ES2409356T3 - Método de realización de un ensayo para neutralizar anticuerpos - Google Patents

Abstract

Un matodo para realizar un ensayo de neutralized& para el titulo de los anticuerpos en una muestra, dondedichos anticuerpos son especificos para una molecule diana predeterminada que active la actividad de transducciande serial de una proteina de una superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones, o sonespecificos para un antagonista de dicha molecule diana predeterminada donde dicho metodo comprende:preparaci6n de una diluciOn seriada de la muestra; la adician a cada dilucion de una cantidad fija de la molecule diana, donde dicha cantidad se correspondecon una unidad de actividad predeterminada de la molecule diana, y donde la concentraci6n de moleculediana es la misma en cada dilucien; la realized& de un ensayo con genes reporteros a cada una de las diluciones para determinar a cantidadde actividad residual de la molecule diana en cada dilucion, donde dicho ensayo con genes reporteroscomprende la medicien del nivel de un producto de genes reporteros cuando dicha dilucion entra encontacto con una linea celular transformada mediante una construcciOn que comprende una secuencia denucleotidos que codifican un producto del gen reportero, vinculado operativamente a uno o varioselementos de control transcripcional, que se regula por a actividad de transducciOn de serial de unaproteina de la superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones en respuesta a una sealextracelular generada per dicha molecule diana; y la determined& de la diluci& en la que la actividad de la molecule diana agregada se reduce un factorpredeterminado x, donde dicho titulo se expresa como una reduce& de x veces en unidades deactividad/ml, donde la sensibilidad del ensayo de neutralized& aumenta, donde la linea celular usada en dicho ensayocon genes reporteros se ha tratado con un agente antimitatico o proapopt6tico para que adquierapropiedad de mantener dicha actividad de transduccion de serial durante al menos alrededor de una hora,aunque perdera dicha actividad e incurrira en muerte celular en un plazo no superior a 30 dias a unatemperature superior a la temperatura de congelacion.

Description

Método de realización de un ensayo para neutralizar anticuerpos.

5 Sector de la técnica

[0001] La presente invención se refiere a un ensayo de genes reporteros y un kit para determinar en una muestra la presencia y/o la cantidad de una molécula que desencadena la actividad de transducción de señal de una proteína de la superficie celular. La presente invención se refiere además a una célula que puede usarse en dicho ensayo ya

10 un método de preparación de dicha célula.

Estado de la técnica

[0002] Las proteínas de la superficie celular permiten la transducción intracelular de señales extracelulares. Las

15 proteínas de la superficie celular ofrecen a las células eucariotas y procariotas un medio para detectar señales extracelulares y transducirlas a nivel intracelular de una manera que resulte en una respuesta celular o una respuesta de un conjunto de tejido u órgano. Las proteínas de la superficie celular, al transmitir intracelularmente información acerca del medio extracelular a través de vías intracelulares específicas, inducen una respuesta adecuada a un estímulo determinado. Esta respuesta puede ser inmediata y transitoria, lenta y continuada, o una 20 combinación de ellas. Debido a un conjunto de variadas proteínas de la superficie de su membrana, las células eucariotas son enormemente sensibles a su entorno.

[0003] Las moléculas de señal extracelular, tales como las citoquinas, los factores de crecimiento, ciertas hormonas, los vasodilatadores y los neurotransmisores, ejercen sus efectos (al menos parcialmente) por medio de la interacción 25 con las proteínas de la superficie celular. Por ejemplo, algunas moléculas de señal extracelular causan cambios en la transcripción de los genes diana por medio de cambios en los niveles de mensajeros secundarios, tales como cAMP. Otras señales, al acflvar la expresión de los genes, indirectamente alteran la expresión de los genes, tales como los genes inmediatos-tempranos que codifican proteínas reguladoras que, a su vez, activan la expresión de otros genes codificadores de proteínas de regulación transcripcional. Otras moléculas de señal extracelular provocan

30 la activación de transductores de señales citoplasmáticas latentes y de activadores de la proteína de transcripción (STAT), que mejoran la transcripción de conjuntos específicos de genes.

[0004] Entre las proteínas de la superficie celular que responden a las señales extracelulares e inician los procesos que conducen a esta variada respuesta y expresión de los genes, se encuentran los receptores de la superticie

5 celular y los canales iónicos. Los canales iónicos y los receptores localizados en la superficie celular son proteínas ubicuas y fisiológicamente importantes de la membrana de la superficie celular. Desempeñan un papel fundamental en la regulación de los niveles intracelulares de varios iones y sustancias químicas, muchos de los cuales Son importantes para la viabilidad y el funcionamiento celular.

[0005] Los receptores localizados en la superficie celular son proteínas transmembranafes que se unen a moléculas de señal extracelular o que detectan cambios en el medio extracelular y transmiten la señal a través de vías de transducción de señales para generar una respuesta celular. Los receptores de la superficie celular se unen a moléculas de señal circulantes, tales como citoquinas, factores de crecimiento y hormonas, etc., como paso inicial en la activación de numerosas vías intracelulares. Los receptores se clasifican según criterios estructurales o en función del tipo determinado de vía que se induce. Entre estas clases de receptores existen clases de receptores de citoquinas que incluyen aquellos que se unen a factores de crecimiento y presentan una actividad intrínseca de tirosina quinasa, tales como los receptores del factor de crecimiento de unión a heparina (HBGF), la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, la superfamilia de receptores de citoquinas/hematopoyetinas, la superfamilia de receptores de factores de crecimiento nervioso, otros receptores de tirosina o serina quinasa, y aquellos que se acoplan a proteínas efectoras a través de proteínas de regulación de unión a nucleótidos de guanina, denominados respectivamente receptores acoplados a proteinas G y proteínas G.

55 [0006] Las citoquinas son mensajeros intercelulares que coordinan la comunicación entre las células de un tejido concreto (por ejemplo, las interacciones entre anticuerpos y células T del sistema inmunitaria) y sirven para modular

o modificar la respuesta biológica. Son pleiotrópicas y tienen un amplio espectro de efectos en más de un tipo de célula o tejido. Los receptores para citoquinas se agrupan genéricamente en dos clases, donde los receptores de la Clase I ﾭ

60 15), a la eritropoyetina (EPO), a la hormona del crecimiento (GH), al factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), al factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), al factor inhibitorio de leucemia (UF), y el factor neurotrófico ciliar (CNTF), el TNFa, el TGF y el ligando Fas, y los receptores para citoquinas de la Clase II inCluyen receptores que se unen al interlerán (IFN) oJ, IFNy Y a la IL-10.

comodescribe el presente documento, la vinculaciOn operative hace referencia a la vinculacian de un elemento de control transcripcional, i.e. un promotor, con una secuencia de codificaciOn de nucleetidos, de modo que este elemento se posiciona de forma adecuada para desempear su actividad, consistente en unir la ARN polimerasa e

iniciar la transcripcion de la secuencia de codificacien de nucleotides. Asi, una secuencia de codificacion de nucleotides en vinculacion operative con un promotor se sitea en sentido descendente respecto a la direccien de la transcripcion desde el promotor, este en el marco de lecture correcto respecto al sitio de inicio de la transcripciOn, y se inserta de modo que la clanged& de la transcripci6n proceda a eaves de la secuencia de codificaciOn de nucleotides.

