KR20200084916A - 다능성 세포를 다시 생성하는 방법 - Google Patents

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찰스 에이. 바칸티
마틴 피. 바칸티
고지 고지마
하루코 오보카타
데루히코 와카야마
요시키 사사이
마사유키 야마토
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브이셀 세라퓨틱스 인코포레이티드
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Abstract

본원에 기재된 기술은 세포가 예를 들어 외부 유전 물질의 도입 없이 더욱 다능성 상태가 되게 하는 것과 관련되는 방법, 분석법, 및 조성물에 관한 것이다.

Description

다능성 세포를 다시 생성하는 방법 {GENERATING PLURIPOTENT CELLS DE NOVO}
관련 출원의 상호-참조
본 출원은 2012년 4월 24일에 출원된 미국 가출원 제61/637,631호 및 2013년 3월 13일에 출원된 제61/779,533호의 35 U.S. C. § 119(e) 하의 이익을 주장하며, 그것의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참조로 포함된다.
기술 분야
본원에 기재된 기술은 다능성 세포의 생성에 관한 것이다.
다능성 세포를 얻기 위한 현재의 방법은 주로 가용성(availability)이 제한된 조직 (예를 들어, 배조직 또는 제대혈) 또는 리프로그래밍 인자(reprogramming factor)의 첨가에 의존하고 (Hanna, J. et al. Cell 2008 133, 250-264; Hockemeyer, D. et al. Cell stem cell 2008 3, 346-353; Kim, D. et al. Cell stem cell 2009 4, 472-476; Kim, J. B. Nature 2009 461, 649-643; Okabe, M. et al. Blood 2009 114, 1764-1767), 이는 외인성 핵산(exogenous nucleic acid)의 도입과 관련된다. 외인성 리프로그래밍 인자의 첨가에 의해 도입된 합병증 없이, 줄기 세포, 특히 자가 줄기 세포를 용이하게 생성하는 방법은 세포 분화에 대한 연구 및 줄기-세포에 기초한 치료의 발달을 가속화할 것이다. 자극물, 예컨대 화상, 화학적 손상, 외상 및 방사선에 대한 노출의 결과로서의 세포의 손상은 정상 체세포를 암세포로 바꿀 수 있다고 가정되나, 건강한 성체 체세포는 리프로그래밍 인자의 특정 조작 없이 다른 상태로 전환된다는 직접적인 증거는 없다.
이전에, 연구자들은 성체 조직에서의 "성체 줄기 세포" 발견을 보고한 바 있다 (Reynolds, B. A. & Weiss, S. Science 1992 255, 1707-1710; Megeney, L. A. et al. ,Genes & development 1996 10, 1173-1183; Caplan, A. I. Journal of orthopaedic research 1991 9, 641-650; Lavker, R. M. & Sun, T. T. The Journal of investigative dermatology 1983 81, 121s-127s). 이러한 보고는 논란이 되고 있다. 예를 들어, 줄기 세포 마커 Oct4를 발현하는 세포를 찾는 연구자들은 정상적인 항상성을 갖는 성체 골수에서 Oct4-발현 세포를 발견하는데 실패하였고 (Lengner, C. J. et al. Cell Cycle 2008 7, 725-728; Berg, J. S. & Goodell, M. A. Cell stem cell 2007 1, 359-360), 한편 다른 연구자들은 상이한 성체 조직들로부터의 Oct4-발현 세포를 분리하는 능력을 보고하고 있다 (Jiang, Y. et al. Nature 2010 418, 41-49; D'Ippolito, G. et al. Journal of cell science 2004 117, 2971-2981; Johnson, J. et al. Cell 2005 122, 303-315; Kucia, M. et al. Leukemia 2006 20, 857-869; Kuroda, Y. et al. PNAS 2011 107, 8639-8643; Obokata, H. et al. Tissue engineering. 2011 Part A 17, 607-615; Rahnemai-Azar, A. et al. Cytotherapy 2011 13, 179-192; Huang, Y. et al. Transplantation 2010 89, 677-685; Zuba-Surma, E. K. et al. Journal of cellular and molecular medicine 2011 15, 1319-1328; Paczkowska, E. et al. Annals of transplantation 2011 16, 59-71). 이러한 세포는 성체 줄기 세포의 개체군(population)을 나타내거나 단순히 사용된 기술에 의해 야기된 인공산물(artifact)이라고 가정되고 있다. 어느 경우든, 이는 드문 것으로 남아 있고 연구 및 치료적 목적을 위한 다능성 세포의 적합한 공급원을 나타내지 않는다.
요약
예를 들어, 분화된 또는 성체 세포로부터 다능성 세포를 다시 생성하거나 제조하는 방법이 본원에 기술되어 있다. 본원에 기술된 상기 방법은 또한 세포의 다능성을 증가시키는 것 (또는, 예를 들어 세포의 성숙을 감소시키는 것), 예를 들어 다분화능 세포(multipotent cell)가 다능성(pluripotent)이 되게 하는 것과 관련될 수 있다. 다능성 세포의 생산과 관련되는 본원에 기재된 기술의 양태(aspect)는 환경 스트레스가 세포를 더욱 다능성 표현형을 띠게 유도할 수 있다는 발명자의 인식에 기초한다.
하나의 양태에 있어서, 세포에 스트레스를 가하는 단계를 포함하는, 다능성 세포를 생성하는 방법이 본원에 기술된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 조직의 일부로서 존재하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 세포로부터 약 40% 이상의 세포질을 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 세포로부터 약 40% 이상의 미토콘드리아를 제거하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 스트레스에 노출된 세포들 중 10% 이상의 세포막을 파괴하기에 충분한 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 체세포, 줄기 세포, 전구 세포(progenitor cell) 또는 배아 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 분리된 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 세포의 이종 개체군에 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 세포의 동종 개체군에 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계는 Oct4 또는 Nanog를 발현하는 세포, 또는 Oct4 및 Nanog를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계는 부착되지 않은 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 약 50% 이상의 세포질이 세포로부터 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 약 60% 이상의 세포질이 세포로부터 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 60-80%의 세포질이 세포로부터 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 약 80% 이상의 세포질이 세포로부터 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 약 90% 이상의 세포질이 세포로부터 제거된다.
일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 환경 자극에 대한 세포의 노출을 포함한다: 외상, 기계적 자극, 화학적 노출, 초음파 자극, 산소-부족, 방사선, 및 극한 온도에의 노출. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 약 4.5 내지 약 6.0의 pH에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 약 5.4 내지 약 5.8의 pH에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 일 이하로 노출된다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 시간 이하로 노출된다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 30 분간 노출된다.
일부 실시형태에 있어서, 극한 온도에의 노출은 세포를 35 ℃ 미만 또는 42 ℃ 초과 온도에 노출하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 극한 온도에의 노출은 어는점 이하의 온도에 세포를 노출시키는 것 또는 약 85 ℃ 이상의 온도에 세포를 노출시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 기계적 자극은 세포의 크기보다 작은 구멍을 갖는 하나 이상의 장치에 세포를 통과시키는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 기계적 자극은 점차적으로 더 작은 구멍을 갖는 다수의 장치에 세포를 통과시키는 것을 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 세포질의 일부의 제거는 세포질로부터 약 50% 이상의 미토콘드리아를 제거한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포질 또는 미토콘드리아의 제거는 세포질로부터 약 50%-90%의 미토콘드리아를 제거한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포질 또는 미토콘드리아의 제거는 세포질로부터 90% 초과의 미토콘드리아를 제거한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 다능성 세포의 증식을 가능하게 하기 위해 상기 다능성 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포는 Oct4 및 Nanog로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 다능성 줄기 세포 마커를 발현한다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 성체 세포 또는 신생아 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 생체외에서 상기 다능성 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포의 후성유전적 상태는 배아 줄기 세포의 후성유전적 상태와 보다 근사하도록 변경된다. 일부 실시형태에 있어서, 후성유전적 상태는 메틸화 패턴을 포함한다.
하나의 양태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 다능성 세포를 후보 물질과 접촉하는 단계를 포함하는 분석법(assay)이 본원에 기술된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 분석법은 다능성 세포의 생존력, 분화, 증식 중 하나 이상에 영향을 주는 물질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 대상체에 대한 세포 치료의 방법에서의 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 다능성 세포의 용도가 본원에 기술된다.
하나의 양태에 있어서, 대상체로부터 얻은 세포로부터 본원에 기술된 방법에 따라 다능성 세포를 생성하는 단계, 및 상기 다능성 세포 또는 그 분화된 자손(progeny)를 포함하는 조성물을 상기 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 세포 치료를 필요로 하는 대상체에서의 자가 세포 치료(autologous cell therapy)의 방법이 본원에 기술된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 방법은 상기 대상체에 상기 조성물을 투여하기 전에 미리 정해진 세포 계통에 따라 상기 다능성 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 다능성 세포를 포함하는 조성물이 본원에 기술되어 있고, 상기 다능성 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 세포로부터 생성된다.
하나의 양태에 있어서, 다능성 세포의 자기재생력(self-renewal ability)을 증가시키는 방법이 본원에 기술되어 있고, 상기 방법은 부신피질자극 호르몬 (ACTH) 또는 3i 배지(medium)의 존재 하에 상기 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 ACTH를 포함하는 LIF 배지에서 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, ACTH는 약 0.1 μΜ 내지 약 100 μΜ의 농도로 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 본원에 기술된 방법에 의해 생성된 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 전능성 세포(totipotent cell)이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 3 일 이상 동안 ACTH 또는 3i 배지의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 5 일 이상 동안 ACTH 또는 3i 배지의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 7 일 이상 동안 ACTH 또는 3i 배지의 존재 하에 배양된다. 일부 실시형태에 있어서, 배양 단계 이후, 상기 세포는 Oct3/4; Nanog; Rexl; Klf4; Sox2; Klf2; Esrr-beta; Tbx3; 및 Klf5로 이루어지는 군에서 선택되는 검출 가능한 수준의 줄기 세포 마커를 발현한다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 세포는 생체내에 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에서 사용되는 세포는 생체외에 있다.
도 1A-1D는 CD45 양성 체세포로부터의 Oct4 발현 세포 생성을 도시한다. 도 1A는 스트레스 처리된 세포의 Oct4-GFP 발현을 도시한다. 스트레스-처리된 세포는 Oct4-GFP을 발현하고, 한편 비처리된 대조군은 그렇지 아니하였다. Oct4-발현 군체(colony)의 확대도는 스트레스-처리된 군에서 오른쪽 상부에 나타내었다. 스케일 바는 100 ㎛를 나타낸다. 도 1B는 스트레스-처리된 세포 및 비-스트레스 처리된 대조군의 개체군 분석을 도시한다. GFP 발현 세포 개체군은 5 일째의 스트레스 처리된 군에서만 관찰된다. 도 1C는 스트레스 처리 전과 처리 후7 일째의 CD 45 양성 세포의 세포-크기 분석을 도시한다. 도 1D는 스트레스 처리 후 CD45 양성 세포의 경시 변화를 도시한다.
도 2A-2B는 동물 칼루스 세포 (ACC)의 특성을 도시한다. 도 2A는 다능성 마커 유전자의 시기적 유전자 발현 변화를 도시한다. 전령 RNA 수준은 GAPDH에 대하여 표준화하였다 (n=3, 평균+표준편차). 도 2B는 Oct4 및 Nanog 프로모터 유전자의 메틸화 분석을 도시한다.
도 3A-3D는 스트레스 처리 후 세포 변형을 도시한다. 도 3A는 ACC 생성 단계 동안 스트레스 방어 유전자의 상대적 유전자 발현을 도시한다. 샘플은 3 일 및 7 일째 수집되었고 CD45 양성 세포와 비교하였다. (n=3, 평균+표준편차) 도 3B는 총 세포 ATP 측정값을 도시한다. (n=3, 평균+표준편차) 도 3C는 ROS 측정값을 도시한다. 에러 바는 표준편차를 나타낸다. 도 3D는 mtDNA 복제 인자의 상대적 유전자 발현을 도시한다. (n=3, 평균+표준편차)
도 4A-4B는 ACC로부터의 키메라 마우스 생성을 도시한다. 도 4A는 키메라 마우스 생성의 개략도를 도시한다. 패널 (i)는 AC가 트립신으로 단일 세포로 분리되었고 또는 패널 (ii) AC가 작은 조작으로 절단된 후 배반포로 주입되었음을 입증하고 있다. 도 4B는 키메라 기여도 분석을 도시한다. 9 마리의 새끼로부터의 조직을 FACS에 의해 분석하였다.
도 5A-5C ACC-생성 조건으로의 실험. 도 5A는 CD45 양성 세포가 다양한 스트레스에 노출되고 Oct4-GFP 발현이 FACS에 의해 분석된 것을 나타낸다. 스트레스 처리 후 생존된 세포에서의 Oct4-GFP 발현 세포의 백분율. (n=3, 평균+표준편차) 도 5B는 pH 조건의 측정값을 도시한다. CD45 양성 세포를 상이한 pH 용액에 노출시켰다. 스트레스 처리 후 3 일째, Oct4-GFP 발현을 FACS에 의해 분석하였다. 도 5C는 배양 조건의 측정값을 도시한다. 스트레스 처리된 세포를 다양한 배지에서 배양하였다. GFP-발현 AC의 수를 14 일째 계수하였다. (n=3, 평균+표준편차)
도 6A-6B는 ICR 마우스로부터 유래된 CD45 양성 세포로부터의 ACC 생성을 도시한다. 도 6A는 스트레스 처리 후 CD45 양성 세포의 경시 변화를 도시한다. E-cadherin 및 SSEA-1의 발현을 FACS에 의해 분석하였다. 도 6B는 E-Cadherin/SSEA1 이중 양성 세포의 Oct4 유전자 발현이 RT-PCR에 의해 확인되었음을 입증한다. (n=3, 평균+표준편차)
도 7A-7B는 GOF 마우스로부터 유래된 다양한 조직으로부터의 ACC 생성을 도시한다. 도 7A는 스트레스 처리 후 Oct4-GFP 발현 세포의 비율을 도시한다. 체세포를 다양한 조직으로부터 분리하였고 다양한 스트레스에 노출시켰다. Oct4-GFP 발현을 FACS에 의해 분석하였다. 도 7B는 다양한 조직으로부터 유래된 ACC의 배아 유전자 발현을 도시한다. 유전자 발현은 GAPDH에 대하여 표준화하였다. (n=3, 평균+표준편차)
도 8은 첫 7 일간 스트레스 방어 유전자의 상대적 유전자 발현을 도시한다. 스트레스 처리 후, 세포를 1, 3 및 7 일째에 수집하였고 유전자 발현을 정상 CD45 양성 세포와 비교하였다. 청색 그래프는 열충격 단백질의 유전자 발현을 나타낸다. 녹색 그래프는 DNA 복구 유전자 발현을 나타낸다. 적색 그래프는 산화환원 유전자(redox gene)의 유전자 발현을 나타낸다. Y-축은 발현의 상대적 배수를 나타낸다.
도 9는 ACC의 분화를 도시한다. 그래프는 키메라 기여도 분석을 도시한다. 다양한 체세포로부터 유래된 ACC로 생성된 키메라 태아를 FACS에 의해 분석하였다. 그래프를 E13.5 내지 15.5에서 5 개의 키메라 태아의 평균을 나타내고 있다.
도 10은 간엽-상피 전이(Mesenchymal-Epithelial Transition) (MET)를 통해 스트레스 처리가 체세포에 대해 리프로그래밍을 야기하는 것을 입증하고 있다. MET-관련 유전자의 발현은 정상 세포에서, 그리고 스트레스 처리의 시작 후 3 및 7 일째 세포에서 나타났다. y-축은, 그 유전자에 대한 발현 수준에 의한, 샘플 내의 수준에 대하여 표준화한, % 발현을 나타내고 있다.
도 11은 스트레스 전과 후의 세포 개체군의 FACS 분석을 도시한다. GFP 발현이 명백하였고, 이는 각각의 시험된 조직 유형으로부터 스트레스 처리 후의 세포 개체군에서 다능성 세포의 생성을 나타낸다.
본원에 기재된 기술의 양태는 세포로부터 다능성 세포의 제조 또는 생성과 관련된다. 본원에 기재된 기술의 양태는, 스트레스가, 세포로 외인성 유전자, 전사물, 단백질, 핵 성분 또는 세포질을 도입할 필요 없이, 또는 세포 융합의 필요 없이, 세포로부터 다능성 줄기 세포의 제조를 유도할 수 있다는 발명자의 발견에 기초한다. 일부 실시양태에 있어서, 스트레스는 세포에서의 세포질 및/또는 미토콘드리아의 양에 있어서의 감소를 유도하고; 이는 탈분화 과정을 야기하고 다능성 세포를 초래한다. 일부 실시양태에 있어서, 스트레스는 예를 들어, 스트레스에 노출된 세포들 중 10% 이상에서 세포막의 파괴를 야기한다. 이러한 다능성 세포는 (생체외 및/또는 생체내에서) 각각의 3 개의 배엽(three germ layers)으로 분화하는 능력, 생체내에서의 테라토마-유사 세포 매스의 생성, 및 생존가능한 배아 및/또는 키메라 마우스를 생성시키는 능력 중 하나 이상을 특징으로 한다.
이에 제한되지 않지만, 세포에서의 세포질 및/또는 미토콘드리아의 양을 감소시키는 스트레스를 포함하는, 특정 환경 스트레스에 의한 세포의 처리는, 미토콘드리아 활성을 감소시키고, 탈분화와 관련된 게놈의 영역을 탈메틸화시키고, 세포가 알려진 탈분화 경로의 마커를 나타내도록 야기할 수 있다는 것을 입증하는 실험이 본원에 기술되어 있다. 따라서, 일부 실시형태에 있어서, 세포로부터 다능성 세포를 생성하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 세포로부터의 약 40% 이상의 세포질 및/또는 미토콘드리아를 감소시키는 단계, 및 다능성 또는 다능성 마커를 나타내는 세포를 선택하는 단계를 포함하고, 상기 세포는 조직에 존재하지 않는다. 또한 세포로부터 다능성 세포를 생성할 수 있는 다른 스트레스 처리가 본원에 기술되어 있다.
편의를 위해, 상세한 설명, 실시예 및 첨부된 특허청구범위에서 본원에서 이용되는 특정 용어를 여기에 모아둔다. 달리 언급되거나, 문맥으로부터 시사되지 않는 한, 하기 용어 및 문구는 하기 제공되는 의미를 포함한다. 명백하게 달리 언급되거나, 문맥으로부터 명확하지 않는 한, 아래의 용어 및 문구는 상기 용어 또는 문구가 그것이 속한 기술분야에서 얻은 의미를 제외하지 않는다. 상기 정의는 특정 실시형태를 기술하는데 보조하기 위해 제공되고, 본 발명의 범위는 특허청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 이는 청구된 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술자 중 일인에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본원에서 사용되는 용어 "포함함" 또는 "포함하다"는, 방법 또는 조성물에 필수적이나, 필수적이든 그렇지 않든 불특정 요소의 개입의 여지가 있는 조성물, 방법, 및 그것의 각각의 구성요소(들)과 관련하여 사용된다.
본원에서 사용되는 용어 "필수적으로 이루어진"은 특정 실시형태에 대해 요구되는 이 요소들을 지칭한다. 상기 용어는 이 실시형태의 기본적이고 신규하거나 기능적인 특징(들)에 실질적으로 영향을 주지 않는 요소의 존재를 허용한다.
용어 "이루어진"은 실시형태의 설명에 인용되지 않은 임의의 요소를 제외하는, 본원에 기술된 조성물, 방법, 및 그것의 각각의 구성요소를 지칭한다.
본 명세서의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태("a", "an" 및 "the")는 문맥이 분명하게 다르게 지시하지 않는 한 복수 어구를 포함한다. 따라서 예를 들어, "방법"에 대한 참조는 본원에 기술되고/되거나 본 개시물 등을 읽는 경우 통상의 기술자에게 자명할 것인 하나 이상의 방법들, 및/또는 이 유형의 단계들을 포함한다. 마찬가지로, 단어 "또는"은 문맥이 분명하게 다르게 표시하지 않는 한 "및"을 포함하는 것으로 의도된다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 개시물의 실시 또는 시험에 사용될 수 있음에도 불구하고, 적합한 방법 및 물질은 후에 기술된다. 약어 "예(e.g.)"는 라틴어 exempli gratia로부터 유래된 것이고, 비제한적인 예를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 약어 "예(e.g.)"는 용어 "예를 들어"와 동의어이다.
세포 생물학 및 분자 생물학에서의 일반 용어의 정의는 문헌 ["The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), and The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]에서 찾을 수 있다. 분자 생물학에서의 일반 용어의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10:0763766321); Kendrew et al. (eds.), , Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Intersciences, Coligan et al., eds]에서 찾을 수 있다.
달리 언급되지 않는 한, 본 발명은 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001); Davis et al, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995); Current Protocols in Cell Biology (CPCB) (Juan S. Bonifacino et. al. ed., John Wiley and Sons, Inc.), and Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique by R. Ian Freshney, Publisher: Wiley-Liss; 5th edition (2005), Animal Cell Culture Methods (Methods in Cell Biology, Vol. 57, Jennie P. Mather and David Barnes editors, Academic Press, 1st edition, 1998)]에 기술된 표준 과정을 사용하여 수행되었고, 이는 본원에서 그 전문이 참조로 모두 포함된다.
용어 "줄어들다", "감소하다", "감소된", 및 "감소"는 모두 참조와 관련하여 통계적으로 유의미한 양으로의 감소를 의미하도록 본원에서 사용된다. 그러나, 불확실성을 피하기 위해, "감소하다", "감소", 또는 "줄어들다"는 통상적으로 특정 처리의 부재와 비교하여 10% 이상까지의 감소를 의미하고, 예를 들어 특정 처리의 부재와 비교하여 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 소정 독립체(entity) 또는 파라미터의 완전한 부재를 포함하는 것까지의 감소, 또는 소정 처리의 부재와 비교하여 10-99% 사이의 임의의 감소를 포함할 수 있다.
