KR20190135946A

KR20190135946A - Hiv 감염 치료 또는 예방을 위한 ccr5/cxcr4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20190135946A
Application number: KR1020190063442A
Authority: KR
Inventors: 강경선; 서광원; 권대기; 한미정
Original assignee: 주식회사 강스템바이오텍
Priority date: 2018-05-29
Filing date: 2019-05-29
Publication date: 2019-12-09

Abstract

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 CCR5/CXCR4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 제조방법, 상기 조혈모세포를 포함하는 HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 세포치료제에 관한 것이다.
본 발명의 조혈모세포 제조방법은 CCR5 및 CXCR4 유전자가 동시에 넉아웃된 조혈모세포를 효율적으로 제조할 수 있는 바, 이로부터 제조된 조혈모세포를 HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 세포치료제로 이용할 수 있다.

Description

HIV 감염 치료 또는 예방을 위한 CCR5/CXCR4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 및 이의 제조방법{A patient-specific CCR5/CXCR4 gene knockout hematopoietic stem cells for treatment or prevention of HIV infection and method thereof}

본 발명은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 CCR5/CXCR4 유전자 동시 넉아웃 환자맞춤형 조혈모세포 제조방법, 상기 조혈모세포를 포함하는 HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 세포치료제에 관한 것이다.

인간면역결핍바이러스(Human Immunodeficiency Virus: HIV)는 후천성 면역결핍증인 AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) 를 일으키는 바이러스로서, HIV는 도움 T 세포(CD4 T 세포)에 감염되어 상기 세포를 파괴시키고, 이러한 감염이 반복되면 환자 체내의 도움 T 세포의 수치가 극도로 감소하여 이로 인해 결국 환자의 면역기능이 상실됨으로서, HIV에 감염된 환자는 기회감염이나 암으로 인해 사망하게 된다.

AIDS는 1981년 미국에서 첫 환자가 발견된 이래로 매년 감염자가 폭발적으로 증가하여 현재 전세계적으로 약 3500만명의 감염자가 있을 것으로 추정되며, 미국에서만 매년 50,000 여명의 신규감염환자가 발생하고 있고, 국내에는 약 1만여명의 감염자가 있는 것으로 추정된다.

HIV는 단일가닥 RNA 바이러스로, 역전사효소를 가지고 있고, 표면의 gp120 단백질을 이용하여 도움 T 세포 표면의 CD4 수용체와 공-수용체인 C-C chemokine receptor type 5 (CCR5; CD195) 또는 C-X-C chemokine receptor type 4 (CXCR4; CD184)와 상호결합하는 기전을 통해 도움 T 세포에 감염된다.

또한, HIV는 도움 T 세포에 감염될 때 사용하는 공-수용체에 따라 2가지 유형으로 나뉘는데, CCR5를 이용하는 HIV를 R5 유형, CXCR4를 이용하는 HIV를 X4 유형이라고 한다.

현재, HIV 감염 시 약물치료는 HIV에 존재하는 역전사효소를 억제하는 약제를 병용하는 칵테일 요법이 주로 활용되고 있다. 그러나, HIV의 변이가 심하여 약물요법으로는 완치가 불가능하고, 매년 늘어나는 HIV 감염환자들 (전세계 연간 210만 여명), 항바이러스제를 투여함에도 사망하고 있는 환자들 (전세계 연간 110만 여명), 낮아지고 있는 HIV 감염연령 (평균 37세), 높은 의료비 (연간 1인당 2,000여 만원) 등으로 인해 AIDS를 근본적으로 치료할 수 있는 방법은 반드시 필요하다.

현재까지 HIV 감염에서 완치된 사례는 1건이 보고되었다. 이 완치된 환자는 베를린에서 치료받았다는 의미로 '베를린 환자'로 명명되었다. 이 환자는 HIV 감염 이후 추가로 백혈병에 걸렸고, 백혈병을 치료하기 위해 타인의 조혈모세포 (hematopoietic stem cells; HSC) 를 이식 받았는데, 이러한 조혈모세포 이식과정을 통해 HIV 감염으로부터 완치되었다고 보고되었다.

후향적 연구 결과 '베를린 환자'가 이식 받은 조혈모세포는 HIV가 도움 T 세포에 감염되는데 필요한 공-수용체인 CCR5가 선천적으로 돌연변이된 상태였기 때문에, 상기 CCR5가 돌연변이된 조혈모세포로부터 HIV에 저항성을 띄는 도움 T 세포를 만들어서, 이를 통해 AIDS가 완치된 것으로 확인되었다.

다만, CCR5가 돌연변이된 조혈모세포를 이식받았음에도 AIDS로부터 완치되지 못하고 사망한 사례도 보고된 바 있으나, 이 환자는 R5 및 X4 유형의 HIV가 동시에 감염된 환자였기 때문에 완치가 되지 않고 사망한 것으로 보인다.

한편, CRISPR/Cas9 시스템은 가장 최근에 개발된 3세대 유전자 가위로 세포의 유전자를 넉아웃 하기 위해 전세계적으로 활발하게 활용되고 있는 기술이다. CRISPR/Cas9 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 와 Cas9 뉴클레아제로 구성되어 있고, 세포 내에 도입된 gRNA가 genomic DNA 상의 넉아웃 시킬 부위와 결합하면 이것을 Cas9 뉴클레아제가 인식하여 genomic DNA 부위를 절단하는 기전을 통해 유전자를 넉아웃시킬 수 있다. 따라서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하면 환자의 체세포에서 CCR5와 CXCR4를 동시에 넉아웃할 수 있을 것으로 보인다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 CCR5 및 CXCR4 유전자를 동시에 넉아웃시킬 수 있는 발현 벡터 및 이를 포함하는 조성물을 개발하였고, 이를 이용하여 CCR5 및 CXCR4 유전자가 넉아웃된 조혈모세포를 제조할 수 있음을 확인하였으며 분화단계에서 Serum-free / xeno-free / gene-free 방식을 사용하여 줄기세포를 배양하여 분화된 세포의 생착능이 향상된 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 분리된 세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 유전자 가위 기술을 이용하여 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 분리된 세포를 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free) 및 진-프리(gene-free) 방법으로 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 조혈모세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 (a) 분리된 체세포로부터 직접 리프로그래밍을 통해 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 조혈모세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계를 포함하는, 조혈모세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 제조된, 조혈모세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 줄기세포를 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free) 및 진-프리(gene-free) 방식으로 배양하여 분화된 세포의 생착능을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 유전자 가위(programmable nuclease)인 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 HIV(Human Immunodeficiency Virus) 감염을 치료하기 위해, 유전자 가위의 표적이 될 수 있는 CCR5 및 CXCR4 유전자에 대한 가이드 RNA 표적 위치를 규명하였다. 이에, 상기 가이드 RNA 표적 위치를 유전자 가위로 절단함으로써 CCR5/CXCR4가 모두 넉아웃된 조혈모세포를 제조할 수 있고, 이를 이용하여 HIV 감염을 효과적으로 치료할 수 있다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같으며, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는, (a) 분리된 세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 유전자 가위 기술을 이용하여 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 분리된 세포를 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free) 및 진-프리(gene-free) 방법으로 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 조혈모세포 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 용어 "조혈모세포(hematopoietic stem cell: HSC)는 골수에서 자가 복제 및 분화를 통해 백혈구, 적혈구 및 혈소판 등의 혈액세포를 만들어 내는 세포이다. 조혈줄기세포라고도 불리우는 조혈모세포는 성인에서는 골수에 약 1% 정도의 적은 수로 존재하며 말초혈액에서도 소수로 존재한다. 조혈모세포는 자가 복제능력을 지녔기 때문에 조혈모세포에서 혈구가 생성되어 말초혈액으로 나간다 해도 정상인의 골수 세포충실도(세포의 수적변화, 형태)는 일정하게 유지된다. 또한 조혈모세포는 골수를 찾아가는, 즉 귀향하는 본능이 있는데 이러한 특성이 있어서 조혈모세포의 이식을 가능하게 한다.

