KR101027288B1 - 스탓3 활성화 줄기세포 - Google Patents

Abstract

유전적 변형 또는 단백질 전달을 통해 스탓3의 활성형을 발현하기 위해 변형된 줄기세포와 스탓3의 활성형을 발현하는 세포로 동시배양된 줄기세포는 생체 외 증폭을 증가시키고, 대조군에 비해 줄기세포의 자가 재생산의 수적 증가에 의해 동반되는 생체 내 재생을 증진시킨다.

스탓3, 스탓3-C, 활성화, 줄기세포, 조혈모세포, 탯줄혈액(제대혈),

Description

스탓3 활성화 줄기세포{STAT3 ACTIVATED STEM CELL}

본 발명은 변형된 줄기세포에 관한 것이다. 본 발명은 또한 시험관내(in-vitro)에서 줄기세포의 증폭을 목적으로 하는 줄기세포의 변형방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 생체내(in-vivo)에서 줄기세포의 증폭과 자가 재생산을 증진시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 나아가 변형된 줄기세포를 이용한 조직의 재생에 관한 것이다.

줄기세포 치료는 많은 종류의 치료 불가능한 질환들에 대한 새로운 의학적인 접근이다. 두 종류의 줄기세포인 성체 줄기세포와 배아 줄기세포가 조직의 재생을 위해 사용될 수 있다. 탯줄혈액의 줄기세포와 골수기원의 줄기세포, 췌장 줄기세포나 간 줄기세포 등을 포함하는 성체 줄기세포는 특정조직에서 얻을 수 있는 수가 매우 제한되어 있다.

다분화능을 가진 성체 줄기세포는 스스로 자가 재생산하는 능력과 다계열 분화를 할 수 있는 능력을 갖고 있다. 하지만 이러한 자가 재생산이나 성체 줄기세포의 증폭을 조절하는 분자적인 기전(molecular mechanism)은, 특히 조혈모세포의 경우, 잘 알려져 있지 않다.

조혈모세포는 다분화능의 다양성이나 시험관내 혹은 생체내에서 증식하는 능 력이 잘 밝혀진 성체 줄기세포의 한 종류이다.

발달단계 중 가장 초기의 미분화 상태에 있는 조혈모세포는 스스로 자가 재생산하는 능력을 지니며 방사선 조사된 수혜자에 이식될 경우 장기간 지속되는(long-term repopulating) 다계열로의 분화가 가능하다. 이러한 세포들은 그 존재가 증명된 바 있으며 이식모델에서 경쟁적 재점유 단위 혹은 생체 이식단위(CRU; competitive repopulating unit)로 정의된다 (Larochelle 1996).

조혈작용에 관여하는 다른 종류의 전구세포들의 계열은 비장집락형성단위(CFU-S; colony-forming unit-spleen)를 형성하는 능력을 통해 평가될 수 있으며 이것은 좀 더 분화된 표현형으로서 단기간 재생(short-term repopulating)되는 능력을 나타낸다.

줄기세포 치료의 최적화를 제한하는 한가지 요인은 이러한 다분화성 줄기세포는 분화과정에 빠지기 쉬우며 이 과정에서 줄기세포의 특성을 잃게 되어 결과적으로 조작과정에서 줄기세포의 알짜수가 줄어든다는 점이다. 싸이토카인을 이용한 체외배양이나 줄기세포의 증식을 조절하는 데 관여하는 유전자의 조작을 통해 이러한 줄기세포를 확장하는 수단이 행해진 바 있다. 하지만 총 세포수의 증가에도 불구하고 체외배양은 좀 더 분화된 줄기세포의 특성을 유발하는 경향이 있다(Danet 2001, Dorrel 2000, Xu 2001).

이러한 제한점들을 극복하기 위해 성장인자의 수용체나 전사인자들을 포함한 줄기세포의 유전적변형을 적용하는 몇몇 시도가 행해진바 있고 이러한 연구들에서 다양한 정도의 줄기세포 활성의 증가를 얻을 수 있었다(Hanazono 2002, Sauvageau 1995).

줄기세포의 분화에 관한 최근의 연구들에서 성체 줄기세포가 예상된 조직 외에 기대 이상의 조직 종류들로 분화할 수 있다는 점이 밝혀졌다. 예를 들어 조혈모세포는 조혈계의 림프-골수계열 외에 신경세포, 간세포, 신장세포, 심근세포 및 혈관세포로 분화가 가능하다(Eglitis 1997, Poulsome 2001, Lagasse 2000, Orlic 2000).

스탓3(STAT3)는 인터류킨6(IL-6) 성장인자나 gp-130수용체 계열의 활성에 의해 촉진되는 신호전달 분자이다. 이 분자는 N-말단부위 근처의 DNA 결합영역, SH2 영역, C-말단부위 근처의 상호 활성화영역으로 구성되어 있다.

gp-130수용체가 신호를 받게 되면 JAK2 키나아제가 활성화되고 이로 인해 스탓3의 티로신 잔기가 인산화된다. 이로 인해 스탓3는 이량체화되고 목표유전자의 활성화를 위해 핵내 국소화된다.

최근 스탓3의 일부 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환함으로써 스탓3의 활성을 지속적으로 유지할 수 있다는 것이 알려져 있다(이러한 분자를 스탓-C로 명명한다). 이러한 조작은 티로신의 인산화나 세린의 인산화과정 없이도 분자간의 이중설파이드 연결의 형성으로 이량체화를 유발한다(Bromberg 1999).

스탓3 유전자의 기능적인 녹 아웃(knock out)은 배아 줄기세포의 자가 재생산과 분화의 상실을 유발한다는 점이 알려져 있으며 스탓3의 기능은 배아 줄기세포의 미분화특성을 유지하는 데 필요한 것으로 보여진다(Matsuda 1999, Niwa 1998).

하지만 성체 조혈모세포를 조절하는 분자적인 기전은 배아 줄기세포의 조절 과는 유사하지 않은 것으로 여겨지는데 왜냐하면 배아 줄기세포의 이식이 골수의 완전한 재생을 유발하지는 못하기 때문이며 성체 조혈모세포에서 이러한 기전은 아직 파악되지 못했다.

최근 우성적 억제형(dominant negative from)의 스탓3의 과발현은 유전조작된 조혈모세포를 통해 골수의 재생을 억제한다는 사실이 밝혀졌고, 이것은 성체 조혈모세포에 특이한, 이식된 줄기세포의 생체내 재점유에 필요한 기전으로서 스탓3의 활성화를 확인한 첫 경우이다(Oh 2002).

하지만 이 연구에서 자연형(wild-type)의 스탓3 유전자는 골수재생과 관련된 줄기세포 기능에 아무런 영향을 미치지 못했다. 그러므로 이 인용에서 스탓3의 유전적 조작을 통한 줄기세포 확장이 밝혀진 것은 아니다.

미국특허 6,235,873은 스탓3의 돌연변이체인 스탓3-C가 세포내에서 스탓3 단백질의 이량체화를 증가시킨는 것을 보여준다. 스탓3-C는 단백질의 SH2영역의 C말단부위에 두개의 시스테인 잔기를 포함하고 있다. 하지만 상기 미국특허는 줄기세포나 관련된 전구세포, 그리고 이들의 재생능력의 기능적인 조절을 나타내거나 제안하지는 않는다.

마쓰다 등은 저널(EMBO Journal 18, 15, 4261-4269, 1999)을 통해 스탓3의 활성화가 마우스(mouse)의 배아 줄기세포를 미분화상태로 유지하는 데 충분조건이라는 것을 밝혔다. 니와 등은(Genes and Development, 12, 13, 2048-2060, 1998) 다분화능의 배아줄기세포의 자가 재생산이 스탓3의 활성화를 통해 매개된다는 것을 밝혔다. 스탓3의 우성적 억제형(STAT3-F)와 스탓3의 활성유도형(STAT3-ER)이 배아 줄기세포의 미분화형을 유지하는 데 있어 스탓3 활성의 필요성을 보여준 바 있다. 하지만 이러한 인용들은 활성화된 스탓3형의 스탓3 기능이 이러한 조작상태 이상으로 증가된다는 것을 보여주지는 못하였다. 또한 성체 줄기세포나 조혈모세포 등의 일반적인 줄기세포에서의 사용이나 조직의 생체 내 재생과정에서 증가된 활성을 증명하지 못했다.

오 등은 스탓3의 우성적 억제형의 과발현이 조혈모세포의 재생활성을 억제한다는 것을 밝혀내었다(Oncogene Jul 18;21(31);4778-87; 2002). 하지만 자연형의 스탓3는 이러한 줄기세포에 아무런 영향을 주지 못하였다. 그러므로 해당 인용은 줄기세포의 활성이 스탓3의 활성형에 의해 증가되었다는 것을 보여주지 못하였다.

본 응용은 스탓3의 활성형(스탓3-C)의 외인적 발현이 자가 재생산 및 재생능력의 증가를 동반한 줄기세포의 수적증가를 유도하는 점을 기술한다.

한편, 본 발명은 자가 재생산을 증가시키며 시험관내 및 생체내 줄기세포의 증가를 통해 조직 및 장기의 재생을 촉진하는 방법을 지향한다. 줄기세포에서의 스탓3 기능의 증가를 통해 줄기세포는 미분화 줄기세포의 수적증가를 동반한 높은 자가 재생산능력과 증가된 재생능력을 보인다.

줄기세포 내로 스탓3 유전자의 활성형(스탓3-C)을 이입하거나 이러한 단백질(His-TAT-STAT3-C 융합단백질)의 전달을 통해 증가된 스탓3 활성은 줄기세포의 증식이나 재생능력을 증가시키는 데 유사한 효과를 보인다.

그러므로 줄기세포의 증폭과 재생능력의 증가는 유전자치료적 접근이나 단백 질치료를 통해서 얻을 수 있다.

