CN102648197A - 促进细胞凋亡和抑制转移的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种在肿瘤细胞中促进细胞凋亡的方法，通过施用有效量的粘附斑激酶(FAK)抑制剂具有抑制肿瘤生长，或抑制肿瘤转移，或促进肿瘤细胞凋亡，或其任何组合的效果。所述抑制剂是一种小分子有机化合物。因此，所述粘附斑激酶抑制剂能够用于治疗肿瘤例如恶性肿瘤。例如，在有关乳腺癌和卵巢癌的鼠类实验模型中施用FAK抑制剂PND-1186具有抑制肿瘤细胞之效果。

Description

促进细胞凋亡和抑制转移的方法

相关申请

本申请要求2009年8月12日提交而申请号为61/233,351的美国专利申请的优先权，该专利申请的内容通过参考引用在此全部并入本文。

政府资助

本发明得到了美国国家健康研究院(NIH)资助项目CA107623和CA102310以及美国陆军医学研究(US Army Medical Research)资助项目OC080051所提供的政府支持。美国政府对于本发明拥有一定的权利。

背景技术

细胞凋亡(Apoptosis)是一种细胞现象，其中细胞应答内部生化信号而经历程序性死亡。通常，细胞凋亡对于生物体来说是有利的，涉及发育和分化。人们认为，在某些情况下，细胞凋亡的失败会导致肿瘤增殖。肿瘤的增殖和转移对于带有肿瘤的生物体来说是负面的过程。肿瘤转移是导致癌症相关死亡的首要原因。

肿瘤细胞能够以锚地非依赖性(anchorage-independent)方式生长。这部分地是经由绕过整合素细胞表面受体控制的正常生长限制的生存信号来介导。

粘附斑激酶(Focal adhesion kinase，FAK)是一种细胞质的酪氨酸激酶，其被募集到整合素介导的基质附着位点，在此FAK的活性被认为涉及细胞存活、迁移和侵袭的控制。FAK与整合素结合并调节各种细胞的包括生长、存活和迁移。

FAK作为信号激酶并且还作为在肿瘤细胞内细胞粘附相关的支架，调整各种不同的细胞支架相关蛋白例如pl30Cas和桩蛋白的位点募集和磷酸化作用。参见Schlaepfer DD，Hauck CR，Sieg DJ.，Signaling through focal adhesionkinase，Prog Biophys MoI Biol 1999，71：435-78；Zouq NK，Keeble JA，LindsayJ，Valentijn AJ，Zhang L，Mills D，et al.，FAK engages multiple pathways tomaintain survival of fibroblasts and epithelia：differential roles for paxillin andpl30Cas，J Cell Sci 2009，122：357-67.在Y379位的增加FAK自磷酸化是FAK激活的一种标记。整合素介导的Y397FAK磷酸化作用能够促使Src家族酪氨酸激酶结合到FAK并且能够引起FAK介导的c-Src激活。参见Wu L，Bernard-Trifilo JA，Lim Y，Lim ST，Mitra SK，Uryu S，et al.，Distinct FAK-Srcactivation events promote alpha5betal and alpha4betal integrin-stimulatedneuroblastoma cell motility，Oncogene 2008，27：1439-48.由于FAK和c-Src两者都能够使其共同下游目标比如pl30Cas磷酸化，从而不甚清楚是否FAK和/或c-Src的抑制作用会对下游目标的磷酸化过程会产生不同的效果。参见Defilippi P，Di Stefano P，Cabodi S.pl30Cas：a versatile scaffold in signalingnetworks，Trends Cell Biol 2006，16：257-63.在鼠类4Tl乳腺癌细胞中，已经表明FAK促进侵袭和转移的细胞表型。参见Mitra SK，Lim ST，Chi A，SchlaepferDD，Intrinsic focal adhesion kinase activity controls orthotopic breast carcinomametastasis via the regulation of urokinase plasminogen activator expression in asyngeneic tumor model，Oncogene 2006，25：4429-40.在侵袭性的人类肿瘤中FAK表达增高(Mitra SK，Schlaepfer DD.，Integrin-regulated FAK-Srcsignaling in normal and cancer cells，Curr Opin Cell Biol 2006，18：516-23)，而且，FAK信号促进定向的细胞运动(Mitra SK，Hanson DA，Schlaepfer DD.，Focal adhesion kinase：in command and control of cell motility，Nat Rev MoICell Biol 2005，6：56-68；Tomar A，Schlaepfer DD.，Focal adhesion kinase：switching between GAPs and GEFs in the regulation of cell motility，Curr OpinCell Biol 2009，21：676-83).

针对FAK的ATP竞争性小分子抑制剂已由Novartis(TAE-226)和Pfizer(PF-573，228，PF-562，271)开发出来。此外，有些化合物(如Y15)被确认会阻挡主要FAK Tyr-397自磷酸化以及Src家族激酶结合到FAK的通路。参见，例如Shi Q，Hjelmeland AB，Keir ST，Song L，Wickman S，Jackson D，et al.，A novel low-molecular weight inhibitor of focal adhesion kinase，TAE226，inhibits glioma growth，MoI Carcinog 2007，46：488-96；Slack-Davis JK，MartinKH，Tilghman RW，Iwanicki M，Ung EJ，Autry C，et al.，Cellularcharacterization of a novel focal adhesion kinase inhibitor，J Biol Chem 2007，282：14845-52；Roberts WG，Ung E，Whalen P，Cooper B，Hulford C，Autry C，etal.，Antitumor activity and pharmacology of a selective focal adhesion kinaseinhibitor，PF-562，271，Cancer Res 2008，68：1935-44；and Golubovskaya VM，Nyberg C，Zheng M，Kweh F，Magis A，Ostrov D，et al.，A small moleculeinhibitor，1，2，4，5-benzenetetraamine tetrahydrochloride，targeting the y397 siteof focal adhesion kinase decreases tumor growth，J Med Chem 2008，51：7405-16.

FAK的各种抑制剂，包括PND-1186，已披露于PCT专利申请PCT/US2008/003205，其提交于2008年3月10日并且公布为WO2008/115369，该申请的内容通过参考引用全部并入本文。PND-1186的制备已描述于这份公布的专利申请。

发明内容

本发明旨在提供一种通过活体，比如在患者体内，促进细胞凋亡或抑制患者细胞转移，或者两者兼而有之，包括对有需要的患者施用有效剂量的粘附斑激酶的小分子抑制剂。例如，所述抑制剂可以是下式所示的化合物：

或任何其药学上可接受的盐。

附图说明

图1显示测定聚Glu∶Tyr(4∶1)的磷酸化作用的GST-FAK 411-686和His-tagged FAK 411-686(Millipore)的K-LISA(Calbiochem)活性图谱。经过杆状病毒表达、谷胱甘肽琼脂糖结合以及尺寸分离色谱分析之后，通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色(Coomassie Blue staining)(如图示)观察GST-FAK 411-686的纯度为＞90％。其中平均值±SD经由三重分析测试确定。

图2显示一系列针对表征蛋白经过免疫印迹的SDS-PAGE条带，表明PND-1186对于FAK、c-Src和pl30Cas酪氨酸磷酸化的效果。在Y379位增加的FAK的自磷酸化是FAK激活的一种标记。4Tl细胞以70％的汇合度被接种在覆盖着10μg/mL纤连蛋白的组织培养板中。细胞采用介质(DMSO)或(A)PND-1186或(B)Dasatinib(LC Labs Inc.)处理1小时。显示出总FAK、pl30Cas、Src或肌动蛋白在细胞裂解液中的浓度。针对FAK或Src活性(pY397 FAK或pY416 Src)以及pl30Cas酪氨酸磷酸化作用(pY249 pl30Cas)进行了磷特异性免疫印迹检测。(C)在经过1小时处理(PND-1186，1μM)接着用PBS洗涤后在4Tl细胞中FAK pY397磷酸化的时间进度。PBS洗涤后在标明的时间制备成蛋白裂解物。

