KR20040023724A - 조혈 간세포의 제조법 - Google Patents

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KR20040023724A
KR20040023724A KR10-2004-7001887A KR20047001887A KR20040023724A KR 20040023724 A KR20040023724 A KR 20040023724A KR 20047001887 A KR20047001887 A KR 20047001887A KR 20040023724 A KR20040023724 A KR 20040023724A
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hematopoietic stem
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tpo
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미쯔오 니시까와
마사따께 오사와
다까히꼬 이시구로
기요시 야스까와
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기린 비루 가부시키가이샤
도소 가부시키가이샤
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Abstract

본 발명은 조혈 간세포의 효과적인 제조법의 제공을 그 목적으로 한다. 본 발명에 의한 조혈 간세포의 제조법은, gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는 것이다.

Description

조혈 간세포의 제조법{Process for Preparing Hematopoietic Stem Cells}
생체 중의 성숙 혈액 세포의 수명은 단기간이며, 끊임없이 조혈 전구세포의 분화에 의해 성숙 혈액 세포가 공급됨으로써, 혈액의 항상성이 유지되고 있다. 조혈 전구세포는, 또한 미분화의 조혈 간세포의 분화에 의해 생성된다. 조혈 간세포는, 각종의 분화계열로 분화할 수 있는 능력(분화 다능성)을 가지고 있는 동시에, 분화 다능성을 보유한 채 자기복제함으로써 생애에 걸쳐 조혈 세포를 공급한다. 즉, 자기복제를 함으로써 분화 다능성을 갖는 간세포를 생기게 하는 동시에, 일부는 조혈 전구세포를 거쳐서 각종의 성숙 혈액 세포로 분화되는 것이 알려져 있다.
이러한 혈액 세포의 분화는 여러 가지 사이토카인에 의해 조절되고 있다. 에리트로포에틴(EPO)은 적혈구계의 세포의 분화를, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)는 호중구계의 분화를, 트롬보포에틴(TPO)은 거핵구 및 혈소판 생산 세포의 분화를, 각각 촉진하는 것이 알려져 있다. 그러나, 조혈 간세포가 분화 다능성을 보유한 채 자기복제함에 있어서, 어떤 인자가 필요하게 될지는 알 수 없다. 조혈 간세포의 증식인자로서, SCF/MGF(Williams, D. E., Cell, 63:167-174, 1990; Zsebo,K. M., Cell, 63:213-224, 1990) 또는, SCGF(W098/08869호) 등 몇개의 보고가 있지만, 모두 조혈 간세포의 분화 다능성을 충분히 유지하는 작용을 가지고 있지 않다. 또한, 기지의 사이토카인을 복수 조합시켜 첨가함으로써 조혈 간세포를 배양하는 시도가 되고 있다(Miller CL, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:13648-13653, 1997; Yagi M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:8126-8131, 1999; Shih C.C. Blood, 94:5 1623-1636 1999).
한편, 조혈 세포의 유지 및 증식에 적합한 환경을 제공하는 기질 세포를 이용해서 조혈 간세포를 분화시키지 않고 유지 및 증식시키는 시도가 되고 있다(Moore K. A., Blood, 89:12 4337-4347 1997, Expansion in vitro of adult murine hematopoietic stem cells with transplantable lympho-myeloid reconstituting ability, Cindy L. Miller and Connie J. Eaves, PNAS 94:13648-13653). 또한, WO99/03980호에는, 마우스 태아의 AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros: 대동맥-생식선-중신) 영역에서 주화된, 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 증식 또는 생존을 지지할 수 있는 기질 세포주가 개시되어 있다. 또한, 문헌(Rappold I, Watt SM, Kusadasi N, Rose-John S, Hatzfeld J, Ploemacher RE. Gp130-signaling synergizes with FL and TPO for the long-term expansion of cord blood progenitors. Leukemia. 1999 Dec; 13(12):2036-48)에는 SCF, FL, TPO, sIL-6R-IL-6 융합 단백질(Hyper-IL-6) 및 기질 세포를 이용해서 배양을 하고 있다.
그러나, 라폴드(Rappold) 등의 배양계는 조혈 전구세포의 배양계이며, 조혈 간세포의 배양계와는 전혀 다르다. 또한, 문헌(Kusadasi N et al., Leukemia.2000; 11:1944-1953)에는, IL-6, Flt-3 리간드(FL), 및 TPO의 배양계에서는 기질 세포의 기능은 FL+TPO에서 대상되고, 기질 세포는 간세포 유지 기능을 증강시키는 작용을 거의 가지고 있지 않은 것이 보고되어 있다.
발명의 개요
발명자들은 금번, gp130 자극 인자와, 사이토카인 칵테일과, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양함으로써, 조혈 간세포를 효율적으로 증식시켜 그 생존을 지지할 수 있는 것을 발견했다.
본 발명은, 조혈 간세포의 효과적인 제조법, 조혈 간세포의 효과적인 배양법, 및 조혈 간세포의 배양에 이용되는 배지의 제공을 그 목적으로 한다.
본 발명에 의한 조혈 간세포의 제조법은, gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는 것이다.
본 발명에 의한 조혈 간세포의 배양법은, gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는 것이다.
본 발명에 의한 조혈 간세포의 배양에 이용되는 배지는, gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포를 포함하는 것이다.
말초혈 간세포 이식이나 제대혈 간세포 이식 등의 조혈 간세포 이식 요법에서는, 이식하는 조혈 간세포수를 충분량 취득할 수 없어서 이식을 실시할 수 없는 경우가 있다. 본 발명에 따르면, 조혈 간세포를 시험관내에서 효율적으로 증폭하고, 또한 안정적으로 유지하는 것이 가능하다. 따라서, 충분한 양의 조혈 간세포를 환자로부터 취득할 수 없는 경우라도, 필요량의 조혈 간세포를 배양하여 환자에게 이식할 수 있다. 즉 본 발명은, 혈액 세포의 이식요법 및 이식요법을 필요로 하는 치료의 실용화에 길을 여는 것이다.
본 발명의 배양계에 의해 증폭한 조혈 간세포는 또한, 혈액 이외의 조직으로 분화되는 세포로서 이용하는 것도 가능하다. 따라서 본 발명에 의해 얻어진 조혈 간세포는, 간부전, 근육 디스트로피, 심근경색 등에 의한 심근의 괴사, 당뇨병에 의한 혈관 괴사, 또는 장관막 세포의 괴사로부터 정상 세포를 재생시키는 치료나, 신경 세포를 재생시키는 치료에 이용할 수 있다.
본 발명은, 조혈 간세포의 제조법 및 조혈 간세포의 배양에 이용되는 배지에 관한 것이다.
도 1은, 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포의 증식에 주는 영향을, 마우스 조혈 간세포를 이식한 개체의 말초혈에 있어서의 공여자 유래 혈구세포의 키메리즘의 경시적인 변화에 따라 도시한 도이다. 「인풋(input)」(□)은, 마우스 조혈 간세포를 채취 후 즉시 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「S+IL6+IL11+FL」(■)은, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, SCF+IL-6+IL-11+FL의 사이토카인 존재하에서 배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「S+FP6+FL」(○)은, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+FL의 사이토카인 존재하에서 배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다.
도 2는, 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포의 증식에 주는 영향을, 마우스 조혈 간세포를 이식한 개체의 말초혈에 있어서의 공여자 유래 혈구세포의 키메리즘의경시적인 변화에 따라 도시한 도이다. 「인풋」(×)은, 마우스 조혈 간세포를 채취 후 즉시 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「액체 STF」(□)는, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO의 사이토카인에서 배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「A9+STF」(■ 및 ◆)는, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「A9+STF(20)」(■)은 FP6의 농도가 20ng/㎖일 때의 결과를 나타낸다. 「A9+STF(50)」(◆)는 FP6의 농도가 50ng/㎖일 때의 결과를 나타낸다.
도 3은, 인간 간엽계 간세포 및 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포의 증식에 주는 영향을 나타낸 도이다. 구체적으로는, 마우스 조혈 간세포를 이식한 개체의 말초혈에 있어서의 공여자 유래 혈구세포의 키메리즘의 경시적인 변화를 나타냈다. 「인풋」(×)는, 마우스 조혈 간세포를 채취 후 즉시 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「MSC」(○)는, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, 인간 간엽계 간세포와 공배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다. 「MSC+STF」(△)는, 마우스 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO의 사이토카인의 존재하, 인간 간엽계 간세포와 공배양한 후에 방사선 조사 마우스에 이식한 경우를 나타낸다.