[0066] Los elementos de control transcripcional adecuados pueden obtenerse o derivarse de las regiones

reguladoras transcripcionales de los genes cuya expresion se induce de forma tide, por lo general on tan solo unos minutes a partir del momento en quo se produce el contacto entre el receptor de reconocimiento de patrones o la proteina de la superficie celular, y la proteina efectora que module la actividad del receptor de reconocimiento de patrones o la protefna de la superficie celular. Entre estos genes se incluyen los genes inmediatos tempranos (Sheng et al., 1990), por ejemplo c-fos. Estos genes se inducen rapidamente cuando un ligando se une a una

proteina de la superficie celular. Entre los elementos de control transcripcional preferidos para las construcciones de genes reporteros se encuentran los correspondientes a los genes inmediatos tempranos, los elementos derivados de otros genes quo presentan parcial o completamente las caracteristicas de los genes inmediatos tempranos, o

elementos sinteticos quo se construyen de modo quo los genes que mantienen con ellos una vinculacien operative presentan estas caracteristicas. Los genes preferidos desde los quo se derivan los elementos de control

transcripcional presentan, entre otras, las siguientes caracteristicas: expresien baja o indetectable en las celulas pasivas, induccien rapida a nivel transcripcional on cuestion de minutos a partir de la estimulacien extracelular, induce& transitoria e independiente de la sintesis de nuevas proteinas, la interrupciOn subsiguiente de la transcripcien precisa la sintesis de nuevas proteinas, y los mRNA transcritos desde estos genes tienen una vide

media corta. No es necesario que estOn presentes todas estas propiedades.

[0067] Entre los elementos de control transcripcional y promotores adecuados se encuentran los promotores del gen de peptide intestinal vasoactivo (VIP) (receptive a cAMP. Fink et al., 1988), del gen de la somatostatina (receptivo a cAMP. Montminy et al., 1986), de la proeneefalina (receptive a cAMP, los agonistas nicotinicos y los esteres de forbol. Comb et al. 1986), del gen de la fosfoenolpiruvato carboxiquinasa (receptivo a cAMP. Short et al., 1986), del

gen NGFI-A (receptive a NGF, cAMP y suero. Changelian et al., 1989), los elementos de control transcripcional obtenidos o derivados del gen c-fos, y cualquier otro elemento que los expertos en a materia conozcan o consideren adecuado preparar.

[0068] El protooncogen c-fos es el homelogo celular del gen transformador del virus del osteosarcoma FBJ. Codifica una

proteina nuclear que con gran probabilidad forma parte de los procesos normales de diferenciaci6n y crecimiento celular. La transcripcion de c-fos se active rapida y transitoriamente a eaves de factores de crecimiento e inductores de otras proteinas de la superficie celular, incluyendo las hormonas, los agentes especificos de la

diferenciacien, los inductores del este, los mitegenos y otros inductores conocidos de las proteinas de la superficie celular. La activacian depende de la sintesis de proteinas. Entre los elementos de regulacien de c-fos se incluye una caja TATA necesaria para iniciar la transcripci6n, dos elementos en sentido ascendente para la transcripcian basal, y un intensificador, quo incluyeun elemento con simetria de diada necesario para la inducci6n por TPA, suero, EGF y PMA. El elemento intensificador transcripcional de 20 pb (pares de bases) se encuentra ubicado entre las bp -317 y 298, en sentido ascendente desde el sitio del casquete de mRNA de c-fos, fundamental para la induccien del suero on las celulas NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los dos elementos situados en sentido ascendente se ubica entre

lasbp -63 y -57, y es semejante a la secuencia de consenso de la regulacien de cAMP.

[0069] Los elementos de control transcripcional, concretamente los relacionados con las realizaciones preferidas de la presente invencion, on la cual el interferon de Tipo I o II actea como serial extracelular, son preferentemente elementos de respuesta al estimulo del interfer6n (ISRE) o secuencias activadas por interferon gamma (GAS). Aunque existen ISRE diversos, caracterizados a partir de los distintos genes humanos receptivos al interferOn de Tipo I, se ha identificado una secuencia de consenso para el ISRE, la ggraaaqwGAAActg (NY Id. sec.: 6. Las mayesculas indican secuencias del nOcleo y el subrayado altos valores de conservacien), a la quo se une el complejo STAT1/STAT2/IRF9 (Levy et al., 1988). Un ISRE preferido es el gen ISG15 humano, que se presenta como NY Id. sec.: 5, donde los nucleotides 41 a 55 corresponden a la secuencia de consenso de ISRE. El ISRE es

altamente conservado entre las especies. Por ejemplo, una secuencia presente en la region del promotor del gen Mx del polio inducible por interferOn (Schumacher et al., 1994) es similar a la detectada en primates y es conforme a la secuencia de consenso de ISRE para los genes de mamiferos receptivos al interfer6n, incluidos roedores y vacas (ver la figura 2 de Perry et al., 1999).

[0070] En cuanto a la secuencia GAS, a la quo se une el homodimero STAT1 on los genes receptivos al interferon de Tipo II, se ha identificado una secuencia de consenso, la nnnsanttccaGGAAntgnsn (NY Id. sec.: 7. Las

celulas con una vide Citil de 24 horas carecen de interes desde un punto de vista comercial. Para emptier su vide Otil,

as celulas tratadas pueden congelarse de forma inmediata. En funci6n de los procesos de canceled& y descongelacion que se apliquen, la vide Otil de las celulas puede ampliarse muy notablemente. No obstante, una vez descongeladas, deberan usarse en un periodo no superior a 24 horas, transcurridas las cuales incurriran en muerte celular (i.e. apoptosis).

[0078] Debe entenderse que segt:in la creencia convencional la criopreservacion de las celulas requiere el uso de procesos (y equipos) especiales de congelaciOn y descongelaciOn, en los cuales se congelan las celulas a una velocidad de 1°C por minuto hasta alcanzar los -80° C, o la temperatura aproximada del nitrogen° liquid° de -200°

C. Llegados a este punto, las celulas podrian almacenarse indefinidamente y someterse posteriormente a

descongelaciOn rapida. Tambien se suele usar sulfaxido de dimetilo (DMSO) u otros crioconservantes para facilitar la proteccion de las calulas. Puesto que muchos laboratorios no disponen de instalaciones de almacenamiento a -200° C (ni siquiera a -80° C), resultarla de gran utilidad poder canceler las celulas a -20°C. No obstante, se conoce que la viabilidad de las colulas es muy baja cuando se congelan a -20°C y posteriormente se descongelan. Los inventores de la presente invencien descubrieron previamente que el DMSO protege las celulas incluso si se congelan a -20°C,

sinnecesidad de recurrir a tOcnicas ni equipos especiales para la congelacion y descongelacion. Aunque el glicerol, un cornpuesto crioconservante reconocido, Protege las calulas a -20° C, si se aplica en el porcentaje elevado (50%) que suele utilizarse en la criopreservaciOn, puede impedir la interacci6n entre los ligandos de las protelnas y los receptores de la superficie. En cualquier caso, puede usarse un porcentaje reducido de este sustancia (muy inferior al 50% que se usa habitualmente). El DMSO no presenta este inconveniente. Ademas, puede proteger las celulas

congeladas a -20° C sin necesidad de recurrir a tecnicas ni equipos especiales para a canceled& y descongelacion, y sin alterar la sensibilidad de las °elutes al IFN. Tras el tratamiento con el agente antimitOtico o proapoptotico, si edemas se trate con DMSO, la celula puede disfrutar de una large vida ütil incluso a la temperatura de congelaciOn estandar de -20° C, y una vez descongelada, la celula permanecera active (por ejemplo, para realizar ensayos de transduccion de serial) durante un periodo aproximado de 24 horas, hasta quo se produzca la

apoptosis como consecuencia del tratamiento con el agente antimitatico o proapoptotico. Para alcanzar este objetivo puede usarse cualquier agente antimitOtico o proapoptOtico que induzca la apoptosis para provocar la muerte celular durante el proceso de replicaciOn, como la radiacion y y agentes quimicos como la vinblastina, el 5-FU, el cisplatino

o un agente intercalante antitumoral (como la mitomicina C), ya que las celulas han de mantenerse biolOgicamente actives durante un periodo de inactividad y hasta que Ilegue ese momento, las cOlulas tratadas comenzaran a morir.