본 발명의 용어, "CCR5(C-C chemokine receptor type 5)"는 도움 T 세포 표면 상에 존재하는 막관통 단백질 중 하나로서, CD195로도 불리운다. 상기 CCR5는 HIV가 도움 T 세포에 감염될 때 공-수용체 역할을 하여 HIV 감염에 도움을 주고, 상기 CCR5를 공-수용체로 이용하는 HIV를 R5 타입이라 한다.

본 발명의 용어, "CXCR4(C-X-C chemokine receptor type 4)"는 CCR5와 같이 도움 T 세포 표면 상에 존재하는 막관통 단백질 중 하나로서, CD184로도 불리운다. 상기 CXCR4는 HIV가 도움 T 세포에 감염될 때 공-수용체 역할을 하여 HIV 감염에 도움을 주고, 상기 CXCR4를 공-수용체로 이용하는 HIV를 X4 타입이라 한다.

본 발명의 용어, "분리된 세포"는 특별한 제한은 없으며, 구체적으로는 체세포(Somatic cell), 생식세포 또는 전구세포(Progenitor cell) 등 이미 계통(Lineage)이 특정된 세포일 수 있으며, 유도만능줄기세포, 성체줄기세포, 골수세포, 중배엽 줄기세포 등 분화능이 한정된 줄기세포일 수 있고, 구체적으로 본 발명의 분리된 세포는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 체세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 분리된 세포에는 생체내 또는 생체외의 세포가 모두 포함될 수 있으며, 구체적으로, 생체에서 분리된 세포일 수 있다.

본 발명에서 "체세포"는 생식세포를 제외한 동·식물을 구성하는 분화가 완결된 모든 세포를 뜻하며, 상기 "전구세포"는 자손에 해당하는 세포가 특정 분화 형질을 발현하는 것으로 밝혀진 경우, 분화 형질을 발현하지 않으나, 그 분화 운명(Fate)을 가지고 있는 모세포를 말한다.

본 발명에서 "성체줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미하며, 이는 그 분화능이 일반적으로 특정 조직을 구성하는 세포로만 한정된다. 구체적으로, 성체줄기세포는 유방, 골수, 뇌, 척수, 제대혈, 혈액, 간, 피부, 위장관, 태반, 및 자궁 등으로 구성된 군에서 유래할 수 있다.

또한, 본 발명에서 "유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)"는 특정한 유전자를 인위적으로 발현시켜 비만능세포인 성체체세포를 유도하여 인공적으로 만들어진 만능줄기세포로서, 배아줄기세포와 같은 자연적인 만능줄기세포와 많은 면이 비슷하다.

본 발명에서는 유도만능줄기세포의 CCR5 및 CXCR4 유전자를 넉아웃시킨 후, 이를 조혈모세포로 분화시켜, CCR5/CXCR4 넉아웃 조혈모세포를 제조하였다.

본 발명의 용어, "발현 수준이 내재적 발현 수준에 비하여 감소"란, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 발현되지 않거나, 유전자 발현에 있어 자연적 상태 또는 변형 전의 상태보다 특정의 감소를 나타내거나, 발현되더라도 기능성이 있는 해당 폴리펩티드를 생산하지 않는 것을 의미한다.

또한, 해당 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 완전하게 불활성화되어 있는 것뿐만 아니라 그 발현 수준이 내재적 발현 수준에 비하여 약화되거나 현저하게 낮아 실질적으로 발현되지 않는 것도 포함되는 의미이다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전(넉아웃)하거나 부분적(예를 들면, 유전자가 내재적 발현 수준 미만을 나타내는 저차형유전자(hypomorph)이거나 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물)일 수 있다.

구체적으로, 본 발명에서 CCR5 또는 CXCR4의 불활성화는,

1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체의 결실,

2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형,

3) 상기 단백질의 활성이 약화되도록 염색체 상의 상기 폴리뉴클레오티드 서열의 변형, 또는

4) 이의 조합 등을 사용하여 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

1) 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 핵산 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 상기 "일부"란 폴리뉴클레오티드의 종류에 따라서 상이하지만, 구체적으로는 1 내지 300개, 더 구체적으로는 1 내지 100개, 보다 구체적으로는 1 내지 50개이다.

다음으로, 2) 상기 폴리뉴클레오티드의 발현이 감소하도록 발현조절 서열을 변형하는 방법은, 특별히 이에 한정되지 않으나, 상기 발현조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 핵산 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 핵산 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현조절 서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

아울러, 3) 염색체 상의 폴리뉴클레오티드 서열을 변형하는 방법은 상기 단백질의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서는 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 내재적 발현 수준에 비해 감소시키기 위해 유전자 가위를 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어 "유전자 가위"는 동식물 유전자에 결합해 특정 DNA 부위를 자르는데 사용하는 인공 효소로서, 특정 유전자 영역을 제거해 문제를 해결하는 유전자 편집 (Genome Editing) 기술을 의미하는 것일 수 있다. 상기 유전자 가위 기술에는 1세대인 징크핑거 뉴클레이즈(Zinc Finger Nuclease: ZFN), 2세대인 탈렌(Transcriptor Activator-Like Effector Nucleases: TALEN) 및 3세대인 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeats: CRISPR)을 포함될 수 있다.

징크핑거 뉴클레아제는 1세대 유전자 가위로 징크핑거와 3~4개의 뉴클레아제가 결합하여 있으며, 상기 뉴클레아제는 'Fok1'이라는 제한효소를 이용한다.

탈렌은 2세대 유전자 가위로 식물성 병원체인 잔토모나스(Xanthmonas)로부터 유래 되었다. 탈렌을 구성하는 아미노산 서열은 절단하는 DNA의 염기서열과 일치하기 때문에 탈렌의 아미노산 서열을 변경하면 결합 대상인 DNA의 염기서열도 달리할 수 있어 단백질을 맞춤식으로 변형하기가 훨씬 수월하며, 징크핑거 뉴클레아제와 마찬가지로 DNA를 절단하는 효소로 'Fokl'을 사용한다.

크리스퍼는 3세대 유전자 가위로 세균의 천적인 바이러스를 막기 위해 구축한 일종의 면역 체계로서 작은 회문구조로 이루어져 있다. 가장 널리 사용되고 있는 CRISPR 시스템은 CRISPR/Cas9으로서 가이드 RNA가 표적하고자 하는 DNA의 20개 염기서열에 상보적으로 결합하고 Cas9(CRISPR associated protein 9) 단백질이 바로 뒤에 존재하는 DNA의 특정 염기서열을 인식하여 절단하는 방식이다. 최근에서는 4세대 유전자 가위로서 CRISPR/Cpf1이 이용되고 있다.

