CN101798336B

CN101798336B - 一种具有示踪功能的抗肿瘤化合物

Info

Publication number: CN101798336B
Application number: CN2009100088064A
Authority: CN
Inventors: 梁华平; 李小凤; 卢芳
Original assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Third Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2009-02-06
Filing date: 2009-02-06
Publication date: 2012-02-29
Anticipated expiration: 2029-02-06
Also published as: CN101798336A

Abstract

本发明涉及一种具有示踪功能的抗肿瘤化合物，所述化合物是一种核因子-κB拮抗五肽用异硫氰酸荧光素进行标记，标记后其空间结构发生改变、抗肿瘤活性明显提高的化合物。

Description

一种具有示踪功能的抗肿瘤化合物

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种用于肿瘤治疗且具有示踪功能的化合物，更具体而言，涉及一种核因子-κB拮抗五肽经过异硫氰酸荧光素(FITC)标记后其空间结构发生改变、抗肿瘤活性明显提高的化合物。本发明还涉及这种抗肿瘤化合物的制备和应用。

背景技术

自1986年核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)被偶然发现以来，其重要性正日益受到关注并成为目前最活跃的研究领域之一。典型的NF-κB是由多肽链p50和p65两亚基形成的异二聚体。当细胞处于静息状态时，NF-κB主要与κB抑制蛋白(IκB_s，，其中起重要作用的是IκB_α，IκB_β)结合形成三聚体，以无活性方式存在于细胞质中；当细胞受到多种外界信号(如炎性刺激、致癌物、电离辐射、生长因子及其它应激原等)刺激进而启动细胞第二信使系统时，IκB_s在IκB激酶(IκKs：由IκK_α、IκK_β、NIK、IKAP组成的复合物)的作用下发生磷酸化并降解，NF-κB失去IκB_s的严格控制而被激活，并移位进入细胞核内；其亚基形成环状结构与靶基因特定部位结合，启动400余种与炎症、细胞存活、增殖、侵袭及血管生成密切相关的基因转录表达。已证实NF-κB的活化不仅与多种炎症相关性疾病的发生发展密切相关，而且也与肿瘤的生长、增殖、存活、侵袭、转移、新生血管生成以及放、化疗耐受有关，因此，NF-κB被认为是极具潜力的抗肿瘤靶点。目前众多医药公司斥巨资研发具有治疗潜力的NF-κB抑制剂，部分已进入I/II期临床实验。可见有关NF-κB的研究态势正逐渐“从克隆向临床”(from clone to clinic)过渡。

目前国外有关拮抗NF-κB活化的治疗策略主要包括以下几个方面：①抗氧化治疗：如吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)等。②抑制IκK的形成及活性：如靶向IκKα的反义核酸，可阻止IκKα的形成，从而缓解或减轻IκB的磷酸化及降解过程，最终达到抑制NF-κB活性的目的；NF-κB必需调节蛋白(NF-κB essential modifier，NEMO)是IκK蛋白复合物的调节蛋白，对维持IκK的功能有重要作用。设计针对NEMO的抗炎多肽，可以与NEMO结合，阻止NEMO与IκKβ的连接，从而抑制IκK的活性及其后续效应。③减少IκB的降解：某些蛋白酶小体抑制剂如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin、epoxomicin均可通过抑制IκB的降解从而拮抗NF-κB的活性，某些丝氨酸蛋白酶抑制剂如TLCK(N alpha-p-tosyl1-L-lysine chloromethyl ketone)、TPCK(N-tosyl-L-phenylalaninechloromethyl ketone)以及分泌性白细胞蛋白酶抑制剂也具有类似的功能。④促进IκB的生成：应用IκBα的腺病毒表达载体，使IκBα显型失活突变体过量表达，可明显抑制NF-κB的核移位及其后续效应。⑤抑制NF-κB的合成：如针对p50和p65的反义寡脱氧核苷酸可与编码NF-κB的基因及mRNA结合，进而阻断基因的转录、翻译过程，最终抑制NF-κB的形成。设计针对NF-κB家族高保守区的核酶，可对编码NF-κB的mRNA进行切割破坏，在mRNA水平阻断NF-κB的形成。⑥干预NF-κB的核定位：如合成p50和p65的核定位基序，导入细胞后可明显抑制NF-κB的入核过程，但同时也干预了其他转录因子的核定位。⑦传统糖皮质激素及非甾体类抗炎药物抑制NF-κB的活化；⑧来源于中药的姜黄素、黄酮类化合物和白藜芦醇等化合物非特异地抑制NF-κB信号通路的活化。