도 4는, 기질 세포 및 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 증식에 주는 영향을 나타낸 도이다. 「인풋」은, 인간 조혈 간세포를 채취 후 즉시 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「A」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO+FL의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「B」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO+FL의 사이토카인의 존재하 배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「BFU-E」: BFU-E(적혈구군 형성 단위), 「CFU-GM」: CFU-GM(과립구-대식세포 콜로니 형성 단위), 「CFU-Emix」: CFU-Emix(적혈구 혼합 콜로니 형성 단위).
도 5는, 기질 세포 및 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 증식에 주는 영향을 나타낸 도이다. 「인풋」은, 인간 조혈 간세포를 채취 후 즉시 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「A」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO+FL의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「B」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+TPO+FL의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「C」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+TPO+FL의 사이토카인의 존재하에 배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「D」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+TPO+FL의 사이토카인의 존재하에 배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「BFU-E」: BFU-E(적혈구군 형성 단위), 「CFU-GM」: CFU-GM(과립구-대식세포 콜로니 형성 단위), 「CFU-Emix」: CFU-Emix(적혈구 혼합 콜로니 형성 단위).
도 6은, 기질 세포 및 사이토카인 칵테일의 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 증식에 주는 영향을 나타낸 도이다. 「인풋」은, 인간 조혈 간세포를 채취 후 즉시 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「A」는, 인간 조혈 간세포를 채취후, SCF+FP6+TPO+FL의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「B」는, 인간 조혈 간세포를 채취 후, SCF+FP6+FL의 사이토카인의 존재하, 기질 세포 AGM-S3-A9와 공배양한 후에 콜로니 분석에 제공한 경우를 나타낸다. 「BFU-E」: BFU-E(적혈구군 형성 단위), 「CFU-GM」: CFU-GM(과립구-대식세포 콜로니 형성 단위), 「CFU-Emix」: CFU-Emix(적혈구 혼합 콜로니 형성 단위).
조혈 간세포
본 발명에 있어서 「조혈 간세포」란, 혈구의 모든 분화계열로 분화될 수 있는 능력(다분화 능력)을 가지고, 또한 그 다분화 능력을 유지한 채 자기복제하는 것이 가능한 세포를 말한다.
조혈 간세포는, 인간 및 마우스 등의 포유동물의 태아 간장, 골수, 태아 골수, 말초혈, 사이토카인 및(또는) 항암제의 투여에 의해 간세포를 동원한 말초혈, 및 제대혈 등으로부터 채취할 수 있다.
마우스에서는, 이식 실험에 의해 조혈 간세포와 조혈 전구세포를 구별할 수 있다. 즉, 시험 세포를 방사선 조사 마우스에 이식하여 이식 후 3개월 이상에 걸쳐 공여자 유래의 골수구, 림프구의 쌍방의 분화계열의 조혈 세포가 이식처 개체(수용자)에 발견되면 다분화 능력을 가져 수용자 개체로 자기복제가능한 조혈 간세포가 이식 세포 집단에 존재하고 있던 것을 나타낸다.
적혈구 전구세포는, 시험관내의 배양 환경에서 유지 증폭시키는 것은 곤란하여 급속히 소실되어 버린다. 적혈구 전구세포의 유지, 증식이 확인될 경우는, 보다 미분화의 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포가 유지, 증식됨으로써, 적혈구 전구세포가 계속적으로 생산되고 있는 것으로 생각된다. 따라서, 인간 조혈 간세포의 평가계에서는, 적혈구 전구세포(BFU-E) 또는 과립구, 대식세포의 두개의 세포계열로 분화가능한 전구세포(CFU-GM)가 유지, 증식되고 있는지를 지표로 함으로써 조혈 간세포 또는 미분화의 조혈 전구세포가 증식하고 있는 것을 확인할 수 있다. 또한, 면역부전 마우스인 NOD/SCID 마우스에 인간 조혈 세포를 이식하고, 이식 후의 인간 조혈 세포의 존재 빈도로부터 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포가 이식 세포 집단에 존재하고 있었는지 확인할 수 있다.
gp130 자극 인자
본 발명에 있어서 「gp130 자극 인자」란, 인간 gp130을 통해서 시그널을 전달하는 분자를 의미하고, IL-6 및 IL-6 수용체의 α쇄(이하 「IL-6R」이라고 하는 경우가 있음)의 복합체와 같이, gp130과 회합함으로써 gp130을 활성화하고, 이어서 JAK 키나제의 활성화, STAT3의 인산화, STAT3에 의한 JunB, JAB, SAA3, C-반응성 단백질 등의 유전자의 전사 촉진을 야기하고, 결과적으로, 세포 증식, 세포 분화 조절 등을 일으키는 분자를 말한다. 인간 gp130을 원래 발현하지 않는 마우스 IL-3 의존성 세포주인 Ba/F3 세포에 인간 gp130을 코드하는 유전자를 발현시킨 형질전환 세포는 gp130 시그널에 의해 증식하므로, 이 형질전환 세포의 증식을 검출함으로써, gp130 자극 인자인지 아닌지를 평가할 수 있다. 형질전환 세포의 증식은 아이소토프 표식한 핵산을 세포에 받아들이게 하는 것, 미토콘드리아의 활성을 평가하는 것, 세포수를 직접 측량하는 것 등에 의해 확인할 수 있고, 예를 들면, 일본 특허 공개 2001-8690호 공보의 실시예 5의 기재를 따라 실시할 수 있다. 또한, 상술한 바와 같이 gp130 자극은 세포내 시그널 전달 분자인 STAT3의 활성화도 행하기 때문에, gp130 자극 인자인지 아닌지는 상기 Ba/F3 세포의 STAT3의 활성화를 검출함으로써 평가하는 것도 가능하다. STAT3의 활성화는, 세포내의 STAT3이 인산화되는 것을 검출함으로써, 또한, STAT3에 의해 전사가 촉진되는 유전자군에 대해서는 그 전사 촉진을 노던 해석, 정량적 RT-PCR법에 의해 검출하는 것이라도 가능하다.
gp130 자극 인자로서는, IL-6 또는 그의 변이체와 IL-6R 또는 그의 변이체와의 융합 단백질, IL-6R(바람직하게는, 가용성 IL-6R(sIL-6R)) 또는 그의 변이체와 IL-6 또는 그의 변이체와의 조합(일본 특허 공고 평10-509040호), gp130에 대해서 아고니스트로서 작용하는 gp130에 대한 항체(Gu ZJ, Vos JD, Rebouissou C, Jourdan M, Zhang XG, Rossi JF, Wijdenes J, Klein B., Agonist anti-gp130 transducer monoclonal antibodies are human myeloma cell survival and growth factors. Leukemia. 2000 Jan; 14(1):188-97), 인터류킨-11(IL-11), 백혈구 유주 저지 인자(LIF), 온코스타틴 M, 및 카르디오트로핀을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「IL-6」이란, 4개의 헬릭스로 구성되는 전장 212개 아미노산 잔기의 단백질(Hirano et al., Nature, 324,731(1986))을 의미한다. 또한 본 발명에 있어서 「IL-6의 변이체」란, 치환, 결실, 삽입, 및 부가에서 선택되는 하나 이상의 개변을 가지고, 또한 gp130 자극 활성을 갖는 IL-6의 변이체를 의미한다. IL-6에 대해서는, 시그널 펩티드인 N 말단에서 28번째의 알라닌 잔기까지가결실하더라도 gp130 자극 활성을 유지하는 것이 알려져 있다(WO00/01731). 또한 IL-6의 37번째의 리신 잔기의 C 말단측이 프로테아제의 소화 작용을 받는 것, 및 28번째의 알라닌 잔기로 37번째의 리신 잔기까지의 10개 아미노산 잔기가 결실하더라도 IL-6 활성에 지장이 없는 것이 알려져 있다(WO00/01731). 따라서, 본 발명에 있어서는 N 말단이 결실하고, 또한 gp130 자극 활성을 갖는 개변 IL-6을 IL-6 변이체로서 이용할 수 있다. 이러한 IL-6 변이체로서는, 28번째까지의 N 말단 배열이 결실한 IL-6, 37번까지의 N 말단 배열이 결실한 IL-6을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「IL-6R」이란, 시그널 영역, 세포외 영역, 막 관통 영역, 및 세포내 영역으로 구성되는 전장 468개 아미노산 잔기의 단백질(Yamasaki et al., Science, 241, p825(1988))을 의미한다. 또한 본 발명에 있어서 「IL-6R의 변이체」란, 치환, 결실, 삽입, 및 부가에서 선택되는 하나 이상의 개변을 가지고, 또한 gp130 자극 활성을 갖는 IL-6R의 변이체를 의미한다. IL-6R에 대해서는, 세포외 영역 중에 존재하는 사이토카인 수용체 영역(112번째의 발린 잔기 부근에서 323번째의 알라닌 잔기 부근까지의 영역)이 IL-6과의 결합에 필요 충분한 것이 알려져 있다(Yawata et al., EMBO J. 12, p1705(1993)). 따라서, 본 발명에 있어서는 IL-6R의 112번째의 발린 잔기 부근에서 333번째의 알라닌 잔기 부근까지의 영역을 포함하는 개변 IL-6R을 IL-6R 변이체로서 이용할 수 있다.