줄기세포의 증식능력의 이러한 증가는 스탓3의 활성형을 발현하는 중간엽 줄기세포의 지지세포층과 동시배양을 통해서도 얻을 수 있다.

증식과 재생능력의 증가는 시험관내 배양 및 생체내 재생에서 모두 일어났으며 체외 줄기세포의 증폭과 동시에 생체내 재생의 증가기법과 동반된 혹은 전술한 방법의 변형으로 특정한 줄기세포군의 선택적인 증폭을 포함한다.

바람직한 실시예로서, 줄기세포는 조혈모세포를 의미하며 좀 더 구체적 실시예에서 조혈모세포는 세포표면 표식자인 CD34나 c-kit을 발현하는 인간 조혈모세포이고 비조혈 조직인 간, 심장, 신장, 혹은 신경조직으로 분화할 수 있는 조혈모세포를 포함한다.

발명의 다른 측면에서 줄기세포 활성은 스탓3 활성의 증가를 통해 촉진될 수 있으며 스탓3의 활성의 조절을 목표로 하는 어떠한 종류의 약리학적인 조정이나 자연적 리간드가 줄기세포의 증식 및 재생능력의 조절을 위해 사용될 수 있다.

그러므로 이 발명은 스탓3 활성을 조절하는 다양한 접근을 통해 줄기세포의 자가 재생산 및 증폭을 증가시키는 방법을 목표로 한다.

이 발명은 스탓3의 활성형태를 포함한 변형된 줄기세포를 지향한다. 변형된 줄기세포는 변형되지 않은 근원세포의 다능성을 유지하며 시험관내 증식능력이 증가될 수 있다. 또한 변형된 줄기세포는 조혈모세포로 간주한다. 변형된 줄기세포는 조혈계세포 뿐만 아니라 비조혈계 세포로 분화할 수 있다. 세포는 포유동물의 세포이며 이중 인간 줄기세포로 탯줄혈액에서 얻어질 수 있다. 또한 스탓3는 스탓3-C로 간주한다.

본 발명은 상기 기술된 변형된 줄기세포를 지향하며 단백질 이입을 통해 세포내 지속적으로 활성화된 스탓3의 단백질 산물을 갖는다.

본 발명은 활성화된 스탓3 유전자를 세포내 이입하는 방법을 포함하여 전술한 변형된 줄기세포를 만드는 방법을 또한 지향한다. 상기 방법에서 스탓3는 스탓3-C이며 변형된 줄기세포는 스탓3 폴리펩티드를 세포내 전달을 통해 만들어질 수 있다. 이 방법에서 스탓3는 스탓3-C이다.

본 발명은 또한 상기한 변형된 줄기세포를 증식하는 것을 고려하여 줄기세포군의 증폭법을 지향한다. 세포군은 체외, 체내, 시험관내의 경우를 포함할 수 있다. 나아가 이 방법은 스탓3의 활성을 증가시키기 위해 줄기세포에 화학적 물질과 접촉하는 것을 포함할 수 있다. 한편 화학적 물질은 스탓3의 이량체화를 유도하는 물질이거나 스탓3의 이량체화 변이이다. 혹은 본 방법은 줄기세포군과 활성화된 스탓3를 발현하는 세포를 동시배양하는 방법을 포함한다.

본 발명은 필요에 의해 특정 대상에게 상기 기술한 변형된 줄기세포를 투여하는 방법을 포함하여 이식 후 생착을 촉진하는 방법을 지향한다. 다른 한편으로 본 발명은 필요에 의해 특정 대상에게 상기한 변형된 줄기세포를 투여하는 방법을 포함하여 대상의 조직재생 방법을 지향한다.

또 다른 한편으로 본 발명은 골수 세포가 손상된 환자가 골수세포를 회복할 수 있는 방법을 지향하며 이것은 필요에 의해 대상에 상기한 변형된 줄기세포를 넣는 방법을 포함한다.

본 발명의 이러한 목적 및 그 외 목적들은 이후 기술 및 인용된 삽화 및 첨부된 주장을 통해 좀 더 이해를 용이하게 한다.

본 기술에서 부정관사는 사물의 단, 복수에 대해 모두 적용된다.

본 발명과 기술되는 방법 이전에 본 발명은 특정한 세포종류, 스탓3-C유전자나 요약된 방법에 국한되지 않는다. 또한 기술되는 용어는 특정 구체화의 기술목적일 뿐 한계설정을 의도하지 않는다.

(정의)

여기에서 사용되는 "활성화된 스탓3"는 줄기세포의 증식능력을 증가시키기 위한 다양한 스탓3의 변형을 의미한다. 이러한 활성화는 스탓3의 이량체화를 통해 나타날 수 있다. 또 다른 방법은 스탓3의 인산화를 포함한다. 예를 들어 스탓4는 티로신(705번째 잔기) 및 세린(723번째 잔기)의 인산화를 통해 활성화될 수 있다. 또한 특정한 탈인산화효소는 이러한 분자에서 신속하게 인산기를 제거하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 스탓3에 특이적으로 작용하는 탈인산화효소를 억제함으로써 스탓3의 활성도를 증가시킬 수 있다. 스탓3를 활성화하는 다른 방법은 스탓3활성화에 대한 음성조절인자를 억제하는 화학물질과 세포를 접촉시키는 것이다. 예를 들어 SOCS계열의 유전자(SOCS-1에서 SCOS-6)는 스탓의 음성조절의 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러므로 SOC유전자계열을 억제함으로써 스탓3를 활성화할 수 있다.

여기서 사용되는 아미노산(amino acid and amino acids)은 자연적으로 존재하는 모든 L-알파-아미노산을 지칭한다. 이 정의는 노르류신, 오르니틴, 호모시스 테인을 포함한다.

여기서 사용되는 아미노산서열의 변이체는 원래의 폴리펩티드서열과 비교해 아미노산서열의 차이가 있는 분자를 지칭한다. 아미노산의 변형은 원 아미노산서열에 대해 변이에 해당하는 치환, 삽입, 삭제, 재조합을 포함한다.

치환변이체는 원서열에서 하나 이상의 아미노산잔기가 삭제되고 동일한 위치에 다른 아미노산이 삽입된 것이다. 이러한 치환은 분자내 하나의 아미노산이 치환된 단일성일 수 있고 하나의 분자에서 두개 혹은 그 이상의 아미노산이 치환된 다중성일 수 있다.

아미노산의 서열내 치환은 해당아미노산이 속하는 계열의 다른 아미노산을 택해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성)의 아미노산은 알라닌, 류신, 이소류신, 발린, 프로린, 페닐알라닌, 트립토판, 메치오닌을 포함한다. 극성의 중성 아미노산은 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴, 글루타민을 포함한다. 양극성(알칼리성) 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘을 포함한다.

음극성(산성) 아미노산은 아스파르틱산과 글루타믹산을 포함한다. 본 발명의 범위에는 동일하거나 유사한 생물학적 특성을 갖는 단백질 및 단백질단편, 단백질유도체를 포함하며 또한 단백번역과정중 혹은 이후에 발생하는 당화, 단백질분해, 항체분자 및 세포리간드와의 결합 등으로 변형된 단백질유도체를 포함한다.

삽입변형체는 하나 혹은 그 이상의 아미노산이 원 아미노산서열의 특정부위에 최인접되어 삽입된 것이다. 최인접된 부위는 아미노산의 알파-카르복실 혹은 알파-아미노 기능군과 연결된 것을 의미한다.

삭제변형체는 원 아미노산서열에서 하나 혹은 그 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 일반적으로 삭제변형체는 분자의 특정영역에서 하나 혹은 두개의 아미노산이 삭제된 것이다.

다른 한편으로 본 발명에서 스탓3의 변형체는 스탓3에서 일정갯수의 아미노산이나 혹은 아미노산의 변형을 포함할 수 있는데 이러한 변형은 스탓3로 해독되는 유전자 혹은 폴리펩티드의 일정영역에 치환, 삽입, 삭제를 포함할 수 있으며 변형된 스탓3는 활성화되어 이러한 활성형의 스탓3 혹은 활성형의 스탓3 유전자를 포함하는 줄기세포의 증식능력을 촉진한다. 스탓3 단백질이나 DNA의 변형체는 알려진 스탓3의 폴리펩티드 및 DNA서열에서 최소한 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%의 유사성을 갖는 서열을 포함한다.

여기서 전달체(carrier)는 약리학적으로 인정된 전달체, 부형제(excipient)나 안정제(stabilizer)로서 사용하는 량 및 농도에 노출되는 세포나 이에 포유동물에 독성이 없는 것이다. 약리학적으로 인정된 전달체는 수성페하완충용액이다. 약리학적으로 인정된 전달체의 예는 인, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코빅산을 포함한 항산화제; 낮은분자량(10이하의 잔기)의 폴리펩티드, 혈청알부민, 젤라틴, 면역글로불린 등의 단백질; 폴리비닐피롤리딘 등의 친수성의 폴리머; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌, 리신 등의 아미노산; 단당류, 이당류 및 글루코스, 만노오스, 덱스트린 등의 당류; EDTA등의 킬레이팅제제; 마니톨이나 소르비톨 등의 당알콜; 나트륨등의 염형성반대이온(salt-forming counterion); TWEEN^®, PEG, PLURONICS^®등의 비이온 계면활성제등이다.

