ES2729501T3 - Ensayo de gen indicador, kit y células con sensibilidad y/o especificidad mejoradas para determinar el nivel del TNF-gamma - Google Patents

Abstract

Una linea celular transformada con una construccion de gen indicador que comprende una secuencia de nucleotidos que codifica un producto genico indicador unido operativamente a un elemento de control de la transcripcion, en la que: a) dicho elemento de control de la transcripcion es un promotor sintetico que comprende un promotor minimo SV40 y la secuencia GAS definida por la SEQ ID NO: 1, y en donde la construccion carece de elementos de respuesta para otros factores de transcripcion; y b) en donde la celula carece de receptores de interferon de tipo I.

Description

DESCRIPCIÓN

Ensayo de gen indicador, kit y células con sensibilidad y/o especificidad mejoradas para determinar el nivel del TNF-gamma

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un ensayo de gen indicador y a un kit para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, de una señal extracelular que activa la actividad de transducción de la señal de una molécula o de un complejo de superficie celular. La presente invención se refiere adicionalmente a una línea celular que ese puede utilizar en dicho ensayo.

Descripción de la técnica relacionada

Las proteínas de la superficie celular permiten la transducción intracelular de señales extracelulares. Las proteínas de la superficie celular proporcionan a las células eucariotas, así como procariotas, un medio para detectar señales extracelulares y transducen dichas señales intracelularmente de manera que en último término dan como resultado una respuesta celular o una respuesta tisular u orgánica concertada. Las proteínas de la superficie celular, al transmitir intracelularmente la información con respecto al ambiente extracelular mediante rutas intracelulares específicas, inducen una respuesta apropiada a un estímulo particular. La respuesta puede ser inmediata y transitoria, lenta y sostenida, o cualquier mezcla de las mismas. Mediante una matriz de proteínas de superficie de membrana variadas, las células eucariotas son exquisitamente sensibles a su medio ambiente.

Las moléculas de señal extracelulares, tales como citocinas, factores de crecimiento, hormonas, vasodilatadores y neurotransmisores, ejercen sus efectos, al menos en parte, mediante la interacción con proteínas de la superficie celular. Por ejemplo, algunas moléculas de señal extracelular producen cambios en la transcripción de genes diana mediante cambios en los niveles de mensajeros secundarios, tales como el cAMP. Otras señales alternan la expresión genética indirectamente activando la expresión de genes, tales como los genes inmediato-tempranos que codifican proteínas reguladoras, que a su vez activan la expresión de otros genes que codifican proteínas reguladoras de la transcripción. Otras moléculas de señal extracelular producen la activación de transductores de señal citoplasmática y proteínas activadoras de la transcripción (STAT) que aumentan la transcripción de grupos específicos de genes.

Los receptores de superficie celular y los canales de iones están entre las proteínas de superficie celular que responden a señales extracelulares e inician los eventos que dan lugar a esta expresión genética y respuestas variadas. Los canales de iones y los receptores localizados en la superficie celular son ubicuos y proteínas de la membrana de la superficie celular fisiológicamente importantes.

Receptores de superficie celular

Los receptores localizados en la superficie celular son proteínas que abarcan la membrana que se unen a moléculas de señalización extracelular o cambios en el medio ambiente extracelular y transmiten la señal mediante las rutas de transducción de la señal para efectuar una respuesta celular. Los receptores de la superficie celular se unen a moléculas de señal circulantes, tales como las citocinas, factores de crecimiento y hormonas, etc., como la etapa inicial en la inducción de numerosas rutas intracelulares. Los receptores se clasifican basándose en el Tipo particular de ruta que se induce. Entre estas clases de receptores hay clases de receptores de citocinas que incluyen las que se unen a factores de crecimiento y que tienen una actividad tirosina cinasa intrínseca, tales como los receptores del factor de crecimiento que se unen a la heparina (HBGF), la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas, la superfamilia de receptores de citocinas/hematopoyetina, la superfamilia de receptores del factor de crecimiento de nervios, otros receptores de tirosina o serina cinasas, y los que se acoplan a proteína efectoras mediante proteínas reguladoras de la unión del nucleótido guanina, a los que se hacer referencia como receptores acoplados a proteína G y proteínas G, respectivamente.

Las citocinas son mensajeros intercelulares que coordinan la comunicación entre las células de un tejido particular, por ejemplo, interacciones entre anticuerpos y células T del sistema inmunitario, y sirven para modular o modificar la repuesta biológica. Son pleiotrópicas y tienen un amplio espectro de efectos biológicos sobre más de un Tipo de células o tejidos. Los receptores para las citocinas se agrupan ampliamente en dos clases, en que los receptores de ^{citocinas de Clase I incluyen receptores que se unen a distintas interleucinas (IL-2, IL-3, IL-4, IL-}6^{, IL-7, IL-9, IL-11,} IL-12, IL-15), eritropoyetina (EPO), hormona de crecimiento (GH), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), y factor neurotrófico ciliar (CNTF), y los receptores de citocina de Clase II incluye receptores que se unen al interferón (IFN) o/p, IFF^y e IL-10.

Receptores de interferón

Los interferones humanos (IFN) son una familia de citocinas helicoidales homólogas compuestas por tres clases distintas: Tipo I, Tipo II, y Tipo III que se basan en la homología de secuencias de nucleótidos y aminoácidos. Los IFN Tipo I humanos consisten en IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-^k, e IFN-w. El IFN-a humano incluye un grupo de proteínas relacionadas estrechamente codificadas por al menos 12 genes de IFN-a funcionales. Los IFN-p, IFN-£, IFN-k e IFN-w se codifican por genes relacionados únicos relacionados más distantes. El IFN Tipo II, o IFN-y, esta codificado por un gen no relacionado y se une a distintos receptores de superficie celular (De Maeyer et al., 1988; Pestka et al., 1987 y Diaz et al., 1993). Recientemente, se ha descrito un nuevo grupo de interferones designados IFN-X o IFN de Tipo III. El grupo tiene tres miembros IFN-X1, IFN-X2, e IFN-X3 también llamado interleucina-29 (IL-29) (X1), e IL-28A/B (X2/3). (Sheppard et al., 2003; y Ank et al., 2006).

Los IFN Tipo I se unen a un receptor común, como se muestra por su capacidad para competir de manera cruzada por la unión al receptor (Pestka et al., 1987; Branca et al., 1981; y Merlin et al., 1985). El receptor de interferón Tipo I tiene el número más grande de ligandos naturales, algunos hasta 14 en total, de todos los receptores de citocinas conocidos. La unión de los interferones a su receptor de superficie celular representa la etapa inicial y probablemente más específica de la ruta de señalización de IFN.

El receptor del IFN Tipo I está compuesto por dos glucoproteínas transmembrana, INFAR1 y INFAR2 (Uze et al., 1990; Novick et al., 1994; Lutfalla et al., 1995; Domanski et al., 1995), que se tirosina-fosforilan rápidamente después de la unión con el IFN (Platanias et al., 1994; Constantinescu et al., 1994; y Abramovich et al., 1994). Ambas subunidades pertenecen a la superfamilia de receptores de citocinas de clase II (Bazan et al., 1990 y Thoreau et al., 1990) y son necesarios para la unión de ligando de alta afinidad y el establecimiento de la actividad biológica (Langer et al., 1996 y Domanski et al., 1996). Los receptores de citocinas de Clase II se distinguen de los receptores de Clase I basándose en el patrón de las parejas conservadas de restos de cisteína que se cree que forman enlaces disulfuro.

El receptor del IFN Tipo II (IFNy) está compuesto por dos glucoproteínas transmembrana, IFNGR1 e IFNGR2 que se pre-ensamblan en la superficie celular. La unión del IFN^y a su receptor activa las tirosina cinasas Jak1 y Jak2 dando como resultado la tirosina-fosforilación y la formación de un homodímero Stat1. El homodímero Stat1 activado se translocaliza entonces en el núcleo donde se une a la GAS (Secuencia activada gamma) dando como resultado la activación transcripcional de los genes activados de IFN^y.

Los interferones de Tipo III se une a un receptor único que comprende la IL-28Ra, que es específica de una cadena de los IFN-X, y la cadena IL-10Rp que también es parte de los receptores para la IL-10, IL-22, e IL-26 (Ank et al, 2006).

Al contrario que con otros receptores de citocinas, particularmente el receptor de IFN^y, ni el IFNAR1 ni el IFNAR2 solos se unen a IFNa ni a IFNp con una afinidad comparable al heterodímero. A pesar del hecho de que el IFNAR2 tiene un papel importante en la unión al ligando, el IFNAR1 contribuye a la unión con el IFN aumentando la afinidad del complejo de receptores (4-10 veces) respecto al del IFNAR2 solo. El IFNAR1 también modula la especifidad de la unión al ligando respecto a la observada en el IFNAR2 solo (Cohen et al., 1995; Russell-Harde et al., 1995; Cutrone et al., 1997; y Cook et al., 1996). El IFNAR1 tiene un dominio extracelular más grande que la mayoría de los demás receptores de citocinas de Clase II, compuesto por 4 subdominios Tipo inmunoglobulinas separados por motivos di o tri-prolinas que se pueden dividir en dos repeticiones en tándem (Novick et al., 1994; Lutfalla et al., 1992; y Uzé et al., 1995).

El IFNAR1 humano, murino y bovino se han clonado y expresado en células humanas y murinas. Los estudios que se han llevado a cabo con células transfectadas muestran que el IFNAR1 tiene un papel central en la unión al ligando, las respuestas celulares a los IFN y en la inducción de actividades biológicas de los interferones Tipo I (Novick et al., 1994; Abramovich et al., 1994; Uzé et al., 1992; Mouchel-Vielh et al., 1992; Lim et al., 1993; Cleary et al., 1994; Constantinescu et al., 1995; Hwang et al., 1995; Vandenbroek et al., 1995; y Colamonici et al., 1994). El receptor del IFN también determina el alto grado de especificidad de especie característico de los IFN. Por lo tanto, la transfección de células de ratón con IFNAR1 e IFNAR2 hace que las células de ratón sean sensibles a los IFN Tipo I humanos ya que tanto las células humanas como las de ratón comparten una ruta de señalización común y elementos de respuesta a IFN comunes en las regiones de los genes regulados por IFN. Además, se ha demostrado que el dominio intracelular del IFNAR1 tiene un papel clave en la transducción de la señal iniciada en la superficie celular uniendo los interferones de Tipo I al núcleo (Basu et al., 1998). La destrucción dirigida del gen de IFNAR1 da como resultado la pérdida de la respuesta antivírica de los IFN Tipo I demostrando que este receptor polipeptídico es un componente esencial del complejo de receptores y que se necesitan tanto la subunidad IFNAR1 como IFNAR2 para la señalización de IFNa e IFNp (Vandenbroek et al., 1995; Muller et al., 1994; Fiette et al., 1995; Steinhoff et al., 1995; y van den Broek et al., 1995).