용어 "증가된", "증가하다, 또는 "높이다"는 모두 일반적으로 통계학적으로 유의미한 양까지의 증가를 의미하기 위해 사용되고; 임의의 불확실성을 피하기 위해, 용어 "증가된", "증가하다", 또는 "높이다"는 참조 수준과 비교하여 약 10% 이상의 증가, 예를 들어 참조 수준과 비교하여 약 20% 이상, 또는 약 30% 이상, 또는 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상, 또는 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상, 또는 약 80% 이상, 또는 약 90% 이상, 100% 증가를 포함하는 것까지의 증가 또는 10-100% 사이의 임의의 증가, 또는 참조 수준과 비교하여 약 2배 이상, 또는 약 3배 이상, 또는 약 4배 이상, 또는 약 5배 이상, 또는 약 10배 이상 증가, 또는 2배 내지 10배 사이의 임의의 증가 또는 그 이상을 의미한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 용어 질환(disease), 장애(disorder) 또는 의학적 상태(medical condition)와 관련하여 사용되는 경우의 "치료하다", "치료", "치료함", 또는 "개선"은 상태에 대한 치료적 처리를 지칭하고, 그 목적은 증상 또는 상태의 진전 또는 심각성을 반전, 완화, 개선, 억제, 지연 또는 중단하는 것이다. 용어 "치료함"은 상태의 하나 이상의 역효과 또는 증상을 감소시키거나 완화시키는 것을 포함한다. 치료는 일반적으로 하나 이상의 증상 또는 임상적 마커가 감소되는 경우 "유효하다". 대안적으로, 치료는 상태의 진전이 감소되거나 중단되는 경우 "유효하다". 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라 치료의 부재시 예상될 수 있는 증상의 진전 또는 악화의 중지 또는 적어도 늦춤을 포함한다. 유익하거나 바람직한 임상적 결과는, 이에 제한되지 않지만, 하나 이상의 증상(들)의 완화, 상기 장애의 정도의 감소, 건강의 안정된 (즉, 악화되지 않은) 상태, 질환 진전의 지연 또는 늦춤, 및 증상의 개선 또는 경감을 포함한다. 치료는 또한 사망이 통계적으로 예상되는 경우를 넘어 생존한 대상체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여함"은 원하는 위치에서의 세포의 적어도 부분적인 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의해 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 다능성 세포 및/또는 이러한 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 대상체로의 배치를 지칭한다. 본원에 기술된 방법에 따라 제조된 다능성 세포 및/또는 이러한 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 포함하는 약학적 조성물은 대상체에서 유효한 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로에 의해 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 "대상체(subject)"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 동물 또는 사냥감 동물과 같은 척추동물이다. 영장류는, 예를 들어 침팬지, 시노몰로구스 원숭이, 거미 원숭이, 및 마카크, 예를 들어 붉은털원숭이를 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 우드척, 페럿, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 가축 및 사냥감 동물은 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양잇과 종, 예를 들어 집고양이, 개과 종, 예를 들어 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 환자 또는 대상체는 상기의 것, 예를 들어 상기 모든 것의 임의의 하위그룹을 포함한다. 특정 실시형태에 있어서, 상기 대상체는 포유동물, 예를 들어 영장류, 예를 들어, 인간이다.
바람직하게는, 대상체는 포유동물이다. 포유동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말, 또는 소일 수 있으나, 이러한 예에 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유동물은 유리하게는 소정 세포 또는 조직의 결함, 기능불량, 및/또는 부전 또는 줄기 세포 분획의 결함, 기능불량, 또는 부전과 관련된 질환의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 사용될 수 있다. 또한, 본원에 기술된 방법은 가축 동물 및/또는 애완동물을 치료하는데 사용될 수 있다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 세포 유형, 조직, 또는 줄기 세포 분획의 결함, 기능불량, 및/또는 부전 또는 이러한 상태와 관련된 하나 이상의 질환 또는 상태를 앓고 있거나, 가진 것으로 전에 진단되거나 확인된 자일 수 있고, 경우에 따라, 이러한 상태에 대한 치료를 이미 받은 자일 수도 있지만 그것이 필수적인 것은 아니다. 대상체는 또한 세포 유형, 조직, 또는 줄기 세포 구획(compartment)의 결함(deficiency), 기능불량(malfunction), 및/또는 부전(failure)을 포함하는 상태를 앓고 있는 것으로 진단되거나 확인되었으나, 이러한 상태에 대한 하나 이상의 치료를 받은 결과로서 알려진 위험 요소에 있어서 개선을 나타내는 자일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 또한 이러한 상태를 갖는 것으로 이전에 진단되지 않은 자일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 이러한 상태에 대한 하나 이상의 위험 요소를 나타내는 자 또는 이러한 상태에 대한 위험 요소를 나타내지 않는 대상체일 수 있다.
본원에서 사용되는, 세포 또는 세포의 개체군에 대해 사용되는 용어 "선택하다"는 원하는 특징을 갖는 하나 이상의 세포를 고르고, 분리하고, 분별하고, 및/또는 선택적으로 증식시키는 것을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "선택하다"는, 원하는 특징을 가지지 않는 세포는 제공된 조건에서 증식할 수 없음을 반드시 의미하는 것은 아니다.
본원에서 사용되는, "유지하다(maintain)"는 세포 또는 세포의 개체군의 생존력을 지속시키는 것을 지칭한다. 유지된 개체군은 다수의 대사적으로 활성인 세포를 가질 수 있다. 이러한 세포의 수는 1 일 이상의 기간에 걸쳐 대략 안정적일 수 있거나 성장할 수 있다.
본원에서 사용되는 "검출 가능한 수준"은 물질 또는 활성의 양이 참조 수준, 예를 들어 스트레스에 노출되지 않은 세포에서의 물질 또는 활성의 수준으로부터 구분될 수 있는 샘플에서의 물질 또는 활성의 수준을 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 검출 가능한 수준은 참조 수준 보다 10% 이상, 예를 들어 10% 이상, 20% 이상, 50% 이상, 100% 이상, 200% 이상, 또는 300% 이상 큰 수준일 수 있다.
용어 "통계적으로 유의미한" 또는 "유의미한"은 통계적 유의도를 지칭하고, 일반적으로 참조, 예를 들어 마커, 예를 들어 줄기 세포 마커 또는 분화 마커의 농도 또는 존재비보다, 2표준 편차(2SD) 차이만큼 초과 또는 미만을 의미한다. 상기 용어는 차이가 있다는 통계적 증거를 가리킨다. 이는 귀무가설(null hypothesis)이 실제로 사실인 때 귀무가설을 거부하는 결정을 내릴 가능성으로서 정의된다. 상기 결정은 대개 p-값(p-value)을 사용하여 이루어진다.
작동 실시예, 또는 다르게 나타내는 경우 이외, 본원에서 사용되는 성분의 양 또는 반응 조건을 표현하는 모든 숫자는 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 수식되는 것으로 이해되어야 한다. 백분율과 관련하여 사용되는 경우에서 용어 "약"은 ±1%를 의미할 수 있다.
다른 용어는 본원에 기재된 기술의 다양한 양태의 설명 내에서 본원에 정의된다.
본원에 기재된 기술의 양태는 세포로부터 다능성 세포의 생성 방법뿐만 아니라 이 다능성 세포의 용도 및 사용 방법과 관련된다. 예를 들어 하나 이상의 리프로그래밍 인자 (예를 들어 Oct4)를 암호화하는 핵산 구조체(construct)를 도입함으로서 리프로그래밍 인자의 발현을 증가시키는 것에 의존하는 다능성 세포 (즉, 유도 다능성 줄기 세포 또는 iPS 세포)의 현존하는 생성 방법과 대조적으로, 본원에 기술된 방법은 세포에 스트레스는 가하지만 외래의(foreign) 리프로그래밍 인자의 도입을 필요로 하지 않는다.
일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 세포의 세포질의 부피 및/또는 세포의 미토콘드리아의 수를 감소시킨다. 세포의 세포질의 부피 또는 세포의 미토콘드리아의 수의 감소는 세포가 적어도 다능성 능력을 얻는 동안 스트레스 반응을 유도한다. 하나의 양태에 있어서, 세포로부터 약 40% 이상의 세포질을 제거하는 단계, 및 다능성을 나타내는 세포 (상기 세포는 조직에 존재하지 않음)를 선택하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 생성 방법이 본원에 기술되어 있다. 하나의 양태에 있어서, 본원에 기술된 발명은 세포로부터 약 40% 이상의 미토콘드리아를 제거하는 단계, 및 다능성을 나타내는 세포 (상기 세포는 조직에 존재하지 않음)를 선택하는 단계를 포함하는 다능성 세포의 생성 방법에 관한 것이다.
본원에 기술된 방법, 분석법, 및 조성물에 사용되는 세포는 임의의 유형의 세포, 예를 들어 성체 세포, 배아 세포, 분화 세포, 줄기 세포, 전구 세포, 및/또는 체세포일 수 있다. 세포는 상기 기술된 용어들의 조합으로 기술될 수 있고, 예를 들어 세포는 배아 줄기 세포 또는 분화된 체세포일 수 있다. 본원에 기술된 방법, 분석법, 및 조성물에 사용되는 세포는 대상체로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 성체 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 신생아 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 태아의 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 양막 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포는 제대혈 세포이다.
"성체"는 출생 후 임의의 시점에서 동물 대상체로부터 유래되는 또는 그 대상체 내부의 조직 및 세포를 지칭한다. "배아"는 출생 전 임의의 시점에서 동물 대상체로부터 유래되는 또는 그 대상체 내부의 조직 및 세포를 지칭한다.
본원에서 사용되는, 용어 "체세포"는 생식 세포, 착상전 배아에 존재하거나 이로부터 얻은 세포, 또는 생체외에서의 이러한 세포의 증식으로부터 유래된 세포 가 아닌 임의의 세포를 지칭한다. 다른 방식으로 언급하자면, 체세포는 생식 세포와 반대되는 생물체의 신체를 형성하는 임의의 세포를 지칭한다. 포유동물에서, 생식 세포 (또한 "생식세포(gametes)"로 알려짐)는 그로부터 전체 포유동물 배아가 발달되는, 접합자(zygote)로 지칭되는 세포를 생성하기 위해 수정 과정에서 융합하는 정자 및 난자이다. 포유동물 신체에서의 모든 다른 세포 유형 - 정자 및 난자, 그들이 만들어지는 세포(생식모세포) 및 미분화된 줄기 세포 외 - 은 체세포이다: 내부 기관, 피부, 뼈, 혈액, 및 결합 조직은 모두 체세포로 구성된다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 "비-배아 체세포"이고, 이는 배아에 존재하거나 이로부터 얻지 않고 생체외에서의 이러한 세포의 증식으로부터 유래되지 않은 체세포를 의미한다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 "성체 체세포"이고, 이는 배아 또는 태아가 아닌 생물체 내에 존재하는 세포, 또는 생체외에서 이러한 세포의 증식으로부터 초래된 세포를 의미한다. 성체 및 신생아 또는 배아세포는 구조적 차이, 예를 들어 후성유전적 구조(organization) 예컨대 메틸화 패턴에 의해 구분될 수 있는 것으로 알려져 있다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 포유동물 체세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 인간 체세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 성체 체세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 체세포는 신생아 체세포이다.
본원에서 사용되는, "분화된 세포(differentiated cell)"는 그것의 발달에 있어서 이전 시점에서보다 그것의 운명 또는 기능에 있어서 더욱 특이화된 세포를 지칭하며, 종말(terminally) 분화된 세포 및 종말 분화되지는 않았지만 그것의 발달에 있어서의 이전 시점에서보다 더욱 특이화된 세포 모두를 포함한다. 미수임 세포(uncommitted cell) (예를 들어, 줄기 세포)로부터, 특정 분화된 세포 유형으로의 증가된 구속도(commitment)를 갖는 세포, 및 종말 분화된 세포로의 세포의 발달은, 점진적 분화 또는 점진적 구속으로서 알려져 있다. 세포 발생학(cell ontogeny)의 맥락에서, 형용사 "분화된", 또는 "분화되는"은 상대적인 용어이다. "분화된 세포"는 이와 비교되는 세포보다 더 아래(down)의 발달 경로가 진행되고 있는 세포이다. 따라서, 줄기 세포는 계통-한정된 전구체 세포(lineage-restricted precursor cell) (예컨대 중배엽 줄기 세포)로 분화될 수 있고, 이는 순차적으로 더 아래의 경로의 다른 유형의 전구체 세포 (예컨대 심근세포 전구체)로, 그리고 특정 조직 유형에서 특징적 역할을 하고 추가로 증식될 수 있는 능력을 보유하거나 보유하지 않을 수 있는 최종-단계(end-stage) 분화된 세포로 분화될 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "줄기 세포(stem cell)"는 자기재생(self-renewal)의 특성을 가지고 발달 잠재력과 관련된 특정의 함축된 의미(즉, 전능성(totipotent), 다능성(pluripotent), 다분화성(multipotent) 등)를 갖지 않는, 보다 분화된 세포 유형으로 자연 분화되는 발달 잠재력을 갖는 미분화되거나 부분적으로 분화된 상태의 세포를 지칭한다. 자기재생은 줄기 세포가 증식하여 보다 많은 이러한 줄기 세포를 발생시키는 한편 그 발달 잠재력을 유지할 수 있는 것을 의미한다. 따라서, 용어 "줄기 세포"는 특정 환경 하에서 실질적 분화없이 증식할 수 있는 능력을 보유한, 보다 특이화되거나 분화된 표현형으로 분화되는 특정 환경 하에서의 발달 잠재력을 가진 세포의 임의의 하위그룹을 지칭한다. 용어 "체세포 줄기 세포"는 태아, 유형(juvenile), 및 성체 조직을 포함하는 비-배아 조직으로부터 유래된 임의의 줄기 세포를 지칭하기 위해 사용된다. 정상 체세포 줄기 세포는 혈액, 골수, 뇌, 후각상피, 피부, 췌장, 골격근, 및 심근을 포함하는 매우 다양한 성체 조직으로부터 분리되었다. 예시적인 자연 발생 체세포 줄기 세포는, 이에 제한되지 않지만, 중간엽 줄기 세포 및 조혈모 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 또는 전구 세포는 배아 줄기 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 "배아 줄기 세포"는 임신 과정의 임의의 시점, 통상적으로 필수적이지 않지만 대략 10-12주 임신 이전에 취해진 전(pre)-배아 조직 (예컨대, 예를 들어 배반포(blastocyst)), 배아 조직, 또는 태아 조직을 포함하는, 수정 이후 그러나 임신 종료 전에 형성된 조직으로부터 유래된 줄기 세포를 지칭한다. 가장 빈번하게는, 배아 줄기 세포는 초기 배아 또는 배반포로부터 유래된 전능성 세포이다. 배아 줄기 세포는 이에 제한되지 않지만, 인간 조직을 포함하는 적합한 조직으로부터, 또는 수립된 배아 세포주로부터 직접 얻을 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 배아 줄기 세포는 문헌 [Thomson et al. (U.S. Pat. Nos. 5,843,780 and 6,200,806; Science 282: 1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38: 133 ff, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995, 이는 본원에서 그 전문이 참조로 모두 포함됨)]에 기술된 바에 따라 수득된다.
예시적인 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 다능성 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 간 줄기 세포, 근육 줄기 세포, 근육 전구체 줄기 세포, 내피 전구 세포, 골수 줄기 세포, 연골 줄기 세포, 림프계 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 조혈모 줄기 세포, 중추신경계 줄기 세포, 말초신경계 줄기 세포 등을 포함한다. 이를 분리하고 배양하는 방법을 포함하는 줄기 세포의 설명은 특히 문헌 [Embryonic Stem Cells, Methods and Protocols, Turksen, ed., Humana Press, 2002; Weisman et al, Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 17:387 403; Pittinger et al, Science, 284: 143 47, 1999; Animal Cell Culture, Masters, ed., Oxford University Press, 2000; Jackson et al, PNAS 96(25): 14482 86, 1999; Zuk et al, Tissue Engineering, 7:211 228, 2001 ("Zuk et al."); Atala et al, particularly Chapters 33 41; and U.S. Pat. Nos. 5,559,022, 5,672,346 and 5,827,735]에서 찾을 수 있다. 이들을 분리하는 방법을 포함하는 간질 세포(stromal cell)의 설명은 특히 문헌 [Prockop, Science, 276:71 74, 1997; Theise et al, Hepatology, 31:235 40, 2000; Current Protocols in Cell Biology, Bonifacino et al, eds., John Wiley & Sons, 2000 (including updates through March, 2002); and U.S. Pat. No. 4,963,489]에서 찾을 수 있다.
본원에 사용되는 "전구 세포(progenitor cell)"는 발달 잠재력 (즉, 전능성, 다능성, 다분화능 등)과 관련된 특정 함축된 의미를 가지지 않는, 하나 이상의 분화된 표현형으로 분화되는 발달 잠재력을 갖고, 자기재생의 특성을 가지지 않는 미분화되거나 부분적으로 분화된 상태의 세포를 지칭한다. 따라서, 용어 "전구 세포"는 보다 특이화되거나 분화된 표현형으로 분화되는, 특정 환경 하에서, 발달 잠재력을 갖는 세포의 임의의 하위그룹을 지칭한다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 또는 전구 세포는 다능성 줄기 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 또는 전구 세포는 전능성 줄기 세포이다.
용어 "전능성(totipotent)"은 신체의 임의의 조직 또는 세포 유형을 발생시킬 수 있는 줄기 세포를 지칭한다. "다능성" 줄기 세포는 생식 계열 세포를 제외하고 신체내 세포의 임의의 유형을 발생시킬 수 있다. 더 소수의 또는 제한된 수의 상이한 세포 유형을 발생시킬 수 있는 줄기 세포는 일반적으로 "다분화능(multipotent)"으로 명명된다. 따라서, 전능성 세포는 태아 발달에 필요한 전부는 아니지만 대부분의 조직을 발생시킬 수 있는 다능성 세포로 분화된다. 다능성 세포는 특정 기능을 갖는 세포를 발생시키도록 구속되는 다분화능 세포로 추가 분화가 진행된다. 예를 들어, 다분화능 조혈모 줄기 세포는 혈액에서 적혈구, 백혈구 및 혈소판을 발생시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성(pluripotent)"은 상이한 조건 하에서 모든 세 개의 배엽 (즉, 내배엽(예를 들어 장 조직(gut tissue)), 중배엽 (예를 들어, 혈액, 근육, 및 혈관), 및 외배엽 (예를 들어, 피부 및 신경)) 특징의 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 다능성 세포는 주로 예를 들어 누드마우스 테라토마 형성 분석법을 사용하여 모든 세 개의 배엽으로 분화되는 이들의 능력을 특징으로 한다. 다능성에 대한 바람직한 시험은 각각의 세 개의 배엽의 세포로 분화되는 능력의 실증이지만, 다능성은 배아 줄기 (ES) 세포 마커의 발현에 의해서도 입증될 수 있다.
본원의 실시예에서 기술되는 "ACC" 및 "STAP" 세포는 다능성 세포의 비제한적인 예이다. "STAP 줄기 세포"는 다능성 줄기 세포의 비제한적인 예이다. 용어 다능성 세포 및 용어 다능성 줄기 세포는 본원에서 상호교환적으로 사용될 수 있고, 이는 두 세포는 본 발명의 목적에 적합하게 사용될 수 있기 때문이다.
본원에서 사용되는 용어 "다능성(pluripotency)" 또는 "다능성 상태(pluripotent state)"는 모든 세 개의 배아 배엽으로 분화되는 능력을 갖는 세포를 지칭한다: 내배엽(장 조직), 중배엽(혈액, 근육, 및 혈관을 포함함), 및 외배엽 (예컨대 피부 및 신경).
"다분화능 세포(multipotent cell)"와 관련하여 사용되는 경우의 용어 "다분화능(multipotent)"은 모든 세 개의 배엽으로부터 유래되는 세포의 전부는 아닌 일부로 분화될 수 있는 세포를 지칭한다. 따라서, 다분화능 세포는 부분적으로 분화된 세포이다. 다분화능 세포는 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 다분화능 세포의 비제한적인 예는 성체 줄기 세포, 예컨대 조혈모 줄기 세포 및 신경 줄기 세포를 포함할 수 있다. 다분화능은 줄기 세포가 다른 계통의 세포가 아닌 소정 계통에서의 다수 유형의 세포를 형성할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 다분화능 혈액 줄기 세포는 다수의 상이한 유형의 혈액 세포 (적혈구, 백혈구, 혈소판 등)를 형성할 수 있으나, 이는 뉴런을 형성할 수 없다. 용어 "다분화성(multipotency)"은 전능성 및 다능성보다 더 작은 발달 다양성의 정도를 가진 세포를 지칭한다.
용어 "전능성(totipotency)"은 성체 신체뿐만 아니라 태반을 포함하는 배외 조직(extra-embryonic tissues)에서의 모든 세포를 만들 수 있는 능력을 기술하는 분화 정도를 가진 세포를 지칭한다. 수정란 (접합자)은 초기에 분리된 세포 (난할구)와 같이 전능성이다.
