JP2002513552A - ＮＦ−κＢ活性化の新規な阻害剤 - Google Patents
ＮＦ−κＢ活性化の新規な阻害剤Info
- Publication number
- JP2002513552A JP2002513552A JP2000547102A JP2000547102A JP2002513552A JP 2002513552 A JP2002513552 A JP 2002513552A JP 2000547102 A JP2000547102 A JP 2000547102A JP 2000547102 A JP2000547102 A JP 2000547102A JP 2002513552 A JP2002513552 A JP 2002513552A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- abin
- seq
- functional
- activation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
本発明は、核因子κＢ（Nuclear factor κＢ：ＮＦ−κＢ）関連疾病の処置及び／又は抗腫瘍処置の改善において有用な、ＮＦ−κＢ活性化経路の新規阻害剤に関する。これらの阻害剤は、ＴＲＡＦ誘導シグナル経路の初期段階を妨害し、それゆえＩκＢよりも特異的である。
Description
【０００１】 発明の領域 本発明は、ＮＦ−κＢ関連疾患の治療及び／又は抗腫瘍治療の改善において有
用な、ヌクレア・ファクター・カッパＢ（Nuclear factor kappa B）（ＮＦ−κ
Ｂ）活性化経路の新規な阻害剤に関する。
用な、ヌクレア・ファクター・カッパＢ（Nuclear factor kappa B）（ＮＦ−κ
Ｂ）活性化経路の新規な阻害剤に関する。
【０００２】 本発明は、該新規阻害剤をコードする核酸にも関する。本発明は、さらに、Ｎ
Ｆ−κＢ関連疾患及び／又は癌の治療における、これらの阻害剤に由来するポリ
ペプチドの使用に関する。
Ｆ−κＢ関連疾患及び／又は癌の治療における、これらの阻害剤に由来するポリ
ペプチドの使用に関する。
【０００３】 さらに、本発明は、新規阻害剤又はこれらの阻害剤に由来するポリペプチドを
含む薬学的調製物に関する。
含む薬学的調製物に関する。
【０００４】 発明の背景 ＮＦ−κＢは、炎症、免疫反応、リンパ球分化、増殖調節及び発生に関与する
極めて多様な遺伝子の発現を調節する、普遍的に発現している転写因子である。
ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害タンパク質と結合した、ｐ５０及びｐ
６５のサブユニットからなる不活性型二量体として、細胞質に存在する。ＩκＢ
は、炎症前サイトカイン、ウイルス、リポ多糖、酸化剤、ＵＶ光及び電離放射線
のような様々な環境刺激に反応してリン酸化され分解される。これにより、ＮＦ
−κＢが核へ移行し、核内で炎症及び免疫反応の制御において重要な役割を果た
す遺伝子、例えば炎症前サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１７）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＲＡＮ
ＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−２）、炎症のメディエーターを生成させる酵素
（ＮＯ合成酵素、シクロオキシゲナーゼ）、免疫受容体（ＩＬ−２受容体）及び
接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン）をコードする遺伝子
を活性化することが可能となる。これらの誘導されたタンパク質のいくつかは、
次に、ＮＦ−κＢを活性化し、炎症反応のさらなる増幅及び継続をもたらすこと
ができる。最近、ＮＦ−κＢが、ある種の細胞型における抗アポトーシス的役割
を有し、それは抗アポトーシス遺伝子の発現の誘導による可能性が最も高いこと
が示された。この機能は、腫瘍細胞を抗癌治療から防御する可能性があり、腫瘍
細胞を感受性にし抗癌治療の効率を改善するために、ＮＦ−κＢ阻害化合物を用
いることができる可能性が開かれる。
極めて多様な遺伝子の発現を調節する、普遍的に発現している転写因子である。
ＮＦ−κＢは、ＩκＢとして知られる阻害タンパク質と結合した、ｐ５０及びｐ
６５のサブユニットからなる不活性型二量体として、細胞質に存在する。ＩκＢ
は、炎症前サイトカイン、ウイルス、リポ多糖、酸化剤、ＵＶ光及び電離放射線
のような様々な環境刺激に反応してリン酸化され分解される。これにより、ＮＦ
−κＢが核へ移行し、核内で炎症及び免疫反応の制御において重要な役割を果た
す遺伝子、例えば炎症前サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＩＬ−１７）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＲＡＮ
ＴＥＳ、ＭＩＰ−１α、ＭＣＰ−２）、炎症のメディエーターを生成させる酵素
（ＮＯ合成酵素、シクロオキシゲナーゼ）、免疫受容体（ＩＬ−２受容体）及び
接着分子（ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、Ｅ−セレクチン）をコードする遺伝子
を活性化することが可能となる。これらの誘導されたタンパク質のいくつかは、
次に、ＮＦ−κＢを活性化し、炎症反応のさらなる増幅及び継続をもたらすこと
ができる。最近、ＮＦ−κＢが、ある種の細胞型における抗アポトーシス的役割
を有し、それは抗アポトーシス遺伝子の発現の誘導による可能性が最も高いこと
が示された。この機能は、腫瘍細胞を抗癌治療から防御する可能性があり、腫瘍
細胞を感受性にし抗癌治療の効率を改善するために、ＮＦ−κＢ阻害化合物を用
いることができる可能性が開かれる。
【０００５】 炎症性サイトカイン及び内毒素に対する反応の制御における直接的な役割のた
め、ＮＦ−κＢの活性化は、様々な疾患（Barnes and Karin, 1997）：慢性関節
リウマチ、喘息及び炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患（Brand et al., 1996
）；敗血症性ショックのような急性疾患（Remick, 1995）；β−アミロイド・タ
ンパク質がＮＦ−κＢを活性化するアルツハイマー病（Behl et al., 1997）；
酸化型脂質によりＮＦ−κＢが活性化されるかもしれないアテローム性動脈硬化
（Brand et al., 1997）；全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患（Kalt
schmidt et al., 1994）；ある種の癌遺伝子のアップレギュレーション又はアポ
トーシスの抑止による癌（Luque et al., 1997）の発生において重要な役割を果
たす。さらに、ＮＦ−κＢは、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、エプ
スタイン−バーウイルス、ＨＴＬＶ、サイトメガロウイルス又はアデノウイルス
による感染時に起こるように、異なるウイルス・タンパク質により活性化される
ため、ウイルス感染にも関与している。さらに、ＨＩＶのようないくつかのウイ
ルスは、プロモーター／エンハンサー領域内にＮＦ−κＢ結合部位を有している
（Mosialos, 1997）。
め、ＮＦ−κＢの活性化は、様々な疾患（Barnes and Karin, 1997）：慢性関節
リウマチ、喘息及び炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患（Brand et al., 1996
）；敗血症性ショックのような急性疾患（Remick, 1995）；β−アミロイド・タ
ンパク質がＮＦ−κＢを活性化するアルツハイマー病（Behl et al., 1997）；
酸化型脂質によりＮＦ−κＢが活性化されるかもしれないアテローム性動脈硬化
（Brand et al., 1997）；全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患（Kalt
schmidt et al., 1994）；ある種の癌遺伝子のアップレギュレーション又はアポ
トーシスの抑止による癌（Luque et al., 1997）の発生において重要な役割を果
たす。さらに、ＮＦ−κＢは、ライノウイルス、インフルエンザウイルス、エプ
スタイン−バーウイルス、ＨＴＬＶ、サイトメガロウイルス又はアデノウイルス
による感染時に起こるように、異なるウイルス・タンパク質により活性化される
ため、ウイルス感染にも関与している。さらに、ＨＩＶのようないくつかのウイ
ルスは、プロモーター／エンハンサー領域内にＮＦ−κＢ結合部位を有している
（Mosialos, 1997）。
【０００６】 前記疾患の多くにおけるＮＦ−κＢの可能性のある役割のため、ＮＦ−κＢ及
びその制御因子は、ＮＦ−κＢ関連疾患の治療のための標的として多くの関心を
集めている。グルココルチコイドは、効果的なＮＦ−κＢ阻害剤であるが、全身
に与えられた場合、内分泌及び代謝に関する副作用を有する（Barnes et al., 1
993）。抗酸化剤は、別のクラスのＮＦ−κＢ阻害剤であるかもしれないが、ア
セチルシステインのような現在利用可能な抗酸化剤は、比較的弱く非特異的であ
る（Schreck et al., 1991）。アスピリン及びサリチル酸ナトリウムも、ＮＦ−
κＢの活性化を阻害するが、それは比較的高い濃度の場合のみである（Kopp and
Gosh, 1994）。アルペルギルス（Aspergillus）由来のグリオトキシン（glyoto
xin）のような天然のＮＦ−κＢ阻害剤がいくつか存在するが、これらの化合物
はあまりに毒性が高く薬物として用いることができない（Pahl et al., 1996）
。最後に、ＩκＢに対する効果を介してＮＦ−κＢを遮断する、ＩＬ−１０のよ
うな内因性のＮＦ−κＢ阻害剤が存在しうる（Wang et al., 1995）。しかし、
ＮＦ−κＢは免疫反応及びその他の防御的反応において重要な役割を果たしてい
るため、長期にわたる全ての細胞型におけるＮＦ−κＢの完全な阻害は望ましく
ない。
びその制御因子は、ＮＦ−κＢ関連疾患の治療のための標的として多くの関心を
集めている。グルココルチコイドは、効果的なＮＦ−κＢ阻害剤であるが、全身
に与えられた場合、内分泌及び代謝に関する副作用を有する（Barnes et al., 1
993）。抗酸化剤は、別のクラスのＮＦ−κＢ阻害剤であるかもしれないが、ア
セチルシステインのような現在利用可能な抗酸化剤は、比較的弱く非特異的であ
る（Schreck et al., 1991）。アスピリン及びサリチル酸ナトリウムも、ＮＦ−
κＢの活性化を阻害するが、それは比較的高い濃度の場合のみである（Kopp and
Gosh, 1994）。アルペルギルス（Aspergillus）由来のグリオトキシン（glyoto
xin）のような天然のＮＦ−κＢ阻害剤がいくつか存在するが、これらの化合物
はあまりに毒性が高く薬物として用いることができない（Pahl et al., 1996）
。最後に、ＩκＢに対する効果を介してＮＦ−κＢを遮断する、ＩＬ−１０のよ
うな内因性のＮＦ−κＢ阻害剤が存在しうる（Wang et al., 1995）。しかし、
ＮＦ−κＢは免疫反応及びその他の防御的反応において重要な役割を果たしてい
るため、長期にわたる全ての細胞型におけるＮＦ−κＢの完全な阻害は望ましく
ない。
【０００７】 ＴＮＦ及びＩＬ１によるＮＦ−κＢの誘導における重要な役割が、それぞれ刺
激されたＴＮＦ受容体及びＩＬ−１受容体に対して動員されるＴＲＡＦ２及びＴ
ＲＡＦ６というＴＮＦ受容体会合因子に関して最近証明された（Roche et al.,
1995; Cao et al., 1996）。ＴＲＡＦ２又はＴＲＡＦ６の過剰発現は、ＮＦ−κ
Ｂを活性化するが、優性ネガティブ変異体は、ほとんどの細胞型においてＴＮＦ
及びＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢの活性化を阻害する。ＴＲＡＦ２ノッ
クアウト研究は、最近、おそらくＴＲＡＦファミリー内の重複のため、ＴＲＡＦ
２がＮＦ−κＢ活性化にとって絶対的に必要ではないことを示した（Yeh et al.
1997）。ＴＲＡＦにより誘導されるＮＦ−κＢへのシグナル伝達経路は、Ｉκ
Ｂキナーゼ−α及びＩκＢキナーゼ−β（ＩＫＫ）との会合及びその活性化によ
りＴＮＦ及びＩＬ−１による刺激時のＮＦ−κＢ活性化を媒介するＴＲＡＦ相互
作用タンパク質ＮＩＫの同定により、さらに解明された（Malinin et al, 1997;
Regnier et al., 1997; DiDonato et al., 1997; Zandi et al., 1997; Woroni
cz et al., 1997）。ＩＫＫは大きな複合タンパク質ＮＦ−κＢ活性化複合体の
一部であり、ＩκＢをリン酸化し、続いて、ＩκＢの分解、及び放出された活性
型ＮＦ−κＢの核への移行をもたらす。これにより、ＴＲＡＦ経路を活性化する
（ＴＮＦ及びＩＬ−１を含む）刺激によるＮＦ−κＢ活性化の、より特異的な阻
害が可能となる。この原理に基づき、国際特許公開第９７／３７０１６号は、Ｎ
Ｆ−κＢ活性化のモデュレーションのための、ＮＩＫ及びその他のＴＲＡＦ相互
作用タンパク質の使用を開示している。
激されたＴＮＦ受容体及びＩＬ−１受容体に対して動員されるＴＲＡＦ２及びＴ
ＲＡＦ６というＴＮＦ受容体会合因子に関して最近証明された（Roche et al.,
1995; Cao et al., 1996）。ＴＲＡＦ２又はＴＲＡＦ６の過剰発現は、ＮＦ−κ
Ｂを活性化するが、優性ネガティブ変異体は、ほとんどの細胞型においてＴＮＦ
及びＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢの活性化を阻害する。ＴＲＡＦ２ノッ
クアウト研究は、最近、おそらくＴＲＡＦファミリー内の重複のため、ＴＲＡＦ
２がＮＦ−κＢ活性化にとって絶対的に必要ではないことを示した（Yeh et al.
1997）。ＴＲＡＦにより誘導されるＮＦ−κＢへのシグナル伝達経路は、Ｉκ
Ｂキナーゼ−α及びＩκＢキナーゼ−β（ＩＫＫ）との会合及びその活性化によ
りＴＮＦ及びＩＬ−１による刺激時のＮＦ−κＢ活性化を媒介するＴＲＡＦ相互
作用タンパク質ＮＩＫの同定により、さらに解明された（Malinin et al, 1997;
Regnier et al., 1997; DiDonato et al., 1997; Zandi et al., 1997; Woroni
cz et al., 1997）。ＩＫＫは大きな複合タンパク質ＮＦ−κＢ活性化複合体の
一部であり、ＩκＢをリン酸化し、続いて、ＩκＢの分解、及び放出された活性
型ＮＦ−κＢの核への移行をもたらす。これにより、ＴＲＡＦ経路を活性化する
（ＴＮＦ及びＩＬ−１を含む）刺激によるＮＦ−κＢ活性化の、より特異的な阻
害が可能となる。この原理に基づき、国際特許公開第９７／３７０１６号は、Ｎ
Ｆ−κＢ活性化のモデュレーションのための、ＮＩＫ及びその他のＴＲＡＦ相互
作用タンパク質の使用を開示している。
【０００８】 ＴＲＡＦ２と結合しうるもう一つのタンパク質が、ジンクフィンガー・タンパ
ク質Ａ２０である（Song et al., 1996）。Ａ２０は、ＴＮＦ又はＩＬ−１によ
る刺激時に異なる細胞株において誘導される極初期反応遺伝子によりコードされ
ている（Dixit et al., 1990）。興味深いことに、Ａ２０の過剰発現は、ＴＮＦ
によるＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−１によるＮＦ−κＢ活性化の両方を遮断する
（Jaattela et al., 1996）。しかしながら、Ａ２０がＮＦ−κＢ活性化を遮断
するメカニズムは全く不明であるが、Ａ２０はＩκＢに対して直接的に作用する
のではないと考えられ、これに関して、ＮＦ−κＢ活性化を調節する別の経路が
続く。
ク質Ａ２０である（Song et al., 1996）。Ａ２０は、ＴＮＦ又はＩＬ−１によ
る刺激時に異なる細胞株において誘導される極初期反応遺伝子によりコードされ
ている（Dixit et al., 1990）。興味深いことに、Ａ２０の過剰発現は、ＴＮＦ
によるＮＦ−κＢ活性化及びＩＬ−１によるＮＦ−κＢ活性化の両方を遮断する
（Jaattela et al., 1996）。しかしながら、Ａ２０がＮＦ−κＢ活性化を遮断
するメカニズムは全く不明であるが、Ａ２０はＩκＢに対して直接的に作用する
のではないと考えられ、これに関して、ＮＦ−κＢ活性化を調節する別の経路が
続く。
【０００９】 デ・バルック（De Valck）ら（１９９７）は、酵母ツーハイブリッド・アッセ
イを用いて、Ａ２０結合タンパク質、いわゆる１４−３−３を単離し、ＮＦ−κ
Ｂ阻害がＡ２０の１４−３−３との結合とは無関係であることを証明した。
イを用いて、Ａ２０結合タンパク質、いわゆる１４−３−３を単離し、ＮＦ−κ
Ｂ阻害がＡ２０の１４−３−３との結合とは無関係であることを証明した。
【００１０】 発明の目的及び説明 本発明において、他の新規なＡ２０相互作用タンパク質が、意外にも、ＮＦ−
κＢ活性化を調節及び／又は阻害しうることが示される。
κＢ活性化を調節及び／又は阻害しうることが示される。
【００１１】 配列番号２に示されたアミノ酸配列と７０〜１００％の相同性を有するアミノ
酸配列を含むか、又は配列番号３に示されたアミノ酸配列と７０〜１００％の相
同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号５に示されたアミノ酸配列と
７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離された機能的タンパ
ク質が、本発明に属する。
酸配列を含むか、又は配列番号３に示されたアミノ酸配列と７０〜１００％の相
同性を有するアミノ酸配列を含むか、又は配列番号５に示されたアミノ酸配列と
７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、単離された機能的タンパ
ク質が、本発明に属する。
【００１２】 より具体的には、該機能的タンパク質は、配列番号２のアミノ酸５４〜６４７
と７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、さらに具体的には、配
列番号２のアミノ酸３９０〜６４７と７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸
配列を含み、かつ／又は配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７と７０〜１００％
の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
と７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含み、さらに具体的には、配
列番号２のアミノ酸３９０〜６４７と７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸
配列を含み、かつ／又は配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７と７０〜１００％
の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１３】 本明細書において、相同性とは、参照された配列と同一であるか、又は類似し
ていることを意味し、提供されたアミノ酸のいずれかの明白な置換／修飾も含ま
れる。これに関する相同性検索は、当業者に周知のＢＬＡＳＴ−Ｐ（Basic Loca
l Alignment Search Tool）プログラムを用いて実施されうる。対応する核酸配
列については、相同性は当分野において既知のＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮプ
ログラムにより検索される。
ていることを意味し、提供されたアミノ酸のいずれかの明白な置換／修飾も含ま
れる。これに関する相同性検索は、当業者に周知のＢＬＡＳＴ−Ｐ（Basic Loca
l Alignment Search Tool）プログラムを用いて実施されうる。対応する核酸配
列については、相同性は当分野において既知のＢＬＡＳＴＸ及びＢＬＡＳＴＮプ
ログラムにより検索される。
【００１４】 本発明の一つの側面は、ＴＮＦ及び／又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κ
Ｂ活性化経路の、新規なモデュレーター及び／又は阻害剤を提供することである
。
Ｂ活性化経路の、新規なモデュレーター及び／又は阻害剤を提供することである
。
【００１５】 本発明の一つの重要な実施態様は、配列番号２のアミノ酸を少なくとも含むタ
ンパク質である。
ンパク質である。
【００１６】 本発明のもう一つの実施態様は、配列番号３に表された配列番号２のアミノ酸
５４〜６４７を少なくとも含むタンパク質である。
５４〜６４７を少なくとも含むタンパク質である。
【００１７】 本発明のさらなる実施態様は、配列番号５のアミノ酸を少なくとも含むタンパ
ク質である。
ク質である。
【００１８】 本発明のさらなる面は、ＮＦ−κＢ関連経路、特にＴＮＦ及び／又はＩＬ−１
により誘導される経路を調節及び／又は阻害するための、配列番号２のアミノ酸
４２０〜６４７を含むタンパク質の使用である。
により誘導される経路を調節及び／又は阻害するための、配列番号２のアミノ酸
４２０〜６４７を含むタンパク質の使用である。
【００１９】 さらに、本発明は、ＴＮＦ及び／又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢ関
連経路を調節及び／又は阻害するための、配列番号６及び／又は配列番号７に示