융합 단백질은 IL-6 또는 그의 변이체와 IL-6R 또는 그의 변이체를 직접 또는 링커를 통해서 연결하여 이루어지는 단백질이다. 융합 단백질은, 예를 들면, WO00/O1731, WO99/02552, 일본 특허 공고2000-506014호, 또는 문헌(Fisher et al.,Nature, Biotech., 15, p142(1997))에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다.
융합 단백질은, IL-6R의 112번의 발린 잔기로부터 333번째의 알라닌 잔기까지의 단편의 C 말단과, IL-6의 38번의 아스파르트산 잔기로부터 212번의 메티오닌 잔기까지의 단편의 N 말단을 직접 연결하여 이루어지는 단백질(FP6)일 수 있다. 이 경우, 융합 단백질을 코드하는 DNA 배열을 숙주에 있어서 발현 가능하도록 연결한 벡터를 적당한 숙주에 도입하여 형질전환된 숙주를 배양하고, 배양물로부터 FP6을 채취함으로써 융합 단백질 FP6을 제조할 수 있다(WOOO/01731 참조).
사이토카인류
본 발명에 있어서 사용되는 「사이토카인류」는, 조혈 간세포를 증식시켜 조혈 간세포를 유지할 수 있다.
이러한 사이토카인류로서는, 트롬보포에틴(TPO) 및 그의 변이체 및 그것들의 유도체, c-mpl 리간드(TPO를 제외함) 및 그의 유도체, 간세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(FL), IL-3(인터류킨-3), 과립구 대식세포·콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), 및 MIP-1α(Davatelis, G., J. Exp. Med. 167:1939, 1988)과 같은 증식인자; 에리트로포에틴(EP0)과 같은 조혈 호르몬; 케모카인, Wnt 유전자 산물, 및 노치 리간드와 같은 분화 증식 조절인자; 발생 조절인자; 및 이들의 조합을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「트롬보포에틴(TPO)」이란, 전장 332개 아미노산 잔기의 아미노산 배열을 포함하는, 혈소판 생산을 특이적으로 자극 또는 증대시키는 활성을 갖는 단백질이다(W095/21919). 또한 본 발명에 있어서 「TPO의 변이체」란, 치환, 결실, 삽입, 및 부가에서 선택되는 하나 이상의 개변을 가지고, 또한 혈소판 생산을 특이적으로 자극 또는 증대시키는 TPO의 변이체를 의미한다. TPO의 변이체로서는, 예를 들면, W095/18858, 특허 제2991640호, 특허 제2991630호, 및 특허 제2996729호 등에 기재되어 있는 것을 들 수 있고, 바람직하게는, 아미노산 잔기 1번으로부터 163번까지의 아미노산 배열을 포함하는 TPO의 변이체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「TPO 및 그의 변이체의 유도체」란, 수용성 폴리머를 연결하는 TPO 및 그의 변이체를 의미한다. 수용성 폴리머로서는, 폴리에틸렌글리콜, 바람직하게는 평균 분자량이 약 5kDa 내지 약 50kDa인 폴리에틸렌글리콜을 들 수 있다. TPO 및 그의 변이체의 폴리에틸렌글리콜화(PEG화)는 주지의 방법에 따라 실시할 수 있다(예를 들면, Focus on Growth Factors 3(2):4-10(1992) 참조). 수용성 폴리머 대 c-mpl 리간드 단백질의 몰비는 1:1 내지 100:1일 수 있고, 폴리PEG화의 경우에는 1:1 내지 20:1, 모노PEG화의 경우에는 1:1 내지 5:1일 수 있다.
본 발명에 있어서 「c-mpl 리간드」란, mpl 수용체에 결합가능한 펩티드성 리간드, 단백질성 리간드, 및 비펩티드성 리간드를 의미한다. 단백질성 c-mpl 리간드(TPO를 제외함)로서는, 거핵구의 자극제로서의 아고니스트 항체(WO99/03495, WO99/10494)나 조혈 수용체 아고니스트 등의 다른 단백질(W096/23888, W097/12978, W097/12985, W098/17810, W096/34016, WO00/24770)을 들 수 있다. 펩티드성 c-mpl 리간드로서는, W096/40189, WO96/40750, WO98/25965, 일본 특허 공개 평10-72492호, WO99/42127, WO00/24770에 기재되어 있는 것을 들 수 있다. 비펩티드성 c-mpl 리간드로서는, 벤조디아제핀 유도체(일본 특허 공개 평11-1477호, 일본 특허 공개평11-152276호)나 다른 저분자 리간드(WO99/11262, WO99/22733, WO99/22734, WO00/35446, WO00/28987)를 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 사이토카인류로서는, 간세포 인자(SCF); 트롬보포에틴(TPO) 및 그의 변이체 및 그것들의 유도체; Flt-3 리간드(FL); 또는 이것들의 조합을 들 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직한 사이토카인류로서는, 트롬보포에틴(TPO) 또는 그의 변이체 또는 그것들의 유도체를 적어도 포함하는 것을 들 수 있다.
기질 세포
본 발명에 있어서 「기질 세포」란, 생체내의 조혈 환경과 동등한, 또는 유사한 조혈 환경을 시험관내에서 제공할 수 있는 세포를 말하고, 시험관내에서 조혈 세포와 공배양할 수 있는 세포이면 그 유래는 불문한다.
기질 세포의 예로서는, AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros) 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포, 간엽계 간세포(mesenchymal stem cell), 선유아 세포, 혈관 내피 세포, 태아 간장 유래 세포, 및 전지방세포를 들 수 있고, 바람직하게는 AGM 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포 및 간엽계 간세포이며, 특히 바람직하게는 AGM 영역 유래의 세포 및 간엽계 간세포이다.
인위적으로 발현을 조절할 수 있는 프로모터의 하류에 자살 유전자 등이 삽입된 재편성 벡터를 기질 세포에 도입하고, 조혈 간세포와 배양 후에 기질 세포만을 사멸시켜, 이식 시에 기질 세포를 제거하는 것도 가능하다. 자살 유전자의 도입 및 발현은 하기와 같이 해서 실시할 수 있다. 즉, 자살 유전자의 발현에 의한수법, 보다 구체적으로는, 디프테리아 독소의 이용(Lidor YJ, Lee WE, Nilson JH, Maxwell IH, Su LJ, Brand E, Glode LM., In vitro expression of the diphtheria toxin A-chain gene under the control of human chorionic gonadotropin gene promoters as a means of directing toxicity to ovarin cancer cell lines. Am J Obstet Gynecol. 1997 Sep; 177(3):579-85.), 헤르페스 바이러스 티미딘 키나아제(HStk)의 이용(Link CJ, Seregina T, Traynor A, Burt RK., Cellular suicide therapy of malignant disease., Oncologist. 2000; 5(1):68-74.), 아폽토시스 관련의 유전자의 발현에 의해, 자살 유전자를 발현시킬 수 있다. 아폽토시스 관련 유전자로서는, 사멸 영역을 갖는 수용체 유전자, 예를 들면, Fas(Ioth N, Cell, 66:233-243, 1991), TNF 수용체 II형(Loetscher H., Cell 61(2): 351-359, 1990), 사멸 수용체 3(Kitoson J., Nature, 384:372-375, 1996), 사멸 수용체 4(Pan G., Science, 276:111-113, 1997)나, 상기 수용체의 신호 전달 분자인 Flice 또는 신호 전달계에 속하는 단백질 분해 효소인 ICE(IL-1 b 전환 효소)(Cerretti D. P., Science 256:97-100, 1992), 나아가서는, 카스파제 계열(Patel T, FASEB. J., 10:587-597, 1996), 예를 들면 CPP32(Fernandes-Alnemri T, J. Biol. Chem., 269:30761-30764, 1994) 등을 이용할 수 있다. 또한, 이들 유전자의 발현을 인위적으로 제어하기 위해서는, 테트라사이클린을 이용한 발현 유도계(Manfred G., Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 89:5547-5551, 1992)를 이용할 수 있다. 이들 유전자를 기질 세포주에 도입하기 위해서는, 숙주에 기질 세포주를 이용하는 이외에는, 통상 동물 세포에의 유전자 도입에 이용되는 방법, 예를 들면, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 등의 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터(Kotin, R.M. Hum Gene Ther 5, 793(1994)), 단순 헤르페스 바이러스 벡터 등의 바이러스 유래의 동물 세포용 벡터를 이용하는 방법, 인산칼슘 공침법, DEAE-덱스트란법, 일렉트로포레이션법, 리보솜법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등을 이용할 수 있다. 기질 세포의 자살 관련 유전자를 도입할 때에, 상기 유전자에 부가해서 약제 내성 유전자 등의 마커 유전자를 이용하면, 목적 유전자가 도입된 기질 세포주의 선택이 용이해진다.