La unión del interferón Tipo I al complejo de receptores activa dos Janus cinasas, Tyk2 y JAK1, que median en la tirosina fosforilación y en la activación de dos factores de transcripción citoplasmáticos latentes STAT1 y STAT2 que forman un complejo (ISGF3) con una proteína de unión a ADN p48, proteína de respuesta al interferón 9 (IRF 9), que se translocaliza en el núcleo para promover la transcripción genética específica (Fu et al., 1992; Schindler et al., 1992; Darnell et al., 1994; Ihle et al, 1995; y Taniguchi, 1995). Tanto Tyk2 como STAT2 están asociadas constitutivamente con la región próximas de membrana de la cadena de IFNAR1, mientras que JAK1 y STAT1 están asociadas físicamente con IFNAR2 y los cuatro factores se activan rápidamente durante la estimulación con IFNa (Lutfalla et al., 1995; Bazan, 1990; Basu et al., 1998; Barbieri et al., 1994; Velazquez et al., 1995; Uddin et al., 1995; Yan et al., 1996(a) y 1996(b).

La unión de los IFN Tipo III a su receptor de superficie celular también activa el complejo ISGF3 lo que sugiere que los IFN Tipo III también activan varios genes en común con los IFN Tipo I (Ank et al., 2006).

Las poblaciones clave de células incluyen las CD distribuidas a lo largo de los tejidos periféricos actúan como centinelas capaces de reconocer agentes infecciosos por medio de receptores de reconocimiento de patrones (PRR). Estos incluyen la familia de receptores Tipo Toll (TLR) de la superficie celular y los receptores de membrana endosómicos (Uematsu y Akira, 2007) y los receptores proteicos citosólicos Tipo gen I inducible por el ácido retinoico (RIG-I), RIG-i, MDA5 y LGP2 (Yoneyama y Fujita, 2007). Se han identificado trece miembros de la familia de TLR en mamíferos (Uematsu y Akira, 2007). Cada TLR media en una respuesta distinta en asociación con diferentes combinaciones de cuatro proteínas adaptadoras que contienen el domino del receptor de IL-1/Toll (TIR) ^(MyD88^{, TRIF, TRAP/MAL, y TRAM). Todos los TLR excepto el TLR3 interactúan con MyD}88^{. El TLR3 que reconoce} el ARN vírico de cadena sencilla o cadena doble, se localiza en los endosomas de las CD mieloides y necesita la acidificación de vesículas para la activación. El TLR3 señaliza mediante TRIF y activa el TBK1/I KKe que fosforila el factor 3 regulador de interferón 3 (I RF3) y NFkB, que da como resultado la producción de IFNp (Hemmi et al, 2004, Perry et al., 2004). Los receptores proteicos Tipo RIG-I son DExD/H box ^a Rⁿ helicasas, dos de las cuales, RIG-I y MDA5, albergan motivos Tipo activación de caspasa y del dominio de reclutamiento (CARD) en el extremo N (Yoneyama y Fujita, 2007). El dominio CARD interactúa con IPS-1 dando como resultado la activación de IRF3 y NFkB, y la producción de IFNp. Por lo tanto, la activación de los PRR da lugar a la producción de citocinas pro­ inflamatorias que incluyen los IFN Tipo I y la activación de la respuesta inmunitaria innata. Las células dendríticas señalizan principalmente mediante los TLR mientras que los receptores Tipo RIG-I predominan en otros Tipos celulares. Se pueden distinguir dos sub-grupos principales de CD en el ser humano, CD mieloides derivadas de monocitos, CD11c(+), presentes en la mayoría de los tejidos, y CD plasmacitoides (pCD), CD11c(-), presentes principalmente en los ganglios linfáticos. Las CD plasmacitoides son las productoras principales de IFN Tipo I en respuesta a virus (Steinmann y Hemmi, 2006). Las CD plasmacitoides expresan altos niveles de TLR 7/8 y TLR9 que reconocen ARN de cadena sencilla (ssARN) y ADN CpG, respectivamente (Diebold et al., 2004, Heli et al., (2004). Hemmi et al., 2000) La activación tanto de TLR 7/8 y TLR9 da lugar a la formación de un complejo con ^MyD88 ^{y la fosforilación de IRF7 y la producción de altos niveles de IFN de Tipo I (Uematsu y Akira, 2007).}

Receptores de TNF

El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) en una citocina multifuncional que ejerce efectos pleiotrópicos en diferentes Tipos celulares. El TNF-a se sintetiza como pro-TNF, una proteína unida a la membrana de 26 kDa, que se libera al escindir su dominio pro por la enzima convertidora de TNF (TACE) para dar lugar a una proteína de 17 kDa que consiste en 157 aminoácidos que se encuentra como un homotrímero en solución. El TNF-a se une a dos receptores distintos el TNFR-1 (p55) y el TNFR-2 (p75). El TNFR-1 contiene un dominio de muerte (ausente en el TNFR2) que está implicado en la inducción de apoptosis. La unión del homotrímero de TNF-a al TNFR-1 da como resultado la trimerización del TNFR-1 y se libera el silenciador del dominio de muerte (SODD). El dominio de muerte asociado al TNFR (TRADD) se une al dominio de muerte del TNFR-1 y recluta proteínas adaptadoras, proteína que interactúa con el receptor (RIP), factor 2 asociado al TNFR (TRAF-2), y el dominio de muerte asociado a Fas ^{(FADD). El TNFR-1 señaliza la apoptosis, uniéndose el FADD a la pro-caspasa-}8^{, cuya activación da lugar a la} inducción de una cascada de proteasas que da como resultado a la apoptosis. El TNFR-1 señaliza la supervivencia por reclutamiento de TRAF-2 que inhibe la apoptosis mediante la proteína citoplasmática inhibidora de apoptosis (cIAP). Una de las rutas de señalizaciones principales desencadenadas por el reclutamiento de TRAF-2 y RIP por el complejo del receptor TNFR-1 es la ruta NF-kB que transduce una señal en el núcleo culminando en la activación transcripcional de varios genes diana de TNF (Schwamborn et al., 2003). El NF-kB es un factor de transcripción ubicuo inducido por varias citocinas (que incluyen IFNy, IL2, IL5 e IFNa2). El NF-kB está implicado en la regulación de numerosos genes implicados en procesos que incluyen, la respuesta inflamatoria, apoptosis, cáncer, supervivencia neuronal, e inmunidad innata. La activación del NF-kB se controla principalmente a nivel posttranscripcional por degradación de la subunidad inhibidora IkB del complejo p55/p65/IkB presente en el citoplasma. Los estímulos activadores tales como el TNF-a activan un complejo cinasa compuesto por dos cinasas específicas de ^kB (IKKa e IKKp) y una subunidad moduladora (NEMO o IKK^y). Esto da lugar a la fosforilación de la subunidad inhibidora, que se ubiquitinila entonces y se degrada mediante el proteosoma. Esto desencadena la translocalización del NF-kB en el núcleo, donde inicia la transcripción uniéndose a secuencias reguladoras (secuencias de unión/reconocimiento de NF-^kB) presentes en la región promotora de los genes diana de NF-^kB.

Receptores acoplados a G

Las rutas de señalización transmembrana de proteína G consisten en tres proteínas: los receptores, las proteínas G y los efectores. Las proteínas G, que son intermediarias en las rutas de señalización transmembrana, son heterodímeros y consisten en subunidades a, p y y. Entre los miembros de una familia de proteínas G las subunidades a son diferentes. Las funciones de proteínas G se regulan por la asociación cíclica de GTP con la subunidad a seguido por la hidrólisis de GTP a GDP y disociación del GDP.

Los receptores acoplados a proteína G son una clase de receptores diversa que median la transducción de señales uniéndose a las proteínas G. La transducción de señal se inicia mediante la unión al ligando con el receptor de la membrana celular, que estimula la unión del receptor a la proteína G. La interacción de receptor con proteína G libera GDP, que se une específicamente a la proteína G y permite la unión de GTP, que activa la proteína G. La proteína G activada se disocia del receptor y activa la proteína efectora, que regula los niveles intracelulares de mensajeros secundarios específicos. Ejemplos de dichas proteínas efectoras incluyen la adenil ciclasa, fosfolipasa C, y otras.

Factores de crecimiento y receptores de factores de crecimiento

Los factores de crecimiento polipeptídicos son moduladores de la proliferación y diferenciación celular cuyas funciones biológicas están mediadas por la interacción del factor de crecimiento con los receptores de la superficie celular y las posteriores alteraciones de la expresión genética. Los factores de crecimiento se unen a receptores específicos y parece que inducen la tirosina fosforilación y la síntesis de ARNm c-fos. Además, al menos algunos factores de crecimiento, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (Yeh et al., 1987) y factor 2 de crecimiento de unión a heparina o factor de crecimiento de fibroblastos (Bouche et al., 1987), se translocalizan en el núcleo.