された共通配列を含むタンパク質の使用に関する。
連経路を調節及び／又は阻害するための、配列番号６及び／又は配列番号７に示
された共通配列を含むタンパク質の使用に関する。
【００２０】 本発明のもう一つの面は、（一つ又は複数の）これらのタンパク質とＮＦ−κ
Ｂ関連経路の他のタンパク質成分との相互作用を妨害する化合物をスクリーニン
グするためのスクリーニング法における、前記タンパク質の使用である。
Ｂ関連経路の他のタンパク質成分との相互作用を妨害する化合物をスクリーニン
グするためのスクリーニング法における、前記タンパク質の使用である。
【００２１】 本発明のもう一つの実施態様は、腫瘍細胞を感受性にし、かつ／又は抗癌治療
を改善するための、前記タンパク質の使用又は前記方法によりスクリーニングさ
れたタンパク質成分の使用である。
を改善するための、前記タンパク質の使用又は前記方法によりスクリーニングさ
れたタンパク質成分の使用である。
【００２２】 又は、本発明は、 （ａ）スクリーニングされる化合物を、本発明のタンパク質と、適当な条件下で
タンパク質と相互作用することができる読み取り系とを含有する反応混同物と組
み合わせる工程、 （ｂ）タンパク質と該読み取り系との相互作用を可能にする条件下で、化合物、
又は複数の化合物を含む試料の存在下で該反応混同物を維持する工程、 （ｃ）それぞれ読み取り系の抑制又は活性化をもたらす、試料及び化合物を同定
又は確認する工程 を含む、（一つ又は複数の）Ａ２０相互作用タンパク質の活性化因子又は阻害剤
を同定し入手するための方法に関する。
タンパク質と相互作用することができる読み取り系とを含有する反応混同物と組
み合わせる工程、 （ｂ）タンパク質と該読み取り系との相互作用を可能にする条件下で、化合物、
又は複数の化合物を含む試料の存在下で該反応混同物を維持する工程、 （ｃ）それぞれ読み取り系の抑制又は活性化をもたらす、試料及び化合物を同定
又は確認する工程 を含む、（一つ又は複数の）Ａ２０相互作用タンパク質の活性化因子又は阻害剤
を同定し入手するための方法に関する。
【００２３】 本発明に関して、「読み取り系」という用語は、細胞、組織、又は生物におけ
る転写及び／又は発現の際に、スコア化可能かつ／又は選択可能な表現型を提供
するＤＮＡ配列を意味する。そのような読み取り系は、当業者に周知であり、例
えば前記の組換えＤＮＡ分子及びマーカー遺伝子を含む。
る転写及び／又は発現の際に、スコア化可能かつ／又は選択可能な表現型を提供
するＤＮＡ配列を意味する。そのような読み取り系は、当業者に周知であり、例
えば前記の組換えＤＮＡ分子及びマーカー遺伝子を含む。
【００２４】 本発明の方法において「複数の化合物」という用語は、同一であっても、又は
同一でなくてもよい複数の物質と理解されたい。該化合物又は複数の化合物は、
例えば試料、例えば動物又は微生物由来の細胞抽出物の中に含まれていてもよい
。さらに、該（一つ又は複数の）化合物は、当分野において既知であるが、Ａ２
０相互作用タンパク質を抑制又は活性化することができることは従来知られてい
なかったものであってもよい。反応混合物は、細胞を含まない抽出物であっても
よいし、又は細胞もしくは組織の培養物を含んでいてもよい。本発明の方法のた
めの適当な設定は、当業者に既知であり、例えば、一般的にはAlberts et al.,
Molecular Biology of the Cell, 第3版(1994)に記載されている。複数の化合物
は、例えば、反応混合物、培養培地に添加されてもよいし、細胞内へ注入されて
もよい。
同一でなくてもよい複数の物質と理解されたい。該化合物又は複数の化合物は、
例えば試料、例えば動物又は微生物由来の細胞抽出物の中に含まれていてもよい
。さらに、該（一つ又は複数の）化合物は、当分野において既知であるが、Ａ２
０相互作用タンパク質を抑制又は活性化することができることは従来知られてい
なかったものであってもよい。反応混合物は、細胞を含まない抽出物であっても
よいし、又は細胞もしくは組織の培養物を含んでいてもよい。本発明の方法のた
めの適当な設定は、当業者に既知であり、例えば、一般的にはAlberts et al.,
Molecular Biology of the Cell, 第3版(1994)に記載されている。複数の化合物
は、例えば、反応混合物、培養培地に添加されてもよいし、細胞内へ注入されて
もよい。
【００２５】 化合物又は複数の化合物を含有する試料が、本発明の方法において同定された
ならば、Ａ２０相互作用タンパク質を抑制又は活性化することができる化合物を
含有することが同定された原試料から化合物を単離するか、又は複数の異なる化
合物からなる場合には、１試料当たりの異なる物質の数を減少させるため、さら
に原試料を分別し、原試料を分別したものを用いて方法を繰り返すことが可能で
ある。試料の複雑度により、前記工程は、好ましくは本発明の方法に従い同定さ
れた試料が限定された数又はただ一つの物質のみを含むようになるまで、数回実
施されうる。好ましくは、該試料は類似した化学的及び／又は物理学的特性の物
質を含み、最も好ましくは、該物質は同一である。本発明の方法に従い試験され
同定されうる化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、
ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子量有機化合物、ホルモン、ペプチド
ミメティクス（peptidomimetics）、ＰＮＡなどでありうる（Milner, Nature Me
dicine 1(1995), 879-880; Hupp, Cell 83(1995)237-245; Gibbs, Cell 79(1994
), 193-198、及び前記の引用された参照）。
ならば、Ａ２０相互作用タンパク質を抑制又は活性化することができる化合物を
含有することが同定された原試料から化合物を単離するか、又は複数の異なる化
合物からなる場合には、１試料当たりの異なる物質の数を減少させるため、さら
に原試料を分別し、原試料を分別したものを用いて方法を繰り返すことが可能で
ある。試料の複雑度により、前記工程は、好ましくは本発明の方法に従い同定さ
れた試料が限定された数又はただ一つの物質のみを含むようになるまで、数回実
施されうる。好ましくは、該試料は類似した化学的及び／又は物理学的特性の物
質を含み、最も好ましくは、該物質は同一である。本発明の方法に従い試験され
同定されうる化合物は、発現ライブラリー、例えばｃＤＮＡ発現ライブラリー、
ペプチド、タンパク質、核酸、抗体、低分子量有機化合物、ホルモン、ペプチド
ミメティクス（peptidomimetics）、ＰＮＡなどでありうる（Milner, Nature Me
dicine 1(1995), 879-880; Hupp, Cell 83(1995)237-245; Gibbs, Cell 79(1994
), 193-198、及び前記の引用された参照）。
【００２６】 又は、本発明は、 （ａ）配列番号２に与えられたアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするヌク
レオチド配列を含むＤＮＡ配列、 （ｂ）配列番号１に与えられたヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、 （ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたＤＮＡ配列の相補鎖とハイブリダイズし、
かつ（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくと
も７０％同一であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれか１つに定義されたようなＤＮＡ配列のヌクレ
オチド配列に対し、遺伝暗号の結果として縮重しているヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ配列、及び （ｅ）（ａ）から（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれか１つによりコードされるタンパ
ク質の断片をコードするＤＮＡ配列 からなる群より選択される、前記タンパク質をコードするか、又はそのようなタ
ンパク質の免疫学的に活性かつ／又は機能的な断片をコードするＤＮＡ配列にも
関する。
レオチド配列を含むＤＮＡ配列、 （ｂ）配列番号１に与えられたヌクレオチド配列を含むＤＮＡ配列、 （ｃ）（ａ）又は（ｂ）に定義されたＤＮＡ配列の相補鎖とハイブリダイズし、
かつ（ａ）又は（ｂ）のＤＮＡ配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくと
も７０％同一であるアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ）から（ｃ）のいずれか１つに定義されたようなＤＮＡ配列のヌクレ
オチド配列に対し、遺伝暗号の結果として縮重しているヌクレオチド配列を含む
ＤＮＡ配列、及び （ｅ）（ａ）から（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれか１つによりコードされるタンパ
ク質の断片をコードするＤＮＡ配列 からなる群より選択される、前記タンパク質をコードするか、又はそのようなタ
ンパク質の免疫学的に活性かつ／又は機能的な断片をコードするＤＮＡ配列にも
関する。
【００２７】 従って、本発明は、前記タンパク質をコードする核酸配列とも呼ばれるＤＮＡ
分子、好ましくは配列番号１に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％の相同性を
有する核酸配列、及び／又は配列番号４に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％
の相同性を有する核酸配列からなる。
分子、好ましくは配列番号１に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％の相同性を
有する核酸配列、及び／又は配列番号４に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％
の相同性を有する核酸配列からなる。
【００２８】 本明細書において、相同性とは、各々の核酸分子又はコードされたタンパク質
が、機能的かつ／又は構造的に等価であることを意味する。前記の核酸分子と相
同である核酸分子及び該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同一の生
物学的機能を有し、特に同一又は実質的に同一の生物学的機能を有するタンパク
質をコードする修飾を示す該核酸分子の異型である。それらは、他の変種又は種
由来の配列のような天然に存在する異型、すなわち突然変異でありうる。これら
の突然変異は、天然に存在するものであっても、又は突然変異誘発技術により得
られたものであってもよい。対立遺伝子異型は、天然に存在する対立遺伝子異型
であっても、合成的に作製された異型、又は遺伝子組み換えにより作出された異
型であってもよい。
が、機能的かつ／又は構造的に等価であることを意味する。前記の核酸分子と相
同である核酸分子及び該核酸分子の誘導体である核酸分子は、例えば、同一の生
物学的機能を有し、特に同一又は実質的に同一の生物学的機能を有するタンパク
質をコードする修飾を示す該核酸分子の異型である。それらは、他の変種又は種
由来の配列のような天然に存在する異型、すなわち突然変異でありうる。これら
の突然変異は、天然に存在するものであっても、又は突然変異誘発技術により得
られたものであってもよい。対立遺伝子異型は、天然に存在する対立遺伝子異型
であっても、合成的に作製された異型、又は遺伝子組み換えにより作出された異
型であってもよい。
【００２９】 前記核酸分子の様々な誘導体及び異型によりコードされるタンパク質は、生物
学的活性、分子量、免疫学的反応性、コンホメーションなどの一般的な特徴が類
似しており、さらに電気泳動移動度、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係
数、至適pH、至適温度、安定性、溶解性、分光特性などの物理学的特性が類似し
ている。
学的活性、分子量、免疫学的反応性、コンホメーションなどの一般的な特徴が類
似しており、さらに電気泳動移動度、クロマトグラフィーにおける挙動、沈降係
数、至適pH、至適温度、安定性、溶解性、分光特性などの物理学的特性が類似し
ている。
【００３０】 本発明は、本発明に係る核酸分子を含有するベクター、特にプラスミド、コス
ミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子組み換えにおいて一般的に用い
られるその他のベクターにも関する。
ミド、ウイルス、バクテリオファージ及び遺伝子組み換えにおいて一般的に用い
られるその他のベクターにも関する。
【００３１】 様々なプラスミド及びベクターを構築するため、当業者に周知の方法を用いる
ことができ、例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. に記載の技術を参照のこと。
ことができ、例えば、Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Col
d Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. に記載の技術を参照のこと。
【００３２】 又は、本発明の核酸分子及びベクターは、標的細胞への輸送のためリポソーム
内に再構築されうる。
内に再構築されうる。
【００３３】 好ましい実施態様において、ベクター中に存在する核酸分子は、原核細胞及び
／又は真核細胞における核酸分子の発現を可能にする（一つ又は複数の）調節配
列と作動可能に連結している。
／又は真核細胞における核酸分子の発現を可能にする（一つ又は複数の）調節配
列と作動可能に連結している。
【００３４】 「調節配列」という用語は、ライゲートしたコード配列の発現を実行するため
に必要な制御ＤＮＡ配列をさす。そのような調節配列の性質は、宿主生物により
異なる。原核生物においては、調節配列は、一般的に、プロモーター、リボソー
ム結合部位、及び終結因子を含む。真核生物においては、調節配列は、一般的に
、プロモーター、終結因子を含み、場合によってはエンハンサー、トランス活性
化因子又は転写因子を含む。「調節配列」という用語は、発現のために存在する
必要がある全ての成分を少なくとも含むものとし、付加的な有利な成分も含みう
る。
に必要な制御ＤＮＡ配列をさす。そのような調節配列の性質は、宿主生物により
異なる。原核生物においては、調節配列は、一般的に、プロモーター、リボソー
ム結合部位、及び終結因子を含む。真核生物においては、調節配列は、一般的に
、プロモーター、終結因子を含み、場合によってはエンハンサー、トランス活性
化因子又は転写因子を含む。「調節配列」という用語は、発現のために存在する
必要がある全ての成分を少なくとも含むものとし、付加的な有利な成分も含みう
る。
【００３５】 「作動可能に連結した」という用語は、そのように記載された成分が、意図さ
れた様式でそれらが作動することを可能にする関係にある隣接位置をさす。コー
ド配列と「作動可能に連結した」調節配列は、調節配列と適合性の条件下でコー
ド配列の発現が達成されるような方式でライゲートしている。調節配列がプロモ
ーターである場合には、二本鎖核酸が用いられることは当業者にとって明白であ
る。
れた様式でそれらが作動することを可能にする関係にある隣接位置をさす。コー
ド配列と「作動可能に連結した」調節配列は、調節配列と適合性の条件下でコー
ド配列の発現が達成されるような方式でライゲートしている。調節配列がプロモ
ーターである場合には、二本鎖核酸が用いられることは当業者にとって明白であ
る。
【００３６】 従って、本発明のベクターは、好ましくは発現ベクターである。「発現ベクタ
ー」とは、選択された宿主細胞を形質転換するために用いられうる、選択された
宿主におけるコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例え
ば、クローニング・ベクター、バイナリー・ベクター、又は組込み型ベクターで
ありうる。発現は、核酸分子の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。
原核細胞及び／又は真核細胞における発現を保証する制御因子は、当業者に周知
である。
ー」とは、選択された宿主細胞を形質転換するために用いられうる、選択された
宿主におけるコード配列の発現を提供する構築物である。発現ベクターは、例え
ば、クローニング・ベクター、バイナリー・ベクター、又は組込み型ベクターで
ありうる。発現は、核酸分子の好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。
原核細胞及び／又は真核細胞における発現を保証する制御因子は、当業者に周知
である。
【００３７】 本発明は、前記ベクター、又は宿主細胞にとって外来の本発明に係る核酸分子
を含む宿主細胞にさらに関する。
を含む宿主細胞にさらに関する。
【００３８】 「外来」とは、核酸分子が宿主細胞と異種である、即ち異なるゲノムのバック
グラウンドを有する細胞又は生物由来であるか、又は宿主細胞と同種であるが、
該核酸分子の天然に存在するカウンターパートとは異なるゲノム環境に位置する
ことを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞と同種であるならば、該宿主のゲ
ノムにおける天然の位置には位置せず、特に、異なる遺伝子が両側に隣接してい
ることを意味する。この場合、核酸分子は、それ自身のプロモーターの調節下に
あるか、又は異種プロモーターの調節下にある。宿主細胞内に存在する本発明に
係るベクター又は核酸分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、又は
染色体外に何らかの形態で維持されていてもよい。これに関して、本発明の核酸
分子が、相同的組み換えを介して変異遺伝子を回復又は作出するために用いられ
うることも理解されたい（Paszkowski (編), Homologous Recombination and Ge
ne Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)）。
グラウンドを有する細胞又は生物由来であるか、又は宿主細胞と同種であるが、
該核酸分子の天然に存在するカウンターパートとは異なるゲノム環境に位置する
ことを意味する。これは、核酸分子が宿主細胞と同種であるならば、該宿主のゲ
ノムにおける天然の位置には位置せず、特に、異なる遺伝子が両側に隣接してい
ることを意味する。この場合、核酸分子は、それ自身のプロモーターの調節下に
あるか、又は異種プロモーターの調節下にある。宿主細胞内に存在する本発明に
係るベクター又は核酸分子は、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、又は
染色体外に何らかの形態で維持されていてもよい。これに関して、本発明の核酸
分子が、相同的組み換えを介して変異遺伝子を回復又は作出するために用いられ
うることも理解されたい（Paszkowski (編), Homologous Recombination and Ge
ne Silencing in Plants. Kluwer Academic Publishers (1994)）。
【００３９】 宿主細胞は、細菌細胞、昆虫細胞、真菌細胞、植物細胞、又は動物細胞のよう
な、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。好ましい真菌細胞は、例えば、サ
ッカロミセス（Saccharomyces）属のもの、特にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae
）のものである。
な、任意の原核細胞又は真核細胞でありうる。好ましい真菌細胞は、例えば、サ
ッカロミセス（Saccharomyces）属のもの、特にＳ．セレビシエ（S. cerevisiae
）のものである。
【００４０】 本発明のもう一つの主題は、本発明に係るベクター又は核酸の存在によって、
タンパク質の発現を可能にする条件下でＡ２０相互作用タンパク質を発現するこ
とができる本発明に係る宿主細胞の培養、及びそのようにして産生されたタンパ
ク質の培養物からの回収を含む、Ａ２０相互作用タンパク質の調製のための方法
である。
タンパク質の発現を可能にする条件下でＡ２０相互作用タンパク質を発現するこ
とができる本発明に係る宿主細胞の培養、及びそのようにして産生されたタンパ
ク質の培養物からの回収を含む、Ａ２０相互作用タンパク質の調製のための方法
である。
【００４１】 「発現」という用語は、細胞におけるタンパク質配列又はヌクレオチド配列の
産生を意味する。しかし、該用語は、無細胞系におけるタンパク質の発現も含む
。それは、ＲＮＡ産物への転写、転写後修飾、及び／又はその産物をコードする
ＤＮＡからのタンパク質産物もしくはポリペプチドへの翻訳、並びに可能性のあ
る翻訳後修飾を含む。用いられる特定の構築物及び条件により、タンパク質は、
細胞、培養培地又は両方から回収されうる。天然型タンパク質を発現させること
のみならず、融合ポリペプチドとしてタンパク質を発現させること、又は宿主細
胞の特定のコンパートメントへタンパク質を指向させるシグナル配列、例えばペ
プチドの培養培地への分泌を保証するシグナル配列などを付加することも可能で
あることは、当業者にとって周知である。さらに、そのようなタンパク質及びそ
れらの断片を、標準的な方法に従い化学的に合成及び／又は修飾することが可能
である。
産生を意味する。しかし、該用語は、無細胞系におけるタンパク質の発現も含む
。それは、ＲＮＡ産物への転写、転写後修飾、及び／又はその産物をコードする
ＤＮＡからのタンパク質産物もしくはポリペプチドへの翻訳、並びに可能性のあ