图3显示：(A)在介质(DMSO)或1μM PND-1186存在的情况下，由伤痕检测(wound assay)在0、11和22h时点(标度为250μM)的延时系列显微图像；(B)由具有代表性的三重的实验所获取延时图像的定量结果；(C)在1μM PND-1186存在的条件下4小时之后，细胞在纤连蛋白涂抹的MilliCell transwells培养小室中，作为DMSO对照(±SD)百分比的运动性。

图4显示：(A)在介质存在以及指定PND-1186浓度历经72小时4Tl细胞在培养皿中的贴附和悬浮(非贴附)生长；(B)采用碘化丙啶染色的细胞贴附和悬浮生长的细胞周期分析，其中显示DNA的相对含量；(C)染色的SDS-PAGE条带，其显示出呈现胱天蛋白酶3(caspase 3)卵裂的附着或悬浮细胞的裂解物；(D)使用流式细胞仪测试标示PND-1186浓度下的附着与悬浮细胞确定的膜联蛋白V(annexin V)阳性细胞生长的图表。

图5显示：(A)在PND-1186的标示浓度下4Tl细胞球悬浮液的显微图像；(B)球状体尺寸在72h时点(n＝40)±SD的图示；(C)经免疫印迹的SDS-PAGE条带，其显示在指定蛋白质上标示浓度PND-1186的活性。

图6中，(A)和(D)是在PND-1186的标示浓度下软琼脂上4Tl细胞集落的显微图像；(B)、(C)和(E)是在PND-1186的标示浓度下分别显示集落数、集落大小和细胞凋亡百分率关系的图表。

图7显示：(A)在100mg/kg PND-1186以及对照组小鼠皮下植入mCherry4Tl肿瘤8天后的显微图像；(B)图形显示在标示量的PND-1186存在时小鼠中皮下植入肿瘤8天后的肿瘤重量；(C)平均荧光TUNEL染色强度与标示量PND-1186之间的定量关系；(D)在标示量PND-1186的情况下，经TUNEL染色的肿瘤具有代表性的显微图像；(E)荧光染色显微图像，其显示与对照例相比来自暴露于100mg/kg PND-1186的移植肿瘤的细胞中的裂解胱天蛋白酶3(cleaved caspase-3)。

图8显示：(A)和(B)分别显示在标明的PND-1186浓度条件下接种的卵巢癌肿瘤ID8细胞中细胞数和存活细胞数；(C)腹腔注射ID8细胞46天后C57BI6小鼠与对照例比较的图像，其中实验小鼠施用了经口不限量自由采食(ad libitum)的0.5mg/mL PND-1186(在5％糖溶液中)；(D)有关从注射了ID8的小鼠的腹膜腔采集的腹水相关细胞的图示；(E)与对照例相比，在经过0.5mg/mL PND-1186处理的小鼠中具有抗FAK以及随后的磷特异性抗FAK的免疫印迹SDS-PAGE条带；(F)显示小鼠腹水细胞中FAK磷酸化相对于总FAK之比率的图示；(G)与对照例相比，暴露于0.5mg/mL PND-1186的注射ID8后的小鼠腹膜组织的明视野和荧光显微图像；(H)显示上述注入ID8的小鼠的腹膜相关肿瘤定量数据的图示。

具体实施方式

在本说明书及所附的权利要求书中，单数形式用词“a(一)”、“an(一)”或“the(该，这个)”包括复数的指称，除非文中明确另有所指。

本文中，“个体(individual)”或“患者(patient)”(作为治疗对象)是指哺乳动物和非哺乳动物。哺乳动物包括，例如：人类；非人类灵长类动物，如猿和猴；和非灵长类动物，如狗、猫、牛、马、绵羊和山羊。非哺乳动物包括，例如，鱼和鸟类。

术语“有效量(effective amount)”，当用来描述对患有病症的个体进行治疗时，是指特定量的本发明化合物对于抑制或以其它方式作用于所述个体组织中与病症相关的FAK是有效的，其中所述抑制或其它的作用达到了足以产生有益治疗效果的程度。

“治疗或处理(Treating or treatment)”在本文中是指使疾患或病症相关的症状得以减轻，或者使这些症状的进一步发展或恶化受到抑制，或者对疾患或病症进行阻止或预防，或者使疾患或病症得以消除或痊愈。

本文中，本发明化合物的“有效量(effective amount)”或“治疗有效量(therapeutically effective amount)”是指全部或部分地减轻疾患或症状，或者阻止或减缓这些症状的进一步发展或恶化，或者对疾病或症状具有防止或预防作用的化合物的用量。尤其是，“治疗有效量”是指在一定剂量和时间条件下为达到期望治疗效果所必需的用量。“治疗有效量”也是本发明化合物用于治疗的有益作用与其毒害作用相比更为显著时的用量。

“细胞凋亡(Apoptosis)”在此作为术语是用来指一个细胞或一组细胞的程序化死亡，其中来自内源性或外源性信号的内部生化机制导致细胞的最终死亡。“促进(Promoting)”细胞凋亡是由于外源性信号，一种FAK抑制剂分子，引起本来可能会继续生存的细胞发生死亡，例如，在肿瘤中的情形(亦即，“促进肿瘤细胞凋亡(promoting tumor apoptosis)”是指在该过程中的作用对于肿瘤中的细胞比起正常细胞来说在一定程度上是有选择性的)。

“抑制肿瘤生长(Inhibiting tumor growth)”是指对肿瘤大小或重量的增长的作用，包括，使得相应于不存在有效量FAK抑制剂的情形下所能预期的增长现象受到阻抑。

“抑制肿瘤转移(Inhibiting tumor metastasis)”是指降低肿瘤细胞群体中细胞的转移或恶变的发生或速率，以及抑制由于癌细胞迁移在正常细胞中引发癌变状态。

“盐(salt)”，如本领域所熟知的，包括比如羧酸、磺酸或胺的离子形式的有机化合物，结合有反离子。例如，阴离子形式的酸可以和阳离子组成盐，而这些阳离子包括金属阳离子，比如钠和钾之类；氨盐，比如NH4+或各种胺类阳离子，包括像四甲基铵(tetramethylammonium)的四烷基季铵盐；或其它阳离子，比如三甲锍(trimethylsulfonium)之类。“药学上可接受的(pharmaceutically acceptable)”或“药理上可接受的(pharmacologicallyacceptable)”盐是由已被准许用于人的离子所形成的盐且通常是无毒的，例如氯盐或钠盐。“两性离子(zwitterion)”是一种内盐，比如可以在一个分子内形成，而这样的分子具有至少两个可电离基团，一个形成阴离子而另一个形成阳离子，彼此相互平衡。例如，氨基酸，比如甘氨酸，就可以以两性离子的形式存在。“两性离子”在本文含义内是一种盐。本发明的化合物可能为盐的形式。术语“盐(salts)”包涵作为本发明化合物的游离酸或游离碱的加成盐。所述盐可以是“药学上可接受的盐”。术语“药学上可接受的盐(pharmaceutically acceptable salts)”是指其毒性程度在能够提供作为药物实际用途范围之内的盐。尽管如此，药学上不可接受的盐可能具有比如高结晶度的性能，这对于本发明的实施是有实用性的，例如在本发明化合物的纯化或制备过程中是有用的。