또한, 상기 유전자 가위와 표적 서열과 유사한 주형(template) DNA를 동시에 세포에 도입하여 표적 서열 부위에 도입된 주형 DNA가 상동성 재조합(homologous recombination)으로 넉인되는 방식을 이용하여, 표적 서열을 넉아웃 시킬 수 있다.

구체적으로 본 발명에서는 CCR5 및 CXCR4 유전자 가이드 RNA가 함께 포함된 발현 벡터 또는 CCR5 및 CXCR4 유전자 가이드 RNA가 각각 별개로 포함된 발현 벡터의 조합을 포함하는 CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 CCR5 및 CXCR4의 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시킬 수 있고, 상기 감소는 CCR5 및 CXCR4 유전자를 동시에 넉아웃시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 (a) 단계에서 분리된 세포에 CCR5 및 CXCR4의 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계는 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있고, 상기 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 조성물은 (a) 서열번호 1의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및 (b) 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 것일 수 있다.

상기 서열번호 1의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 HIV 감염에 도움을 주는 공-수용체 중 하나인 CCR5 유전자를 표적으로 하고, 상기 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA는 또 다른 공-수용체인 CXCR4 유전자를 표적으로 한다.

본 발명에서는 HIV 감염에 도움을 주는 공-수용체인 CCR5 및 CXCR4 유전자가 모두 넉아웃된 조혈모세포를 제조하였는 바, 이를 HIV가 감염된 환자에게 이식하면 상기 조혈모세포는 CCR5 및 CXCR4 유전자가 모두 넉아웃된 T 세포 등의 면역세포를 만들 수 있으므로, HIV 감염에 저항성을 가지게 되어 HIV에 의해 유발된 AIDS 등을 치료할 수 있게 된다.

본 발명에서 용어, "RNA-가이드 뉴클레아제"는 목적하는 유전체 상의 특정위치를 인식하여 절단할 수 있는 뉴클레아제로서, 특히 가이드 RNA에 의해 표적 특이성을 갖는 뉴클레아제를 말한다. 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 이에 제한되는 것은 아니나, 구체적으로 미생물 면역체계인 CRISPR에서 유래한 Cas9 (CRISPR-Associated Protein 9) 뉴클레아제 (nuclease), 이의 변이체인 Cas9 니케이즈 (nickase) 및 Cpf1 뉴클레아제를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "Cas 단백질"은 CRISPR/Cas 시스템의 주요 단백질 구성요소로, 활성화된 엔도뉴클레아제로 작용할 수 있는 단백질이다. 상기 Cas 단백질은 crRNA (CRISPR RNA) 및 tracrRNA (trans-activating crRNA)와 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다.

상기 Cas9 뉴클레아제는 인간 세포를 비롯한 동식물 세포의 유전체에서 특정 염기서열을 인식해 이중나선절단 (double strand break, DSB)을 일으킨다. 상기 이중나선절단은 DNA의 이중 나선을 잘라 둔단 (blunt end) 또는 점착종단 (cohesive end)을 만드는 것을 모두 포함한다. DSB는 세포 내에서 상동재조합 (homologous recombination) 또는 비상동재접합 (non-homologous end-joining, NHEJ) 기작에 의해 효율적으로 수선되는데 이 과정에 연구자가 원하는 변이를 표적 장소에 도입할 수 있다. 상기 RNA-가이드 뉴클레아제는 인공적인, 혹은 조작된 비자연적으로 발생된 (non-naturally occurring)것일 수 있다.

상기 Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제의 촉매적 도메인들 중 1개에 돌연변이 1개 이상을 포함하는데, 여기서 상기 돌연변이 1개 이상은 RuvC 도메인 내 D10A, E762A 및 D986A로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 상기 돌연변이 1개 이상은 HNH 도메인 내 H840A, N854A 및 N863A로 이루어진 군으로부터 선택된다.

본 발명에서 상기 Cas9 니케이즈는 D10A 돌연변이를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Cas9 니케이즈는 Cas9 뉴클레아제와는 달리 단일가닥 절단 (single strand break)을 일으킨다. 따라서, Cas9 니케이즈가 작동하기 위해서는 두 개의 가이드 RNA를 필요로 하며, 쌍 (pair)으로서 기능한다. 상기 두 개의 가이드 RNA는 각각의 표적 서열에 대해 CRISPR 복합체의 서열 특이적 결합을 지시하고, 각 표적 서열 근처의 DNA 듀플렉스의 한 가닥의 절단을 지시하여, 서로 다른 DNA 가닥에 두 개의 틈 (nick)을 유도할 수 있다.

Cas 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질일 수 있다. 또한, 상기 Cas 단백질은 스타필로코커스 (Staphylococcus) 속, 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 네이세리아 (Neisseria) 속, 파스테우렐라 (Pasteurella) 속, 프란시셀라 (Francisella) 속, 캄필로박터 (Campylobacter) 속 유래의 Cas 단백질일 수 있으나, 상기 기술된 예에 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 용어 "Cpf1 뉴클레아제"는 Francisella novicida에서 유래된 것으로, crRNA과 복합체를 형성하여 이의 활성을 나타낼 수 있다. 또한, Cpf1 단백질의 구조는 Cas9 단백질과 달라 결합하는 RNA의 길이가 짧아 제작이 수월하며 정확성이 우수하다. 상기 Cpf1 단백질 또는 유전자 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 GenBank와 같은 공지의 데이터 베이스에서 얻을 수 있다.

본 발명자들은 상기 HIV(Human immunodeficiency virus) 감염을 치료하기 위한 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 조혈모세포를 제조하기 위해, CCR5 유전자 및 CXCR4 유전자 각각의 엑손 3의 표적 서열을 규명하였다(도 1). 본 발명에서 규명된 표적 위치는 CCR5 유전자의 경우 서열번호 1의 염기서열, CXCR4 유전자의 경우 서열번호 2의 염기서열을 가진다. 이에, 상기 서열번호 1 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 CCR5 유전자에 대한 가이드 RNA를 암호화하고, 상기 서열번호 2 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드는 CXCR4 유전자에 대한 가이드 RNA를 암호화하는 것일 수 있으며, 상기 폴리뉴클레오티드를 이용하여 가이드 RNA를 제조할 수 있다.

본 발명의 발현벡터는 추가적으로 Cas9 뉴클레아제, Cas9 니케이즈 또는 Cpf1 뉴클레아제를 암호화하는 것일 수 있다. 즉, Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질과 가이드 RNA가 함께 존재하는 경우에 표적 대상의 DNA를 절단할 수 있으므로, Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 가이드 RNA와 하나의 벡터에 포함되는 형태로 이용될 수 있고, 또는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질을 암호화하는 별개의 발현 벡터를 이용할 수도 있다. 상기 벡터는 바이러스 벡터, 플라스미드 벡터, 또는 아그로박테리움 (agrobacterium) 벡터일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 가이드 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 Cas9 단백질 또는 Cpf1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 당업계에 공지된 클로닝 (clonning) 방법을 수행하여 제조될 수 있으며, 그 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 (a) 단계의 CCR5 및 CXCR4의 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소된 분리된 세포를 조혈모세포로 분화시키는 단계는 상기 분리된 세포가 유도만능줄기세포인지 또는 체세포인지에 따라 다른 방법이 이용될 수 있다.