배양
본 발명에 따르면, 조혈 간세포를 증폭하는 배양계가 제공된다. 배양계의 이용에 의해, 조혈 간세포의 증식, 생존을 효율적으로 유지하는 것이 가능해진다.
본 발명에 의한 배양계는, 조혈 간세포를 포함하고, 또한 다른 조혈 세포를 포함할 수 있다. 나아가서는, 조혈 간세포를 포함하는 분획일 수 있다. 즉, 조혈 간세포를 특이적으로 인식하는 항체로 제대혈, 말초혈, 골수 등의 조혈 간세포를 포함하는 조직으로부터 조혈 간세포를 분리한 것을 배양하는 것이 가능하다. 적혈구 등의 각종 세포를 특이적으로 제거하는 방법은 지금까지의 혈액 세포 분화법에 의해 실시하는 것이 가능하다. 또한, 분획하지 않고 배양을 행할 수 있다.
조혈 간세포를 배양함에 있어서는, 소위 배양용의 샤알레, 플라스크, 배양 백을 이용한 배양이 가능하지만, 배지 조성, pH 등을 기계적으로 제어하고, 고밀도에서의 배양이 가능한 바이오리액터에 의해, 그 배양계를 개선할 수도 있다(Schwartz, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88:6760, 1991; Koller, M. R.,Bio/Technology, 11:358, 1993; Koller, M. R., Blood, 82: 378, 1993; Palsson, B.O., Bio/Technology, 11:368, 1993).
기질 세포와 조혈 세포의 공배양은, 골수를 채취한 뒤, 그대로 배양을 행함으로써 가능하다. 또한, 골수를 채취한 뒤 기질 세포, 조혈 세포, 그 밖의 세포군 등을 분리하고, 골수를 채취한 개인 이외의 기질 세포, 조혈 세포의 조합으로 공배양을 실시하는 것도 가능하다. 또한, 기질 세포만을 배양하여 증식시킨 후에 사이토카인 칵테일과 조혈 세포를 첨가하여 공배양을 실시하는 것도 가능하다. 기질 세포를 배양할 때에, 보다 유효하게 증식, 생존을 지지하기 위해서, 세포자극 인자를 배양계에 첨가할 수 있다. 이러한 세포자극 인자로서는, 트롬보포에틴(TPO) 및 그의 변이체 및 그것들의 유도체, c-mpl 리간드(TPO를 제외함) 및 그의 유도체, 간세포 인자(SCF), Flt-3 리간드(FL), 인터류킨-3(IL-3), 과립구 대식세포·콜로니 자극 인자(GM-CSF), 인터류킨-6(IL-6), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF), 형질전환 성장 인자-β(TGF-β), MIP-1α(Davatelis, G., J. Exp. Med. 167:1939, 1988) 등의 사이토카인으로 대표되는 증식인자, 에리트로포에틴(EPO)과 같은 조혈 호르몬, 케모카인, Wnt 유전자 산물, 노치 리간드와 같은 분화 증식 조절인자, 발생 조절인자 등을 들 수 있다. 이들 사이토카인은 기질 세포에 생산시킬 수 있다. 또한 사이토카인과 같은 시그널을 사이토카인 수용체를 통해서 전달하는 물질이면, 이들 사이토카인과 마찬가지로 사용할 수도 있다.
배양에 이용하는 배지로서는, 조혈 간세포의 증식 및 생존을 해지지 않는 한 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면 MEM-α배지(GIBCO BRL), SF-02배지(산코순약), Opti-MEM 배지(GIBCO BRL), IMDM 배지(GIBCO BRL), PRMI1640 배지(GIBCO BRL)를 바람직한 것으로 들 수 있다. 배양 온도는, 통상 251 내지 39℃, 바람직하게는 33 내지 39℃이다. 또한, 배지에 첨가하는 물질로서는, 소 태아 혈청, 인간 혈청, 말 혈청, 인슐린, 트랜스페린, 락토페린, 에탄올아민, 아셀렌산나트륨, 모노티오글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 소 혈청 알부민, 피루브산나트륨, 폴리에틸렌글리콜, 각종 비타민, 각종 아미노산을 들 수 있다. CO2는, 통상 4 내지 6%이며, 5%가 바람직하다.
조혈 간세포는, 모든 조혈계의 분화계열로 분화가 가능하므로, 시험관내에서 조혈 간세포를 증폭 후 여러 가지 세포종으로 분화시켜 이식하는 것이 가능하다. 예를 들면, 적혈구가 필요하면, 환자의 간세포를 배양하여 증폭한 후, EPO 등의 적혈구 분화 유도를 촉진하는 인자를 이용해서 적혈구를 주성분으로 하는 조혈 세포를 인위적으로 생산하는 것이 가능하다.
본 발명에 의한 방법에 있어서는 조혈 간세포를 배양한 후, 배양물로부터 조혈 간세포를 채취하는 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 의한 방법에 따라 배양한 조혈 간세포는, EDTA 단독, EDTA를 포함하는 트립신 액 등 세포 분산 용액으로서 사용되는 물질을 이용해서 배양기로부터 박리하여, 인체에 투여할 수 있는 세포 현탁액으로 할 수 있다.
본 발명에 의한 방법에 따라 배양한 조혈 간세포는, 조혈 간세포와 기질 세포를 분리해서 환자에게 이입하는 것도 가능하다. 또한 기질 세포와 조혈 간세포를 동시에 이식하는 것도 가능하다.
본 발명에 의한 제조법 중 바람직한 것으로서는, 인터류킨-6(IL-6)과 IL-6 수용체의 α쇄(IL-6R)의 융합 단백질과, 트롬보포에틴(TPO)과, AGM 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포, 및 간엽계 간세포로부터 선택되는 기질 세포와, 경우에 따라서는 간세포 인자(SCF) 및 Flt-3 리간드(FL)의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는 제조법을 들 수 있다.
본 발명에 의한 배지 중 바람직한 것으로서는, 인터류킨-6(IL-6)과 IL-6 수용체의 α쇄(IL-6R)의 융합 단백질과, 트롬보포에틴(TPO)과, AGM 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포, 및 간엽계 간세포로부터 선택되는 기질 세포와, 경우에 따라서는 간세포 인자(SCF) 및 Flt-3 리간드(FL)를 포함하는 배지를 들 수 있다.
조혈 간세포의 용도
본 발명에 의한 배양계를 이용해서 배양된 조혈 간세포는, 종래의 골수 이식이나 제대혈 이식을 대신하는 혈액 세포 이식용의 이식편으로서 이용할 수 있다. 조혈 간세포의 이식은, 이식편을 반영구적으로 생골수 이식에, 종래의 혈액 세포 이식 치료를 개선할 수 있다.