[0079] La celula transformada tratada se congela a una temperature y en unas condiciones que le permiten reanudar la transduccion de sena, tras su descongelaciOn. Aunque es preferente congelar la celula a temperatures comprendidas entre -20° C y -200°C, preferentemente a -80° C, las celulas pueden almacenarse posteriormente a 20° C, una temperature de canceled& de fad acceso en la mayorla de los laboratories, el objetivo es englobar otras temperatures adecuadas para la criopreservaciOn de las celulas, coma la temperature aproximada del nitrogen° liquid° de -200°C. Antes de canceler la cOlula transformada tratada, es edemas preferente resuspenderla en una solucien con un crioconservante. Aunque el crioconservante preferido es el sulfoxido de dimetilo (DMSO), siempre quo no interfieran con el uso de la celula tras la descongelaciOn, tambien pueden usarse otros crioconservantes adecuados quo presenten una afinidad elevada de union con el agua, como el etilenglicol, el

polietilenglicol, el propilenglicol, el glicerol, el butanodiol, el propanodiol y la formamida. Si se usa DMSO de forma aislada como crioconservante, la solucion debe contener de manera preferente aproximadamente un 10% de DMSO. Mas preferente, se usa coma crioconservante un 2,5% de DM50 on combined& con un 10% de glicerol.

[0080] El metodo de la presente invenciOn, quo usa un ensayo con genes reporteros para el interferon de Tipo I para

determinar el titulo de los anticuerpos neutralizantes para esta sustancia, es una realized& mas preferida de la presente invencion. Para el producto del gen reporter° se usa preferentemente la luciferasa de luciOrnage, el aequorin de medusa o la proteina verde fluorescente mejorada (EGFP), y de manera preferente se controla con un promotor quimerico sensible al interferon quo contenga el ISRE de ISG15 y un promotor SV40 minima Las figures 1 y 2 presentan ejemplos de estas construcciones de genes reporteros. La figura 1 es una representaciOn

esquematica de una construed& de genes reporteros de la luciferasa on un vector ISRE-luc (N.° Id. sec.: l), donde or ISIRE de ISG15 (N.° Id. sec.: 5) se posiciona en los nucleatidos 38 a 97 de N.° Id. sec.: 1, el promotor 5V40 minima on los nucleotidos 103 a 288 de N.° Id. sec.: I, y la secuencia de codificaciOn del gen reporter° de la luciferasa quo contiene la secuencia de aminoacidos de N.° Id. sec.: 2 se posiciona en los nucleotidos 328 a 1980 de N.° Id. sec.: 1. Asimismo, la figura 2 es una represented& esquemetica de una construed& de genes reporteros de

EGFP en un vector ISRE-EGFP (N.° Id. sec.: 3), donde el ISRE de ISG15 se posiciona en los nucleotidos 30 a 89 de

N.° Id. sec.: 3, el promotor SV40 minimo en los nucleotidos 95 a 290 de N.° Id. sec.: 3, y la secuencia de codificacien

del gen reportero de EGFP quo contiene la secuencia de aminoacidos de N.° Id. sec.: 4 se posiciona en los

nucleotides 358 a 1077 de N.° Id. sec.: 3.

[0081] Respecto a la celula quo se usa en la realized& preferida del ensayo con genes reporteros para el interferan de Tipo I de la presente invencien, se usa preferentemente una celula de sujeto manlier° o aviar, y mas preferente 14

Lacelula se trate para obtener una linea celular apta para su comercializacion, con as propiedades necesarias para este fin: que cuente con una vide suficiente conforme al objetivo del ensayo y que sea de un solo uso, sin posibilidad de propagacien para otras aplicaciones. De manera preferente, la celula 1) se somete a niveles de radiacion y comprendidos entre 6 y 12 Gy, preferentemente a 9 Gy, y se almacena a temperature ambiente durante un maxim° de 14 Was tras recibir la radiaciOn, o bien 2) se expone a un agente antimitotico y proapoptetico, como la

vinblastina, el cisplatino o el 5-fluorouracilo, preferentemente a vinblastina, durante 10 minutos a 37°C antes de resuspenderse en una soluciOn con un 40% de suero bovino fetal (FBS) y un 2,5% de DMSO, mas un 10% de glicerol, y congelarse a -80°C.

[0082] Para optimizar el metodo de obtencian de una celula con una vide ütil indefinida durante el almacenamiento

enestado de congelacien, que morira aproximadamente a las 24 horas de descongelarse (aunque, una vez descongelado, el producto ofrece una sensibilidad, precisi6n y selectividad excelentes), pueden utilizarse variaciones de los siguientes parametros:

1) Concentraci6n de FBS. Ademas de FBS, podria usarse practicamente cualquier suero que actOe como deposit° toxic° para proteger a las celulas de las toxinas, por ejemplo, durante los procesos de descongelacien o tratamiento con un agente antimitatico y proapoptotico. La concentracien de FBS puede varier los resultados.

2) El tiempo es una variable. Debe considerarse la cantidad de tiempo de exposicion a un agente quimico antimit6tico o proapopt6tico, como la vinblastina, antes de que las celulas se centrifuguen y se laven para retirar dicho agente (i.e. vinblastina).

3) Usando la vinblastina como ejemplo no limitativo , hay que observer que su formulacion es importante. Actualmente se prefiere la vinblastina soluble de la preparaci6n registrada y comercializada en Francia por Eli Lilly bajo el nombre Velbe. Para una formula diferente habria que varier ligeramente la combinaci6n de los parametros.

4) La concentraciOn de vinblastina.

5) La concentrackin celular durante el tratamiento con vinblastina.

6)La cantidad del crioconservante o la combinaciOn de varios crioconservantes.

[0083] Resulta factible varier todos estos parametros empiricamente y comprobar los resultados de sensibilidad y precision tras a congelacion, siempre que las celulas se mantengan vivas durante aproximadamente 24 horas tras su descongelaciOn. Cualquier expert° en la materia puede determinar este hecho facilmente sin experimentacien

indebida, en particular teniendo en cuenta la informaci6n especifica que contienen los experimentos de las figuras 11 a 24 de los documentos WO 2004/039990 y US 2004/0235157 sobre las celulas PIL5, para obtener un producto que basicamente cuente con la misma sensibilidad que las celulas vivas no tratadas durante un period° de al menos una hora, preferentemente entre 8 y 24 horas, tras la descongelacion, y cuya viabilidad no supere los 30 dias, preferentemente los 14 dies, mas preferentemente los 5 dies, y aim mas preferentemente los 3 dies.