여기서 사용되는 공유유도체(covalent derivatives)는 스탓3 등의 원(native) 폴리펩티드나 이로부터 유래하는 유기 단백 혹은 비단백 유도체를 포함한 단백단편, 변역후 변형 등의 일련의 변형을 포함한다. 스탓3의 활성화는 우선적으로 이러한 공유성변형을 통해서 얻어진다. 이러한 활성화는 스탓3의 이량체화를 통해 발생한다. 다른 방법은 인산화를 포함한다. 공유성 변형은 전통적으로 목표로 하는 아미노산 잔기를 선택된 잔기 혹은 말단잔기와 반응할 수 있는 유기성 유도성물질과 반응시키거나 혹은 선택된 재조합 숙주세포에서 기능하는 번역후변형(post-translation modification)의 기전을 이용함으로써 행해진다. 특정한 번역후변형은 재조합 숙주세포가 발현된 폴리펩티드에 대한 영향의 결과이다.

여기서 사용되는 효과적인 양(effective amount)은 효과적인 이로운 혹은 원하는 임상적 혹은 생화학적 결과를 얻는 데 충분한 양이다. 효과적인 양은 일회 혹은 그 이상 횟수로 투여될 수 있다. 본 발명의 의도에서 효과적인 양은 줄기세포의 증식능력을 향상시키는데 필요한 스탓3의 활성화시키는 물질의 양 혹은 활성화된 스탓3의 양이다. 또 다른 실시예로 효과적인 양은 조직재생에 효과적인 활성화된 줄기세포의 양으로 정의한다.

여기서 사용되는 숙주세포(host cell)는 본 발명의 벡터의 수혜를 받는 단일 세포 혹은 세포배양을 포함한다. 숙주세포는 단일숙주세포의 분열된 세포를 포함하며 이러한 분열후 세포는 정상적인, 우연히 나타나는, 혹은 의도적인 돌연변이 및 변화에 의해 형태학적이나 총 DNA양 등에서 원래의 근원세포와 완전히 동일할 필요는 없다. 숙주세포는 혈관신생인자를 만드는 폴리펩티드를 포함한 벡터를 체내에서 감염된 세포를 포함한다.

여기서 사용되는 포유동물(mammal)은 치료의 대상이 되는 사람, 애완용동물 혹은 가축으로 개, 고양이, 소, 양, 말, 돼지 등의 동물을 포함하는 모든 종류의 포유동물을 지칭한다. 선택적으로 포유동물은 사람이다.

여기서 정제된(purified) 혹은 분리된(isolated) 분자는 원래의 환경에서 추출되거나 자연적으로 연관된 원래의 다른 요소들로부터 고립되고 분리되어 나온 된 생물학적 분자를 지칭한다.

여기서 사용되는 표본(sample) 혹은 생물학적표본(biological sample)은 넓은 의미로 개인, 체액, 세포주, 조직배양 및 줄기세포를 포함할 수 있는 다른 종류의 공급원에서 얻어진 모든 종류의 생물학적 표본은 포함하며 행해질 분석의 종류에 따른다.

여기서 사용되는 서열동일도(sequence identity)는 해당서열에서 원래의 폴리펩타이드서열과 서열의 상호나열을 통해 완전히 일치하는 아미노산잔기의 비율로 필요시 최대 서열동일도를 얻기 위해 갭을 포함할 수 있으며 서열동일도의 일부로서 보존적인 치환을 고려하지 않을 수 있다. 서열동일도의 비율은 NCBI BLAST 2.0소프트웨어(Altschul등; 1997)나 "Gapped BLAST and PSI-BLAST" (Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)를 통해서 얻을 수 있다.

여기서 사용되는 대상(subject)은 척추동물로, 선택적으로 포유동물이며, 인 간이다.

여기서 사용되는 치료(treatment)는 이로운 혹은 의도된 임상적인 결과를 얻기 위한 접근이다. 본 실험의 목적에서 이로운 혹은 의도된 임상적인 결과는 증상의 완환, 질환정도의 감소, (악화되지 않는)질환상태의 유지, 질환진행의 지연, 질환상태의 개선 혹은 완화(palliation), (일부 혹은 완전한)완화(remission)로 발견유무에 관계없이 포함한다. 치료는 또한 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존률과 비교해 증가된 생존을 의미할 수 있다. 치료는 치료적 외 예방적 수단을 동시에 포함한다. 치료가 필요한 경우는 질환을 이미 가지고 있는 경우와 질환이 예방되어야 하는 경우를 포함한다. 질병의 완화는 치료받지 않는 상황과 비교해서 원치않는 질병의 임상양상의 호전이나 질병의 추이가 지연되거나 연장되는 경우이다. 전형적으로 치료는 조직재생을 위해 환자에게 활성화된 혹은 변형된 줄기세포를 투여하는 경우를 포함한다.

여기서 사용되는 벡터(vector), 폴리뉴클레오티드벡터(polynucleotide vector), 컨스트럭트(construct), 폴리뉴클레오티드 컨스트럭트(ploynucleotide construct)는 상호적으로 사용된다. 본 발명에서 폴리뉴클레오티드벡터는 여러 가지 형태를 포함하여 RNA, DNA, 역전사바이러스 외피로 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 외피로 캡슐화된 DNA, 바이러스 혹은 바이러스유사체(허피스(herpes), 아데노관련바이러스(AAV) 등)로 패키지된 DNA, 리포좀으로 캡슐화된 DNA, 폴리리신이나 다가양이온분자, 폴리에틸렌글리콜(PEG)등 분자를 면역학적으로 차폐시켜 반감기를 중가하는 물질과 결합된 DNA, 혹은 비바이러스성 단백질과 결합된 DNA 등이다. 여 기서 DNA는 A,T,C,G 등의 염기 이외에 이들의 유사체 혹은 염기의 변형체로 메틸화된 뉴클레오티드나 비극성연관, 티오에이트 등의 뉴클레오티드간 변형, 당유사물의 사용, 폴리아미드 등의 다른 DNA백본구조의 사용 등을 모두 포함한다.

여기서 사용되는 줄기세포(stem cell)는 다계열로 분화하며 자가재생산능력 및 조직재생능을 갖춘 세포를 지칭한다. 비록 본 응용에서 줄기세포의 대부분은 조혈모세포의 관점에서 씌여졌으나 본 발명은 여기에 제한되지 않고 간, 췌장, 신경, 골수기원 중간엽 줄기세포 등의 다른 기원의 줄기세포를 포함할 수 있다.

여기서 사용되는 생착(engraftment), 체내 재생(in-vivo regeneration)은 생물학적인 현상을 지칭하며 임플란트되거나 이식된 줄기세포가 체내에서 분화하거나 자가재생산하며 이와 동반되어 주입된 세포가 소실되거나 손상받은 세포를 대체하는 경우이다.

여기서 사용되는 이식생착단위(CRU(competitive repopulating unit))는 장기간의 생착가능한 줄기세포로 체내이식 후 발견가능한 단위를 지칭한다.

여기서 사용되는 변형된 줄기세포(modified stem cell) 및 활성화된 줄기세포(activated stem cell)는 외인적 유전물질가 세포내부로 주입되어 특정한 경우 유전체 내로 삽입되거나 세포내부에 외인적 단백산물이 주입된 줄기세포를 지칭한다.

(줄기세포)

줄기세포는 신체내의 다른 종류의 세포와 구분된다. 모든 줄기세포는 그 기원에 상관없이 세가지의 특징을 갖는데 장기간 분화 및 자가재생산하며, 특정계열 로 분화되지 않은 상태이며, 특이계열로 분화된 세포를 생산할 수 있다. 장기간의 자가 재생산과 관련하여 배아 줄기세포는 실험실적 배양을 통해 일년 이상 분화없이 증식시킬 수 있으나 대부분의 성체 줄기세포는 그렇지 못하다.

줄기세포는 다양한 싸이토카인을 포함하는 배양배지에서 배양된 바 있다. 하지만 대부분의 실험에서 보여지듯 이러한 배양기술은 유핵세포 전체의 수적증가를 유발하는 데 비해 이렇게 체외증가된 세포는 분화쪽으로 유도되며 줄기세포의 특성을 잃게 된다(Danet 2001, Dorrel 2000, Xu 2001). 배양과정에 수반되는 이러한 줄기세포함량의 손실은 일부 미분화된 줄기세포가 분화된 딸세포를 생산하는 비대칭적 세포분열에 기인한다. 또한 체외배양과정에서 세포표면 표현형의 변화가 따르는데 예를 들어 CD34+CD38+ 세포는 CD34+CD38- 세포보다 좀 더 분화된 세포군을 의미하는 데 이러한 세포가 CD38의 발현이 소실되는 경우 CD34+CD38- 의 표현형을 가짐으로써 좀 더 원시상태의 CD34+CD38- 세포의 증폭과 유사하지만 실제로는 체내 생착의 정도로 대변되는 이식가능한 중기세포의 실질적인 증가는 없다(Dorrel 2000).

줄기세포의 이러한 분화손실은 줄기세포이식에 의한 생착 및 체내증식의 저하를 유발한다.

원시상태의 조혈모세포의 전통적인 연구는 방사선조사 후 골수내 재생능력을 갖는 이식생착세포를 통해 반영된 바 있다(Larochellel 1996).

비록 이식생착세포가 자가 재생산에서 우연적인 행동을 하는 것으로 보여졌지만 이러한 세포는 특정조합의 사이토카인 혼합체에서 자가재생산의 확률을 높일 수 있는 것으로 보여졌다(Zandstra 1997). 이러한 관찰은 조혈모세포의 자가재생산 과 분자적조작에 기인한 체외 증폭을 유도하는 특정한 신호기전의 존재를 암시한다. 하지만 자가재생산의 분자기전이나 원시상태의 조혈모세포의 미분화상태를 유지하는 기전에 대해서는 알려진 바가 거의 없다.