조혈 간세포의 이식은, 백혈병에 대한 전신 X선 방사요법이나 고도 화학요법을 행할 때에 실시할 수 있다. 예를 들면, 고형암 환자의 화학요법, 방사선요법 등의 골수억제가 부작용으로서 생기는 치료를 실시할 때에, 시술전에 골수를 채취해 두고, 조혈 간세포를 시험관내에서 증폭하여, 시술후에 환자에게 되돌려 줌으로써, 부작용에 의한 조혈계의 장해로부터 조기에 회복시킬 수 있고, 보다 강력한 화학요법을 행할 수 있게 되어, 화학요법의 치료 효과를 개선할 수 있다. 또한, 본 발명에 의해 얻을 수 있는 조혈 간세포를 각종 혈액 세포로 분화시키고, 그것들을 환자의 체내에 이입함으로써, 각종 혈액 세포의 저형성에 의해 부전한 상황을 보이고 있는 환자의 개선을 꾀할 수 있다. 또한, 재생불량성 빈혈 등의 빈혈을 나타내는 골수 저형성에 기인하는 조혈 부전증을 개선할 수 있다. 그 밖에, 본 발명의 방법에 의한 조혈 간세포의 이식이 유효한 질환으로서는, 만성 육아종증, 중복 면역 부전 증후군, 무감마글로불린혈증, 위스코트-알드리히 증후군, 후천성 면역 부전 증후군(AIDS) 등의 면역 부전 증후군, 사라세미아, 효소 결손에 의한 용혈성 빈혈, 겸상 적혈구증 등의 선천성 빈혈, 고셔병, 뮤코다당증 등의 리소좀 축적증, 부신 백질변성증, 각종 암 또는 종양 등을 들 수 있다.
조혈 간세포의 이식은, 이용하는 세포 이외에는, 종래 행하지고 있는 골수 이식이나 제대혈 이식과 같이 행할 수 있다.
상기와 같은 조혈 간세포 이식에 이용될 가능성이 있는 조혈 간세포의 유래는, 골수로 한정되지 않고, 전술한 바와 같은 태아 간장, 태아 골수, 말초혈, 사이토카인 및(또는) 항암제의 투여에 의해 간세포를 동원한 말초혈, 및 제대혈 등을 이용할 수 있다.
이식편은, 본 발명의 방법에 의해 생산한 조혈 간세포 외에, 완충액 등을 포함하는 조성물로 할 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 생산되는 조혈 간세포는, 생체외의 유전자 치료에 이용할 수 있다. 조혈 간세포에 대한 유전자 치료는, 간세포가 정지기에 있어 염색체와의 재편성율이 낮은 점, 또한 배양 중에 간세포가 분화되어 버리는 점 등때문에 곤란했다. 본 발명을 이용함으로써, 간세포를 분화시키지 않고 증폭할 수 있고, 유전자 도입 효율을 대폭 개선할 수 있다. 이 유전자 치료는, 조혈 간세포에 외래 유전자(치료용 유전자)를 도입하여, 얻어지는 유전자 도입 세포를 이용해서 행하여진다. 도입되는 외래 유전자는, 질환에 따라 적당히 선택된다. 혈액 세포를 표적 세포로 하는 유전자 치료의 대상이 되는 질환으로서는, 만성 육아종증, 중복 면역 부전 증후군, 무감마글로불린혈증, 위스코트-알드리히 증후군, 후천성 면역 부전 증후군(AIDS) 등의 면역 부전 증후군, 사라세미아, 효소 결손에 의한 용혈성 빈혈, 겸상 적혈구증 등의 선천성 빈혈, 고셔병, 뮤코다당증 등의 리소좀 축적증, 부신 백질변성증, 각종 암 또는 종양 등을 들 수 있다.
조혈 간세포에 치료용 유전자를 도입하기 위해서는, 통상 동물 세포의 유전자 도입에 이용되는 방법, 예를 들면, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 등의 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터, 단순 헤르페스 바이러스 벡터, HIV 벡터나 고양이 내재성 바이러스 백터 RD114(Kelly PF, Vandergriff J, Nathwani A, Nienhuis AW, Vanin EF., Highly efficient gene transfer into cord blood nonobese diabetic/severe combined immunodeficiency repopulating cells by oncoretroviral vector particles pseudotyped with the feline endogenous retrovirus(RD114) envelope protein. Blood. 2000 Aug 15; 96(4):1206-14) 등의 바이러스 유래의 유전자 치료에 이용되는 동물 세포용 벡터(유전자 치료용 벡터에 대해서는, Verma, I.M., Nature, 389:239, 1997 참조)를 이용하는 방법, 인산칼슘 공침법, DEAE-덱스트란법, 일렉트로포레이션법, 리포솜법, 리포펙션법, 마이크로인젝션법 등을 이용할 수 있다. 이들 중에서는, 표적 세포의 염색체 DNA에 갖추어져서 항구적으로 유전자의 발현을 기대할 수 있다고 하는 점에서, 레트로바이러스 벡터, 아데노 수반 바이러스 벡터 또는 HIV 벡터가 바람직하다.
예를 들면, 아데노 수반 바이러스(AAV) 벡터는, 다음과 같이 해서 제작할 수 있다. 우선, 야생형 아데노 수반 바이러스 DNA의 양단의 ITR(inverted terminal repeat: 역위 말단 반복물) 사이에 치료용 유전자를 삽입한 벡터 플라스미드와, 바이러스 단백질을 보충하기 위한 헬퍼 플라스미드를 293 세포로 트랜스펙션한다. 계속해서 헬퍼 바이러스의 아데노바이러스를 감염시키면, AAV 벡터를 포함하는 바이러스 입자가 생산된다. 또는, 아데노바이러스 대신에, 헬퍼 기능을 담당하는 아데노바이러스 유전자를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션할 수도 있다. 다음에, 얻어지는 바이러스 입자를 조혈 간세포에 감염시킨다. 벡터 DNA 중에 있어서, 목적 유전자의 상류에는, 적당한 프로모터를 삽입하고, 하류에 적당한 터미네이터를 삽입하고, 또한, 엔한서를 적당히 상류 또는 하류에 삽입하고, 이들에 의해 유전자의 발현을 조절하는 것이 바람직하다. 또한, 사이렌싱를 방지하기 위해서, 인슐레이터를 목적 유전자의 상류 및 하류에 연결할 수 있다. 또한, 치료용 유전자가 도입된 세포의 선택이 용이해지도록, 치료용 유전자에 부가해서 약제 내성 유전자 등의 마커 유전자를 연결할 수 있다. 치료용 유전자는, 센스 유전자이거나 안티센스 유전자일 수 있다.
유전자 치료용 조성물은, 본 발명에 의한 방법에 따라 생산된 조혈 간세포 외에, 완충액이나 신규의 활성물질 등을 더 포함하는 조성물일 수 있다.
또한, 본 발명에 의한 배양계에 의해 증폭된 조혈 간세포를 혈액 이외의 조직으로 분화되는 세포로서 이용하는 것도 가능하다. 종래, 생체에 존재하는 각종 조직의 간세포는 그 조직의 간세포로밖에 기능할 수 없다면 생각되어 왔지만, 최근들어, 다른 장기의 간세포로서 기능하는 것이 알려지게 되었다. 조혈 간세포 또는 조혈 간세포를 포함하는 세포 집단이 간장세포(Lagasse E, Connrs H, Al-Dhalimy M, Reitsma M, Dohse M, Osborne L, Wang X, Finegold M, Weissman IL, Grompe M., Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo., Nat Med. 200O Nov; 6(11):1229-34., [2127] PRODUCTION OF HUMAN HEPAT0CYTES BY HUMAN LIN-, CD34+/- CELLS IN VIVO., Esmail D. Zanjani, Christopher D. Porada, Kirsten B. Crapnell, Neil D. Theise, Dianne S. Krause, F.R. MacKintosh, Joao L. Ascensao, Graca Almeida-Porada. Department of Veterans Affairs Medicl Center, Reno, NV, USA; University of Nevada School of Medicine, Reno, NV, USA; New York University School of Medicine, New York, NY, USA; Yale University, New Haven, CT, USA. Blood 2000 96(11); 494a), 골격근세포(Gussoni E, Soneoka Y, Strickland CD, Buzney EA, Khan MK, Flint AF, Kunkel LM, Mulligan RC., Dystrophin, expression in the mdx mouse restored by stem cell transplantation. Nature. 1999 Sep 23; 401(6751):390-4), 심근세포(0rlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B,Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P., Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature. 2001 Apr 5; 410:701-5), 혈관 내피 세포, 장관 점막 세포(Krause DS, Theise ND, Collector MI, Henegariu O, Hwang S, Gardner R, Neutzel S, Sharkis SJ., Multi-organ, multi-lineage engraftment by a single bone marrow-derived stem cell. Cell. 2001 May 4; 105(3):369-77) 등으로 분화되는 능력을 갖는 것이 나타내어져 있다. 따라서 본 발명에 의한 배양법에 의해 제조된 조혈 간세포를, 간부전, 근육 디스트로피, 심근경색 등에 의한 심근의 괴사, 당뇨병에 의한 혈관 괴사, 또는 장관막 세포의 괴사로부터 정상 세포를 재생시키는 치료에 이용할 수 있다. 본 발명에 의한 배양법에 의해 제조된 조혈 간세포는 또한, 신경 세포의 재생 치료에 이용할 수 있다.