合适的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或有机酸来制备。无机酸的实例包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。合适的有机酸可以选自：脂肪酸、脂环酸、芳香酸、芳脂酸、杂环酸、羧酸和磺酸类的有机酸，其实例包括甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、甘醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨茴酸、4-羟基苯甲酸、苯乙酸、扁桃酸、亚甲基双羟萘酸(帕莫酸)、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、泛酸、三氟甲磺酸、2-二羟基乙磺酸、对甲苯磺酸、氨基苯磺酸、环已基氨基磺酸、硬脂酸、海藻酸、β-羟基丁酸、水杨酸、粘酸和半乳糖醛酸。药学上不可接受的酸加成盐的实例包括高氯酸盐和四氟硼酸。

本发明提供了FAK的小分子抑制剂比如PND-1186的用途，以在体内促进细胞凋亡，或抑制患者体内的转移，或两者兼而有之。小分子的FAK抑制剂能够阻止FAK Tyr-397的活体磷酸化作用，并且能够呈现抗肿瘤的功效，比如通过诱导或促进肿瘤细胞凋亡来减少肿瘤大小以及防止肿瘤转移。

本发明提供了一种促进细胞凋亡，或抑制其在患者体内的转移，或两者兼有的方法，所述方法包括将有效量的粘附斑激酶抑制剂施用于对其有需求的患者。例如，所述抑制剂可以是下式所述的化合物：

或其药学上可接受的盐。各种药学上可接受的盐将在下文中描述。其他相关的FAK抑制剂在申请号为PCT/US2008/003205、提交于2008年3月10日、公开号为WO 2008/115369的PCT专利申请中披露，该专利申请的内容通过参考引用全部并入本文。

在各种实施方式中，促进细胞凋亡可以导致在肿瘤患者体内抑制肿瘤生长、抑制肿瘤转移或者促进肿瘤细胞凋亡，或者上述效果的任何组合。例如，所述肿瘤是恶性癌症。例如，所述肿瘤包括乳腺癌或卵巢癌。

在不同的实施方式中，所述抑制剂能够以包含药学上可接受的赋形剂的制剂施用于患者。各种药学上可接受的赋形剂将在下文中描述。

在各种实施方式中，所述抑制剂可以通过口服给药施用于患者；在其他实施方式中，所述抑制剂可以通过肠外给药施用于患者。包含所述抑制剂的、用于口服或肠外给药的不同制剂将在下文中描述。

不同的配药方案可被用来施用促进细胞凋亡的FAK抑制剂。例如，可以在一定的时间里以能够提供有益效果的持续时间和频率对患者多次地施用所述抑制剂。在各种实施方式中，根据受治患者的具体情况可以施用有效量的第二种药物。

在不同的实施方式中，本发明提供粘附激酶抑制剂用于制备促进细胞凋亡药物的用途，其中所述抑制剂包括下式所述的化合物：

或其药学上可接受的盐。在不同的实施方式中，促进细胞凋亡可以导致抑制肿瘤生长、或抑制肿瘤转移、或促进肿瘤的细胞凋亡，或以上效果的任何组合。在不同的实施方式中，所述药物可用于治疗包括恶性或非恶性肿瘤的病症。

本申请的发明人发现PND-1186在体内能够阻止FAK Tyr-397磷酸化并且在人和鼠科原位乳腺癌小鼠肿瘤模型中显示抗肿瘤功效。施用PND-1186(100mg/kg腹腔注射)能够持续12小时抑制(＞60％)肿瘤FAK Tyr-397磷酸化(在12h时点平均为血浆中15.1μM和肿瘤中10.4μg/g)。以每日两次口服150mg/kg的剂量施用PND-1186明显地抑制原位和同源的乳腺癌肿瘤的增长以及自发的肿瘤细胞向肺部的转移。令人惊讶的是，在其饮水中自由采食地加入0.5mg/ml PND-1186的小鼠(平均为血浆中1.0μM和肿瘤中0.52μg/g)显示出明显降低的肿瘤生长以及肿瘤FAK-pl30Cas磷酸化。虽然PND-1186对于培养中的细胞是无细胞毒性的，来自接受自由采食PND-1186的动物的肿瘤显现出在肿瘤核心部位的坏死区域，增加的TUNEL染色，以及降低的白细胞浸润。PND-1186的处理降低肿瘤相关的脾肿大以及由肿瘤坏死因子α所引起的白介素6细胞因子的表达，表明FAK抑制可以影响肿瘤。因此，PND-1186通过同时对肿瘤和基质细胞的作用，例如促进或诱导肿瘤细胞的凋亡，对于抑制肿瘤的生长和转移或恶化在临床上可以是有用的。参见：C.Walsh，et al.，Oral delivery of PND-1186 FAK inhibitor decreasestumor growth and spontaneous breast to lung metastasis in pre-clinical models，Cancer Biology & Therapy(2010)，9：10，778-790；I.Tanjoni，et al.，PND-1186FAK inhibitor selectively promotes tumor cell apoptosis in three-dimensionalenvironments，Cancer Biology & Therapy(2010)，9：10，764-777；上述文献在此通过参考引用全部并入本文。

PND-1186被发现，经过针对FAK Tyr-397的抗磷化特异性免疫印迹测定，在鼠类和人类乳腺癌细胞中具有～100nM的IC₅₀值。FAK抑制不改变培养的肿瘤细胞中的c-Src、pl30Cas或桩蛋白酪氨酸磷酸化。令人惊讶的是，抑制细胞生长和移动需要较高的浓度(＞5倍于IC₅₀之上)。尽管如此，当细胞在软琼脂中或在非粘附条件下以集落的方式生长时，100nM PND-1186抑制细胞的增殖和FAK-Cas磷酸化，并诱导细胞死亡。这样，添加到小鼠饮用水的低浓度的0.5mg/ml PND-1186就降低肿瘤负担，增加胱天蛋白酶3(caspase-3)裂解，并且增加肿瘤TUNEL染色。因此，FAK的活性在三维环境中对于促进肿瘤细胞存活起着意想不到的关键作用，从而，对FAK的抑制就会导致肿瘤细胞在这样的环境中死亡。

利用重组FAK斑激酶结构域作为在体外激酶试验中的谷胱甘肽-S-转移酶(GST)融合蛋白(见图1)，PND-1186抑制FAK的活性显示1.5nM的IC₅₀值。采用Millipore KinaseProfiler Service对PND-1186的选择性进行了评价。在重组蛋白激酶的筛选中，0.1μM PND-1186显示出对于FAK以及Flt3(FMS样酪氨酸激酶3)抑制的特异性。在更高的PND-1186浓度(1μM)，FAK和Flt3具有的活性微不足道，而其他的激酶，包括ACKl(activatedCdc42-associated tyrosine kinase 1)、Aurora-A、CDK2(cyclin-dependent kinase2)/cyclin A、insulin receptor(IR)、Lck(lymphocyte-specific protein tyrosinekinase)以及TrkA(tropomyosin-related kinase A)，受到高于50％的抑制作用。Flt3的表达在造血起源的细胞中被发现但是在本文所使用的4Tl、MDA-MB-231或ID8细胞中则检测不到。参见表1，如下。

表1：PND-1186的激酶图谱分析

(表中数值为活性百分数，高于50％的抑制量被突显标出)