비록 스탓3가 배아줄기세포의 미분화상태를 유지하는 데 필요한 것으로 알려졌지만 배아줄기세포와 성체 조혈모세포 사이에는 유의한 구분이 존재한다. 첫째, 배아 줄기세포는 골수에서 림프계나 골수계의 재생을 유발하지 못하며 이러한 점에서 배아 줄기세포와 성체 조혈모세포는 다른 두 종류의 줄기세포로 여겨진다. 두 번째로 배아 줄기세포의 분자적인 환경을 성체 조혈모세포와는 다르다. 예를 들어 배아 줄기세포의 가장 특징적인 표면표식자는 계열특이항원(SSEA)와 전사인자인 Oct-4인데 이들 중 어느것도 성체조혈모세포에서 발현되지 않는다. 그러므로 조혈모세포가 생착되고 다계열로 분화되어 골수를 재건하는 분자적인 기전은 조혈모세포에 특이한 상황으로서 다른 종류의 세포에서 유추될 수 없는 것이다.

최근 인간골수내 원시상태의 세포군이 스탓3의 발현정도를 이후발달단계의 분화된 전구체세포군보다 높은 상태로 유지한다는 것이 밝혀졌다. 또한 스탓3의 우성적 억제체의 역전사바이러스를 통한 발현이 내인적인 스탓3활성기전을 억제하여 마우스 태아의 간에서 기원한 이식가능한 줄기세포의 재점유능력을 상당부분 억제하는 것이 밝혀졌다.

본 응용에서 원시상태의 조혈모세포의 생착 및 이식된 골수를 재생하는 능력이 스탓3의 활성도에 의해서 직접적으로 조절된다는 것을 보여주며 나아가 응용자들은 증가된 스탓3의 활성도에 의해서 원시상태의 조혈세포의 증식 및 재생능력이 유의한 정도로 증가됨을 보여주었다.

그러므로 줄기세포의 행동양식이 우연적인 방법으로 조절된다는 전통적인 관점과는 달리 세포내 스탓3의 활성도를 제어함으로써 줄기세포의 행동을 조절할 수 있다는 점이 밝혀졌다. 이러한 제어는 1) 유전적변이 2) 스탓3의 활성형의 단백질이입 3) 스탓3의 유전산물의 분자적활성도를 조절할 수 있는 약리학적 중재를 통해서 얻어질 수 있다.

이러한 방법을 적용함으로써 원시상태의 줄기세포는 줄기세포이식의 효율의 실질적인 증가와 이후 기술되는 유전자치료의 고려대상을 위한 특정한 세포부분의 선택적인 증폭을 위해 시험관 내 배양과정이나 생체내 재생과정에서 수적인 증가가 가능하다.

(줄기세포에 의한 생체내 재생의 향상)

동종이식을 위한 조혈모세포는 스탓3-C의 직접적인 전달이나 다양한 바이러스 벡터를 통한 전달을 위해 채취되거나 유동상태 유발을 통해 얻을 수 있다.

화학요법이나 방사선요법을 받은 환자는 변형된 줄기세포를 체내 재주입받고 변형된 줄기세포는 가속화된 생착과 골수의 재생을 보이며 이는 무형성기간의 단축과 결과적으로 이식과 연관된 사망률의 감소를 가져온다.

선택적으로 제거된 줄기세포는 단백질이입영역을 갖는 스탓3-C 단백질을 포함하는 배양액에서 배양된 후 개체에 재주입될 수 있다. 스탓3단백의 활성형은 세포내로 전달되며 세포의 자가재생산과 골수내 재생능력이 증가된다. 본 연구진의 연구결과에 의해면 TAT-STAT3-C 단백질이 이입된 줄기세포는 TAT-GFP 단백질이 전 이된 대조군과 비교하여 2배에서 5배까지 증가된 골수내 재점유능력을 나타내었다. 그러므로 이러한 접근은 스탓3 활성화를 목표로 한 줄기세포의 단백질치료에서 성공적으로 이용될 수 있다.

또한 이러한 단백질은 환자에게 직접적으로 투여될 수 있으며 체내에서 투여된 단백질은 줄기세포로 전달되어 체내 재생능력의 효과를 증가시킬 수 있다.

(특정 줄기세포군의 선택적인 증폭)

지중해성 빈혈이나 선천적 대사질환 등 체성 돌연변이에 의한 유전질환을 앓는 사람에서 모든 계열로 분화할 수 있는 줄기세포를 분리한 후 유전적인 교정이 행해질 수 있다. 이러한 세포가 체내로 재주입되는 경우 유전적으로 교정된 세포는 그렇지 않은 세포에 대해 증식에 있어 선택적인 잇점을 갖게 되지 못하며 두 세포군간의 경쟁에 의해 치료적 치환 효과가 감소하게 된다.

하지만 중재적인 방법을 통해 유전적으로 조절된 특정한 줄기세포가 스탓3의 활성형을 발현하도록 변형되어 이러한 변형세포가 그렇지 않은 줄기세포군에 비해 선택적인 잇점을 갖게 되어 유전적으로 교정된 세포비율의 증가를 가져올 수 있다.

(화학적 이량체화를 통한 체내 줄기세포증식의 유도증폭)

스탓3의 활성화는 줄기세포 재생의 직접적인 조절자이다. 그러므로 줄기세포의 행동을 유도할 수 있다. 스탓3와 FKBP 결합단백질이나 DNA gyrase B의 이량체화영역의 융합유전자를 만듦으로써(Brino 2000), FK1012나 쿠머마이신 A1의 존재하에서 스탓3의 이량체화를 유도할 수 있다. 이량체화 영역과 스탓3의 융합유전자가 이입된 줄기세포를 개체에 재주입한다. 개체가 FK1012나 쿠머마이신 A1으로 처리될 경우 스탓3의 키메라형이 이량체화되어 변형된 줄기세포에 국한된 증식효과를 가져온다. 화학적 이량체화 유도제가 없을 경우는 이량체화가 유도되지 않으므로 스탓3에 의한 자극효과는 없어진다. 이러한 방법으로 이량체화 유도제의 외적 투여를 통해 체내 이식된 줄기세포의 활성을 조절할 수 있다.

(체외증폭과 줄기세포특성의 유지)

많은 종류의 줄기세포는 개체에서 채취된 후 시험관 내 조작과정이 필요하다. 이러한 상황은 줄기세포의 숫적 증가를 위한 줄기세포의 체외 증폭과정을 포함한다. 도한 줄기세포는 기능적인 변화를 얻기 위해 유전적으로 변이되거나 화학적으로 처리될 수 있으며 바이러스벡터에 의한 유전자전달 및 상보서열의 올리고뉴클레오티드나 사이토카인에 의한 처리 등의 체외 조작과정에 노출 될 수 있다. 이러한 과정에서 줄기세포는 쉽게 줄기세포의 특성을 읽게 되며 또한 그 수가 줄어든다. 스탓3의 활성형과 융합된 단백질 산물을 이용하며 세포는 자가재생산과 재생능력을 유지하는 것이 용이하게 된다. 혹은 스탓3의 활성을 증가시키기 위한 화학물질이나 자연적 리간드가 전술한 목적을 위해 이용될 수 있다.

다른 측면에서 이러한 중재는 골수내에 포함된 종양세포의 제거를 지향한다. 암이나 백혈병 환자들은 일반적으로 화학치료이나 방사선치료를 필요로 하는데 이러한 치료는 골수세포에 독성효과를 가진다. 골수세포는 이후 재주입을 위해 일단 채취된 후 항암요법을 받게 된다. 재주입까지의 기간동안 오염된 종양세포는 정상세포의 표면표식자의 선택을 통해서 혹은 세포독성, 방사선화학물질 등을 통해서 제거된다. 이 과정에서 줄기세포내의 스탓3 활성도를 증가시키기 위해 단백질 이입 이나 화학적처리 등의 전술한 방법을 적용함으로써 좀 더 용이한 줄기세포의 유지가 가능하다.

(유전자치료)

특정한 실시예로 스탓3 폴리펩티드로 전사될 수 있는 염기서열로 구성된 핵산이 줄기세포를 활성화시키기 위해 주입되며 이것은 유전자치료를 통한 줄기세포의 증식과 조직재생을 위해 이용되는 것이다. 유전자치료는 발현된 혹은 발현가능한 핵산을 개체에 주입함으로써 성립되는 치료이다. 중재방법의 구체화에서 핵산은 치료효과를 매개할 수 있는 단백질을 생산한다.

유전자치료의 모든 경우는 해당 발명에 따라서 사용될 수 있다. 예시적 방법은 다음에 기술한다.

유전자치료의 방법에 대한 일반적 고찰은 Goldspiel등, Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu등, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstochev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32;573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); Morgan등 Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5);155-215 (1993)을 참고한다. 재조합 DNA기술에서 일반적으로 알려진 방법은 Ausubel등의 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)에 기술되어 있다.

바람직한 측면에서 핵산서열은 스탓3 폴리펩티드로 발현될 수 있으며 핵산서열은 적절한 숙주에서 폴리펩티드로 발현되는 발현벡터의 부분이다. 특히 이러한 핵산서열은 폴리펩티드의 해석영역과 기능적으로 연결된 프로모터를 가지며 프로모터는 유도된 혹은 지속적인 기능을 가지며 이는 선택적 혹은 조직특이적일 수 있다. 또 다른 실시예로 핵산분자는 폴리펩티드로 만들어지는 서열로서 다른 의도된 염기서열이 유전체 내 원하는 부위로의 유사재조합을 촉진하기 위한 영역으로 둘러싸여질 수 있고 이를 통해 스탓3 핵산의 염색체내 발현을 제공할 수 있다.

핵산의 환자제공은 환자를 직접 핵산 혹은 핵산이 포함된 백터에 노출시키는 직접적인 방법과 세포가 시험관내에서 먼저 핵산이 전달된 후 환자에 이식되는 비간적접인 방법으로 행해질 수 있다. 이 두가지 방법은 각각 체내 및 체외 유전자치료로 알려져 있다.