る翻訳後修飾を含む。用いられる特定の構築物及び条件により、タンパク質は、
細胞、培養培地又は両方から回収されうる。天然型タンパク質を発現させること
のみならず、融合ポリペプチドとしてタンパク質を発現させること、又は宿主細
胞の特定のコンパートメントへタンパク質を指向させるシグナル配列、例えばペ
プチドの培養培地への分泌を保証するシグナル配列などを付加することも可能で
あることは、当業者にとって周知である。さらに、そのようなタンパク質及びそ
れらの断片を、標準的な方法に従い化学的に合成及び／又は修飾することが可能
である。
【００４２】 本明細書において用いられる「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語
は、相互に交換可能である。「ポリペプチド」とは、アミノ酸の重合体（アミノ
酸配列）をさし、分子の特定の長さをさすのではない。従って、ペプチド及びオ
リゴペプチドは、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの
翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などもさすか、又は含
む。その定義には、例えば、一つ又は複数のアミノ酸アナログ（例えば、非天然
アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペ
プチド、並びに天然に存在するものであっても天然には存在しないものであって
もよい当分野において既知のその他の修飾が含まれる。
は、相互に交換可能である。「ポリペプチド」とは、アミノ酸の重合体（アミノ
酸配列）をさし、分子の特定の長さをさすのではない。従って、ペプチド及びオ
リゴペプチドは、ポリペプチドの定義に含まれる。この用語は、ポリペプチドの
翻訳後修飾、例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化などもさすか、又は含
む。その定義には、例えば、一つ又は複数のアミノ酸アナログ（例えば、非天然
アミノ酸などを含む）を含有するポリペプチド、置換された結合を有するポリペ
プチド、並びに天然に存在するものであっても天然には存在しないものであって
もよい当分野において既知のその他の修飾が含まれる。
【００４３】 本発明は、さらに、本発明に係る核酸分子によりコードされるか、又は前記方
法により産生もしくは入手されるタンパク質に関し、機能的かつ／又は免疫学的
活性を有するＡ２０相互作用タンパク質の断片に関する。本発明のタンパク質及
びポリペプチドは、表記された核酸配列から必ずしも翻訳されず、ポリペプチド
は、化学合成、又は組み換え発現系の発現、又は適当なウイルス系からの単離を
含む、任意の様式で作製されうる。ポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸ア
ナログ、リン酸化アミノ酸、又は非天然アミノ酸を含みうる。アミノ酸アナログ
を配列に挿入する方法は当分野において既知である。ポリペプチドは、当業者に
既知の一つ又は複数の標識も含みうる。これに関して、本発明に係るタンパク質
は当分野において既知の従来の方法により、さらに修飾されてもよいことも理解
される。本発明に係るタンパク質を提供することにより、生物学的活性を保持す
る断片、即ち成熟したプロセシングされた形態を決定することも可能である。こ
のことにより、その結合活性にとって重要である本発明のタンパク質由来のアミ
ノ配列を含むキメラのタンパク質及びペプチドの構築が可能となる。その他の機
能的アミノ酸配列は、例えば化学的手段により、本発明のタンパク質と物理学的
に連結されてもよいし、又は当分野において周知の組み換えＤＮＡ技術により融
合されてもよい。
法により産生もしくは入手されるタンパク質に関し、機能的かつ／又は免疫学的
活性を有するＡ２０相互作用タンパク質の断片に関する。本発明のタンパク質及
びポリペプチドは、表記された核酸配列から必ずしも翻訳されず、ポリペプチド
は、化学合成、又は組み換え発現系の発現、又は適当なウイルス系からの単離を
含む、任意の様式で作製されうる。ポリペプチドは、一つ又は複数のアミノ酸ア
ナログ、リン酸化アミノ酸、又は非天然アミノ酸を含みうる。アミノ酸アナログ
を配列に挿入する方法は当分野において既知である。ポリペプチドは、当業者に
既知の一つ又は複数の標識も含みうる。これに関して、本発明に係るタンパク質
は当分野において既知の従来の方法により、さらに修飾されてもよいことも理解
される。本発明に係るタンパク質を提供することにより、生物学的活性を保持す
る断片、即ち成熟したプロセシングされた形態を決定することも可能である。こ
のことにより、その結合活性にとって重要である本発明のタンパク質由来のアミ
ノ配列を含むキメラのタンパク質及びペプチドの構築が可能となる。その他の機
能的アミノ酸配列は、例えば化学的手段により、本発明のタンパク質と物理学的
に連結されてもよいし、又は当分野において周知の組み換えＤＮＡ技術により融
合されてもよい。
【００４４】 「配列の機能的断片」又は「配列の機能的部分」という用語は、言及された原
配列の短縮型配列を意味する。短縮型配列（核酸配列又はタンパク質配列）は、
様々な長さを有することができ、最小のサイズは、言及された原配列と少なくと
も比較可能な機能及び／又は活性を有する配列を提供するために十分なサイズの
配列であり、最大のサイズは重要でない。いくつかの適用において、最大のサイ
ズは、通常、原配列の（一つ又は複数の）所望の活性及び／又は機能を提供する
ために必要なサイズよりも実質的に大きくない。典型的には、断端されたアミノ
酸配列は、約５から約６０アミノ酸長であろう。しかし、より典型的には、配列
は、最大約５０アミノ長、好ましくは最大約３０アミノ長であろう。通常、少な
くとも約１０、１２又は１５アミノ酸、最大で約２０又は２５アミノ酸の配列を
選択することが望ましい。
配列の短縮型配列を意味する。短縮型配列（核酸配列又はタンパク質配列）は、
様々な長さを有することができ、最小のサイズは、言及された原配列と少なくと
も比較可能な機能及び／又は活性を有する配列を提供するために十分なサイズの
配列であり、最大のサイズは重要でない。いくつかの適用において、最大のサイ
ズは、通常、原配列の（一つ又は複数の）所望の活性及び／又は機能を提供する
ために必要なサイズよりも実質的に大きくない。典型的には、断端されたアミノ
酸配列は、約５から約６０アミノ酸長であろう。しかし、より典型的には、配列
は、最大約５０アミノ長、好ましくは最大約３０アミノ長であろう。通常、少な
くとも約１０、１２又は１５アミノ酸、最大で約２０又は２５アミノ酸の配列を
選択することが望ましい。
【００４５】 さらに、適当なコンピュータ・プログラムを用いて、本発明のタンパク質の構
造モチーフの折り畳みシミュレーション及びコンピュータ再設計を実施すること
が可能である（Olszewski, Proteins 25(1996), 286-299; Hoffman, Comput. Ap
pl. Biosci. 11(1995), 675-679）。タンパク質折り畳みのコンピュータ・モデ
リングは、詳細なペプチド及びタンパク質のモデルの高次構造及びエネルギーに
ついての分析のため用いられうる（Monge, J. Mol. Biol. 247(1995), 995-1012
; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376(1995), 37-45）。特に、相補的ペプチド
配列のコンピュータ補助検索による、本発明のタンパク質、その受容体、そのリ
ガンド、又はその他の相互作用タンパク質の相互作用部位の同定のため、適当な
プログラムが用いられうる（Fassina, Immunomethod 5(1994), 114-120）。タン
パク質及びペプチドの設計にとって適当なさらなるコンピュータ・システムは、
先行技術、例えばBerry, Biochem. Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036; Wodak,
Ann. N. Y. Acad. Sci. 501(1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25(1986), 5987
-1991に記載されている。前記コンピュータ分析から得られた結果は、例えば、
本発明のタンパク質又はその断片のペプチドミメティクスの調製のため用いられ
うる。タンパク質の天然アミノ酸配列のそのような偽ペプチド・アナログは、極
めて効率的に親タンパク質を模倣するかもしれない（Benkirane, J. Biol. Chem
. 271(1996), 33218-33224）。例えば、容易に入手可能なアキラル・アミノ酸残
基の、本発明のタンパク質又はその断片への取り込みは、脂肪族鎖のポリメチレ
ン単位によるアミド結合の置換をもたらし、それによりペプチドミメティクスを
構築するための好都合な戦略を提供する（Banerjee, Biopolymers 39(1996), 76
9-777）。他の系における小ペプチド・ホルモンの超反応性ペプチドミメティク
スアナログが、先行技術において記載されている（Zhang, Biochem. Biophys. R
es. Commun. 224(1996), 327-331）。本発明のタンパク質の適当なペプチドミメ
ティクスは、連続的なアミド・アルキル化によるペプチドミメティクス・コンビ
ナトリアル・ライブラリーの合成、及び得られた化合物の、例えば結合特性及び
免疫学的特性に関する試験によっても同定されうる。ペプチドミメティクスコン
ビナトリアル・ライブラリーの作製及び使用のための方法は、先行技術、例えば
Ostresh, Methods in Enzymology 267(1996), 220-234及びDorner, Bioorg. Med
. Chem. 4(1996), 709-715に記載されている
造モチーフの折り畳みシミュレーション及びコンピュータ再設計を実施すること
が可能である（Olszewski, Proteins 25(1996), 286-299; Hoffman, Comput. Ap
pl. Biosci. 11(1995), 675-679）。タンパク質折り畳みのコンピュータ・モデ
リングは、詳細なペプチド及びタンパク質のモデルの高次構造及びエネルギーに
ついての分析のため用いられうる（Monge, J. Mol. Biol. 247(1995), 995-1012
; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376(1995), 37-45）。特に、相補的ペプチド
配列のコンピュータ補助検索による、本発明のタンパク質、その受容体、そのリ
ガンド、又はその他の相互作用タンパク質の相互作用部位の同定のため、適当な
プログラムが用いられうる（Fassina, Immunomethod 5(1994), 114-120）。タン
パク質及びペプチドの設計にとって適当なさらなるコンピュータ・システムは、
先行技術、例えばBerry, Biochem. Soc. Trans. 22(1994), 1033-1036; Wodak,
Ann. N. Y. Acad. Sci. 501(1987), 1-13; Pabo, Biochemistry 25(1986), 5987
-1991に記載されている。前記コンピュータ分析から得られた結果は、例えば、
本発明のタンパク質又はその断片のペプチドミメティクスの調製のため用いられ
うる。タンパク質の天然アミノ酸配列のそのような偽ペプチド・アナログは、極
めて効率的に親タンパク質を模倣するかもしれない（Benkirane, J. Biol. Chem
. 271(1996), 33218-33224）。例えば、容易に入手可能なアキラル・アミノ酸残
基の、本発明のタンパク質又はその断片への取り込みは、脂肪族鎖のポリメチレ
ン単位によるアミド結合の置換をもたらし、それによりペプチドミメティクスを
構築するための好都合な戦略を提供する（Banerjee, Biopolymers 39(1996), 76
9-777）。他の系における小ペプチド・ホルモンの超反応性ペプチドミメティク
スアナログが、先行技術において記載されている（Zhang, Biochem. Biophys. R
es. Commun. 224(1996), 327-331）。本発明のタンパク質の適当なペプチドミメ
ティクスは、連続的なアミド・アルキル化によるペプチドミメティクス・コンビ
ナトリアル・ライブラリーの合成、及び得られた化合物の、例えば結合特性及び
免疫学的特性に関する試験によっても同定されうる。ペプチドミメティクスコン
ビナトリアル・ライブラリーの作製及び使用のための方法は、先行技術、例えば
Ostresh, Methods in Enzymology 267(1996), 220-234及びDorner, Bioorg. Med
. Chem. 4(1996), 709-715に記載されている
【００４６】 さらに、本発明のタンパク質の三次元及び／又は結晶学的構造は、本発明のタ
ンパク質の生物学的活性のペプチドミメティクス阻害剤の設計のため用いられう
る（Rose, Biochemistry 35(1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Che
m. 4(1996), 1545-1558）。
ンパク質の生物学的活性のペプチドミメティクス阻害剤の設計のため用いられう
る（Rose, Biochemistry 35(1996), 12933-12944; Rutenber, Bioorg. Med. Che
m. 4(1996), 1545-1558）。
【００４７】 さらに、本発明は、本発明に係るＡ２０相互作用タンパク質、又はそのような
タンパク質の一部、即ち特異的断片もしくはエピトープを特異的に認識する抗体
に関する。本発明の抗体は、任意の生物におけるその他のＡ２０相互作用タンパ
ク質及び遺伝子を同定し単離するために用いられうる。これらの抗体は、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は合成抗体であってもよく、またＦａｂ
断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片などのような抗体の断片であってもよい。モ
ノクローナル抗体は、例えば、マウス骨髄腫細胞を免疫化された哺乳動物由来の
脾細胞と融合させることを含む、Koehler and Milstein, Nature 256(1975), 49
5及びGalfre, Meth. Enzymol. 73(1981), 3に最初に記載されたような技術によ
り調製されうる。さらに、前記ペプチドに対する抗体又はそれらの断片は、例え
ばHarlow and Lane"Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spri
ng Harbor, 1988に記載された方法を用いることにより入手されうる。これらの
抗体は、例えば、本発明に係るタンパク質の免疫沈降及び免疫学的位置決定、並
びに例えば組換え生物におけるそのようなタンパク質の合成のモニタリング、及
び本発明に係るタンパク質と相互作用する化合物の同定のため用いられうる。例
えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて使用されるような表面プラスモン共鳴が
、ファージ抗体選択の効率を増加させ、本発明のタンパク質のエピトープに結合
するファージ抗体の単一ライブラリーから親和性の高度の増強を得るために用い
られうる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996), 97-105; Malmborg,
J. Immunol. Methods 183(1995), 7-13）。多くの場合において、抗体と抗原と
の結合現象は、他のリガンド／アンチリガンド結合と等価である。
タンパク質の一部、即ち特異的断片もしくはエピトープを特異的に認識する抗体
に関する。本発明の抗体は、任意の生物におけるその他のＡ２０相互作用タンパ
ク質及び遺伝子を同定し単離するために用いられうる。これらの抗体は、モノク
ローナル抗体、ポリクローナル抗体、又は合成抗体であってもよく、またＦａｂ
断片、Ｆｖ断片、又はｓｃＦｖ断片などのような抗体の断片であってもよい。モ
ノクローナル抗体は、例えば、マウス骨髄腫細胞を免疫化された哺乳動物由来の
脾細胞と融合させることを含む、Koehler and Milstein, Nature 256(1975), 49
5及びGalfre, Meth. Enzymol. 73(1981), 3に最初に記載されたような技術によ
り調製されうる。さらに、前記ペプチドに対する抗体又はそれらの断片は、例え
ばHarlow and Lane"Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spri
ng Harbor, 1988に記載された方法を用いることにより入手されうる。これらの
抗体は、例えば、本発明に係るタンパク質の免疫沈降及び免疫学的位置決定、並
びに例えば組換え生物におけるそのようなタンパク質の合成のモニタリング、及
び本発明に係るタンパク質と相互作用する化合物の同定のため用いられうる。例
えば、ＢＩＡｃｏｒｅシステムにおいて使用されるような表面プラスモン共鳴が
、ファージ抗体選択の効率を増加させ、本発明のタンパク質のエピトープに結合
するファージ抗体の単一ライブラリーから親和性の高度の増強を得るために用い
られうる（Schier, Human Antibodies Hybridomas 7(1996), 97-105; Malmborg,
J. Immunol. Methods 183(1995), 7-13）。多くの場合において、抗体と抗原と
の結合現象は、他のリガンド／アンチリガンド結合と等価である。
【００４８】 本発明は、少なくとも一つの前記の核酸分子、ベクター、タンパク質、抗体又
は化合物を含み、場合により検出のための適当な手段を含む診断用組成物にも関
する。
は化合物を含み、場合により検出のための適当な手段を含む診断用組成物にも関
する。
【００４９】 該診断用組成物は、細胞からｍＲＮＡを単離すること、及びハイブリダイズす
る条件下で、そのようにして得られたｍＲＮＡを前記のような核酸プローブを含
むプローブと接触させること、プローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を
検出すること、及びそれにより細胞におけるタンパク質の発現を検出することを
含む、対応するｍＲＮＡの存在を検出することにより、関連したＡ２０相互作用
タンパク質の発現を検出するための方法のため用いられうる。本発明に係るタン
パク質の存在を検出するさらなる方法は、当分野において周知の免疫学的技術、
例えば酵素連結イムノソルベントアッセイを含む。
る条件下で、そのようにして得られたｍＲＮＡを前記のような核酸プローブを含
むプローブと接触させること、プローブとハイブリダイズしたｍＲＮＡの存在を
検出すること、及びそれにより細胞におけるタンパク質の発現を検出することを
含む、対応するｍＲＮＡの存在を検出することにより、関連したＡ２０相互作用
タンパク質の発現を検出するための方法のため用いられうる。本発明に係るタン
パク質の存在を検出するさらなる方法は、当分野において周知の免疫学的技術、
例えば酵素連結イムノソルベントアッセイを含む。
【００５０】 本発明は、呼吸器障害、特に成人呼吸促進症候群、同種移植拒絶、慢性関節リ
ウマチ、喘息もしくは炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患、及び／又は全身性
エリテマトーデスのような自己免疫疾患のようなＮＦ−κＢ関連疾患の治療のた
めの、生物学的活性を有する量の前記スクリーニング法により得られた一つ又は
複数の化合物を含む薬学的組成物にも関する。
ウマチ、喘息もしくは炎症性腸疾患のような慢性炎症性疾患、及び／又は全身性
エリテマトーデスのような自己免疫疾患のようなＮＦ−κＢ関連疾患の治療のた
めの、生物学的活性を有する量の前記スクリーニング法により得られた一つ又は
複数の化合物を含む薬学的組成物にも関する。
【００５１】 もう一つの面において、本発明は、呼吸器障害、特に成人呼吸促進症候群、同
種移植拒絶、慢性関節リウマチ、喘息もしくは炎症性腸疾患のような慢性炎症性
疾患、及び／又は全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患のようなＮＦ−
κＢ関連疾患の治療のための、生物学的活性を有する量の一つ又は複数の前記タ
ンパク質を含む薬学的組成物に関する。
種移植拒絶、慢性関節リウマチ、喘息もしくは炎症性腸疾患のような慢性炎症性
疾患、及び／又は全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患のようなＮＦ−
κＢ関連疾患の治療のための、生物学的活性を有する量の一つ又は複数の前記タ
ンパク質を含む薬学的組成物に関する。
【００５２】 本発明は、腫瘍細胞を感受性にする治療のための、生物学的活性を有する量の
一つもしくは複数の前記タンパク及び／又は一つもしくは複数の前記化合物を含
む薬学的組成物にも関する。
一つもしくは複数の前記タンパク及び／又は一つもしくは複数の前記化合物を含
む薬学的組成物にも関する。
【００５３】 定義 以下の定義は、本明細書において用いられる様々な用語の意味及び範囲をさら
に例示し定義するために提供される。
に例示し定義するために提供される。
【００５４】 「治療」、「治療すること」又は「治療する」という用語は、（１）疾患の臨
床的症状を引き起こす疾患が発生するのを予防すること、（２）疾患を阻害し臨
床的症状の発生を阻止すること、及び／又は（３）疾患を寛解し臨床的症状の減
退を引き起こすこと、を含む、哺乳動物における疾患の任意の治療を意味する。