在鼠类4Tl乳腺癌细胞中，FAK促进侵袭的和转移的细胞表型。提高加到4Tl细胞的PND-1186浓度(0.1至1.0μM)抑制FAK Tyr-397的磷酸化(pY397)，并在1小时内提高总FAK蛋白的水平(见图2A)。在人类MD-MB A-231乳腺癌细胞和鼠类ID8卵巢癌细胞中加入PND-1186也得到类似的结果。有关FAKpY397抑制的细胞IC₅₀通过密度计量分析测得为～0.1μM PND-1186而pY397FAK磷酸化的最大减少量是～80％(见图2A)。

PND-1186抑制FAK是可逆的，如冲刷试验显示，FAK pY397磷酸化可以在60分钟内完全恢复(图2C)。令人惊讶的是，PND-1186加到1μM并未影响c-Src活性，其决定于在附着4Tl细胞中磷特异性抗体对SrcTyr-416(pY416)或pl30Cas Tyr-249(pY249)磷酸化的反应性(图2A)。相对地，当达沙替尼(Dasatinib)(BMS-354825)被加到4Tl细胞(抑制Abelson鼠科白血病病毒致癌基因同源体1，Ab1和Src族激酶)，Src pY416和pl30Cas pY249都以剂量依赖的方式降低(图2B)。值得注意的是，达沙替尼并没有影响pY397 FAK的浓度(图2B)，而且当使用MD-MBA-231细胞或其它比如4-氨基-5-(4-甲苯基)-7-(t-丁基)吡唑并[3，4-d]嘧啶(通常称为PP1)的Src抑制剂时也得到类似的结果。综合来看，这些结果表明，PND-1186以可逆的方式有效地抑制FAK的磷酸化，而且Src pY416和pl30Cas pY249的磷酸化在附着4Tl细胞中是依赖于Src而不是FAK的活性。

就如DMSO(二甲基亚砜，对照)或1μM PND-1186存在条件下进行22小时的延时伤口愈合检测(time lapse wound healing assays)所表明的，PND-1186也能抑制4Tl细胞的迁移(图3A)。PND-1186阻止4Tl细胞运动，这是与突起形成的缺乏以及从集合单层的4Tl边缘细胞分离的次数不够频繁有关的。采用1μM PND-1186超过22小时并未发现4Tl细胞分离或死亡的证据，而且尤其是，在1.0μM PND-1186存在的条件下可观察到细胞分裂。针对几个伤口区超过22小时的定量实验表明，经DMSO处理的4Tl细胞呈现89％的伤口愈合，然而，经PND-1186处理的细胞只有40％的愈合(图3B)。

为了验证伤口分析结果，采用涂有纤连蛋白(fibronectin)和血清作为趋化刺激物的膜进行了Millicell小室运动性检测(Millicell chamber motilityassays)(图3C)。针对Millicell小室运动性检测添加PND-1186以剂量依赖的方式阻止4Tl细胞的运动，在0.4μM PND-1186添加4小时之情形具有～50至60％的最大抑制作用。重要的是，PND-1186并不影响4Tl细胞对纤连蛋白的粘附，而达沙替尼在亚微摩尔浓度会有影响。这些结果证实了FAK活性对于促进4Tl细胞运动性的重要性。

为了判断4Tl细胞的细胞增殖作用，增加浓度(0.1至1.0μM)的PND-1186被加入到粘附或悬浮(非粘附)4Tl细胞，而且在24、48和72h之后计算总的细胞数(图4A)。粘附的细胞中，在24或48h时点没有观察到差异。然而，在72h时点，经过1.0μM PND-1186处理的细胞数量减少，碘化丙啶(PI)染色结合流式细胞仪分析显示，与DMSO对照例相比，在细胞周期的S和G2/M相位有少量的累积(图4B)。在悬浮的4Tl细胞中，所有浓度的PND-1186均在48h时点降低细胞的数量，这种差异对于0.1μM PND-1186在72h时点与DMSO相比较是很显著的(p＜0.001)(图4A)。有趣的是，经过1.0μM PND-1186处理的在悬浮液中细胞的PI染色分析未显示细胞周期差异(图4B)。然而，存在亚二倍体(1N)的积累，经由PI染色测定，而这是其他类型细胞中细胞凋亡的一种标记。这些结果表明PND-1186对于细胞周期进程具有有限的作用，而对总细胞数量的作用可能与细胞死亡有关。

为了判断PND-1186是否引发悬浮4Tl细胞凋亡，对于经过PND-1186处理24小时的粘附和悬浮4Tl细胞的裂解物进行了免疫印迹分析(图4C)。PND-1186在0.1μM就足以在贴附和悬浮细胞中抑制FAK pY397的磷酸化。值得注意的是，裂解的胱天蛋白酶3在经过PND-1186处理的悬浮细胞中被检测出增高现象(最高为0.4μM)，但在经过PND-1186处理的粘附细胞中未被检测到(图4C)。胱天蛋白酶3的裂解与胱天蛋白酶3的活化有关，同时也是细胞凋亡的引发因素。作为对于在悬浮液中添加PND-1186之后4Tl细胞凋亡的独立验证，细胞在经过24小时处理之后采用流式细胞仪(flow cytometry)进行了有关膜联蛋白V结合(annexin V binding)检测(图4D)。在贴附条件下，只检测到低浓度的膜联蛋白V阳性细胞，并且当PND-1186添加到1.0μM也未见增加。相比之下，悬浮的4Tl对比细胞表现出增加的膜联蛋白V染色，而且当添加0.1至0.4μM PND-1186之后这进一步提高到50-60％膜联蛋白V阳性染色(图4D)。综合起来，在悬浮条件下添加低浓度的PND-1186后对4Tl细胞凋亡的引发作用，提示FAK的活性可能对于锚地非依赖(anchorage-independent)条件下细胞的生存是必需的。

由于PND-1186在悬浮细胞条件下选择性地促进4Tl细胞凋亡，对4Tl细胞以三维(3D)球状体进行了培养，并且添加增高浓度的PND-1186(0.1至1.0μM)经历72小时以判断球状体大小的影响(图5A和B)。在0.1μMPND-1186情况下，平均球状体大小有成～3倍的减少，而观察到的最大效果在于0.2μM PND-1186。迄今为止，就本申请人所知没有其他的FAK抑制剂显示在亚微摩尔浓度对生物响应的最大抑制。

为了判断PND-1186在4Tl细胞球状体中抑制FAK的特异性，进行了使用免疫印迹分析(图5C)。与粘附的4Tl细胞情形相比，在3D球状体条件下，FAK pY397磷酸化的总体浓度降低。粘附与3D球状体条件相比较，没有发现pl30Cas pY249或pl30Cas pY410磷酸化的差别(图5C，1和2道)。然而，0.1μM PND-1186有效地抑制在4Tl球状体细胞中FAK pY397、pl30Cas pY249和pl30Cas pY410的磷酸化(图5C，3道)。提高PND-1186的添加导致总FAK浓度的升高，而pl30Cas的表达以及持续的FAK抑制和pl30Cas酪氨酸的磷酸化并没有发生变化(图5C)。附着的、球状体的或PND-1186处理过球状体的4Tl细胞中SRC pY416或Src的表达水平没有变化(图5C)。重要的是，在4Tl球状体中通过PND-1186对pl30Cas磷酸化的抑制作用，不同于在4Tl细胞上作为二维(2D)单层缺少PND-1186时的效果。标的物比如pl30Cas的FAK磷酸化能够促进在3D条件下4Tl细胞的存活。