上述以NF-κB为靶点的治疗策略在动物实验及体外细胞培养系统中已表现出不同程度的疗效，部分治疗策略已进入临床试用阶段并已通过United States Patent and TrademarkOffice和European Patent Office等注册专利受到保护。但上述措施均存在特异性欠佳的问题。如蛋白酶小体，它除了可降解IκB外，还具有其他许多重要的功能，因此抑制蛋白酶小体活性将导致潜在的毒副作用。如第一个临床应用治疗复发或难治的多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂——硼替佐米(bortezomib，商品名为万珂Velcade，最初被称为PS-341)，主要对抗NF-κB路径，也有其他作用，而这些其他作用会导致一些毒性——例如用药后出现显著的神经病变。靶向IKK、IκB的措施对NF-κB活性的干预也不完全特异，如干扰IKK复合物形成的干扰肽已被证实，其不仅可抑制NF-κB的活性，还可抑制转录因子AP-1和NFAT的活性。糖皮质激素、非甾体类抗炎药物、姜黄素、黄酮类化合物和白藜芦醇等化合物除了抑制NF-κB信号通路外，还对其它信号通路具有调控作用。而直接抑制NF-κB的合成策略虽然对于NF-κB是特异性的，但反义核酸和siRNA策略进入临床应用也还存在许多问题，因此抑制NF-κB的合成策略并非最优选择。从NF-κB的整个活化途径不难看出，NF-κB与DNA顺式元件的结合是特异的，也是NF-κB启动相关基因转录的必经之路。只有对NF-κB与DNA顺式元件的结合实施直接的干预措施，才能达到真正意义上的特异性。目前针对NF-κB与DNA顺式元件结合设计阻断措施，采用的是圈套(Decoy)策略，即合成与DNA顺式元件序列一致的寡核苷酸序列，阻断NF-κB与DNA顺式元件的结合。如美国医药公司Corgentech和AlgoRx于2005年12月联合注册了商品名为Avrina的药物，对湿疹进行I、II期临床试验。该药物为NF-κB圈套分子，被认为是高度选择性的NF-κB抑制剂。但众所周知，NF-κB拮抗剂只有进入细胞内才能发挥抑制作用，而目前获得的NF-κB圈套分子不能自由穿过细胞膜，通过细胞内外的浓度梯度而发生的药物扩散有限，而应用脂质体转染等手段则又面临转染效率难以控制(特别是在体内给药时)等问题。

随着20世纪80年代后期崛起的一种研究蛋白质相互作用的有力工具——酵母双杂交技术的建立、成熟和发展，对NF-κB拮抗多肽的筛选工作最终成为可能。酵母双杂交系统具有很高的灵敏度，能检测微弱而短暂的蛋白质间相互作用，且该系统中蛋白质的相互作用发生于酵母细胞胞内和/或核内。与原核细胞相比，真核酵母细胞对蛋白质的翻译和加工更加接近哺乳细胞，以其为工程菌研究蛋白质的相互作用将更佳接近哺乳细胞的生理状态，即保持蛋白质天然的折叠状态，使蛋白质间相互作用更接近哺乳细胞内的真实水平。因此，应用该系统研究蛋白质间的相互作用已得到愈来愈广泛的应用，特别对胞内靶蛋白相互作用蛋白或多肽的筛选，此系统更为首选。NF-κB是核转录因子，存在于细胞浆中，但于细胞核内发挥转录调控功能。因此，我们选用酵母双杂交系统，以NF-κB p65 DNA结合域为诱饵蛋白，从随机肽库中筛选NF-κB相互作用多肽，并鉴定这些多肽的功能。目前我们已筛选获得8条具有不同序列的NF-κB p65亚基拮抗肽，这里所列的是其中一条五肽，其氨基酸序列为ArgLeu Arg Trp Arg，另外5条分别见专利200510007479.2，200510069451.1。

为了提高多肽的活性并降低其副作用，需要对现有的活性多肽进行结构改造或结构优化。目前对多肽进行结构改造的方法可分为两大类：(1)在不改变多肽本质基础上进行的改造。包括将直链肽改造成环肽、定位突变或化学修饰(如聚乙二醇修饰)、结构拼接组装、微囊包埋等设计策略。(2)把肽结构变换成非肽分子。

