CN101974073B

CN101974073B - 一种抗炎六肽

Info

Publication number: CN101974073B
Application number: CN 201010536659
Authority: CN
Inventors: 梁华平; 范霞; 张醇; 王希; 杨雪
Original assignee: Third Affiliated Hospital of TMMU
Current assignee: Third Military Medical University TMMU; Third Affiliated Hospital of TMMU
Priority date: 2010-11-05
Filing date: 2010-11-05
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2030-11-05
Also published as: CN101974073A

Abstract

本发明涉及一种抗炎六肽Lys Val Cit Lys Pro Val，及这种抗炎六肽的制备和应用，本发明还包括本发明的多肽的制备方法，所述方法选自常规的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重组方法或化学合成方法，本发明所述药物用途是治疗炎性免疫相关疾病的药物用途，其中所述炎性相关疾病是脓毒症、脓毒性休克、(类)风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮等。

Description

一种抗炎六肽

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及一种能够抑制炎症因子分泌的六肽分子Lys Val Cit LysPro Val，本发明还涉及这种抗炎六肽的制备和应用。

背景技术

自1986年核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)被偶然发现以来，其重要性正日益受到关注并成为目前最活跃的研究领域之一。典型的NF-κB是由多肽链p50和p65两亚基形成的异二聚体。当细胞处于静息状态时，NF-κB主要与κB抑制蛋白(IκBs，，其中起重要作用的是IκBα，IκBβ)结合形成三聚体，以无活性方式存在于细胞质中；当细胞受到多种外界信号(如炎性刺激、致癌物、电离辐射、生长因子及其它应激原等)刺激进而启动细胞第二信使系统时，IκBs在IκB激酶(IκKs：由IκKα、IκKβ、NIK、IKAP组成的复合物)的作用下发生磷酸化并降解，NF-κB失去IκBs的严格控制而被激活，并移位进入细胞核内；其亚基形成环状结构与靶基因特定部位结合，启动400余种与炎症、细胞存活、增殖、侵袭及血管生成密切相关的基因转录表达。已证实NF-κB的活化不仅与肿瘤的生长、增殖、存活、侵袭、转移、新生血管生成以及放、化疗耐受有关，而且也与多种炎症相关性疾病的发生发展密切相关，如(类)风湿性关节炎、哮喘、慢性肾小球性肾炎、幽门螺杆菌相关性胃炎、炎症性肠道疾病等慢性炎性疾病，脓毒症、脓毒性休克、急性肾小球性肾炎等急性炎性疾病，Alzheimer′s病，动脉粥样硬化，系统性红斑自狼疮等身免疫性疾病和癌症的发生和发展均于NF-κB过度或持续活化密切相关。因此，NF-κB被认为是极具潜力的抗肿瘤、抗炎靶点。目前众多医药公司斥巨资研发具有治疗潜力的NF-κB抑制剂，部分已进入I/II期临床实验。可见有关NF-κB的研究态势正逐渐“从克隆向临床”(from clone to clinic)过渡。

鉴于NF-κB在上述疾病的发生和发展中的潜在作用，以NF-κB及其信号传导通路中的相关蛋白为靶点，研发NF-κB相关疾病的治疗药物已成为本领域中的研究热点。目前国外有关以NF-κB为靶点的拮抗治疗策略主要包括以下几个方面：(1)抗氧化治疗：如抗氧化剂——吡咯烷二硫氨基甲酸(Pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)非特异抑制NF-κB的转录活性；(2)抑制IKK的形成及活性：应用IKKα的反义核酸、表达IKKα显性失活突变体以及应用干扰IKK复合物形成的干扰肽等抑制IKK的形成及活化；(3)减少IκB的降解：某些蛋白酶小体抑制剂如MG101、MG115、MG132、PS-341、lactacystin以及近来发现的epoxomicin等均可通过抑制IκB的降解，达到拮抗NF-κB活性的目的。(4)促进IκB的生成：应用IκBα的腺病毒表达载体，使IκBα显型失活突变体过量表达，可明显抑制NF-κB的核移位及其后续效应；(5)抑制NF-κB的合成：设计P50和P65的反义核酸和siRNA阻滞NF-κB的合成；(6)传统非甾体类抗炎药物抑制NF-κB的活化；(7)来源于中药的姜黄素、黄酮类化合物和白藜芦醇等化合物非特异地抑制NF-κB信号通路的活化。