4Tl细胞在软琼脂中是以集落的方式生长，而添加PND-1186的影响被评估(图6)。经过10天，PND-1186的添加以剂量依赖的方式抑制了4Tl细胞的软琼脂集落的总数和大小(图6A-C)。在将PND-1186添加到在软琼脂中形成的4Tl细胞4天之后可以得到类似的效果(图7)。在0.2μMPND-1186的情形，4Tl软琼脂集落大小被抑制77％(图6C)，这相当于通过膜起泡和细胞收缩确定的增加4Tl细胞凋亡(＞50％)(图6D和E)。综合起来，我们的结果支持这样的假设：PND-1186不是作为普通细胞毒性药物发生作用，而是选择性地并且有效地干扰细胞在3D环境中的存活。

为了判断4Tl肿瘤生长对于施用PND-1186的敏感性，使mCherry荧光标记的4Tl细胞在BALB/c小鼠皮下生长(图7)。在允许初始肿瘤形成8天之后，每12小时(每日二次，b.i.d.)施用30mg/kg或100mg/kg的载体或PND-1186达5天，此后对mCherry 4Tl肿瘤进行原位观测再进行提取和秤重(图7A和B)。载体处理过的4Tl肿瘤荧光明亮、通常为多叶型并且对周围组织具有侵袭性，然而经100mg/kg PND-1186处理的小鼠的肿瘤包含阴暗而无荧光的中心、通常为圆形并且松散地贴附于皮下组织(图7A)。100mg/kg PND-1186的处理明显成2倍地降低最终4Tl肿瘤重量(n＝8，p＜0.05)，而30mg/kg PND-1186稍微降低最终肿瘤重量但与对照例相比没有明显的不同(n＝8，p＞0.05)。为了判断在100mg/kg PND-1186肿瘤的中心mCherry荧光的损失是否与细胞凋亡的增加有关，对中间切片进行了TUNEL(图7C和D)和抗裂胱天蛋白酶3(图7E)染色分析。与载体处理的对照例相比，施用30和100mg/kg的PND-1186都明显地增加肿瘤TUNEL染色(图7D)。由于增加的裂解胱天蛋白酶3染色也在经过PND-1186处理的老鼠的肿瘤中出现(图7E)，这些结果与本发明人进行的体外分析结果类似，表明PND-1186促进4Tl细胞在3D条件下的凋亡从而抑制体内肿瘤生长。

在卵巢癌肿瘤细胞的扩展过程中，细胞能够脱离原发肿瘤并且在腹膜腔内生长为多细胞球状体。PND-1186选择性地促进4Tl乳腺癌细胞在3D环境下的凋亡，从而针对PND-1186对于小鼠ID8卵巢癌细胞生长的作用进行了体外和体内的评估(图8)。在为球状体的悬浮细胞培养中，0.1、0.4和1.0μM的PND-1186在72h时点显著地抑制ID8细胞数(图8A)并且使得15天后存活细胞明显减少(图8B)。为了判断是否低浓度的PND-1186会影响ID8体内生长，dsRed荧光标记的ID8细胞被腹腔注入C57B16小鼠，11天后，小鼠被提供5％蔗糖(对照)或5％蔗糖中0.5mg/ml PND1186，以自由采食的方式代替饮水。在施用PND-1186的情况下，没有观察到不良反应，也没有体重降低现象。经过30天的处理后，饮水中有PND-1186的小鼠并没有出现腹部肿胀，而对照小鼠却有(图8C)。这对应于较低的腹水相关细胞数量(图8D)以及，与0.5％蔗糖对照组相比，施用5mg/mlPND-1186对FAK pY397有成＞2倍的抑制作用(图8E和8F)。除了抑制腹水相关ID8球状体生长，经PND-1186处理的小鼠在腹膜腔内肿瘤结节由体内dsRed荧光成像法检测呈现明显的减少(图8G和8H)。这些结果表明，低浓度PND-1186的施用抑制卵巢癌细胞在体外和体内条件的生长。对于PND-1186在三维环境中促进细胞凋亡的选择性影响意味着FAK活性在产生锚地非依赖性存活信号中的新的作用。

经口的PND-1186剂量给药提供了，在两种不同的、没有动物病态或死亡或减重的原位乳腺癌小鼠肿瘤模型(4Tl和MDA-MB-231)中明显的抗肿瘤和抗转移效果。PND-1186显著地降低具有同源4Tl肿瘤的小鼠内肿瘤相关的炎性细胞浸润和脾肿大，而这提示PND-1186能够降低肿瘤相关的炎症。

在Balb/c小鼠中，静脉内(i.v.)、腹腔内(i.p.)和经口(p.o.)给药后，测定了PND-1186的药物动力学(PK)(见表2如后)。PND-1186显示出具有在i.v.注射后终端半衰期(t_1/2)为1.72小时的多重指数衰减。腹腔内和经口的剂量给药之后，PND-1186被迅速吸收，具有终端半衰期(T1/2)2.15至2.65小时，生物利用率(％F)14.8至42.2％。PND-1186的生物利用率经腹腔给药比口服给药的相对要高一些，而PND-1186血浆浓度、最高浓度(C_max)以及在从零到无穷大(0-inf)的血浆浓度-时间曲线(AUC)之下的面积根据剂量呈线性增长。

表2：静脉(i.v.)、腹腔(i.p.)、口服(p.o.)和不限量自由采食(ad libitum) 给药后小鼠中的PND-1186药物动力学(PK)参数

所列药物动力学参数包括观测到最高血浆浓度(C_max)和腹腔或口服给药后达到最高浓度(T_max)的时间、在从零到无穷大的的血浆浓度对时间曲线下的面积AUC(0-inf)、分布容积(V_d)、总清除率(C1)、对数线性终端半衰期(t_1/2)和生物利用度(％F)。在WinNonlin Professional4.1(Pharsight Corp.，Mountain View，CA)中通过非房室分析法针对i.p.和p.o.采用模型200而针对i.v.采用模型201、进行了药学动力学分析。

为了判断PND-1186是否影响固体肿瘤中的FAK和pl30Cas，确认了皮下4Tl乳房癌肿瘤并且实施了载体(在PBS中50％PEG400)或PND-1186的单独静脉注射。对于100mg/kg PND-1186，最高血浆浓度(117μM)在30分钟内达到，肿瘤中最高PND-1186值(16.1μg/g)在1个小时内达到并维持长达12小时(在12h时点血浆浓度1.1μM)。100mg/kg PND-1186引起对肿瘤FAK Tyr-397磷酸化(pY397 FAK)达12小时的持续抑制(＞60％)并且3小时内明显地降低pl30Cas Tyr-410磷酸化(pY410Cas)。在对pl30Cas的pTyr-249使用磷特异性抗体时，可得到类似的结果。对于30mg/kgPND-1186，最高血浆浓度(35μM)在15分钟内达到，而肿瘤中最高PND-1186值(0.75μg/g)在1小时内实现。这足以抑制FAK pY397磷酸化3至6小时，此后PND-1186浓度在12小时内下降到0.04μg/g(血浆浓度为0.1μM)，在该时点肿瘤FAK pY397磷酸化并没有被明显的抑制。所述结果表明PND-1186以剂量依赖的方式在体内抑制肿瘤中的FAK和pl30Cas酪氨酸磷酸化，并且血浆浓度处在1μM或以上时是足以促进肿瘤相关的FAK抑制。