La activación de los receptores de factores de crecimiento por la interacción con los factores de crecimiento específicos o con agentes tales como el acetato forbol místrico (PMA) activa la proteína cinasa C, que es una familia de proteína cinasas activadas por calcio y fosfolípidos. Esta activación da como resultado la transcripción de una matriz de genes que codifican factores de transcripción de proto-oncogenes, incluyendo c-fos, c-myc, y c-jun, proteasas, inhibidores de proteasas, incluyendo la colagenasa Tipo I y el inhibidor del activador de plasminógeno, y moléculas de adhesión, que incluyen la molécula de adhesión intercelular I. La activación de proteína cinasa C antagoniza con la actividad del factor de crecimiento por la rápida fosforilación de receptores de factores de crecimiento, que de esta manera disminuye la actividad de la tirosina cinasa. Se cree que los factores de crecimiento y otros mitógenos que inducen la proliferación celular y el crecimiento celular tienen un papel en el crecimiento tumoral que a menudo albergan receptores de superficie celular identificables para los factores de crecimiento y otras señales extracelulares.

La interacción del factor de crecimiento de nervios (NGF) con su receptor es típica de la matriz de respuestas que induce dicha señal extracelular. El NGF es una hormona polipeptídica de crecimiento que es necesaria para la diferenciación y crecimiento de la neurona sensitiva derivada de la cresta neural. El NGF se une a su receptor de la superficie celular específico y se transporta retrógradamente al cuerpo celular (Changelian et al., 1989). Esto inicia una cascada de eventos intracelulares, que culminan en un fenotipo diferenciado. Las células PC12, que son una línea celular de feocromocitoma de rata, se utilizan como modelo para el estudio de la diferenciación mediada por NGF. Cuando las células se PC12 se tratan con NGF, cambian de células Tipo cromafines adrenales replicantes a células Tipo neuronas simpáticas excitables eléctricamente no replicantes.

Junto con los cambios fenotípicos, existe la inducción y expresión de genes específicos. La unión del NGF a las células PC12 induce la expresión inmediata y rápida de ciertos genes, incluyendo los genes de c-fos, NGF1-A, y NGF1-B, a los que se hace referencia como genes tempranos. Se cree que dichos genes tempranos codifican reguladores de la transcripción. El producto del gen NGFl-A contiene dominios en “dedos de zinc” repetidos en tándem que son característicos de las proteínas de unión a ADN, y el NGF1-B proteico es homólogo a los miembros de la familia de receptores de glucocorticoides y, por lo tanto, pueden funcionar como modulador de la transcripción dependiente de ligando. El producto del gen c-fos, FOS parece funcionar como una molécula reguladora de la transcripción.

El gen c-fos y genes relacionados

Como se ha expuesto anteriormente, la inducción de la expresión del gen c-fos es un evento que es común a varias rutas de respuesta que se inician por la actividad de varias proteínas de la superficie celular.

El producto del gen c-fos, FOS, se asocia con el activador de la transcripción JUN, que es el producto del gen c-jun, para formar un complejo que forma un complejo de activación de la transcripción, AP-1. La transcripción de ambos c-fos y c-jun se induce rápidamente y transitoriamente después de la estimulación. Los ARNm inducidos se acumulan durante 1-2 horas en el citoplasma en el que las proteínas FOS y JUN, que tienen una vida corta, se traducen y después se translocalizan en el núcleo para formar un complejo proteico heterodimérico que se une al elemento regulador de ADN, el sitio de unión de AP-1.

Los genes c-fos y c-jun son miembros de familias genéticas que codifican proteínas que participan en la formación de complejos heterodiméricos que interactúan con los sitios de unión AP-1. El factor de transcripción AP-1 está compuesto de varios complejos proteicos cuyas concentraciones cambian con la estimulación celular. Estos complejos interactúan específicamente con un motivo de secuencias de nucleótidos con un núcleo de siete bases, del que se sabe que es un constituyente relativamente común de elementos reguladores de la transcripción tanto positivos como negativos y que son necesarios tanto para los niveles de la expresión genética basales como inducidos.

Los productos génicos, FOS y JUN cooperan en la regulación de genes diana que soportan muchas respuestas celulares y adaptativas al medio ambiente. Están implicados en varios procesos neurofisiológicos.

Por lo tanto, la inducción de c-fos implica rutas de mensajeros secundarios distintos que actúan mediante elementos reguladores separados y que modifican diferencialmente, el producto génico resultante, FOS, que a su vez interactúa con diferentes rutas con proteína JUN modificada diferencialmente. Por lo tanto, una multitud de eventos extracelulares induce la expresión de un pequeño número de proteínas inducibles que forman una matriz de complejos proteicos que pueden unirse diferencialmente a elementos reguladores de ADN que contienen sitios de ^{unión AP-}1^{. Por lo tanto, muchas proteínas de la superficie celular pueden actuar mediante rutas de transducción} solapadas y transducen señales extracelulares que en último término inducen varias respuestas.

Hay muchos ensayos que se pueden basar en la actividad in vivo en una línea celular viva. Un ejemplo es una línea celular que tiene un Elemento de Respuesta Estimulante de Interferón (ISRE) conectado a un gen de luciferasa, u otro gen indicador, de manera que cuando la línea celular se somete a la presencia del interferón como señal extracelular, la actividad de transducción de la señal de los receptores de la superficie celular del interferón endógeno produce una señal que activa el ISRE, que produce entonces la transcripción del gen de luciferasa. Por lo tanto, la actividad de luciferasa de creación de luz se puede medir y se relaciona con la cantidad de interferón que está presente en la muestra, y que es proporcional a la cantidad de interferón a lo largo de un intervalo particular (Lallemand et al., 1996).

Lleonart et al. (1990) describieron un ensayo de gen indicador para el interferón Tipo I basado en células Vero de mono transfectadas con el promotor Mx de ratón inducible por el interferón Tipo I unido al gen de la hormona de crecimiento humana (hGH) como gen indicador. Este ensayo de interferón Tipo I se desarrolló adicionalmente transfectando las células Vero de mono con un plásmido que alberga el gen indicador de luciferasa bajo el control del promotor Mx1 de ratón inducible por interferón Tipo I (Canosi et al., 1996).

Un Tipo adicional de ensayo de gen indicador de interferón se desarrolló por Hammerling et al. (1998) que utilizó una línea celular de glioblastoma humano transfectada con una construcción de gen indicador del promotor proteico ácido fibrilar (GFAP) y un gen indicador de p-galactosidasa (IacZ) de E. coli.. En este ensayo en particular, lo que se mide es la reducción/inhibición de la expresión de p-galactosidasa por el interferón humano Tipo I o Tipo II de una manera selectiva y dependiente de la dosis. El documento WO 2004/039990 desvela una línea cellular que comprende una construcción de gen indicador que puede activarse mediante la señalización corriente abajo del receptor de IFN-gamma, comprendiendo dicha construcción un gen indicador unido a un elemento de la transcripción con un promotor mínimo SV40 y un elemento de respuesta STAT1.

Sumario de la invención

Es un objetivo de la presente invención desarrollar un gen indicador contenido en una línea celular con una especificidad y/o sensibilidad por una señal extracelular particular de interés (es decir, un ligando) de manera que se pueda utilizar en un ensayo de gen indicador para determinar con precisión la presencia y/o el nivel de la señal extracelular de interés en presencia de otras señales extracelulares que son capaces de activar la misma ruta de transducción de la señal iniciada por una primera molécula o complejo de la superficie celular como la señal extracelular de interés o que son capaces de activar otra ruta de transducción de la señal capaz de modular la transcripción del gen indicador. La invención se define a través de las reivindicaciones adjuntas.

Por lo tanto, la presente divulgación proporciona una línea celular transformada con una construcción de gen indicador que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador unido operativamente a un elemento de control de la transcripción que se activa como parte de la ruta de transducción de la señal iniciada por una primera molécula o complejo de la superficie celular en respuesta a una primera señal extracelular (la señal extracelular de interés). La ruta de transducción de la señal incluye un factor de transcripción que se une al elemento de control de la transcripción de manera que activa el elemento de control de la transcripción y de esta manera regula la transcripción del gen indicador. La sensibilidad y/o especificidad de la respuesta de esta línea celular por la señal extracelular de interés está mejorada debido a:

a) el elemento de control de la transcripción es una modificación de un elemento de control de la transcripción de origen natural o de un elemento de control de la transcripción sintético que contiene una o más secuencias de reconocimiento específicas del factor de transcripción, que se activa como parte de la ruta de transducción de la señal iniciada por la primera señal extracelular, y por tanto de la sensibilidad y/o especificidad del elemento de control de la transcripción aumentando el número de secuencias de reconocimiento específicas de los factores de transcripción de interés y/o excluyendo secuencias de reconocimiento para factores que son susceptibles de reducir la sensibilidad o especificidad por la señal extracelular de interés; y/o

b) las células de la línea celular carecen de una segunda molécula de superficie que responda a, o sea parte de un complejo que responda a, una segunda señal extracelular, cuya segunda señal extracelular, si la segunda molécula de superficie celular estuviera presente, produciría el inicio de una segunda ruta de transducción que modula la transcripción de dicho gen indicador que disminuya la sensibilidad o especificidad de la respuesta de la primera señal extracelular.

La presente divulgación también proporciona un kit de ensayo basado en células para la determinación con una sensibilidad y/o especificidad mejorada, la presencia y/o nivel de una señal extracelular de interés que activa la actividad de transducción de señal de una molécula o complejo de la superficie celular.

Se proporciona adicionalmente por la presente divulgación un ensayo de gen indicador para determinar la presencia y/o nivel de una señal extracelular de interés (es decir, un ligando) en una muestra.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es una ilustración esquemática de una construcción de gen indicador inicial con los -500 a 1 nucleótidos de la región promotora del gen del factor de respuesta al interferón (IRF-1) clonada corriente arriba del gen indicador de luciferasa de luciérnaga para regular la transcripción de luciferasa de luciérnaga.

La Figura 2 es un gráfico que muestra las unidades de luciferasa relativas (RLU) de la construcción de gen indicador de la Figura 1 en respuesta a IFNy, TNF-a, e IFNy TNF-a.

La Figura 3 es un gráfico que muestra las x veces de inducción de la actividad de luciferasa de luciérnaga convertida a partir de los datos que se muestran en la Figura 2.

La Figura 4 es una ilustración esquemática de una construcción de gen indicador en la que una repetición de 5 tándems del NF-kB canónico (SEQ ID NO: 2) se posiciona corriente arriba del promotor mínimo SV40 para regular la transcripción de la luciferasa de luciérnaga.