床的症状を引き起こす疾患が発生するのを予防すること、（２）疾患を阻害し臨
床的症状の発生を阻止すること、及び／又は（３）疾患を寛解し臨床的症状の減
退を引き起こすこと、を含む、哺乳動物における疾患の任意の治療を意味する。
【００５５】 「有効量」という用語は、治療される疾患状態のための治療を提供するために
十分な用量を意味する。これは、患者、疾患及び実施される治療により異なるで
あろう。
十分な用量を意味する。これは、患者、疾患及び実施される治療により異なるで
あろう。
【００５６】 「相互作用することができる」とは、酵母ツーハイブリッド系、又は共免疫沈
降、又は当業者に既知の等価な系を用いて測定されうる、タンパク質が他のタン
パク質と複合体を形成することができることを意味する。
降、又は当業者に既知の等価な系を用いて測定されうる、タンパク質が他のタン
パク質と複合体を形成することができることを意味する。
【００５７】 「機能的な」タンパク質又は断片とは、ジンクフィンガー・タンパク質Ａ２０
又はＮＦ−κＢ関連経路の他のタンパク質と相互作用することができるタンパク
質又は断片を意味する。
又はＮＦ−κＢ関連経路の他のタンパク質と相互作用することができるタンパク
質又は断片を意味する。
【００５８】 「タンパク質Ａ２０（「Ａ２０」）」とは、（Dixit et al., 1990; Opipari
et al., 1990; Tewari et al., 1995）により記載された、ＴＮＦにより誘導さ
れるジンクフィンガー・タンパク質、又はジンクフィンガー含有部分（ヒトＡ２
０のアミノ酸３８７〜７９０；マウスＡ２０のアミノ酸３６９〜７７５）のよう
なその活性断片を意味する。
et al., 1990; Tewari et al., 1995）により記載された、ＴＮＦにより誘導さ
れるジンクフィンガー・タンパク質、又はジンクフィンガー含有部分（ヒトＡ２
０のアミノ酸３８７〜７９０；マウスＡ２０のアミノ酸３６９〜７７５）のよう
なその活性断片を意味する。
【００５９】 本明細書において用いられるように、「（一つ又は複数の）遺伝子」、「ポリ
ヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」又は「
（一つ又は複数の）核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリ
ボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さの重合体型をさす。
この用語は、分子の一次構造のみをさす。従って、この用語は、二本鎖及び一本
鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。それは、既知の型の修飾、例えばメチル化、一つ
又は複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの「ｃａｐｓ」置換も含む
。好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、上に定義されたＡ２０相互作用タンパク
質をコードするコード配列を含む。
ヌクレオチド」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ＤＮＡ配列」又は「
（一つ又は複数の）核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド又はデオキシリ
ボヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの任意の長さの重合体型をさす。
この用語は、分子の一次構造のみをさす。従って、この用語は、二本鎖及び一本
鎖のＤＮＡ及びＲＮＡを含む。それは、既知の型の修飾、例えばメチル化、一つ
又は複数の天然に存在するヌクレオチドのアナログとの「ｃａｐｓ」置換も含む
。好ましくは、本発明のＤＮＡ配列は、上に定義されたＡ２０相互作用タンパク
質をコードするコード配列を含む。
【００６０】 「コード配列」とは、適当な制御配列の調節下におかれた場合に、ｍＲＮＡに
転写され、かつ／又はポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コー
ド配列の境界は、５′末端の翻訳開始コドン及び３′末端の翻訳終止コドンによ
り決定される。コード配列は、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、
組換えヌクレオチド配列又はゲノミック配列を含み、ある種の状況においてはイ
ントロンが存在していてもよい。
転写され、かつ／又はポリペプチドに翻訳されるヌクレオチド配列である。コー
ド配列の境界は、５′末端の翻訳開始コドン及び３′末端の翻訳終止コドンによ
り決定される。コード配列は、これらに限定されないが、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、
組換えヌクレオチド配列又はゲノミック配列を含み、ある種の状況においてはイ
ントロンが存在していてもよい。
【００６１】 「共通配列」とは、ＡＢＩＮとＡＢＩＮ２との間の５０〜１００％の相同性、
好ましくは７０〜１００％の相同性を示す、少なくとも１５アミノ酸の領域を意
味する。
好ましくは７０〜１００％の相同性を示す、少なくとも１５アミノ酸の領域を意
味する。
【００６２】 「化合物」とは、配列番号２、３、５、６又は７に示されたタンパク質とＡ２
０のようなＮＦ−κＢ関連経路の化合物との結合を妨害する、単純又は複雑な非
有機又は有機の分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、タンパク質、抗体、炭
水化物、又は核酸を含む、任意の化学的又は生物学的化合物を意味する。
０のようなＮＦ−κＢ関連経路の化合物との結合を妨害する、単純又は複雑な非
有機又は有機の分子、ペプチド、ペプチドミメティクス、タンパク質、抗体、炭
水化物、又は核酸を含む、任意の化学的又は生物学的化合物を意味する。
【００６３】 本明細書において用いられるように、「組成物」という用語は、おそらくは当
業者に既知の適当な賦形剤の存在下で、活性成分として本発明の単離された機能
的タンパク質を含む薬学的組成物のような任意の組成物をさし、従って、当業者
の知識の範囲内の任意の適当な投与法により、下記のような任意の適当な組成物
の形態で投与されうる。好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与におい
て、本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液又は乳
濁液のような、単位用量の注射可能な形態で製剤化されよう。そのような賦形剤
は、本質的に非毒性であり、非治療的である。そのような賦形剤の例は、生理食
塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液である。固定油及び
オレイン酸エチルのような非水性賦形剤も用いられうる。好ましい賦形剤は、５
％デキストロースを含む生理食塩水である。賦形剤は、緩衝剤及び保存料を含む
、等張性及び化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加剤を含有してい
てもよい。
業者に既知の適当な賦形剤の存在下で、活性成分として本発明の単離された機能
的タンパク質を含む薬学的組成物のような任意の組成物をさし、従って、当業者
の知識の範囲内の任意の適当な投与法により、下記のような任意の適当な組成物
の形態で投与されうる。好ましい投与経路は、非経口である。非経口投与におい
て、本発明の組成物は、薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液又は乳
濁液のような、単位用量の注射可能な形態で製剤化されよう。そのような賦形剤
は、本質的に非毒性であり、非治療的である。そのような賦形剤の例は、生理食
塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液及びハンクス溶液である。固定油及び
オレイン酸エチルのような非水性賦形剤も用いられうる。好ましい賦形剤は、５
％デキストロースを含む生理食塩水である。賦形剤は、緩衝剤及び保存料を含む
、等張性及び化学的安定性を増強する物質のような、微量の添加剤を含有してい
てもよい。
【００６４】 本発明の単離された機能的タンパク質は、同種拒絶、ＧＶＨＤ、アレルギー及
び自己免疫疾患を予防するため、治療に有効な濃度で投与される。投与の用量及
び様式は、個体により異なるであろう。一般的には、組成物は、単離された機能
的タンパク質が１μg／mlと１０mg／kgの間、より好ましくは１０μg／mlと５mg
／kgの間、最も好ましくは０．１mg／kgと２mg／kgの間の用量で与えられるよう
に投与される。好ましくは、ボーラス用量として与えられる。継続的な短時間の
注入（３０分間）も用いられうる。本発明に係る単離された機能的タンパク質を
含む組成物は、５μg／kg／分と２０mg／kg／分の間、より好ましくは７μg／kg
／分と１５mg／kg／分の間の用量で注入されうる。
び自己免疫疾患を予防するため、治療に有効な濃度で投与される。投与の用量及
び様式は、個体により異なるであろう。一般的には、組成物は、単離された機能
的タンパク質が１μg／mlと１０mg／kgの間、より好ましくは１０μg／mlと５mg
／kgの間、最も好ましくは０．１mg／kgと２mg／kgの間の用量で与えられるよう
に投与される。好ましくは、ボーラス用量として与えられる。継続的な短時間の
注入（３０分間）も用いられうる。本発明に係る単離された機能的タンパク質を
含む組成物は、５μg／kg／分と２０mg／kg／分の間、より好ましくは７μg／kg
／分と１５mg／kg／分の間の用量で注入されうる。
【００６５】 特定の場合に応じて、必要とされる本発明に係る単離された機能的タンパク質
の「治療に有効な量」は、治療の必要がある患者を治癒するため、又は疾患及び
その合併症を少なくとも部分的に阻止するために充分な量として決定されるべき
である。そのような使用のための有効な量は、疾患の重度及び患者の一般的な健
康状態により異なるであろう。患者が必要とし耐えうる用量及び頻度に応じて、
単回又は複数回の投与が必要とされうる。
の「治療に有効な量」は、治療の必要がある患者を治癒するため、又は疾患及び
その合併症を少なくとも部分的に阻止するために充分な量として決定されるべき
である。そのような使用のための有効な量は、疾患の重度及び患者の一般的な健
康状態により異なるであろう。患者が必要とし耐えうる用量及び頻度に応じて、
単回又は複数回の投与が必要とされうる。
【００６６】 同種移植拒絶を予防するための、本発明の単離された機能的タンパク質の使用
に関して、該本発明のタンパク質又はそれを含む組成物は症例毎に望ましいよう
に臓器移植の前、間、又は後に投与されうることが強調されるべきである。タン
パク質又はそれを含む組成物が宿主に直接的に投与される場合には、同種移植片
上のＭＨＣに対する宿主Ｔ細胞の活性化及び分化を予防するため、治療は好まし
くは移植時に開始され、その後継続されるであろう。ドナー臓器に本発明に係る
機能的タンパク質又はそれを含む組成物がエクスビボで潅流される場合には、同
種移植片上のＭＨＣに対する宿主Ｔ細胞の活性化及び分化を予防するため、エク
スビボのドナー臓器の治療は、ドナー臓器の移植時より前に開始されるであろう
。
に関して、該本発明のタンパク質又はそれを含む組成物は症例毎に望ましいよう
に臓器移植の前、間、又は後に投与されうることが強調されるべきである。タン
パク質又はそれを含む組成物が宿主に直接的に投与される場合には、同種移植片
上のＭＨＣに対する宿主Ｔ細胞の活性化及び分化を予防するため、治療は好まし
くは移植時に開始され、その後継続されるであろう。ドナー臓器に本発明に係る
機能的タンパク質又はそれを含む組成物がエクスビボで潅流される場合には、同
種移植片上のＭＨＣに対する宿主Ｔ細胞の活性化及び分化を予防するため、エク
スビボのドナー臓器の治療は、ドナー臓器の移植時より前に開始されるであろう
。
【００６７】 以下、本発明の範囲を制限するものではない実施例により、本発明をさらに説
明する。
明する。
【００６８】 実施例 実施例１：新規な阻害剤の単離 バイト（bait）としてタンパク質Ａ２０を用いた酵母ツーハイブリッド・アッ
セイを用いて、ＮＦ−κＢ経路の新規な阻害剤を単離した。酵母ツーハイブリッ
ド・アッセイは、クロンテック・ラボラトリーズ（Chlontech Laboratories）（
Palo Alto, CA）より購入した。ｐＡＳ−Ａ２０を用いたＬ９２９ｒ２ｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングは、以前に記載されている（De Valck et al. 19
97）。相互作用タンパク質を発現する酵母コロニーを、５mMの３−アミノ−１，
２，４−トリアゾールの存在下でのトリプトファン、ロイシン及びヒスチジンを
欠く最小培地上での増殖、及びβ−ｇａｌ活性についてのスクリーニングにより
選択した。陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１
０１におけるエレクトロポレーション及びロイシンを欠く培地上での増殖により
、候補Ａ２０相互作用タンパク質をコードするｐＧＡＤ４２４ベクターを回収し
た。
セイを用いて、ＮＦ−κＢ経路の新規な阻害剤を単離した。酵母ツーハイブリッ
ド・アッセイは、クロンテック・ラボラトリーズ（Chlontech Laboratories）（
Palo Alto, CA）より購入した。ｐＡＳ−Ａ２０を用いたＬ９２９ｒ２ｃＤＮＡ
ライブラリーのスクリーニングは、以前に記載されている（De Valck et al. 19
97）。相互作用タンパク質を発現する酵母コロニーを、５mMの３−アミノ−１，
２，４−トリアゾールの存在下でのトリプトファン、ロイシン及びヒスチジンを
欠く最小培地上での増殖、及びβ−ｇａｌ活性についてのスクリーニングにより
選択した。陽性コロニーからプラスミドＤＮＡを抽出し、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＨＢ１
０１におけるエレクトロポレーション及びロイシンを欠く培地上での増殖により
、候補Ａ２０相互作用タンパク質をコードするｐＧＡＤ４２４ベクターを回収し
た。
【００６９】 １．３×１０6個の形質転換体のうち、１１クローンがＡ２０自体（De Valck
et al. 1996）及び１４−３−３タンパク質（De Valck et al. 1997）を含むＡ
２０相互作用タンパク質を発現した。３個のクローンが、ここで「ＮＦ−κＢ活
性化のＡ２０結合阻害剤（ＡＢＩＮ）」と名付けられた未知のタンパク質をコー
ドする同一ｃＤＮＡのＣ末端断片を含有しており、１個のクローンが、ここでＡ
ＢＩＮ２と名付けられた未知のタンパク質のＣ末端断片（１１３６ｂｐ）を含有
していた。
et al. 1996）及び１４−３−３タンパク質（De Valck et al. 1997）を含むＡ
２０相互作用タンパク質を発現した。３個のクローンが、ここで「ＮＦ−κＢ活
性化のＡ２０結合阻害剤（ＡＢＩＮ）」と名付けられた未知のタンパク質をコー
ドする同一ｃＤＮＡのＣ末端断片を含有しており、１個のクローンが、ここでＡ
ＢＩＮ２と名付けられた未知のタンパク質のＣ末端断片（１１３６ｂｐ）を含有
していた。
【００７０】 その後、ツーハイブリッド分析によりクローニングされたＡＢＩＮ断片（アミ
ノ酸３９０〜５９９に相当）をプローブとして用いたコロニー・ハイブリダイゼ
ーション（De Valck et al. 1996）により、Ｌ９２９ｒ２ｃＤＮＡライブラリー
から、全長ＡＢＩＮ ｃＤＮＡを単離した。いくつかのｃＤＮＡが単離され、最
も長いｃＤＮＡにおいては、３つのリーディング・フレーム全てにおいて、可能
性のある開始メチオニンの５′に終止コドンが同定された。２つの異なるメチオ
ニンで開始する、それぞれ１９４１ヌクレオチド及び１７８１ヌクレオチドのオ
ープン・リーディング・フレームを有する、およそ２８００ヌクレオチド長及び
２６００ヌクレオチド長の２つの異なるスプライス異型（ＡＢＩＮ（１〜６４７
）（配列番号２）及びＡＢＩＮ（５４〜６４７）（配列番号３））が見出された
。これらのｃＤＮＡは、ロイシンジッパー構造の特徴である４つの連続するロイ
シンのリピート及びそれに続く６個のランダムなアミノ酸残基を含む両親媒性ヘ
リックスを含有する７２ｋＤａ及び６８ｋＤａのタンパク質をコードする。
ノ酸３９０〜５９９に相当）をプローブとして用いたコロニー・ハイブリダイゼ
ーション（De Valck et al. 1996）により、Ｌ９２９ｒ２ｃＤＮＡライブラリー
から、全長ＡＢＩＮ ｃＤＮＡを単離した。いくつかのｃＤＮＡが単離され、最
も長いｃＤＮＡにおいては、３つのリーディング・フレーム全てにおいて、可能
性のある開始メチオニンの５′に終止コドンが同定された。２つの異なるメチオ
ニンで開始する、それぞれ１９４１ヌクレオチド及び１７８１ヌクレオチドのオ
ープン・リーディング・フレームを有する、およそ２８００ヌクレオチド長及び
２６００ヌクレオチド長の２つの異なるスプライス異型（ＡＢＩＮ（１〜６４７
）（配列番号２）及びＡＢＩＮ（５４〜６４７）（配列番号３））が見出された
。これらのｃＤＮＡは、ロイシンジッパー構造の特徴である４つの連続するロイ
シンのリピート及びそれに続く６個のランダムなアミノ酸残基を含む両親媒性ヘ
リックスを含有する７２ｋＤａ及び６８ｋＤａのタンパク質をコードする。
【００７１】 ツーハイブリッド分析により単離されたＡＢＩＮ２断片に相当するが、５′末
に５０７個の付加的なヌクレオチドを有するＥＳＴクローン（５７２２３１）に
ハイブリダイズする３′プライマーを用いて、５′ＲＡＣＥ（SMART PCR cDNA合
成キット、クロンテック）により、ＡＢＩＮ２の全長ｃＤＮＡを、マウス心臓か
ら単離した。１２９０ヌクレオチド長のオープン・リーディング・フレームを有
し、４３０アミノ酸のタンパク質（配列番号５）をコードする１９６７ヌクレオ
チド長のｃＤＮＡを単離した。
に５０７個の付加的なヌクレオチドを有するＥＳＴクローン（５７２２３１）に
ハイブリダイズする３′プライマーを用いて、５′ＲＡＣＥ（SMART PCR cDNA合
成キット、クロンテック）により、ＡＢＩＮ２の全長ｃＤＮＡを、マウス心臓か
ら単離した。１２９０ヌクレオチド長のオープン・リーディング・フレームを有
し、４３０アミノ酸のタンパク質（配列番号５）をコードする１９６７ヌクレオ
チド長のｃＤＮＡを単離した。
【００７２】 実施例２：ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ２の発現パターン ノーザンブロット分析により、ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ２の両方が、試験された
全てのマウス組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣：図１参照
；ＡＢＩＮについてのデータのみが示されている）において発現していることが
明らかになった。ＡＢＩＮは、クローニングされた全長ｃＤＮＡの長さと一致す
るおよそ２８００ｋｂのｍＲＮＡとして存在する。Ａ２０とは対照的に、ＡＢＩ
Ｎ ｍＲＮＡは、ＴＮＦ刺激に無関係に、親細胞株Ｌ９２９ｓに由来するＴＨＦ
感受性サブクローン及びＴＮＦ耐性サブクローンの両方において構成性発現して
いる。ＡＢＩＮ２は、クローニングされた全長ｃＤＮＡの長さと一致するおよそ
２０００ｋｂのｍＲＮＡとして存在する。
全てのマウス組織（心臓、脳、脾臓、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、精巣：図１参照
；ＡＢＩＮについてのデータのみが示されている）において発現していることが
明らかになった。ＡＢＩＮは、クローニングされた全長ｃＤＮＡの長さと一致す
るおよそ２８００ｋｂのｍＲＮＡとして存在する。Ａ２０とは対照的に、ＡＢＩ
Ｎ ｍＲＮＡは、ＴＮＦ刺激に無関係に、親細胞株Ｌ９２９ｓに由来するＴＨＦ
感受性サブクローン及びＴＮＦ耐性サブクローンの両方において構成性発現して
いる。ＡＢＩＮ２は、クローニングされた全長ｃＤＮＡの長さと一致するおよそ
２０００ｋｂのｍＲＮＡとして存在する。
【００７３】 実施例３：ＡＢＩＮタンパク質及びＡＢＩＮ２タンパク質及びタンパク質断片
とＡ２０との相互作用の研究 全長ＡＢＩＮ（１〜６４７）及びＡＢＩＮ（５４〜６４７）は、酵母ツーハイ
ブリッド・アッセイにおいてＡ２０に結合することができ、３つのＣ末端断片Ａ
ＢＩＮ（３９０〜５９９）、ＡＢＩＮ（２４９〜６４７）及びＡＢＩＮ（３１２
〜６４７）により見出された最初の相互作用が確認された。Ｃ末端断片は、推定
ロイシンジッパー・タンパク質相互作用モチーフ（３９７〜４２０）を含有する
。共免疫沈降により、さらなる分析を行った。Ｎ末端Ｅ−ｔａｇとインフレーム
で対応するＰＣＲ断片を哺乳動物発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ（Niwa et al., 1
991）に挿入することにより、ＡＢＩＮ及びその断片のため、並びにＡＢＩＮ２
のための真核生物プラスミドを作成した。変異型ＧＦＰ（Ｇ６５Ｔ）及びＧＦＰ
（Ｇ６５Ｔ）とマウスＡ２０との融合タンパク質をコードするｃＤＮＡも、ｐＣ
ＡＧＧＳにクローニングした。
とＡ２０との相互作用の研究 全長ＡＢＩＮ（１〜６４７）及びＡＢＩＮ（５４〜６４７）は、酵母ツーハイ
ブリッド・アッセイにおいてＡ２０に結合することができ、３つのＣ末端断片Ａ
ＢＩＮ（３９０〜５９９）、ＡＢＩＮ（２４９〜６４７）及びＡＢＩＮ（３１２
〜６４７）により見出された最初の相互作用が確認された。Ｃ末端断片は、推定
ロイシンジッパー・タンパク質相互作用モチーフ（３９７〜４２０）を含有する
。共免疫沈降により、さらなる分析を行った。Ｎ末端Ｅ−ｔａｇとインフレーム
で対応するＰＣＲ断片を哺乳動物発現プラスミドｐＣＡＧＧＳ（Niwa et al., 1