본원에서 기술된 방법에서 사용되는 세포는 조직에 존재하지 않는 세포일 수 있다. 본원에서 사용되는 "조직(tissue)"은 하나 이상의 특정 기능의 수행에 있어서 통합된, 유사하게 특이화된 세포의 구조화된 생체물질 (예를 들어, 군, 층, 또는 응집체)을 지칭한다. 세포가 구조화된 상부구조로부터 제거되고, 또는 그렇지 않으면 생체내 존재하는 구조화된 상부구조로부터 분리되는 경우, 이들은 더이상 조직에 존재하지 않는다. 예를 들어, 혈액 샘플이 2 이상의 비-동일 분획으로 분리되거나, 지라가 잘게 잘라지거나 파스퇴르 피펫(Pasteur pipette)으로 기계적으로 분리되는 경우, 상기 세포는 더이상 조직에 존재하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 조직에 존재하지 않는 세포는 분리된 세포이다. 세포와 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "분리된(isolated)"은 일반적으로 생체내에서 연관되는 다른 그룹의 세포로부터 기계적 또는 물리적으로 분리된 세포를 지칭한다. 다른 그룹의 세포로부터 하나 이상의 세포를 분리하는 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Culture of Animal Cells: a manual of basic techniques (3rd edition), 1994, R. I. Freshney (ed.), Wiley-Liss, Inc.; Cells: a laboratory manual (vol. 1), 1998, D. L. Spector, R. D. Goldman, L. A. Leinwand (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press; Animal Cells: culture and media, 1994, D. C. Darling, S. J. Morgan, John Wiley and Sons, Ltd.]을 참조한다. 임의로, 분리된 세포는 다른 세포의 존재 하에 예를 들어 생체외에서 배양된다.
일부 실시형태에 있어서, 조직에 존재하지 않는 세포는 세포의 개체군에 존재한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 세포의 개체군은 하나의 세포의 개체군이다. 본원에서 사용되는 "세포의 개체군(population of cells)"은 2 이상 세포, 예를 들어, 2 개의 세포, 3 개의 세포, 4 개의 세포, 10 개의 세포, 100 개의 세포, 1000 개의 세포, 10,000 개의 세포, 100,000 개의 세포 또는 이들 사이의 임의의 값, 또는 그 이상의 세포들의 군(group)을 지칭한다. 임의로, 세포의 개체군은 공통 기원을 가진 세포일 수 있고, 예를 들어 이들은 동일 부모 세포로부터의 유래될 수 있고, 이들은 클론일 수 있고, 이들은 동일 조직으로부터 분리된 세포로부터 분리되거나 유래될 수 있고, 또는 이들은 동일한 조직 샘플로부터 분리된 세포로부터 분리되거나 유래될 수 있다. 세포의 개체군은 1 개 이상의 세포 유형, 예를 들어 1 개의 세포 유형, 2 개의 세포 유형, 3 개의 세포 유형, 4 개의 세포 유형 또는 그 이상의 세포 유형을 포함할 수 있다. 세포의 개체군은 이종 또는 동종일 수 있다. 만약 이들이 90% 이상의 동일 세포 유형을 포함하는 경우, 예를 들어 90%, 92%, 95%, 98%, 99%, 또는 그 이상의 세포가 동일 유형인 경우, 세포의 개체군은 실질적으로 동종일 수 있다. 만약 개체군에 존재하는 세포의 90% 미만이 동일 세포 유형인 경우, 세포의 개체군은 이종일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법은 비-다능성 세포 (예를 들어, 분화된 세포)를 다능성 표현형을 띠게 하는 것과 관련될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포의 생성은 더욱 다능성(more pluripotent)의 표현형의 세포를 생성하는 것, 즉 세포가 보다 넓은 분화 잠재력을 가지는 표현형을 띠게 야기하는 것을 포함한다. 비제한적인 예로서, 매우 작은 배아-유사 세포 (very small embryonic-like cell, VSEL) 세포는 다능성 대신 단분화능(unipotent)일 수 있고/있거나 특정 분화된 세포 유형으로 분화되는 이들의 능력에 있어서 제한될 수 있다(아마도 배아 줄기 세포보다는 분화된 세포에 더 근사한 VSEL의 후성유전적 상태에 기인하여). 본원에 기술된 방법에 따라, 단분화능 세포 및/또는 제한된 분화 능력을 가진 세포는 더욱 다능성의 표현형을 띠게 할 수 있다. 더욱 다능성의 표현형은, 더 많은 수의 분화된 세포 유형으로 분화될 수 있는 표현형일 수 있고, 예를 들면, 2 개의 단분화능 세포 중에서 그 계통이 더욱 다능성인 더 많은 수의 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 1 개를 말하고/말하거나 다능성 세포는 단분화능 세포보다 더욱 다능성이다.
본원에 기술된 다능성 세포 (또는 더욱 다능성의 세포)의 생성 방법은 예를 들어, 세포로부터 세포질의 일부를 제거하는 단계 및/또는 세포로부터 미토콘드리아를 제거하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포로부터의 세포질 또는 미토콘드리아의 일부의 제거는 세포의 일부 후성유전적 제어를 제거한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포질의 약 40% 이상이 제거되고, 예를 들어 세포의 세포질의 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 그 이상이 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 세포의 세포질의 60% 내지 80%가 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 미토콘드리아의 약 40% 이상이 제거되고, 예를 들어 세포의 미토콘드리아의 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상 또는 그 이상이 제거된다. 일부 실시형태에 있어서, 세포의 미토콘드리아의 50% 내지 90%가 제거된다.
세포에 스트레스를 가하고/가하거나 세포로부터 세포질 또는 미토콘드리아의 일부를 제거하는 방법은 치사(lethality)의 문턱값(threshold value) 미만으로 세포의 막에 구멍(pore) 및/또는 파열(rupture)을 야기할 수 있는 임의의 환경적 자극일 수 있다. 스트레스는 조직 또는 세포 배양액에서의 비생리적인 스트레스를 포함할 수 있다. 적합한 환경적 자극의 비제한적인 예는 외상, 기계적 자극, 화학적 노출, 초음파 자극, 산소-부족, 영양-부족, 방사선, 극한 온도에의 노출, 분리(dissociation), 분쇄(trituration), 신체적 스트레스, 고삼투압, 저삼투압, 막 손상, 독소, 극한 이온 농도, 활성 산소, UV 노출, 강한 가시광선, 필수 영양분의 부족, 또는 비생리적 산성 환경을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 하나의 환경적 자극이 세포에 가해질 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다수의 환경 자극이 세포에 가해질 수 있고, 예를 들어 2 개의 자극, 3 개의 자극, 4 개의 자극 또는 그 이상의 자극이 가해질 수 있다. 다수의 환경 자극은 동시에 또는 별도로 가해질 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 스트레스는 스트레스에 노출된 세포들 중 10% 이상에서 막 파괴를 야기하는 스트레스일 수 있다. 본원에서 사용되는 "막 파괴(membrane disruption)"는 이에 제한되지 않지만 미토콘드리아 및 DNA를 포함하는, 검출 가능한 양의 세포 기관 및/또는 세포 물질을 세포외 환경으로 방출하기에 충분한 구멍(pore) 또는 간극(gap)을 형성하도록 막을 위태롭게 하고(compromising), 파열하고(rupturing), 또는 파괴하는(disrupting) 것을 지칭한다. 세포 물질, 예를 들어 미토콘드리아의 방출을 검출하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고 본원에 기술되어 있다. 방출된 세포 물질은 유리되어 있거나 막에 의해 캡슐화되거나 둘러싸여 있다.
스트레스는 스트레스에 노출된 세포의 10% 이상, 예를 들어, 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상에서 막 파괴를 야기할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 스트레스에 노출된 세포는 본원에 기술된 더욱 다능성으로 제조된 세포와 동일 유형 및 특징의 세포일 수 있고, 예를 들어 하나의 유형의 세포에 대해 적합한 스트레스가 다른 유형의 세포에는 적합하지 않을 수 있다.
세포가 스트레스에 노출되는 시간의 길이는 사용되는 자극에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 따라 세포에 스트레스를 주기 위해 저영양 조건을 사용하는 경우, 세포는 1 주 이상, 예를 들어 1 주, 2 주, 또는 3 주 또는 그보다 길게 저영양 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 3 주 동안 저영양 조건 하에 배양된다. 다른 비제한적인 예에서, 본원에 기술된 방법에 따라 저 pH 또는 저산소 조건에 노출되는 세포는 수분 또는 수시간 이상을 포함하는 오랫동안, 예를 들어 2분 이상 동안, 5 분 이상 동안, 20 분 이상 동안, 1 시간 이상 동안, 2 시간 이상 동안, 6 시간 이상 동안 또는 그 이상으로 노출될 수 있다.
다능성 세포의 생성을 유도하는 기계적 자극은 막의 온전성을 기계적으로 파괴할 수 있는, 물질 또는 표면과 세포막과의 임의의 형태의 접촉을 포함할 수 있다. 기계적 자극은 전단 응력 및/또는 고압에 세포를 노출시키는 것을 포함할 수 있다. 기계적 자극의 예시적 형태는 분쇄이다. 분쇄는 마찰을 통해 입자의 표면을 갈고/갈거나 연마하는 공정이다. 세포의 분쇄를 위한 공정의 비제한적인 예는 세포를 세포의 크기보다 작은 구멍을 갖는 장치에 통과시키는 것이다. 예를 들어, 세포를 진공 압력 및/또는 유체의 흐름에 의해, 피펫의 내부 공간의 적어도 일부가 세포의 직경보다 작은 직경을 갖는 피펫에 통과시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서는, 세포를 세포의 크기보다 더 작은 구멍을 갖는 하나 이상의 장치에 통과시킨다. 일부 실시형태에 있어서, 세포를 점진적으로 더 작은 구멍을 갖는 다수의 장치에 통과시킨다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 5 분 이상, 예를 들어 5분, 10 분, 20 분, 30 분, 또는 60 분간 분쇄될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 50 ㎛의 내부 직경을 갖는 파스퇴르 피펫을 통과시킴으로써 분쇄될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 20 분간 50 ㎛의 내부 직경을 갖는 파스퇴르 피펫을 통과시킴으로써 분쇄될 수 있다.
다능성 세포를 생성하기 위해 세포를 유도하는데 필요한 스트레스를 가하기 위한 다른 방법은 예를 들어, 특정의 화학적, 또는 물리-화학적 조건 (예를 들어, 높거나 낮은 pH, 삼투압 충격, 극한 온도, 산소 부족 등)에의 노출을 포함한다. 다능성 세포의 생성을 유도하는 이러한 종류 및 다른 것의 처리는 후에 추가로 논의된다. 화학적 노출은 예를 들어, pH, 삼투압, 및/또는 세포막의 완전성을 파괴하거나 위태롭게 하는 기공-형성 화합물의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포는 비생리적인 산성 환경 또는 저 pH, 스트렙톨리신 O, 또는 증류수 (즉, 삼투압 충격)에 노출될 수 있다.
저 pH는 6.8 미만 예를 들어 6.7, 6.5, 6.3, 6.0, 5.8, 5.4, 5.0, 4.5, 4.0 또는 그보다 저 pH를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 3.0 내지 약 6.0이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 4.5 내지 약 6.0이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 5.4 내지 약 5.8이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 5.4 내지 약 5.6이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 5.6이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 5.7이다. 일부 실시형태에 있어서, 저 pH는 약 5.5이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 수일까지 동안, 예를 들어, 6 일 이하 동안, 4 일 이하 동안, 3 일 이하 동안, 2 일 이하 동안, 1 일 이하 동안, 12 시간 이하 동안, 6 시간 이하 동안, 3 시간 이하 동안, 2 시간 이하 동안, 1 시간 이하 동안, 30 분 이하 동안, 20 분 이하 동안, 10 분 미만 동안 저 pH 조건에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 3 일 이하 동안 5.4 내지 5.6 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 3 일 이하 동안 약 5.6 내지 6.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 시간 이하 동안 약 5.6 내지 6.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 30 분간 약 5.6 내지 6.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 20 분간 약 5.6 내지 6.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 3 일 이하 동안 약 5.6 내지 5.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 시간 이하 동안 약 5.6 내지 5.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 30 분간 약 5.6 내지 5.8 사이의 pH에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 20 분간 약 5.6 내지 5.8 사이의 pH에 노출될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포는 다능성 세포의 생성을 유도하기 위해 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 20 μΜ 내지 약 200 mM의 농도로 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 200 μΜ 내지 약 20 mM의 농도로 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 2.4 mM의 농도로 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 HBSS에 희석된 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1분 이상, 예를 들어 1 분 이상, 2 분 이상, 5 분 이상, 15 분 이상, 30 분 이상, 45 분 이상, 1 시간 이상 동안 또는 그보다 더 오랫동안 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 5 분 내지 약 30 분간 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 15 분간 ATP에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 15 분간 약 2.4 mM의 ATP에 노출될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포는 다능성 세포의 생성을 유도하기 위해 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 20 μΜ 내지 약 200 mM의 농도로 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 200 μΜ 내지 약 20 mM의 농도로 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 2 mM의 농도로 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 HBSS에 희석된 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 일 이상, 예를 들어 1 일 이상, 2 일 이상, 1 주 이상, 2 주 이상, 3 주 이상 동안 또는 그보다 더 오랫동안 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 1 주 내지 3 주 동안 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 2 주 동안 CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 2 주 동안 약 2 mM CaCl2에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 1 주 동안 약 2 mM CaCl2에 노출될 수 있다.
기공-형성 화합물의 예는 스트렙톨리신(streptolysin) O (SLO), 사포닌(saponin), 디지토닌(digitonin), 필리핀(filipin), Ae I, 말미잘의 시톨리신(cytolysin), 에어로리신(aerolysin), 아마톡신(amatoxin), 아메바포어(amoebapore), 엔타메바 디스파로부터의 아메바포어 동족체(amoebapore homolog from Entamoeba dispar), 브레비닌-1E(brevinin-lE), 브레비닌-2E(brevinin-2E), 바르바톨리신(barbatoiysin), 엔테로코쿠스 파에칼리스의 시톨리신(cytolysin of Enterococcus faecalis), 델타 헤몰리신(delta hemolysin), 디프테리아독소(diphtheria toxin), 콜레라균의 El Tor 시톨리신, 에퀴나톡신(equinatoxin), 에어로모나스 하이드로필라의 엔테로톡신(enterotoxin of Aeromonas hydrophila), 에스쿨렌틴(esculentin), 그래뉼리신(granulysin), 장염비브리오균의 해몰리신(haemolysin), 스트렙토코쿠스 인테메딘의 인터메딜리신(intermedilysin of Streptococcus intermedins), 렌티바이러스 리틱 펩티드(lentivirus lytic peptide), 악티노바실루스 악티노마이세템코미탄스의 류코톡신(leukotoxin of 　Actinobacillus actinomycetemcomitans), 마가이닌(magainin). 멜리틴(melittin), 막-연관 림포톡신( membrane-associated lymphotoxin), 메트-엔케팔린(Met-enkephalin), 네오쿄토르핀(neokyotorphin), 네오쿄토르핀 절편 1, 네오쿄토르핀 절편 2, 네오쿄토르핀 절편 3, 네오쿄토르핀 절편 4, NK리신(NKlysin), 파라닥신(paradaxin), 황색포도구균의 알파 시톨리신(alpha cytolysin of Staphylococcus aureus), 악성부종균의 알파 시톨리신(alpha cytolysin of　Clostridium septicum), 바실러스 튜링겐시스 톡신(Bacillus thuringiensis toxin), 콜리신(colicin), 보체(complement), 디펜신(defensin), 히스톨리신(histolysin), 리스테리오리신(listeriolysin), 마가이닌(magainin), 멜리틴(melittin), 뉴몰리신(pneumolysin), 이스트 킬러 톡신(yeast killer toxin), 발리노마이신(valinomycin), 피터슨의 크라운 에테르(Peterson's crown ether), 퍼포린(perforin), 퍼플린고리신 O(perfringolysin O), 가스괴저균의 테타-톡신(theta-toxin of　Clostridium perfringens), 팔롤리신(phallolysin), 팔로톡신(phallotoxin), 및 다른 분자, 예컨대 문헌 [Regen et al. Biochem Biophys Res Commun 1989 159:566-571]에 기술된 것을 포함하고, 이는 본원에서 그 전문이 참조로 모두 포함된다. 기공-형성 화합물의 정제 또는 합성 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 또한, 기공-형성 화합물, 예를 들어 스트렙톨리신 O (Cat No. S5265; Sigma-Aldrich; St. Louis, MO)는 시판된다. 비제한적인 예로서, 세포는 약 5 분 이상, 예를 들어 5 분 이상, 10 분 이상, 20 분 이상, 30 분 이상, 45 분 이상, 1 시간 이상, 2 시간 이상, 3 시간 이상, 또는 그 이상 동안 SLO에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 30 분 내지 2 시간 동안 SLO에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 50 분간 SLO에 노출될 수 있다. 비제한적인 예로서, 세포는 약 10 ng/mL 내지 1 mg/mL의 농도로 SLO에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 1 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL의 농도로 SLO에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 10 ㎍/mL로 SLO에 노출될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 50 분간 약 10 ㎍/mL로 SLO에 노출될 수 있다.
다능성 세포의 생성을 유도하는 산소-부족 조건은 감소된 산소 조건 하에 세포를 배양하는 것, 예를 들어 10% 이하의 산소에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 5% 이하의 산소 하에 배양된다. 감소된 산소 조건 하에서의 배양하는 기간은 1 시간 이상, 예를 들어 1 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 주 내지 1 개월 동안 감소된 산소 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 3 주 동안 감소된 산소 조건 하에 배양될 수 있다.
다능성 세포의 생성을 유도하는 영양-부족 조건(nutrient-deprivation condition)은 세포 성장에 유리한 임의의 인자 또는 영양의 결핍을 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 영양-부족 조건은 기초 배지, 예를 들어 추가 보충물, 예컨대 FBS 또는 성장 인자가 없는 F12 또는 DMEM에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 영양-부족 조건에서의 배양 기간은 1 시간 이상, 예를 들어 1 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 1 주 내지 1 개월 동안 영양-부족 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 2 주 동안 영양-부족 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 약 3 주 동안 영양-부족 조건 하에 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 영양-부족 조건은 성장 인자가 없는 조건 또는 소정 세포 유형에 대한 하나 이상의 성장 인자의 표준 농도의 50% 미만의 조건을 포함한다.
다능성 세포의 생성을 유도하는 극한 온도에의 노출은 저온 또는 고온에의 노출을 포함할 수 있다. 포유동물 세포에 대해, 극저온은 35 ℃ 미만, 예를 들어 34 ℃, 33 ℃, 32 ℃, 31 ℃ 또는 그보다 낮은 온도일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 극저온은 어는점 미만의 온도일 수 있다. 세포의 동결은 얼음 결정에 의해 막 천공을 야기하여 세포질 제거를 위한 길을 제공할 수 있다. 포유동물 세포에 대해, 극고온은 42 ℃ 초과, 예를 들어 43 ℃, 44 ℃, 45 ℃, 46 또는 그 이상의 온도일 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 극고온은 약 85 ℃ 이상의 온도일 수 있다. 극한 온도 하에서의 배양 기간은 20 분 이상, 예를 들어 20 분, 30 분, 1 시간, 12 시간, 1 일, 2 일, 1 주, 2 주, 3 주, 1 개월, 2 개월 또는 그 이상일 수 있다. 분명한 것은, 온도가 높을수록, 다능성 세포의 생성을 가능하게 하기 위해 견딜 노출이 더 짧아질 것이다.
본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있는 스트레스의 추가의 예는, 이에 제한되지 않지만, 초음파 자극 및 방사선 처리를 포함한다.
일부 실시형태에 있어서, 스트레스에 노출된 후, 세포는 하기 본원에 기술된 방법에 따라 선택 전에 배양될 수 있다. 세포는 선택 전 1 시간 이상 동안 배양될 수 있고, 예를 들어 스트레스 자극이 제거되고 본원에 기술된 선택 전에 세포가 1 시간 이상, 2 시간 이상, 6 시간 이상, 12 시간 이상, 1 일 이상, 2 일 이상, 7 일 이상 동안 배양된다. 비제한적인 예로서, 세포는 약 50 분간 SLO에 노출되고 이후 선택 전에 약 7 일간 SLO 없는 배지에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 선택 전에 세포를 배양하는데 사용되는 배지는 분화 인자를 함유하거나 분화를 촉진하지 않는다. 일부 실시형태에 있어서, 배지는 줄기 세포 및/또는 다능성 세포의 배양에 적합한 것이다. 이러한 배지의 예는 본원에서 이하에 기술되어 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포에서의 세포질의 양이 감소된다. 세포에서의 세포질의 감소는 세포의 크기를 모니터링함으로서 측정될 수 있다. 세포 크기를 측정하는 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있고 비제한적인 예로서 세포형광측정 분석법(cytofluorimetric analysis)을 포함한다. 간단하게는, 단일 세포는 프로피디움 요오드화물로 착색되고 여과된 후 예를 들어 FLOMAX™ 소프트웨어를 사용하는 DAKO GALAXY™ (DAKO) 분석기에서 측정된다. 세포형광측정 분석법이 이후 세포 크기를 규명하기 위해 수행될 수 있다. 미리 정해진 크기의 마이크로비드를 등장 인산 식염수(isotonic phosphate saline) (pH 7.2)에 재-현탁시키고 세포형광측정 분석을 사용하여 구체에 함유된 세포의 크기를 비교하기 위한 표준으로서 사용한다. 세포 및 비드 모두는 동일한 장비 세팅 (세포 및 비드 크기를 나타내는 전방 스캐터(forward scatter) 및 세포 입도(cellular granularity)를 나타내는 측면 스캐터(side scatter))을 사용하여 분석된다. 세포 크기를 비드 크기를 x-축으로 하고 전방 스캐터 값을 y-축으로 하는 커브에서 계산할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 세포에서의 미토콘드리아의 양이 감소된다. 세포에서의 미토콘드리아의 수의 측정 방법은 본 기술 분야에서의 통상의 기술자 중 일인에게 잘 알려져 있고, 미토콘드리아-특이적 염료로 착색하는 단계 및 현미경으로 관찰시 세포 당 가시되는 미토콘드리아의 수를 계수하는 단계를 포함한다. 미토콘드리아-특이적 염료, 예를 들어 MITOTRACKER™ (Cat No M7512 Invitrogen; Grand Island, NY)는 시판된다. 일부 실시형태에 있어서, 미토콘드리아의 수 또는 미토콘드리아-특이적 염료로부터의 신호의 강도는 본원에 기술된 방법으로 처리 후 40% 이상까지 감소될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 본원에서 상기 기술된 방법으로 처리 후 미토콘드리아의 수 또는 미토콘드리아-특이적 염료로부터의 신호의 강도가 40% 이상까지 감소되는 세포를 선택한다.