PND-1186在水中的口服给药生物利用率比腹腔给药时要低些(表2如上)。PND-1186的150mg/kg口服给药导致在4小时内最高血浆浓度达到～14μM并且使得血浆浓度在12小时内维持在3μM，而这种口服(p.o)每日两次(b.i.d.)的给药剂量通过采用原位植入mCherry荧光4Tl肿瘤细胞被用来测试抗肿瘤疗效。到第7天，与载体对照例相比，150mg/kg PND-1186明显地降低肿瘤体积。到第16天，150mg/kg PND-1186使得最终肿瘤体积成3倍地减小而最终肿瘤重量成3.1倍地降低，而对总体重没有任何影响。原发性乳腺脂肪垫4Tl肿瘤的分析结果显示由抗CD31染色测到较高数量的血管。先前涉及肺癌异种移植的研究显示在施用PF-562，271之后肿瘤微血管密度降低，然而，根据抗CD31染色的检测，在经过PND-1186处理的4Tl原位肿瘤中没有观察到明显的血管差异。为了判断可能的分子机理用来解释经PND-1186处理4Tl肿瘤的较小尺寸，对中间切片采用脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)进行了分析。施用PND-1186的小鼠，与载体处理的对照组相比，显示乳腺脂肪垫肿瘤中TUNEL染色成2.8倍的增加。因此，肿瘤细胞凋亡的增加可能是解释PND-1186抑制肿瘤生长的机理。

对4Tl肿瘤切片进行了CD45染色分析，在巨噬细胞和其他造血细胞上出现了共同的标记。在未经处理的以及经载体处理的小鼠中，4Tl原发肿瘤内有大量的CD45阳性细胞。经过150mg/kg PND-1186处理的小鼠呈现CD45肿瘤相关染色成2.8倍的降低，印证了经过PND-1186处理渗透到4Tl肿瘤中免疫细胞减少。

为了判断这是局部还是全身的反应，对经过载体在或PND-1186处理过的正常Balb/c小鼠或者带有肿瘤小鼠的脾脏大小进行了分析。经过载体处理小鼠的脾脏重量是经过PND-1186处理的小鼠的＞2倍。值得注意的是，PND-1186处理的小鼠的脾脏是健康的并且与未经处理的、不带肿瘤的小鼠的相比没有明显差别。脾脏肿大部分地是由于炎性细胞因子生成的增加，培养中的4Tl细胞由于肿瘤坏死因子α(TNFα)的添加而受到激发，而白细胞介素6(IL-6)是通过酶联免疫吸附检测(ELISA)的方法检测到的。TNFα触发4Tl IL-6成＞4倍的增加，而添加PND-1186(0.25至1.0μM)以剂量依赖的方式抑制IL-6的释放。PND-1186治疗的抗炎作用，可以用来限制4Tl肿瘤的扩展。

4Tl肿瘤被用来作为晚期乳腺癌扩展的模型。参见，如Heppner GH，Miller FR，Shekhar PM.，Nontransgenic models of breast cancer，Breast CancerRes 2000，2：331-4。植入乳房脂肪垫的4Tl细胞会侵渗(intravasate)进入血管循环并且在7至10天之内形成肺部转移。由于PND-1186抑制4Tl肿瘤的生长和相关炎症，在原位乳房脂肪垫注射和PND-1186(150mg/kg口服每日两次)治疗15天后，对mCherry荧光4Tl细胞的转移分布进行了测定。针对来自背侧和腹侧肺部图像的mCherry荧光直接图谱进行了量化处理，针对肺转移进行了计数，并且将分布程度划分为可忽略、中度或高度的组别。在载体对照的小鼠中，大多数带有中度和高度的肺转移(7/12)，然而在PND-1186小鼠中，大多数具有可忽略的肺转移(7/12)并且没有小鼠具有高度的肺转移情形。这些发现通过针对肺部切片的苏木精-伊红(Hematoxylin and Eosin，H&E)染色分析得到了证实，其中在对照组而不是PND-1186治疗的小鼠中显出可测的4Tl肺转移。因此，小分子的FAK抑制剂PND-1186可以中断乳腺癌自发转移的进程。

为了判断对肿瘤生长的影响，在mCherry-4Tl原位肿瘤植入48小时之后，开始对小鼠实施自由采食的PND-1186口服给药。第13天时，用卡尺测得肿瘤大小明显不同，而且在第22天时，PND-1186的施用成＞1.8倍地抑制了最终肿瘤重量且无毒性或减重现象。在对于原发4Tl肿瘤的免疫印迹分析中，自由采食PND-1186的给药足以抑制FAK pY397以及pl30CaspY410磷酸化。自由采食PND-1186的给药也能够抑制肿瘤中的pY 118桩蛋白磷酸化，但不能抑制pY416 Src、pY402 Pyk2、pS473 Akt或pT308 Akt的磷酸化。脾脏对比表明，经过自由采食PND-1186处理的小鼠的大小正常，而对照小鼠具有肿大的脾脏。接受5％蔗糖的对照小鼠呈现出中度到高度的肺部转移性负担(9/11)，而采用自由采食PND-1186的小鼠大多数只有可忽略到中度的肺转移负担(13/15)。因此，低浓度PND-1186的施用对于减缓4Tl肿瘤体内扩展是有效的。

为了将所述4Tl的研究结果推广到人类乳腺癌，将带有在K-Ras和B-Raf中激活突变的MDA-MB-231细胞植入NOD/严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠的乳房脂肪垫内。经过12天后，当肿瘤变得可触觉时，将0.5mg/ml PND-1186或对照的5％蔗糖以自由采食的方式提供为饮水。到实验第27天(施用PND-1186的第15天)，用卡尺测得对照肿瘤明显较大，而且在70天时，自由采食的PND-1186使得最终肿瘤重量成＞5倍的减少。低浓度的PND-1186治疗足以显著地降低在MDA-MB-231肿瘤中的FAKpY397磷酸化。为了判断对于自发MDA-MB-231转移的作用，对NOD/SCID小鼠的肺部进行了切片，H&E染色和微转移计算。对照组小鼠呈现可测得的转移，而PND-1186自由采食处理导致转移性的肺部病变的量成＞3.5倍降低。

由于PND-1186治疗能够降低原发肿瘤的大小进而影响肿瘤细胞转移的一些因素，通过mCherry荧光蛋白表达的MDA-MB-231细胞的尾静脉注射进行了实验性转移检测(experimental metastasis assays)。对小鼠预先施用了经口服的150mg/kg PND-1186或水(载体)，并且采用荧光成像对在1或6小时后肺部毛细管内肿瘤细胞的累聚或积存进行了定量处理。在1h和6h时点，PND-1186都明显地抑制肿瘤细胞在肺部的积聚。由于在实验性转移检测中PND-1186的血浆浓度有可能超过1μM，通过在有PND-1186的悬浮液中体外孵化细胞对MDA-MB-231细胞凋亡进行了分析。经过膜联蛋白V结合检测的确定以及流式细胞术的定量分析，浓度至10μM的PND-1186在6小时内并没有促进增加MDA-MB-231的凋亡。因此，经口服的PND-1186给药降低在体内的FAK酪氨酸磷酸化，这通过两种不同的原位乳腺癌模型导致强劲的抗肿瘤和抗转移作用。

本发明方法的相关药物组合物及其施用

本发明的实施方式在另一方面提供了本发明化合物的独自或与其他药物结合的组合物，用于针对人或其他患者施用小分子的FAK抑制剂。含有本发明化合物的组合物，可以由通常的方法制备，如Remington所述：TheScience and Practice of Pharmacy，19th Ed.，1995，或其后来的版本，其通过参考引用并入本文。这些组合物能够采用通常的剂型来施用，例如胶囊(capsules)、片剂(tablets)、气雾剂(aerosols)、溶液(solutions)、悬浮液(suspensions)或局部施用(topical applications)的形式。