991）に挿入することにより、ＡＢＩＮ及びその断片のため、並びにＡＢＩＮ２
のための真核生物プラスミドを作成した。変異型ＧＦＰ（Ｇ６５Ｔ）及びＧＦＰ
（Ｇ６５Ｔ）とマウスＡ２０との融合タンパク質をコードするｃＤＮＡも、ｐＣ
ＡＧＧＳにクローニングした。
【００７４】 ２×１０6個のヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を１０cmのペトリ皿に置き、リン酸
カルシウムＤＮＡ共沈降により、適当なプラスミドで一過性トランスフェクトし
た。トランスフェクションの２４時間後、細胞を５００μlの溶解緩衝液（５０m
M ヘペス pH７．６、２５０mM ＮａＣｌ、０．１％ ノニデットＰ−４０及び５m
M ＥＤＴＡ）中で溶解した。溶解物を５μlのウサギ抗ＧＦＰ抗体（クロンテッ
ク）と共にインキュベートし、免疫複合体をプロテインＡトリスアクリル（prot
ein A-trisacryl）（ピアース（Pierce））上に固定化した。それを溶解緩衝液
で２回、１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で２回洗浄した。共沈降したタン
パク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗Ｅ−ｔａｇ抗体（ファルマシ
ア（pharmacia））を用いたウェスタン・ブロッティングにより明らかにした。
カルシウムＤＮＡ共沈降により、適当なプラスミドで一過性トランスフェクトし
た。トランスフェクションの２４時間後、細胞を５００μlの溶解緩衝液（５０m
M ヘペス pH７．６、２５０mM ＮａＣｌ、０．１％ ノニデットＰ−４０及び５m
M ＥＤＴＡ）中で溶解した。溶解物を５μlのウサギ抗ＧＦＰ抗体（クロンテッ
ク）と共にインキュベートし、免疫複合体をプロテインＡトリスアクリル（prot
ein A-trisacryl）（ピアース（Pierce））上に固定化した。それを溶解緩衝液
で２回、１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で２回洗浄した。共沈降したタン
パク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗Ｅ−ｔａｇ抗体（ファルマシ
ア（pharmacia））を用いたウェスタン・ブロッティングにより明らかにした。
【００７５】 キメラＧＦＰ−Ａ２０タンパク質の発現プラスミド、及び全長ＡＢＩＮ又は短
縮型ＡＢＩＮとＮ末端Ｅ−ｔａｇとの発現プラスミドで一過性トランスフェクト
されたＴ２９３細胞において、全長ＡＢＩＮのみならず、ロイシンジッパー・モ
チーフを欠くＣ末端断片（ＡＢＩＮ（４２０〜６４７））も、依然としてＡ２０
と共に免疫沈降することができた（図２）。ＡＢＩＮとＡ２０との相互作用には
、Ａ２０のＣ末端ジンクフィンガー含有部分（Ａ２０（３６９〜７７５））が必
要であった。このドメインは、以前にＡ２０の二量体化及びＡ２０と１４−３−
３タンパク質との相互作用にとって必要であることが示された（De Valck et al
. 1996; De Valck et al. 1997）。対照的に、ヒトＡ２０のＮ末端部分（Ａ２０
（１〜３８６））は、以前にＴＲＡＦ２と相互作用することが示され（Song et
al., 1996）、このことからＡ２０がＴＲＡＦ２とＡＢＩＮとの間のアダプター
・タンパク質として作用することが示唆された。Ａ２０とＡＢＩＮとの相互作用
は、ＴＮＦによる刺激により影響を受けなかった。
縮型ＡＢＩＮとＮ末端Ｅ−ｔａｇとの発現プラスミドで一過性トランスフェクト
されたＴ２９３細胞において、全長ＡＢＩＮのみならず、ロイシンジッパー・モ
チーフを欠くＣ末端断片（ＡＢＩＮ（４２０〜６４７））も、依然としてＡ２０
と共に免疫沈降することができた（図２）。ＡＢＩＮとＡ２０との相互作用には
、Ａ２０のＣ末端ジンクフィンガー含有部分（Ａ２０（３６９〜７７５））が必
要であった。このドメインは、以前にＡ２０の二量体化及びＡ２０と１４−３−
３タンパク質との相互作用にとって必要であることが示された（De Valck et al
. 1996; De Valck et al. 1997）。対照的に、ヒトＡ２０のＮ末端部分（Ａ２０
（１〜３８６））は、以前にＴＲＡＦ２と相互作用することが示され（Song et
al., 1996）、このことからＡ２０がＴＲＡＦ２とＡＢＩＮとの間のアダプター
・タンパク質として作用することが示唆された。Ａ２０とＡＢＩＮとの相互作用
は、ＴＮＦによる刺激により影響を受けなかった。
【００７６】 ＡＢＩＮの細胞内分布を特徴決定するため、ＧＦＰ−Ａ２０及びＥ−ｔａｇ付
加ＡＢＩＮのｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトし、ＧＦＰ蛍光
及び抗Ｅ−ｔａｇ抗体を介した免疫学的蛍光によりそれらの発現を分析した。４
×１０5個の２９３Ｔ細胞を６穴プレートのカバーグラス上に播き、１μgのプラ
スミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、カ
バーグラス上で３％パラホルムアルデヒドにより細胞を固定した。１％トライト
ンＸ−１００による透過性化の後、細胞をマウス抗Ｅ−ｔａｇ抗体（１／１００
０）と共に２時間インキュベートし、その後ビオチンとカップリングした抗マウ
スＩｇ抗体（アマシャム（Amersham）、１／１０００）と共に２次インキュベー
ションを行った。続いて、テキサスレッド（アマシャム）とカップリングしたス
トレプトアビジンと共にインキュベートした後、５４３nmにおける励起及び６０
０nmにおける発光を用いたフィルター・セットを用いた蛍光顕微鏡（Zeiss, Axi
ophot）を介して蛍光を分析することができる。同一の細胞において、異なる波
長、即ち４８５nmにおける吸光及び５１０nmにおける発光において、ＧＦＰの蛍
光を検出することができる。
加ＡＢＩＮのｃＤＮＡを２９３Ｔ細胞に一過性トランスフェクトし、ＧＦＰ蛍光
及び抗Ｅ−ｔａｇ抗体を介した免疫学的蛍光によりそれらの発現を分析した。４
×１０5個の２９３Ｔ細胞を６穴プレートのカバーグラス上に播き、１μgのプラ
スミドＤＮＡでトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、カ
バーグラス上で３％パラホルムアルデヒドにより細胞を固定した。１％トライト
ンＸ−１００による透過性化の後、細胞をマウス抗Ｅ−ｔａｇ抗体（１／１００
０）と共に２時間インキュベートし、その後ビオチンとカップリングした抗マウ
スＩｇ抗体（アマシャム（Amersham）、１／１０００）と共に２次インキュベー
ションを行った。続いて、テキサスレッド（アマシャム）とカップリングしたス
トレプトアビジンと共にインキュベートした後、５４３nmにおける励起及び６０
０nmにおける発光を用いたフィルター・セットを用いた蛍光顕微鏡（Zeiss, Axi
ophot）を介して蛍光を分析することができる。同一の細胞において、異なる波
長、即ち４８５nmにおける吸光及び５１０nmにおける発光において、ＧＦＰの蛍
光を検出することができる。
【００７７】 未刺激細胞においても、ＴＮＦ刺激細胞においても、ＡＢＩＮはＡ２０と共に
細胞質全体に局在していた。この観察により、制御的な再分布イベントの存在の
可能性は極めて低くなる。
細胞質全体に局在していた。この観察により、制御的な再分布イベントの存在の
可能性は極めて低くなる。
【００７８】 実施例４：ｃＤＮＡの配列分析 ＡＢＩ３７３Ａシーケンサー（アプライド・バイオシステムズ（Applied Bios
ystems）, Foster City, CA）上でのサイクル・シーケンシングを用いて、ヌク
レオチド配列分析を実施した。全長ＡＢＩＮの配列を配列番号１に示し、ＡＢＩ
Ｎ２の配列を配列番号４に示す。
ystems）, Foster City, CA）上でのサイクル・シーケンシングを用いて、ヌク
レオチド配列分析を実施した。全長ＡＢＩＮの配列を配列番号１に示し、ＡＢＩ
Ｎ２の配列を配列番号４に示す。
【００７９】 データベース類似性検索（ＢＬＡＳＴ）は、ＡＢＩＮが、未知の機能を有する
タンパク質をコードする部分的ヒトｃＤＮＡのマウス・ホモログであることを示
した（ジェンバンク受託番号Ｄ３０７５５；Nagase et al., 1995）。さらに、
ＡＢＩＮは、部分的ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｎｅｆ相互作用タンパク質
ＮＩＰ４０−１（いわゆるＮａｆ１＝ｎｅｆ関連因子１（nef associated facto
r 1）；Fukushi et al., FEBS Letters, 442(1999), 83-88）との相同性を示す
。ＨＩＶ−Ｎｅｆは、ウイルス複製を増強し、Ｔ細胞機能を顕著に混乱させるこ
とにより、疾患の病原に実質的に寄与する。興味深いことに、宿主細胞活性化に
対するＮｅｆの効果は、シグナル伝達に関与する特定の細胞タンパク質との相互
作用により部分的に説明されており（Harris, 1996）、ＡＢＩＮはその一例であ
る。
タンパク質をコードする部分的ヒトｃＤＮＡのマウス・ホモログであることを示
した（ジェンバンク受託番号Ｄ３０７５５；Nagase et al., 1995）。さらに、
ＡＢＩＮは、部分的ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）Ｎｅｆ相互作用タンパク質
ＮＩＰ４０−１（いわゆるＮａｆ１＝ｎｅｆ関連因子１（nef associated facto
r 1）；Fukushi et al., FEBS Letters, 442(1999), 83-88）との相同性を示す
。ＨＩＶ−Ｎｅｆは、ウイルス複製を増強し、Ｔ細胞機能を顕著に混乱させるこ
とにより、疾患の病原に実質的に寄与する。興味深いことに、宿主細胞活性化に
対するＮｅｆの効果は、シグナル伝達に関与する特定の細胞タンパク質との相互
作用により部分的に説明されており（Harris, 1996）、ＡＢＩＮはその一例であ
る。
【００８０】 ＡＢＩＮと明確に相同であるタンパク質はデータベースに存在しない。しかし
、ＡＢＩＮ２とＡＢＩＮを比較することにより、これらのタンパク質の相互作用
にとって、かつ／又はシグナル伝達におけるそれらの機能にとって重要であるか
もしれない２つの相同領域を決定し、２つの共通配列を導出することが可能であ
る（図３、配列番号６及び７）。
、ＡＢＩＮ２とＡＢＩＮを比較することにより、これらのタンパク質の相互作用
にとって、かつ／又はシグナル伝達におけるそれらの機能にとって重要であるか
もしれない２つの相同領域を決定し、２つの共通配列を導出することが可能であ
る（図３、配列番号６及び７）。
【００８１】 実施例５：レポーター遺伝子活性により測定されるＮＦ−κＢ活性化をもたら
すＴＮＦ、ＩＬ−１及び／又はＴＰＡにより誘導される伝達経路におけるＡＢＩ
Ｎ、ＡＢＩＮ断片及び／又はＡＢＩＮ２の役割 ＡＢＩＮ、ＡＢＩＮ断片及びＡＢＩＮ２のプラスミドの構築を、前記と同様に
実施した。キムラ（Kimura）ら（１９８６）により記載された最小ＮＦ−κＢ反
応性プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ・レポーター遺伝子をコード
するプラスミドｐＮＦｃｏｎｌｕｃ、及びβ−ガラクトシダーゼをコードするプ
ラスミドｐＵＴ６５１は、ユーロジェンテック（Eurogentec）（Seraing, Belgi
um）より入手した。ＮＦ−κＢ活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦ−
κＢ依存性発現により決定した。従って、２９３Ｔ細胞を１穴当たり４×１０5
個で６穴プレートに置き、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈降法により一過性トラン
スフェクトした。各トランスフェクションは、８００ngの発現プラスミドを含有
し、さらにレポーターとしての１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃプラスミド、及び
トランスフェクション効率の参照としての１００ngのｐＵＴ６５１プラスミドを
含有していた。トランスフェクションの２４時間後、これらの細胞をトリプシン
処理し、２４穴プレートに播いた。
すＴＮＦ、ＩＬ−１及び／又はＴＰＡにより誘導される伝達経路におけるＡＢＩ
Ｎ、ＡＢＩＮ断片及び／又はＡＢＩＮ２の役割 ＡＢＩＮ、ＡＢＩＮ断片及びＡＢＩＮ２のプラスミドの構築を、前記と同様に
実施した。キムラ（Kimura）ら（１９８６）により記載された最小ＮＦ−κＢ反
応性プロモーターにより駆動されるルシフェラーゼ・レポーター遺伝子をコード
するプラスミドｐＮＦｃｏｎｌｕｃ、及びβ−ガラクトシダーゼをコードするプ
ラスミドｐＵＴ６５１は、ユーロジェンテック（Eurogentec）（Seraing, Belgi
um）より入手した。ＮＦ−κＢ活性をルシフェラーゼレポーター遺伝子のＮＦ−
κＢ依存性発現により決定した。従って、２９３Ｔ細胞を１穴当たり４×１０5
個で６穴プレートに置き、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈降法により一過性トラン
スフェクトした。各トランスフェクションは、８００ngの発現プラスミドを含有
し、さらにレポーターとしての１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃプラスミド、及び
トランスフェクション効率の参照としての１００ngのｐＵＴ６５１プラスミドを
含有していた。トランスフェクションの２４時間後、これらの細胞をトリプシン
処理し、２４穴プレートに播いた。
【００８２】 さらに２４時間後、細胞を１０００IU／mlのｈＴＮＦ、２０ng／mlのｍＩＬ−
１β、２００ng／mlのＴＰＡ（シグマ（Sigma））のいずれかで刺激するか、又
は未処理のままにした。刺激の６時間後、細胞を２００μlの溶解緩衝液中で溶
解し、デ・バルク（De Valck）ら、１９９７に記載のようにして、ルシフェラー
ゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ＧＦＰ及びＧＦＰ−Ａ
２０を、それぞれネガティブ・コントロール及びポジティブ・コントロールとし
て用いた。
１β、２００ng／mlのＴＰＡ（シグマ（Sigma））のいずれかで刺激するか、又
は未処理のままにした。刺激の６時間後、細胞を２００μlの溶解緩衝液中で溶
解し、デ・バルク（De Valck）ら、１９９７に記載のようにして、ルシフェラー
ゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性について分析した。ＧＦＰ及びＧＦＰ−Ａ
２０を、それぞれネガティブ・コントロール及びポジティブ・コントロールとし
て用いた。
【００８３】 Ａ２０と同様に、ＡＢＩＮの両方のスプライス異型が、これらの細胞において
、ＴＮＦ又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を遮断することができ
、より短いＮ末端短縮型アイソフォームの方がわずかに効率が高かった（図４Ａ
）。さらに、ＡＢＩＮ欠失変異体の構造−機能分析は、ＮＦ−κＢ阻害活性が、
Ａ２０との相互作用にとっても充分である、Ｃ末端の２２８アミノ酸（ＡＢＩＮ
（４２０−６４７））に存在することを明らかにした。このＡＢＩＮ変異体は、
ロイシンジッパー構造をもはや含有しておらず、このことは、このタンパク質ド
メインがＡ２０との相互作用にもＮＦ−κＢの阻害にも関与していないことを証
明している（図４Ａ）。単独ではＮＦ−κＢ活性化を阻害するために十分でない
、準至適用量のＡ２０及びＡＢＩＮの組み合わせの過剰発現は、ＴＮＦ（図４Ｂ
）又はＩＬ−１による刺激の際のＮＦ−κＢ活性化を大きく消失させた。このこ
とは、ＡＢＩＮがＡ２０のＮＦ−κＢ阻害効果を媒介することを示唆している。
、ＴＮＦ又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を遮断することができ
、より短いＮ末端短縮型アイソフォームの方がわずかに効率が高かった（図４Ａ
）。さらに、ＡＢＩＮ欠失変異体の構造−機能分析は、ＮＦ−κＢ阻害活性が、
Ａ２０との相互作用にとっても充分である、Ｃ末端の２２８アミノ酸（ＡＢＩＮ
（４２０−６４７））に存在することを明らかにした。このＡＢＩＮ変異体は、
ロイシンジッパー構造をもはや含有しておらず、このことは、このタンパク質ド
メインがＡ２０との相互作用にもＮＦ−κＢの阻害にも関与していないことを証
明している（図４Ａ）。単独ではＮＦ−κＢ活性化を阻害するために十分でない
、準至適用量のＡ２０及びＡＢＩＮの組み合わせの過剰発現は、ＴＮＦ（図４Ｂ
）又はＩＬ−１による刺激の際のＮＦ−κＢ活性化を大きく消失させた。このこ
とは、ＡＢＩＮがＡ２０のＮＦ−κＢ阻害効果を媒介することを示唆している。
【００８４】 全長ＡＢＩＮ（１〜６４７；配列番号２）、短いスプライス異型（５４〜６４
７；配列番号３）及びＣ末端断片（３９０〜６４７）も、ＴＰＡにより誘導され
るＮＦ−κＢ活性化を遮断することができる（図５）。
７；配列番号３）及びＣ末端断片（３９０〜６４７）も、ＴＰＡにより誘導され
るＮＦ−κＢ活性化を遮断することができる（図５）。
【００８５】 ＡＢＩＮ又はＡＢＩＮ断片の代わりにＡＢＩＮ２を試験において用いた場合に
も、同様の結果が得られた（図６）。
も、同様の結果が得られた（図６）。
【００８６】 実施例６：ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ又はｐ６５の過剰発現に
より誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対するＡＢＩＮ及び／又はＡＢＩＮ断片の効
果 ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ断片の発現ベクターを前記と同様にして構築した。ＴＲ
ＡＦ２、ＮＩＫ及びｐ６５を含有する発現ベクターは記載されている（Malinin
et al., 1997; Rothe et al., 1994; Vanden Berghe et al., 1998）。ＴＲＡＤ
Ｄ及びＲＩＰをコードするＰＣＲ断片を、Ｃ末端Ｅ−ｔａｇとインフレームでｐ
ＣＤＮＡ３（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングした。トランスフェク
ション及びレポーター・アッセイを前記と同様にして実施した。
より誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対するＡＢＩＮ及び／又はＡＢＩＮ断片の効
果 ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ断片の発現ベクターを前記と同様にして構築した。ＴＲ
ＡＦ２、ＮＩＫ及びｐ６５を含有する発現ベクターは記載されている（Malinin
et al., 1997; Rothe et al., 1994; Vanden Berghe et al., 1998）。ＴＲＡＤ
Ｄ及びＲＩＰをコードするＰＣＲ断片を、Ｃ末端Ｅ−ｔａｇとインフレームでｐ
ＣＤＮＡ３（Invitrogen, Carlsbad, CA）にクローニングした。トランスフェク
ション及びレポーター・アッセイを前記と同様にして実施した。
【００８７】 ＮＦ−κＢは、ＴＮＦ処理によっても、ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２及び
ＮＩＫを含むＴＮＦ受容体複合体の特定のタンパク質の過剰発現によっても、２
９３Ｔ細胞において活性化されうる（Rothe et al., 1995; Malinin et al., 19
97; Hsu et al., 1995; Ting et al., 1996）。ＴＮＦ受容体複合体のタンパク
質は、ＩκＢキナーゼ複合体と会合し、それを活性化してＩκＢリン酸化をもた
らす。これは、ＩκＢの遍在化（ubiquitination）及び分解のためのシグナルで
あり、それによりＮＦ−κＢが放出され、次に核へと移行する。これらのＴＮＦ
受容体会合タンパク質をコードする発現プラスミドと全長ＡＢＩＮをコードする
発現プラスミドとの共トランスフェクションは、全長ＡＢＩＮが、ＴＲＡＤＤ又
はＲＩＰにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を完全に阻害し、ＴＲＡＦ２により
誘導されるＮＦ−κＢ活性化を部分的に阻害することを示した。対照的に、ＮＦ
−κＢ依存性レポーター遺伝子発現をＮＩＫにより、又はより直接的にＮＦ−κ
Ｂのｐ６５サブユニットの過剰発現により誘導した場合には、明確な差異は観察
されなかった（図７）。これらの結果は、ＡＢＩＮが、ＮＩＫ−ＩκＢキナーゼ
活性化の段階よりも前のレベルで、例えばＴＮＦ受容体複合体中のＴＲＡＦ２の
レベルで、ＴＮＦにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示唆して
いる。
ＮＩＫを含むＴＮＦ受容体複合体の特定のタンパク質の過剰発現によっても、２
９３Ｔ細胞において活性化されうる（Rothe et al., 1995; Malinin et al., 19
97; Hsu et al., 1995; Ting et al., 1996）。ＴＮＦ受容体複合体のタンパク
質は、ＩκＢキナーゼ複合体と会合し、それを活性化してＩκＢリン酸化をもた
らす。これは、ＩκＢの遍在化（ubiquitination）及び分解のためのシグナルで
あり、それによりＮＦ−κＢが放出され、次に核へと移行する。これらのＴＮＦ
受容体会合タンパク質をコードする発現プラスミドと全長ＡＢＩＮをコードする
発現プラスミドとの共トランスフェクションは、全長ＡＢＩＮが、ＴＲＡＤＤ又
はＲＩＰにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を完全に阻害し、ＴＲＡＦ２により