La Figura 5 es un gráfico que muestra las unidades de luciferasa relativas en un ensayo de gen indicador utilizando la construcción de gen indicador de la Figura 4 en presencia de distintas cantidades de TNF-a, IFNy, IL-2, IL-5 e IFNa2.

Descripción detallada de la invención

En el presente documento se desvela un ensayo de gen indicador que utiliza una línea celular transfectada con una construcción de gen indicador de manera que el ensamblaje es capaz de detectar y responder a bajos niveles de una señal extracelular (es decir, un ligando) de una manera altamente específica, permitiendo así la cuantificación de la señal extracelular. En una realización preferida, esto se obtuvo utilizando un promotor quimérico sintético, que contenía un número óptimo de elementos de respuesta para los factores de transcripción inducidos por la señal extracelular de interés y que carece de elementos de respuesta para factores de transcripción activados por señales extracelulares no relacionadas (es decir, ligandos), para dirigir un promotor mínimo y regular la expresión de un gen indicador. Se obtiene un nivel adicional transfectando células que albergan un receptor específico para la señal extracelular de interés pero que carecen de receptores para otras señales extracelulares capaces de activar la misma ruta de transducción de la señal que la señal extracelular de interés o que son capaces de activar otra ruta de transducción de señal, capaces de modular la transcripción del gen indicador mediante la interacción con elementos de respuesta específicos de la señal extracelular regulados por el promotor sintético. Dicho ensamblaje mejora también preferentemente el nivel de sensibilidad en la detección de la señal extracelular de interés.

El término “especificidad” como se utiliza en el presente documento es la capacidad de un ensayo de gen indicador para reconocer una señal extracelular particular de interés sin interferencia de otras señale extracelulares. El término “sensibilidad” como se utiliza en el presente documento es la capacidad de un ensayo de gen indicador para detectar cantidades bajas de una señal extracelular de interés que de otra manera sería indetectable en un ensayo que sea menos “sensible” a la señal extracelular.

Más preferentemente, la línea celular de acuerdo con la presente divulgación es en la que la línea celular está a) transformada con una construcción de gen indicador en la que se mejora la sensibilidad y/o especificidad de un elemento de control transcripcional unido operativamente al gen indicador por la modificación de un elemento de control transcripcional de origen natural o un promotor sintético que contiene un número óptimo de elementos de control específico para los factores de transcripción inducidos por la señal extracelular de interés, y b) carente de una segunda molécula o complejo de superficie celular funcional que responda a otras señales extracelulares que interferirían de otra manera con una primera señal de interés produciendo el inicio de una ruta de transducción de la señal que module la transcripción del gen indicador con el fin de mejorar la sensibilidad y/o especificidad de la línea celular a la señal extracelular de interés. Se contempla que la línea celular pueda carecer de más de una molécula o complejo de superficie celular funcional dependiendo de la cantidad de otras moléculas o complejos de la superficie celular sea necesario que estén ausentes/inactivas en la línea celular para evitar la interferencia de otras señales extracelulares en un ensayo de gen indicador con la señal extracelular de interés. La falta de una o más moléculas o complejos de superficie celular funcionales (es decir, receptores y complejos de receptores) en la línea celular puede ser de origen natural o se puede obtener por técnicas tales como “desactivación” inactivando el gen que codifica la molécula de superficie celular o silenciando (“supresión”) el gen que codifica la molécula de la superficie celular utilizando un ARN de interferencia (ARNi).

La molécula de superficie celular de cuya actividad de transducción de la señal, en respuesta a una señal extracelular, regula la expresión de un producto génico indicador puede ser cualquier proteína de la superficie celular que sea conocida por los expertos en la técnica o que pueda ser identificada por los expertos en la técnica. Las proteínas de superficie celular a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a, receptores de la superficie celular y canales iónicos. Ejemplos no limitantes de receptores de superficie celular incluyen receptores de citocinas (por ejemplo, receptores para el interferón Tipo I, interferón Tipo II, factor de necrosis tumoral (TNF), interleucinas, hormona de crecimiento, eritropoyetina (EPO), factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), factor inhibidor de leucemia (LIF), factor neurotrófico ciliar (CNTF), etc.), receptores de factores de crecimiento, receptores de hormonas, receptores de células T, receptores de antígenos, receptores de complemento , receptores de muerte, y neurorreceptores. El texto de referencia, J. M. Cruse y Robert E. Lewis, Atlas of Immunology, CRC Press, Washington, DC, 1999, que desvela muchos receptores implicados en la respuesta inmunitaria y las interacciones del sistema inmunitario se toma como referencia. Los receptores de superficie celular también incluyen, pero no se limitan a, receptores del TNF (por ejemplo, TNF-a), receptores muscarínicos (por ejemplo, el M2 humano (acceso de GenBank n° M16404); M3 de rata (acceso de GenBank n° M16407), M4 humano (acceso de GenBank n° M16405); M5 humano (Bonner et al., 1988); y ^{similares); receptores de acetilcolina nicotínicos neuronales (por ejemplo, los subtipos a}2^{, a3 y p}2^{); la subunidad a}2 de rata (Wada et al., 1988); la subunidad a3 de rata (Boulter et al., 1986); la subunidad a4 de rata (Goldman et al., 1987); la subunidad a5 de rata (Boulter et al., 1986); la subunidad p2 de rata (Deneris et al., 1988); la subunidad p3 de rata (Deneris et al., 1988); la subunidad p4 de rata (Duvoisin et al., 1989); combinaciones de las subunidades a, subunidades p y subunidades a y p de rata; receptores GABA (por ejemplo, las subunidades a1 y p1 bovinas (Schofield et al., 1987); las subunidades a2 y a3 bovinas (Levitan et al., 1988); la subunidad y (Pritchett et al., 1989); las subunidades p2 y p3 (Ymer et al., 1989); la subunidad 5 (Shivers, B.D., 1989); y similares); receptores de glutamato (por ejemplo, el receptor aislado del cerebro de rata (Hollmann et al., 1989); y similares); receptores adrenérgicos (por ejemplo, el p1 humano (Frielle et al., 1987); a2 humano (Kobilka et al., 1987); p2 de hámster (Dixon et al., 1986); y similares); receptores de dopamina (por ejemplo, D2 humano (Stormann et al., 1990); de rata (Bunzow et al., 1988); y similares); receptores NGF (por ejemplo, receptores NGF humano (Johnson et al., 1986); y similares); receptores de serotonina (por ejemplo el 5HT1a humano (Kobilka et al., 1987); 5HT2 de rata (Julius et al., 1990); 5HTlc de rata (Julius et al., 1988); y similares).

También se incluyen como receptores de superficie celular nominalmente los receptores Tipo Toll intracelulares y/o extracelulares y receptores intracelulares tales como RIG-1 y MDA5, debido a que dichos receptores detectan señales extracelulares, tales como partículas víricas o bacterianas o componentes que en el caso de los receptores Tipo Toll intracelulares, interactúan con estos receptores Tipo Toll tras la endocitosis desde la superficie celular. Dichos receptores de superficie celular Tipo Toll (TLR) o de membrana endosómicos (Uematsu y Akira, 2007), o los receptores proteicos RIG-I, MDA5 y LGP citosólicos Tipo gen 1 inducible por el ácido retinoico (GIG-I) (Yoneyama y Fujita, 2007) son ejemplos no limitantes de receptores de reconocimiento de un patrón.

Los canales de iones incluyen, pero no se limitan a, canales de ion calcio (por ejemplo, la subunidad a2 neuronal humana (véase el documento WO89/09834); subunidad a1 de músculo esquelético de conejo (Tanabe et al. 1987); subunidad a2 de músculo esquelético de conejo (Ellis et al., 1988); subunidad p de músculo esquelético de conejo (Ruth et al., 1989); subunidad y de músculo esquelético de conejo (Jay et al., 1990); y similares); canales de potasio (por ejemplo, de cerebro de rata (BK2) (McKinnon, D., 1989); cerebro de ratón (BK1) (Tempel et al., 1988); y similares); canales de ion de sodio (por ejemplo, cerebro de rata I y II (Noda et al., 1986); cerebro de rata III (Kayano et al., 1988); y otros).

Los expertos en la técnica apreciaran que la proteína de superficie celular expuesta anteriormente es preferentemente endógena a la línea celular de la presente divulgación. Sin embargo, también se apreciará que la proteína de superficie celular de la superficie de la célula, o la proteína de superficie celular se puede expresar de un ADN clonado pero será una proteína de superficie celular que es heteróloga a la célula huésped.

Para la transducción de la señal, la señal intracelular que se transduce se inicia por la interacción específica de una señal extracelular, es decir una molécula o un cambio en el medio ambiente extracelular (tal como la luz, la radiación UV, o la radiación ^y), con una molécula o complejo de superficie celular, receptor o canal iónico presentes en la superficie celular. Esta interacción pone en movimiento una cascada de eventos intracelulares, cuya última consecuencia es un cambio rápido y detectable en la expresión de un producto génico, que en la célula de la presente divulgación es un producto génico indicador. La señal extracelular o molécula efectora es cualquier compuesto o sustancia que de alguna manera altera específicamente la actividad de una molécula de superficie celular o un complejo de moléculas de superficie celular (es decir, complejos de receptores). Ejemplos de dichas señales incluyen, pero no se limitan a, moléculas tales como citocinas (es decir, interferones), factores de crecimiento, hormonas, endorfinas, neurotransmisores, acetilcolina, y sustancias mitogénicas, tales como el acetato místrico forbol (PMA), que se unen a los receptores de superficie celular y canales iónicos y modulan la actividad de dichos receptores y canales. Por ejemplo, los antagonistas son señales extracelulares que bloquean o disminuyen la actividad de una proteína de superficie celular y los agonistas son ejemplos de señales extracelulares que potencian, inducen o aumentan de otra manera la actividad de las proteínas de superficie celular.