上述以NF-κB为靶点的治疗策略在体外和动物实验中已表现出不同程度的疗效，部分治疗策略已进入临床试用阶段，且已通过United States Patent and Trademark Office和European Patent Office等注册并受专利保护。如第一个临床应用治疗复发或难治的多发性骨髓瘤的蛋白酶体抑制剂——硼替佐米(bortezomib，商品名为万珂Velcade，最初被称为PS-341)，主要对抗NF-κB路径。如美国医药公司Corgentech和AlgoRx于2005年12月联合注册了商品名为Avrina的药物，对湿疹进行I、II期临床试验。该药物为NF-κB诱骗(Decoy)分子，被认为是高度选择性的NF-κB抑制剂。但众所周知，NF-κB拮抗剂的应用必然要面对如下不可回避的问题：①安全性：由于NF-κB遍布全身所有的细胞，不加选择的抑制其活性会导致广泛的生理功能紊乱。如上述硼替佐米使用后可出现显著的神经病变。解决该问题的理想选择有两个：一是采用药物靶向传输系统，使其只在病灶部位或病变细胞中起作用；二是局部用药，如上述Avrina药物对湿疹治疗时采用的是局部涂抹用药方式。②穿膜性：NF-κB拮抗剂只有进入细胞内才能发挥抑制作用。解决方法如下：一是选择小分子拮抗剂，因其可自由穿过细胞膜；二是通过转染制剂如脂质体转染；三是通过连接穿膜肽后，由其导入细胞内。③高效性：对获得的阳性多肽或化合物，在提高其药代动力学性质(如溶解度、疏水性、转运特性等)的基础上，通过改构、优化等策略提高其与靶分子的亲和力或同时作用多个靶标发挥作用。目前有关NF-κB拮抗剂的安全性(靶向性)、穿膜性、高效性的研究正成为该领域的研究热点和难点。

我们在国家自然科学基金项目的资助下，利用酵母双杂交技术，以NF-κB亚基p65的DNA结合域为“诱饵”，筛选出系列p65相互作用多肽，后经Pull-down、表面等离子共振分析、报告基因实验、离体细胞培养和在体炎症动物模型实验验证，成功获得系列NF-κB亚基拮抗肽，其中5条分别见专利200510007479.2，200510069451.1。

为了提高多肽的活性并降低其副作用，需要对现有的活性多肽进行结构改造或结构优化。目前对多肽进行结构改造的方法可分为两大类：①在不改变多肽本质基础上进行的改造。包括将直链肽改造成环肽、定位突变或化学修饰(如聚乙二醇修饰)、结构拼接组装、微囊包埋等设计策略。②把肽结构变换成非肽分子。我们通过不同的策略对自行研制的上述NF-κB亚基拮抗肽进行结构改造，意外发现NF-κB亚基拮抗肽AspLysProVal序列本身具有穿膜特性并表现出抗炎作用，而改构后的短肽Lys(D-Pro)ValCit在保留其穿膜特性的基础上，表现出的抗炎活性更强，见专利201010111921.7。在此基础上，我们进一步对该肽进行改构，发现改构后的六肽分子Lys Val Cit Lys Pro Val的抗炎作用更强，且仍然保留其穿膜特性。实验结果表明，该六肽不仅能够抑制炎性细胞炎症因子的分泌，还可有效拮抗酵母多糖A所致的小鼠足跖炎症反应。

发明内容

本发明的目的是提供以Lys(D-Pro)ValCit为母体的改构六肽，该改构六肽具有穿膜作用且具有更强的抗炎活性。

本发明的另一目的是提供此抗炎六肽的药物用途。

本发明的六肽，氨基酸序列如下：

Lys Val Cit Lys Pro Val。

本发明还包括本发明的多肽的制备方法，所述方法选自常规的固相合成方法、溶液中合成方法，基因重组方法或化学合成方法。

本发明所述药物用途是治疗炎性免疫相关疾病的药物用途。其中所述炎性相关疾病是脓毒症、脓毒性休克、(类)风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮等。

本发明还包括含有本发明的多肽的药物组合物。本发明的药物组合物，必要时可以含有药物可接受的载体。本发明的药物组合物，可以以任何形式的药物制剂形式存在。如适合口服的制剂或适合注射的制剂，优选是注射剂。最优选是冷冻干燥注射剂。

具有本发明氨基酸序列结构的多肽既可以以多肽形式单独存在，也可与其它蛋白和多肽融和，或被甲基化、乙酰化和氨基化等修饰，或进行个别氨基酸的突变或替代，或插入蛋白质表面的特定部位，如凸环区，或与其它物质连接。无论以什么形式存在，含此结构多肽的物质可能表现出抗炎活性。