誘導されるＮＦ−κＢ活性化を部分的に阻害することを示した。対照的に、ＮＦ
−κＢ依存性レポーター遺伝子発現をＮＩＫにより、又はより直接的にＮＦ−κ
Ｂのｐ６５サブユニットの過剰発現により誘導した場合には、明確な差異は観察
されなかった（図７）。これらの結果は、ＡＢＩＮが、ＮＩＫ−ＩκＢキナーゼ
活性化の段階よりも前のレベルで、例えばＴＮＦ受容体複合体中のＴＲＡＦ２の
レベルで、ＴＮＦにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を阻害することを示唆して
いる。
【００８８】 ＴＲＡＦファミリーのメンバーは、ＩＬ−１、リンホトキシンβ、ＣＤ３０及
びＣＤ４０を含む、いくつかの他の刺激によるＮＦ−κＢ活性化を媒介するため
（Rothe et al., 1995; Cao et al., 1996; Nakano et al., 1996; Aizawa et a
l., 1997; Ishada et al., 1996）、ＡＢＩＮは広範囲の誘導因子に反応したＮ
Ｆ−κＢ活性化を阻害する能力を有する可能性がある。従って、ＡＢＩＮの活性
を模倣する薬物は、炎症性疾患及び神経変性疾患において、さらに癌及びＡＩＤ
Ｓにおいて治療的価値を有する可能性が高い。
びＣＤ４０を含む、いくつかの他の刺激によるＮＦ−κＢ活性化を媒介するため
（Rothe et al., 1995; Cao et al., 1996; Nakano et al., 1996; Aizawa et a
l., 1997; Ishada et al., 1996）、ＡＢＩＮは広範囲の誘導因子に反応したＮ
Ｆ−κＢ活性化を阻害する能力を有する可能性がある。従って、ＡＢＩＮの活性
を模倣する薬物は、炎症性疾患及び神経変性疾患において、さらに癌及びＡＩＤ
Ｓにおいて治療的価値を有する可能性が高い。
【００８９】 実施例７：細胞トランスフェクション、共免疫沈降、及びウェスタンブロッテ
ィング ２×１０6個のヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を１０cmのペトリ皿に置き、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ共沈殿により一過性トランスフェクトした。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を５００μlの溶解緩衝液中で溶解した（５０mM ヘペ
ス pH７．６、２５０mM ＮａＣｌ、０．１％ ノニデットＰ−４０及び５mM ＥＤ
ＴＡ）。溶解物を５μlのウサギ抗ＧＦＰ抗体（クロンテック）と共にインキュ
ベートし、免疫複合体をプロテインＡ−トリスアクリル（ピアース）上に固定化
した。それを、溶解緩衝液で２回、１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で２回
洗浄した。共沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗Ｅ
−ｔａｇ抗体（ファルマシア）を用いたウェスタンブロッティングにより分析し
た。
ィング ２×１０6個のヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を１０cmのペトリ皿に置き、リン酸
カルシウム−ＤＮＡ共沈殿により一過性トランスフェクトした。トランスフェク
ションの２４時間後、細胞を５００μlの溶解緩衝液中で溶解した（５０mM ヘペ
ス pH７．６、２５０mM ＮａＣｌ、０．１％ ノニデットＰ−４０及び５mM ＥＤ
ＴＡ）。溶解物を５μlのウサギ抗ＧＦＰ抗体（クロンテック）と共にインキュ
ベートし、免疫複合体をプロテインＡ−トリスアクリル（ピアース）上に固定化
した。それを、溶解緩衝液で２回、１Ｍ ＮａＣｌを含有する溶解緩衝液で２回
洗浄した。共沈殿したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、マウス抗Ｅ
−ｔａｇ抗体（ファルマシア）を用いたウェスタンブロッティングにより分析し
た。
【００９０】 実施例８：ＮＦ−κＢ依存性レポーター遺伝子アッセイ ＮＦ−κＢ活性を、ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子のＮＦ−κＢ依存性発
現により決定した。従って、２９３Ｔ細胞を１穴当たり４×１０5細胞で６穴プ
レートに置き、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法により一過性トランスフェク
トした。各トランスフェクションは、８００ngの特定の発現プラスミドを含有し
、さらに１００ngのｐＮＦｃｏｌｕｃプラスミド及び１００ngのｐＵＴ６５１プ
ラスミドを含有していた。トランスフェクションの２４時間後、これらのトラン
スフェクタントをトリプシン処理し、２４穴プレートに播いた。さらに２４時間
後、細胞を、１０００IU／mlのｈＴＮＦ又は７０００IUのｍＩＬ−１のいずれか
で刺激するか、又は未処理のままにした。刺激の６時間後、細胞を２００μlの
溶解緩衝液中で溶解し、ルシフェラーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性につ
いて分析した。ルシフェラーゼ値（ｌｕｃ）をβ−ガラクトシダーゼ値（ｇａｌ
）に対して標準化し、ｌｕｃ／ｇａｌとしてプロットした。
現により決定した。従って、２９３Ｔ細胞を１穴当たり４×１０5細胞で６穴プ
レートに置き、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈殿法により一過性トランスフェク
トした。各トランスフェクションは、８００ngの特定の発現プラスミドを含有し
、さらに１００ngのｐＮＦｃｏｌｕｃプラスミド及び１００ngのｐＵＴ６５１プ
ラスミドを含有していた。トランスフェクションの２４時間後、これらのトラン
スフェクタントをトリプシン処理し、２４穴プレートに播いた。さらに２４時間
後、細胞を、１０００IU／mlのｈＴＮＦ又は７０００IUのｍＩＬ−１のいずれか
で刺激するか、又は未処理のままにした。刺激の６時間後、細胞を２００μlの
溶解緩衝液中で溶解し、ルシフェラーゼ活性及びβ−ガラクトシダーゼ活性につ
いて分析した。ルシフェラーゼ値（ｌｕｃ）をβ−ガラクトシダーゼ値（ｇａｌ
）に対して標準化し、ｌｕｃ／ｇａｌとしてプロットした。
【００９１】 実施例９：部位特異的突然変異導入 ＡＢＩＮに対する部位特異的突然変異導入は、所望の変異を含有するプライマ
ーを用いた重複ＰＣＲ反応により実施した。用いられたプライマーは、変異プラ
イマー５′−ＧＡＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣ
ＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣ−３′、５′−ＧＴＴＧＣＴＧＡＡ
ＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧ−３′、５′−ＧＣＡ
ＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧ
−３′、５′−ＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣ
ＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧＧＡＧＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧ−３′
、開始コドンに位置する順向きプライマー及び２つの逆向きプライマー（一つは
３′ＵＴＲ、もう一つはコーディング領域にハイブリダイズする）であった。ｐ
ＣＡＧＧＳ中の野生型ＡＢＩＮ（５４〜６４７）のＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片
を、ＰＣＲ増幅された変異型ＡＢＩＮ ｃＤＮＡの同断片と交換した。
ーを用いた重複ＰＣＲ反応により実施した。用いられたプライマーは、変異プラ
イマー５′−ＧＡＡＴＡＣＣＡＧＧＡＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＣＡＧＣＧＧＣＴＣ
ＡＡＴＡＡＡＧＣＴＴＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣ−３′、５′−ＧＴＴＧＣＴＧＡＡ
ＡＧＡＧＧＡＣＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧ−３′、５′−ＧＣＡ
ＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＡＡＴＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧ
−３′、５′−ＧＣＡＧＧＴＡＡＡＡＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣ
ＡＧＡＧＧＧＡＡＣＧＧＡＧＴＧＡＴＧＣＧＣＡＡＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧ−３′
、開始コドンに位置する順向きプライマー及び２つの逆向きプライマー（一つは
３′ＵＴＲ、もう一つはコーディング領域にハイブリダイズする）であった。ｐ
ＣＡＧＧＳ中の野生型ＡＢＩＮ（５４〜６４７）のＸｈｏＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片
を、ＰＣＲ増幅された変異型ＡＢＩＮ ｃＤＮＡの同断片と交換した。
【００９２】 実施例１０：ＡＢＩＮとＡ２０との結合は、ＮＦ−κＢ阻害能にとって充分で
ない Ａ２０を用いたツーハイブリッド・アッセイは、過剰発現の際にやはりＮＦ−
κＢ活性化を阻害することができる、もう一つの新規なＡ２０結合タンパク質を
明らかにした。ＡＢＩＮ−２と名付けられたこの新規タンパク質を用いたＢＬＡ
ＳＴ検索は、既知のタンパク質との相同性が存在しないことを明らかにした。し
かし、ＡＢＩＮ−２及びＡＢＩＮのタンパク質配列の比較により、それぞれ６８
％及び６７％の相同性を有する１９アミノ酸長（ＡＡ４２３〜４４１）及び２１
アミノ酸長（ＡＡ４７５〜４９５）の２つのボックスが同定された（図８）。従
って、ＡＢＩＮのＡ２０との結合及びＮＦ−κＢ阻害効果に対するこれらの領域
の寄与を、多数の保存アミノ酸の部位特異的突然変異導入により分析した（図８
Ａ）。２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ又はＧＦＰ／Ａ２０と野生型ＡＢＩＮ又はそ
の部位特異的変異体（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−Ｍ
ＵＴ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）との一過性過剰発現の後の共免疫沈降は、これ
らの変異体の全てが、依然としてＡ２０に結合しうることを示した（図８Ｂ）。
他方、第二ボックスの点突然変異（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３及
びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）は、これらの発現プラスミドをより多量にトランスフェ
クトした場合ですら、ＴＮＦによる２９３Ｔ細胞の刺激の際のＮＦ−κＢ活性化
を遮断するＡＢＩＮの能力を完全に消失させた。対照的に、第一ボックスにおけ
る突然変異は、ＡＢＩＮのＮＦ−κＢ阻害効果をわずかにしか消失させなかった
（図８Ｃ）。さらに、第二の保存モチーフにおける点突然変異は、野生型ＡＢＩ
ＮのＮＦ−κＢ阻害効果を優性に妨害した（図８Ｄ）。ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２及び
ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３は、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ４と比較して、より強力なＡＢＩＮの
優性ネガティブ変異体としての機能を示す。これらのアッセイにおいて、抗Ｅ−
ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロット分析により判定したところ、異なる変異
体及び野生型ＡＢＩＮの比較可能な発現レベルが得られた。これらの結果は、第
二の保存領域がＡＢＩＮのＮＦ−κＢ阻害効果に関与していること、及びＡＢＩ
ＮとＡ２０との結合自体はＮＦ−κＢ活性化の阻害にとって充分ではないことを
示している。
ない Ａ２０を用いたツーハイブリッド・アッセイは、過剰発現の際にやはりＮＦ−
κＢ活性化を阻害することができる、もう一つの新規なＡ２０結合タンパク質を
明らかにした。ＡＢＩＮ−２と名付けられたこの新規タンパク質を用いたＢＬＡ
ＳＴ検索は、既知のタンパク質との相同性が存在しないことを明らかにした。し
かし、ＡＢＩＮ−２及びＡＢＩＮのタンパク質配列の比較により、それぞれ６８
％及び６７％の相同性を有する１９アミノ酸長（ＡＡ４２３〜４４１）及び２１
アミノ酸長（ＡＡ４７５〜４９５）の２つのボックスが同定された（図８）。従
って、ＡＢＩＮのＡ２０との結合及びＮＦ−κＢ阻害効果に対するこれらの領域
の寄与を、多数の保存アミノ酸の部位特異的突然変異導入により分析した（図８
Ａ）。２９３Ｔ細胞におけるＧＦＰ又はＧＦＰ／Ａ２０と野生型ＡＢＩＮ又はそ
の部位特異的変異体（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−Ｍ
ＵＴ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）との一過性過剰発現の後の共免疫沈降は、これ
らの変異体の全てが、依然としてＡ２０に結合しうることを示した（図８Ｂ）。
他方、第二ボックスの点突然変異（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３及
びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）は、これらの発現プラスミドをより多量にトランスフェ
クトした場合ですら、ＴＮＦによる２９３Ｔ細胞の刺激の際のＮＦ−κＢ活性化
を遮断するＡＢＩＮの能力を完全に消失させた。対照的に、第一ボックスにおけ
る突然変異は、ＡＢＩＮのＮＦ−κＢ阻害効果をわずかにしか消失させなかった
（図８Ｃ）。さらに、第二の保存モチーフにおける点突然変異は、野生型ＡＢＩ
ＮのＮＦ−κＢ阻害効果を優性に妨害した（図８Ｄ）。ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２及び
ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３は、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ４と比較して、より強力なＡＢＩＮの
優性ネガティブ変異体としての機能を示す。これらのアッセイにおいて、抗Ｅ−
ｔａｇ抗体を用いたウェスタンブロット分析により判定したところ、異なる変異
体及び野生型ＡＢＩＮの比較可能な発現レベルが得られた。これらの結果は、第
二の保存領域がＡＢＩＮのＮＦ−κＢ阻害効果に関与していること、及びＡＢＩ
ＮとＡ２０との結合自体はＮＦ−κＢ活性化の阻害にとって充分ではないことを
示している。
【００９３】 参考文献 Aizawa S, et al. Tumor necrosis factor receptor-associated factor (TRAF)
5 and TRAF2 are involved in CD30-mediated NFκB activation. J Biol Chem
. 272, 2042-2045. (1997) Barnes PJ, et al. Anti-inflammatory actions of steroids: molecular mecha
nisms. Trends Pharmacol Sci. 14(12): 436-441 (1993). Barnes PJ and Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription fa
ctor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med. 336(15): 1066-1071
(1997). Behl C, et al. Mechanism of amyloid beta protein induced neuronal cell d
eath: current concepts and future perspectives. J Neural Transm Suppl. 4
9: 125-134 (1997). Brand K, et al. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is
present in the atherosclerotic lesion. J Clin Invest. 97(7): 1715-1722
(1996). Brand K, et al. Dysregulation of monocytic nuclear factor-kappa B by oxi
dized low-density lipoprotein. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17(10): 19
01-1909 (1997). Cao Z, et al. TRAF6 is a signal transducer for interleukin-1. Nature. 38
3, 443-446. (1996) De Valck D, et al. A20, an inhibitor of cell death, self-associates by i
ts zinc finger domain. FEBS Lett. 384, 61-64. (1996) De Valck D, et al. A20 inhibits NF-κB activation independently of bindi
ng to 14-3-3 proteins. Biochem Biophys Res Commun. 238, 590-594. (1997) DiDonato JA, et al. A cytokine-responsive IκB kinase that activates the
transcription factor NF-κB. Nature. 388, 548-554. (1997) Dixit VM, et al. Tumor necrosis factor-alpha induction of novel gene pro
ducts in human endothelial cells including a macrophage-specific chemota
xin. J Biol Chem. 265, 2973-2978. (1990) Harris M. From negative factor to a critical role in virus pathogenesis:
the changing fortunes of Nef. J Gen Virol. 77, 2379-2392. (1996) Hsu H, et al. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell d
eath and NF-κB activation. Cell. 81, 495-504. (1995) Ishida T, et al. Identification of TRAF6, a novel tumor necrosis factor
receptor-associated factor protein that mediates signaling from an amino
-terminal domain of the CD40 cytoplasmic region. J Biol Chem. 271, 28745
-28748. (1996) Jaattela M, et al. A20 zinc finger protein inhibits TNF and IL-1 signali
ng. J Immunol. 156, 1166-1173. (1996) Kaltschmidt C, et al. Transcription factor NF-kappa B is activated in mi
croglia during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol
. 55(1): 99-106. (1994) Kimura A, et al. Detailed analysis of the mouse H-2Kb promoter: enhancer
-like sequences and their role in the regulation of class I gene express
ion. Cell 44(2): 261-272. (1986) Kopp EB and Ghosh S. Inhibition of NF-kappa B by sodium salicylate and a
spirin. Science. 265(5174): 956-959. (1994) Krikos A, et al. Transcriptional activation of the tumor necrosis factor
alpha-inducible zinc finger protein, A20, is mediated by κB elements.