실시예 1: 마우스 골수로부터의 조혈 간세포의 조제
C57BL/6-Ly 5.1 pep(8 내지 10주령, 수컷)(쯔쿠바 대학 나카우치 케이코 교수로부터 공여)의 대퇴골 내의 골수를 채취하여, PBS에 현탁했다. 정법에 따라(타카츠 세이시, 면역연구의 기초기술, 요오도사, 1995년), 마우스 골수 단핵구 세포 획분을 비중 원심법에 의해 농축한 후, 염색 버퍼(5% FCS, 0.05% NaN3을 포함하는 PBS)에 현탁하고, 문헌(0sawa, M. et al., Science 273:242-245, 1996)에 따라서 이하의 방법으로 조혈 간세포 분획을 취득했다.
FITC 결합 CD34 항체, 피코에리트린 결합 Sca-1 항체, 아로피코시아닌 c-Kit(모두 Pharmingen사제), 및 분화 마커(Lin)로서 이하의 6종류의 비오틴화한 분화 항원 특이적인 항체, CD45R, CD4, CD8, Gr-1, Ter119, CD11c(모두 Pharmingen사제)를, 골수 단핵구 세포 현탁액에 첨가하고, 얼음 안에서 20분간 방치하여 반응시켰다. 염색 버퍼로 2회 세정한 후에, 셀 소터(FACS Vantage, Becton Dickinson사)에 의해, CD34 음성, Sca-1 양성, c-Kit 양성, Lin 음성의 세포를 분취했다.
실시예 2: 사이토카인 칵테일과 마우스 조혈 간세포의 액체 배양
실시예 1에 따라 조제한 마우스 조혈 간세포를 U바닥 96웰 플레이트에 50개/웰로 뿌리고, 배양을 했다. 배양에 이용한 배지는 엑스클론 SF03(산코순약사)에 0.1% BSA를 첨가한 것을 이용했다. 사이토카인 칵테일로서, 마우스 SCF(크린빌사), 인간 IL-6(크린빌사), 마우스 IL-11(R&D Systems), Flt-3 리간드(R&D Systems) 각각 50ng/㎖, 또는, 마우스 SCF(크린빌사), FP6(도소사), Flt-3 리간드(R&D Systems) 각각 50ng/㎖를 첨가하고, 37℃, 5% CO2로 7일간 배양을 했다. 7일간의 배양 후, 조혈 간세포/전구세포 증폭의 비율을 조사하기 위해, 실시예 3에 나타내는 경합적 장기 조혈 재구축 분석을 했다.
실시예 3: 방사선 조사한 마우스에의 조혈세포 이식
실시예 2 및 실시예 3에서 배양을 한 세포를, 20만개의 전골수 세포(C57BL/6-Ly 5.2 마우스 유래, 챨스리버사)와 함께, 8.5Gy의 X선을 조사한 C57BL/6-Ly 5.2 마우스(챨스리버사, 8주령, 수컷) 각 5마리씩에 꼬리 정맥주로 이식했다. 이식 후, 경시적으로 안와로 말초혈을 회수하고, FACS에 의해 C57BL/6-Ly5.1 pep 마우스 유래의 세포수의 비율을 산정했다. 정법에 따라(타카츠 세이시, 면역연구의 기초기술, 요오고사, 1995년), 말초혈의 해석을 했다. 말초혈 50㎕에 증류수를 350㎕를 가하고, 30초간 방치하여, 적혈구를 용혈시킨 후에, 2배 농도의 PBS를 가해서 원심하여 백혈구를 회수했다. 세포를 염색 버퍼(5% FCS, 0.05% NaN3을 포함하는 PBS)로 1회 세정한 후에, 항CD16 항체, FITC결합 항Ly 5.1(CD 45.1) 항체, 피코에리트린 결합 항Gr-1 및 CD11c 항체, 및 아로피코시아닌 결합 CD90(Thy1) 및 CD45R(B220) 항체(모두, Pharminen사에서 구입)를 첨가하고, 얼음 안에서 30분 방치해서 반응시켰다. 그 다음에, 염색 버퍼로 세정 후, FACS 해석을 했다. 이식 후 경시적으로, 말초혈 중의, Gr-1 또는 CD11c 양성 세포 중(골수구계)의 Ly 5.1 양성의 비율과, CD90 또는 CD45R 양성 세포 중(림프구계)의 Ly 5.1 양성의 비율을, 각각 산정함으로써, 조혈 간세포 배양 기간 중의 재구축을 행하는 것이 가능한 세포수의 증감을 추정했다.
도 1에 도시한 대로, 사이토카인을 첨가하여 배양을 행함으로써 이식 후 2주간에 높은 키메리즘을 나타내는 단기 골수 재구축 능력을 갖는 조혈 전구세포를 유의하게 증가시키는 것이 가능하다. 그러나, 사이토카인 존재하에 배양한 세포의 키메리즘은 1개월 이후 급속히 저하하여, 배양을 하지 않고 이식한 간세포의 키메리즘보다도 저하하게 되어, 배양 기간에 조혈 간세포가 분화되어 조혈 간세포의 성질인 장기 재구축 능력을 소실한 것을 알 수 있다. 한편, SCF+FP6+FL의 사이토카인 콤비네이션과 SCF+IL-6+IL-11+FL의 사이토카인 콤비네이션을 비교하면, 전자쪽이 장기간에 걸쳐 키메리즘을 높은 값으로 유지하고 있다. 이 결과는, FP6을 이용한 배양계에서는, 마찬가지로 gp130 수용체 시그널을 전달하는 IL-6, IL-11을 첨가한 경우와 다른 조혈 세포의 증폭이 행하여지고 있는 것을 알 수 있다. 전자에있어서는 이식 후 3개월에 있어서도 후자보다 높은 키메리즘이 관찰되어, Fp6을 넣은 사이토카인 콤비네이션은 보다 미분화된 조혈 세포를 증폭하는 것이 가능한 것을 나타낸다.
실시예 4: 마우스 기질 세포 AGM-S3-A9와 조혈 간세포의 공배양
WO99/03980 또는 일본 특허 공개 2001-37471에 따라 기질 세포 AGM-S3을 조제하여, 얻어진 AGM-S3을 서브클로닝함으로써, 인간 제대혈 유래 조혈 간세포에 대한 지지 활성이 높은 서브클론, 즉 BFU-E를 증폭 또는 유지하는 활성이 높은 서브클론으로서 AGM-S3-A9 세포를 얻었다. AGM-S3-A9 세포(10% FCS를 포함하는 MEMα배지에서 배양)를, 1×105개씩 24웰의 배양 접시에 뿌리고, 1일 배양하여, 세포가 배양 접시의 바닥 일면을 덮을 때까지 증식시켰다. 그 후, SCF(크린빌사), TPO(크린빌사)(각 20ng/㎖), FP6(도소사)(각 20ng/㎖ 또는 50ng/㎖)을 포함하는 1㎖의 신선한 배지(10% FCS를 포함하는 MEMα배지)로 교환하고, 실시예 1에서 얻은 마우스 조혈 간세포(C57BL/6-Ly 5.1 유래) 100개를 이들 세포 위에 중층하고, 배양을 개시했다. 배양 7일째에, 세포를 트립신 처리(0.05% 트립신, 0.5mM EDTA를 포함하는 PBS에서 37℃, 2 내지 5분간 방치)하고, 배양 접시의 기질 세포를 포함하는 모든 세포를 회수하여, 배양계의 2분의 1 상당을 1마리의 마우스에 이식했다. 대조로서사이토카인 칵테일만(각 사이토카인 농도는 20ng/㎖)의 배양계(10% FCS를 포함하는 MEMα배지)을 실시예 2에 따라 동시에 준비하여 회수했다. 회수한 세포를 이용하여, 실시예 3에 나타내는 방법에 의해 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포의 증식 상황을 해석한다(도 2).