本课题组在对自行研制的五肽进行结构改造的探索过程中，意外地发现该五肽经荧光素FITC标记后，其抗肿瘤活性明显提高，获得了一种对多肽分子进行示踪与结构优化的同步设计策略。经过进一步的对比实验及分子构象分析，证实该五肽经荧光素FITC标记后，其空间结构发生了较大的改变。更出人意料的是，该新型化合物与原五肽分子相比，其对NF-κB的抑制活性不仅没有增加，反而明显降低了。基于其抗肿瘤活性明显提高的事实，我们有足够的理由推测：该化合物除了对NF-κB具有调节作用外，还作用于其它的靶点以发挥其抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的是提供核因子-κB拮抗五肽经过异硫氰酸荧光素(FITC)标记的标记化合物。标记后的化合物其空间结构发生改变、抗肿瘤活性明显提高。

其中所述核因子-κB拮抗五肽为Arg Leu Arg Trp Arg，

本发明的优选标记化合物如下：

FITC-Arg Leu Arg Trp Arg(FITC-RLRWR)

本发明的另一目的是提供标记化合物的药物用途。

本发明所述的药物用途是抗肿瘤的药物用途。其中所述肿瘤是肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、直(结)肠癌、乳腺肿瘤、膀胱癌、前列腺肿瘤等。

本发明还包括含有本发明标记化合物的药物组合物。本发明的药物组合物，必要时可以含有药物可接受的载体。本发明的药物组合物，可以以任何形式的药物制剂形式存在。如适合口服的制剂或适合注射的制剂，优选是注射剂。最优选是冷冻干燥注射剂。

本发明还包括本发明的标记化合物的制备方法，所述方法选自常规的固相合成方法、溶液中合成方法或化学合成方法，在合成过程中加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记物。

本发明的标记化合物既可以单独存在，也可与其它蛋白和多肽融和，或被甲基化、乙酰化和氨基化等修饰，或进行个别氨基酸的突变或替代，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此分子结构的物质可表现出抗肿瘤活性。

本发明将荧光素FITC对具有抑制核因子-κB p65亚基的五肽分子进行氨基端标记，并证实该分子尽管对核因子-κB的抑制活性降低，但抗肿瘤作用明显增强，这是其空间结构发生改变的结果。这对于设计和研制新型抗肿瘤药物具有重要意义。

本发明的标记化合物可以成为新的抗肿瘤药物或药物前体，可以用于治疗各种肿瘤。另外，本发明的标记化合物作为生物制剂也有着潜在的应用价值，如作为示踪配体用于其作用靶点的筛选等。

本发明的标记化合物可有各种应用方式，主要包括在体外和体内抑制肿瘤细胞的生长，以及其作用靶点的筛选等。

含本发明的标记化合物在生物医学方面的应用还包括：

1、通过合成的方式，将该化合物与其它蛋白或肽融合或进行化学修饰，用于肿瘤的治疗。

2、用于在体器官组织、离体细胞培养的示踪研究。

3、用于其作用靶点的筛选与鉴定。

附图说明

图1为通过能量优化的方法分析优选标记化合物与未标记五肽的结构差异。

图2为荧光素酶报告基因实验检测优选标记化合物与未标记五肽对核因子-κB反应性荧光素酶报告基因表达的抑制效应。A、B、C、D、E、F、G、H、I分别为U937、U937+LPS、U937+LPS+p4-kB-Luc、U937+LPS+p4-kB-Luc+9.375μmol/L标记化合物或五肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+18.75μmol/L标记化合物或五肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+37.5μmol/L标记化合物或五肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+75μmol/L标记化合物或五肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+150μmol/L标记化合物或五肽、U937+LPS+p4-kB-Luc+150μmol/L阴性标记化合物或阴性肽。

图3为优选标记化合物与未标记五肽对LOVO细胞体外增殖的抑制实验结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、能量优化的方法分析优选标记化合物与未标记五肽的结构差异

利用生物信息学分析软件，通过能量优化的方法分析该化合物与五肽的结构差异。

结果说明，与五肽RLRWR结构相比，KRLRWR、KRLRWRC、biotin-RLRWR构象变化较小，而FITC-RLRWR的构象变化最大，与RLRWR的相似程度是0.686。结果见图1。