J Biol Chem. 267, 17971-17976. (1992) Luque I, et al. Rel/NF-kappa B and I kappa B factors in oncogenesis. Sem
in Cancer Biol. 8(2): 103-111. (1997) Malanin NL, et al. MAP3K-related kinase involved in NF-κB induction by
TNF, CD95 and IL-1. Nature. 385, 540-544 (1997) Mosialos G. The role of Rel/NF-kappa B proteins in viral oncogenesis and
the regulation of viral transcription. Semin Cancer Biol. 8(2): 121-129
. (1997) Nagase, T et al. Prediction of the coding sequences of unidentified huma
n genes. III. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0081-KIAA0120) d
educed by analysis of cDNA clones from human cell line KG-1. DNA Res.2(1
), 37-43 (1995). Nakano H, et al. TRAF5, an activator of NF-κB and putative signal trans
ducer for the lymphotoxin-β receptor. J Biol Chem. 271, 14661-14664. (1
996) Niwa H. et al. Efficient selection for high-expression transfectants wit
h a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199. (1991) Opipari, A.W.et al.. The A20 cDNA induced by tumor necrosis factor alpha
encodes a novel type of zinc finger protein. J. Biol. Chem. 265, 14705-
14708, (1990). Pahl HL, et al. The immunosuppressive fungal metabolite gliotoxin specif
ically inhibits transcription factor NF-kappaB. J Exp Med. 183(4): 1829-
1840. (1996) Regnier CH, et al. Identification and characterization of an IκB kinase
. Cell. 90, 373-383. (1997) Remick DG. Applied molecular biology of sepsis. J Crit Care. 10(4): 198-
212. (1995) Rothe M, et al. TRAF2-mediated activation of NF-κB by TNF receptor 2 an
d CD40. Science. 269, 1424-1427. (1995) Rothe M, et al. A novel family of putative signal transducers associated
with the cytoplasmic domain of the 75 kDa tumor necrosis factor recepto
r. Cell. 78, 681-692. (1994) Schreck R, et al. Reactive oxygen intermediates as apparently widely use
d messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor an
d HIV-1. EMBO J. 10(8): 2247-2258 (1991) Song HY, et al. The tumor necrosis factor-inducible zinc finger protein
A20 interacts with TRAF1/TRAF2 and inhibits NF-κB activation. Proc Natl
Acad Sci USA. 93, 6721-6725. (1996) Tewari et al., Lymphoid expression and regulation of A20, an inhibitor o
f programmed cell death; J.Immunol. 1995, 154: 1699-1706. Ting AT, et al. RIP mediates tumor necrosis factor receptor 1 activation
of NF-κB but not Fas/APO-1-initated apoptosis. EMBO J. 15, 6189-6196.
(1996) Vanden Berghe W. Et al. p38 and extracellular signal-regulated kinase mi
togen-activated protein kinase pathways are required for nucelar factor-
kappaB p65 transactivation mediated by tumor necrosis factor. J Biol Che
m 273 (6): 3285-3290. (1998) Wang P, et al. Interleukin (IL)-10 inhibits nuclear factor kappa B (NF k
appa B) activation in human monocytes. Il-10 and IL-4 suppress cytokine
synthesis by different mechanisms. J Biol Chem. 270(16): 9558-9563. (199
5) Woronicz JD, et al. IκB kinase-beta: NF-κB activation and complex form
ation with IκB kinase-α and NIK. Science. 278, 866-869. (1997) Yeh WC. Et al. Early lethality, functional NF-kappaB activation, and inc
reased sensitivity to TNF-induced cell death in TRAF2-deficient mice. Im
munity 7(5): 715-725. (1997) Zandi E, et al. The IκB kinase complex (IKK) contains two kinase subuni
ts, IKKα and IKKβ, necessary for IκB phosphorylation and NF-κB activ
ation. Cell. 91, 243-252. (1997)
5 and TRAF2 are involved in CD30-mediated NFκB activation. J Biol Chem
. 272, 2042-2045. (1997) Barnes PJ, et al. Anti-inflammatory actions of steroids: molecular mecha
nisms. Trends Pharmacol Sci. 14(12): 436-441 (1993). Barnes PJ and Karin M. Nuclear factor-kappaB: a pivotal transcription fa
ctor in chronic inflammatory diseases. N Engl J Med. 336(15): 1066-1071
(1997). Behl C, et al. Mechanism of amyloid beta protein induced neuronal cell d
eath: current concepts and future perspectives. J Neural Transm Suppl. 4
9: 125-134 (1997). Brand K, et al. Activated transcription factor nuclear factor-kappa B is
present in the atherosclerotic lesion. J Clin Invest. 97(7): 1715-1722
(1996). Brand K, et al. Dysregulation of monocytic nuclear factor-kappa B by oxi
dized low-density lipoprotein. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 17(10): 19
01-1909 (1997). Cao Z, et al. TRAF6 is a signal transducer for interleukin-1. Nature. 38
3, 443-446. (1996) De Valck D, et al. A20, an inhibitor of cell death, self-associates by i
ts zinc finger domain. FEBS Lett. 384, 61-64. (1996) De Valck D, et al. A20 inhibits NF-κB activation independently of bindi
ng to 14-3-3 proteins. Biochem Biophys Res Commun. 238, 590-594. (1997) DiDonato JA, et al. A cytokine-responsive IκB kinase that activates the
transcription factor NF-κB. Nature. 388, 548-554. (1997) Dixit VM, et al. Tumor necrosis factor-alpha induction of novel gene pro
ducts in human endothelial cells including a macrophage-specific chemota
xin. J Biol Chem. 265, 2973-2978. (1990) Harris M. From negative factor to a critical role in virus pathogenesis:
the changing fortunes of Nef. J Gen Virol. 77, 2379-2392. (1996) Hsu H, et al. The TNF receptor 1-associated protein TRADD signals cell d
eath and NF-κB activation. Cell. 81, 495-504. (1995) Ishida T, et al. Identification of TRAF6, a novel tumor necrosis factor
receptor-associated factor protein that mediates signaling from an amino
-terminal domain of the CD40 cytoplasmic region. J Biol Chem. 271, 28745
-28748. (1996) Jaattela M, et al. A20 zinc finger protein inhibits TNF and IL-1 signali
ng. J Immunol. 156, 1166-1173. (1996) Kaltschmidt C, et al. Transcription factor NF-kappa B is activated in mi
croglia during experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol
. 55(1): 99-106. (1994) Kimura A, et al. Detailed analysis of the mouse H-2Kb promoter: enhancer
-like sequences and their role in the regulation of class I gene express
ion. Cell 44(2): 261-272. (1986) Kopp EB and Ghosh S. Inhibition of NF-kappa B by sodium salicylate and a
spirin. Science. 265(5174): 956-959. (1994) Krikos A, et al. Transcriptional activation of the tumor necrosis factor
alpha-inducible zinc finger protein, A20, is mediated by κB elements.
J Biol Chem. 267, 17971-17976. (1992) Luque I, et al. Rel/NF-kappa B and I kappa B factors in oncogenesis. Sem
in Cancer Biol. 8(2): 103-111. (1997) Malanin NL, et al. MAP3K-related kinase involved in NF-κB induction by
TNF, CD95 and IL-1. Nature. 385, 540-544 (1997) Mosialos G. The role of Rel/NF-kappa B proteins in viral oncogenesis and
the regulation of viral transcription. Semin Cancer Biol. 8(2): 121-129
. (1997) Nagase, T et al. Prediction of the coding sequences of unidentified huma
n genes. III. The coding sequences of 40 new genes (KIAA0081-KIAA0120) d
educed by analysis of cDNA clones from human cell line KG-1. DNA Res.2(1
), 37-43 (1995). Nakano H, et al. TRAF5, an activator of NF-κB and putative signal trans
ducer for the lymphotoxin-β receptor. J Biol Chem. 271, 14661-14664. (1
996) Niwa H. et al. Efficient selection for high-expression transfectants wit
h a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199. (1991) Opipari, A.W.et al.. The A20 cDNA induced by tumor necrosis factor alpha
encodes a novel type of zinc finger protein. J. Biol. Chem. 265, 14705-
14708, (1990). Pahl HL, et al. The immunosuppressive fungal metabolite gliotoxin specif
ically inhibits transcription factor NF-kappaB. J Exp Med. 183(4): 1829-
1840. (1996) Regnier CH, et al. Identification and characterization of an IκB kinase
. Cell. 90, 373-383. (1997) Remick DG. Applied molecular biology of sepsis. J Crit Care. 10(4): 198-
212. (1995) Rothe M, et al. TRAF2-mediated activation of NF-κB by TNF receptor 2 an
d CD40. Science. 269, 1424-1427. (1995) Rothe M, et al. A novel family of putative signal transducers associated
with the cytoplasmic domain of the 75 kDa tumor necrosis factor recepto
r. Cell. 78, 681-692. (1994) Schreck R, et al. Reactive oxygen intermediates as apparently widely use
d messengers in the activation of the NF-kappa B transcription factor an
d HIV-1. EMBO J. 10(8): 2247-2258 (1991) Song HY, et al. The tumor necrosis factor-inducible zinc finger protein
A20 interacts with TRAF1/TRAF2 and inhibits NF-κB activation. Proc Natl
Acad Sci USA. 93, 6721-6725. (1996) Tewari et al., Lymphoid expression and regulation of A20, an inhibitor o
f programmed cell death; J.Immunol. 1995, 154: 1699-1706. Ting AT, et al. RIP mediates tumor necrosis factor receptor 1 activation
of NF-κB but not Fas/APO-1-initated apoptosis. EMBO J. 15, 6189-6196.
(1996) Vanden Berghe W. Et al. p38 and extracellular signal-regulated kinase mi
togen-activated protein kinase pathways are required for nucelar factor-
kappaB p65 transactivation mediated by tumor necrosis factor. J Biol Che
m 273 (6): 3285-3290. (1998) Wang P, et al. Interleukin (IL)-10 inhibits nuclear factor kappa B (NF k
appa B) activation in human monocytes. Il-10 and IL-4 suppress cytokine
synthesis by different mechanisms. J Biol Chem. 270(16): 9558-9563. (199
5) Woronicz JD, et al. IκB kinase-beta: NF-κB activation and complex form
ation with IκB kinase-α and NIK. Science. 278, 866-869. (1997) Yeh WC. Et al. Early lethality, functional NF-kappaB activation, and inc
reased sensitivity to TNF-induced cell death in TRAF2-deficient mice. Im
munity 7(5): 715-725. (1997) Zandi E, et al. The IκB kinase complex (IKK) contains two kinase subuni
ts, IKKα and IKKβ, necessary for IκB phosphorylation and NF-κB activ
ation. Cell. 91, 243-252. (1997)
【配列表】
【図１】 ＡＢＩＮ転写物の組織分布。様々なマウス組織のポリ（Ａ）+ＲＮＡ（１レー
ン当たり２μg）のノーザンブロット（クロンテック）を、Ｃ末端配列ＡＢＩＮ
（３９０〜５９９）を包含するツーハイブリッド分析によりクローニングされた
ＡＢＩＮの断片を用いて検索した。ＲＮＡサイズマーカーがｋＢで示されている
。β−アクチンの発現を、ロードされたＲＮＡ量のためのコントロールとして用
いた。
ン当たり２μg）のノーザンブロット（クロンテック）を、Ｃ末端配列ＡＢＩＮ
（３９０〜５９９）を包含するツーハイブリッド分析によりクローニングされた
ＡＢＩＮの断片を用いて検索した。ＲＮＡサイズマーカーがｋＢで示されている
。β−アクチンの発現を、ロードされたＲＮＡ量のためのコントロールとして用
いた。
【図２Ａ】 ２３９Ｔ細胞におけるＥタグ付加ＡＢＩＮ及びグリーン・フルオレセント・プ
ロテイン（ＧＦＰ）、ＧＦＰ−Ａ２０、ＧＦＰ−Ａ２０（３６９〜７７５）、Ｇ
ＦＰ−Ａ２０（１〜３６８）のコーディング・プラスミド、又はネガティブ・コ
ントロールとしての空ベクターの一過性形質転換の後のＡ２０及びＡＢＩＮの共
免疫沈降。免疫沈降（上パネル）は、抗ＧＦＰ抗体を用いて実施され、抗Ｅ−ｔ
ａｇ抗体を用いたウェスタンブロット検出が行われた。ＡＢＩＮの発現レベルを
調節するため、溶解物のうちの１０μlを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、抗Ｅ−ｔａｇ抗体
を用いたウェスタンブロット検出を行った（下パネル）。
ロテイン（ＧＦＰ）、ＧＦＰ−Ａ２０、ＧＦＰ−Ａ２０（３６９〜７７５）、Ｇ
ＦＰ−Ａ２０（１〜３６８）のコーディング・プラスミド、又はネガティブ・コ
ントロールとしての空ベクターの一過性形質転換の後のＡ２０及びＡＢＩＮの共
免疫沈降。免疫沈降（上パネル）は、抗ＧＦＰ抗体を用いて実施され、抗Ｅ−ｔ
ａｇ抗体を用いたウェスタンブロット検出が行われた。ＡＢＩＮの発現レベルを
調節するため、溶解物のうちの１０μlを、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離し、抗Ｅ−ｔａｇ抗体
を用いたウェスタンブロット検出を行った（下パネル）。
【図２Ｂ】 ２９３Ｔ細胞における一過性過剰発現の際の推定ロイシンジッパー構造を欠く
ＡＢＩＮのＣ末端断片とＧＦＰ−２０とのの共免疫沈降。免疫沈降及び発現のレ
ベルは、全長ＡＢＩＮについての記載と同様にして検出され、それぞれ上下のパ
ネルに示されている。
ＡＢＩＮのＣ末端断片とＧＦＰ−２０とのの共免疫沈降。免疫沈降及び発現のレ
ベルは、全長ＡＢＩＮについての記載と同様にして検出され、それぞれ上下のパ
ネルに示されている。
【図３】 ＡＢＩＮ１配列とＡＢＩＮ２配列との比較から導出された共通配列。
【図４Ａ】 レポーター遺伝子活性により測定された、ＴＮＦ及びＩＬ−１により誘導され
るＮＦ−κＢの活性化に対するＡＢＩＮ又はＡＢＩＮの断片の効果。２９３Ｔ細
胞に、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び１００ngの
発現プラスミドを一過性トランスフェクトし、ｈＴＮＦ（１０００IU／ml）又は
ｍＩＬ１β（２０ng／ml）で６時間刺激した。コントロールとして、１００ngの
ＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。
るＮＦ−κＢの活性化に対するＡＢＩＮ又はＡＢＩＮの断片の効果。２９３Ｔ細
胞に、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び１００ngの
発現プラスミドを一過性トランスフェクトし、ｈＴＮＦ（１０００IU／ml）又は
ｍＩＬ１β（２０ng／ml）で６時間刺激した。コントロールとして、１００ngの
ＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。
【図４Ｂ】 ２９３Ｔ細胞におけるＴＮＦ媒介ＮＦ−κＢ誘導に対する、準至適量のＡ２０
（５ng）及びＡＢＩＮ（２０ng）をコードする発現プラスミドの一過性トランス
フェクションの効果。両方の実験において、標準偏差は１０％未満であった。
（５ng）及びＡＢＩＮ（２０ng）をコードする発現プラスミドの一過性トランス
フェクションの効果。両方の実験において、標準偏差は１０％未満であった。
【図５】 レポーター遺伝子活性により測定された、ＴＰＡにより誘導されるＮＦ−κＢ
活性化に対するＡＢＩＮ又はＡＢＩＮの断片の効果。２９３Ｔ細胞に、１００ng
のｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び１００ngの発現プラスミド
を一過性トランスフェクトし、ＴＰＡ（２００ng／ml）で６時間刺激した。コン
トロールとして、１００ngのＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２０をコードするプラスミド
をトランスフェクトした。
活性化に対するＡＢＩＮ又はＡＢＩＮの断片の効果。２９３Ｔ細胞に、１００ng
のｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び１００ngの発現プラスミド
を一過性トランスフェクトし、ＴＰＡ（２００ng／ml）で６時間刺激した。コン
トロールとして、１００ngのＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２０をコードするプラスミド
をトランスフェクトした。
【図６】 レポーター遺伝子活性により測定された、ＴＮＦ及びＴＰＡにより誘導される
ＮＦ−κＢ活性化に対するＡＢＩＮ２の効果。２９３Ｔ細胞に、１００ngのｐＵ
Ｔ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び６００ngの発現プラスミドを一過
性トランスフェクトし、ｈＴＮＦ（１０００IU／ml）又はＴＰＡ（２００ng／ml
）で６時間刺激した。コントロールとして、６００ngのＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２
０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。
ＮＦ−κＢ活性化に対するＡＢＩＮ２の効果。２９３Ｔ細胞に、１００ngのｐＵ
Ｔ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び６００ngの発現プラスミドを一過
性トランスフェクトし、ｈＴＮＦ（１０００IU／ml）又はＴＰＡ（２００ng／ml
）で６時間刺激した。コントロールとして、６００ngのＧＦＰ又はＧＦＰ−Ａ２
０をコードするプラスミドをトランスフェクトした。
【図７Ａ】 ３００ngのＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ又はｐ６５のコーディン
グ・プラスミドを、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及
び５００ngのｐＣＡＧＧＳ−ＡＢＩＮと共にトランスフェクトした後の、ＴＲＡ
ＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ又はｐ６５の過剰発現により誘導される２９
３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対する、全長ＡＢＩＮの効果。細胞をトラ
ンスフェクションの２４時間後に溶解し、ルシフェラーゼ活性及びβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。
グ・プラスミドを、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及
び５００ngのｐＣＡＧＧＳ−ＡＢＩＮと共にトランスフェクトした後の、ＴＲＡ
ＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２、ＮＩＫ又はｐ６５の過剰発現により誘導される２９
３Ｔ細胞におけるＮＦ−κＢ活性化に対する、全長ＡＢＩＮの効果。細胞をトラ
ンスフェクションの２４時間後に溶解し、ルシフェラーゼ活性及びβ−ガラクト
シダーゼ活性を測定した。
【図７Ｂ】 ＴＲＡＤＤ、ＲＩＰ、ＴＲＡＦ２又はＮＩＫにより誘導されるＮＦ−κＢ活性
化に対するロイシンジッパー構造含有短縮型ＡＢＩＮ（ＡＢＩＮ（３９０〜６４
７））の効果。両方の実験において、標準偏差は１０％未満であった。
化に対するロイシンジッパー構造含有短縮型ＡＢＩＮ（ＡＢＩＮ（３９０〜６４
７））の効果。両方の実験において、標準偏差は１０％未満であった。
【図８Ａ】 Ａ２０との結合及びＮＦ−κＢ活性化の阻害に対するＡＢＩＮの２領域におけ
る部位特異的変異の効果。ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ−２に見出される２つの相同配
列のアミノ酸比較。同一のアミノ酸は太字で示されている。部位特異的変異（下
線）は、示されたような変異体ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢ
ＩＮ−ＭＵＴ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４を生じた。
る部位特異的変異の効果。ＡＢＩＮ及びＡＢＩＮ−２に見出される２つの相同配
列のアミノ酸比較。同一のアミノ酸は太字で示されている。部位特異的変異（下
線）は、示されたような変異体ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢ
ＩＮ−ＭＵＴ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４を生じた。
【図８Ｂ】 ２９３Ｔ細胞におけるこれらの遺伝子の一過性発現後の変異型ＡＢＩＮとＡ２
０との共免疫沈降。細胞に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰ又はｐＣＡＧＧＳ
−ＧＦＰ／Ａ２０を、ＡＢＩＮ又はその部位特異的変異体（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１
、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３又はＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）をコード