[0084] A continuacien se describen ejemplos de protocolos de preparacion de las places de microtitulacion del ensayo y las ampollas o los viales de celulas PIL5 (comb celulas modelo) tratadas con 1 pg/ml de vinblastina como agente antimit6tico y proapoptOtico durante 10 minutos a 37°C, antes de proceder a su almacenamiento en estado de congelacion a -20°C y a su posterior descongelacien para la realizacien del ensayo.

PREPARAcK5N DE LAS PLACAS DE MICROTITULACION DEL ENSAYO

[0085]

1.Las celulas PIL5, a una concentraci6n aproximada de 2x10-a 7x10 celulas/ml, en un medio RMPI 1640 con 10% de suero bovino fetal (FBS), se tratan con una solucian fresca de 1 pg/ml de vinblastina (formula preparada distribuida comercialmente por Eli Lilly bajo el nombre VELBE), diluida a partir de 1 mg/ml en H20 durante 10 minutos a 37°C en una atmOsfera de 5% de CO2. Si se desea, puede usarse un incubador de CO2.

2. Las celulas PIL5 se centrifugan a 800 x g durante 10 minutos a 4°C, y se lavan una vez con el mismo volumen de medio RPMI 1640 de 10% de FBS para retirar la vinblastina.

3.

Las celulas PIL5 se resuspenden a una concentraci6n de 2x10 celulas/ml en un medio RMPI 1640, con un 40% de suero bovino fetal (FBS) y un 2,5% de dimetilsulfaxido, mas un 10% de glicerol.

4.

La suspension celular se dispense en los pocillos de una microplaca de base plena para depositar 300 000 celulas por pocillo (el equivalente a 25 pl de suspensiOn celular por pocillo).

5.La microplaca se congela a -80°C en una bolsa de aluminio sellada al vacio con la tapa superior.

6. A partir de este momento y hasta su uso, las microplacas pueden almacenarse durante periodos limitados 15

manera, se establecio una linea celular humana PIL5, portadora del gen reporter° de la luciferasa, bajo el control de un promotor quimerico receptivo al IFN. Esta linea constituye la base de un ensayo que permite determinar actividad de IFN con mayor celeridad y precisi6n quo el bioensayo antiviral estandar (Lallemand et al., 1996). La

table 1 presenta las ventajas del ensayo con genes reporteros de la luciferasa para el interferon usando las celulas 5 PIL5, respecto al bioensayo antiviral estandar. La table 2 establece una comparacien entre estos dos ensayos en cuanto a la sensibilidad al interferon que se produce como resultado de la infecci6n por virus diversos.

TABLA 1

Parametro CPE MxA Gen reportero

ELISA PCR Lineacelular Kit IL/to

Duraci on 3-4dias 23 dias 23 -dies 1-2dies 7-16horas

-

Contenc i On P3 ND ND ND ND

Niveldeespecial i zaciOn Al tamente Cultivocelul ar Cul tivocelul ar Cul ti vocel ul ar Ensayo

delanal i sta espec i al i zado +ensayo +ensayo +ensayo solamente

Di sponi bi l idaddel Restringi da Li mitadapor Instrumento Limitadopor Disponible

reacti vo ant i cuerpos Q-PCR lineace l ul ar prontamente

Sensibil i dad I U/m1 1 ,0 ND ND 10 1,0

Ni ve l minimodetectable 5,0 ND ND 1 ,5 0,2

de IFN ( I U/m1 )

Selecti vi dad Baja Al ta Al ta Al ta Alta

Vari aci 6ndelensayocon Si Si Si Si No

cu l tivocelul ar

Al to rendimi ento No Moderado Moderado Si Si

Restri cciones PI NA Si Si Si No

Transferi bi l i dada CRO Restringi da Restr i ngi da Restri ngi da Restr i ngida Sin restriccion

10 TABLA2

Interferon Sensibili dad (IU/m1) Limite inferiordedeteccion (IU/m1)

Celulasvivas Celulas tratadas Celulasvivas Ululas tratadas quimicamente quimicamente

l ntronATM 15 4,0 1 ,0 0,25

AvonexTM 10 2,5 1 ,5 0,2

RebifTM 10 1,0 1 ,5 0,2

BetaferonTM 10 3,0 2,0 0,5

[0092] El ensayo con genes reporteros usando celulas PIL5 presenta una sensibilidad muy alta (permite detectar de forma rutinaria cantidades inferiores a 1,0 111/m1 de IFNa o IFN6), es facilmente reproducible (con un error estandar de +/-un 10%) y permite detectar la actividad de IFN en una gran variedad de concentraciones (de 0,1 a 100 IU/m1). 15 Asimismo, el metodo de ensayo ofrece una gran especificidad y permite detectar, por ejemplo, niveles muy bajos de IFN de Tipo I (IFNa o IFN6) en presencia de niveles elevados de IFNy, lo que no resulta posible con los bioensayos antivirales convencionales. El ensayo resulta idoneo para determinar la actividad de IFN en fluidos biologicos, como el suero humano, el liquid° cetalorraquideo o la orina, ya quo el metodo esta menos sujeto a interferencias no especificas a bajas diluciones que el bioensayo antiviral convencional. A menudo, el suero humano y otros fluidos

20 biolegicos contienen inhibidores no especificos de la replicacian de virus sin relacion con el IFN, lo que puede afectar la replicacion de virus en bajas diluciones y generar falsos positivos.

[0093] El ensayo con genes reporteros de PIL5 para el IFN reconoce cualquier interfer6n de Tipo I que se une a un receptor de interferon de Tipo I. Tambien permite distinguir entre los distintos subtipos de IFNa, debido a su 25 capacidad para detectar diferencias en las curves de dosis-respuesta (estandar) quo caracterizan a estos subtipos de IFNa individuales. Esta caracteristica tiene un gran valor a la hora de distinguir los interferones que se producen en circunstancias distintas. Los paramixovirus tipo Sendai inducen principalmente IFNa1, IFNa2 e IFN6, mientras que el interferon de Tipo I producido por ciertas celulas en ausencia aparente de infecci6n viral, se corresponde

adquirido en Schering-Plough, Levallois-Perret, Francia.

[01011 IFNp-1a recombinante (AVONEXTm): adquirido en Biogen, Nanterre, Francia. La prepared& que se ha usado en este estudio muestra un titulo de 6 x 106 IU/m1 en celulas WISH humanas infectadas con VSV. Se siguieron los estandares de la prepared& internacional de referencia del 1FNP humano (Gb23-902-531). La actividad especifica

dela preparaci6n de interferon fue de 2 x 108 IU/mg de proteina.

[00102] recombinante (REBIFTm): adquirido en Serono, Boulogne, Francia. La preparaciOn que se ha usado en este estudio muestra un titulo de 6 x 106 IU/m1 en celulas WISH humanas infectadas con VSV. Se siguieron los estandares de la prepared& internacional de referencia del IFNr3 hurnano (Gb23-902-531). La actividad especifica

dela prepared& de interfer6n fue de 2,7 x 108 111/mg de proteina.

[00103] IFN13-1b recombinante (BETAFERONTm): adquirido en Schering AG, Berlin, Alemania. La preparaci6n que se ha usado en este estudio muestra un titulo de 8 x 106 IU/m1 en celulas WISH humanas infectadas con VSV. Se siguieron los estandares de la preparaci6n internacional de referenda del IFNp humano (Gxb02-901-535). La

actividad especifica de la prepared& de interferon fue de 3,2 x 107 IU/mg de proteina.