먼저, 상기 분리된 세포가 유도만능줄기세포인 경우 in vitro 방식 또는 in vivo 방식으로 조혈모세포를 분화시킬 수 있다.

in vitro 방식의 경우에는 상기 분리된 세포를 조혈모세포 분화용 배지에서 배양하여 조혈모세포를 제조할 수 있으며, 본 발명자들은 iPSC spontaneous differentiation 배지 및 HSC 배양배지가 1:1로 혼합된 배지에서 상기 분리된 세포를 배양하는 경우 조혈모세포 분화 효율이 우수한 것을 확인하였다(실시예 3-1). 또한, 다른 in vitro 방식은 상기 분리된 세포를 골수기질세포(Bone marrow stromal cell)인 OP9 세포를 feeder cell로 사용하여 공배양하는 방식으로서, 상기 방식을 통해 조혈모세포를 제조할 수 있음을 확인하였다(실시예 3-1).

In vivo 방식의 경우에는, (i) 상기 (a) 단계의 분리된 세포를 마우스의 피하에 이식하여 테라토마(teratoma) 조직을 형성하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계에서 형성된 테라토마(teratoma) 조직에서 조혈모세포를 분리하는 단계를 포함하는 방법으로 조혈모세포를 분화시켜 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예를 살펴보면 테라토마 조직을 형성하기 위해 accutase 처리로 수득한 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포를 마트리겔과 혼합하여 누드 마우스의 피하에 주입하는 방법을 통해 테라토마 조직을 형성하였고, 이 중 CD34+ 세포를 분리하여 조혈모세포를 제조하였다(실시예 3-2).

또한, 상기 (a) 단계의 CCR5 및 CXCR4의 발현수준이 내재적 발현 수준에 비하여 감소된 분리된 세포가 체세포인 경우, 리프로그래밍을 통해 CCR5/CXCR4 넉아웃 유도만능줄기세포를 제조한 후, 상기 전술한 in vitro 방식 또는 in vivo 방식으로 조혈모세포를 분화시킬 수 있으며, 또는 직접 리프로그래밍을 통해 상기 체세포를 유도조혈모세포 유도하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "리프로그래밍(Reprogramming)"은 특정 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴 (Global gene expression pattern) 등을 조절하여, 목적하는 세포로 전환시키는 방법을 의미한다. 다시 말해서, 본 발명에서 리프로그래밍은 세포의 운명을 인위적으로 조작하여 전혀 다른 특성을 가지는 세포로 전환시키는 방법을 의미하며, 본 발명의 목적상 상기 리프로그래밍은 외래 유전자 혹은 RNA 또는 DNA를 포함하는 벡터를 세포에 도입함으로써 수행되는 것일 수 있다. 일례로, 리프로그래밍은 세포의 역분화(Dedifferentiation), 직접 리프로그래밍 (Direct reprogramming 또는 Direct conversion), 또는 직접 교차분화(Trans-differentiation)을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "리프로그래밍 인자(Reprogramming factor)"는 최종적으로 또는 일정부분 분화된 세포에 도입되어 리프로그래밍을 유도할 수 있는 유전자(혹은 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드), 또는 단백질을 의미한다. 상기 리프로그래밍 인자는 리프로그래밍을 유도하고자 하는 그 목적 세포에 따라, 그리고 리프로그래밍이 유도되는 분리된 세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 조혈모세포를 제조하는 경우에 있어서 리프로그래밍 인자는, Lin28, Asc11, Pitx3, Nurr1, Lmx1a, Nanog, Oct3, Oct4, Sox2, Klf4 및 Myc으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 인자를 포함하는 것일 수 있으며, 그 외에도 조혈모세포를 제조할 수 있는 것으로 당업계에 공지된 모든 인자를 포함할 수 있다. 또한, 상기 리프로그래밍 인자를 이용하여 조혈모세포로의 직접 리프로그래밍을 유도할 수 있다. 직접 리프로그래밍 방법론에서 리프로그래밍 유전 인자를 이용하는 방법이 있는데, 당업자는 그 목적 세포 및 리프로그래밍되기 전의 세포의 종류에 따라 적절한 인자를 선택할 수 있고, 이는 당업계에 공지된 범위 내에서라면 모두 본 발명의 범위에 포함되는 것으로, 그 종류에 특별히 제한되지 않는다. 리프로그래밍 유전인자를 이용한 리르로그래밍은 세포가 가지는 전체 유전자 발현 패턴을 조절하여 목적 세포로의 전환을 유도하는 것이므로, 상기 리프로그래밍 유전 인자가 세포에 도입되고, 세포를 일정 기간 배양함으로써 목적하는 종류의 세포의 유전자 발현 패턴을 가지는 목적 세포로 초기 세포를 리프로그래밍시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "직접 리프로그래밍"은 리프로그래밍 과정을 통해 전분화능을 가진 유도 만능 줄기세포를 제작하는 기술과는 차별화되며, 리프로그래밍 배양을 통해 직접적으로 원하는 목적 세포로의 직접 전환을 유도하는 기술이다. 기존 체세포 핵이식은 난자를 사용해야 하는 단점이 있어 다른 세포 리프로그래밍 기술에 비해 활용가능성이 낮으며, 유도 만능 줄기세포 리프로그래밍 기술을 이용하는 경우 태생적으로 전분화능 줄기세포를 경유하기 때문에, 미분화 세포의 잔류 여부 및 안전성 확보 여부가 검증되어야 한다는 단점이 있다. 하지만, 본 발명은 직접 리프로그래밍을 통해 목적 세포인 조혈모세포를 초기 세포로부터 직접 생산함으로써, 생산 시간, 비용, 효율, 안전성 등 상기 기술의 문제점을 극복할 수 있는 대안을 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 본 발명의 목적상 직접 리프로그래밍은 직접 역분화, 직접 분화, 직접 전환, 직접교차분화, 교차분화 등과 혼용될 수 있다. 본 발명에서 직접 리프로그래밍은 조혈모세포로의 직접 역분화 또는 교차분화를 의미할 수 있다.

본 발명에서 상기 (a) 단계에서 분리된 세포는, 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free), 및 진-프리(gene-free) 방법으로 배양하여 조혈모세포로 분화시킬 수 있다.

본 발명에서 말하는 "프리(free)" 방식이란, 세포를 배양 시 특정 성분 또는 물질을 포함하지 않은 배지나 특정 기법을 사용하지 않고 세포를 배양하는 방식을 의미한다.

"세럼-프리(serum-free)" 방식이란, 혈청 및/또는 혈장을 포함하지 않은 배지에서 세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 일 구현예로, 성분이 특정되지 않은 혈청 (serum) 대신, 이를 대체할 수 있는 성분이 특정된 물질을 사용하여 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로는 알부민일 수 있으나 이에 한정된 것은 아니다.