La construcción de gen indicador albergada en la línea celular de la presente divulgación es una molécula de ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador unido operativamente a elementos/secuencias de control de la transcripción. La transcripción del gen indicador se controla por estas secuencias. La actividad de al menos uno o más de estas secuencias de control está regulada directa o indirectamente por la molécula o complejo de superficie celular. Las secuencias de control de la transcripción incluyen pero no se limitan a promotores y otras regiones reguladoras, tales como secuencias amplificadoras y sitios de unión represores y activadores, por ejemplo, para la unión con un factor de transcripción tal como NF-^kB, que modula la actividad del promotor, o secuencias de control que modulan la actividad o eficacia de la ARN polimerasa que reconoce el promotor, o secuencias de control que son reconocidas por las moléculas efectoras, incluyendo las que son inducidas específicamente por la interacción de una señal extracelular con una proteína de superficie celular. Por ejemplo, la modulación de la actividad del promotor se puede efectuar alterando la unión de la ARN polimerasa a la región del promotor, o, de manera alternativa, interfiriendo el inicio de la transcripción o la elongación del ARNm. Se hace referencia a dichas secuencias colectivamente en el presente documento como elementos de control de la transcripción. Además, la construcción puede incluir secuencias de nucleótidos que alteren la traducción del ARNm resultante, alterando de esta manera la cantidad del producto génico indicador expresado.

Un promotor que se regula o modula por la actividad de una molécula o complejo de superficie celular es un promotor cuya actividad cambia cuando una célula se expone a una señal extracelular particular mediante la presencia de moléculas o complejos de superficie celular cuyas actividades están afectadas por la señal extracelular. Por ejemplo, el promotor c-fos se activa específicamente con la interacción específica de ciertas señales extracelulares, tal como las hormonas de crecimiento, con una molécula de superficie celular, tal como un receptor de la hormona de crecimiento. En particular, la regulación de dichos promotores por la molécula o complejo de superficie celular, aunque indirecta, se produce en unos minutos de la interacción de la molécula o complejo de superficie celular con la señal extracelular. Como se utiliza en el presente documento, unión operativa se refiere a la unión de un elemento de control de la transcripción, es decir, el promotor y/o el sitio de unión al factor de transcripción, con un nucleótido que codifica una secuencia de manera que el elemento de control de la transcripción se posiciona apropiadamente para su actividad de unión a la ARN polimerasa y el inicio de la transcripción de la secuencia de nucleótidos codificante. Por lo tanto, una secuencia de nucleótidos codificante en unión operativa con un promotor, está corriente abajo con respecto a la dirección de la transcripción a partir del promotor, está en el marco de lectura correcto con respecto al sitio de inicio de transcripción y está insertado de manera que dicha elongación de la transcripción progresa a lo largo de la secuencia de nucleótidos codificante.

Los elementos de control de la transcripción adecuados se pueden obtener o derivar de las regiones reguladoras de la transcripción de genes cuya expresión se induce rápidamente, generalmente en minutos, del contacto entre la proteína de superficie celular y la proteína efectora que modula la actividad de la proteína de superficie celular. Ejemplos de dichos genes incluyen, pero no se limitan a, los genes inmediatos tempranos (Sheng et al., 1990), tales como c-fos. Los genes inmediatos tempranos son genes que se inducen rápidamente con la unión de un ligando a una proteína de superficie celular. Los elementos de control de la transcripción que se prefieren para su uso en las construcciones genéticas indicadoras incluyen elementos del control de la transcripción de genes inmediatos tempranos, elementos derivados de otros genes que presentan alguna o todas las características de genes inmediatos tempranos, o elementos sintéticos que se construyen de manera que los genes unidos operativamente entre ellos presenten dichas características. Las características de los genes preferidos a partir de los cuales se derivan los elementos de control de la transcripción incluyen, pero no se limitan a, la expresión baja o indetectable en células quiescentes, inducción rápida a nivel transcripcional en minutos de la estimulación extracelular, inducción que es transitoria e independiente de la síntesis de nuevas proteínas, la posterior interrupción de la transcripción necesita la síntesis de nuevas proteínas, y los ARNm de estos genes tienen una semivida corta. No es necesario que todas estas proteínas estén presentes.

Los promotores y elementos de control de la transcripción adecuados incluyen, pero no se limitan a, la secuencia de IFN gamma activada (GAS) del gen del factor regulador de interferón 1 (IRF-1), SV40 u otros promotores mínimos en combinación con elementos de control de la transcripción tal como secuencias de unión al factor activador o de transcripción (tales como para NF-kB), el promotor del gen del péptido vasoactivo intestinal (que responde a cAMP; Fink et al., 1988); el promotor del gen de la somatostatina (que responde a cAMP; Montminy et al., 1986); el promotor proencefalina (que responde a cAMP, agonistas nicotínicos, y ésteres de forbol; Comb et al. 1986); el promotor del gen de fosfoenolpiruvato carboxi-cinasa (que responde a cAMP; Short et al., 1986); el promotor del gen de NGFI-A (que responde a NGF, cAMP, y suero; Changelian et al., 1989); los elementos de control de la transcripción obtenidos o derivados del gen c-fos; y otros que pueden ser conocidos o preparados por los expertos en la técnica.

El proto-oncogén c-fos es el homologo celular del gen transformante del virus del osteosarcoma FBJ. Este codifica una proteína nuclear lo más probable es que esté implicada en el crecimiento y diferenciación celular. La transcripción de c-fos se activa transitoria y rápidamente por factores de crecimiento y por inductores de otras proteínas de superficie celular, incluyendo hormonas, agentes específicos de la diferenciación, estrés, mitógenos y otros inductores conocidos de proteínas de superficie celular. La activación es independiente de la síntesis de proteínas. Los elementos reguladores c-fos incluyen un TATA box que es necesaria para el inicio de la transcripción, dos elementos corriente arriba para la transcripción basal, y un amplificador, que incluye un elemento con simetría en díada y que es necesario para la inducción por TPA, suero, EGF, y PMA. El elemento amplificador de la transcripción de 20 pb localizado entre 317 y 298 pb corriente arriba del sitio de la protección c-fos de ARNm, es esencial para la inducción sérica en las células NIH 3T3 privadas de suero. Uno de los dos elementos corriente arriba se localiza de 63 a 57 y se parece a la secuencia de consenso para la regulación por cAMP.

Preferentemente, el elemento de control de la transcripción es un promotor quimérico sintético que contiene un promotor mínimo, que es más preferentemente el promotor mínimo SV40, y un número óptimo de elementos de respuesta específicos de los factores de transcripción inducidos por la señal extracelular de interés, pero que carece de elementos para los factores activados para señales extracelulares no relacionadas.

En una realización de la presente divulgación, la línea celular contiene una construcción de gen indicador que tiene tanto especificidad como sensibilidad por el IFNy como la señal extracelular. Los bioensayos actuales para el IFNy se basan en su mayor parte en la capacidad del IFNy para inhibir la replicación vírica (Ank et al., 2006) o inhibir la proliferación celular (Sato et al., 2006). Dichos métodos carecen de especificidad ya que los INF Tipo I (IFN-a, IFN-p, IFN-£, IFN-^k, e IFN-w) también inhiben la replicación vírica y la proliferación celular. La actividad del IFN^y también se puede evaluar por su capacidad para inducir NO en células de exudado peritoneal recién aislado (Malu et al, 2003), kinurenina en células WISH (Boyanova et al, 2002), o antígenos del MHC clase II en células susceptibles (King, D.P., Jones, P.P., J. 1983). Dichos bioensayos también carecen de especificidad y se basan en sistemas de cultivo celular que son variables inherentemente y dan resultados que varían de un ensayo a otro (Meager, 2006). Aunque se ha desarrollado un ensayo de gen indicador para IFN^y basado en la inducción de la actividad de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) el ensayo carece de especificidad ya que también es sensible a los IFN Tipo I (Lewis, 1995). Por lo tanto, es altamente deseable un ensayo de gen indicador que sea específico y sensible a bajos niveles de IFNy (interferón Tipo II) en presencia de interferones de Tipo I (IFN-a e IFN-p) en la técnica. Sin embargo, debido a la degeneración entre las secuencias de GAS e ISRE y debido a la inter-relación entre el heterodímero STAT1-STAT2 (de la ruta de transducción de la señal en el receptor de interferón Tipo I IFNAR1/IFNAR2) y el homodímero STAT1-STAT2 (de la ruta de transducción de la señal iniciada en el receptor de interferón Tipo II GAR1/GAR2), la presencia de interferones de Tipo I interfiere fuertemente los ensayos de gen indicador para determinar el nivel de IFN^y en una muestra. Por lo tanto, una línea celular que contuviera una construcción de gen indicador con una especificidad y sensibilidad mejorada por el IFNy permitiría rápidamente los niveles de IFNy en una muestra. Esta capacidad de detectar la presencia y/o determinar el nivel de IFN^y, incluso en presencia de un interferón de Tipo I, tendría aplicaciones clínicas inmediatas. Por ejemplo, la presencia de IFNy en el líquido cefalorraquídeo es indicativa de la progresión de la enfermedad en la recaída de esclerosis múltiple en remisión u otras enfermedades neurodegenerativas. Se piensa también que la reducción de la producción de IFNy está implicada en la fisiopatología de enfermedades fibróticas tales como la fibrosis pulmonar idiopática, esclerosis sistémica, o escleroderma. La cuantificación de la producción de IFN^y humano se puede utilizar también como un marcador in ^{vitro de la maduración/proliferación de células T, la respuesta de CTL CD}8^{+, y la activación de células NK. La} cuantificación de IFNy también proporciona la base de un ensayo para la infección por TB midiendo la proliferación de células T in vitro en respuesta a antígenos de TB. La presencia de IFN^y en el derrame pleural es diagnóstico de tuberculosis extrapulmonar. Por lo tanto, con dicha línea celular en un ensayo de gen indicador para IFN^y, se cubre la necesidad de un ensayo diagnóstico no invasivo.

El elemento de control de la transcripción, particularmente como se refiere a una realización preferida de la presente divulgación en la que el interferón Tipo II (IFN^y) es la señal extracelular, es la secuencia gamma activada (GAS). Con respecto a gAs , a la que se une el homodímero STAT1 en los genes que responden al interferón Tipo II, se identificó la secuencia de consenso, nnnsanttccgGGAAntgnsn (SEQ ID NO: 3; con la secuencia central en mayúsculas; y la alta conservación subrayada), en muchas secuencias de unión seleccionadas.