含此氨基酸序列的物质可有各种应用方式，主要包括在体外和体内的抗炎活性，以各种给药方式实现以抗炎活性为目的的疾病治疗。

本发明的多肽比先前开发的几种多肽更加优越，具体表现为本发明的多肽序列较短，便于合成，且抗炎活性更强，有关实验的比较数据见实施例。

附图说明

图1为抗炎六肽对小鼠腹腔巨噬细胞肿瘤坏死因子-α分泌的影响。

图2为抗炎六肽对小鼠腹腔巨噬细胞白细胞介素6分泌的影响。

图3为酵母多糖A致小鼠足跖炎症及抗炎六肽治疗效果。

图4为抗炎六肽的穿膜实验结果。

具体实施方式

以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。

实施例1、Lys Val Cit Lys Pro Val制备方法的操作步骤

固相多肽合成的主要操作步骤如下：1、树脂溶涨：将Wang-Resin树脂放入反应管中，加DMF(15ml/g)，30min。2、脱保护：去掉DMF，加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，5min，去掉再加20％哌啶DMF溶液(15ml/g)，15min。3、检测：抽掉哌啶溶液，取十几粒树脂，用乙醇洗三次，加入茚三酮，KCN，苯酚溶液各一滴，105℃～110℃加热5min，变深蓝色为阳性反应。4、洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。5、缩合：加入保护氨基酸三倍过量，活化剂HBTU三倍过量，均用尽量少DMF溶解，加入反应管，立刻加入NMM十倍过量，反应30min。6、洗涤：DMF(10ml/g)一次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次。7、重复二至六操作依次连接氨基酸(从C端到N端顺序：Val、Pro、Lys、Cit、Val、Lys)，最后一次洗涤：DMF(10ml/g)两次，甲醇(10ml/g)两次，DMF(10ml/g)两次，DCM(10ml/g)两次。9、裂解：配制裂解液(10ml/g)——TFA 94.5％；水2.5％；EDT 2.5％；TIS 1％，120min。10、吹干洗涤：将裂解液用氮气尽量吹干，用乙醚洗六次，然后常温挥干。11、HPLC纯化：以水和乙腈做流动相，在流动相中加入0.1％的TFA，梯度从5％--85％，使用C18反相柱。

实施例2、抗炎六肽对小鼠腹腔巨噬细胞炎症因子分泌的影响

取20克左右雌性C57BL/6小鼠，常规灌洗出腹腔巨噬细胞，以1×10⁶个细胞/孔细胞量加入24孔培养板，分别加入内毒素(LPS)1μg/ml作用24小时，同时加入不同组别不同浓度的多肽，收集上清，以ELISA试剂盒测定炎症因子如肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素

水平。

结果表明，本发明的多肽(阳性肽1)可抑制腹腔巨噬细胞经内毒素刺激的炎症因子的分泌，且该抑制效应具有量效关系，该作用强度明显高于阳性肽2组(序列为Lys(D-Pro)ValCit)；而阴性肽则无明显作用。如图1、图2所示。

实施例3、酵母多糖A致小鼠足跖炎症及抗炎六肽治疗效果

取20克左右雌性C57BL/6小鼠，随机分为对照组、致炎组与不同治疗组，每组5只。以酵母多糖A(15mg/ml)注入致炎组、治疗组双后肢足跖部各50μl，对照组于相应部位注入等剂量的生理盐水。注射当天定为0天，于第2天对治疗组分别应用地塞米松注射液(750μmol/L)、多肽注射液(75μmol/L)一次，50μl/足，观察期内动态测定小鼠足跖容积。

结果表明，致炎组发生足跖炎症肿胀，本发明的多肽(阳性肽1)可有效减轻其炎症肿胀程度，其抗炎效果优于阳性肽2(序列为Lys(D-Pro)ValCit)和地塞米松；而阴性多肽则不具有这种治疗作用。如图3所示。

实施例4、抗炎六肽的穿膜实验

荧光素FITC标记的多肽序列(FITC-Lys Val Cit Lys Pro Val)由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度＞95％。1640培养基培养RAW 264.7细胞，以5×10⁵个细胞/孔细胞量加入至放有盖玻片的24孔培养板，加入FITC标记的多肽10μM分别作用0.5、1、2小时，之后取盖玻片在激光共聚焦显微镜下观察并照相。

结果显示，本发明的多肽在0.5小时即可穿膜进入细胞内，1、2小时经过多肽穿膜的细胞几乎达到100％。如图4所示经过多肽穿膜1小时的细胞。

Claims

1.一种抗炎六肽，结构如下：Lys Val Cit Lys Pro Val。

2.权利要求1的六肽在制备抗炎药物中的应用。

3.权利要求2的应用，所述抗炎是对抗炎性免疫相关的疾病。

4.权利要求3的应用，其中所述炎性免疫相关的疾病是风湿性关节炎、类风湿性关节炎、哮喘、急慢性肾小球性肾炎、系统性红斑狼疮。

5.含有权利要求1的六肽的药物组合物。

6.权利要求5的药物组合物，其中含有药物可接受的载体。

7.权利要求5的药物组合物，其以任何形式的药物制剂形式存在。

8.权利要求5的药物组合物，其是注射剂。

9.权利要求5的药物组合物，其是冷冻干燥注射剂。

10.权利要求1的多肽的制备方法，其特征在于，所述方法选自基因重组方法或化学合成方法。

11.如权利要求10所述的制备方法，其特征在于，所述化学合成方法为常规的固相合成方法或溶液中合成方法。