[00104] IFNy humano recombinantel adquirido en PBL, Pisctaway, Nueva Jersey. La prepared& que se ha usado en este estudio muestra un titulo de 1 x 107 IU/m1 en celulas WISH humanas infectadas con VSV. Se siguieron los estandares de la prepared& internacional de referencia del IFNy humano (Gxg-902-535). La actividad especifica de

la preparaci6n de interfer6n fue de 1,6 x 107 Ill/mg de proteina.

Ensayos con interferon

[00105] Bioensayo de IFN: para someter a ensayo a actividad de IFN, se inhibieron los efectos citopaticos (CPE) del

virus de la estomatitis vesicular (VSV) en la linea celular amnietica humana WISH, o en as celulas HuH7 humanas, conforme a lo descrito con anterioridad (Tovey et al., 1977). 0 bien, se inhibieron los CPE del virus de la encefalomiocarditis (EMCV) en calulas A549 humanas, conforme a lo descrito con anterioridad (Grossberg et al.,

2001a).

[00106] Ensayo con genes reporteros en celulas PIL5: el oligonucleOtido bicatenario sintetico CTCGGGAAAGGGAAACCGAAACTGAAGCC (N.° Id. sec.: 8), correspondiente al IRSE del gen ISG15, que controla un promotor SV40 minimo, se clon6 en sentido ascendente respecto al gen reporter° de la luciferasa mediante la inserci6n en el sitio Xho/BglIl del vector pGL2-promotor (Promega), para generar la construcci6n de genes reporteros regulada por IFN, conforme a lo descrito con anterioridad (Lallemand et al., 1996). Se transfectaron celulas U937

promonociticas humanas con la construcci6n de genes reporteros regulada por IFN, y se aislaron y clonaron los transfectantes estables. De esta manera, se establecio una linea celular humana (PIL5) portadora del gen reporter° de la luciferasa bajo el control de un promotor quimerico receptivo al IFN. Las celulas PIL5 constituyen la base de un ensayo que permite determiner de forma selective, con gran precisi6n y celeridad la actividad de IFN de Tipo I. Las celulas PIL5 con replicacion inhibida, tratadas con vinblastina y preparadas para el ensayo (ensayo de Alfa y Beta de

iLite) se adquirieron en NeutekBio, Galway, Wanda, y se almacenaron en estado de congelacion a -80°C hasta su uso, conforme a las instrucciones de los fabricantes. De forma resumida, las celulas congeladas se sometieron a descongelacien rapida y se incubaron durante la noche en una place de microtitulacien de 96 pocillos (50 000

celulas/pocillo), por duplicado y con diluciones seriadas de IFN. A continuacian, las celulas fueron lisadas agregando el sustrato de luciferasa portador del reactivo y se determine la actividad de la luciferasa con un luminametro (LumiCountTM, Packard Instruments Inc, Downers Grove IL). Se determine la activided de interferon a nadir de la curve dosis-respuesta de unidades relatives de luciferase (RLU), respecto a la dilucien de la preparaci6n de referencia internacional del IFN, Y el resultado se expres6 en ILI/ml.

Ensayo de neutralizacion

[00107] De forma resumida, las diluciones seriadas del suero humano se incubaron por duplicado durante 1 hora a 37° C y, a continuacian, durante 2 horas mas a 4° C, con una cantidad constante (10 LU/ml, o de 50 a 250 pg/ml) de una prepared& especifica de IFN, en un medio RPM 1640 con un 2% de suero bovino fetal (FBS), en una place de microtitulaci& de 96 pocillos. A continuaciOn, se sometie a ensayo la actividad de IFN residual con el bioensayo del

IFNo el ensayo con genes reporteros en celulas PIL5. De forma simultanea, se someti6 a ensayo la preparaci6n de IFN que se use en la prueba de neutralization para determinar su actividad de IFN precisa. Asimismo, se examine por separado la dilucian mas baja del suero analizada, para determinar la presencia de actividad o toxicidad de IFN.

[00108] El titulo de neutralized& se determine con el metodo de calculo de Kawade (Kawade of al., 1984), que

especifica el inverso de la dilucien de anticuerpos que reduce la activided de IFN de 10 a 1,0 LU/ml, segOn la fOrmula t = f (n4)/9, donde f es el inverso de la diluciOn de anticuerpos y n es la concentraciOn de IFN en LU/ml (Grossberg et

= =

neutralized& constituye el estandar aceptado convencionalmente para todos los ensayos de neutralizacion.

RESULTADOS

Determinacion de la actividad de IFN de Tipo I mediante el ensayo con genes reporleros de iLite

[00109] Se transfectaron celulas U937 promonociticas humanas con el gen reportero de la luciferasa, pejo el control de un promotor quimerico receptivo al IFN, conforme a lo descrito en el epigrafe MATERIALES Y METODOS. Los transfectantes estables se aislaron, se clonaron y se sometieron a pruebas de sensibilidad al IFN. De esta manera, seestableci6 una linea celular (PIL5), que permite determinar la actividad de IFN human° de Tipo I de forma selective, con gran precisi6n y en cuestiOn de horas (figures 4A y 48). Para evitar las posibles variaciones en el ensayo asociadas al cultivo continuado de limas celulares, se establecieron bancos de celulas primarios y de trabajo, y se conservaron en nitr6geno liquid°. Para cada lote de celulas del ensayo se descongelo una ampolla de celulas PIL5, y se amplificaron las colulas para un Miner° constante de pases en condiciones estander. A

continuaciOn, se trataron con la sustancia antimitotica vinblastina, que permite almacenar las celulas preparadas para el ensayo en estado de congelaciOn a -80°C durante periodos prolongados (>3 anos), sin perder la sensibilidad al IFN y sin necesidad de realizar cultivos celulares. Este procedimiento obvia las posibles variaciones asociadas a la proliferacion celular.

[00110] Las celulas P1L5 congeladas, preparadas para el ensayo y tratadas con vinblastina (ensayo de Alfa y Beta de iLite, NeutekBio, Galway, Wanda) se usaron para determiner la actividad de varies preparaciones de IEN bien caracterizadas. De forma resumida, las celulas congeladas se sometieron a descongelacion rapida y se incubaron durante la noche con diluciones seriadas al decimo (1:10) de IFNa2a (ROFERON-AT"), IFNa2b (INTRON-ATM), IFNa2a pegilado (PEGASYSTm), IFNa2b pegilado (PEG-INTRONTm), IFN[3-1a (AVONEXT"), IFN61a (REBIFTM) e

IFNI3-1b (BETAFERONTm). A continuaciOn, las celulas se lisaron con el sustrato de luciferasa portador del reactivo y se determin6 a actividad de la luciferasa con un luminemetro. A continuaciOn, se determine la actividad de interfer6n a partir de la curve dosis-respuesta de actividad de la luciferasa expresada en unidades relatives de luz (RLU), respecto a la concentraciOn de IFN expresada en unidades internacionales/ml (1U/m1), en comparaciOn con la preparaciOn internacional de referencia de la OMS para IFNa o IFN6 humano. El ensayo de iLite consiguie detectar

cantidades de 1,0 Um] o inferiores de IFNa o IFN6, con un error estandar de +/-15%, en una gran variedad de concentraciones de IFN (<1,0 a 100 ILI/m1) (figures 4A y 4B). Asimismo, el ensayo de iLite fue capaz de detectar todos los subtipos de IFNa humano sometidos a la prueba (figura 3).