미토콘드리아의 양 및/또는 막 파괴는 또한 세포외 환경에서의 산화환원 활성을 측정함으로서 검출될 수 있다. 미토콘드리아가 본원에 기술된 스트레스에 의해 세포외 환경으로 방출됨에 따라, 세포외 환경에서의 ROS의 수준이 증가되어 주어진 스트레스의 효과를 측정하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 양태의 일부 실시형태에 있어서, 세포는 LIF (백혈병 억제 인자)의 존재 하에 스트레스가 가해질 수 있다.
일부 양태에 있어서, 세포의 세포질 및/또는 미토콘드리아의 일부를 제거하는 단계 후, 상기 방법은 또한 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계를 더 포함한다. 다능성 세포는 다능성 세포의 마커, 표현형, 또는 기능을 나타내는 세포를 선택함으로서 선택될 수 있다. 세포를 선택하는 단계는 원하는 특징을 나타내는 세포를 분리하고 증식시키는 단계 또는 원하는 특징(들)을 가진 세포가 원하는 특징(들)을 갖지 않은 세포들보다 높은 비율로 생존하고/하거나 증식할 수 있는 조건 하에 미지의 특징을 가진 세포의 개체군을 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 다능성 세포의 마커 및 특징의 비제한적인 예는 본 명세서에서 후술된다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성과 관련하여 세포를 선택하는 단계는, 적어도 부분적으로, Oct4를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성과 관련하여 세포를 선택하는 단계는 적어도 부분적으로, Nanog를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성과 관련하여 세포를 선택하는 단계는 적어도 부분적으로, Oct4, Nanog, E-cadherin, 및/또는 SSEA를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포는 이들 마커 및 FACS에 대해 특이적인 항체를 사용하여 SSEA-1 및 E-cadherin을 발현하는 세포를 선택함으로서 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 FACS 또는 본 기술분야에 알려지고/알려지거나 본원에 기술된 다른 세포 분류 장치를 사용하여 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 세포는 또한 배양 용기에의 부착불능성에 의해 선택될 수 있다.
세포는 또한 스트레스를 가한 후의 더 작은 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 즉, 다능성이 진전되는 스트레스 받은 세포는 그것의 비-다능성 체세포 전구체보다 더 작다. 일부 실시형태에 있어서, 8 ㎛ 보다 작은 직경을 갖는 세포, 예를 들어 8 ㎛ 이하, 7 ㎛ 이하, 6 ㎛ 이하, 5 ㎛ 이하, 또는 그 이하의 직경을 갖는 세포가 선택된다. 세포는 짧은 기간 (예를 들어, 수분 내지 수일) 동안 배양한 후 또는 스트레스 처리하고나서 휴지시킨 후 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 세포는 스트레스 처리 후 즉시 크기에 기초하여 선택될 수 있다. 세포는 본 기술분야에 알려진 임의의 방법, 예를 들어 필터의 사용 또는 FACS에 의해 크기에 기초하여 선택될 수 있다.
본원에 기술된 방법의 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포는 다능성 세포의 증식(즉, 줄기 세포의 증식)이 가능하도록 배양될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포는 세포외에서 유지될 수 있다. 하나의 양태에 있어서, 본원에 기재된 기술은 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 그것의 자손을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 그것의 자손은 세포외에서 예를 들어 세포주(cell line)로서 유지될 수 있다. 세포주는 시험 후보 물질, 예를 들어 소정 질환에 대한 치료제 및/또는 본원에 이하에 기술된 줄기 세포를 조절하는 물질을 스크리닝 및/또는 시험하기 위해 사용될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 그것의 자손은 질환, 예를 들어 자연 발생 세포 또는 조직 유형 또는 자연 발생 다능성 및/또는 다분화능 세포 (본원에 이하에 기술됨)의 부전과 관련된 질환, 및/또는 유전적 돌연변이를 포함하는 세포와 관련된 질환, 예를 들어 암을 가진 대상체로부터 얻은 세포로부터 유래될 수 있다. 본원에 기술된 조성물은 예를 들어, 질환 모델링, 약물 발견, 진단, 및 개별화된 치료에서 사용될 수 있다.
줄기 및/또는 다능성 세포의 증식 및/또는 유지에 적합한 조건은 본 기술분야에 알려져 있다. 줄기 세포의 증식은 분화를 실질적으로 유도하거나 허용함 없이 세포 수의 팽창(expansion)을 가능하게 한다. 비제한적인 예로서, 다능성 세포의 증식에 적합한 조건은 2% B27, 20 ng/mL 기본 섬유아세포 성장 인자, 및 10 ng/mL 상피 성장 인자가 보충된 F12/DMEM (1 : 1, v/v)에 1×106 세포/cm2로 세포를 플레이팅(plating)하는 것을 포함한다. 배지의 약 50%는 배양 기간 동안 2-3일마다 교체될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 및/또는 다능성 세포의 증식에 적합한 조건은 본원에서 그 전문이 참조로 모두 포함되는 문헌 [Hitoshi, S. et al. Genes & development 2004 18, 1806-1811]에 기술된 B27-LIF (즉, LIF ( 1 x 103 units/mL, Chernicort; Cat No: ESG1107 EMD Millipore, Billerica, MA) 및 B27 보충물 (Cat No: 0080085-SA; Invitrogen; Grand Island, NY)를 함유하는 무-혈청 배지)에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 본원에 기술된 세포를 배양하기에 적합한 다른 배지, 예를 들어 ES 수립 배지, 2i, 3i 및 ACTH, ES 배지, ES-LIF, 배아 신경 줄기 세포 배양 조건, 및 EpiSCs 배양 조건은 본원에서의 실시예에 기술되어 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포의 증식 또는 유지를 위한 조건은 LIF (백혈병 억제 인자)의 존재 하에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
증식 과정에서, 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포는 동일한 다능성 줄기 세포 마커(들)를 발현하는 것을 지속할 것이다. 다능성 줄기 세포 마커의 비제한적인 예는 SSEA-1, SSEA-2, SSEA-3, SSEA-4 (본 명세서에서 SSEA로 통칭됨), AP, E-cadherin 항원, Oct4, Nanog, Ecatl, Rexl, Zfp296, GDF3, Dppa3, Dppa4, Dppa5, Sox2, Esrrb, Dnmt3b, Dnmt31, Utfl, Tcll, Batl, Fgf4, Neo, Cripto, Cdx2, 및 Slc2a3를 포함한다. 세포가 다능성 줄기 세포 마커를 발현하는지를 결정하는 방법은 본 기술분야의 통상의 기술자 중 일인에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 RT-PCR, 리포터 유전자 구조체의 사용 (예를 들어 FACS 또는 형광 현미경과 결합되는 본원에 기술된 Oct4-GFP 구조체의 발현), 및 FACS 또는 관심 대상의 세포 표면 마커에 대해 특이적인 항체를 사용하는 형광 현미경법을 포함한다.
다능성 세포 마커는 또한 세포와 비교되는 연장된 텔로미어를 포함한다. 텔로미어 길이는 예를 들어 게놈 DNA를 분리하고 Hinfl 및 Rsal와 같은 제한 효소로 gDNA를 소화(digestion)하고, 텔로미어 길이 분석 시약으로 텔로미어를 검출함으로서 측정될 수 있다. 이러한 시약은 본 기술분야에 알려져 있고 예를 들어 TELOTAGGG™TELOMERE LENGTH ASSAY 키트 (Cat No. 12209136001 Roche; Indianapolis, IN)로 시판된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 처리되는 세포는, 본 개시된 방법에 따라 처리되기 전보다 배아 줄기 세포의 후성유전적 상태(epigenetic state)에 보다 근사하도록 개조될 수 있다. 세포의 후성유전적 상태는 게놈의 뉴클레오티드 서열에서의 변화가 아니라, 게놈의 화학적 마크(mark)를 가리킨다. 후성유전적 마크는 DNA 메틸화 (임프린트)뿐만 아니라 DNA와 관련된 단백질, 예컨대 히스톤의 메틸화 및 아세틸화를 포함할 수 있다. 용어 "DNA 메틸화"는 DNA에 특정 염기에의 메틸(CH3)기의 부가를 지칭한다. 포유동물에서, 메틸화는 거의 오로지, 뒤에 구아닌이 따를 때의 시토신(CpG)의 5 위치에서 발생한다. 일부 실시형태에 있어서, 후성유전적 상태는 후성유전적 메틸화 패턴, 예를 들어 DNA 메틸화 패턴을 포함할 수 있다. 후성유전적 표지의 존재 및 위치를 결정하기 위한 분석법은 본 기술분야에 알려져 있고 바이설파이트 시퀀싱(bisulfite sequencing)을 포함할 수 있다. 간단하게는, DNA는 CpGenome™ DNA Modification 키트 (Chemicon, Temecula, CA,)로 처리되고 관심 대상의 영역 (예를 들어 Nanog 및 Oct4 유전자)은 증폭되고 시퀀싱된다.
본원에 기재된 기술의 일부 양태는 본원에 기술된 방법에 의해 생성되는 다능성 줄기 세포를 사용하는 분석법에 관한 것이다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법에 의해 제조되는 다능성 줄기 세포는 다능성 줄기 세포의 생존력, 분화도, 또는 증식력을 조절하는 물질을 스크리닝하고/하거나 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 분석법은 본원에 기술된 방법에 따라 제조되는 다능성 세포를 후보 물질과 접촉시키는 단계 및 상기 후보 물질과 접촉된 상기 다능성 세포의 생존력, 분화도 및/또는 증식력이 상기 후보 물질과 접촉되지 않은 상기 다능성 세포의 생존력, 분화도 및/또는 증식력과 달라졌는지를 측정하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 물질은 다능성 줄기 세포의 생존력, 분화도 및/또는 증식력을 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 물질은 다능성 줄기 세포의 생존력, 분화도 및/또는 증식력을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 줄기 세포는 예를 들어 시너지 또는 길항 효과를 측정하기 위해 또는 모집단(pool)에서 후보 물질을 스크리닝하기 위해 다수의 후보 물질과 접촉될 수 있다.
후보 물질은, 부존재하에 비해 후보 물질의 존재하에 생존 가능한 즉 살아있는 다능성 세포의 수가 더 많거나 적은 경우에, 제조된 다능성 세포의 생존력을 조절하는 물질로서 확인된다. 세포의 생존력을 측정하는 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 비제한적인 예로서, 살아 있는 세포 마커로부터의 신호의 강도, 또는 살아 있는 세포 마커에 의해 착색된 세포의 수 또는 비율을 검출함으로서 둘 이상의 시점에서 생존가능한 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 살아 있는 세포 마커는, 예를 들어 PRESTO BLUE™ (Cat No A-13261; Life Technologies; Grand Island, NY)로 시판된다. 후보 물질은 다능성 세포의 증식율이 변경되는 경우 즉, 주어진 시간에서 제조된 자손 세포의 수가 후보 물질의 존재 하에서 더 많거나 더 적은 경우, 제조된 다능성 세포의 증식을 조절하는 물질로서 확인된다. 세포의 증식율을 측정하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고 비제한적인 예로서 시간에 따라 살아 있는 세포 수의 증가를 측정하는 단계를 포함한다.
후보 물질은 다능성 세포의 분화의 속도 또는 특징이 후보 물질의 존재 하에 더 많거나 적을 경우 다능성 세포의 분화를 조절하는 물질로서 확인된다. 세포의 분화의 속도 또는 특징을 측정하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고, 비제한적인 예로서, 특정 계통의 마커 또는 모폴로지를 검출하는 단계, 및 후보 물질과 접촉된 개체군에서의 그러한 마커 또는 모폴로지를 갖는 세포의 수 및/또는 세포의 출현 속도를 그 후보 물질과 접촉하지 않은 개체군과 비교하는 단계를 포함한다. 다양한 세포 운명 계통(cell fate lineage) 및 성숙한 세포 유형의 마커 및 모폴로지적 특징은 본 기술분야에 알려져 있다. 비제한적인 예로서, 중배엽 세포는 액틴, 미오신, 및 데스민의 발현에 의해 다능성 세포로부터 구분된다. 연골세포는 사프라닌-O 및/또는 FASTGREEN™ 염료 (Fisher; Pittsburg, PA; F99)로 착색시킴으로써 그것의 전구체 세포 유형과 구분될 수 있다. 골세포는 Alizarin Red S (Sigma; St. Louis, MO: Cat No A5533)로 착색시킴으로써 그것의 전구체 세포 유형과 구분될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 후보 물질은 종양 줄기 세포의 잠재적 억제제일 수 있고, 예를 들어 본원에 기술된 방법은 성숙한 종양 세포로부터 다능성 세포를 제조하는데 사용되고, 종양 세포의 제조 및/또는 생존력을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 기술된 방법은 또한 종양 줄기 세포의 발달 및/또는 생존을 촉진하지 않는, 성숙한 종양 세포를 죽이는 물질을 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포는 하나 이상의 후보 물질과 접촉되고 특정 세포 계통 또는 성숙한 세포 유형으로의 분화를 촉진하는 조건 하에 배양된다. 분화에 적합한 조건은 본 기술분야에 알려져 있다. 비제한적인 예로서, 중배엽 계통으로의 분화에 적합한 조건은 3일마다 교환되는 배지와 함께 20% 우태 혈청(FCS)으로 보충된 DMEM을 포함한다. 추가적인 비제한적인 예로서, 신경 계통으로의 분화에 적합한 조건은 2% B27, 10% FCS, 10 ng/mL bFGF, 및 20 ng/m LEGF가 보충된 F12/DMEM (1 : 1, v/v)에서의 오르니틴-코팅된 챔버 슬라이드에 세포를 플레이팅하는 단계를 포함한다. 배지는 3일마다 교환될 수 있다.
본원에서 사용되는, "후보 물질"은 통상 존재하지 않거나 세포, 조직 또는 대상체에 투여되는 수준으로 존재하지 않는 임의의 독립체(entity)를 지칭한다. 후보 물질은 하기 군으로부터 선택될 수 있다: 화학물질; 작은 유기 또는 무기 분자; 핵산 서열; 핵산 유사체; 단백질; 펩티드; 압타머; 펩티도미메틱, 펩티드 유도체, 펩티드 유사체, 항체; 인트라바디(intrabodies); 생물 거대분자; 박테리아, 식물, 펀자이, 또는 동물 세포 또는 조직과 같은 생물 물질로부터의 추출물; 자연 발생 또는 합성 조성물 또는 그것의 기능성 절편. 일부 실시형태에 있어서, 후보 물질은 제한 없이 합성 및 자연-발생 비단백질 독립체를 포함하는 임의의 화학적 독립체(entity) 또는 모이어티(moiety)이다. 특정 실시형태에 있어서, 후보 물질은 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 매크로라이드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 그것의 유사체를 포함하는 비치환된 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로시클릴 모이어티를 포함한다. 후보 물질은 바람직한 활성 및/또는 특성을 가지는 것을 알려져 있을 수 있고, 또는 다양한 화합물의 라이브러리로부터 선택될 수 있다.
후보 물질은 다능성 세포의 생존력, 증식력, 및/또는 분화도를 조절하는 그것의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 하나의 실시형태에 있어서, 후보 물질은 상기 및 본원의 실시예에 기술된 생존력, 분화도, 및/또는 증식력에 대한 분석법을 사용하여 스크리닝된다.
일반적으로, 화합물은 적절한 기간에 걸쳐 대조군에 대해 세포 기능, 유전자 발현 또는 단백질 활성을 조절할 수 있는 임의의 농도에서 시험될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 화합물은 약 0.1 nM 내지 약 1000 mM 범위의 농도에서 시험된다. 한 실시형태에 있어서, 화합물은 약 0.1 μΜ 내지 약 20 μΜ, 약 0.1 μΜ 내지 약 10 μΜ, 또는 약 0.1 μΜ 내지 약 5 μΜ 범위에서 시험된다.
실시되는 특정 실시형태에 따라, 후보 또는 시험 물질은 용액에서 유리되어 제공될 수 있고, 또는 담체, 또는 고체 지지체, 예를 들어 비드에 부착될 수 있다. 다수의 적합한 고체 지지체가 시험 물질의 고정화를 위해 이용될 수 있다. 적합한 고체 지지체의 예는 한천, 셀룰로오스, 덱스트란 (예를 들어, Sephadex, Sepharose로 시판됨) 카르복시메틸 셀룰로오스, 폴리스티렌, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 여과 종이, 니트로셀룰로오스, 이온 교환 수지, 플라스틱 필름, 폴리아민메틸비닐에테르 말레산 공중합체, 유리 비드, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 실크 등을 포함한다. 추가적으로, 본원에 기술된 방법을 위해, 시험 물질은 개별적으로, 또는 그룹으로 또는 모집단(pool)으로 스크리닝될 수 있다. 소정 그룹에 대하여 양성의 결과가 하나보다 더 기대되지 않을 정도로 유효 시험 물질에 대한 히트율(hit rate)이 낮을 것으로 예상되는 경우 그룹 스크리닝이 특히 유용하다.
소분자, 중합체 및 게놈 기반 라이브러리를 개발하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Ding, et al. J Am. Chem. Soc. 124: 1594-1596 (2002) and Lynn, et al., J. Am. Chem. Soc. 123: 8155-8156 (2001)]에 기술되어 있다. 시판되는 화합물 라이브러리는, 예를 들어 ArQule (Woburn, MA), Invitrogen (Carlsbad, CA), Ryan Scientific (Mt. Pleasant, SC), 및 Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)로부터 얻을 수 있다. 이들 라이브러리는 다능성 줄기 세포의 생존력, 증식력, 및/또는 분화도를 조절하는 구성원의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 후보 물질은 자연 발생 단백질 또는 그것의 절편일 수 있다. 이러한 후보 물질은 천연 공급원, 예를 들어, 세포 또는 조직 용해물로부터 얻을 수 있다. 폴리펩티드 물질의 라이브러리는 또한 예를 들어 시판되거나 일반 방법으로 생성되는 cDNA 라이브러리로부터 제조될 수 있다. 후보 물질은 또한 펩티드, 예를 들어 약 5 내지 약 30 개의 아미노산, 바람직하게는 약 5 내지 약 20 개의 아미노산, 특히 바람직하게는 약 7 내지 약 15 개의 아미노산의 펩티드일 수 있다. 펩티드는 자연 발생된 단백질의 소화물, 랜덤 펩티드, 또는 "편향된(biased)" 랜덤 펩티드일 수 있다. 일부 방법에 있어서, 후보 물질은 폴리펩티드 또는 단백질이다. 펩티드 라이브러리, 예를 들어 펩티드 또는 다른 화합물의 조합 라이브러리는 임의의 지점에서의 서열 선호도(sequence preference) 또는 컨스턴트(constant) 없이 완전히 무작위적일 수 있다. 대안적으로, 라이브러리는 편향될(biased) 수 있고, 즉 서열 내의 일부 위치가 일정하게 고정되거나, 제한된 수의 가능한 것으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 경우에 있어서, 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기는 예를 들어 소수성 아미노산, 친수성 잔기, 입체적으로 편향된 (작거나 큰) 잔기, 가교를 위해, 시스테인의 생성 방향으로, SH-3 도메인을 위해 프롤린, 인산화 부위를 위해 세린, 트레오닌, 티로신 또는 히스티딘, 또는 퓨린을 위한, 의 한정된 클래스 내에서 무작위화된다.
후보 물질은 또한 핵산일 수 있다. 핵산 후보 물질은 자연 발생 핵산, 랜덤 핵산, 또는 "편향된" 랜덤 핵산일 수 있다. 예를 들어, 원핵 또는 진핵 게놈의 소화물은 단백질에 대해 상기 기술된 바와 유사하게 사용될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 다능성 세포의 생존력, 증식력 및/또는 분화도를 조절하는 것으로 스크리닝되고 확인된 후보 물질은 비처리된 대조군과 관련하여 5% 이상, 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 1-배, 1.1-배, 1.5-배, 2-배, 3-배, 4-배, 5-배, 10-배, 50-배, 100-배 또는 그 이상으로 다능성 세포의 생존력, 증식력 및/또는 분화도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 다능성 세포의 생존력, 증식력 및/또는 분화도를 조절하는 것으로 스크리닝되고 확인된 후보 물질은 비처리된 대조군과 관련하여 5% 이상, 바람직하게는 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상까지, 완전한 제거(즉, 제로 생존력, 성장, 증식력, 또는 분화도)까지 포함하여 다능성 세포의 생존력, 증식력 및/또는 분화도를 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 후보 물질은 투여되는 형태로 직접적으로 기능한다. 대안적으로, 후보 물질은 원하는 활성, 예를 들어 세포로의 핵산 서열의 도입 및 세포에서의 유전자 발현 또는 단백질 활성의 억제제 또는 활성제의 생성을 초래하는 그것의 전사를 조절하는 형태를 생성하기 위해 세포 내에서 변형되거나(modified) 활용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 예를 들어 암 백신의 개발에서 사용될 수 있다고 여겨진다. 본원에 기술된 바와 같이 (예를 들어, 본원에 기술된 방법에 따라 성숙한 종양 세포를 처리함으로서) 얻어지는 다능성 종양 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 생성은 보다 효험있는 APC (항원 제시 세포)에 기초한 암 백신의 개발을 가능하게 할 수 있는 다양하고 변화되는 항원 프로파일을 제공할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법은 세포의 형질전환 효능을 증가시키는 것과 관련된다. 세포에 스트레스를 가하는 것, 예를 들어 본원에 기술된 바와 같이 다능성을 유도하는 것은 이에 제한되지 않지만 전이유전자 삽입, 바이러스 벡터, 및/또는 징크 핑거 엔도뉴클레아제를 포함하는 유전적 변형 방법에 보다 수용적인 세포를 제조할 수 있다. 본원에 기술된 방법은, 네이키드 DNA(naked DNA)가 생성된 다능성 세포를 형질전환시키기 위해 사용될 수 있도록, 세포가 유전적으로 수용가능 상태로 변형될 수 있게 한다고 여겨진다.