"제노-프리(xeno-free)" 방식이란, 동물 유래 물질이 포함되지 않은 배지에서 세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 일 구현예로, 마우스 세포인 OP9 세포 대신, 동물유래 성분이 포함되어 있지 않은 STEMdiff hematopoietic basal medium (STEMCELL) 등의 배지를 사용하여 배양하는 것을 포함할 수 있다.

"진-프리(gene-free)" 방식이란, 세포에 유전적 변화를 가져올 수 있는 유전자 도입 방법을 사용하지 않고 세포를 배양하는 것을 의미할 수 있다. 일 구현예로, STEMdiff hematopoietic basal medium (STEMCEL) 등의 배지를 사용하여 배양하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서는 세럼-프리, 제노-프리 및 진-프리 방식을 사용하여 조혈모세포를 제작하면, 실험결과의 일관성을 증진시키고, 체내 이식시 동물 유래 물질에 의한 불필요한 면역반응을 배제시키며, 외래 유전자에 의한 세포의 암화 가능성을 차단시킬 수 있다.

상기 배양 방법은 세포 생착능을 증진시키기 위해 사용될 수 있다.

본 발명에서 “생착능”이란 이식된 줄기세포가 분화된 후속세포, 이식된 후 체내에서 생산한 세포 또는 주입된 세포가 손실 혹은 손상된 세포를 대체할 수 있는 능력을 말한다. 생착능 증진에 따라 예컨대 유효 이식 줄기세포 수의 절감, 이에 따른 줄기세포 체외 배양 기간 단축 및 줄기세포의 안전성 증가와 제조원가 절감의 장점을 가질 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서는, 제조된 유도만능줄기세포를 조혈모세포로 분화하는 단계에서 serum-free, xeno-free 및 gene-free 방식으로 배양함으로써 분화된 세포의 생착능이 향상된 것을 확인하였는 바, 본 발명의 다른 하나의 양태는 줄기세포를 serum-free, xeno-free, 및 gene-free 방식으로 배양하여 분화된 세포의 생착능을 향상시키는 방법을 제공한다.

상기 줄기세포는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell) 모두 포함하며 유도만능줄기세포, 성체줄기세포, 골수세포, 중배엽 줄기세포 등 분화능이 한정된 줄기세포 뿐 아니라 분화능을 갖는 것이면 제한없이 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태는 (a) 분리된 체세포로부터 직접 리프로그래밍을 통해 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 조혈모세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계를 포함하는, 조혈모세포 제조방법을 제공한다.

분리된 세포, 조혈모세포, 직접 리프로그래밍, CCR5, CXCR4 및 내재적 발현수준에 비하여 감소하는 단계에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 조혈모세포 제조방법에 의해 제조된 조혈모세포를 제공한다.

조혈모세포에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 HIV 바이러스 감염은 구체적으로 후천적면역결핍증(acquired immune deficiency syndrome: AIDS)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 용어 "예방"은 상기 조성물의 투여에 의해 HIV 감염을 억제시키거나 발생을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명의 용어, "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 HIV 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 의미할 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

상세하게는, 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여할 수 있다.

상기 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 감염된 바이러스 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물 또는 이들의 약학적으로 허용 가능한 염은 각각 1일 0.0001 내지 1000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여할 수 있다.

상기 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물을 매일 투여 또는 간헐적으로 투여해도 좋고, 1일당 투여 횟수는 1회 또는 2~3회로 나누어 투여하는 것이 가능하다. 두 유효성분이 각각 단제인 경우의 투여횟수는 같은 횟수여도 좋고, 다른 횟수로 해도 된다. 또한, 본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 다른 약물 치료와 병용하여 사용할 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

상기 개체란, 암이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간과, 원숭이, 소, 말, 양, 돼지, 닭, 칠면조, 메추라기, 고양이, 개, 마우스, 쥐, 토끼 또는 기니아피그를 포함한 모든 동물을 의미한다. 본 발명의 약학적 조성물을 개체에게 투여함으로써 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다면 개체의 종류는 제한없이 포함된다.

본 발명의 또 다른 양태는, 상기 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공한다.

조혈모세포에 대해서는 상기 설명한 바와 같다.

본 발명의 용어, "세포 치료제"는 개체로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종 세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 다른 하나의 양태는, 상기 약학적 조성물 또는 세포치료제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 "개체", "투여", "암", 및 "치료"는 전술한 바와 같다.

본 발명의 조혈모세포 제조방법은 CCR5 및 CXCR4 유전자가 동시에 넉아웃된 조혈모세포를 효율적으로 제조할 수 있는 바, 이로부터 제조된 조혈모세포를 HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 세포치료제로 이용할 수 있다.

도 1은 CCR5 및 CXCR4 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA 설계 과정을 간략히 나타내는 도면이다.
도 2는 CRISRPR/Cas9 벡터의 도입을 위한 전기천공법 조건 확립 실험 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 CRISRPR/Cas9 시스템을 이용하여 CCR5 및 CXCR4 유전자가 넉아웃된 것을 확인한 도면이다.
도 4는 본 발명의 CRISRPR/Cas9 시스템을 이용하여 CXCR4 유전자가 monoallelic 및 biallelic 넉아웃된 것을 확인한 도면이다.
도 5는 유도만능줄기세포(iPSC)의 제조를 확인한 도면이다.
도 6은 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포의 제조를 확인한 도면이다.
도 7은 본 발명의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포의 전분화능을 확인한 도면이다.
도 8은 본 발명의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포가 in vitro 에서 조혈모세포로 분화될 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 9는 본 발명의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포가 in vivo 에서 조혈모세포로 분화될 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 10은 본 발명의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포가 in vitro에서 serum free / xeno-free / gene-free 방식으로 조혈모세포로 분화될 수 있음을 보여주는 도면이다.
도 11은 serum free / xeno-free / gene-free 방식으로 제작된 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 유도만능줄기세포 유래 조혈모세포가 nude mouse에 이식되었을 때 골수 (bone marrow), 지라 (spleen), 말초혈액 (peripheral blood) 에 생착될 수 있음을 보여주는 도면이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: CCR5 및 CXCR4 유전자 넉아웃 용도의 CRISPR/Cas9 제작

실시예 1-1: CCR5 및 CXCR4의 표적 위치 선정 및 가이드 RNA 제작

CRISPR/Cas9 시스템을 이용하여 CCR5 및 CXCR4 유전자를 넉아웃시키기 위해 상기 CCR5 및 CXCR4 유전자를 표적으로 하는 가이드 RNA를 제작하였다. 후보 가이드RNA 서열을 표 1에 기재하였다.

표적 유전자		프라이머 서열	서열번호
CCR5	CCR5-1	5'-TAATAATTGATGTCATAGAT-3'	1
CXCR4	CXCR4-1	5'-TGAGGGCCTTGCGCTTCTGG-3'	2
	CXCR4-2	5'-AGGTGGTCTATGTTGGCGTC-3'	3
	CXCR4-3	5'-GCTTCTACCCCAATGACTTG-3'	4
	CXCR4-4	5'-GTTCCAGTTTCAGCACATCA-3'	5

구체적으로, CCR5 또는 CXCR4 유전자의 엑손 3의 특정 서열을 표적으로 하여 가이드 RNA를 설계하였고(도 1a), 상기 후보 가이드 RNA 서열 중 넉아웃 효율이 우수한 가이드 RNA인 CCR5-1 및 CXCR4-1을 각각 CCR5 및 CXCR4 유전자 넉아웃을 위한 가이드 RNA로 선정하였다(도 1b 및 c).