典型的组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的例如载体或稀释剂的赋型剂。例如，活性化合物通常可以与载体混合，或者被载体稀释，或者被封装于载体，比如安瓿(ampoule)、胶囊(capsule)、包袋(sachet)、纸(paper)或其他容器。当活性化合物与载体混合，或当载体作为稀释剂时，所述载体可以是固体、半固体或液体的物质，以充当活性化合物的承载物、赋型剂或介质。所述活性化合物可以被吸附于容纳在比如包袋中的粒状固体载体。合适的载体例子包括水(water)、盐溶液(salt solutions)、酒精(alcohols)、聚乙二醇(polyethylene glycols)，聚羟乙氧基化的蓖麻油(polyhydroxyethoxylated castor oil)，花生油(peanut oil)，橄榄油(olive oil)，明胶(gelatin)，乳糖(lactose)，白土(terra alba)，蔗糖(sucrose)，糊精(dextrin)，碳酸镁(magnesium carbonate)，食糖(sugar)，环糊精(cyclodextrin)，淀粉醣(amylose)，硬脂酸镁(magnesium stearate)，滑石(talc)，明胶(gelatin)，琼脂(agar)，果胶(pectin)，金合欢胶(acacia)，硬脂酸(stearic acid)或纤维素的低烷基醚(lower alkyl ethers of cellulose)，硅酸(silicic acid)，脂肪酸(fatty acids)，脂肪酸胺(fatty acid amines)，脂肪酸单甘酯(fatty acid monoglycerides)和双甘酯(diglycerides)，季戊四醇脂肪酸酯(pentaerythritol fatty acid esters)，聚氧乙烯(polyoxyethylene)，羟甲基纤维素(hydroxymethylcellulose)和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone)。同样地，所述载体或稀释剂可包括本领域里已知的任何缓释材料，比如单硬脂酸甘油酯(glyceryl monostearate)或二硬脂酸甘油酯(glyceryl distearate)，单独地或与蜡相混合。

制剂(formulations)可以是采取与不会和活性化合物产生有害反应的助剂混合。这样的添加剂包括润湿剂、乳化剂和分散剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、保存剂、甜味剂或调味剂。需要的话，所述组合物也可以是无菌的。

给药途径(route of administration)可以是能够有效地将本发明的活性化合物输送到适当或需要的作用部位的任何途径，例如经过口(oral)、鼻(nasal)、肺部(pulmonary)、颊部(buccal)、皮下(subdermal)、皮内(intradermal)、透皮(transdermal)或肠胃外(parenteral)，比如，直肠(rectal)、储库剂(depot)、皮下(subcutaneous)、静脉内(intravenous)、尿道内(intraurethral)、肌肉内(intramuscular)、鼻内(intranasal)、眼的(ophthalmic)溶液或软膏，其中口服给药是优选的。

如果使用固体载体于口服给药，有关制剂可以是片剂(tabletted)，以粉末或球粒的形式置于硬胶囊(hard gelatin capsule)中，也可以是锭剂(troche)或含片(lozenge)的形式。如果使用液态载体，有关制剂可以是糖浆(syrup)、乳液(emulsion)、软胶囊(soft gelatin capsule)或无菌注射液(sterile injectable liquid)的形式，比如含水或无水的液态悬浮液或溶液。

注射剂型一般包括含水悬浮液或油悬浮液，其可以用适当的分散剂或润湿剂和悬浮剂来制备。注射剂型的可以是溶液相或是悬浮液，其是用溶剂或稀释剂来制备。合适的溶剂或载体包括无菌的水，林格液或等渗含水盐溶液。另外，无菌油可以作为溶剂或分散剂。优选地，所述油或脂肪酸是非挥发性的，包括天然或合成油、脂肪酸、甘油单酯、甘油双酯或甘油三酯。

用于注射，所述制剂也可以是能够与前述的合适溶液配制的粉剂。这样的例子包括，但不限于，冻结干燥、旋转干燥或喷雾干燥的粉末(powders)，非晶粉(amorphous powders)，粒料(granules)，沉淀(precipitates)或微粒(particulates)。用于注射，所述制剂能够可选地含有稳定剂、pH调整剂、表面活性剂、生物利用度调整剂，以及上述这些的组合。所述化合物可以制备通过注射肠胃外给药，比如大剂量注射(bolus injection)或连续输液(continuous infusion)。用作注射的单位剂型可以在安瓿或多剂量容器内。

本发明的制剂可以设计为在对患者给药后采用本领域已知的操作程序提供活性成分的快速、持续、或延迟释放。因此，所述制剂也可以配制用于控释或缓释。

本发明所设计的组合物可以包括，例如胶束或脂质体，或其他包囊的形式，或者可以通过延缓释放的方式给药以提供延期存储和/或输送的效果。因此，所述制剂可以压缩成球丸或柱状体并且作为储库剂(depot)注射而植入肌内或皮下。这种植入物可以采用已知的惰性材料例如硅酮和可生物降解的聚合物，如聚交酯-聚乙二醇(polylactide-polyglycolide)。其他可生物降解的聚合物的例子包括聚原酸酯(poly(orthoesters))和聚烯酐(poly(anhydrides))。

用于鼻腔给药，制剂可以含有本发明的化合物，其溶解或悬浮于液态的载体，优选为含水载体，作为气溶胶使用。所述载体可以包含比如增溶剂的添加物，例如，丙烯甘醇、表面活性剂、如卵磷脂(磷脂酰胆碱)或环糊精的吸收促进剂，或如苯甲酸酯类的防腐剂。

对于肠胃外施用，特别适合的是注射用溶液或悬浮液，优选为含有溶解在聚羟基化的蓖麻油中的活性化合物的水溶液。

片剂、糖衣丸或胶囊，其中含有滑石粉和/或碳水化合物载体或粘合剂或类似物，尤其适用于口服给药。用于片剂、糖衣丸或胶囊的优选载体包括乳糖、玉米淀粉和/或土豆淀粉。糖浆(syrup)或酏剂(elixir)可以用于允许使用加糖载体的场合。

能够通过常规压片技术制备的片剂可以包含：

*酰化甘油单酯用作表层膜衣的增塑剂。

本发明的化合物在较大剂量范围内是有效的。例如，在成人的治疗中，可取的每天剂量为约0.05至约5000mg，优选为约1至约2000mg，更优选为约2至约2000mg。典型的剂量是是约10mg至1000mg每天。在为患者选择用药方案时，常常有必要开始时采用较高的剂量，在病情状得到控制的情况下再减少剂量。精确的剂量取决于化合物的活性、给药方式、治疗需求、用药剂型、治疗对象及其体重以及主管医生或兽医的偏好和经验。

一般来说，本发明的化合物是按单位剂型进行配制，包含从约0.05mg到约1000mg的活性成分加上与每单位剂量相应的药学上可接受的载体。

通常情况下，适用于经过口、鼻、肺或皮肤给药的剂型包含约125μg至约1250mg，优选地约250μg至约500mg，更优选地约2.5mg至约250mg的所述化合物，并混合有药学上可接受的载体或稀释剂。

所述剂型可以施用为每天一次，或每天一次以上，比如每日两次或三次。另外，如果处方医师认为合适，所述剂型可以施用为少于每天一次，比如隔日一次或每周一次。

实施例

化合物：PND-1186的合成以及作为HCl盐的应用被描述于2008年3月10提交、申请号为PCT/US2008/003205、公布号为WO 2008/115369的PCT专利申请文件中。针对体内检测，PND-1186是溶解于水(溶解度＝22mg/ml)。