본원에 기재된 기술의 일부 양태는 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 다능성 세포, 또는 이러한 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 세포 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료 방법에 관한 것이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 또는 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 치료적 유효량이 마련된다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 자가(autologous)이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 동종이형(allogeneic)이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 자가이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 HLA-매칭된 동종이형(HLA-matched allogeneic)이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 동계(syngeneic)이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 그것의 자손은 이종발생성(xenogenic)이다. 일부 실시형태에 있어서, 세포 치료는 자가유래 치료(autologous therapy)일 수 있고, 예를 들어 대상체로부터의 세포는 본원에 기술된 방법에 따른 다능성 세포를 제조하는데 사용될 수 있고 그 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손은 그 대상체에게 투여될 수 있다. 본원에 사용되는, "세포 치료를 필요로 하는 대상체"는 자연 발생 세포 또는 조직 유형 또는 자연 발생 다능성 및/또는 다분화능 세포 (예를 들어, 줄기 세포)의 부전과 관련된 질환을 갖거나, 이를 갖거나 발병될 위험이 있는 것으로 진단되는 대상체를 지칭한다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법은 예를 들어, 본원에 기술된 바에 따라 얻어지는 동종이형 다능성 세포 및/또는 그것의 자손을 투여함으로서 유전적 장애, 예를 들어 테이-색스병(Tay-Sachs) 또는 혈우병을 치료하는데 사용될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 하기를 포함하는, 대상체에 투여되는 세포 치료에 적합한 세포 또는 조직의 제조 방법이 기술된다: 본원에 기술된 방법에 따라 세포로부터 다능성 세포(또는 더욱 다능성의 세포)를 생성하는 단계, 여기서 세포는 자가 세포 또는 HLA-매칭된 동종이형 세포이다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포(또는 더욱 다능성의 세포)는 대상체로 그 세포 또는 조직을 투여하기 전에 미리 정해진 세포 계통에 따라 분화될 수 있다.
다능성 세포, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 줄기 세포는 암 치료에 사용될 수 있다. 예를 들어, 골수 조혈계를 재생하기 위한 조혈모 줄기 세포 이식 플러스 고용량 화학요법은 본원에 기술된 바와 같이 생성된 다능성 세포의 사용의 혜택을 향유할 수 있다.
자연 발생 세포 또는 조직 유형 또는 자연 발생 다능성 및/또는 다분화능 세포의 부전과 관련된 질환의 비제한적인 예는 재생불량성 빈혈, 판코니 빈혈, 및 발작성 야간혈색소증 (PNH)을 포함한다. 다른 것은 예를 들어 하기를 포함한다: 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 급성 골수성 백혈병 (AML), 급성 이중표현형 백혈병 및 급성 미분화 백혈병을 포함하는 급성 백혈병; 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 소아형 만성 골수성 백혈병 (JCML) 및 소아형 골수단백구형 백혈병 (JMML)을 포함하는 만성 백혈병; 급성 골수섬유증, 혈관생성 골수화생 (골수섬유증), 진성다혈구증 및 본태성 혈소판 증가증을 포함하는 골수증식성 질환; 뮤코다당증 (MPS), 헐러 증후군 (MPS-IH), 샤이 증후군 (MPS-IS), 헌터 증후군 (MPS-II), 산필립포 증후군 (MPS-III), 모르쿠오 증후군 (MPS-IV), 마로토-라미 증후군 (MPS-VI), 슬라이 증후군, 베타-글루쿠로니다아제 결핍 (MPS-VII), 부신백질이영양증, 뮤코리피드증 II (I-세포 질환), 크라베병, 고세병, 니맨-픽 질환, 월만병 및 본태성 혈소판증가증을 포함하는 리소좀 축적 질환; 가족성 적혈구탐식성 림프조직구 증식증, 히스티오사이토시스-X 및 혈구포식증후군을 포함하는 조직구 장애; 체디아크 히가시 증후군, 만성 육아종, 중성구 액틴 결핍증 및 세망 이생성증을 포함하는 식세포 질환; 거대핵세포증가증/선천성 혈소판감소증을 포함하는 유전성 혈소판 이상증; 다발성 골수종, 형질 세포성 백혈병, 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증을 포함하는 형질 세포 질환. 줄기 세포 요법으로 치료될 수 있는 다른 악성종양은 이에 제한되지 않지만 유방암, 유잉육종, 신경모세포종 및 신세포암종 등을 포함한다. 또한 줄기 세포 요법으로 치료가능한 것은 하기와 같다: COPD 및 기관지 천식을 포함하는 폐 질환; 모세혈관확장성운동실조증, 코스트만 증후군, 백혈구 부착 결핍증, 디죠지 증후군, 베어 림프 증후군, 오멘 증후군, 중증 복합형 면역 부전증 (SCID), 아데노신탈아미노화효소 결핍증을 갖는 SCID, T & B 세포 SCID의 결여증(absence of T & B cells SCID), T 세포 결여증(absence of T cells), 정상 B 세포 SCID, 공통 가변성 면역결핍증, 및 X-연관성 림프세포증식성 질환을 포함하는 선천성 면역 질환; 레쉬-니한 증후군, 연골-모발 발육부전, 글란즈만 혈소판무력증 및 골석화증을 포함하는 다른 유전성 질환; 급성 및 만성 뇌졸증, 외상성 뇌손상, 뇌성마비, 다발성 경화증, 근위축측삭경화증 및 간질을 포함하는 신경성 상태; 죽상동맥경화증, 울혈심부전 및 심근경색증을 포함하는 심장 상태; 당뇨병을 포함하는 대사 장애; 및 황반변성 및 시신경위축을 포함하는 안구 장애. 이러한 질환 또는 장애는 원하는 분화를 촉진하는 물질의 투여와 함께 또는 투여 없이 원하는 세포 유형으로의 생체내 분화를 가능하게 하는 다능성 세포 자체를 투여함으로서, 및/또는 생체외에서 원하는 세포 유형으로 분화되는 또는 적어도 부분적으로 분화되는 다능성 세포를 투여함으로서 치료될 수 있다. 이러한 상태의 진단 방법은 본 기술분야의 통상의 기술을 가진 의사에게 잘 알려져 있다. 일부 실시형태에 있어서, 대상체는 방사선 요법 또는 세포 또는 줄기 세포의 개체군을 파괴하는 다른 요법으로 치료된 사람일 수 있고, 예를 들어 대상체는 골수가 방사선 요법으로 파괴된 암을 가진 대상체일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포는 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 부분적으로 분화된 세포는 대상체에 투여된다. 일부 실시형태에 있어서, 세포 치료의 방법은 세포를 투여하기 전에 미리 정해진 세포 계통에 따라 상기 다능성 세포를 분화하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 원하는 세포 계통에 따라 줄기 세포를 분화시키는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고 예가 본원에 기술된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 얻어진 다능성 세포, 또는 상기 다능성 세포의 자손인 적어도 부분적으로 분화된 세포를 포함하는 조성물은 대상체에 투여된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법에 따라 얻어진 다능성 세포, 또는 상기 다능성 세포의 자손인 적어도 부분적으로 분화된 세포를 포함하는 조성물은, 임의로 G-CSF, GM-CSF 및/또는 M-CSF를 추가로 포함할 수 있고/있거나 별도의 조성물로 G-CSF, GM-CSF 및/또는 M-CSF를 투여되었거나 투여될 것인 대상체로 투여될 수 있다. G-CSF, GM-CSF 및/또는 M-CSF의 투여는 예를 들어 장기 재생에 바람직한 염증의 상태 및 조직 잔해, 폐물 및 구성물의 제거를 유도할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 자손의 투여는 본원에 기술된 방법에 따라 배양액에서 다능성 세포의 생성 이후 상대적으로 짧은 기간 (예를 들어, 생성 후 1, 2, 5, 10, 24 또는 48 시간) 내에 일어날 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 적어도 부분적으로 분화된 자손의 투여는 본원에 기술된 방법에 따라 배양액에서 다능성 세포의 분화 이후 상대적으로 짧은 기간 (예를 들어, 생성 후 1, 2, 5, 10, 24 또는 48 시간) 내에 일어날 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 자손은 투여 이전에 극저온으로 보존될 수 있다.
일부 양태에 있어서, 본원에 기재된 기술은 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포 및/또는 상기 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 포함하는 조성물과 관련된다. 일부 실시형태에 있어서, 약학적 조성물은 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포 및/또는 상기 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 상기 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
약학적 조성물은 적합한 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있고, 예를 들어 용액, 현탁액, 겔, 또는 에멀젼일 수 있다. 통상적으로, 조성물은 담체와 함께 세포 약 0.01 내지 99%, 바람직하게는 약 5 내지 95%를 함유할 것이다. 상기 세포는, 약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정화제와 조합되는 경우, 비경구적으로, 피하로, 이식 또는 주사에 의해 투여될 수 있다. 대부분의 치료적 목적을 위해, 상기 세포는 액체 형태의 용액 또는 현탁액으로서 주사를 통해 투여될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포 및/또는 상기 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 투여를 위한 담체를 지칭한다. 이러한 담체는, 이에 제한되지 않지만, 식염수, 완충 식염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 및 이들의 조합을 포함한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분에 적합한 의미에서 "허용가능함(acceptable)"이어야 하고, 예를 들어 담체는 대상체에 대한 물질의 영향을 감소시키지 않는다. 다시 말해서, 담체는 약학적으로 불활성이고 살아있는 세포에 적합하다.
적합한 제형은 또한 항-산화제, 완충액, 세균발육억제제, 살균 항생물질 및 그 제형을 의도된 수용자의 체액과 등장성이 될 수 있게 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 주사액을 포함한다. 수성 및 비-수성 멸균 현탁액은 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있다. 제형은 단위-복용 또는 다중-복용 용기에 보존될 수 있다.
비경구 복용 형태의 예는, 이에 제한되지 않지만, 주사에 용이한 용액, 주사에 용이한 현탁액, 및 에멀젼을 포함한다. 비경구 복용 형태는, 예를 들어 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포 및/또는 상기 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 유지하는 생분해성 스캐폴드재를 사용하여 제조될 수 있다.
용어 "후성유전적 변형(epigenetic modification)"은 게놈의 화학적 마킹(chemical marking)을 지칭한다. 후성유전적 마크는 DNA 메틸화 (임트린트) 뿐만 아니라 히스톤과 같은 DNA와 관련된 단백질의 메틸화 및 아세틸화를 포함할 수 있다. 원부모-특이적 유전자 발현(parent-of-origin-specific gene expression) (모계 또는 부계 염색체)은 종종 포유동물에서 관찰되고 후성유전적 변형에 기인한다. 부모 생식계열에서, 후성유전적 변형은 안정적인 유전자 침묵화(gene silencing) 또는 활성화를 초래할 수 있다.
본원에서 사용되는, 용어 "투여하다" 또는 "이식하다"는 원하는 효과가 발생되는 원하는 위치에서 세포의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 대상체로의 세포의 배치를 지칭한다.
본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손은 임상의가 적절하다고 판단한 임의의 방법으로 투여될 수 있고, 예를 들어 세포의 현탁액의 주사에 의해, 또는 예를 들어 이식가능한 스캐폴드 또는 지지체 상이나 내부에 퇴적되거나(deposited) 성장된 세포의 준비된 것을 이식함에 의한 국소 투여를 포함할 수 있다. 이식가능한 스캐폴드는 특히 다수의 분해가능하거나 흡수가능한 중합체, 또는 예를 들어 실크 스캐폴드 등 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 포함하는 약학적 조성물의 투여를 위한 적합한 경로는 이에 제한되지 않지만 국소 투여, 예를 들어 복강내주사, 비경구, 강내 또는 피하 투여를 포함한다. 본원에서 사용되는 문구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여되는"은 일반적으로 주사에 의한 경장(enteral) 및 국소(topical) 투여 외의 투여 방식을 지칭하고 제한됨 없이 복강내주사, 피내주사, 피하 주사 및 정맥주입을 포함한다. 투여는 주사에 적합한 바늘, 카테터 및 주사기, 또는 외과적 이식의 사용과 관련될 수 있다. 전달 수단 및 전달 위치의 조합의 사용이 원하는 의료적 효과를 달성하기 위해 고려된다.
용어 "후성유전적 변형"은 게놈의 화학적 마킹(chemical marking)을 지칭한다. 후성유전적 마크는 DNA 메틸화 (임트린트) 뿐만 아니라 히스톤과 같은 DNA와 관련된 단백질의 메틸화 및 아세틸화를 포함할 수 있다. 원부모-특이적 유전자 발현 (모계 또는 부계 염색체)은 종종 포유동물에서 관찰되고 후성유전적 변형에 기인한다. 부모 생식계열에서, 후성유전적 변형은 안정적인 유전자 침묵화 또는 활성화를 초래할 수 있다.
하나의 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 치료적 유효량이 대상체에 투여된다. "치료적 유효량"은 치료될 증상 또는 상태의 마커에 있어서의 측정가능한 개선을 낳기에 충분한, 본원에 기술된 다능성 줄기 세포 및/또는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 양이다. 치료 조성물에서의 세포의 실제 복용 수준은 특정 대상체에 대한 원하는 치료 반응을 달성하기에 효과적인 세포의 양을 투여하기 위해 변화될 수 있다. 선택된 복용 수준은 이에 제한되지 않지만 치료적 조성물, 제형, 투여 경로, 다른 약물 또는 치료와의 조합, 치료되는 상태의 심각성, 대상체의 신체적 조건, 치료되는 대상체의 이전 의료 이력 및 요법을 투여하는 의료인 또는 의사의 경험 및 판단을 포함하는 다양한 인자들에 좌우될 것이다. 일반적으로, 계획된 복용량 및 투여법은 상태의 진전을 늦추고, 바람직하게는 억제하고, 또한 바람직하게는 상태의 하나 이상의 증상 또는 마커의 감소를 야기하기에 충분하여야 한다. 치료적 유효량의 결정 및 판단뿐만 아니라 이러한 판단의 시기 및 방법의 평가는 의약 분야의 통상의 기술자에게 알려져 있다.
본원에 기술된 방법에 따라 투여되는 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 복용량은 필요에 따라 치료의 관찰된 효과에 적합하도록 의사에 의해 결정 및 조정될 수 있다. 치료의 기간 및 빈도와 관련하여, 치료가 치료적 이익을 제공하는 시기를 결정하고, 다른 복용량의 세포를 투여할지 여부, 복용량을 증가하거나 감소시키는 여부, 치료의 중단 여부, 치료의 재개 여부, 또는 치료 요법에 다른 변경을 가할지 여부를 결정하기 위해 대상체를 모니터링하는 것은 숙달된 의료인에게 통상적인 것이다. 투여된 세포가 장기간으로 배지에 이식되어 생존할 것으로 예상되는 경우, 반복 복용량이 필요할 수 있다. 그러나, 투여는 대상체에게 필요한 만큼 그리고 견딜 수 있는 만큼 반복될 수 있다. 복용량은 실질적 부작용을 야기할 정도로 많아서는 안된다. 복용량은 또한 임의의 합병증이 발생하는 경우 담당 의사에 의해 조절될 수 있다. 그러나, 통상적으로, 복용량은 성인 인간에 대하여 100 내지 1×109 개의 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 그것의 부분적으로 분화된 자손, 예를 들어 100 내지 10,000 개의 세포, 1,000 내지 100,000 개의 세포, 10,000 내지 1,000,000 개의 세포, 또는 1,000,000 내지 1×109 개의 세포 범위일 수 있다. 효과적인 복용량은 예를 들어 동물 모델 시험 검정 또는 시스템으로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 추론될 수 있다.
본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 본원에 기술된 바에 따라 제조되는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손을 포함하는 치료 조성물은 본 기술분야에 알려진 방법에 따라 효험을 확인하고, 이식된 세포의 생체내 성장을 평가하고, 복용량을 산출하기 위해 SCID 마우스 모델과 같은, 하나 이상의 적절한 생체외 및/또는 생체내 동물 모델에서 임의로 시험된다. 특히, 복용량은 관련 분석법에서의 치료 대 비-치료 (예를 들어 치료된 것 대 비치료된 동물 모델의 비교)의 활성, 안정성 또는 다른 적합한 측정수치에 의해 초기에 결정될 수 있다. 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 자손의 유효량을 결정함에 있어, 의사는 기준들 중에서도, 이식된 세포의 성장 및 부피와 치료되는 상태의 진전을 평가한다. 복용량은 이용되는 복용 형태 및 이용되는 투여 경로에 따라 변화될 수 있다.
본원에 기술된 치료 방법과 관련하여, 본원에 기술된 다능성 줄기 세포, 및/또는 그것의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 투여는 투여의 특정 방식, 복용량, 또는 복용 빈도에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 근육내, 정맥내, 복강내, 소낭내(intravesicular), 관절내, 병변내, 피하, 또는 치료되는 상태를 치료하기에 충분한 복용량을 제공하기에 충분한 임의의 다른 경로를 포함하는 투여의 모든 방식이 고려된다.
일부 실시형태에 있어서, 본원에 기술된 방법은 생체내에서 다능성 세포를 생성하는데 사용될 수 있고, 예를 들어 대상체에 존재하는 세포는 다능성 표현형을 얻도록 본원에 기술된 바에 따라 스트레스가 가하여질 수 있다. 생체내 세포에 본원에 기술된 스트레스를 가하는 방법은 간단 명백하며, 예를 들어 약산(mild acid) 용액이 주사 및/또는 직접 도포를 통해 조직에 도입될 수 있고, 온도는 주변 조직을 가열하거나 냉각할 수 있는 프로브에 의해 또는 비-침습적 방법, 예를 들어 포커스 빔 방사(focus beam radiation)의 사용을 통해 변경될 수 있다. 다능성의 생체내 조절은 예를 들어 조직 재생 또는 상처 치유를 증가시키는데 사용될 수 있다. 비제한적인 예는 무릎 관절 세포 (예를 들어, 활액(synovial) 또는 연골 세포)가 다능성 표현형을 띠게 하고 새로운 조직을 재생하게 하는, 관절염이 있는 무릎 관절로의 약산의 주입을 포함할 수 있다. 추가의 비제한적인 예는 뇌졸중 또는 중추 신경계 손상 (예를 들어 척수 손상)을 가진 대상체의 치료를 포함할 수 있다. 염증이 해소된 후, 손상된 영역에 인접한 세포를 본원에 기술된 바와 같이 스트레스로 치료하여, 손상된 조직을 복원시키고/복원시키거나 손상된 조직을 재생하거나 고칠 수 있다.
추가적인 비제한적인 예에서, 후성유전적 상태의 변화 (예를 들어, 탈메틸효소에 의한 치료에 의함)는 비-인슐린 분비 세포 (예를 들어 췌장의 알파 글루카곤 세포)를 인슐린-분비 세포 (예를 들어 베타 세포)로 전환시킬 수 있다. 따라서, 본원에 기술된 방법에 따라 비-인슐린 분비 세포 (예를 들어, 췌장의 알파 글루카곤 세포)를 처리하는 것은 생체내 또는 생체외에서 세포가 인슐린-분비 세포, 예를 들어 베타-유사 세포가 되는 것을 초래할 수 있다.
또한, 본원에 기술된 다능성 세포는 다른 세포 (즉, "수용 세포(recipient cell)"), 예를 들어 본원에 기술된 방법에 따라 처리되지 않은 세포, 비-다능성 세포, 성숙 세포, 악성 세포, 및/또는 손상된 세포와 융합될 수 있다. 세포의 융합은 융합 이전과 비교하여 수용 세포에서의 세포의 복구 효소 발현 및/또는 활성의 증가된 수준을 초래할 수 있다. 이는 예를 들어 수용 세포의 세포 손상, 돌연변이, 및/또는 후성유전적 상태의 변형의 복구를 증가시킴으로써 수용 세포의 건강 및/또는 기능을 증가시킬 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 생체내 세포의 다능성을 증가시킴으로써, 이러한 세포의 후성유전적 마커 (예를 들어, DNA 메틸화, 탈메틸화, 및/또는 히드록시메틸화 상태)가 조절될 수 있다. 후성유전적 마커의 조절은 예를 들어 악성종양, 관절염, 자가면역 질환, 노화 등과 연루되어 왔으며, 본원에 기술된 방법에 따라 이러한 후성유전-연관 상태의 치료가 고려된다.
일부 실시형태에 있어서, 다수의 조직은 동시에 생체내에서 치료될 수 있고, 광범위한 손상 또는 노화를 치료하기 위해, 예를 들어 약산성 상태가 다수의 기관에서, 예를 들어 연속적이거나 동시에 (예를 들어, 뇌, 심장, 간, 폐, 및/또는 갑상선)에서 유도될 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 세포의 생체내 치료는 본원에 기술된 바에 따라 제조된 다능성 세포 및/또는 적어도 부분적으로 분화된 그것의 자손의 투여와 조합될 수 있음이 추가로 고려된다.
본원에 기술된 방법이 예를 들어 자궁 내 태아 또는 배아를 치료하기 위해 사용될 수 있음이 본원에서 고려된다.