En la realización de la presente divulgación en la que el interferón Tipo II es la señal extracelular de interés (la primera señal extracelular) y un interferón de Tipo I (IFN-a e IFN-p) es una señal extracelular de interferencia (la segunda señal extracelular), un elemento de control de la transcripción preferido en la construcción de gen indicador es un promotor quimérico que responde al interferón Tipo II en el que la GAS controla un promotor mínimo SV40 unido operativamente a una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador. Además, en esta realización de una línea celular para su uso en un ensayo de gen indicador para IFN^y, la línea celular se ha seleccionado de manera que carezca de un receptor de IFN de Tipo I, o células que se han modificado genéticamente para desactivar el receptor de interferón Tipo I (IFNAR1/IFNAR2), al que se hace referencia en general en la sección “Sumario de la invención” anterior como segunda molécula de superficie celular. En ausencia de un receptor de interferón Tipo I funcional, no hay inter-relación STAT1-STAT2 para que interfiera la activación de la transcripción de GAS en respuesta al homodímero STAT1. Por lo tanto, la especificidad y sensibilidad de la respuesta a una señal extracelular con IFNy está considerablemente mejorada. Ahora se pueden detectar bajos niveles de IFNy utilizando la línea celular con IFNAR1/IFNAR2 “desactivado” que se ha descrito anteriormente.

El término “desactivado” como se utiliza en el presente documento se refiere a una línea celular en la que se han inactivado genes específicos, tal como por un método de direccionamiento génico. Este es el contrario a “activado” que como se utiliza en el presente documento se refiere a una línea celular de acuerdo con la presente divulgación en la que un gen de un receptor o complejo o una parte de los mismos (es decir, al menos la parte extracelular y los elementos necesarios para la activación de la ruta de transducción de la señal) de la superficie celular de una primera especie animal se ha introducido (“activado”) en la línea celular de una segunda especie animal. Dicho receptor o complejo de la superficie celular “activado” se puede utilizar en la línea celular en un ensayo de gen indicador cuando hay una especificidad estricta de especie entre el receptor o complejo de superficie celular y su ligando, es decir, el receptor o complejo de superficie celular que es endógeno de la línea celular y que es ortólogo con el receptor de superficie celular “activado” no inicia (o de manera insignificante) una señal junto con su ruta de transducción de señal en respuesta a un ligando del receptor de superficie celular “activado” de otra especie animal.

El producto del gen indicador en la línea celular de la presente divulgación, cuyo nivel es una medida de la presencia y/o el nivel de una señal extracelular que activa la actividad de transducción de la señal de una molécula de la superficie celular, puede ser un ARN o una proteína, siempre que sea detectable fácilmente. Por ejemplo, la luciferasa de luciérnaga, luciferasa Renilla, la proteína verde fluorescente aumentada (EGFP) de luciferasa secretada por Metridios y aequorina de medusas son las realizaciones más preferidas de productos génicos indicadores que se utilizan de acuerdo con la presente divulgación. En el caso de la enzima luciferasa de luciérnaga (deWet et al., 1987) y aequorina de medusa (Rider et al., 2003), se detecta el resultado de su actividad enzimática, la luz, y se mide utilizando un luminómetro, mientras que en el caso de EGFP, se puede utilizar un clasificador celular o analizador de fluorescencia activada (FACS) a una longitud de onda apropiada para detectar y cuantificar la cantidad de EGFP expresada en una célula. La curva de distribución de la cantidad de luciferasa, aequorina o EGFP que se expresa en una muestra de células se determinará por la cantidad de ligando (en un intervalo determinado) a la que se expone la célula. Ejemplos no limitantes de otros productos génicos indicadores adecuados incluyen dsRED, cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) (Alton et al., 1979), otros sistemas de detección enzimáticos, tales como p-galactosidasa, luciferasa bacteriana (Engebrecht et al., 1984 y Baldwin et al. 1984), fosfatasa alcalina (Toh et al. 1989 y Hall et al. 1983), y p-lactamasa bacteriana o humanizada (Zlokarnik et al., 1998).

El desarrollo de un ensayo de gen indicador específico para una citocina pleiotrópica se hace difícil cuando la transducción de la señal está mediada por un factor de transcripción ubicuo inducido por varias citocinas no relacionadas y/o cuando los genes diana activados por la citocina están sometidos a un patrón complejo de regulación. Estas dificultades se pueden obviar por el uso de una construcción de gen indicador de promotor quimérico sintético que carezca de los sitios de reconocimiento para factores de transcripción activados por las citocinas no relacionadas para transfectar una línea celular que contenga un receptor específico de ligando pero que carezca de receptores para otros ligandos que compartan una ruta de transducción de la señal común con el ligando de interés. Esta estrategia se ilustra en referencia a la citocina pleiotrópica TNFa que utiliza la ruta NF-^kB para activar los genes diana. En una realización preferida de la presente invención la línea celular que contiene la construcción de gen indicador tiene sensibilidad y especificidad para TNF-a.

El TNF-a es una citocina pro-inflamatoria multifuncional que tiene un papel clave en la regulación de la apoptosis y la supervivencia celular y está implicado en procesos biológicos importantes como la inflamación, transformación neoplásica y respuesta inmunitaria. Por lo tanto, puede detectarse TNF-a en el plasma de pacientes con enfermedad de Crohn (Balog et al., 2004), en el plasma y líquido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (Marotte et al., 2005), y en el fluido de heridas de las heridas crónicas no cicatrizadas (Cowin et al., 2006). Es por lo tanto importante ser capaces de evaluar la relación entre la presencia de TNF-a en una muestra clínica particular y la progresión de la enfermedad, o determinar la capacidad de las terapias anti-TNF-a incluyendo los anticuerpos anti-TNF-a (Remicade, Adlimumab) o un receptor de TNF-a soluble (Enbrel) para bloquear la actividad de TNF-a. Los bioensayos convencionales para el TNF-a se basan en la capacidad del TNF-a para destruir líneas celulares susceptibles (células L929 de ratón, células WEHI 164, o células HeLa humanas habitualmente en presencia de un inhibidor de la transcripción tal como actinomicina D o un inhibidor de la traducción tal como cicloheximida. De manera alternativa, también se puede utilizar la capacidad del TNF-a para regular positivamente las moléculas de adhesión celular tal como la IcAM-1 (moléculas de adhesión celular -1) como base para un bioensayo del TNF-a. Una desventaja obvia de dichos métodos es su falta de especificidad. TNF-P, TRAIL, y TWEAK (ligando Apo-3) interfieren con el ensayo de citotoxicidad de TNF-a y TNF-P, IL-1 a, IL-1p, e IFNy inducen la expresión de ICAM-1 (Meager, 2006). Además, dichos bioensayos se basan en sistemas de cultivo celular que son inherentemente variables y dan resultados que varían de un ensayo a otro (Meager, 2006). Aunque se ha desarrollado un ensayo de gen indicador para TNF-a, que se basa en la activación de una construcción de gen indicador de luciferasa regulada por NF-kB, el ensayo carece de especificidad ya que también es sensible a otros agentes que activan la NF-kB (McFarlane et al., 2002).

La unión del homotrímero TNF-a al TNFR-1 da como resultado la trimerización del TNFR-1, el reclutamiento de TRAF-2 y RIP en el complejo receptor TNFR-1, y la activación de la ruta del NF-kB culminando en la activación de la transcripción de varios genes diana del TNF (Schwamborn et al., 2003). El NF-^kB es un factor de transcripción ubicuo inducido por varias citocinas (incluyendo IFNy, IL2, IL5, e IFNa2). El NF-kB está implicado en la regulación de numerosos genes implicados en procesos que incluyen, la respuesta inflamatoria, apoptosis, cáncer, supervivencia neuronal, e inmunidad innata. La activación del NF-kB se controla principalmente a nivel post-transcripcional por degradación de la subunidad inhibidora I^kB del complejo p55/p65/IKB presente en el citoplasma. Los estímulos activadores tales como el TNF-a activan un complejo cinasa compuesto por dos cinasas específicas de kB (IKKa e IKKp) y una subunidad moduladora (NEMO o IKK^y). Esto da lugar a la fosforilación de la subunidad inhibidora, que se ubiquitinila entonces y se degrada mediante el proteosoma. Esto desencadena la translocalización del NF-kB en el núcleo, donde inicia la transcripción uniéndose a secuencias reguladoras (secuencias de reconocimiento/unión a NF-kB) presentes en la región promotora de los genes diana de NF-kB.

Los genes diana del TNF-a se somete a un patrón complejo de regulación ya que NF-^kB es un factor de transcripción ubicuo inducido por varias citocinas. Además, el TNF-a induce la expresión de varios genes dianas de NF-kB que en sí mismos son factores de transcripción incluyendo JunD y factor regulador del interferón-1 (IRF-1). Por lo tanto, el aumento de transcripción de IRF-1, por ejemplo, es responsable del acoplamiento cruzado de una respuesta de interferón con la respuesta mediada por el receptor del TNF. Con el fin de construir un ensayo de gen indicador específico para la detección de TNF-a de manera que otras citocinas distintas al TNF-a (por ejemplo, IFNy, ^{IL-2, IL-5, IL-}6^{) que activan el NF-kB no interfieran con el ensayo, se transfectó una línea celular que es negativa en} receptores (es decir, de origen natural, “desactivada” o “inactivada”) para los receptores de los activadores extracelulares principales de la ruta de señalización del NF-^kB, distintos del TNF-a, con una construcción de gen indicador regulada por NF-kB sintética que carezca de sitios de reconocimiento para los factores de transcripción inducida por citocinas no relacionadas.