특정한 실시예로, 핵산서열은 체내에서 직접적으로 투여되어 단백질산물을 생산하도록 발현될 수 있다. 이것은 문헌에 알려진 다양한 방법으로 행해질 수 있는데 예를 들어 적절한 핵산발현벡터의 일부로 구축한 후 세포내에 위치하도록 주입하거나, 다른 증식불가능하거나 기능이 희석된 역전사바이러스, 혹은 바이러스벡터에 의한 감염유도나 직접적인 DNA주입을 통하거나 지질, 세포표면수용체, 유전자전달물질, 리포솜에 의한 캡슐형성, 미세분자, 미세외피, 핵내 이동이 가능한 펩티드와의 연결을 통한 외피형성이나 수용체-매개성 내제화(Wu등, J. Biol. Chem. 262:429-4432 (1987); 수용체를 발현하는 특정한 세포를 목표로 사용될 수 있다)를 유도하는 리간드와의 연결 등을 통해서 가능하다. 또 다른 실시예로 리간드가 핵산-리간드 복합체가 리간드가 엔도솜을 분열시킬 수 있는 바이러스 펩티드로 구성되어 핵산이 리소좀의 붕괴를 억제할 수 있다. 또 다른 실시예로 핵산은 체내에서 세 포의 특이적인 흡수와 발현을 위해 특이 수용체를 목표로 할 수 있다. 혹은 핵산이 세포내부에 이입되어 발현을 위해 유사재조합을 통해 숙주의 DNA내부에 포함될 수 있다(Koller, Smithies, PNAS 86:8932-8935 (1989); Zijlstra 등, Nature 342:435-438 (1989)).

특정적으로 바이러스 벡터는 이용하고자 하는 폴리펩티드로 발현가능한 핵산서열을 포함한다. 이용되는 폴리펩티드로 발현가능한 핵산서열은 한 혹은 그 이상의 벡터에 클로닝되는데 이러한 벡터는 유전자의 환자전달을 용이하게 한다. 역전사바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노연관 바이러스 등이 사용되는 바이러스 벡터의 예이다. 역전사바이러스는 바이러스유전체의 적절한 팩키징이나 숙주 DNA진입을 위해 필요한 요소를 포함한다.

아데노 바이러스는 호흡기상피로 유전자를 전달하는 데 적절한 벡터이며 이 바이러스는 호흡기의 상피에 일반적인 감염을 유발하여 가벼운 증상을 유발한다. 아데노 바이러스를 기반으로 한 벡터의 또 다른 목표는 간, 중추신경계, 혈관내피세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 세포분열을 하지 않는 세포를 감염시킬 수 있는 장점이 있다. 또한 아데노관련 바이러스(AAV; adeno-associated virus) 또한 유전자 치료 사용이 제시된 바 있다.

유전자치료의 다른 접근방법으로 조직배양에서 세포에 유전자를 전달하는 방법으로 전기충격법(electroporation), 리포펙션, 칼슘포스페이트를 이용한 유전자이입, 바이러스감염 등을 포함한다. 일반적으로 유전자전달방법은 세포에 선택적인 표지자를 전달하는 것을 포함한다. 세포는 이후 선택과정을 통해 전달된 유전자를 포함하고 발현하는 세포들만 분리할 수 있고 선택된 세포들은 환자에게 투여된다.

이러한 실시예에서 핵산은 체내투여 이전에 세포에 주입되어 재조합 세포를 이룬다. 이러한 주입은 문헌에서 기술한 모든 방법을 이용해서 이루어질 수 있으며 유전자이입, 전기충격법, 미세주입(microinjection), 염색체매개유전자전달, 미세세포매개유전자전달, 스페로플라스트(세포벽불완전제거균) 융합 등을 포함한다. 외인성 유전자를 세포내 주입하는 기술은 많은 문헌에서 제시된 바 있으며 본 발명에서 이에 맞게 이식되는 세포의 발달 및 생리학적 기능이 방해받지 않는 수준 하에서 이용된다. 이러한 기술은 핵산의 세포내 안정적인 주입을 제공하여 핵산이 세포에서 발현되며 또한 유전되어 분열된 세포군에서도 발현되어야 한다.

유전자치료의 목적으로 핵산이 주입되는 세포는 다양한 줄기세포 및 전구체세포를 모두 포함하며 특히 골수, 탯줄혈액, 말초혈액, 태아간 등에서 얻어진 조혈모세포를 포함한다.

바람직한 실시예로서, 유전자치료에 이용되는 세포는 환자의 자가세포이나 동종공여세포를 포함한다.

실시예로 재조합세포가 유전자치료에 이용되는 경우, 폴리펩티드로 해석가능한 핵산서열이 세포에 주입되어 해당 세포 및 분열세포에서 발현토록 하며 제조합세포는 체내에서 치료목적으로 주입된다. 특정한 실시예로 줄기세포 혹은 전구체세포가 쓰인다. 체외에서 분리되고 유지될 수 있는 모든 줄기세포 및 전구체세포가 본 발명의 이러한 실시예로 사용될 수 있다.

특정한 실시예로서, 유전자치료의 목적으로 주입되는 핵산이 해석영역과 기 능적으로 연관된 유도가능한 프로모터로 구성될 수 있으며 이로써 적절한 전사유도체의 존재를 조절함으로써 해당 핵산의 발현으로 조절할 수 있다.

(치료구성)

치료물질의 조합은 일반적으로 알려져 있으며 관련문헌은 Reminton's Pharmaceutical Science, 17th Ed,., Mack Publiching Co., Easton, Pa., USA에서 구할 수 있다. 예를 들어 매일 체중 1kg당 0.05ug에서 20mg까지 스탓3의 활성체나 스탓3 유전자나 단백질의 활성체를 투여할 수 있다. 용량은 최적의 치료목적에 맞게 조절될 수 있다. 예를 들어 분할된 양을 매일 투여할 수 있으며 투여양은 치료상황의 긴급사태에 맞게 비례되어 감소시킬 수 있다. 활성상태의 물질은 형편에 따라 구강, 정맥내(친수성일 경우), 근육내, 피하, 비강내, 피하 혹은 좌약이나 임플란트(복강내 서방형 분자 혹은 시험관내에서 감작된 단핵구나 수지상세포로 이식환자에 입양전달된 경우) 등을 사용할 수 있다. 투여경로에 맞추어 펩티드는 효소의 작용이나 산, 비활성을 유도하는 자연물질에서 보호될 수 있는 외피가 필요할 수 있다.

활성물질은 혈액내 혹은 복강내에 주입될 수 있다. 글리세롤 액체 폴리에틸렌글리콜을 이용한 부유상태의 혼합체나 오일을 이용한 혼합체로 준비될 수 있다. 통상적인 저장 및 사용의 경우 미생물의 증식을 억제하기 위한 보존제를 포함할 수 있다.

주사용액으로 적합한 사용을 위해 멸균된 액체수용액 혹은 부유상태의 혼합체나 즉각적 사용이 가능한 멸균된 주사용액이나 부유상태의 혼합물이 준비될 수 있다. 모든 경우에서 이러한 제제는 멸균상태를 유지해야 하며 주사가 용이하도록 적절한 액체상태를 유지해야 한다. 제조 및 보존상의 조건하에서 안정상태를 유지해야 하며 박테리아나 진균류 등의 미생물의 오염에 대해 보존되어야 한다. 전달체는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체상태의 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적절한 혼합체, 식물성 오일을 포함한 용매나 부유액체일 수 있다. 레시틴에 의한 코팅이나 부유상태의 경우 적절한 입자크기를 유지 및 활성물질 등의 사용을 통해 적절한 액상이 유지될 수 있다. 클로로부탄올, 페놀, 소르빅산, 티오머살 등의 다양한 항생, 항진균물질을 통해 미생물의 작용을 억제할 수 있다. 많은 경우에 당이나 염을 이용한 등장액을 사용하는 것이 바람직하다. 주입조성의 지속적인 흡수를 돕기위해 흡수를 지연하는 알루미늄 모노스테레이트나 젤라틴을 사용할 수 있다.

활성물질을 적절한 용매의 필요한 양에 상기 기술된 다양한 성분을 추가한 후 필터링을 통한 멸균화를 통해 멸균된 주사액을 얻을 수 있다. 일반적으로 몇 종류의 멸균된 활성성분을 알칼리성의 부유배지를 포함하는 역시 멸균된 전달체에 넣고 필요한 성분을 넣음으로써 만들어진다. 멸균된 주사가능용액의 준비에서 필요한 멸균파우더를 만들 때는 흔히 진공건조나 냉동건조기법이 사용되며 이 과정에서 활성성분의 파우더상태를 얻을 수 있다.

(전달시스템)

중재물질은 전달하는데 사용될 수 있는 다양한 전달계가 알려져있으며 리포솜, 미세입자, 미세캡슐에 의한 캡슐화, 해당물질을 발현하도록 고안된 재조합세 포, 수용체-매개 세포내재화, 역전사바이러스 및 다양한 전달체의 일부로서 핵산의 컨스트럭트 등이 그 예이다. 주입방법은 피하, 근육, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 경막외, 구강주입 등이 사용될 수 있으며 이외에도 다양한 방법이 있다. 물질 및 복합체는 사용이 용이한 경로로 투여되며 예를 들어 주입 및 일시투여, 상피나 점막피층(예를 들어 구강점막, 직장 및 장점막 등)에 흡수유도 등이 가능하며 기타 생물학적 작용제제와 같이 투여될 수 있다. 투여는 국소적 혹은 전신적으로 할 수 있다. 또한 중추신경계에 대한 중재로 약리학적 물질이나 복합체를 투여시 뇌실내 및 척수강내 주입 등의 적절한 경로를 확보하는 것이 바람직하며 뇌실내 주입의 경우 Ommaya씨 리저브 등과 연결된 뇌실내부로의 카테터확보를 통해 용이하게 할 수 있다. 폐투여 또한 흡입계나 네불라이져 등의 사용 및 분무제의 처방으로 가능하다.