치료의 효과는 본원에 기술된 바와 같이 치료되는 상태의 예를 들어 마커, 지표, 증상 또는 발생 정도 또는 임의의 측정가능한 적절한 파라미터, 예를 들어 다능성 세포 자손의 수를 측정함으로서 평가될 수 있다. 이러한 파라미터 중 임의의 하나, 또는 파라미터의 임의의 조합을 측정함으로서 치료 또는 예방의 효과를 모니터링하는 것은 본 기술분야의 통상의 기술자의 능력 범위 내에서 가능하다.
효과적인 치료는 하나 이상의 마커, 지표, 또는 치료되는 상태의 증상에서의 통계적으로 유의미한 개선이 있거나 또는 그 치료가 없다면 예상되는 증상의 악화 또는 발전의 불이행(failure)에 의해 입증된다. 예로서, 상태의 측정가능한 파라미터에서의 약 10% 이상, 바람직하게는 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50% 이상 또는 그 이상의 바람직한 변화는 효과적인 치료의 지표일 수 있다. 본원에 기술된 방법에 따라 생성된 다능성 세포 및/또는 상기 다능성 세포의 적어도 부분적으로 분화된 자손의 효능은 또한 본원에 기술된 상태에 대한 본 기술분야에서 알려진 실험 동물 모델을 사용하여 판단될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 마커에서의, 예를 들어 골수 제거 및 본원에 기술된 다능성 세포를 사용한 치료 후 마우스에 존재하는 조혈모 세포의 수에서의, 통계적으로 유의미한 변화가 관찰되는 경우 치료의 효능이 입증된다.
하나의 양태에 있어서, 태반 세포로 분화가 가능한 다능성 세포의 제조 방법이 본원에 기술되어 있고, 상기 방법은 FGF4의 존재 하에 본원에 기술된 방법에 따라 얻은 다능성 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에 있어서, 상기 다능성 세포는 배아 줄기 세포로 분화될 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, FGF4의 농도는 약 1 nM 내지 약 1 ㎛이다. 일부 실시형태에 있어서, FGF4의 농도는 1 nM 내지 1 ㎛이다. 일부 실시형태에 있어서, FGF4의 농도는 약 5 nM 내지 약 500 nM이다. 일부 실시형태에 있어서, FGF4의 농도는 약 10 nM 내지 약 100 nM이다.
일부 양태에 있어서, 본원에 기재된 기술은 세포로부터 다능성 세포를 생성하기 위한 시스템에 관한 것이고, 이는 세포로부터 세포질 및/또는 미토콘드리아의 일부를 제거하는 것을 포함한다.
본원에 기술된 방법에 따라, 세포로부터 다능성 세포를 생성하기 위한 시스템은 세포에 스트레스가 가해지는 컨테이너를 포함한다. 예를 들어 본원에 기술된 방법에 따라 세포질 및/또는 미토콘드리아의 양을 감소시키기 위해 저산소 조건 하에서 세포를 수일 또는 그 이상 동안 배양하는 경우, 상기 컨테이너는 체세포 및/또는 다능성 세포의 배양에 적합한 것일 수 있다. 대안적으로, 상기 컨테이너는 세포가 제한된 기간, 예를 들어 1 시간 미만 동안 좁은 구멍을 갖는 장치에서 분쇄되는 경우 세포의 배양에 적합하지 않으나 세포에 스트레스를 가하는데 적합한 것일 수 있다. 컨테이너는 예를 들어 용기(vessel), 튜브, 마이크로유체소자, 피펫, 생물반응기, 또는 세포 배양 디쉬일 수 있다. 컨테이너는 체세포 및/또는 다능성 세포의 배양에 적합한 조건을 제공하는 환경(예를 들어 인큐베이터에 담긴 것) 또는 세포에 환경적 스트레스를 야기하는 조건을 제공하는 환경(예를 들어 저산소 함량 환경을 제공하는 인큐베이터에 함유된 것)에서 유지될 수 있다. 컨테이너는 본원에 기술된 1 개 이상의 환경적 스트레스, 예를 들어 1 개의 스트레스, 2 개의 스트레스, 3 개의 스트레스, 또는 그 이상을 제공하도록 구성될 수 있다. 체세포 및/또는 다능성 세포를 취급하고/하거나 배양하기에 적합한 컨테이너는 본 기술분야에서 통상의 기술자 중 일인에게 잘 알려져 있고 시판된다 (예를 들어 Cat No CLS430597 Sigma-Aldrich; St. Louis, MO). 일부 실시형태에 있어서, 컨테이너는 마이크로유체소자이다. 일부 실시형태에 있어서, 컨테이너는 세포 배양 접시, 플라스크, 또는 플레이트이다.
일부 실시형태에 있어서, 시스템은 다능성 세포를 선택하는 수단을 추가로 포함할 수 있고, 예를 들어 시스템은 다능성 마커 (예를 들어 Oct4-GFP)를 발현하는 세포를 선택하거나 상기 본원에 기술된 바와 같이 크기로 선택할 수 있는 FACS 시스템을 포함할 수 있다. 세포의 선택을 위한 방법 및 장치는 본 기술분야의 통상의 기술자 중 일인에게 잘 알려져 있고, 예를 들어 BD Biosciences; Franklin Lakes, NJ에 의해 제조된 BD LSRII™ 및 BD FACSDIVA™ 소프트웨어가 결합된 BD FACSARIA SORP™ (Cat No. 643629)로 시판된다.
일부 실시형태에 있어서, 조직에 존재하지 않는 세포가 상기 시스템에 제공된다. 일부 실시형태에 있어서, 조직이 상기 시스템에 제공되고 상기 시스템은 하나 이상의 유형의 세포를 분리하는 수단을 추가로 포함한다. 비제한적인 예로서, 상기 시스템은 조직 균질화기(tissue homogenizer)를 포함할 수 있다. 조직 균질화기 및 그것의 사용 방법은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 시판된다 (예를 들어 FASTH21™, Cat No. 21-82041 Omni International; Kennesaw, GA). 대안적으로, 상기 시스템은 혈액 또는 체액 샘플을 가공하는 원심분리기를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 시스템은 자동화될 수 있다. 세포 분리, 세포 배양, 및 선택 장치를 자동화하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있고 예를 들어, FASTH21™ Tissue Homogenizer (Cat No. 21-82041 Omni International; Kennesaw, GA) 및 BD FACSARIA SORP™로 시판된다.
일부 실시형태에 있어서, 상기 시스템은 살균될 수 있고, 예를 들어 살균 환경에서 작동될 수 있거나 상기 시스템은 폐쇄된 살균 시스템으로서 작동될 수 있다.
하나의 양태에 있어서, 다능성 세포의 자기재생력을 증가시키는 방법이 본원에 기술되어 있고, 상기 방법은 부신피질자극호르몬 (ACTH), 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 본원에 사용되는, "자기재생력"은 세포가 생체외에서 배양되고 패시징될 수 있는 시간의 길이, 예를 들어 생존가능한 세포를 제조하기 위해 세포 및 그것의 자손에게 행해지고 지속될 수 있는 패시지(passage)의 수를 지칭한다. 본원에 기술된 방법에 따라 증가된 자기재생력을 갖게 되는 세포는 예를 들어 전능성 세포 및/또는 본원의 다른 곳에 기술된 바에 따라 스트레스에 노출됨으로서 생성된 세포일 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, ACTH의 존재 하에 배양하는 것은 약 0.1 μΜ 내지 약 1,000 μΜ, 예를 들어 약 0.1 μΜ 내지 약 100 μΜ, 약 0.1 μΜ 내지 약 10 μΜ, 또는 약 10 μΜ을 포함하는 세포 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에 있어서, ACTH의 존재 하에 세포를 배양하는 것은 ACTH를 포함하는 LIF 배지에서 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. LIF, ACTH, 2i 및 3i는 시판되고 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 ACTH는 Sigma-Aldrich (Cat No. A0673; St. Louis, MO)로부터 구입될 수 있고 LIF 배지는 Millipore (예를 들어 CatNos ESG1107; Billerica, MA)로부터 구입될 수 있고, 3i는 Stem Cells Inc. (예를 들어 "iSTEM Stem Cell Culture Medium, Cat No. SCS-SF-ES-01; Newark, CA)로부터 구입될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 배양 단계는 3 일 이상, 예를 들어 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 또는 그 이상 동안 진행될 수 있다. 배양 단계 후, 세포는 본원의 다른 곳에 기술된 바에 따라 다능성 세포를 유지하기에 적합한 조건 하에 유지될 수 있다.
일부 실시형태에 있어서, 배양 단계 후, 세포는 검출 가능하고/하거나 증가된 수준의 줄기 세포 마커를 발현할 수 있다. 줄기 세포 마커 및 이를 검출하는 방법은 본원의 다른 곳에 기술되어 있다. 일부 실시형태에 있어서, 줄기 세포 마커는 Oct3/4; Nanog; Rexl; Klf4; Sox2; Klf2; Esrr-beta; Tbx3; 및 Klf5로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
본 개시물의 실시형태의 설명은 망라적이거나 또는 개시된 정확한 형태로 본 개시물을 제한하려는 것으로 의도되지 않는다. 개시물의 특정 실시형태, 이에 대한 실시예가 예시적 목적을 위해 본원에 기술되어 있으나, 다양한 등가의 변형이 개시물의 범위 내에서 가능하고, 이는 관련 기술의 통상의 기술자에게 인식될 수 있다. 예를 들어, 방법 단계들 또는 기능들은 주어진 순서로 나타내지만, 대안적인 실시형태는 다른 순서로 기능들을 수행할 수 있고, 또는 기능들은 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본원에 제공된 개시물의 교시는 적합한 다른 과정 또는 방법에 적용될 수 있다. 본원에 기술된 다양한 실시형태는 추가의 실시형태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 개시물의 양태는, 필요한 경우, 본 개시물의 추가 실시형태를 제공하기 위해 참조 문헌들의 조성물, 기능 및 개념을 이용하도록 수정될 수 있다. 상세한 설명을 고려하여 본 개시물에 대해 이러한 및 다른 변화가 이루어질 수 있다.
상기 실시형태 중 임의의 것의 특정 구성요소는 다른 실시형태의 구성요소와 조합되거나 대체될 수 있다. 또한, 본 개시물의 특정 실시형태와 관련된 장점이 이러한 실시형태의 문맥에 기술되었지만, 다른 실시형태가 또한 이러한 장점을 나타낼 수 있고, 모든 실시형태가 본 개시물의 범위 내에 포함되는 이러한 장점을 필수적으로 나타내야 하는 것도 아니다.
여기 밝힌 모든 특허 및 다른 공개물은, 예를 들어 본 발명과 연관되어 사용될 수 있는 이러한 공개물에 기술된 방법론을, 기재 및 개시하려는 목적을 위해, 참조로 본원에 명확하게 포함된다. 이러한 공개물은 오직 본 출원의 출원일 이전에서의 그것의 공개 때문에 제공된다. 이와 관련하여 어느 것도 본 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 이러한 개시물에 선행하지 않는 것을 인정한 것으로 해석되어서는 안된다. 이러한 문헌의 내용에 대한 날짜 및 표현에 관한 모든 언급은 출원인이 이용가능한 정보에 기초하며, 이러한 문헌의 날짜 또는 내용의 정확도에 관하여 인정하는 것은 전혀 아니다.
본 발명은 제한 해석되어서는 안되는 하기 실시예에 의해 추가로 설명된다.
본원에 기재된 기술의 일부 실시형태는 하기 번호가 붙여진 문단 중 임의의 것에 따라 정의된다.
1. 세포에 스트레스를 가하는 단계를 포함하는, 다능성 세포의 생성 방법.
2. 문단 1에 있어서, 상기 다능성 세포는 외인성 유전자, 전사물, 단백질, 핵성분 또는 세포질의 도입 없이, 또는 세포 융합 없이 생성되는 방법.
3. 문단 1-2 중 어느 하나에 있어서, 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
4. 문단 1-3 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 조직의 일부로서 존재하지 않는 방법.
5. 문단 1-4 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 체세포, 줄기 세포, 전구 세포 또는 배아 세포인 방법.
6. 문단 1-5 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 분리된 세포인 방법.
7. 문단 1-6 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 세포의 이종 개체군에 존재하는 방법.
8. 문단 1-7 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 세포의 동종 개체군에 존재하는 방법.
9. 문단 1-8 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계는 줄기 세포 마커를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
10. 문단 9에 있어서, 상기 줄기 세포 마커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
Oct4; Nanog; E-cadherin, 및 SSEA4.
11. 문단 1-10 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성을 나타내는 세포를 선택하는 단계는 부착되지 않은 세포를 선택하는 단계를 포함하는 방법.
12. 문단 1-11 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 조직 또는 세포 배양에서의 비생리적 스트레스를 포함하는 방법.
13. 문단 1-12 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 세포의 하기로부터 선택되는 하나 이상의 환경적 자극에의 노출을 포함하는 방법: 외상, 기계적 자극, 화학적 노출, 초음파 자극, 산소-부족, 방사선, 극한 온도에의 노출, 분리, 분쇄, 신체적 스트레스, 고삼투압, 저삼투압, 막 손상, 독소, 극한 이온 농도, 활성 산소, UV 노출, 강한 가시광선, 필수 영양분의 부족, 또는 비생리적 산성 환경.
14. 문단 1-13 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 세포의 약 3.0 내지 약 6.8의 pH에의 노출을 포함하는 방법.
15. 문단 1-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 세포의 약 4.5 내지 약 6.0의 pH에의 노출을 포함하는 방법.
16. 문단 15에 있어서, 상기 스트레스는 세포의 약 5.4 내지 약 5.8의 pH에의 노출을 포함하는 방법.
17. 문단 12-16 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 2-3일간 노출되는 방법.
18. 문단 12-17 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 1 일 이하 동안 노출되는 방법.
19. 문단 12-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 1 시간 이하 동안 노출되는 방법.
20. 문단 12-19 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 약 30 분간 노출되는 방법.
21. 문단 13에 있어서, 상기 극한 온도에의 노출은 35 ℃ 미만 또는 42 ℃ 초과의 온도에 세포를 노출시키는 것을 포함하는 방법.
22. 문단 21에 있어서, 상기 극한 온도에의 노출은 어는점 이하의 온도에 세포를 노출시키는 것 또는 세포의 약 85 ℃ 이상의 온도에의 노출을 포함하는 방법.
23. 문단 13에 있어서, 상기 기계적 자극은 세포를 전단 응력 및/또는 고압에 노출시키는 것을 포함하는 방법.
24. 문단 23에 있어서, 상기 기계적 자극은 세포의 크기보다 더 작은 구멍을 갖는 하나 이상의 장치에 세포를 통과시키는 것을 포함하는 방법.
25. 문단 23에 있어서, 상기 기계적 자극은 점진적으로 더 작은 구멍을 갖는 다수의 장치에 세포를 통과시키는 것을 포함하는 방법.
26. 문단 1-25 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 세포의 증식이 가능하도록 상기 다능성 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
27. 문단 1-26 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 세포는 줄기 세포 마커를 발현하는 방법.
28. 문단 27에 있어서, 상기 줄기 세포 마커는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법:
Oct4; Nanog; E-cadherin, 및 SSEA4
29. 문단 1-28 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 포유동물 세포인 방법.
30. 문단 1-29 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 인간 세포인 방법.
31. 문단 1-30 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 성체 세포, 신생아 세포, 태아 세포, 양막 세포, 또는 제대혈 세포인 방법.
32. 문단 1-31 중 어느 하나에 있어서, 생체외에서 상기 다능성 세포를 유지하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
33. 문단 1-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포의 후성유전적 상태는 배아 줄기 세포의 후성유전적 상태와 배아 줄기 세포의 후성유전적 상태와 보다 근사하도록 개조되는 방법.
34. 문단 33에 있어서, 상기 후성유전적 상태는 메틸화 패턴을 포함하는 방법.
35. 문단 1-34 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 세포로부터 약 40% 이상의 세포질을 제거하는 것을 포함하는 방법.
36. 문단 35에 있어서, 약 50% 이상의 세포질이 세포로부터 제거되는 방법.
37. 문단 36에 있어서, 약 60% 이상의 세포질이 세포로부터 제거되는 방법.
38. 문단 37에 있어서, 약 60-80%의 세포질이 세포로부터 제거되는 방법.
39. 문단 37에 있어서, 약 80% 이상의 세포질이 세포로부터 제거되는 방법.
40. 문단 39에 있어서, 약 90% 이상의 세포질이 세포로부터 제거되는 방법.
41. 문단 1-40 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 세포로부터 약 40% 이상의 미토콘드리아를 제거하는 것을 포함하는 방법.
42. 문단 41에 있어서, 세포질의 일부의 제거는 세포질로부터 약 50% 이상의 미토콘드리아를 제거하는 방법.
43. 문단 42에 있어서, 세포질 또는 미토콘드리아의 제거는 세포질로부터 약 50%-90%의 미토콘드리아를 제거하는 방법.
44. 문단 42에 있어서, 세포질 또는 미토콘드리아의 제거는 세포질로부터 90% 초과의 미토콘드리아를 제거하는 방법.
45. 문단 1-44 중 어느 하나에 있어서, 상기 스트레스는 스트레스에 노출된 세포들 중 약 10% 이상의 세포막을 파괴하기에 충분한 방법.
46. 문단 1 내지 45 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 다능성 세포를 후보 물질에 접촉시키는 단계를 포함하는 분석법.
47. 문단 46에 있어서, 상기 다능성 세포의 생존력, 분화도, 증식력 중 어느 하나 이상에 영향을 주는 물질을 확인하기 위해 사용되는 분석법.
48. 대상체에 대한 세포 치료의 방법에서의 문단 1 내지 45 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 다능성 세포의 용도.
49. 하기를 포함하는, 대상체에 투여되는 세포 치료에 적합한 세포 또는 조직의 제조 방법:
문단 1 내지 45 중 어느 하나에 따라 세포로부터 다능성 세포를 생성하는 단계;
상기 세포는 자가 세포 또는 HLA-매칭된 동종이형 세포임.
50. 문단 49에 있어서, 상기 대상체에 상기 세포 또는 조직을 투여하기 전에 미리 정해진 세포 계통에 따라 상기 다능성 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
51. 문단 1 내지 45 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 세포로부터 생성되는 다능성 세포를 포함하는 조성물.
52. 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 다능성 줄기 세포의 제조 방법.
53. 문단 52에 있어서, 상기 세포는 ACTH를 포함하는 LIF 배지에서 배양되는 방법.
54. 문단 52 또는 53에 있어서, 상기 ACTH는 약 0.1 μΜ 내지 약 100 μΜ의 농도로 존재하는 방법.
55. 문단 52-54 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 문단 1-45 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 세포인 방법.
56. 문단 52-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 전능성 세포인 방법.
57. 문단 52-56 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 3 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
58. 문단 52-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 5 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
59. 문단 52-58 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 7 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
60. 문단 52-59 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 단계 이후, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 수준의 줄기 세포 마커를 발현하는 방법:
Oct3/4; Nanog; Rexl; Klf4; Sox2; Klf2; Esrr-beta; Tbx3; 및 Klf5.
61. 부신피질자극 호르몬 (ACTH), 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 세포를 배양시키는 단계를 포함하는, 다능성 세포의 자기재생력을 증가시키는 방법.
62. 문단 61에 있어서, 상기 세포는 ACTH를 포함하는 LIF 배지에서 배양되는 방법.
63. 문단 61-62 중 어느 하나에 있어서, 상기 ACTH는 약 0.1 μΜ 내지 약 100 μΜ의 농도로 존재하는 방법.
64. 문단 61-63 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 문단 1-45 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 세포인 방법.
65. 문단 61-64 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 전능성 세포인 방법.
66. 문단 61-65 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 3 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
67. 문단 61-66 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 5 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
68. 문단 61-68 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포는 7 일 이상 동안 ACTH, 2i 또는 3i 배지의 존재 하에 배양되는 방법.
69. 문단 61-68 중 어느 하나에 있어서, 배양 단계 이후, 상기 세포는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 검출 가능한 수준의 줄기 세포 마커를 발현하는 방법:
Oct3/4; Nanog; Rexl; Klf4; Sox2; Klf2; Esrr-beta; Tbx3; 및 Klf5.
70. 하기를 포함하는, 세포 치료를 필요로 하는 대상체에서의 자가 세포 치료의 방법
a. 문단 1 내지 45 중 어느 하나에 따라 세포로부터 다능성 세포를 생성하는 단계, 상기 세포는 상기 대상체로부터 수득됨, 및
b. 상기 대상체에 상기 다능성 세포 또는 그 분화된 자손을 포함하는 조성물을 투여하는 단계.
71. 문단 70에 있어서, 상기 대상체에 상기 조성물을 투여하기 전에 미리 정해진 세포 계통에 따라 상기 다능성 세포를 분화시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
72. FGF4의 존재 하에 문단 1-45 중 어느 하나의 방법에 의해 생성된 다능성 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 태반 세포로 분화될 수 있는 다능성 세포의 제조 방법.
73. 문단 72에 있어서, FGF4의 농도는 1 nM 내지 1 μΜ인 방법.
74. 문단 72 또는 73에 있어서, 상기 다능성 세포는 배아 줄기 세포로 분화될 수 있는 방법.
실시예
실시예 1
모든 생물체는 원초적인 생존 본능을 가진다. 식물이 유의미한 외부 스트레스를 받은 경우, 이들은 세포의 탈분화를 야기하고 손상된 부분 또는 전체 생물체의 재생을 가능하게 하는 생존 메카니즘을 활성화시킨다. 이러한 메카니즘은 극한 환경 변화를 견디기 위해 더 하등 생물체에 필요로 되는 것이나, 포유동물에서는 아직 문서로 뒷받침되지 않았다.