Por lo tanto, los presentes inventores han desarrollado un método altamente sensible y reproducible para cuantificar la actividad del TNF-a como otra realización de la presente divulgación. Una realización preferida se basa en la línea de células T humanas, Jurkat, transfectada con un gen indicador de luciferasa controlada por un promotor quimérico que responde al TNF-a, que permite determinar la actividad del TNF-a con un alto grado de precisión en pocas horas. El promotor que responde al TNF-a que se utiliza para transfectar las células Jurkat es un promotor sintético basado en repeticiones en tándem de 5 secuencias canónicas de reconocimiento del NF-^kB, el elemento de respuesta principal para el factor de transcripción principal inducido por el TNF-a (Imanishi et al., 2000). Como se descubrió sorprendentemente que las repeticiones en tándem de la secuencia canónica de reconocimiento/unión de ^{NF-kB eran altamente eficaces (10}5 ^{veces más) para aumentar la transcripción a partir del promotor mínimo SV40, se diseñó una repetición en tándem de} 6 ^{secuencias canónicas de reconocimiento de NF-kB para conferir la máxima} actividad transcripcional al promotor sintético en respuesta al tratamiento con TNF-a (Figura 4). Se seleccionó entonces un clon estable, JUT-4, de células Jurkat transfectadas basándose en el aumento máximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF-a con respecto a las células de control sin tratar. Se apreciará que aunque los presentes inventores han descubierto que las repeticiones en tándem de cinco secuencias canónicas de reconocimiento/unión a NF-kB se prefieren, también se contemplan repeticiones en tándem de más o menos de cinco canónicas de reconocimiento/unión a NF-kB.

La Figura 5 demuestra que esta realización de línea celular preferida, que es negativa a receptores de IFN^y e IL2 y que alberga una construcción de gen indicador de repeticiones en tándem de cinco secuencias canónicas de reconocimiento de NF-kB que controla un promotor mínimo SV40 unido operativamente a una secuencia codificante de luciferasa, es altamente sensible y específico de TNF-a. La mejora de la sensibilidad y especificidad por el TNF-a se puede ver fácilmente con respecto a una línea celular U937 (que tiene receptores funcionales para IFN^y e IL2) que alberga una construcción de gen indicador en la que la región promotora (-500 a 1) del gen IRF-1 está unida operativamente a la secuencia codificante de luciferasa (Figura 1). Esta región promotora contiene secuencias de reconocimiento de NF-kB y una secuencia GAS que responde a IFNy. La Figura 2 muestra que la línea celular U937 transfectada con la construcción de gen indicador responde tanto a IFN^y como a TNF-a. Cuando está presentes el IFNy y TNF-a, la sensibilidad del gen indicador se reduce ya que la actividad de luciferasa en RLU es menor que la suma de las unidades relativas de luciferasa (RLU) para IFNy y TNF-a ensayados por separado.

Otros ejemplos no limitantes de líneas celulares de acuerdo con la presente divulgación incluyen las líneas celulares que contienen, por ejemplo, la construcción de gen indicador de la Figura 4, pero que carece de receptores de superficie celular al menos para TNF-a e IFN^y (cuando se desea un ensayo de gen indicador para IL2) y para al menos TNF-a, IFN^y e IL2 (cuando se desea un ensayo de gen indicador para IL5).

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un kit de ensayo para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, de una molécula que activa la actividad de transducción de la señal de una molécula o complejo de superficie celular. Este kit de ensayo incluye una pluralidad de células de la línea celular de la presente divulgación (como reactivo) y un dispositivo de ensayo que tiene una pluralidad de pocillos. Preferentemente, el dispositivo de ensayo es una placa de titulación multipocillo, pero también puede ser cualquier Tipo de receptáculo, tal como placas o platos de Petri, con una pluralidad de pocillos en los que se pueda llevar a cabo el ensayo para determinar el nivel de una molécula en una muestra. Se prefiere que las células como componente o reactivo del kit de ensayo se dispongan en los pocillos del dispositivo de ensayo, aunque se apreciará que en vez de eso dichas células pueden dispensarse en los pocillos del dispositivo de ensayo por el usuario final justo antes de llevar a cabo el ensayo. El kit puede incluir adicionalmente un grupo de instrucciones para utilizar el kit para llevar a cabo el ensayo que se pretende para la determinación de la presencia y/o nivel de una molécula que active la actividad de transducción de la señal en una muestra.

Cuando las células de la línea celular de acuerdo con la presente invención se utilizan como un reactivo en un kit, las células se tratan preferentemente con un agente anti-mitótico y pro-apoptótico y se almacenan congeladas para su uso futuro en un ensayo de gen indicador como parte de un kit. La preparación de células de esta manera se desvela en el documento US2004-0235157.

La presente divulgación proporciona además un método de ensayo para determinar la presencia y/o el nivel, en una muestra, en referencia a una referencia incluida en el ensayo, de una señal extracelular que activa la actividad de transducción de la señal de una molécula o complejo de superficie celular, preferentemente un receptor o complejo de superficie celar. Este método de ensayo utiliza células de la línea celular de la presente invención. Tras la incubación con una muestra en la que se desea determinar la presencia y/o nivel de una señal extracelular que activa la actividad de transducción de la señal de una molécula o complejo de superficie celular, se determina el nivel de expresión de in producto génico indicador, codificado en la construcción de gen indicador albergada en las células de la línea celular de la presente invención en la muestra. Este nivel de expresión según se determina por el método de acuerdo con la presente invención se utiliza para después determinar cualitativamente la presencia y/o determinar cuantitativamente el nivel, en una muestra, de la señal extracelular que activa la actividad de transducción de señal de una molécula o complejo de superficie celular.

Los expertos en la técnica apreciarán que el kit y el método de ensayo de acuerdo con la divulgación se pueden utilizar tanto para cuantificar un agonista o ensayar indirectamente el nivel de una molécula que se une a la molécula de señal extracelular como un antagonista o que se une el antagonista de la molécula de señal extracelular. Un ejemplo preferido de dicho ensayo indirecto es cuando la molécula de señal extracelular es TNF-a y la molécula que se ensaya indirectamente mediante la determinación del nivel de TNF-a es o un antagonista de TNF-a o un anticuerpo neutralizante contra el antagonista de TNF-a. Esta realización se describe adicionalmente al final de esta sección.

Los ensayos de gen indicador para el interferón Tipo II y para el TNF-a son las realizaciones de la presente divulgación. El producto del gen indicador preferentemente es luciferasa de luciérnaga, aequorina de medusa, o proteína verde fluorescente aumentada (EGFP) y está preferentemente bajo el control de un promotor quimérico sensible al interferón Tipo II que contiene GAS de IRF-1 y un promotor mínimo SV40. Ejemplos de dichas construcciones genéticas indicadoras en los ensayos de gen indicador para IFN^y y TNF-a se presentan, respectivamente, en SEQ ID NO: 4 y en la Figura 4 (SEQ ID NO: 5). El SEQ ID NO: 4 es la secuencia completa de una construcción de gen indicador de luciferasa, en la que la GAS del IRF-1 (nucleótidos 41-83 de SEQ ID NO: 4) se clona en el sitio XhoI/BgIII del ADN plasmídico de promotor pGL2 (n° de catálogo E1631, Promega, Madison, WI) inmediatamente corriente arriba del promotor mínimo SV40 unido operativamente a la secuencia del gen indicador de luciferasa de luciérnaga. La Figura 4 es una representación esquemática de una construcción de gen indicador en la que una repetición en tándem de 5x del sitio de reconocimiento/unión del NF-^kB (nucleótidos 41-111 de SEQ ID NO: 5) se posiciona inmediatamente corriente arriba del promotor mínimo SV40 unido operativamente a la secuencia del gen indicador codificante de la luciferasa de luciérnaga (es decir, en el sitio de clonación XhoI/BgIII del ADN plasmídico del promotor pGL2). El SEQ ID NO: 5 es la secuencia completa del plásmido resultante.

Como línea celular de la presente divulgación que se utiliza en el ensayo de gen indicador, la línea celular es preferentemente una línea celular de mamífero o aviar, más preferentemente una línea celular humana, y más preferentemente una célula pro-monocítica humana o célula T (es decir, Jurkat). Otras líneas celulares preferidas incluyen, pero no se limitan a, líneas celulares mieloides humanas (es decir, U266R) y adenocarcinoma de mama humano (es decir, MCF7) y líneas celulares de linfoma de ratón y leucemia eritroide de ratón.

Una aplicación adicional del ensayo de gen indicador de la presente divulgación es para utilizar el nivel de señal extracelular de interés para determinar indirectamente el nivel de un antagonista contra la señal extracelular de interés o el nivel de un anticuerpo (es decir, un anticuerpo neutralizante) contra el antagonista.

Los antagonistas del TNF-a se utilizan ampliamente para el tratamiento de varios trastornos inflamatorios que incluyen la enfermedad de Crohn y artritis reumatoide (AR) (Targan et al., 1997; y Lipsky et al., 2000). El tratamiento repetido con antagonistas del TNF-a da lugar a la producción de anticuerpos contra el antagonista (anticuerpo o proteína de fusión recombinante) en un número de pacientes (Baert et al., 2003).La aparición de anticuerpos contra los antagonistas del TNF-a se asocia con una farmacodinamia reducida y una respuesta clínica deficiente (Baert et al., 2003). Por lo tanto, en un estudio, el 45 % de los pacientes con enfermedad de Crohn tratados con Infliximab, un anticuerpo IgG1 monoclonal quimérico contra TNF-a, desarrollaba anticuerpos contra el infliximab tras la primera infusión y del 61 % tras la quinta infusión. La aparición de anticuerpo contra infliximab se asoció con un aumento del riesgo de reacciones en la infusión y con una duración más corta de la respuesta clínica (Baert et al., 2003). Actualmente el TNF-a o los anticuerpos contra el TNF-a se cuantifican utilizando ensayos basados en anticuerpos tales como ELISA (Ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas) Dichos ensayos no pueden distinguir entre anticuerpos de unión (BAbs) y anticuerpos neutralizantes (NAbs). Aunque ambos Tipos de anticuerpos pueden impactar negativamente la farmacodinamia del fármaco, solamente los NAbs pueden neutralizar la actividad biológica de los antagonistas del TNF-a dando como resultado una respuesta clínica reducida y la progresión de la enfermedad. El tratamiento de células JUT-4, una línea celular de acuerdo con la presente invención desarrollada para el uso en un ensayo de gen indicador para TNF-a con un fármaco anti-mitótico permite que las células se almacenen congeladas durante varios meses sin pérdida de sensibilidad al TNF-a o necesidad del cultivo celular (véase el documento US2004-0235157 para la preparación de células con un fármaco anti-mitótico para su almacenamiento como células congeladas). Este ensayo forma la base de un método para la cuantificación selectiva de los anticuerpos neutralizantes contra los antagonistas de TNF-a incluyendo el infliximab (IgG1 quimérico), Adlimumab (IgG1 humana), y Etanercept (proteína de fusión TFNRp75-Fc de IgG1 humana). En resumen, se pre­ incuba una cantidad de antagonista de TNF-a suficiente para neutralizar 10 ng/ml de TNF-a con 10 ng/ml de TNF-a y entones se incuban con diluciones en serie de suero humano que contiene los anticuerpos contra el antagonista de TNF-a. El título neutralizante del anti-suero anti-antagonista de TNF-a se estima entonces a partir de la dilución del suero recíproca que da como resultado la detección de 1,0 ng/ml de TNF-a utilizando el ensayo de gen indicador con JUT-4, después de la incubación del suero con 10 ng de unidades neutralizantes del antagonista de TNF-a y 10 ng/ml de TNF-a.