특정한 실시예로서, 치료가 필요한 국소영역에 대한 중재에 사용되는 약리적물질 및 복합체의 투여가 바람직할 수 있는데 이는 외과적 수술시 국소적 주입이나 국소적적용, 예를 들어 수술시 드레싱 과정과 같이, 주사나 카테터, 좌약, 임플란트(임플란트의 경우 다공물질 혹은 그렇지 않거나 젤라틴 물질로서 실라스틱막이나 섬유 등) 등을 통해서 가능하다. 되도록 항체나 중재펩티드를 사용하는 단백질 주입의 경우 단백질이 흡수되지 않는 물질을 이용하는 주의가 필요하다. 또 다른 실시예로 물질 및 복합체는 리포솜 등의 소포를 통해 전달될 수 있다. 또한 물질 및 복합체는 방출조절계를 통해 전달될 수 있다. 또한 펌프가 사용될 수 있다. 또한 폴리머성물질이 사용될 수 있다. 또한 방출조절계는 치료목표에 근접해서 설치될 수 있으며 예를 들어 뇌의 경우 전신사용량의 일부만 필요하게 된다.

약리적으로 혹은 생리학적으로 용인될 수 있는 물질은 이식동물이 투여방법을 견딜 수 있어야 하며 이 동물의 투여에 적합하여야 한다. 치료적으로 유효한 양은 생리학적으로 유의한 투여양이다. 생리학적으로 유의한 것은 이식환자의 생리적으로 발견가능한 변화를 유도한 경우이다.

본 발명은 기술된 특정한 경우로 제한되지 않는다. 실제로 상기 기술한 외에 발명의 다양한 변형이 이후 기술되는 내용과 도면을 통해 당업자에게 명백할 수 있다. 이러한 변형들은 첨부된 청구항의 범위에 속하는 것으로 인정되어야 한다. 이후 나열된 예들은 본 발명의 설명을 위해 제공되며 제한의 의도는 없다.

이어지는 자세한 기술, 삽화로서 첨부되는 도면을 통해 본 발명에 대한 이해를 돕고자 하며 이것은 본 발명에만 한정되는 것은 아니다.

도 1은 다양한 조혈모세포의 단계에서 스탓3의 활성의 효과를 연구하기 위해 실험적인 전략의 모식도이다. 표면표식자 Ly5.2 (C57/BL6)를 갖는 이식용세포는 전구체세포의 증폭을 위해 4일간의 5-FU처리 후 골수세포를 얻는다. 세포는 싸이토카인 조합 하에서 전처치되고 다양한 스탓의 변형체를 포함하는 바이러스에 감염된 후 방사선 조사된 수혜동물(표면표식자 Ly5.1의 Pep3b)에 이식되고 수혜동물의 골수내 생착, 재생하는 능력을 평가한다. 동시에 이입된 세포의 일부는 이식 12일 후의 비장집락형성능을 평가하기 위해 또 다른 수혜동물에 이식되거나 배양접시 내 집락형성능을 평가하기 위해 메칠셀룰로오스 접시에서 배양될 수 있다.

도 2는 우성적 억제형인 스탓3(dn스탓3)나 활성화된 스탓3(스탓3-C)의 역전사바이러스 구조물에 대한 도식적인 개략도이다. 각각의 cDNA는 역전사바이러스벡터인 MIG(MSCV-IRES-GFP)에 클론되어 있으며 MIG벡터에서 각각의 cDNA는 IRES(internal ribosomal entry site)와 GFP(Green Fluorescence Protein)와 연결되고 각 유전자의 발현은 두 유전자의 동시발현촉진에 의한 GFP유전자의 발현을 통해 모니터링될 수 있다.

도 3a는 변경된 스탓3의 활성이 조혈모세포의 생착 및 골수내에서의 체내재생에 갖는 효과를 보여준다. 5-FU처리된 골수에서 얻어진 조혈모세포는 대조군벡터와 함께 dn스탓3나 스탓3-C의 단백질을 만들 수 있는 역전사바이러스(MIG)가 이입되고 방사선조사된 수헤동물에 이식된다. 각 바이러스에 의한 유전자전달률은 85-90%였다. 이식후 다양한 시점에서 이식동물의 말초혈액을 통해 공여세포의 생착율과 변화된 스탓3의 활성도가 Ly5.2(공여세포)와 GFP(유전자이입된세포)의 비율(%)을 분석함으로써 측정될 수 있다. 도면에서 보여지듯 감소된 스탓3활성도(dn스탓3)를 갖는 세포는 대조군에 비해 낮은 생착과 재생도를 나타내나 증가된 스탓3 활성도(스탓3-C)를 갖는 세포는 뚜렷하게 증가된 체내재생능력을 보인다.

도 3b는 스탓3-C 이입된 세포의 다계열분화를 보여준다. 공여세포에서 스탓3-C가 이입된 세포가 B림프구계열의 표면표식자(B220항체) 및 골수계의 표면표식자(Mac-1/Gr-1항체)를 이용하여 림프계 및 골수계로의 분화정도를 분석하였다. 도면에서 보여지듯 스탓3-C가 이입된 조혈모세포는 특정계열로 편향되는 양상을 보이지 않고 골수계열 및 림프계열로 모두 분화하는 능력을 보유한다. 이러한 자료는 도 3a에서 보여진 증가된 생착력이 특정한 계열로의 선택적인 증식에 의한 것이 아니며 다양한 계열로 분화가능한 능력을 가진 줄기세포 수준에서의 증가에 의한 것임을 나타낸다.

도 4는 조혈전구체의 다른 단계에서 스탓3의 증가된 활성도가 나타내는 효과를 보여준다. dn스탓3, 스탓3-C 및 대조군벡터에 이입된 골수세포는 이식 12일째 비장집락형성단위(CFU-S)를 보기 위해 방사선조사된 마우스에 이식되거나 집락형성세포(CFC)측정을 위해 메칠셀룰로오스 반고형 배지에 올려졌다. 도면에서 보여지듯 각 바이러스에 이입된 세포들의 비장집락형성단위(CFU-S) 및 집락형성세포(CFC)에서 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이러한 자료는 스탓3-C나 dn스탓3의 발현이 조혈모세포의 하위단계에 대한 영향없이 근원적인 이식가능 줄기세포의 활성을 선택적으로 조절함으로써 가지는 효과를 증명하는 것이다.

도 5a와 5b는 체외 증폭 및 체내재생의 증가를 목적으로 한 조혈모세포의 단백질치료에 관한 개략적인 모식도이다. 활성화된 스탓3(스탓3-C)의 단백질산물은 단백이입영역(인간면역결핍바이러스(HIV)의 TAT단백서열을 이용)과 6개의 히스티딘 잔기와 융합된다. 이렇게 만들어진 키메라 단백질은 세포막을 통과하여 세포내로 전달될 수 있으며 세포내 스탓3의 활성도의 변화를 가져온다. 또한 이러한 단백질을 포유동물의 몸에 주입할 경우 줄기세포의 유사한 스탓3 활성도 변화를 유도할 수 있다. 도 5b는 이러한 단백질발현을 위한 벡터의 모식도이다.

도 6은 자가 재생산 및 줄기세포의 체내증폭에 대한 양적인 평가방법을 보여준다. 실험세포는 스탓3-C로 이입한 후 3단계의 각기 다른 세포량을 최소한 6마리 이상의 방사선조사된 수혜동물에 이식된다. 이러한 이식마우스에서 공여세포의 재생정도를 평가한다. 37%의 실험동물에서 림프계나 골수계세포 1%미만의 음성생착을 가져오는 세포량을 하나의 이식생착세포(CRU)로 정의한다. 일차이식된 골수는 이식 36주 후 다시 채취하여 이차이식동물에게 이식되는 데 이때 37%미만의 음성생착을 나타내는 한계세포량에 이를 때까지 연속희석하며 일차이식동물에 이식된 총 이식생착세포수와 일차이식동물에서 이차이식세포로 이식된 이식생착세포수를 계산한다.

도 7은 스탓3-C, dn스탓3, 대조군벡터가 이입된 중간엽 줄기세포와 줄기세포의 동시배양의 효과를 보여준다. 골수에서 얻어진 중간엽 줄기세포는 스탓3-C, dn스탓3, 대조군벡터로 이입된다. 유전자이입후 GFP양성인(각각의 역전사바이러스 벡터가 이입증명된) 세포가 선택되어 배양접시에 배양된다. 5FU처리된 동물에서 골수전구체세포를 얻어 5일간 동시배양한다. 각 세포군은 방사선조사된 마우스에 이식되어 공여세포의 생착빈도를 공여세포에 특이적인 표식자인 Ly5.2를 이용하여 이식후 3주째 면역형광세포분석법을 이용하여 측정하였다. 도면에서 보여지듯, 스탓3-C가 이입된 중간엽 줄기세포와 같이 배양된 줄기세포는 이식 3주 째 증가된 체내 생착율을 보여준다.

(예)

(예 1 - 재료와 방법)

동물: 극소이유전자형 마우스로 골수기증에는 주령 8-12주의 Peb3b/C57/BL6( 세포표면표식자: Ly5.1) 골수수혜에는 C57/BL6(세포표면표식자: Ly5.2)가 이용됨.

상기 마우스는 카톨릭의과대학의 동물시설에서 멸균된 격리구역에서 멸균된 사료와 물로 사육함.