するプラスミドと共にトランスフェクトした。これらの細胞の溶解物をポリクロ
ーナル抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。Ａ
ＢＩＮ又はその変異体の共免疫沈降を検索するため、モノクローナル抗Ｅ−ｔａ
ｇ抗体を用いてウェスタンブロット分析を実施した（上パネル）。下パネルは、
ＧＦＰ、ＧＦＰ／Ａ２０及びＡＢＩＮの総発現レベルを示す。この場合、全溶解
物の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、発現を抗ＧＦＰ抗体又は抗Ｅ−ｔａ
ｇ抗体を用いて検出した。
０との共免疫沈降。細胞に、プラスミドｐＣＡＧＧＳ−ＧＦＰ又はｐＣＡＧＧＳ
−ＧＦＰ／Ａ２０を、ＡＢＩＮ又はその部位特異的変異体（ＡＢＩＮ−ＭＵＴ１
、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３又はＡＢＩＮ−ＭＵＴ４）をコード
するプラスミドと共にトランスフェクトした。これらの細胞の溶解物をポリクロ
ーナル抗ＧＦＰ抗体を用いて免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。Ａ
ＢＩＮ又はその変異体の共免疫沈降を検索するため、モノクローナル抗Ｅ−ｔａ
ｇ抗体を用いてウェスタンブロット分析を実施した（上パネル）。下パネルは、
ＧＦＰ、ＧＦＰ／Ａ２０及びＡＢＩＮの総発現レベルを示す。この場合、全溶解
物の画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、発現を抗ＧＦＰ抗体又は抗Ｅ−ｔａ
ｇ抗体を用いて検出した。
【図８Ｃ】 ＴＮＦにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化に対する変異型ＡＢＩＮの効果。２
９３Ｔ細胞に、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び２
００ngの示されたような発現プラスミドを一過性トランスフェクトし、ＴＮＦ（
１０００IU／ml）で６時間刺激した。細胞抽出物をルシフェラーゼ活性及びβ−
ガラクトシダーゼ活性について分析し、ＮＦ−κＢ活性に対応するｌｕｃ／ｇａ
ｌとしてプロットした。各値は、平均（Ｎ＝３）であり、標準偏差は１０％未満
であった。
９３Ｔ細胞に、１００ngのｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び２
００ngの示されたような発現プラスミドを一過性トランスフェクトし、ＴＮＦ（
１０００IU／ml）で６時間刺激した。細胞抽出物をルシフェラーゼ活性及びβ−
ガラクトシダーゼ活性について分析し、ＮＦ−κＢ活性に対応するｌｕｃ／ｇａ
ｌとしてプロットした。各値は、平均（Ｎ＝３）であり、標準偏差は１０％未満
であった。
【図８Ｄ】 ＡＢＩＮのＮＦ−κＢ阻害機能に対するＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵ
Ｔ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４の優性ネガティブ効果。２９３Ｔ細胞に、１００ng
のｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び２００ngのｐＣＡＧＧＳ−
ＡＢＩＮ又は空ベクターを一過性トランスフェクトした。さらに、示されたよう
に、６００ngのＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ４
をコードする発現ベクター、又は空ベクターを共トランスフェクトした。細胞を
ＴＮＦ（１０００IU／ml）で６時間刺激した。細胞抽出物をルシフェラーゼ活性
及びβ−ガラクトシダーゼ活性について分析し、ｌｕｃ／ｇａｌとしてプロット
した。
Ｔ３及びＡＢＩＮ−ＭＵＴ４の優性ネガティブ効果。２９３Ｔ細胞に、１００ng
のｐＵＴ６５１、１００ngのｐＮＦｃｏｎｌｕｃ及び２００ngのｐＣＡＧＧＳ−
ＡＢＩＮ又は空ベクターを一過性トランスフェクトした。さらに、示されたよう
に、６００ngのＡＢＩＮ−ＭＵＴ２、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ３、ＡＢＩＮ−ＭＵＴ４
をコードする発現ベクター、又は空ベクターを共トランスフェクトした。細胞を
ＴＮＦ（１０００IU／ml）で６時間刺激した。細胞抽出物をルシフェラーゼ活性
及びβ−ガラクトシダーゼ活性について分析し、ｌｕｃ／ｇａｌとしてプロット
した。
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年７月４日（２０００．７．４）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正内容】
【００８３】 Ａ２０と同様に、ＡＢＩＮの両方のスプライス異型が、これらの細胞において
、ＴＮＦ又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を遮断することができ
、より短いＮ末端短縮型アイソフォームの方がわずかに効率が高かった（図４Ａ
）。さらに、ＡＢＩＮ欠失変異体の構造−機能分析は、ＮＦ−κＢ阻害活性が、
Ａ２０との相互作用にとっても充分である、Ｃ末端の２２８アミノ酸（ＡＢＩＮ
（４２０−６４７）配列番号８）に存在することを明らかにした。このＡＢＩＮ
変異体は、ロイシンジッパー構造をもはや含有しておらず、このことは、このタ
ンパク質ドメインがＡ２０との相互作用にもＮＦ−κＢの阻害にも関与していな
いことを証明している（図４Ａ）。単独ではＮＦ−κＢ活性化を阻害するために
十分でない、準至適用量のＡ２０及びＡＢＩＮの組み合わせの過剰発現は、ＴＮ
Ｆ（図４Ｂ）又はＩＬ−１による刺激の際のＮＦ−κＢ活性化を大きく消失させ
た。このことは、ＡＢＩＮがＡ２０のＮＦ−κＢ阻害効果を媒介することを示唆
している。
、ＴＮＦ又はＩＬ−１により誘導されるＮＦ−κＢ活性化を遮断することができ
、より短いＮ末端短縮型アイソフォームの方がわずかに効率が高かった（図４Ａ
）。さらに、ＡＢＩＮ欠失変異体の構造−機能分析は、ＮＦ−κＢ阻害活性が、
Ａ２０との相互作用にとっても充分である、Ｃ末端の２２８アミノ酸（ＡＢＩＮ
（４２０−６４７）配列番号８）に存在することを明らかにした。このＡＢＩＮ
変異体は、ロイシンジッパー構造をもはや含有しておらず、このことは、このタ
ンパク質ドメインがＡ２０との相互作用にもＮＦ−κＢの阻害にも関与していな
いことを証明している（図４Ａ）。単独ではＮＦ−κＢ活性化を阻害するために
十分でない、準至適用量のＡ２０及びＡＢＩＮの組み合わせの過剰発現は、ＴＮ
Ｆ（図４Ｂ）又はＩＬ−１による刺激の際のＮＦ−κＢ活性化を大きく消失させ
た。このことは、ＡＢＩＮがＡ２０のＮＦ−κＢ阻害効果を媒介することを示唆
している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 29/00 １０１ Ａ６１Ｐ 37/02 35/00 37/06 37/02 43/00 １１１ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １１１ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ０７Ｋ 14/47 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，Ｇ Ｈ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ヘイニンク，カレン ベルギー国、ベー−9830 シント−マルテ ンス−ラテム、コペルストラート １ (72)発明者 フィアス，ウォルター ベルギー国、ベー−9070 デステルベルヘ ン、ベーケンドレーフ ３
Claims (21)
- 【請求項１】 タンパク質Ａ２０と相互作用することができ、かつＮＦ−κ
Ｂ活性化、好ましくはＴＮＦにより誘導されるＮＦ−κＢ活性化を調節及び／又
は阻害することができる、単離された機能的タンパク質。 - 【請求項２】 配列番号２に示されたアミノ酸配列と７０〜１００％の相同
性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された機能的タンパク質
。 - 【請求項３】 配列番号３に表された配列番号２のアミノ酸５４〜６４７と
７０〜１００％の相同性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離さ
れた機能的タンパク質。 - 【請求項４】 配列番号５に示されたアミノ酸配列と７０〜１００％の相同
性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の単離された機能的タンパク質
。 - 【請求項５】 配列番号６及び／又は配列番号７に示された共通・アミノ酸
配列を含む、請求項１〜４に記載の単離された機能的タンパク質。 - 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質をコードする核
酸。 - 【請求項７】 配列番号１に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％の相同性
を有する、請求項６に記載の核酸。 - 【請求項８】 配列番号４に示されたＤＮＡ配列と７０〜１００％の相同性
を有する、請求項６に記載の核酸。 - 【請求項９】 請求項１〜５のいずれかに記載の単離された機能的タンパク
質及び／又はその機能的断片の、薬剤としての使用。 - 【請求項１０】 請求項１〜５のいずれかに記載の単離された機能的タンパ
ク質及び／又はその機能的断片の、ＮＦ−κＢ関連疾患を治療するための使用。 - 【請求項１１】 ＮＦ−κＢ関連疾患が呼吸器障害、特に成人呼吸促進症候
群、同種移植拒絶、慢性関節リウマチ、喘息、もしくは炎症性腸疾患のような慢
性炎症性疾患、及び／又は全身性エリテマトーデスのような自己免疫疾患である
、請求項１０に記載の使用。 - 【請求項１２】 請求項１〜５のいずれかに記載の単離された機能的タンパ
ク質及び／又はその機能的断片の、腫瘍細胞を抗腫瘍治療に対して感受性にする
ための使用。 - 【請求項１３】 タンパク質が、配列番号２のアミノ酸５４〜６４７、好ま
しくは３９０〜６４７を少なくとも含む、請求項１０〜１２のいずれかに記載の
単離された機能的タンパク質及び／又はその機能的断片の使用。 - 【請求項１４】 タンパク質が、配列番号２のアミノ酸４２０〜６４７を少
なくとも含む、請求項１３に記載の機能的タンパク質及び／又はその機能的断片
の使用。 - 【請求項１５】 請求項１〜５のいずれかに記載の機能的タンパク質及び／
又はその機能的断片の、（一つ又は複数の）該タンパク質とＮＦ−κＢ関連経路
の他のタンパク質成分との相互作用を妨害する化合物をスクリーニングするため
の使用。 - 【請求項１６】 請求項１５に記載のタンパク質の使用を含む、化合物をス
クリーニングする方法。 - 【請求項１７】 請求項１６に記載の方法により単離された化合物。
- 【請求項１８】 一つ又は複数の請求項１〜５のいずれかに記載の単離され
た機能的タンパク質及び／又はその機能的断片と、薬学的に許容される担体材料
とを含む、薬学的組成物。 - 【請求項１９】 請求項１７に記載の一つ又は複数の化合物と、薬学的に許
容される担体材料とを含む、薬学的組成物。 - 【請求項２０】 有効量の請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質及び
／又はその機能的断片を投与することを含む、ＮＦ−κＢ活性化を阻害する方法
。 - 【請求項２１】 請求項１〜５のいずれかに記載のタンパク質及び／又はそ
の機能的断片の、ＮＦ−κＢ関連疾患を治療するための薬学的組成物の製造のた
めの方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP98201472 | 1998-05-06 | ||
| EP98201472.2 | 1998-05-06 | ||
| PCT/BE1999/000055 WO1999057133A2 (en) | 1998-05-06 | 1999-05-05 | Inhibitors of nf-kb activation |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002513552A true JP2002513552A (ja) | 2002-05-14 |
| JP2002513552A5 JP2002513552A5 (ja) | 2006-05-11 |
Family
ID=8233686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000547102A Pending JP2002513552A (ja) | 1998-05-06 | 1999-05-05 | ＮＦ−κＢ活性化の新規な阻害剤 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6673897B1 (ja) |
| EP (1) | EP1075519B1 (ja) |
| JP (1) | JP2002513552A (ja) |
| AT (1) | ATE309352T1 (ja) |
| AU (1) | AU754434B2 (ja) |
| CA (1) | CA2328483A1 (ja) |
| DE (1) | DE69928244T2 (ja) |
| ES (1) | ES2251831T3 (ja) |
| WO (1) | WO1999057133A2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003518507A (ja) * | 1999-12-24 | 2003-06-10 | シノヴィス・リミテッド | 免疫系の活性化および阻害 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE69928244T2 (de) | 1998-05-06 | 2006-08-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. | Inhibitoren der nf-kb aktivierung |
| CA2447249A1 (en) * | 2001-06-22 | 2003-01-03 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw | Abin-mediated hepatitis protection |
| US7700553B2 (en) | 2003-09-24 | 2010-04-20 | Institut Pasteur | Selective inhibition of NF-κB activation by peptides designed to disrupt nemo oligomerization |
| WO2006029981A1 (en) * | 2004-09-13 | 2006-03-23 | Vib Vzw | Abin-mediated protection against lung inflammatory disease |
| CN1304418C (zh) * | 2005-02-22 | 2007-03-14 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 核因子－κB p65亚基拮抗肽及其应用 |
| WO2006108844A1 (en) * | 2005-04-14 | 2006-10-19 | Vib Vzw | Treatment of egfr dependent tumors by abin (a20-binding inhibitor of nf kappab) |
| US8759091B2 (en) * | 2006-10-30 | 2014-06-24 | Le Centre National De La Recherche Scientifique | Gene reporter assay, kit and cells with improved sensitivity and/or specificity for determining the level of an extracellular signal |
| CN101307094B (zh) * | 2008-03-21 | 2011-09-28 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 一种核因子-κB p65亚基拮抗多肽 |
| CN101798336B (zh) * | 2009-02-06 | 2012-02-29 | 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 | 一种具有示踪功能的抗肿瘤化合物 |
| CN111606976A (zh) * | 2020-05-26 | 2020-09-01 | 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 | 一种小肽及其在抑制阿片成瘾性和耐受性上的应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4217344A (en) * | 1976-06-23 | 1980-08-12 | L'oreal | Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres |
| US4235871A (en) * | 1978-02-24 | 1980-11-25 | Papahadjopoulos Demetrios P | Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles |
| US4186183A (en) * | 1978-03-29 | 1980-01-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis |
| US4261975A (en) * | 1979-09-19 | 1981-04-14 | Merck & Co., Inc. | Viral liposome particle |
| US4485054A (en) * | 1982-10-04 | 1984-11-27 | Lipoderm Pharmaceuticals Limited | Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV) |
| US4501728A (en) * | 1983-01-06 | 1985-02-26 | Technology Unlimited, Inc. | Masking of liposomes from RES recognition |
| US4946787A (en) * | 1985-01-07 | 1990-08-07 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US5049386A (en) * | 1985-01-07 | 1991-09-17 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4897355A (en) * | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
| US4797368A (en) * | 1985-03-15 | 1989-01-10 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector |
| US4774085A (en) * | 1985-07-09 | 1988-09-27 | 501 Board of Regents, Univ. of Texas | Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators |
| US4837028A (en) * | 1986-12-24 | 1989-06-06 | Liposome Technology, Inc. | Liposomes with enhanced circulation time |
| US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
| WO1991017424A1 (en) | 1990-05-03 | 1991-11-14 | Vical, Inc. | Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes |
| US5173414A (en) * | 1990-10-30 | 1992-12-22 | Applied Immune Sciences, Inc. | Production of recombinant adeno-associated virus vectors |
| US5587308A (en) | 1992-06-02 | 1996-12-24 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services | Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter |
| UA71889C2 (uk) * | 1996-04-02 | 2005-01-17 | Йєда Рісерч Енд Дівелопмент Ко. Лтд. | Модулятори зв'язаного з рецептором tnf фактора (traf), їх одержання та застосування |
| DE69928244T2 (de) | 1998-05-06 | 2006-08-10 | Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw. | Inhibitoren der nf-kb aktivierung |
-
1999
- 1999-05-05 DE DE69928244T patent/DE69928244T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-05 JP JP2000547102A patent/JP2002513552A/ja active Pending
- 1999-05-05 AT AT99924594T patent/ATE309352T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-05-05 ES ES99924594T patent/ES2251831T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-05 AU AU41244/99A patent/AU754434B2/en not_active Ceased
- 1999-05-05 EP EP99924594A patent/EP1075519B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-05-05 WO PCT/BE1999/000055 patent/WO1999057133A2/en active IP Right Grant
- 1999-05-05 CA CA002328483A patent/CA2328483A1/en not_active Abandoned
-
2000
- 2000-10-31 US US09/702,953 patent/US6673897B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2003
- 2003-10-08 US US10/680,998 patent/US7414026B2/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003518507A (ja) * | 1999-12-24 | 2003-06-10 | シノヴィス・リミテッド | 免疫系の活性化および阻害 |
| US7915009B2 (en) * | 1999-12-24 | 2011-03-29 | The Mathilda And Terence Kennedy Institute Of Rheumatology Trust | Activation and inhibition of the immune system |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU754434B2 (en) | 2002-11-14 |
| CA2328483A1 (en) | 1999-11-11 |
| ATE309352T1 (de) | 2005-11-15 |
| AU4124499A (en) | 1999-11-23 |
| EP1075519B1 (en) | 2005-11-09 |
| US6673897B1 (en) | 2004-01-06 |
| EP1075519A2 (en) | 2001-02-14 |
| WO1999057133A3 (en) | 2000-02-24 |
| WO1999057133A2 (en) | 1999-11-11 |
| US20040092430A1 (en) | 2004-05-13 |
| ES2251831T3 (es) | 2006-05-01 |
| DE69928244T2 (de) | 2006-08-10 |
| US7414026B2 (en) | 2008-08-19 |
| DE69928244D1 (de) | 2005-12-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Li et al. | Human Genome and Diseases:¶ WD-repeat proteins: structure characteristics, biological function, and their involvement in human diseases | |
| Hayashi et al. | Ubc9 is essential for viability of higher eukaryotic cells | |
| US5863795A (en) | Nucleic acids that encode peptides which modulate apoptosis | |
| KR100536394B1 (ko) | Fas/ap01수용체들의기능조절인자 | |
| JP2002513552A (ja) | ＮＦ−κＢ活性化の新規な阻害剤 | |
| US20060286091A1 (en) | RelA-ASSOCIATED INHIBITOR, PROCESS FOR PRODUCING THE SAME AND UTILIZATION THEREOF | |
| AU2001290179B2 (en) | Mechanism of conditional regulation of the hypoxia-inducible factor-1 by the von hippel-lindau tumor suppressor protein | |
| Bounpheng et al. | Characterization of the mouse JAB1 cDNA and protein | |
| AU2001290179A1 (en) | Mechanism of conditional regulation of the hypoxia-inducible factor-1 by the von hippel-lindau tumor suppressor protein | |
| CN109200287B (zh) | 直接或间接调控yb-1磷酸化的物质在制备治疗炎性因子所致疾病的药物方面的应用 | |
| KR100399982B1 (ko) | Ａｓｋ１과 결합하는 ｃａｄ의 선택적인 저해제로서아폽토시스를 억제하는 신규한 마우스 ｃｉａ 단백질,ｃｉａ 유전자 및 그의 용도 | |
| WO2004072094A2 (en) | Hmgb1 modulator binding domain | |
| US20040054129A1 (en) | Novel peptides and compositions which modulate apoptosis | |
| US6172195B1 (en) | IKAP proteins and methods | |
| HIRANO et al. | Cloning and functional expression of a degradation-resistant novel isoform of p27Kip1 | |
| US6566501B1 (en) | Transcription factor regulating TNF-α | |
| US20050101769A1 (en) | CD40-interacting and TRAF-interacting proteins | |
| Parekh et al. | Isolation of a hamster cDNA homologous to the mouse and human cyclin kinase inhibitory protein p27 Kip1 | |
| JP3993439B2 (ja) | Ａｉｐ処理により発現の変化する新規遺伝子群 | |
| JP2000224993A (ja) | ＲｅｌＡ結合性阻害因子、その製造方法およびその用途 | |
| JP2002247990A (ja) | マウスａｐ１・リプレッサー転写因子ｊｄｐ−２ | |
| JP2003238591A (ja) | アポトーシス誘導剤、アポトーシス誘導活性を有する化合物、抗がん剤、薬剤スクリーニング方法および薬剤スクリーニングキット | |
| WO2003018776A9 (en) | IDENTIFICATION OF THE IκBNS PROTEIN AND ITS PRODUCTS | |
| MXPA02007620A (es) | Coparticipes del dominio ptb1 de fe65, preparacion y usos. | |
| JP2002101891A (ja) | 細胞周期調節タンパク質 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060315 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060315 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090414 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090714 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090901 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091228 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100118 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20100402 |