그 후, pCas-guide 벡터를 이용하여 상기 가이드 RNA가 포함된, 각각 CCR5 및 CXCR4 유전자 넉아웃 용도의 벡터를 제작하였다. 구체적으로, pCas-guide 플라스미드 벡터 1ug에 2개의 제한효소(BamH1 및 BsmB1) 을 각각 0.8ul씩 혼합하고 37℃에서 3시간 처리하여 절단하고, 상기 절단된 벡터의 탈인산화를 통한 자가-연결을 억제하기 위해 Antarctic phosphatase 1ul를 첨가한뒤 37℃에서 30분간 추가로 인큐베이션 하였다. 그 후, 겔 정제 칼럼을 이용하여 상기 절단된 벡터를 정제하여, 10mM Tris 완충액에 용출시키고, 상기에서 합성한 가이드 RNA 서열을 절단된 벡터에 연결시켜 제작하였다.

실시예 1-2: CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 CCR5 및 CXCR4 유전자 넉아웃 확인

상기 실시예 1-1에서 제작한 CCR5 및 CXCR4 넉아웃을 위한 CRISPR/Cas9 벡터가 실제로 CCR5 및 CXCR5 유전자의 발현을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 상기 CRISPR/Cas9 벡터를 도입하기 위한 조건을 알아보기 위해, 다양한 방식으로 상기 벡터를 세포에 도입하여 형질전환 효율을 확인하였다. 구체적으로, Lipopectamine 3000, Convoy 및 전기천공법(electroporation) 방법을 이용하여 형질전환을 실시한 결과, 전기천공법으로 형질전환을 실시하였을 때 효율이 가장 우수한 것을 확인하였다(도 2a). 또한, CRISPR/Cas9 벡터 도입 효율이 우수한 전기천공법 조건을 확립하기 위해 GFP가 포함된 CRISPR/Cas9 벡터를 이용하여 다양한 조건으로 형질전환을 수행하여 GFP 발현량을 확인하였다(도 2b 및 c).

그 결과, Pulse voltage=1450, Pulse width=30, Pulse No.= 2인 경우 CRISPR/Cas9 벡터 도입 효율이 가장 우수한 것을 확인하였는 바, 이하의 실험에서는 상기 조건으로 전기천공법을 수행하였다.

그 후, 상기 실험결과를 토대로, 실시예 1-1에서 제작한 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 CRISPR/Cas9을 전기천공법을 이용하여 세포에 도입한 후 상기 CCR5 및 CXCR4 유전자의 넉아웃 여부를 확인하기 위해 CCR5 또는 CXCR4 유전자 부분을 증폭하기 위하여 표 2의 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 수행하였고(도 2a), 이로부터 얻은 PCR 생산물의 서열 분석을 통해 CCR5 및 CXCR4 유전자의 넉아웃 여부를 확인하였다.

구체적으로, AccuPrep Genomic DNA Extraction Kit (Bioneer)를 이용하여 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 벡터가 도입된 세포에서 gDNA를 분리하였다. AccuPower PCR Premix (Bioneer), CCR5 및 CXCR4 정방향 및 역방향 프라이머(표 2) 및 Genetouch Thermal Cycler(Hanzhou bioer technology)를 이용하여 분리된 gDNA를 주형으로 하여 PCR 증폭을 수행하였다. PCR이 끝난뒤 겔 전기영동(Mupid)를 통해 유전자 증폭 여부를 확인하였으며(도 3a), 상기 PCR 생산물을 MEGAquick-spin plus fragment DNA purification kit(iNtRON) 를 이용하여 정제하였다. 상기 정제된 PCR 생산물은 PCR에 사용한 정방향 프라이머와 함께 마크로젠(Seoul, Korea)에서 시퀀싱을 진행하였다(도 3b 및 c).

표적 유전자		프라이머 서열	서열번호
CCR5	정방향	5'-CCAAGCTCTCCATCTAGTGGAC-3'	6
CCR5	역방향	5'-TCACAAGCCCACAGATATTT-3'	7
CXCR4	정방향	5'-TCCATTCCTTTGCCTCTTTT-3'	8
CXCR4	역방향	5'-TTAGCTGGAGTGAAAACTTG-3'	9

대조군 및 CRISPR/Cas9 벡터가 도입된 세포의 CCR5 유전자 부분이 증폭된 PCR 생산물의 서열 분석 결과, CRISPR/Cas9 벡터가 도입된 경우 CCR5 유전자 중 일부분이 결실된 것을 확인할 수 있었고(도 3b), 대조군 및 CRISPR/Cas9 벡터가 도입된 세포의 CXCR4 유전자 부분이 증폭된 PCR 생산물의 서열 분석 결과, CRISPR/Cas9 벡터가 도입된 경우 CXCR4 유전자 중 일부분이 결실된 것을 확인할 수 있었다(도 3c). 또한, 상기 CRISPR/Cas9 벡터가 도입된 경우, CXCR4 유전자가 monoallelic 및 biallelic 넉아웃됨을 확인하였다(도 4).

따라서, 상기 결과를 토대로 실시예 1-1에서 제작한 CRISPR/Cas9 벡터가 CCR5 및 CXCR4 유전자를 넉아웃시킴을 알 수 있다.

실시예 2: CCR5 및 CXCR4 유전자가 넉아웃된 iPSC 제작

CCR5 및 CXCR4 유전자가 넉아웃된 유도만능줄기세포(iPSC)를 제작하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 성인의 피부섬유아세포에 야마나카 인자(Oct3/4, Sox2, Klf4 및 c-Myc)을 Multiplicity of infection (MOI) 5, 10, 20으로 도입하고 이를 배양하여 iPSC를 제작하였다. 상기 제작된 iPSC는 전형적인 콜로니 형태를 띄었고, 전분화능(pluripotency) 마커인 Oct4와 Nanog가 과발현됨을 확인하였다(도 5).

또한, Oct4와 Nanog의 전사 발현양을 확인하기 위해 qRT-PCR을 수행하였다.구체적으로, 상기 qRT-PCR을 수행하기 위해 PureLink RNA Mini Kit (Invitrogen)를 이용하여 세포 펠렛으로부터 mRNA를 분리하였고, AccuPower RT Premix(Bioneer)를 이용하여 분리된 mRNA로부터 cDNA를 합성하였다. 상기 cDNA, PowerUp SYBR Green Master Mix (Appliedbiosystems), Oct4 및 Nanog 정방향 및 역방향 프라이머(표 3) 및 증류수를 혼합하여 20 ul로 만들고, Quant Studio3 (Appliedbiosystems) 를 이용하여 PCR 반응을 수행하여, Oct4 및 Nanog 유전자의 상대적인 배수 값을 계산하였다.