클로닝 및 역전사바이러스 생산

스탓3-C는 기존의 기술대로(Bromberg등, 1999) 자연형의 스탓3의 cDNA에서 특정위치의 돌연변이유도(site-specific mutagenesis)로 만들어짐. 우성적 억제형의 스탓3는 Dr. Allice Mui(University of British Columbia, Canada)에게 기증받음. 상기 cDNA는 EcoR1과 Xho1의 제한효소자리를 이용해 MIG벡터의 다중클로닝위치에 클로닝됨.

역전사바이러스 MIG(MSCV-IRES-GFP)는 마우스 줄기세포 바이러스(MSCV; murine stem cell virus, donated by Dr. R. Hawley, American Redcross)의 LTR영역에서 유도됨. 상기 벡터의 클로닝영역은 EGFP(enhanced green fluorescent protein)과 IRES(internal ribosomal entry site)와 연관되어 클로닝된 유전자의 발현은 형광을 통해 측정가능한 EGFP의 발현과 연관됨(도 2).

클로닝 후 역전사바이러스는 역전사바이러스의 컨스트럭트인 gag-pol(GP3, provided by Dr. Rob Kay, Terry Fox Lab, Vancouver, Canada)를 코딩하는 플라스미드와 외피(env, VSV-G)에 해당하는 플라스al드를 293 T세포에 칼슘포스페이트이입법으로 동시이입시켜 생산함. 이입 48시간 후 바이러스를 포함하는 상층액을 분리하여 초원심분리(25,000RPM, 1시간)로 바이러스를 농축함. 농축된 바이러스는 GPE-86 세포나 PG13세포에 감염시키는 데 이용되었고 프로타민 설페이트(5ug/ml)과 함께 골수세포에 감염시킴.

역전사바이러스이입 및 골수이식

도 1은 다양한 조혈단계에서 조혈모세포의 재생능력을 분석하기 위한 실험적 고안을 나타냄.

5-fluorouracil로 처리된 마우스에서 처리 4일 후 골수세포를 채취함. 이 과정에서 5-FU가 분열하는 세포에 갖는 선택적인 독성에 의해 미분화된 전구세포의 비율이 높아짐.

공여세포는 싸이토카인혼합체(thrombopoietin 50ng/ml, FLT3-ligand 100ng/ml, steel factor 100ng/ml)와 함께 혈청을 포함하지 않은 배지에서 48시간 동안 전처치되고 같은 조건 하에서 48시간동안 역전사바이러스입자로 3번에 걸쳐 유전자이입된 후 수혜동물에 이식됨.

유전자이입된 공여세포의 이식시 수혜동물은 900rad로 방사선 조사되며 방사선조사 24시간 안에 공여세포를 이식받음. 이후 3주간 페하3(pH3.0)의 산성물을 공급받음.

이식된 공여세포의 재생평가를 위해 이식후 다양한 시점에서 수혜동물의 말초혈액을 채취함. 특정 항체를 이용하여 공여세포의 비율(수혜동물의 %Ly5.2)를 면역형광기법(flow-cytometry)(FACS Caliber, Beckton Dickinson)을 이용하여 계산함.

추가로 이입된 줄기세포는 12일째 비장집락형성단위의 측정을 위해 이식되고 메칠셀룰로오스배지에서 집락형성세포측정을 위해 배양됨.

(예 2 - 스탓3 활성형에 의한 줄기세포활성의 향상)

변형된 스탓3 활성이 골수줄기세포에 가지는 효과는 이식용 공여세포에 우성적억제형 dn스탓3(dn-STAT3), 활성화된 스탓3-C(STAT3-C) 및 대조군벡터(MIG)를 유전자이입함으로써 측정되었다.

50,000개의 초기 세포를 상기 방법으로 유전자이입한 후 GFP에 의한 유전자이입도는 85-90%로 측정되었다. 이 세포들은 수혜동물에 이식되었으며 골수내 생착 및 재생은 다양한 시점에서 수혜동물의 말초혈액에서 측정되는 GFP발현세포의 비율을 측정함으로써 계산되었다.

도 3은 골수재생에서 각각의 바이러스 컨스트럭트가 줄기세포 활성에 미치는 영향을 나타낸다.

도 3a에서 스탓3의 활성형(스탓3-C)이 대조군에 비해 공여세포의 생착을 5-10배 증가시키는 것을 볼 수 있다(유의도 P<0.05). 스탓3-C에 이입된 세포의 증가된 체내 재생은 이식 3주후의 초기단계에서 시작하는 것이 명확하며 이것은 이식된 공여세포의 생착을 가속화하였을 가능성을 보여준다.

흥미롭게도, 스탓3-C에 유전자이입된 세포의 증가된 능력은 이식 6주후 정점에 도달하며 지속된 재생의 증가를 유발하지 못했다. 그러므로 스탓-3 활성화에 의한 줄기세포의 체내 재생능력의 증가는 백혈병상태를 유발하는 것이 아니라 재생단계의 정점에 이르면 정상적인 생리적인 되먹임조절 하에 놓이게 됨을 의미한다.

이와 대조적으로 우성적 억제형 dn스탓-3(dnSTAT-3)는 대조군과 비교해 골수재생의 유의한 감소를 유발하였으며 이는 스탓-3의 활성도의 감소는 이식된 줄기세 포의 체내 재생능력을 억제함을 보여준다.

스탓3-C로 이입된 세포가 다양한 계열로 분화하는 능력을 가지고 있는지 보기 위해 스탓-3C 이입된 세포에서 기원한 세포들의 계열분포를 분석하였다. 도 3b는 림프계열(B220)과 골수계열(Mac-1/Gr-1)세포로 나타나는 계열분포의 분석표시이다. 도면에서 나타낸 바와 같이, 스탓3-C에 이입된 세포는 림프계열과 골수계열 모두 편향됨없이 분화하는 것으로 보여진다. 이 결과는 스탓3-C이입된 세포의 증가된 골수재생이 특정한 계열의 세포의 클론성의 증식에 의한 것이 아니고 원시상태의 다능성 줄기세포 수준에서의 재생의 향상에 의한 것임을 나타낸다.

(예 3 - 비장집락형성단위와 집락형성세포에 변화된 스탓3 활성도가 미치는 영향)

스탓-3C에 의한 골수재생능력의 향상이 다른 조혈계분화과정에서도 역시 나타나는지 알기 위해 비장집락형성단위를 이식 12일째 분석하였고 이는 다능성줄기세포에서 시작한 줄기세포분화의 하위수준에서의 분화정도를 나타낸다. 또한 집락형성세포는 비장집락형성단위보다 더 하위의 소-클론성 전구세포를 반영한다.

도 4에서, 12일째 관찰된 비장집락형성단위나 집락형성세포에서 유의한 변화가 관찰되지 않았으며 이는 스탓3의 활성이 조혈모세포 이외의 다른 단계에 영향을 미치지 않음을 나타낸다. 그러므로 스탓3의 활성화는 이후의 전구세포에 대한 영향이 아니라 줄기세포에 대한 선택적인 활성을 통해 골수재생을 향상시키는 것으로 보이며 이러한 재생능력의 증가는 줄기세포기능의 향상을 의미한다.

(예 4 - 줄기세포활성화의 증가 및 체외 증폭을 위한 단백질치료)

비록 스탓3의 활성형의 유전자 이입은 세포내에서 스탓3의 활성도를 증가시키기 위한 신뢰도가 높은 방법이지만 활성형의 스탓3의 단백산물을 전달하는 것을 세포내 스탓3의 활성도를 증가시키는 또 다른 방법이 될 수 있다.

도 5에서 나타난 인간면역결핍바이러스의 TAT서열에서 기원한 9개의 아미노산 잔기로 구성된 단백이입영역(PTD; protein transduction domain)의 융합단백질을 만듦으로써 단백산물을 외부에서 세포내 이입시킬 수 있다.

만들어진 키메라 단백질은 6개의 히스티딘 잔기와 TAT, 스탓3-C로 구성되어 있으며 박테리아에서 만들어지고 Ni-NTA컬럼에서 정제된다. 5-FU로 전처치된 동물에서 얻어진 골수세포는 싸이토카인혼합체(thrombopoietic, steel factor, FLT-3 ligand) 존재하에서 HIS-TAT-STAT3-C(1ug/ml) 혹은 TAT-GFP단백질(1ug/ml)과 함께 배양된다.

배양 5일 후 세포는 방사선조사된 동물에 이식된 후 3주와 6주에서 공여세포재생능력이 평가되었다. 이러한 실험들에서 TAT-STAT3-C이입된 세포는 대조군세포에 비해 2-5배의 재생능력의 증가를 보였고 이로써 세포내 스탓3의 활성도증가는 단백이입영역이 융합된 활성형의 스탓3의 단백산물을 이용한 단백질치료를 통해서도 얻을 수 있음이 증명되었다.

(예 5 - 이식된 줄기세포의 생체내 자가 재생산)

증가된 줄기세포능력이 이식가능한 줄기세포의 자가 재생산을 증가시키는 지 여부를 알기 위해 GFP와 스탓3-C의 연속이식을 행하였다. 생체내에서 이식가능한 줄기세포의 자가 재생산을 보기 위해 일차이식동물에 이식될 세포를 연속희석하였 고 생체이식단위의 빈도측정을 위해 각 경우 및 세포량에서 최소한 6마리 이상의 일차이식동물에 이식하였다. 이식 36주 후 생착된 세포는 다시 채취되어 동일한 연속희석법으로 이차이식동물에 이식하였다.

도 6은 생체이식단위의 변화로 나타난 줄기세포함량의 변화를 측정하기 위한 실험적 고안의 모식도이다.

이러한 실험들에서 계산된 생체이식단위의 빈도가 표 1,2에 나타나 있다. 스탓3-C로 유전자이입된 세포의 1X106세포 중 생체이식단위는 20개, 대조군의 GFP군의 경우 16개로 계산되었다. 이식은 바이러스 유전자이입후 48시간 후에 이루어졌으므로 이 결과는 48이내의 배양시간에 의한 차이로 보여지며 생체이식단위(줄기세포의 숫자)의 유의한 증가는 시험관 내에서 이루어졌다. 그러므로 스탓-3의 활성도의 증가는 자가재생산 및 체내증폭을 유발하는 데 모두 이용될 수 있다.

