となれば、それに伴って、固定化されている血管形成誘導因子が、放出されるようになる。すなわち、ハイド口ゲルの分解によって、血管形成誘導因子の徐放性を制御することができる。ハイド口ゲルの分解性は、ハイド口ゲル作成時での架橋程度によって変えることができる。

架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、 0〜40°C、 1〜48時間で行うことができる。

本発明のゼラチンヒドロゲルは、その含水率が血管形成誘導因子の徐放性に大きく影響することが明らかとなっており、好ましい徐放性効果を示す含水率としては約 80〜99w/w%が挙げられる。さらに好ましいものとしては、約 95〜98 ％のものが挙げられる。この架橋度の測定可能な指標に含水率がある。含水率が大きければ架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値が血管形成誘導因子の徐放（徐々に放出）を左右する。

本発明のゼラチンヒドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンヒドロゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で 30分以上、又は一 80°Cで 1時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で 1〜3日間乾燥させることにより行うことができる。

ゼラチンヒトロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度は、所望の含水率に応じて適宜選択すれば良いが、ゼラチン濃度は、 l〜20w/w%、架橋剤濃度は、 0. 01〜： Lw/w%が挙げられる。

本発明で使用される H G Fは公知物質であり、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができ、また既に市販されている製品（例えば、東洋紡 CodeNo. HGF— 101等）を使用してもよい。 HGFの製造法としては、例えば、 HGFを産生する初代培養細胞や株化細胞を培養し、培養上清等から分離、精製して該 HGFを得ることができる。あるいは遺伝子工学的手法こより HGFをコードする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、これを適当な宿主に揷入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え HGFを得ることもできる。（例えば、 Nature, 342, 440 (1989)、特開平 5— 1 1 1 382号公報、 Biochem. Biophys. Res. Commun. 163, 967 (1989)などを参照）。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母又は動物細胞などを用いることができる。このようにして得られた HGFは、天然型 H G Fと実質的に同じ作用を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び/又は付加されていてもよい。

本発明における HGF徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤とは、上記の酸性ゼラチンヒドロゲルに H G Fを含浸させて得られる製剤である。 H G Fは塩基性タンパク質であるため、酸性ゼラチンヒドロゲルと複合体を形成するが、前述の溶液中のィォン強度変化に対する H G Fの収着抑制効果を考慮すると、この HGFゼラチン (ヒドロゲル) 複合体は静電的相互作用だけでなく、疎水結合等の他の相互作用が大きく寄与している。この複合体の解離定数（Kd) およびゼラチンに対する HGFの結合モル比はスキャッチャ一ド結合モデル（Scatchard, G. 1949) にしたがって得られた。ゼラチンに対する HGFの結合モル比として、およそ H G F分子 7個が、酸性ゼラチン分子 1個に結合している。

また、 37°Cの酸性ゼラチンの Kd値は、 5. 5 X 10— ⁷Mであり、これは、 20 °Cの硫酸へパリンの Kd値 1 X 1 (Γ⁹〜2. 0 X 1 0— ^1QMよりも約 2〜 3次数大きい（Rahmoune, H et al., 1998)。これは、 H G Fゼラチン複合体の結合性が H G Fへパリン硫酸ほど強固でなく、緩やかであることを示している。

ゼラチンに対して HGFのモル比を約 1 ： 7以上に上げた場合には、 HGFの遊離が起きやすく活性的にはほとんど遊離の HGFと同様の挙動を示す。しかし、 HGFのモル比を約 1 ： 7以下に下げた場合には、 HGFが吸着され解離するものが少なくなるため、 H G Fの見かけの活性は低下するように見える。

従って、 HGFとゼラチンあるいはゼラチンヒドロゲルとの複合体は、 HGF とゼラチンのモル比が種々に変化したものを作り得るが、初期バーストを回避するためには、好適なものとして、ゼラチンヒドロゲル 1モルに対して HGFが約 7モル以下のモル比の複合体が挙げられる。

なお、ゼラチンに対しては、 HGFの重量比が約 5倍量以下のものが好適である。さらに好適なものとしては、ゼラチンに対して HGFが約 5〜約 1Z10⁴ 倍量の重量比のものが望ましい。

本発明の HGF徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤は、 HGFの徐放性効果と HG

Fの安定化効果を持っため、 HGFの機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、 HGFの本来的機能である血管新生の促進、再還流障害の防止、線維化の抑制などの心血管保護作用が効果的に発揮され、これら心筋症治療剤として有効に使用することができる。

本発明の HGFゼラチンヒドロゲル製剤は、注射用製剤として、非経口的に使用することができる。例えば、皮下、筋肉内、静脈内、体腔内、結合組織内、骨内膜あるいは障害臓器等に投与することができる。

本発明の HGF徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、スティック状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが考えられる。

本発明製剤中の HGFの用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常成人患者当たり約 0. 01〜約 5 zg の範囲、好ましくは、約 0. 01〜約0. 5 /gの範囲から投与量が選択され、これを患部またはその周辺部位に注入することができる。また 1回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。