实施例2、优选标记化合物与未标记五肽对核因子-κB反应性报告基因表达的抑制实验

该化合物与五肽序列由上海华大天源生物科技有限公司合成，纯度＞95％。1640培养基培养U937细胞，转染前一天将细胞密度调整为0.5～2.5×10⁵个/mL，过夜培养；取1mL过夜培养细胞或以0.5×10⁵个细胞/孔细胞量加入24孔培养板；取3μL GeneJuice转染试剂加入100μL无血清1640培养基中，旋涡混匀，室温放置5min；取1μg p4kB-Luc质粒加入GeneJuice/1640培养基混合物中，轻轻吹打混匀，室温放置5-15min；将上述混合物逐滴加入完全培养基中，轻轻震荡，使混合物和细胞充分混匀；37℃，5％CO2培养箱培养；转染5h后，用完全培养基进行换液培养1h后用PBS洗细胞3次，最后将细胞重悬于100μL的含10％小牛血清的1640培养基中；按分组的不同分别加入系列浓度的该化合物、五肽、阴性化合物、阴性五肽100μl，终浓度分别为75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM，同时设对照组(加1640培养液100μl)，再加入终浓度为1μg/mL的LPS进行刺激，培养2h后吸取细胞500g离心5min，PBS洗涤细胞一次，除尽PBS上清；以100μl/孔加入1×CCLR细胞裂解缓冲液；涡旋EP管10-15s，4℃，12000rpm离心2min，取上清，-70℃保存或直接检测荧光素酶的活性；于96孔检测板中加入100μL/孔荧光素酶检测试剂后，再加入100μL/孔细胞裂解液后立刻读数，并打印或记录数据。

结果表明，五肽对核因子-κB反应性荧光素酶报告基因的表达具有抑制作用，且这种抑制作用具有量效关系，即抑制作用随着肽浓度的升高而增加，而本发明的化合物对核因子-κB反应性荧光素酶报告基因的表达抑制作用明显降低，阴性化合物/阴性五肽则不具有这种抑制作用，如图2所示。由此说明，我们筛选获得的新型化合物对核因子-κB的抑制活性明显减弱。

实施例3、优选标记化合物与未标记五肽对LOVO细胞体外增殖的抑制实验。

以含10％小牛血清的RPMI1640培养人结肠癌细胞株——LOVO细胞，取对数生长期的细胞，经0.25％胰酶消化后计数，以2.5×10⁴/ml的细胞浓度接种在96孔板中，每孔接种100μl，使细胞接种量分别为2.5×10³/孔。待细胞培养贴壁4小时后，按分组的不同分别加入系列浓度的该化合物、五肽、阴性化合物、阴性五肽100μl，终浓度分别为75μM、37.5μM、18.75μM、9.375μM，同时设对照组(加1640培养液100μl)，待细胞培养72小时后以MTT法测定细胞增殖，采用多功能读板机在波长570nm下测量各孔OD值。

结果表明，与五肽相比，本发明的化合物对LOVO细胞在体外的增殖的抑制作用明显增强，且该抑制效应具有量效关系，即抑制作用随分子浓度的升高而增强，而阴性化合物则对LOVO细胞在体外的增殖反应无明显影响，如图3所示。

实施例4、FITC-Arg Leu Arg Trp Arg优选标记化合物的制备方法

固相多肽合成的主要操作步骤如下：1、树脂溶涨：将2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，振荡30min。2、接C端第一个氨基酸：通过沙芯抽滤掉溶剂，加入3倍摩尔过量的Fmoc-L-Arg(pbf)-OH氨基酸，再加入10倍摩尔过量的DIEA，最后加入DMF溶解，振荡30min。3、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。4、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃-110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。5、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。6、重复二至五步操作，从右到左依次连接序列中的氨基酸。7、最后加入1.5倍过量的FITC，在吡啶/DMF/DCM为12/7/5的溶液中避光反应4-6小时。8、抽干，按照下列方法洗树脂：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次，抽干10min。9、从树脂上切割多肽：配制切割液(10/g)TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％；切割时间：120min。10、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。11、用HPLC纯化多肽。12、最后将纯化后的溶液冻干，既得到成品。13、鉴定：分别取少量的成品多肽，做MS的分子量鉴定，和HPLC分析的纯度鉴定。14、将白色粉末状的多肽，密封包装，-20度保存。

Claims

1.一种具有抗肿瘤作用的标记化合物，其特征在于，所述标记化合物为：FITC-Arg Leu Arg Trp Arg。

2.含有权利要求1的标记化合物的药物组合物。

3.权利要求2的药物组合物，其中含有药物可接受的载体。

4.权利要求2的药物组合物，以任何形式的药物制剂形式存在。

5.权利要求2的药物组合物，是注射剂。

6.权利要求2的药物组合物，是冷冻干燥注射剂。

7.权利要求1的标记化合物的制备方法，其特征在于，所述方法选自常规的固相合成方法，在合成过程中加入异硫氰酸荧光素标记物。

8.权利要求7的制备方法，其特征在于，所述在合成过程中加入异硫氰酸荧光素标记物，是用异硫氰酸荧光素标记物对具有抑制核因子-κB p65亚基的五肽分子进行氨基端标记，其中所述五肽分子为ArgLeu Arg Trp Arg。

9.权利要求1的标记化合物在制备治疗结肠癌的药物中的应用。