본 발명자들은 식물 및 더 하등 생물체에서 보이는 것과 유사하게, 신체적 스트레스가 성숙한 포유동물 세포를 줄기 세포 상태로 복귀시킬 수 있다는 것을 가정하였다. 이러한 가설을 조사하기 위해, 7 개의 성체 체세포 조직으로부터 얻은 성숙한 세포를 연구하였다. 우선 어떤 신체적 스트레스가 성숙한 세포를 덜 성숙한 상태로 변경하는데에 가장 효과적인지에 초점을 두고, Oct4-GFP 마우스로부터 얻은 CD45 양성 림프구를 연구하였다. 이들 마우스로부터의 세포는 줄기세포 특이적 Oct4 프로모터가 활성화될 때 줄기 세포 표현형으로의 복귀(reversion)의 판독(readout)을 제공한다. 성숙한, 완전하게 분화된 세포를 다수의 유의미한 외부 자극에 노출시켰다.
예를 들어, 강한 화학적 스트레스를 제공하기 위해 CD45 양성 림프구를 저 pH 용액에 노출시켰다. 노출 3 일 내에, GFP 발현 세포가 관찰되었고, 5 일 이내에, GFP 발현 세포로 이루어진 구형의 군체가 관찰되었다. 이러한 방법으로 생성된 세포는 본 실시예에서 스트레스 개조된 줄기 세포(Stress Altered Stem Cell) (SASC 또는 SAC)로 지칭된다. SAC는 또한 회춘(rejuvenated) 줄기 세포 (RSC) 또는 동물 칼루스 세포(animal callus cell) (ACC)로 지칭될 수 있다. SAC는 일반적으로 배아 줄기 세포와 연관된 몇몇 마커들을 발현하였다. SAC은 ES 세포와 동등한 분화 잠재력을 나타내었고, 키메라 마우스의 생성에 기여하였으며, 4N 배반포에 주입되는 경우 온전한 태아를 생성할 수 있었다. 이러한 방식으로 생성된 세포는 초기에 낮은 미토콘드리아 활성 및 손상 방어 메카니즘에 기초한 세포의 유도와 일반적으로 관련된 다른 조건들을 보여주었다. 이들은 이후 Oct4 및 Nanog 유전자 프로모터의 탈메틸화를 나타내었다. 스트레스 개조된 세포의 리프로그래밍은 간엽-상피 전이(mesenchymal-epithelial transition)를 통해 유도되는 것으로 나타났다. 상기 발견은 손상 (외부 자극)에 대응하는 식물 칼루스에 함유된 세포의 설명과 일치한다. 식물 칼루스는, 세포의, 클론체를 형성할 수 있는, 다능성 식물 줄기 세포로의 스트레스 유도 전환으로부터 형성된다. 유의미한 외부 자극에 대응하여 성숙한 완전히 분화된 체세포 포유동물 세포로부터 생성된, 이러한 구형 군체(spherical colony)는 본원에서 동물 칼루스(Animal Callus)로 지칭되며, 이러한 군체 또는 칼루스에 함유된 스트레스 개조 세포는 "동물 칼루스 세포" (ACC) 또는 SAC로 지칭된다.
이와 같이, 유의미한 물리적 및 화학적 스트레스는 정상인 성숙한 성체 세포가 배발생(embryogenesis)을 가능하게 하는 다능성 줄기 세포로 리프로그래밍되도록 야기하였다. 이론에 구속됨 없이, 리프로그래밍의 메카니즘은 손상에 대한 대응에서 일반적으로 나타나는 세포 생존 및 복구 과정의 유도를 포함하는 것으로 나타난다. 포유동물 세포는 유의미한 스트레스 외부 자극에 대응하여 리프로그래밍된 상태로 복귀되는, 식물의 것과 매우 유사한 생존 메카니즘을 가짐이 본원에 의해 입증된다.
보고된 바에 따르면 다양한 유형의 세포가 특정 유전자의 유도 또는 강제 발현을 통해 다능성 줄기 세포 상태로 리프로그래밍되었다고 한다1-5. 또한 화상, 화학적 손상, 외상 및 방사선과 같은 자극물에 대한 노출의 결과로서의 세포에 대한 손상은 정상 세포를 암 세포가 되도록 개조할 수 있다고 여겨진다.
서론
모든 생물체는 그들 자신을 환경에 대해 적응시켜 그들의 신체를 재생시킴으로써 스트레스 자극과 관련된 손상에 견디는 공통된 본능을 가지는 것으로 나타난다. 식물의 경우, 개체발생(ontogenesis)이 접합자뿐만 아니라 종말(terminally)분화된 세포 및 미성숙 화분에서도 관찰된다. 척추동물의 경우, 영원류(newts)는 이들의 팔을 포함하여 몇몇의 해부학적 구조 및 기관을 재생시킬 수 있다1. 식물 및 영원류 모두에서 보이는 현저한 재생 능력은, 전에 완전하게 분화된 체세포의 세포 탈분화를 야기하는, 외부 자극에 의해 유도된다는 점이 특히 주목된다. 생명의 초기 형태로부터 수십억년이 지나고 상이한 생명체들이 독특한 방식으로 진화되는 동안, 이러한 생존 본능은 근대 생물체의 동일 조상으로부터 유전될 수 있다. 종말 분화된 포유동물 세포는 일반적으로 분화 과정을 반전시킬 수 없는 것으로 여겨짐에도, 포유동물은 급격한 환경 변화에 대응하여 죽음을 피하기 위한, 이전에 인정받지 못한 프로그램을 보유할 수 있다.
식물 칼루스, 증식 세포 매스는 식물 호르몬2에 의해 배양시 자극될 수 있는, 상처(wounding)와 같은 외부 자극에 대응하여 형성되었다. 칼루스는, 칼루스 세포로 지칭되는 리프로그래밍된 체세포를 함유하고, 그것의 각각은 완전체를 복제에 의해 재생할 수 있다. 칼루스 세포는 식물에 내재되어 있지 않으나, 외부 자극에 대응하여 체세포로부터 생성된다. 최근의 연구는 포유동물 체세포가 유전자 유도와 같은 외인성 과정에 의해 리프로그래밍될 수 있음을 입증하였음에도 불구하고3-7, 식물과 유사한 방식으로, 외부 물리적 및 또는 화학적 자극에 대응한 포유동물 체세포의 리프로그래밍은 보고된 바가 없다. 흥미롭게도, 화상, 화학적 손상, 외상 및 방사선을 포함하는, 자극물에의 노출과 같은 극한 외부 자극은 정상 체세포를 암세포가 되도록 변경할 수 있다고 여겨진다. 이러한 시험은 외부 자극이 포유동물 세포 변화를 초래함을 나타내는 것으로 보인다.
본 연구에서, 포유동물 세포는 식물과 동일한 방식으로, 유의미한 외부 스트레스에의 노출에 견디는 메카니즘을 보유하는 것으로 가정하였다. 이 보고는 유의미한 물리적 및 화학적 자극을 가함이, 다양한 조직으로부터 구한, 성숙한 완전하게 분화된 포유동물 체세포의 리프로그래밍을 야기할 수 있고, 이러한 스트레스 개조된 세포는 클론체를 재생할 수 있는, "동물 칼루스 세포"를 함유하는 동물 칼루스를 형성할 수 있다는 증거를 제시한다.
결과
유의미한 물리적 및 화학적 자극을 성숙한 체세포에 가하였다. 배아 전사 인자 Oct4가 세포의 다능성 상태의 조절(regulation)에 중요한 것으로 여겨지기 때문에, 초기 전략은 어떤 외부 자극이 가장 성숙한 세포를 Oct4를 발현하도록 리프로그래밍시키는지를 확인하는 것이었다. CD45 양성 조혈모 계통 세포가 미분화된 세포로 오염되는 것을 피하기 위해 우선 연구되었다. Oct4-GFP (GOF) 마우스8로부터 얻은 지라로부터 채취한 CD45 양성 세포를 다양한 유의미한 물리적 및 화학적 자극에 노출시켰다. 상기 노출은 하기의 것을 포함한다: 삼투압 처리, 유의미한 기계적 분쇄에 의한 처리, 저 pH에의 노출, 스트렙톨리신 O (SLO)를 사용한 세포막 손상을 가하는 것, 저영양에의 노출 및 저산소증 및 고 Ca 농도에의 노출. 다음으로, GFP 발현 세포를 확인하고, 분류하고, FACS를 사용하여 수집하였다. Oct4의 유전자 발현은 R-T PCR에 의해 확인되었다. 가해진 자극 각각에의 노출은 성숙한 세포가 어느 정도로 GFP를 발현하도록 리프로그래밍되는 것을 초래하였다 (도 5A). 성숙한 세포의 저 pH의 화학적 스트레스 및 유의미한 기계적 분쇄의 물리적 스트레스에 대한 노출은 성숙한 세포가 Oct4를 발현하도록 개조하는데 가장 효과적인 처리임을 나타내었다. Oct4 발현 세포로의 전환을 유도하기 위한 최적 pH를 결정하기 위해, CD45 양성 세포를 pH 4.0 내지 pH 6.8로 산도가 변화하는 용액에 노출시켰다. 산성 용액에의 노출 후 3일째에, 세포의 GFP 발현을 FACS를 사용하여 분석하였다. pH 5.4-5.6의 산성 용액이 세포를 GFP를 발현하도록 가장 유효하게 개조하였다 (도 5B). 그 결과, 나머지 연구를 위한 스트레스 처리의 선택은 저 pH에의 노출에 초점을 두었다.
스트레스 개조 Oct4 발현 세포를 유지하기 위한 최적 배양 조건을 이후 결정하였다. ES 수립 배지, 3i9 및 ACTH10, ES 배양 조건, ES-LIF11, 배아 신경 줄기 세포 배양 조건, B27-LIF12, 및 EpiSC 배양 조건13을 포함하는 몇몇의 이전에 기술된 배지가 연구되었다.
세포를 각각의 배지에 플레이팅하고, GFP 발현 군체를 계수하였다 (도 5C). 배지 B27-LIF는 GFP 발현 구형 군체를 생성하는데 가장 효과적인 것으로 나타났다. 따라서 B27-LIF 배지를 처리된 세포의 배양을 위해 이용하였다.
스트레스 처리된 CD45 양성 세포를 B27-LIF 배지에서 배양하고, 5일 내에, GFP 발현 구형 군체를 관찰하였으나, 비처리된 대조군에서는 어떠한 GFP 발현 군체도 발견되지 않았다 (도 1A). 구형 군체는 처음 7 일간 직경에 있어서 대략 70 ㎛로 성장하였고, 구형 군체는 이 배양 조건에서 추가 7 일간 유지될 수 있었다. 군체의 형태는 약간 찌그러졌고(baroque), 구체라기보다 식물학에서 보이는 칼루스에 대한 형태와 보다 유사하게 나타났다. 스트레스 처리에 의해 생성된 세포 군체를 이에 따라 동물 칼루스 (AC)라고 지칭하였다. 배양된 세포를 분리하였고 개체군 분석을 이후 FACS를 사용하여 수행하였다. 상기 분석은 특정의 유의미한 자극을 가하는 것이, CD45 양성 세포 개체군에서, 이전에 존재하지 않았던, 이제 동물 칼루스 세포 (ACC)로 지칭되는 스트레스 개조된 세포의 생성을 초래하는 것을 나타내었다 (도 1B). 스트레스 처리 결과로서 CD45 양성 세포의 표현형 변화가 단일 세포 수준에서 관찰되었다. CD45 양성 세포는 GFP를 발현하지 않은 반면, ACC는 CD45의 감소된 발현과 연관되는 GFP를 발현하였다 (데이터를 나타내지 않음). 단일 세포의 조사는 처리된 세포의 세포 크기가 비처리된 세포보다 작음을 나타내었다. 따라서, ACC 개체군의 세포 크기를 FACS로 분석하였다. ACC의 세포 크기는 상당히 작았고, 세포의 80%는 직경에 있어서 8 ㎛ 보다 작았다 (도 1C).
CD45 감소 및 Oct4 발현과 관련된 경시적 표현형 변화를 조사하기 위해, 스트레스 처리된 CD45 양성 세포를 1 일, 3 일 및 7 일째에서 분석하였다. 1 일째, 대부분의 세포가 여전히 Oct4가 아니라 CD45를 발현하였다. 3 일째, 마커 발현은 CD45 음성 세포 또는 CD45 음성/Oct4양성 (dim) 세포를 나타내는 것으로 변화하였다. 7 일째, CD45 발현은 사라졌고, Oct4 발현 세포가 관찰되었다 (도 1D). 특히, 배양 첫 7 일간, PI 양성 세포 (사멸 세포)의 수는 점차적으로 증가하였고 (데이터를 나타내지 않음), 이는 스트레스 처리 및 배양 조건이 세포의 특성을 점차적으로 변화시켰으며 Oct4를 발현한 성공적으로 개조된 세포에 대해 선택된 것을 시사한다.
ACC의 특징 규명. 외부 자극에의 노출의 결과로서 체세포의 리프로그래밍을 확인하기 위해, ACC의 조기 배발생 마커 유전자 발현을 조사하였다. 초기 배발생의 양성 대조군으로서, ES 세포를 이후 실험에서 이용하였다. 마커 발현 및 DNA 메틸화는 하기와 같이 특징지워졌다: 7 일째에서의 면역형광 염색은 ACC를 함유하는 구형 군체가 다능성 세포 마커, E-cadherin 항원, Nanog, SSEA-1, PCAM-1, 및 AP를 균일하게 발현하고, Oct4-GFP에 대해 양성인 것을 나타내었다 (데이터를 나타내지 않음). 유전자 발현 분석은 1차 CD45 양성 세포가 아니라 ACC 및 ES 세포가 비교가능한 수준의 Oct4, Nanog, Sox2, Ecatl, Esgl, Daxl, Fgf5, Klf4 및 Rexl 유전자를 발현한 것을 나타내었다 (도 2A). ACC에서의 ES 특이적 유전자의 유전자 발현은 7 일째 피크에 도달하였다 (도 2A). 바이설파이트 시퀀싱(Bisulfite sequencing)을 ACC에서의 Oct4 및 Nanog 유전자 프로모터의 메틸화 상태를 결정하기 위해 수행하였다. 네이티브 림프구(Native lymphocyte) 및 배양된 림프구 대조군 샘플은 두 프로모터에서 폭넓은 메틸화를 나타내었고, 반면 ACC는 ES 세포에서 보이는 것과 유사하게 이러한 구간의 넓은 탈메틸화를 나타내었다 (도 2B). 따라서, 포유동물 체세포가 외부 스트레스에 의해 리프로그래밍된다는 것이 입증되었다.
상기 Oct4 유전자 발현이 GOF 마우스에서 뿐만 아니라 야생형 마우스에서의 성숙한 세포의 스트레스 처리에 기인하였다는 것을 확인하기 위하여, CD45 양성 림프구를 ICR 마우스로부터 얻은 지라로부터 채취하였다. 림프구를 이후 스트레스 처리에 노출시켰고 FACS를 사용하여 7 일째까지 시간에 따라 분석하였다. SSEA-1 양성/E-cadherin 양성 세포 개체군은 스트레스 처리된 군집에서 나타났고, 한편 SSEA-1 /E-cadherin 발현은 비-스트레스 처리된 대조군에서 관찰되지 않았다 (도 6A). 이 이중 양성 세포는 Oct4 유전자 발현을 발현시켰고, 이는 R-T PCR에 의해 확인되었다 (도 6B). 이러한 결과는 스트레스 처리의 결과로서, ACC, Oct4 양성 및 다능성 마커 발현 세포가 마우스 종에 관계없이 CD45 양성 세포로부터 생성되었음을 입증한다.
이러한 결과는 성숙한 완전하게 분화된 성체 체세포가 스트레스 처리의 결과로서 "줄기세포성(stemness)"으로 전환되는 것을 의미한다.
ACC의 줄기세포성을 평가하기 위해, 그것의 자기재생력 및 그것의 분화력을 조사하였다. 그것의 자기재생력을 연구하기 위해, 이전에 성숙한 CD45 양성 림프구로부터 유래된 ACC 군체를 단일 세포로 분리하고, 복제에 의해 유래된 개체군을 생성하기 위해 96 웰에 웰당 1세포로 플레이팅했다. 플레이팅 후 10 일째에, 구형 군체가 96 웰 중 4 개에서 나타났다. ACC의 분할 시간(dividing time)은 웰 간에 상이하였다. 일부는 12-16h에서 분할되었고 나머지는 30-34h에서 분할되었다. ACC를 5 회 이상 패시지시켰고, Cct4의 계속 발현이 관찰되었다. 결과적으로, ACC는 자기재생에 대한 잠재력, 및 생체외에서 모든 세 개의 배엽으로부터의 세포로 분화되는 잠재력을 입증하였다.
성숙한 GOF 림프구로부터 유래된 AC를 다시 단일 세포로 분리하였고, GFP가 발현된 세포의 개체군만을 함유하도록 분류하고, 이후 분화 배지에서 배양하였다. 플레이팅 후 14-21 일째에서, 세포는 외배엽 마커, βⅢ-튜불린 및 GFAP, 중배엽 마커, α-평활근 액틴, 및 내배엽 마커, α-태아단백질 및 시토케라틴 7을 발현하였다 (데이터를 나타내지 않음). 이와 같이, ACC는 생체외에서 세 개의 배엽을 나타내는 세포로 분화되었다.
다양한 성체 조직으로부터 얻은 성숙한 체세포의 스트레스 개조. ACC가 성숙한 림프구뿐만 아니라 다른 유형의 체세포를 생성할 수 있는지를 조사하기 위해, 뇌, 피부, 근육, 지방, 골수, 폐 및 간을 Oct4-GFP (GOF) 마우스8로부터 채취하였다. 세포를 조직 샘플로부터 분리하고, 단일 세포로 분리하고, 상이한 물리적 및/또는 화학적 스트레스 조건으로 처리하였다. 세포를 개조하는 공정의 효능은 세포의 공급원 및 세포가 노출되었던 스트레스 조건(들) 모두의 함수에 따라 상이하였다 (도 7A). 성숙한 세포가 Oct4를 발현하도록 개조하는 스트레스의 능력은 세포의 유래(derivation of cell)에 따라 상이하였지만, 스트레스는 세포가 모든 세 개의 배엽으로부터 유래된 성숙한 세포에서 어느 정도로 Oct4를 발현하도록 개조할 수 있었다 (도 7A). 임의의 성숙한 조직으로부터 유래된 ACC 군체는 다능성 마커, E-cadherin, Nanog, PCAM-1 및 AP (데이터를 나타내지 않음), 및 ES 특이적 마커 유전자를 발현하였다 (도 7B). 조직의 공급원 및 배엽의 유래에도 불구하고, 유의미한 물리적 및 화학적 스트레스는 성숙한 체세포를 줄기 세포 상태로 되돌아가도록 개조하였다.
ACC 생성의 초기 단계에서의 세포 변형. 이러한 결과는 강한 물리적 및 화학적 자극이 체세포의 리프로그래밍을 초래한다는 것을 입증한다. 스트레스 처리된 림프구는 5 일 이내에 AC를 형성하는 것으로 관찰되었다. 분자 이벤트(molecular event)의 급격한 변화가 스트레스 노출의 결과로서 발생된다는 것을 가정하였다. 따라서 연구는 자극에의 노출 후 첫 7 일간인 리프로그래밍의 초기 단계에 초점을 두었다.
ACC는 유의미한 스트레스 노출 이후 생존하였기 때문에, 세포 손상을 복구하도록 통상 가동되는 생존 메카니즘이 ACC 생성 과정에서 유도된 것으로 추측하였다. 우선 스트레스에 대한 세포 반응과 DNA 복구에 관련된 다수의 후보 유전자의 발현14을 1 일, 3 일 및 7 일째 네이티브 CD45 양성 세포 및 스트레스-처리된 CD45 양성 세포에서 비교하였다. 세포 반응 유전자 발현은 1 일째 이미 관찰되었고, 이러한 유전자는 ACC 생성 세포 및 다른 세포의 혼합물이 분석되었을 때 7 일에 걸쳐 상향-조절되었다(up-regulated) (도 8). 세포 반응 유전자의 상향-조절은 ACC 생성과 상관되기 때문에, 3 일 및 7 일째에서 ACC를 분류하였고, 유전자 발현을 분석하였다. Hif3a를 제외하고, 모든 후보 유전자가 ACC 생성 과정에서 다양한 정도로 상향-조절되었다 (도 3A). 4 개의 열충격 유전자(heat shock genes) 및 하나의 DNA 복구 유전자가 ACC 생성 과정에서 상향-조절되는 것으로 발견되었다. 또한, 7 개의 상향-조절 유전자가 세포 산화환원 상태(cellular redox state)의 조절에 직접 관련되는 것으로 알려져 있다. 이러한 결과는 자기-복구 또는 자기-방어 능력이 ACC 생성 과정에서 유도되었음을 시사한다.
ACC가 세포 산화환원 관련 유전자의 상향-조절을 나타내기 때문에, ACC의 미토콘드리아의 기능을 이후 조사하였다. 미토콘드리아는 진핵 세포에서 산소를 사용하여 산화환원 반응을 통한 대다수의 ATP의 생성을 책임지는 세포 기관이다. ACC 구형 군체의 GFP 발현은, 군체가 패시지 없이 배양된 경우, 7 일 이후 주변에 위치한 세포로부터 점차적으로 감소되었다. ACC는 10 일째에 GFP 발현 중심 세포 및 비-GFP 분화 주변 세포를 함유하였다 (데이터를 나타내지 않음). 미토콘드리아 모폴로지를 미토콘드리아-특이적 염료, MitoTracker Red로 염색시켜 ACC 및 분화된 세포에서 평가하였다. ACC 미토콘드리아는 반점이 있고 구형인 핵-주위 클러스터로서 관찰되었고, 한편 분화된 세포는 필라멘트 형태이고 세포질에 넓게-퍼진 다수의 미토콘드리아를 함유하고 있었다. ACC의 ATP 생성은 네이티브 CD45 양성 세포에서의 것보다 더 적었다 (도 3B). 또한, ACC의 반응성 산소종 (ROS) 생성은 네이티브 CD45 양성 세포에서의 것보다 더 적었다 (도 3C). 마지막으로 mtDNA 복제와 관련된 핵심 인자를 평가하였고; 이는 미토콘드리아성 전사 인자 A (Tfam), 미토콘드리아-특이적 DNA 폴리머라아제 감마 (Polg) 및 그것의 부속 유닛 (Polg2)이었다. ACC에서의 Tfam, Polg, 및 Polg2의 유전자 발현은 분화된 세포에서의 것보다 더 낮았다 (도 3D). 결과적으로, ACC는 소수의 미토콘드리아를 함유하고, ACC의 미토콘드리아 활성은 분화된 세포의 것보다 낮았다. 이러한 결과는 ACC가 심한 스트레스 반응 후 생존하기 위해 분화된 세포와 구별되는 대사 시스템을 얻은 것을 의미한다.