本発明の HGF徐放性ゼラチンヒドロゲル製剤の適用疾患は、上記のように、心筋症である。本発明でいう心筋症とは、心筋に病変が見られるすべての疾患をいい、明らかな原因のない、心筋の異常肥大、変性、線維化を特徴とする。

適用疾患の具体例としては、拡張型心筋症又は肥大型心筋症、あるいは、特発性心筋症、原発性心筋症又は続発性心筋症を挙げることができる。好ましい疾患は、拡張型心筋症である。続発性心筋症にあっては、薬剤の副作用若しくは毒物の作用、ウィルスやバクテリアの感染症に伴う続発性心筋症が好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、左室拡張末期径の変化を示す。

H G F処理群においては、心臓の拡大が抑制されるのみならずむしろ縮小したのに対し、 S h am群では心臓の拡大が見られた。

図 2は、左室収縮末期径の変化を示す。

HGF処理群においては、心臓の拡大が抑制されるのみならずむしろ縮小したのに対し、 Sh am群では心臓の拡大が見られた。

図 3は、左室短径短縮率（心臓を輪切りにした断面における左室径の、収縮に伴つて生じる短縮の割合のこと）の変化を示す。

HGF処理群では、心収縮力の改善が見られたのに対し、 Sh am群では、心機能の悪化が進んだ。

図 4は、左室内腔面積変化率 (心臓を輪切りにした断面における左室断面積の収縮に伴つて生じる縮小の割合のこと）の変化を示す。

HGF処理群では、心収縮力の改善が見られたのに対し、 Sh am群では、心機能の悪化が進んだ。実施例

実験方法

HGFの徐放が投与後約 4週間にわたって持続するように、田畑らの方法にしたがって HGF徐放剤を作製した。 L ewi sラット（雄性、 n = 9、清水実験動物株式会社より購入）の皮下にブ夕心筋由来のミオシンを投与することによつて急性心筋炎を誘発し、その後 6週間放置し、心筋症を誘発させ、拡張型心筋症のモデルとした。これらを HGF処理群（n = 4) と Sh am群（n = 5) とに分類し、 HGF処理群には、開胸後に、 HGF徐放剤を浸潤させたゼラチンシートを左室前壁に付着させることによってその後の HGFの徐放を図り、 Sh am 群には生食をしみ込ませたゼラチンシ一トを左室前壁に付着させた。術後 4週にわたり、 10〜12MHz の周波数の超音波フローべを用いた心エコーにて心臓の大きさおよび機能を追跡した。 HGF処理群においては、心臓の拡大が抑制されるのみならずむしろ縮小したのに対し、 S h am群では心臓の拡大が見られた。

左室拡張末期径（cm) ：

術刖 2週後 4週後

HGF群 0.91±0.04 0.86±0.05 0.80±0.05

Sham群 0.89±0.03 0.88±0.03 0.91±0.05

=0.0043

左室収縮末期径（cm)

術前 2週後 4週後

HGF群 0.67±0.02 0.55±0.08 0.47±0.07

Sham群 0.68±0.01 0.63±0.06 0.74±0.05*

*p=0.0011

また、 HGF処理群では、心収縮力の改善が見られたのに対し、 Sh am群では、心機能の悪化が進んだ。

左室短径短縮率（％)：

術前 2週後 4週後

HGF群 26.7±1.9 37.9±3.4 41.7±9.3

Sham群 24.3±2.2 21.1±8.7 17.0±2.8*

*p=0.0014

左室内腔面積変化率（％) ：

術前 2週後 4週後

HGF群 40.8±5.2 48.7±11.2 61.8±14.9

Sham群 43.1±3.9 35.0土 8.0 30.3+ 3.3*

*p=0.0010

HGF徐放剤の心筋への直接投与は、ラットにおいて、術後 4週にわたり心臓の縮小および心収縮力の著明な改善をもたらした。この手法は、拡張型心筋症の進行を抑えるのみならず、積極的な治療効果があることが示唆された。

Claims

請求の範囲

1. HGF及びゼラチンヒドロゲルを含み、 HGFが徐放される、心筋症治療剤。

2. ゼラチンが、以下の物性：

(1) コラ一ゲンからのアルカリ加水分解処理によって得られる、酸性ゼラチンであり、

( 2 ) 分子量が、 S D S— P A G Eの非還元条件下で約 10〜約 20万ダルトンであり、

(3) 水溶液中のジ一夕電位が、約— 15〜約一 2 OmVである

を有する、請求の範囲第 1項記載の心筋症治療剤。

3. 心筋症が、拡張型心筋症である、請求の範囲第 1項又は 2項に記載の心筋症治療剤。

4. 心筋症が、肥大型心筋症である、請求の範囲第 1項又は 2項に記載の心筋症治療剤。

5. 心筋症が、特発性心筋症、原発性心筋症又は続発性心筋症である、請求の範囲第 3項〜 4項のいずれか 1項に記載の心筋症治療剤。