[00111] La actividad especifica del IFNa2a pegilado (PEGASYSTM) determinada con el ensayo de iLite, resulta

aproximadamente diez veces menor que la actividad del IFNa2a no pegilado (ROFERON-ATM), tal como muestra la figura 5A. En esta figura tambien puede verse que, sin embargo, la actividad especifica del IFNa2b pegilado (PEG-INTRONTm) resulto ser tan solo ligeramente inferior a la del IFNa2b nativo (INTRON-ATm).

[00112] La actividad de IFN de las preparaciones formuladas clinicamente de IFN6-1a (AVONEXTm), IFN61 -a

(REBIFTM) e IFN61-b (BETASERONTm), determinada mediante el ensayo con genes reporteros de iLite (figura 58), correspondia bien tanto con los valores obtenidos por un bioensayo antiviral (celulas I-IuH7/VSV) como con los datos facilitados por los fabricantes (datos no mostrados).

[00113] El ensayo con genes reporteros en celulas PIL5 puede detectar IFN humano de Tipo I incluso con concentraciones reducidas de IFNy humano, ya quo el IFNy humano muestra en este ensayo un 10% o menos de reactividad cruzada (datos no mostrados).

[00114] Las colulas PIL5 congeladas con division inhibida y tratadas con vinblastina mostraron un nivel de sensibilidad mayor, definido como el punto medio de la curve dosis-respuesta de IFN (1,0 LU/ml), un limite inferior de detecciOn de IEN y, en algunos casos, un rango de deteccion ligeramente menor quo las celulas PIL5 no tratadas (figures 6A a 60). Asi, para las tres preparaciones formuladas clinicamente de IFNp (AVONEXTm, REBIETTM y BETAFERONTm) 1,0 LU/ml result() equivalente a 2,5, 1,0 y 3,0 IU/m1 respectivamente para las celulas tratadas con vinblastina, on compared& con los valores de 10, 10 y 11 IU/mlobtenidos para las celulas no tratadas (figures 6A a 60). Tambien se obtuvo un limite de deteccion inferior para AVONEXT", REBIETM y BETAFERONTm, de 0,2, 0,2 y

0,5IU/m1 respectivamente para las celulas tratadas con vinblastina, en compared& con los valores de 1,5, 1,5 y 2,0 ItEml obtenidos para las celulas no tratadas (figures 6A-6D).

Determinacion de la actividad neutralizante de un antisuero anti-IFN a/I1 policlonal mediante el ensayo con genes reporteros de ILite

[00115] Con el ensayo con genes reporteros de iLite se determin6 el titulo de neutralizaciOn de un antisuero anti20

IFNa/p policlonal antihumano de oveja. De forma resumida, diluciones seriadas de un antisuero anti-IFNa/p policlonal humano, para cuya prepared& se inmunizo a una oveja con IFN linfoblastoide humano purificado, se incubaron con 10 unidades de laboratorio (LU)/m1 de IFNa (INTRONAT") o IFNP1-a (AVONEXTM) en una place de microtitulacion, durante 1 hora a 37°C y, a continuacion, durante 2 horas mas a 4° C. Seguidamente, se agregaron 5 lascelulas PIL5 congeladas y tratadas con vinblestine a la mezcla de anticuerpos anti-IFN y se incubaron durante la noche a 37°C. El titulo de neutralized& se determine a partir del inverso de la dilucien de anticuerpos que redujo la actividad de IFN de 10 a 1,0 unidades de laboratorio/ml (matodo de Kawade). Los titulos de neutralized& de anti-IFNa y anti-IFNp obtenidos para el antisuero anti-IFNa/P policlonal de oveja mediante el ensayo con genes reporteros en celulas PIL5 concordaron con los que se obtuvieron mediante el bioensayo antiviral con VSV en

10 celulas WISH, dado que esta Ultima prueba solo detecta diferencias por duplicacion o superiores (table 3).

Tabla 3. Comparacion del titulo de neutralizacion de un anticuerpo IFNa/g policlonal anti-humano obtenido mediante el ensayo iLitecon aquellos obtenidos mediante un ensayo CPE

Interferon Antisuerode IFNa/3poli clonalAnti-humano :Titulomedio neutralizane (TRU/m1)

Bi oensayo VSV/WI SH

Ensayo de gen reportero PI L5

1

FNa-2b 204. 800 240. 000

I

FM3 1 a 2. 559 2. 500

15 Determinacion de la actividad neutralizante de los autoanticuerpos anti-IFN humano mediante el ensayo con genes reporteros de ILite

[00116] La presencia de suero humano de voluntarios sanos a una concentraciOn correspondiente a una dilucien

20 final de 1:4 en el ensayo con genes reporteros de iLite, indica valores en RLU identicos a los obtenidos para las muestras de control no tratadas (datos no mostrados). Del mismo rnodo, a presencia de suero humano de voluntarios sanos a una dilucion final de 1:4no tuvo ningOn efecto en el titulo de IFN de IFNa2-b (INTRON ATM) o IFNB1 -a (datos no mostrados). No se encontraron niveles detectables de IFNa circulante en ninguna de las muestras procedentes de personas no tratadas, que se sometieron a la prueba sin IFNa agregado (dates no mostrados). Por

25 elcontrario, si se encontraron niveles detectables de IFNa2 circulante en cienas muestras de suero de pacientes con hepatitis C cr6nica tratados Con IFNa2 recombinante, que se sometieron a la prueba sin IFNa agregado, en ausencia de anticuerpos anti-IFNa (datos no mostrados).

[00117] Diluciones seriadas de muestras de suero de pacientes con hepatitis C crOnica tratados con IFNa2

30 recombinante, se incubaron con 10 LU/ml de IFNa2a (ROFERONT") o IFNa2b (INTRON ATM) durante 1 hora a 37°C y, a continuaciOn, durante 2 horas mas a 4° C. Seguidamente, se comprob6 la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-IFNa usando las celulas PIL5 congeladas y tratadas con vinblastina (figures 7A a 70). Con la metodologia de Kawade, pudieron apreciarse diferencias significativas en los titulos de neutralized& entre las muestras de pacientes en un intervalo de <20 a 3500 TRU/ml (table 4). En los ensayos ciegos, se detectaron

35 grandes coincidencias entre los titulos de NAB de las muestras de autoanticuerpos para IFNa determinados con el ensayo de iLite, y los valores obtenidos con un bioensayo antiviral (celulas HuH7/VSV) (datos no mostrados).

[00118] Los titulos de neutralizaciOn de sueros de pacientes tratados con IFNa2a (ROFERONTM) obtenidos

resultaron identicos a los detectados para IFNa2a (ROFERONTM) o IFNa2b (INTRONAT") mediante un ensayo con

40 genes reponeros de iLite (datos no mostrados). Asimismo, los titulos de neutralized& de sueros de pacientes tratados con IFNa2b (INTRON ATM) obtenidos resultaron identicos a los valores determinados para IFNa2a (ROFERONTM) o IFNa2b (INTRON ATM) mediante un ensayo con genes reporteros de iLite (datos no mostrados). No obstante, los titulos de neutralized& de sueros de pacientes tratados con IFNa2a o IFNa2b revelaron diferencias significativas respecto a los obtenidos para IFNa1 (table 4).