Ejemplo 1

Ensayo de interferón gamma humano

Se co-transfectó la línea celular U266R pro-monocítica humana, que carece de un receptor funcional de IFN Tipo I (Abramovich et al., 1994) y se derivó de la línea celular linfoblastoide humana U266 (ATCC N° TIB-196), con el plásmido GAS-Luc (luciferasa) y la construcción del gen neo PSV2, y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando técnicas convencionales. El plásmido GAS-Luc que contenía la secuencia GAS (secuencia de IFN gamma activado) del gen del IRF-1 (Factor Regulador del Interferón 1) (número de acceso de GenBank L05078.1 GI: 186551; Harada et al., 1989) y un promotor mínimo SV40 que regula la transcripción del gen indicador de luciferasa de luciérnaga se construyó clonando el oligonucleótido de doble cadena sintética tctacaacagcctgatttccccgaaatgacgg cacgcagccg (SEQ ID NO:1), que se corresponde con la secuencia GAS del gen IRF1, en el sitio XhoI/BgIII del vector de promotor pGL2 (Promega). Se seleccionó entonces un clon estable, el Clon 2, basándose en el máximo aumento de unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con IFNy humano con respecto a las células de control sin tratar. Este clon estable de células U266R transfectadas con GAS-Luc, denominado UIG2, se aisló y se cultivó en medio RPMI 1640 con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y gentamicina. Las células se sembraron a ^{una densidad de 2 x 10}5 ^{células/ml en medio RPMI 1640 con un 10 % de FBS y se dividieron 1:4 cinco días más tarde cuando se alcanzaba una concentración de} 0,8 ^x 106 ^células/ml.

Los resultados de un ensayo con interferón gamma (IFN^y) humano en la línea celular U937 humana, que tiene receptores funcionales para IFN Tipo I y Tipo II y que se había co-transfectado con el plásmido GAS-Luc y la ^{construcción genética neo PSV}2^{, se muestran en la Tabla} 1^{, a continuación.}

Tabla 1

IFN ^y (UI/ml) RLU (Unidades relativas de luciferasa):

Veces de aumento

10.0 1,25

1000 1,50

IFNa (UI/ml)

1.0 1,5

100.0 3,0

El aumento de RLU en respuesta al IFNy humano era mínimo con respecto a las células de control sin tratar, y se puede ver que la especificidad por IFN^y era pobre ya que el tratamiento de células con IFNa humano presentaba un relativamente gran aumento en RLU.

Por el contrario, los resultados del ensayo con IFNy humano en la línea celular U266R humana Clon 2 estable, que carece de un receptor de IFN Tipo I funcional, y que se transfectó con la misma construcción de gen indicador que se utilizó para transfectar células u937, se muestra en la Tabla 2, a continuación.

Tabla 2

IFNy (UI/ml) RLU (Unidades relativas de luciferasa):

Veces de aumento

1.0 1,5

1000 9

IFNa (UI/ml)

100.0 < 0,15

Estos resultados muestran que el incremento de RLU en respuesta al IFNy humano era grande con respecto a las células de control sin tratar, y se puede ver que la especificidad por el IFNy era bueno ya que el tratamiento de células con el IFNa humano no daba lugar a un aumento significativo en ULR.

Ejemplo 2

Ensayo de TNF-a humano

Se estableció aquí un ensayo de gen indicador para la cuantificación de TNF-a utilizando una línea celular transfectada con una construcción de gen indicador de manera que el ensamblaje sea capaz de detectar y responder a bajos niveles de TNF-a de una manera altamente específica.

En una serie inicial de experimentos, la región promotora (nucleótido -500 a 1) del gen IRF-1 (número de acceso de GenBank L05078.1 GI: 186551; Harada et al., 1989) se clonó corriente arriba de un promotor mínimo SV40 en el sitio XhoI/BgIII del vector ADN promotor-pGL2 (Promega) con el fin de regular la transcripción del gen indicador con luciferasa de luciérnaga (Figura 1). Se co-transfectaron células U927 pro-monocíticas humanas con el plásmido IRF-Luc y una construcción genética neo PSV2 y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando técnicas convencionales. Se seleccionó entonces un clon estable, el Clon 2, basándose en el aumento máximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF-a humano con respecto a las células de control sin tratar.

La línea de células T humana Jurkat, que es refractaria a IL-2 y responde pobremente a IFN^y, se co-transfectó con el plásmido 5^xNF^kB-L^uc y una construcción genética neo PSV2, y se seleccionaron los clones resistentes a G418 utilizando técnicas convencionales. Se construyó el plásmido 5^xNF^kB-L^uc que contenía una repetición en tándem de 5 veces de la secuencia canónica de reconocimiento del NF-kB y un promotor mínimo SV40 que regula la transcripción del gen indicador de luciferasa de luciérnaga clonando el oligonucleótido de doble cadena sintético (Figura 4), que se corresponde con la repetición en tándem 5 veces de la secuencia canónica de reconocimiento del NF-KB en el sitio XhoI/BgIII del vector de promotor pGL2 (Promega). Se seleccionó entonces un clon estable, el Clon 4, basándose en el incremento máximo en unidades relativas de luciferasa (RLU) en respuesta al tratamiento con TNF-a humano con respecto a las células de control sin tratar.

Se aisló un clon estable, el Clon 4, de células Jurkat transfectadas con 5xNFkB-Luc, denominado JUT-4, y se cultivó en medio RPMI 1640 con un 10 % de suero fetal bovino (FBS) y gentamicina. Las células se sembraron a una ^{densidad de 1 x 10}5 ^{células/ml en medio RPMI 1640 con un 10 % de FBS y entonces se dividieron 1:10 cinco días más tarde cuando la concentración celular alcanzaba} 1,0 ^x 106 ^células/ml.

Tabla 3

Células MCF7 humanas transfectadas con el promotor IRF-1, Clon n° 1

TNFa (n /ml) RLU (Unidades relativas de luciferasa):

( g ) Veces de aumento

0,1 0^*

100,0^{______________________________________________________} 0^{*_________________}

IL2 (ng/ml)

1,0 ^< 0,1

100,0 ^< 0,1

* Ausencia completa de una respuesta en RLU debido a la inducción de apoptosis masiva en las células de ensayo_______________________________________________________________

Las células MCF-7 transfectadas con el promotor IRF-1 son altamente sensibles al TNF-a pero son inadecuadas como base para un ensayo de gen indicador para TNF-a debido a la inducción de apoptosis masiva en las células de ensayo y la rápida muerte celular.

Células U937, Clon 2

El tratamiento de células IRF-Luc transfectadas con el plásmido IRF-Luc con TNF-a (10 ng daban como resultado un aumento modesto de 1,58 veces en RLU, mientras que el tratamiento de células IRF-Luc2 con IFNy o TNF-a IFNy daba un aumento de 1,1 y 1,85 veces en RLU respectivamente (Figura 3).

Células Jurkat, Clon n° 4

Tabla 4

continuación

Las células Jurkat, JUT-4, transfectadas con el promotor 5^xNF^kB eran altamente sensibles al TNF-a y no respondían completamente al IFNy o IL-2 y por lo tanto proporcionan una base ideal para un ensayo de gen indicador capaz de detectar y cuantificar bajos niveles de TNF-a de una manera altamente específica.

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Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una línea celular transformada con una construcción de gen indicador que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico indicador unido operativamente a un elemento de control de la transcripción, en la que:

a) dicho elemento de control de la transcripción es un promotor sintético que comprende un promotor mínimo SV40 y la secuencia GAS definida por la SEQ ID NO: 1, y en donde la construcción carece de elementos de respuesta para otros factores de transcripción; y

b) en donde la célula carece de receptores de interferón de tipo I.

2. La línea celular de la reivindicación 1, en la que las células de dicha línea celular existen de manera natural sin receptores de interferón de tipo I.

3. La línea celular de la reivindicación 1, en la que las células de dicha línea celular han sido modificadas genéticamente para desactivar dichos receptores de interferón de tipo I.

4. Un kit para determinar, en una muestra, la presencia y/o el nivel de IFN-^y, que comprende: un dispositivo de ensayo ^{que tiene una pluralidad de pocillos; y una pluralidad de células de la línea celular de la reivindicación} 1^.

5. El kit de la reivindicación 4, en el que dicho dispositivo de ensayo es una placa de microtitulación.

6^{. El kit de la reivindicación 4, en el que dicho reactivo se deposita en los pocillos de dicho dispositivo de ensayo.}

7. Un método para determinar, en una muestra, la presencia y/o el nivel de IFN-y, que comprende:

^{(i) incubar las células de la línea celular de la reivindicación} 1 ^{con una muestra en la que se va a determinar el} nivel de IFN-y;

(ii) determinar en las células el nivel de expresión del producto génico indicador, comparando la expresión del indicador con la de una referencia conocida incluida en el ensayo, para determinar de esta manera el nivel de IFN-y.