표적 유전자		프라이머 서열	서열번호
Oct4	정방향	5'-GAAGGATGTGGTCCGAGTGT-3'	10
Oct4	역방향	5'-GTGAAGTGAGGGCTCCCATA-3'	11
Nanog	정방향	5'-GGCAAACAACCCACTTCTGC-3'	12
Nanog	역방향	5'-TGTTCCAGGCCTGATTGTTC-3'	13
CD34	정방향	5'-CACCCTGTGTCTCAACATGG-3'	14
CD34	역방향	5'-GGGAGATGTTGCAAGGCTAG-3'	15

또한, 상기 iPSC에 실시예 1-1에서 제작한 CRISPR/Cas9 벡터를 도입한 후, CCR5 및 CXCR4 유전자가 넉아웃된 것을 확인하기 위해, 실시예 1-2와 같이, CCR5 및 CXCR4 유전자 부분을 PCR로 증폭한 후, 상기 증폭된 PCR 생산물의 서열을 분석하였다.

그 결과, CCR5 및 CXCR4 유전자가 biallelic 넉아웃된 것을 확인하였다(도 6).

상기 CCR5 및 CXCR4 유전자가 biallelic 넉아웃된 iPSC(CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC)가 유도만능줄기세포의 특성을 유지하고 있는지 확인하기 위해, CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC에서 전분화능 마커인 Oct4, Sox2, Nanog, TRA-1-60의 발현량을 면역 염색법을 이용하여 확인하였다.

구체적으로, 상기 면역 염색법은 하기와 같은 과정으로 수행하였다. 먼저, 고정(Fixation), 투과(permeabilization) 및 블락킹(blocking)이 완료된 상기 WT-iPSC와 CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC에 실험목적에 맞게 Alexa Fluor 488 conjugated 항-Oct4 (Millipore), Cy3 conjugated 항-Sox2 (Millipore), Alexa Fluor 488 conjugated 항-Nanog (Millipore), Cy3 conjugated 항-TRA-1-60 (Millipore) 1차 항체 (각각 1:100) 를 4℃에서 하루 동안 처리하였다. 다음날 PBS로 워싱 후 염색된 세포의 관찰은 Nikon ECLIPSE Ti-U 현미경 (Nikon)을 이용하였다. Excitation/emission 파장은 Alex Fluor 488이 488/525 nm, Cy3가 594/617 nm 였다. 상기 면역염색 결과, WT-iPSC에서 Oct4, Sox2, Nanog, TRA-1-60는 단백질 수준에서 과발현하고 있음을 확인하였다(도 7a).

또한, 상기 CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC가 in vivo에서 3-germ layer로 분화되는 것을 확인하였고(도 7b), CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC를 분화시킨 세포에서 조혈모세포의 대표적 마커인 CD34가 발현하고 있음을 RT-PCR을 통해 확인하였는 바(도 7c), 본 발명에서 제조된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC는 in vivo에서도 전분화능을 갖는 것을 알 수 있다.

실시예 3: CCR5 및 CXCR4가 넉아웃된 조혈모세포 제작

실시예 3-1: in vitro 방식을 이용한 조혈모세포 제작

상기 실시예 2에서 제작된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC(CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC)를 in vitro 상에서 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로 분화시키기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 조혈모세포로 분화시키기 위한 배양 배지로서 iPSC spontaneous differentiation 배지[DMEM/F12+GlutaMAX-I (Gibco) 500 ml + Primocin (Invivogen) 1 ml + Knockout SR (Gibco) 125 ml] 및 HSC 배양배지[Stempro-34 SFM SFM (1X) (Gibco) 500 ml + Stempro-34 Nutrient Supplement (Gibco) 13ml + Glutamax-I (Gibco) 5 ml + Primocin (Invivogen) 1ml + SCF (R&D) 100 ng/ml + IL-3 (Gibco) 50 ng/ml + GM-CSF (Gibco) 25 ng/ml]를 1:1 (v/v) 로 혼합하였고, 상기 실시예 2에서 제조한 CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC를 배양체(embryoid body) 상태로 상기 혼합 배지에서 2주간 배양하였다.

그 결과, 조혈모세포 마커인 CD34가 발현된 CD34⁺ 세포로의 분화가, 상기 혼합 배지로 분화시킨 경우 대조군(spontaneous differentiation)에 비해 약 20배 증가된 것을 확인하였는 바(도 8a), 조혈모세포로의 분화가 상기 혼합 배지 조건에서 증진됨을 확인하였다.

또한, 골수기질세포(Bone marrow stromal cell)인 OP9 세포를 feeder cell로 사용하여 CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC를 분화시킨 결과, 조혈모세포의 형태를 가지면서(도 8b), 조혈모세포의 대표적인 마커인 CD34를 강하게 발현하고 있는 것을 확인하였다(도 8c).

따라서, 이를 통해 본 발명에서 제조된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC이 in vitro 방식을 이용해서 조혈모세포로 분화될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3-2: in vivo 방식을 이용한 조혈모세포 제작

상기 실시예 2에서 제작된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC(CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC)를 in vivo 상에서 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로 분화시키기 위해, 상기 CCR5^-/- CXCR4^-/- iPSC를 누드 마우스에 주입하여 테라토마(teratoma)를 형성한 뒤, 상기 테라토마를 기계적/화학적 방법을 이용하여 분리시키고, 상기 분리된 테라토마에 CD34 항체를 결합시킨 뒤 MACS sorting 하여, CD34⁺ 세포인 분화된 CCR5^-/- CXCR4^-/-조혈모세포를 수득하였다(도 9a).

구체적으로, 테라토마 형성을 위해 약 1x10⁵ 내지 5x10⁵개의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 iPSC를 accutase로 뗀 뒤, 100ul의 마트리겔(matrigel)과 혼합하여 Balb/c 누드 마우스의 피하에 이식한 결과, 8-12주 후에 100%의 테라토마 형성율을 보였다 (Wild type iPSC-2/2, 동시 넉아웃 iPSC-4/4)(도 9b).

이는 기존의 일반적인 테라토마 형성율에 비해 비약적으로 향상된 결과로서, 일반적으로 테라토마 형성을 위해 마우스에 주입하는 iPSC 숫자인 1x10⁶내지 5x10⁶개에 비해 약 10% 수준의 적은 양의 세포를 주입했음에도 불구하고 높은 테라토마 형성율을 보였다. 상기 결과는 iPSC 콜로니를 배양 접시에서 떼어낼 때 강하지 않은 프로테아제인 accutase를 사용하고, 세포를 떼어낸 직후 iPSC와 혼합한 100% 마트리겔의 시너지 효과 때문으로 판단된다.

또한, 상기 테라토마 유래의 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 iPSC는 골수에서 분리한 조혈모세포와 비슷한 비율의 CD34 발현율을 보였는 바(도 9c), 본 발명에서 제조한 CCR5/CXCR4 동시 넉아웃 iPSC를 이용하여 조혈모세포를 제조할 수 있음을 알 수 있다.