Tabla 4. Comparaci6n de los titulos de NAB Anti-IFNa obtenidos con dosis de antigeno bien como masa de proteina IFN o bien como 10 Unidades Funclonales de Laboratorio (LU)

Terapia N2de Interferon suero

10LU/ml 250pg/ml

lntronA IFNa1 PEG-Pegasys lntronA !Mat PEG-Pegasys

lntron Intron

I ntron A D1 400 <20 150 20 500 8000 1000 1000

IntronA D2 40 <20 <20 <20 50 60 100 200

IntronA D3 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20 <20

I ntron A D4 400 <20 150 10 650 700 1000 1000

IntronA D5 100 20 35 <20 150 200 180 ND

IntronA D6 30 <20 <20 <20 40 80 40 70

l ntronA D8 30 <20 <20 <20 ND ND ND ND

Intron A D1 1 1000 70 350 40 1500 4000 3000 3000

IntronA D12 700 <20 250 30 1000 800 1500 1000

I ntron A D13 20 <20 <20 <20 35 <20 20 40

IntronA D15 50 <20 25 <20 45 <20 80 50

IntronA D16 3500 450 1000 100 8000 5000 10000 10000

ND:Nodeterminado

5 [00119] En cambio, cuando se utilize una cantidad constante (250 pg/ml) de proteina IFNa1 o IFNa2 (ROFEAONTM o INTRON ATM) on el ensayo de neutralizacion, se obtuvieron titulos de neutralized& similares para un suero determinado (table 4). Asimismo, los titulos de neutralized& de sueros de pacientes tratados con IFNa2a o IFNa2b mostraron diferencias significativas respecto a los ensayos realizados con 10 LU/ml de IFNa2a pegilado (PEGASYSTM) y, en menor medida, con IFNa2b (PEG-INTRONTm), donde pudieron apreciarse actividades

10 especificas nes reducidas quo con las correspondientes molecules natives (Deisenhammer et al., 2004).

[00120] Asi, los resultados de los titulos de neutralized& de sueros de pacientes tratados con IFNa2a o IFNa2b resultaron de forma sistema.tica inferiores a los resultados obtenidos en ensayos con PEG-INTRON', significativamente inferiores a los obtenidos con PEGASYSTM (table 4). Por el contrario, se obtuvieron titulos de

15 neutralized& similares al realizar el ensayo con los mismos sueros y 250 pg de IFNa2a (ROFERONTm), PEG-INTRONTm o PEGASYSTM (table 4). Ninguno de los sueros de pacientes tratados con IFNa2a (ROFERONTM) o IFNa2b (INTRON ATM) fue capaz de neutralizer el IFNf31-a (datos no mostrados) ni el IFN[31-b (table 4).

Determinacion de la actividad neutralizante de los autoanticuerpos anti-IFNI1 humano mediante el ensayo 20 congenes reporteros de iLite

[00121] La presencia de suero human° de voluntarios sanos a una dilucien final de 1:4 no tuvo ningun efecto en el

titulo de IFN de dos preparaciones diferentes de IFNP1-a (AVONEXTM y REBIFTM) on el ensayo con genes

repoderos de iLite (datos no mostrados). En ciertas muestras de suero de pacientes tratados con IFNp quo se

25 sometieron a la prueba sin IFN agregado se encontraron niveles detectables de IFN circulante, en ausencia de anticuerpos anti-IFNP humano (datos no mostrados).

[00122] Diluciones seriadas de muestras de suero de pacientes tratados con IFNP recombinante, se incubaron con 10 LU/mIde IFNP-a (AVONEXTM o REBIFTm) o 10 LU/ml de IFNP1-b (BETAFERONTm), y se sometieron al ensayo de 30 iLite para detectar, a presencia de anticuerpos neutralizantes anti-IFNp, conforme a lo descrito on el epigrafe MATERIALES Y METODOS (figuras 8A a 8C). En los ensayos ciegos, los titulos de NAB de las muestras sometidas al ensayo de iLite, con la misma prepared& de IFN con la quo se trat6 a los pacientes, mostraron resultados muy prOximos a los valores obtenidos con un bioensayo antiviral (datos no mostrados). Los titulos de NAB oscilaron on un intervalo entre <10 y 150 000 TRU/ml. Los titulos de neutralized& de sueros de pacientes tratados con IFN31-a 35 (AVONEXTM o REBIFTM) mostraron resultados identicos o muy similares a las pruebas realizadas con 10 LU/m1 de AVONEXTM o REBIFTM, aunque significativamente diferentes a los obtenidos con 10 LU/ml de IFNP1 -b (BETAFERONT"), tal como se muestra on la table 5. En cambio, al realizar el ensayo de neutralized& con una cantidad constante (50 pg/ml) de protelna IFNp1-a (AVONEXTM o REBIFTM) o IFNB1-b (BETAFERONTm), se obtuvieron Mulos de neutralized& identicos o muy similares para un suero determinado al usar cualquiera de los

40 tres subtipos de IFNp (table 5). Adernas, cuando se use una cantidad constante (50 pg/ml) de proteina IFNp on el ensayo de neutralizacion, los Mulos obtenidos para una muestra de suero determinada de un paciente tratado con 22

IFN61-a (AVONEXTM o REBIFTM) o IFNP1-b (BETAFERONTm) resultaron muy similares a los obtenidos al realizar el ensayo con el mismo IFN con el que se habia tratado al paciente, o con otra subespecie distinta de iFNp (table 5).

[00123] Ninguna de las muestras de suero de pacientes tratados con IFN6 recombinante, tanto el IFN61-a (AVONEXTM o REBIFTm) como el IFNI31-b (BETAFERONTm), fue capaz de neutralizer el IFNa2a (ROFERONTM) o IFNa2b (INTRON ATM) (datos no mostrados).

Table 5. Comparacion de los titulos de NAB Anti-IFNa obtenidos con dosis de antigen° bien como masade proteina IFN o bien como 10 Unidades Funcionales de Laboratorio (LU) Terapia N2suero Interferon 10LU/ml 50 pg/ml Betaferon Rebif Avonex Betaferon Rebif Avonex Betaferon Cl 25 100 100 25 40 25 Betaferon C2 100 350 400 100 150 150 Betaferon C3 150 700 900 150 200 250 ND C4 200 900 1 . 000 200 300 200 Betaferon C5 15.000 50.000 50.000 15.000 . 1000. 0

1 5 000 Rebi f C6 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Betaferon C7 600 3.500 4.000 600 700 500 Betaferon C8 300 7.000 2. 500 300 400 350 Rebif C9 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Betaferon C10 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Avonex C1 1 7.000 35.000 25.000 7.000 8.000 10.000 Betaferon C12 150 2.000 1 .200 150 150 150 ND C13 4.000 40.000 24.000 4.000 6. 000 6.000 Betaferon C14 200 2.500 2.500 200 200 300 Avonex 81 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Betaferon B2 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Avonex 83 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Avonex B4 <20 <20 <20 <20 <20 <20 Rebi f B5 <20 <20 <20 <20 <20 <20 ND 86 150 700 700 150 150 150 Reb i f 87 100 700 450 100 200 200 Reb i f 88 400 4.000 4.000 400 1 .000 900 Betaferon 89 <20 80 30 <20 <20 <20

ND B10 <20 25 20 <20 <20 <20 ND B11 30 300400 30 35 35 ND Nodeterminado

:

ANALISIS

[00124] La administraci6n repetida de hornologos recombinantes de proteinas humanas puede bajar la tolerancia inmunitaria a los autoantigenos y desencadenar la producciOn de autoanticuerpos, como ocurre en el caso de los interferones, IL-2, GM-CSF y EPO (Schellekens, 2003). Los autoanticuerpos para el IFNa quo se producen en pacientes con hepatitis C cr6nica, que han sido tratados con IFNa recombinante, son generalmente anticuerpos de uni6n, sin consecuencias adversas aparentes para or paciente. No obstante, los anticuerpos neutralizantes aparecen

enuna proporcion elevada de pacientes con RRMS quo ban sido tratados con IFN6, y se asocian a una reducci6n de los efectos terapeuticos y de la progresiOn de a enfermedad (Hartung et al., 2007; Noronha, 2007; y Namaka et al., 2006). Para detectar anticuerpos neutralizantes es necesario recurrir a ensayos basados en celulas, que en muchas ocasiones parten de objetivos imprecisos, como la inhibicien de la proliferacien celular o de los efectos citopaticos virales (Meager, 2006). En un intento de obtener un bioensayo mas preciso para el IFN humano de Tipo

Listado de secuencias

[0130]

<110> TOVEY, Michael LALLEMAND, Christophe

<120> METHOD FOR CONDUCTING AN ASSAY FOR NEUTRALIZING ANTIBODIES

<130> TOVEY9APCT

<150> US60/983,813

<151> 2007-10-30

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 5849

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Synthetic

<220>

<221> CDS

<222> (328).11980)

<400> 1

cccgggaggt accgagctct tacgcgtgct agctcgactc gggaaaggga aaccgaaact 60

gaagcccctc gggaaaggga aaccgaaact gaagcccgat ctgcatctca attagtcagc 120

aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca 180

ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc 240

ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa 300

gcttggcatt ccggtactgt tggtaaa atg gaa gac gcc aaa aac ata aag aaa 354 met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys Lys 1 5

ggc ccg gcg cca ttc tat cct cta gag gat gga acc gct gga gag caa 402 Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu Gin 10

15 20 25

ctg cat aag gct atg aag aga tac gcc ctg gtt cct gga aca att gct 450 Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile Ala 30

35 40

ttt aca gat gca cat atc gag gtg aac atc acg tac gcg gaa tac ttc 498 Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr Phe 45 50 55

gaa atg tcc gtt cgg ttg gca gaa gct atg aaa cga tat ggg ctg aat 546 Glu Met Set Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu Asn 60 65 70

aca aat cac aga atc gtc gta tgc agt gaa aac tct ctt caa ttc ttt 594

<212> DNA <213> Artificial

<220> <223> Synthetic

<400> 5 ctcgggaaag ggaaaccgaa actgaagccc ctcgggaaag ggaaaccgaa actgaagccc

60

<210> 6 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial

<220> <223> Synthetic

<400> 6 ggraaagwga aactg

1 5

<2 1 0> <2 1 1 > <2 1 2> <2 1 3>

7 2 1 DNA Arti ficial

<220> <223>

Synthetic

<2 20> <2 21 > <2 22 > <2 2 3>

misc feature ( 1 ) . . ( 3 ) n is either a, _ c, g, or t .

<220> <2 2 1> <2 22> <2 23>

misc feature ( 6) ( 6) n is either a, _ — c, g, or t .

<220> <221> <2 22> <22 3>

misc feature ( 1 6) . . ( 1 6) n is either a, _ c, g, or t .

<220> <22 1> <22 2> <22 3>

misc feature ( 1 9) ( 1 5 ) n is either a, _ — c, g, or t .

<220> <22 1 > <22 2> <223>

misc feature ( 2 1 ) . . ( 2 1 ) n is either a, _ c, 9, or t .

<4 00> 7 nnnsanttcc gggaantgns n

21

<210>

8

44

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para realizar un ensayo de neutralización para el título de los anticuerpos en una muestra, donde dichos anticuerpos son específicos para una molécula diana predeterminada que activa la actividad de transducción de señal de una proteína de una superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones, o son específicos para un antagonista de dicha molécula diana predeterminada, donde dicho método comprende:

   la preparación de una dilución seriada de la muestra; la adición a cada dilución de una cantidad fija de la molécula diana, donde dicha cantidad se corresponde con una unidad de actividad predeterminada de la molécula diana, y donde la concentración de molécula diana es la misma en cada dilución; la realización de un ensayo con genes reporteros a cada una de las diluciones para determinar la cantidad de actividad residual de la molécula diana en cada dilución, donde dicho ensayo con genes reporteros comprende la medición del nivel de un producto de genes reporteros cuando dicha dilución entra en contacto con una línea celular transformada mediante una construcción que comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un producto del gen reportero, vinculado operativamente a uno o varios elementos de control transcripcional, que se regula por la actividad de transducción de señal de una proteína de la superficie celular o de un receptor de reconocimiento de patrones en respuesta a una señal extracelular generada por dicha molécula diana; y la determinación de la dilución en la que la actividad de la molécula diana agregada se reduce un factor predeterminado x, donde dicho título se expresa como una reducción de x veces en unidades de actividad/mi, donde la sensibilidad del ensayo de neutralización aumenta, donde la línea celular usada en dicho ensayo con genes reporteros se ha tratado con un agente antimitótico o proapoptótico para que adquiera la propiedad de mantener dicha actividad de transducción de señal durante al menos alrededor de una hora, aunque perderá dicha actividad e incurrirá en muerte celular en un plazo no superior a 30 días a una temperatura superior a la temperatura de congelación.

2. 2.

   El método según la reivindicación 1, donde dicha línea celular tratada, sustancialmente de manera inmediata tras el tratamiento, se ha resuspendido en una solución que contiene un crioconservante, se ha congelado aproximadamente a _800 e y posteriormente se ha descongelado antes de su uso en dicho ensayo con genes reporteros.

3. 3.

   El método según la reivindicación 2, donde dicho crioconservante es dimetilsulfóxido (DMSO) y dicha solución contiene un 10% de DMSO.

4. 4.

   El método según la reivindicación 2, donde dicho crioconservante es una combinación de un 2,5% de dimetilsulfóxido (DMSQ) y un 10% de glicerol.

5. 5.

   El método según la reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es vinblastina.

6. 6.

   El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es 5-fluorouracilo.

7. 7.

   El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico o proapoptótico es mitomicina e, un agente intercalante antitumoral.

8. 8.

   El método según las reivindicaciones 1 a 4, donde dicho agente antimitótico O proapoptótico es una radiación y, y donde dicha línea celular ha sido irradiada con radiación y a una intensidad y durante un tiempo suficientes para mantener dicha actividad de transducción de señal durante al menos 1 hora, aunque pierde dicha actividad e incurre en muerte celular en un plazo no superior a 30 días a una temperatura superior a la temperatura de congelación.

9. 9.

   El método según las reivindicaciones 1 a 8, donde dicha proteína de la superficie celular es un receptor de superficie celular.

10. 10.

    El método según la reivindicación 9, donde dicho receptor de la superficie celular se selecciona de un grupo compuesto por un receptor de citoquinas, un receptor de factores de crecimiento, un receptor de hormonas, un neurorreceptor, un receptor de células T, un receptor de antígenos, y un receptor complementario.

11. 11.

    El método según la reivindicación 9, donde dicho receptor de la superficie celular es un receptor de interferón de Tipo 1, y dicha señal extracelular es proporcionada por un interferón de Tipo I como la molécula diana predeterminada.

12. 12.

    El método según la reivindicación 11, donde la molécula diana predeterminada es un interferón o.

13. 13.

    El método según la reivindicación 11, donde la molécula diana predeterminada es un interferón 13.