SCF+TPO+FP6만의 액체 배양에서는, 실시예 3과 같이 이식 후 2주에서 높은 키메리즘은 인지되었지만, 이식 후 2개월에 걸쳐서 키메리즘은 감소한다. 한편, 기질 세포 AGM-S3-A9와 SCF+TPO+FP6의 공배양에서는, 이식 후 2주에 있어서 사이토카인만의 배양 조건과 마찬가지로 높은 키메리즘이 인지되는 동시에, 이식 후 2개월을 경과해도 인풋을 초과하는 높은 키메리즘이 유지되고 있다. 인풋의 키메리즘을 훨씬 초과하는 이 키메리즘의 상승은, 기질 세포 AGM-S3-A9와 SCF+TPO+FP6의 공배양 종료 시에 배양 개시 시의 조혈 간세포보다도 많은 조혈 간세포가 존재하고 있는 것을 나타내고, 조혈 간세포가 이 배양계에서 자기복제하여 증식하고 있는 것을 나타낸다. 이 결과는 AGM-S3-A9 기질 세포와 SCF+TPO+FP6의 존재하 조혈 간세포를 배양하면 조혈 전구세포뿐만 아니라, 조혈 간세포도 증폭할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 5: 인간 간엽계 간세포(hMSC)와 조혈 간세포의 공배양
인간 간엽계 간세포(hMSC)(CAMBREX사, cat. #PT-2501:Lot#:0F0558, 전용배지; hMSC Bullet Kit에서 배양)를, 1×105개씩 24웰의 배양 접시에 뿌리고, 1일 배양하여, 세포가 배양 접시의 바닥 일면을 덮을 때까지 증식시켰다. 그 후, SCF(크린빌사), TPO(크린빌사), FP6(도소사)(각 20ng/㎖)을 포함하는 1㎖의 신선한 배지 (10% FCS를 포함하는 MEMα배지)로 교환하고, 실시예 1에서 얻은 마우스 조혈 간세포(C57BL/6-Ly 5.1 유래) 50개를 이들 세포 위에 중층하고, 배양을 개시했다. 배양 7일째에, 세포를 트립신 처리(0.05% 트립신, 0.5mM EDTA를 포함하는 PBS에서 37℃, 2 내지 5분간 방치)하고, 배양 접시의 기질 세포를 포함하는 모든 세포를 회수했다. 대조로서 사이토카인 칵테일을 첨가하지 않은 hMSC와의 공배양계를 준비하고, 동시에 회수했다. 회수한 세포를 이용하여, 실시예 3에 나타내는 방법에 따라 조혈 간세포의 증식 상황을 해석한다(도 3).
hMSC만과의 공배양을 한 경우 키메리즘의 상승은 관찰되지 않고, 조혈 전구세포, 조혈 간세포 모두 배양 기간 중에 소실되어 갔다. 한편, SCF+TPO+FP6의 사이토카인 칵테일 존재하에 hMSC 세포와 조혈 간세포를 공배양하면, 이식 후 2주에 있어서 높은 키메리즘이 인지되는 동시에 이식 후 2개월을 경과해도 인풋을 초과하는 높은 키메리즘이 유지되고 있다. 인풋의 키메리즘을 훨씬 초과하는 이 키메리즘의 상승은, hMSC 세포와 SCF+TPO+FP6의 공배양 종료 시에 배양 개시 시의 조혈 간세포보다도 많은 조혈 간세포가 존재하고 있는 것을 나타내고, 조혈 간세포가 이 배양계에서 자기복제하여 증식하고 있던 것을 나타낸다. 이 결과는 hMSC 세포와 SCF+TPO+FP6의 존재하 조혈 간세포를 배양하면 조혈 전구세포뿐만 아니라, 조혈 간세포도 증폭할 수 있는 것을 나타낸다.
실시예 6: 인간 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 지지 활성의 평가
(1) 인간 제대혈 CD34 양성 간세포의 분리
인간 제대혈은, 크린빌 의약 탐색 연구소 연구 윤리위원회의 기준에 준거하여, 정상 분만 시에 채취했다. 제대혈은 응고하지 않도록 헤파린(노보 노르디스크사)을 첨가한 시린지를 이용해서 채취했다. 헤파린 처리 제대혈을 Ficoll-paque(Phramacia사)에 중층하고, 비중 원심(400×G, 실온, 30분간)에 의해 단핵 세포를 분리했다. 단핵 세포에 혼입한 적혈구는, 적혈구 용혈제(PharmLyse™, Pharmingen사)로 실온 5분간 처리해서 용출시켰다. 1mM EDTA를 포함하는 PBS로 단핵 세포를 세정 후, CD34 항체 결합 자성체 비즈(Direct CD34 isolation kit, Miltenyi Biotec사)를 첨가하여 빙냉하, 30분간 방치했다. 세포를 세정 후, CD34를 발현하는 세포를 자기 컬럼(MidiMACS, Miltenyi Biotec사)을 이용해서 분리했다. 이 세포 집단을 인간 제대혈 유래 조혈 간세포 집단으로 했다.
(2) 인간 조혈 간세포와 AGM-S3 서브클론(AGM-S3-A9)의 공배양
전일에 A9를 2×105개/웰(6웰 배양 접시)(Falcon사)에 파종하여, 10% FCS를 포함하는 MEMα배지 1㎖로 배양하고, 세포가 웰의 바닥 일면을 덮을 때까지 증식시켰다. 상기 기질 세포 위에 CD34 양성 인간 제대혈 유래 조혈 간세포를 10,000개/웰로 중층하고, 4㎖의 10% FCS를 포함하는 MEMα배지에 FP6 20ng/㎖, 인간 SCF 20ng/㎖, 인간 TPO(크린빌사) 20ng/㎖, 및 인간 FL 100ng/㎖(R&D systems사, 카탈로그 번호 308-FK)를 포함하는 사이토카인 칵테일(STF+FP6)을 첨가하여 공배양했다. 증식 활성 비교를 위해, 대조군은 사이토카인을 첨가하지 않고 A9만의 공배양, 또는 A9 비존재하, 12웰 플레이트에서 2㎖의 상술의 사이토카인 칵테일을 포함하는 배지에서 배양했다. 공배양 개시 1주간 후에 절반의 배지를 제거하고, 새로 배지 1㎖를 첨가했다. 공배양 개시 2주간째에 트립신 처리(0.05% 트립신, 0.5mM EDTA를 포함하는 PBS(GIBCO BRL사)에서 37℃, 5 내지 10분간 방치)에 의해 기질 세포와 인간 혈액 세포를 동시에 배양 접시에서 떼어내어, 콜로니 분석에 붙여서 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포의 증식을 해석했다.
(3) 콜로니 분석에 의한 조혈 간세포 및 조혈 전구세포의 증식 상황의 평가
상기 공배양계에서 증식한 세포는, 적당히 희석해서 1㎖ 메틸 셀룰로오스 배양계에 붙이고, 4중 해석을 했다. 또한 증폭 효과를 비교하기 위해서 대조로서 공배양 전의 CD34 양성세포에 대해서도 같은 콜로니 분석을 실시했다. 메틸 셀룰로오스 배양계는, 0.89% 메틸 셀룰로오스(신에쯔 화학)를 포함하는 IMDM 배지(GIBCO BRL사)에 10% 소 태아 혈청(Hyclone사), 2mM L-글루타민(GIBCO BRL사), 1mM 피루브산나트륨(와코 화학), 0.5μM 2-메르캅토에탄올 및 항생물질(최종 농도는 페니실린 100U/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖, 안포테리신 B ng/㎖; 항생제-항진균제(×100), 액체, GIBCO BRL사)을 첨가한 것에 사이토카인으로서 10Ong/㎖ 인간 SCF, 인간 IL-6, 10ng/㎖ 인간 IL-3, 인간 G-CSF, 인간 TPO, 4IU/㎖ EPO(모두 크린빌사)를 첨가하여, 35㎜ 배양 접시(Nunc사)에서 실시했다. 상기에서 이용한 각종 조혈인자는, 모두 리콘비난트체이며, 순수한 것이다. 2주간의 배양 후, 출현된 콜로니를 현미경하에서 관찰하여, CFU-GM(과립구-대식세포 콜로니 형성 단위), BFU-E(적혈구군 형성 단위), CFU-Emix(적혈구 혼합 콜로니 형성 단위)의 수를 계측했다.