실시예 3-3: In vitro 방식을 이용한 조혈모세포 제작 (serum-free / xeno-free / gene-free 방식)

상기 실시예 2에서 제작된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC (CCR5-/- CXCR4-/- iPSC) 를 세포치료제로 활용하기 위해 serum-free / xeno-free / gene-free 방식으로 조혈모세포(hematopoietic stem cell)로 분화시키는 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, iPSC 배양 배지[DMEM/F12+GlutaMAX-I (Gibco) 500 ml + Primocin (Invivogen) 1 ml + Knockout SR (Gibco) 125 ml + bFGF 4ng/ml] 에서 5-7일간 부착상태로 배양중이던 미분화 iPSC를 메커니컬하게 detach하여 12 well culture plate에 시딩하였다. 12 well culture plate는 1/45로 PBS에 희석한 matrigel (BD) 로 상온에서 2시간 코팅한 뒤 사용하였다. 12 well culture plate에 seeding하는 iPSC aggregate의 개수를 약 10개 (2-3개/cm²) 로 하였다 [(Manufacturer가 제시하는 조건은 well당 40-80개 (10-20개/cm²)). iPSC aggregate의 seeding density를 2-3개/cm2로 정밀하게 조절한 이유는 조혈모세포 분화과정 중 급격한 pH 변화를 방지하여 생착능을 유지하는 건강한 조혈모세포를 제조하기 위해서이다. 하루 뒤, 조혈모세포로 분화시키기 위한 배지로서 STEMdiff hematopoietic basal medium (STEMCELL) 45ml, Primocin 90ul, STEMdiff hematopoietic supplement A (STEMCELL) 225ul가 섞인 분화배지에서 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC를 부착상태로 3일간 분화 유도하였다. 분화 3일부터 12일째까지 STEMdiff hematopoietic basal medium (STEMCELL) 75ml, Primocin 180ul, STEMdiff hematopoietic supplement B (STEMCELL) 375ul가 섞인 분화배지에서 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC를 부착상태로 9일간 분화 유도하였다. 조혈모세포 분화는 21% 산소 (normoixa) 혹은 1-5% 산소 (hypoxia) 조건에서 12일간 수행하였다.

그 결과 조혈모세포 마커인 CD34가 90% 이상 발현하는 순수한 조혈모세포를 제작하였다 (도10a). 이 조혈모세포는 CD14를 발현하는 monocyte (도10b, 10c), CD44를 발현하는 macrophage로도 분화 될 수 있었다 (도10d). iPSC에서 조혈모세포로 분화 시 iPSC aggregate seeding을 low density (2-3개/cm2) 로 유지하였을 때 high density (10-20개/cm2) 에 비해 이후 조혈모세포에서 monocytes로의 분화가 원활하게 진행되었다 (도10e).

따라서, 이를 통해 본 발명에서 제조된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC가 serum-free / xeno-free / gene-free 방식으로 조혈모세포로 분화될 수 있음을 알 수 있다.

실시예 4: Serum-free / xeno-free / gene-free 방식으로 제작한 조혈모세포의 in vivo 생착능 검증

상기 실시예 3-3에서 제작된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC (CCR5-/- CXCR4-/- iPSC) 유래 조혈모세포를 세포치료제로 활용하기 위해 nude mouse의 생체 (bone marrow, spleen, peripheral blood) 에 조혈모세포(hematopoietic stem cell)를 이식하는 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 항암제 (Busulfan, 50ug/g) 를 24시간 간격으로 2번 복강내에 주입하여 mouse의 체내에서 조혈모세포를 제거하는 컨디셔닝을 수행하였다. 다음날 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC (CCR5-/- CXCR4-/- iPSC) 유래 조혈모세포를 mouse당 5 x 10⁴개 정맥주입하였다. 8주후, mouse의 bone marrow, spleen, peripheral blood 를 추출하여 PCR 방식으로 정맥주입한 세포의 존재여부를 확인하였다.

그 결과, mouse bone marrow에서 human CCR5 genomic DNA와 서열이 일치하는 human cell이 존재함을 확인하였다 (도 11a). 이 세포에도 CCR5 넉아웃이 확인되었다 (도 11b). Spleen과 peripheral blood에서도 human cell의 존재가 확인되었다 (도 11c).

따라서, 이를 통해 본 발명에서 제조된 serum-free / xeno-free / gene-free 방식으로 제조된 CCR5/CXCR4 넉아웃 iPSC 유래 조혈모세포가 in vivo에서 생착 가능함을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> Kangstem Biotech CO., LTD. <120> A patient-specific CCR5/CXCR4 gene knockout hematopoietic stem cells for treatment or prevention of HIV infection and method thereof <130> KPA180495-KR-P1 <150> KR 10-2018-0061354 <151> 2018-05-29 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5-1_gRNA <400> 1 taataattga tgtcatagat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-1_gRNA <400> 2 tgagggcctt gcgcttctgg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-2_gRNA <400> 3 aggtggtcta tgttggcgtc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-3_gRNA <400> 4 gcttctaccc caatgacttg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4-4_gRNA <400> 5 gttccagttt cagcacatca 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5_F <400> 6 ccaagctctc catctagtgg ac 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CCR5_R <400> 7 tcacaagccc acagatattt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4_F <400> 8 tccattcctt tgcctctttt 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CXCR4_R <400> 9 ttagctggag tgaaaacttg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_F <400> 10 gaaggatgtg gtccgagtgt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oct4_R <400> 11 gtgaagtgag ggctcccata 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_F <400> 12 ggcaaacaac ccacttctgc 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nanog_R <400> 13 tgttccaggc ctgattgttc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34_F <400> 14 caccctgtgt ctcaacatgg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD34_R <400> 15 gggagatgtt gcaaggctag 20

Claims

(a) 분리된 세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 유전자 가위 기술을 이용하여 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 분리된 세포를 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free) 및 진-프리(gene-free) 방법으로 배양하여 조혈모세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 조혈모세포 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 분리된 세포는 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 체세포인 것인, 조혈모세포 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 유전자 가위 기술은 크리스퍼(CRISPR), 탈렌(TALEN) 및 징크핑거(Zinc finger) 뉴클레아제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인, 조혈모세포 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 분리된 세포에 CCR5 및 CXCR4의 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계는 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 조성물을 이용하는 것을 특징으로 하는 것인, 조혈모세포 제조방법.
제4항에 있어서, 상기 CCR5 및 CXCR4 넉아웃용 조성물은
(a) 서열번호 1의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터; 및
(b) 서열번호 2의 염기서열 또는 이와 상보적인 염기서열로 이루어진 가이드 RNA를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 포함하는 것인, 조혈모세포 제조방법.
제5항에 있어서, 상기 발현 벡터는 Cas9 뉴클레아제 (nuclease), Cas9 니케이즈 (nickase) 또는 Cpf1 뉴클레아제 (nuclease) 중 어느 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것인, 조혈모세포 제조방법.
(a) 분리된 체세포로부터 직접 리프로그래밍을 통해 조혈모세포로 분화시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 조혈모세포의 CCR5 및 CXCR4 발현수준을 내재적 발현 수준에 비하여 감소시키는 단계;
를 포함하는, 조혈모세포 제조방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된, 조혈모세포.
제8항의 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, HIV 바이러스 감염 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
제8항의 조혈모세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제.
줄기세포를 세럼-프리(serum-free), 제노-프리(xeno-free) 및 진-프리(gene-free) 방식으로 배양하여 분화된 세포의 생착능을 향상시키는 방법.
제11항에 있어서, 상기 방법은 실험결과의 일관성을 증진시키고, 체내 이식시 동물 유래 물질에 의한 불필요한 면역반응을 배제시키며, 외래 유전자에 의한 세포의 암화 가능성을 차단시키는 것인, 방법.