ACC의 발달 잠재력. 마지막으로, ACC가 식물 칼루스 세포의 것과 유사한 발달 잠재력(developmental potential)을 가지는 지를 평가하였다. 발달 잠재력에 대한 초기 시험으로서, 면역결핍 (SCID) 마우스에 피하로 이식된 ACC를 연구하였다. 이식 후 6 주째에, ACC가 모든 세 개의 배엽을 나타내는 조직을 생성하였다 (데이터를 나타내지 않음).
ACC는 생체내 및 생체외 모든 세 개의 배엽을 나타내는 세포로 분화되었다. 따라서, ACC의 키메라 기여 잠재력(chimera contribution potency)을 평가하였다. 키메라 생성 연구에 사용하기 위한 ACC를 Fl GFP (C57BL/6GFP×DBA/2 또는 129/SvGFP×C57BL/6GFP) 또는 GOF로부터 유래된 CD45 양성 세포를 사용하여 제조하였다. 유전자 발현 분석은 7 일째, ACC가 최고 수준의 다능성 마커 유전자를 발현한 것을 나타내었기 때문에, 7 일째 ACC를 키메라 마우스 생성 연구에 이용하였다. 초기에, 키메라 생성에 대한 종래의 방법을 이용하였다. AC를 트립신 처리를 통해 단일 세포로 분리하였다. ACC를 이후 배반포에 주입하였다 (도 4A). 이러한 방법을 사용하여, 분리된 ACC의 키메라 기여도는 상당히 낮았다 (표 1). 이와 같이, 세포 손상15을 종종 야기하는, 선행된 트립신 처리가 없는 ACC를 배반포에 주입하였다. 현미경 하에서 마이크로나이프를 사용하여 AC를 작은 클러스터로 절단하였다. AC의 작은 클러스터를 이후 배반포에 주입하였다 (도 4A). 이러한 방법을 사용하여, ACC의 키메라 기여도는 급격하게 증가하였다 (데이터를 나타내지 않음). ACC로 생성된 키메라 마우스는 건강하게 성장하였고 (데이터를 나타내지 않음) 생식선 전이가 관찰되었다. 각각의 조직의 키메라 기여율을 FACS에 의해 분석하였다. 상기 결과는 림프구로부터 유래된 ACC는 모든 조직에 기여하는 것을 나타내었다 (도 4B).
상기에서 입증된 바와 같이, ACC는 모든 세 개의 배엽으로부터 유래된 다양한 세포로부터 생성될 수 있다 (도 7A-7B). 다양한 조직으로부터 유래된 ACC가 상이한 분화 경향을 가지는지를 조사하기 위해, ACC를 F1GFP 마우스로부터 유래된 다양한 조직으로부터 생성하였고,ICR 배반포에 주입하였다. 이후, FACS를 사용하여, 생성된 키메라 마우스에서의 각각의 조직의 기여율을 분석하였다. 임의의 조직으로부터 유래된 ACC는 키메라 마우스 생성에 기여하는 것을 발견하였다 (도 9). 또한, 피부, 뇌, 근육, 지방, 간 및 폐에 대한 기여율을 다양한 조직으로부터 유래된 ACC를 사용하여 생성된 키메라 마우스에서 분석하였다. 임의의 조직으로부터 유래된 ACC는 모든 세 개의 배엽을 대표하는 조직을 생성하는데 기여하였고, 어떠한 분화 경향도 관찰되지 않았다 (도 9).
4N 호스트 배반포에 다능성 세포의 주입과 관련된, 4배체 상보성(tetraploid complementation)에 의한 마우스의 생성은 발달 잠재력에 대한 가장 철저한 시험을 나타내는데, 이는 생성된 배아가 단지 주입된 도너 세포로부터만 유래되기 때문이다16. ACC를 DBA×B6GFP Fl 마우스 또는 129/SvGFP×B6GFP Fl으로부터 유래된 림프구로부터 생성하였다. ACC는 4N 배반포에 주입 후 (중간) 말기-재태((mid) late-gastration) '모든 ACC 배아(all ACC embryos)'의 생성을 초래하였다. 유전자형 분석은 '모든 ACC 배아'가 ACC를 생성하는데 이용되는 종(strain)의 특이적 유전자를 가진 것을 입증하였다. 따라서, ACC는 식물 칼루스 세포처럼 클론체를 생성하는 잠재력을 가졌다.
논의
포유동물 체세포는 식물과 매우 유사한 경향으로, 유의미한 외부 자극에의 노출의 결과로서 동물 칼루스 (AC) 형성에 대한 능력을 나타낸다. 이들 칼루스 (동물 칼루스 세포, ACC)에 함유된 세포는 키메라 마우스를 생성하고 ACC로부터 생성된 세포만으로 이루어진 신생 배아를 생성하는 능력을 가진다. 상기 기술된 결과는 포유동물 체세포가 외부 자극에 의해 세 개의 배엽 중 임의의 것으로 분화되는 능력을 회복하는 것을 입증한다. 이는 체세포가 이전에 믿어지고 있던 것보다 더 큰 가소성(plasticity)을 가지는 것을 의미한다. 또한, 본 연구는 유전자 유도 또는 외래 단백질의 도입 없이 리프로그래밍되는 체세포의 잠재력을 증명하고, 성체 줄기 세포의 잠재력에 대한 새로운 이해를 제공하며; 이는 줄기 세포 생물학의 해석에서의 중요한 사건을 나타낸다.
물질 및 방법
조직 채취 및 세포 배양. 성숙한 림프구 분리를 위해, GOF 마우스 또는 ICR 마우스로부터 유래된 지라를 가위로 잘게 자르고 파스퇴르 피펫으로 기계적으로 분리하였다. 분리된 지라를 세포 스트레이너 (BD Biosciences, San Jose)를 통해 물기를 걸렀다(strained). 수집된 세포를 DMEM 배지에 재-현탁시키고 동일 부피의 림포라이트 (CEDARLANE®, Ontario, Canada)를 첨가하고, 이후 15 분간 1000g에서 원심분리하였다. 림프구 층을 수거하고 CD45 항체 (ab25603, abcam, Cambridge, MA)를 얻었다. CD45 양성 세포를 FACS Aria (BD Biosciences)로 분류하였다. 이후, CD45 양성 세포를 스트레스 처리 (15 분간 pH5.5 용액)로 처리하고 1000U LIF (Sigma) 및 10 ng/ml FGF 2 (Sigma)가 보충된 B27 배지에 플레이팅했다.
외부 자극 - 스트레스 처리에의 노출. 성숙한 세포에 기계적 스트레스를 주기 위해, 파스퇴르 피펫을 가열하고 이후 직경에 있어 대략 50 미크론의 루멘을 생성하기 위해 잡아당긴 후 부러뜨렸다. 이후 성숙한 체세포를 이 피펫을 통해 20 분간 분쇄하였고, 7 일간 배양하였다. 성숙한 세포에 저산소 자극을 제공하기 위해, 세포를 5% 산소 인큐베이터에서 3 주 동안 배양하였다. 3 주 동안 기초 배지에서 세포를 배양시킴으로써 저영양 자극을 성숙한 세포에 제공하였다. 성숙한 세포를 생리적 스트레스에 노출시키기 위해, 이들을 저 pH (pH5.5) 용액으로 처리하고, 7 일간 배양하였다. 또한, 세포에 보다 심한 손상을 주었다. 성숙한 세포막에 구멍을 형성하기 위해, 세포를 SLO (Streptolysin O)로 처리하였다.
SLO-처리 세포는, 37 ℃에서 50 분간 10 μg/mL SLO를 함유하는 HBSS에서 배양시킨 후 7 일간 SLO 없는 배지에서 배양하였다. 저-영양 스트레스에 노출된 세포는, 기본 배지에서 2 내지 3 주 동안 배양하였다. "ATP" 스트레스에 노출된 세포는, 37 ℃에서 15 분간 2.4 mM ATP를 함유하는 HBSS에서 배양시킨 후 7 일간 배지에서 배양하였다. "Ca" 스트레스에 노출된 세포는, 2 주 동안 2 mM CaCl2를 함유한 배지에서 배양하였다.
바이설파이트 시퀀스 (Bisulfite sequence). GOF 마우스로부터 얻은 세포를 단일 세포로 분리하였다. GFP 양성 세포를 FACS Aria를 사용하여 수집하였다. 게놈 DNA를 ACC로부터 추출하여 연구하였다. DNA의 바이설파이트 처리를 제조자의 지시에 따라 CpGenome DNA Modification 키트 (Chemicon, Temecula, CA, http://www.chemicon.com)를 사용하여 수행하였다. 생성된 변형 DNA를 2 개의 정방향 (F) 프라이머 및 1 개의 역방향 (R) 프라이머를 사용하여 네스티드 중합효소 연쇄 반응 PCR에 의해 증폭시켰다: Oct4 (Fl, GTTGTTTTGTTTTGGTTTTGGATAT (서열번호1 ; F2,
ATGGGTTGAAATATTGGGTTTATTTA (서열번호2);
R,CCACCCTCTAACCTTAACCTCTAAC (서열번호3)). 및 Nanog (Fl,
GAGGATGTTTTTTAAGTTTTTTTT (서열번호:4); F2,
AATGTTTATGGTGGATTTTGTAGGT (서열번호5); R,
CCCACACTCATATCAATATAATAAC (서열번호:6)). PCR을 TaKaRa Ex Taq Hot Start Version (RR030A)을 사용하여 수행하였다. DNA 시퀀싱을 GRAS (The Genome Resource and Analysis Unit)로 보조하여 M13 프라이머를 사용하여 수행하였다.
면역조직화학. 배양된 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하고 1% BSA 용액 (Life Technology, Tokyo, Japan)으로 차단하기 이전에 0.1% Triton X-100/PBS로 투과화(permeabilized)했다. 2차 항체는 Alexa-488 또는 -594 (Invitrogen)가 결합된 염소 항-마우스(goat anti-mouse) 또는 -토끼였다. 세포핵을 DAPI (Sigma)로 가시화했다. 슬라이드에 SlowFade Gold antifade 시약 (Invitrogen)을 배치했다.
형광-활성화 세포 분류 및 유세포 분류. 세포를 표준 프로토콜에 따라 제조하고 FACS에 앞서 얼음 상에서 0.1% BS A/PBS에 현탁시켰다. PI (BD Biosciences)를 사용하여 사멸된 세포를 배제시켰다. 세포를 BD FACSAria SORP 상에서 분류하고 BD FACSDiva Software에 의해 BD LSRII(BD Biosciences)로 분석하였다.
RNA 제조 및 RT-PCR 분석. RNA를 RNeasy Micro 키트 (QIAGEN)로 분리하였다. 역전사를 SupeSACript III First Strand Synthesis 키트 (Invitrogen)로 수행하였다. 증폭을 위해 SYBR Green Mix I (Roche Diagnostics)를 사용하고, 샘플을 Lightcycler-II Instrument (Roche Diagnostics) 상에서 실시하였다.
동물 연구. 종양 유전자 연구를 위해, 100 ml PBS에 현탁시킨 세포를 연령-일치시킨 면역결핍 SCID 마우스의 측부에 피하 주입하였다. 6주 후 마우스를 도살하고 해부하였다.
ATP 및 ROS 분석. 세포간 ATP 수준을 공급자의 프로토콜에 따라 ATP Bioluminescence Assay Kit HS II (Roche)에 의해 측정하였다. 발광 강도를 Gelomax 96 Microplate Luminometer (Promega, Madison, WI)를 사용함으로서 측정하고 발광 판독(luminescence reading)을 세포 계수에 의해 표준화했다(nomalized). ROS 수준의 측정을 위해, 세포를 37 ℃에서 15 분간 암실에서 2 μΜ 디히드로에티듐 (Molecular Probes)를 함유한 배지에서 배양하였다. 세포를 이후 PBS로 세정하고 0.5% BSA를 함유한 PBS에 현탁시켰다. 30000 세포의 형광 강도를 BD Biosciences LSR II (BD Bioscience, Spark, MD)로 보조하여 기록하였다.
키메라 마우스 생성 및 분석. 이배체 및 사배체 키메라의 제조. 이배체 배아를 ICR 수컷과 교배시킨 ICR종 암컷으로부터 얻었고 사배체 배아를 BDF1 수컷과 교배시킨 BDF1종 암컷으로부터 얻었다. 사배체 배아를 2-세포 배아17의 전기융합에 의해 제조하였다. 본 연구에서는, 트립신 처리가 낮은 키메라성(chimerism)을 야기하기 때문에, ACC 구형 군체를 현미경 하에 마이크로나이프를 사용하여 작은 조각으로 잘랐고, 이후 ACC의 작은 클러스터를 큰 피펫에 의해 4.5 일 배반포에 주입하였다. 다음 날, 키메라 배반포를 2.5 일 가임신 암컷 내로 트랜스퍼했다.
참조
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표 1: ACC로부터의 키메라 마우스의 생성
Figure pat00001
* 모든 태아를 13.5 dpc 내지 15.5 dpc에서 수집하였고 각각의 기관(organ)으로의 ACC의 기여율을 FACS에 의해 조사함
** 각각의 키메라로의 SAC의 기여도는 높게 기록되었음 (GFP 발현의 모색(coat color)의 >50%)
표 2: 프라이머 시퀀스. 중간열은 상부에서 하부까지, 서열 번호7-39를 포함하고, 오른쪽 열은 상부에서 하부까지, 서열 번호40-72를 포함함.
Figure pat00002
표 3 - 스트레스 처리 1 주 후 다능성 표현형을 나타내는 세포의 백분율.
처리는 제 1 열에 나타내었고 체세포의 유래의 조직은 제 2 행에 나타내었다. 수는 백분율이다.
Figure pat00003
실시예 2
이론에 구속됨 없이, 본원에 기술된 방법은 아포토시스(apoptosis), 또는 제어된 세포 사멸과 관련된 프로세스를 활성화시킨다고 여겨진다. 세포에 대한 가벼운 손상은 복구 유전자의 활성화를 유도할 수 있다. 세포에 대한 심한 손상은 이전에 정의되지 않은 생존 메카니즘을 활성화할 수 있다. 세포가 유의미한 스트레스, 예컨대 본원에 기술된 스트레스에 노출되는 경우, 세포 성분 (예를 들어 미토콘드리아, 소낭, 핵, 리보솜, 소포체, 엑소좀, 엔도솜, 세포막, 미토콘드리아, 리소좀, ATP, 단백질, 효소, 탄수화물, 지질 등)이 손상된 세포로부터 "cellieu"로 방출된다고 여겨진다. 본원에 기술된 데이터는 이 "cellieu"는 세포의 생존을 재구성하고/하거나 촉진할 수 있다는 것을 나타낸다. 이론에 구속됨 없이, 미토콘드리아 (및 다른 세포 기관)는 세포의 재구성을 지시할 수 있다고도 여겨진다. 작은 크기, 단순성, 세포 분화를 지시하는 능력, 및 원핵세포-유사 특성 때문에, 미토콘드리아는 부모세포에 치명적인 것으로 입증되는 스트레스를 견딜 수 있다. 미토콘드리아는 세포로부터 자유롭게 방출, 막에 캡슐화, 및/또는 다른 세포 성분에 결합될 수 있다.
대안적으로, 이론에 구속됨 없이, 핵은 온전하게 유지되고, 일부 미토콘드리아를 포함할 수 있는 세포막에 캡슐화될 수 있다. 핵의 후성유전적 제어를 잃은, 매우 적은 세포질 및 매우 소수의 세포 기관을 갖는 이러한 손상된 세포는 상호작용하여 가능하게는 밀려나온(extruded) 세포 기관과 융합될 수 있다. 이는 세포에 성장 및 복제에 필요한 서브셀룰러 성분(subcellular components)을 제공하지만 상기 세포는 후성유전적 제어를 잃었고, 따라서 보다 원시적인 (예를 들어 보다 강한 다능성) 상태가 유도된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE BRIGHAM AND WOMEN'S HOSPITAL, INC. RIKEN TOKYO WOMEN'S MEDICAL UNIVERSITY <120> GENERATING PLURIPOTENT CELLS DE NOVO <130> 043214-071768-KR <140> <141> <150> PCT/US13/37996 <151> 2013-04-24 <150> 61/779,533 <151> 2013-03-13 <150> 61/637,631 <151> 2012-04-24 <160> 90 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 1 gttgttttgt tttggttttg gatat 25 <210> 2 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 2 atgggttgaa atattgggtt tattta 26 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 3 ccaccctcta accttaacct ctaac 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 4 gaggatgttt tttaagtttt tttt 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 5 aatgtttatg gtggattttg taggt 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 6 cccacactca tatcaatata ataac 25 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 7 gtcatccttg atctgcccct 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 8 ggtacttacg atgcccagca 20 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 9 ccctgaatat ccctctgct 19 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 10 agatggctac atctctcggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 11 cactctggac ttggagatgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 12 cttgtcgttg gtgatggtga 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 13 gttgaagcag ttaatatggc 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 14 agatgagacc aacctggacc 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 15 aggtggagat catcgccaac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 16 cgttgaattt gccgtgagtg 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 17 attgccaagt cgttctacga 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 18 aggtcgctta cagattgctg 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 19 gtctctttag aaaagtgtga 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 20 tacagctttc ttcctggcca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 21 atgtcagcct tgtggaaatt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 22 gtctgacaga ccaataccat 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 23 aacggctgcg tggtgaagcg 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 24 ggacctccct tagagaggga 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 57 agcatgccag ccagagtcac t 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 58 actccaatct gagcaagacc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 59 gttatatgct gaacgaggtc 20 <210> 60 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 60 tgcgggcgga catggggaga tcc 23 <210> 61 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 61 atgggccgcc atacgacgac gctcaact 28 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 62 actcgataca ctggcctagc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 63 cggttcatca tggtacagtc 20 <210> 64 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 64 cactgccttg tactcgggta gctg 24 <210> 65 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 65 agcgaggcat ggagagagcg gagcag 26 <210> 66 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 66 ccttcttggt ccgcccgttc tta 23 <210> 67 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 67 tatgactcac ttccaggggg cact 24 <210> 68 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 68 ctttgaggtc ctggtccatc acgtgaccat 30 <210> 69 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 69 gggcactgtt cagttcagcg gatc 24 <210> 70 <211> 23 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Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 76 gaggatgttt tttaagtttt tttt 24 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 77 aatgtttatg gtggattttg taggt 25 <210> 78 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 78 cccacactca tatcaatata ataac 25 <210> 79 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 79 gttgttttgt tttggttttg gatat 25 <210> 80 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 80 atgggttgaa atattgggtt tattta 26 <210> 81 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 81 ccaccctcta accttaacct ctaac 25 <210> 82 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 82 gaggatgttt tttaagtttt tttt 24 <210> 83 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 83 aatgtttatg gtggattttg taggt 25 <210> 84 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 84 cccacactca tatcaatata ataac 25 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 85 gcacctgtgg ggaagaaact 20 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 86 tgagagctgt ctcctactat cgatt 25 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 87 agaactggga ccactccagt g 21 <210> 88 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 88 ttcaccctct ccactgacag atct 24 <210> 89 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 89 ctaggccaca gaattgaaag atct 24 <210> 90 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 90 gtaggtggaa attctagcat catcc 25

Claims (9)

  1. 비-배아 분화된 체세포 개체군에서 다능성 세포의 수를 증가시키기 위한 방법으로서, 세포 개체군에 ATP를 포함하는 유효량의 화학적 스트레스 단독 또는 다른 화학적 또는 기계적 스트레스와의 조합을 가하여 스트레스 유도된 유전자의 수준을 증가시키는 단계를 포함하고, 여기서 화학적 또는 기계적 스트레스는 다능성 마커를 발현하는 세포 개체군에서의 세포의 수를 증가시키도록, 약 3.0 내지 약 6.8의 저 pH, 산소 부족 및 세포막의 기공(pore)의 기계적 파괴로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    다능성 세포는 외인성 유전자, 전사물, 단백질, 핵성분 또는 세포질의 도입 없이, 또는 세포 융합 없이 생성되는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포 마커를 발현하는 세포를 선택하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    줄기 세포 마커는 Oct4; Nanog; E-cadherin, 및 SSEA로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    화학적 또는 기계적 스트레스는 약 3.0 내지 약 6.8의 저 pH 및 전단 응력을 야기하는 기계적 스트레스에 세포 개체군을 노출시키는 것을 포함하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    세포 개체군은 35 ℃ 미만 또는 42 ℃ 초과의 온도에 노출되는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    세포 개체군은 전단 응력 또는/및 고압에 노출되는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    세포 개체군은 기공을 파괴하는 기계적 스트레스에 노출되어 세포에서 적어도 약 40%의 세포질 또는 미토콘드리아의 손실을 초래하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    유효량의 ATP가 약 0.02 mM 내지 200 mM인 방법.
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