표 1. 시험관내 유전자이입배양 후 생체이식단위의 빈도

이식형태	생체이식단위 (95% Cl)	생체이식단위/1X106 GFP양성세포 (95% Cl)
스탓3-C, GFP	1/49,794(1/18,474-1/134,209)	20(8-54)
대조군, GFP	1/98,652(1/24,438-1/398,235)	14(3-41)

표 2. 이식 36주 후 생체이식단위의 재생

이식형태	생체이식단위 (95% Cl)	생체이식단위/2대퇴골 & 2경골 (95% Cl)
스탓3-C, GFP	1/85,840(1/25,231-1/292,046)	208(61-709)
대조군, GFP	1/279,382(1/109,682-1/711,641)	14(6-36)

표 2는 생착과정에서 일차이식동물에서 나타난 생체이식단위의 변화를 나타낸다. GFP에 이입된 대조군이 2개의 대퇴골과 경골에서 14개의 생체이식단위를 낸 것에 비해 동일한 실험조건에서 스탓3-C에 이입된 세포는 208개의 생체이식단위를 만들었다. 그러므로 이러한 결과들에서 증가된 줄기세포 내에서 스탓3의 증가된 활성도는 체내에서 증가된 자가재생산을 유도하며 변형된 줄기세포의 증가된 재생산을 만들어냄을 알 수 있다.

(예 6 - 스탓3-C이입된 세포와 동시배양을 통한 줄기세포의 체외증폭)

줄기세포에서 증가된 스탓3 활성도는 자가재생산과 줄기세포의 재생능력을 증가시킨다.

여기서 증가된 스탓3의 활성도가 수용성 활성물질의 세포간 접촉 혹은 분비에 의한 측분비기전을 통해 작용하는지를 알기 위한 실험을 행하였다.

이러한 가능성을 조사하기 위해 스탓3-C와 dn스탓3, 대조군(MIG)을 이입한 중간엽줄기세포를 골수에서 채취하여 확보하였다. 각 유전자의 이입후 GFP양성세포를 이입세포로 간주하고 면역형광염색법을 사용하며 분리하여 전술한 싸이토카인조합하에서 공여세포(C57BL6/Ly5.2)와 5일간 동시배양하였다. 배양된 세포는 수혜동물에 이식되었고 공여세포의 생착정도가 분석되었다. 도 7은 이러한 실험에서 얻어진 자료를 보여준다. 자료에서 보여지듯, 인접한 중간엽 줄기세포에서 증가된 스탓3의 활성도는 동시배양된 줄기세포의 생체내 재생능력의 증가를 유발하였다.이 결과는 스탓3에 의한 줄기세포능력의 증가는 세포내 신호전달 기전 뿐만 아니라 측분비 기전에 의해서도 기능함을 보여준다.

이 결과는 동시배양되는 세포층의 스탓3의 활성을 조절할 수 있는 상황에서 동시배양 시스템에서 수용성의 분비인자를 이용하여 이러한 세포들이 줄기세포 활성조절에 사용될 수 있음을 보여준다.

(인용논문)

1. Danet GH, Lee HW, Luongo JL, Simon MC, Bonnet DA. 체외증폭후 인간말초혈액의 CD34(+)세포의 줄기세포형질과 면역결핍마우스에서의 재생능력의 비연관성. Exp Hematology, 2001 Dec; 29(12); 1465-73.

2. Dorrel C, Gan OI, Pereira DS, Hawley RG, Dick JE (2000), Blood, 95, 1, 102-1120: 역전사바이러스이입을 통한 인간제대혈 CD34+CD38- 세포의 체외배양을 통한 증폭과 SRC빈도의 비연관성

3. Eglitis MA, Mazey E. 성체마우스의 조혈모세포의 신경교종세포으로의 분화. PNAS; 1997. Apr 15; 94(8); 4080-5.

4. Hanazono Y, Nagashima T, Takatoku M, Shibata H, Ageyama N, Asano T, Ueda Y, Dunbar CE, Kume A, Terao K, Hasegawa M, Ozawa K. 유인원모델에서 유전자변형된 조혈모세포의 체내 선택적인 증폭. Gene Ther. 2002 Aug;9(16);1055-64.

5. Il-Hoan Oh, Eaves CJ, 2000, 역전사바이러스에 의한 스탓3의 우성적억제형의 과발현 조혈계의 후기단계의 영향없이 장기재생세포의 기능억제를 유발하는 기전. 2000. Blood, 96, 11, 275

6. Lagasse E, Connors H, Al-Dhalimy M, Reitsma N, Dohse M, Osborne L, Wang X, Finegold M, Weissman IL, Grompe M. 정제된 조혈모세포의 체내에서의 간세포로의 분화. Nat Med. 2000. Nov; 6(11); 1229-34

7. larochelle A, Vormoor J, Hanenberg H, Wang JC, Bhatia M, Lapidot T, Moritz T, Murdoch B, Xiao Xl, Kato I, Williams Da, Dick JE. 면역완전결핍마우 스의 골수에서 재생능력을 가진 인간의 원시조혈모세포의 확인: 유전자치료의 의의. Nat. Med. 1996 Dec;2(12); 1329-37

8. Matsuda T, nakamura T, nakao K, Arai T, Katsuke M, Heike T, Yokita T (1999) EMBO Journal, 18, 15, 4261-4269, 마우스배아줄기세포의 미분화상태유지의 충분조건으로서의 스탓3활성화.

9. Niwa H, Burdon T, Chambers I, Smith A (1998) Genes & Development, 12, 13, 2048-2060. 스탓3의 활성화를 통해 매개되는 다능성 배아줄기세포의 자가재생산.

10. Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, Jakoniuk I, Anderson SM, Li B, Pickel J, McKay R, Nadal-Ginard B, Bodine DM, Leri A, Anversa P. 골수세포에 의한 허혈심근의 재생. Nature 2001. Apr 5;410(6829);701-5.

11. Poulsom R, Forbes SJ, Hodivala-Dilke K, 꾜무 E, Wules S, Navaratnarasah S, Jeffery R, Hunt T, Alison M, Cook T, Pusey C, Wright NA. 골수세포에 의한 신실질조직의 재편성 및 재생. J Pathol. 2001 Setp;195(2);229-35

12. Sauvageau G, Thorsteinsdottir U, Eaves CJ, Lawrence HJ, Largman C, Lansdorp PM, Humphries RK. 조혈모세포의 HOXB4의 과발현을 통한 시험관내 및 체내의 원시세포군의 선택적증폭. Genes Dev. 1995 Jul 15;9(14); 1753-65.

13. Xu R, Reems JA. 제대혈액 내 체외증폭후 유지되는 CD34+표현형세포와 증폭되지 않는 CD34+세포간의 생착능력의 차이. Transfusion. 2001 Feb;41(2); 213-8.

14. U.S. Patent No 6,235,873.

인용되는 모든 논문들은 전체적 인용논문으로 삽입됨.

당업자라면 여기서 특히 기술된 본 발명의 특정 실시예의 다수의 균등물을 인정하거나 반복적인 실험을 사용하여 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물들은 청구범위에 포함되는 것으로 인정되어야 한다.

Claims (24)

1. 스탓3가 활성화되도록 변형된 줄기세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포로서, 상기 변형된 줄기세포는 미분화 상태의 유지, 증가된 자가재생산 능력, 증가된 생착능 및 변형되지 않은 기원세포의 다능성을 보유하는 것을 특징으로 하는 것인 스탓3가 활성화된 줄기세포.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포는 증가된 시험관내 증식능력을 가지며 변형되지 않은 기원세포의 다능성을 보유하는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포는 조혈모세포인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포는 조혈계세포와 비조혈계의 세포로 분화가능한 다능성 줄기세포인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포는 포유동물의 줄기세포인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
6. 청구항 5에 있어서, 상기 포유동물은 인간인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
7. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포는 탯줄혈액에서 얻어지는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
8. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포에서 스탓3는 스탓3-C인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
9. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포에서 활성화된 스탓3의 단백질산물은 단백질이입을 통해 세포로 전달되는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
10. 삭제
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제
14. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포가 증식되도록 줄기세포군을 증폭하여 제조하는 것을 포함하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
15. 청구항 14에 있어서, 상기 줄기세포군은 생체 외의 것인 스탓3가 활성화된 줄기세포.
16. 청구항 14에 있어서, 상기 줄기세포군은 생체 내의 것인 스탓3가 활성화된 줄기세포.
17. 청구항 14에 있어서, 상기 줄기세포군은 시험관 내의 것인 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
18. 삭제
19. 삭제
20. 청구항 14에 있어서, 상기 활성화된 스탓3를 발현하는 세포를 상기 줄기세포군과 동시배양하여 제조하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
21. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포를 필요한 개체에 투여하여 개체내 생착을 촉진할 수 있는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
22. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포를 필요한 개체에 투여하여 개체내 조직을 재생할 수 있는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
23. 청구항 1에 있어서, 상기 변형된 줄기세포를 필요한 개체에 투여하여 골수세포의 결핍을 보이는 환자의 골수를 복원할 수 있는 것을 특징으로 하는 스탓3가 활성화된 줄기세포.
24. 스탓 3를 활성화시켜 하기 특징을 가지는 스탓 3가 활성화된 줄기세포를 제작하는 방법:

    1) 미분화 상태의 유지;

    2) 증가된 자가재생산 능력;

    3) 증가된 생착능; 및

    4) 변형되지 않은 기원세포의 다능성 보유.

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