도 4에 CD34 양성 조혈 간세포와 AGM-S3-A9 기질 세포 존재하, 또는 기질 세포 비존재하 2주간 배양 후의 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포의 증폭 상황을 검토한 결과를 나타낸다. AGM-S3-A9 기질 세포와 사이토카인 칵테일 배지에 의해 공배양 전에 비해서 CFU-GM, BFU-E, CFU-Emix 모든 분화 계열 세포의 증식이 지지된다. 또, 사이토카인 단독의 배양계와 비교해서, 기질 세포가 존재함으로써 사이토카인 칵테일만 존재한 경우와 비교해서 모든 콜로니의 증폭을 확인할 수 있었다. 특히 적혈구계의 전구세포인 BFU-E, CFU-Emix를 유지하는 것은 통상 곤란하지만, 사이토카인 칵테일 존재하에서의 기질 세포와의 공배양계에서는 사이토카인 단독보다도 그 증식이 인지되었다. 따라서, 인간 조혈 세포에 대해서도 기질 세포 존재하에 sIL-6R-IL-6 융합 단백질을 포함하는 사이토카인 칵테일을 첨가함으로써 조혈 간세포 또는 조혈 전구세포의 증폭을 촉진하는 것이 가능해졌다.
(4) A9와 사이토카인 칵테일에 의한 조혈 간세포 지지 활성에 있어서의 FP6의 효과
본 조혈 간세포 증식 배양계에 있어서의 FP6의 활성에 대해서 평가했다. FP6을 포함하는 사이토카인 칵테일(SCF+TPO+FL+FP6) 또는 FP6을 포함하지 않는 사이토카인 칵테일(SCF+TPO+FL)을 첨가한 경우의 AGM-S3-A9 공배양계, 또는 비공배양계에 대해서, CD34 양성 인간 제대혈 유래 조혈 간세포에 대한 간세포 지지능력의 비교를 CFU-GM, BFU-E, CFU-Emix를 지표로, 상기 (2) 및 (3)의 평가계를 이용해서 실시했다. 도 5에 2주간 공배양의 결과를 나타낸다. 어떤 사이토카인 칵테일을 이용한 경우라도 기질 세포의 존재에 의해, 모든 콜로니 형성 세포를 증폭시킬 수 있었다. SCF+TPO+FL+FP6과 SCF+TPO+FL의 사이토카인의 조합에서는, FP6이 존재하는 쪽이 보다 많은 콜로니 형성 세포의 증가가 확인되었다.
지금까지 기질 세포 비존재하에 SCF+TPO+FL에 sIL-6R-IL-6 융합 단백질, 또는 SCF+TPO+FL에 sIL-6R, IL-6을 첨가하여 배양함으로써 SCID 재구축 세포를 효율적으로 증폭시킬 수 있는 보고가 되어 있는데(Kollet O, Aviram R, Chebath J, ben-Hur H, Nagler A, Shultz L, Revel M, Lapidot T., sIL-6R-IL-6:The soluble interleukin-6(IL-6) receptor/IL-6 fusion protein enhances in vitro maintenance and proliferation of human CD34(+)CD38(-/low) cells capable of repopulating severe combined immunodeficiency mice., Blood 1999 Aug 1 94:3 923-31, Ueda T, Tsuji K, Yoshino H, Ebihara Y, Yagasaki H, Hisakawa H, Mitsui T, Manabe A, Tanaka R, Kobayashi K, Ito M, Yasukawa K, Nakahata T., Expansion of human NOD/SCID-repopulating cells by stem cell facter, Flk2/Flt3 ligand, thrombopoietin, IL-6, and soluble IL-6 receptor. J Clin Invest. 2000 Apr; 105(7):1013-21.), 본 실시예에서는 기질 세포를 상기 사이토카인의 조합에 가함으로써 사이토카인 칵테일 단독을 능가하는 콜로니 형성 세포의 증폭이 확인되었다. 본 실시예의 결과는 사이토카인 칵테일 단독에 비해서 기질 세포를 배양계에 존재시킴으로써 콜로니 형성 세포를 증가시키는 것이 가능한 것을 나타내고 있고 인간 조혈 간세포가 증폭되어 있는 것을 나타내는 것이다.
본 조혈 간세포 배양계에 있어서의 TPO의 활성에 대해서 검토했다. TPO를 포함하는 사이토카인 칵테일(SCF+TPO+FL+FP6) 또는 TPO를 포함하지 않는 사이토카인 칵테일(SCF+FL+FP6)을 첨가한 경우의 AGM-S3-A9 공배양계에 대해서, CD34 양성 인간 제대혈 유래 조혈 간세포에 대한 간세포 지지 능력의 비교를 CFU-GM, BFU-E,CFU-Emix를 지표로, 상기 (2) 및 (3)의 평가계를 이용해서 실시했다. 도 6에 결과를 나타낸다. TPO가 존재할 경우(SCF+TPO+FL+FP6)와 TPO가 존재하지 않는 (SCF+FL+FP6)경우에서 비교하면 BFU-E에서 3.8배, CFU-Emix에서 33배의 증폭 효과의 차이가 인지되었다. 이 결과는, 본 조혈 간세포 배양계에 첨가해야 할 사이토카인으로서 TPO가 선택되는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 검토를 행함으로써, 본배양계에 적합한 사이토카인의 선택을 행할 수 있는 것을 나타낸다.

Claims (13)

  1. gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는, 조혈 간세포의 제조법.
  2. 제1항에 있어서, gp130 자극 인자가, 인터류킨-6(IL-6) 또는 그의 변이체와 IL-6 수용체의 α쇄(IL-6R) 또는 그의 변이체와의 융합 단백질, IL-6R 또는 그의 변이체와 IL-6 또는 그의 변이체와의 조합, gp130에 대해서 아고니스트로서 작용하는 gp130에 대한 항체, IL-11, 백혈구 유주 저지 인자(LIF), 온코스타틴 M, 또는 카르디오트로핀인 제조법.
  3. 제1항에 있어서, gp130 자극 인자가 IL-6 또는 그의 변이체와 IL-6R 또는 그의 변이체와의 융합 단백질인 제조법.
  4. 제3항에 있어서, 융합 단백질이, IL-6R의 112번으로부터 333번까지의 단편의 C 말단과, IL-6의 38번으로부터 212번까지의 단편의 N 말단을 직접 연결하여 이루어지는 단백질(FP6)인 제조법.
  5. 제1항에 있어서, 사이토카인류가 조혈 간세포를 증식 및(또는) 유지하는 인자인 제조법.
  6. 제1항에 있어서, 사이토카인류가 간세포 인자(SCF), 트롬보포에틴(TPO) 또는 그의 변이체 또는 그것들의 유도체, Flt-3 리간드(FL), 또는 이것들의 조합인 제조법.
  7. 제1항에 있어서, 사이토카인류가 적어도 트롬보포에틴(TPO) 또는 그의 변이체 또는 그것들의 유도체를 포함하는 것인 제조법.
  8. 제1항에 있어서, 기질 세포가 AGM(Aorta-Gonad-Mesonephros: 대동맥-생식선-중신) 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포, 간엽계 간세포, 선유아 세포, 혈관 내피 세포, 태아 간장 유래 세포 또는 전지방세포인 제조법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 조혈 간세포의 배양 공정 전에, 기질 세포를 배양하는 공정을 더 포함하는 제조법.
  10. gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는, 조혈 간세포의 배양법.
  11. 인터류킨-6(IL-6)과 IL-6 수용체의 α쇄(IL-6R)의 융합 단백질과, 트롬보포에틴(TPO)과, AGM 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포 및 간엽계 간세포로부터선택되는 기질 세포와, 경우에 따라서는 간세포 인자(SCF) 및 Flt-3 리간드(FL)의 존재하에서 조혈 간세포를 배양하는 공정을 포함하는, 조혈 간세포의 제조법.
  12. gp130 자극 인자와, 1종 이상의 사이토카인류와, 기질 세포를 포함하는, 조혈 간세포의 배양에 이용되는 배지.
  13. 인터류킨-6(IL-6)과 IL-6 수용체의 α쇄(IL-6R)의 융합 단백질과, 트롬보포에틴(TPO)과, AGM 영역 유래의 세포, 골수 유래 기질 세포 및 간엽계 간세포로부터 선택되는 기질 세포와, 경우에 따라서는 간세포 인자(SCF) 및 Flt-3 리간드(FL)를 포함하는, 조혈 간세포의 배양에 이용되는 배지.
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