杆状病毒FAK催化域和体外激酶检测：FAK催化域(FAK catalyticdomain region)(411-686)是用引物5′-cgatcgaattctcgaccagggattatgagattca-3′5′-tagctgtcgacttactgcaccttctcctcctccagg-3′通过聚合酶链反应生成，克隆到与GST融合的pGEX4T，并且移入pAcG2T杆状病毒表达载体(Pharmingen，Baculogold)。病毒的复制体是通过空斑检测(plaque assays)识别并放大的。对于蛋白质表达，SF9细胞于2-5pfu/cell(空斑形成单位/细胞)的感染复数(multiplicity of infection)被转导并且在27℃培养48小时。通过谷胱甘肽琼脂糖亲和色谱(Glutathione agarose affinity chromatography)纯化GST-FAK(411-686)，接着使用hiload 16/60 Superdex色谱(GE Healthcare)进行大小分级。蛋白质被浓缩并冷冻储藏于50mM Tris pH 8.0，150mMNaCl，1mM原钒酸钠，0.5mM EDTA，0.5mM EGTA，0.1％β-巯基乙醇以及20％甘油中。纯度由SDS-PAGE估算为＞90％。对GST-FAK体外激酶的活性进行了测定，并与采用K-LISA筛查试剂盒(Calbiochem)和聚(Glu∶Tyr)(4∶1)共聚物(P0275，Sigma)作为固定于微滴板的底物而与His标记的FAK411-686(Millipore)进行比较。IC₅₀值是通过不同浓度的被测化合物在含有50μM ATP和10mM MnCl₂，50mM HEPES(pH 7.5)，25mM NaCl，0.01％BSA以及0.1mM原钒酸钠的缓冲剂中在室温下5分钟来测定的。对于按1/2-Log浓度(起始于1μM)系列稀释的化合物进行了三重测定。底物磷酸化作用是采用辣根过氧物酶(horseradish peroxidase)标记的抗pTyr抗体(PY20，Santa Cruz Biotechnology)通过分光色差定量方法(spetrophotometic color quantitation)进行测定的。IC₅₀值是采用Hill-Slope模型来确定的。激酶选择性的资料是通过KinaseProfiler service(Millipore)来提供的。

试剂和细胞：对β-肌动蛋白的抗体(AC-17)来自Sigma-Aldrich。对Src(Src-2)和Akt的抗体来自Santa Cruz Biotechnology。对FAK(4.47)的抗体来自Millipore。对pY249 pl30Cas，pY410 pl30Cas，pY416 Src和抗裂解胱天蛋白酶3的位点及磷特异性抗体来自Cell Signaling Technology。抗pY397 FAK和TOPRO-3来自Invitrogen。抗GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)来自Chemicon，牛血纤连蛋白(bovine plasma fibronectin)是来自Sigma，而达沙替尼(Dasatinib)和PPl分别来自LC Laboratories和Calbiochem。4Tl鼠类乳腺癌细胞和MDA-MB-231人类乳腺癌细胞来自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。ID8鼠科卵巢癌细胞来自KatherineRoby(Roby KF，Taylor CC，Sweetwood JP，Cheng Y，Pace JL，Tawfik O，et al.Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.Carcinogenesis 2000；21：585-91)。细胞是培养在Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Dulbecco′s modified Eagle′s medium)中并辅以10％小牛血清(FBS)、1mM非必需氨基酸、2mM谷氨酰胺、100U/mL青霉素以及100μg/mL链霉素。在体外实验中，PND-1186是溶解在二甲基亚砜(DMSO)中并存储在-80℃下直到使用。DMSO的最终实验浓度在0.1％至0.2％之间。红色荧光mCherry蛋白或dsRed蛋白(Clontech)的编码序列分别亚克隆到慢病毒表达载体(pCDH-MSCl，System Biociences)，而且重组慢病毒被制备，有关制备的描述见Mitra SK，Lim ST，Chi A，Schlaepfer DD，Intrinsicfocal adhesion kinase activity controls orthotopic breast carcinoma metastasisvia the regulation of urokinase plasminogen activator expression in a syngeneictumor model，Oncogene 2006；25：4429-40。转导的4Tl或ID8细胞通过荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting)(FACS Aria，Becton-Dickinson)来富集以获得细胞的稳定种群。高度转移性mCherry 4Tl细胞的选择是通过来自肺部转移的细胞的分离和扩展来操作的。

mCherry-4Tl细胞被收获并注射到8-10周雌性BALB/c小鼠的T4乳腺脂肪垫中。4周后，肺被移除，通过弹性蛋白酶和胶原酶处理而解离成单细胞，然后用60μM 6-硫鸟嘌呤(Sigma)培养2周以用来选择4Tl细胞。mCherry-4Tl细胞(4Tl-L)的群体通过荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cellsorting，FACS)获得，用环丙沙星(10μg/ml)处理，通过聚合酶链反应(Stratagene)验证为支原体阴性，并且在乳腺脂肪垫注射后10天之内重新验证以形成自发性肺肿瘤转移集落。

锚地依赖性(Anchorage-dependent)、球状体及软琼脂细胞生长检测：细胞(2×10⁵)在生长培养基中、粘附(组织培养处理的)和非粘附(聚-HEMA涂层的)条件下，在6孔培养板(Costar)中接种于每个35mm培养孔。在24和168小时之间，将所有的细胞收集起来，通过限制的胰蛋白酶-EDTA处理(trypsin-EDTA treatment)制备单份细胞悬浮液，并通过台盼蓝染色和计数(trypan blue staining and counting)(ViCeIl XR，Beckman)来计算存活细胞。为了测定球状体的面积，使用Olympus 1X51显微镜对细胞在相位反衬72小时后进行成像。使用Image J软件(version 1.43)计算面积。关于软琼脂检测，在48孔培养板涂覆有以1∶4混合的2％琼脂(EM Science)于0.2ml培养基(底层)。5×10⁴细胞按每孔(一式三份)接种于0.3％琼脂在0.2ml生长培养基(顶层)的混合物中。琼脂凝固后，加入含有DMSO或PND-1186(最终浓度为0.6ml)的0.2ml培养基。在分别的实验中，4天后加入PND-1186。10天后，将集落进行相位反衬成像，通过计算9视野(3视野每孔)来计数，并且使用Image J软件来确定总面积。对于所有分析而言，实验点是按一式三份进行的，且重复至少两次。

免疫印迹(Immunoblotting)：细胞的蛋白提取物是通过使用含有1％Triton X-100、1％脱氧胆酸钠和0.1％SDS的细胞裂解缓冲液来制备，并且采用4-12％SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gelelectrophoresis，十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳)和顺序免疫印迹法来进行分离，其有关操作描述就如Mitra SK，Lim ST，Chi A，Schlaepfer DD，Intrinsic focal adhesion kinase activity controls orthotopic breast carcinomametastasis via the regulation of urokinase plasminogen activator expression in asyngeneic tumor model，Oncogene 2006；25：4429-40。相对表达水平以及磷特异性抗体反应性是通过印迹的密度分析法并利用Image J(version 1.42q)来测定的。通过计算pY397 FAK蛋白相对总FAK之比来量化FAK和pl30Cas酪氨酸磷酸化的抑制。使用pY410 pl30Cas与总pl30Cas印迹数据针对pl30Cas进行了类似的分析。

免疫组织化学：为了检测细胞凋亡，切面(7μm)是采用末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记法(TUNEL)试剂盒(Roche)来分析的。对于CD45染色，切面(7μm)在4％多聚甲醛中固定，用PBS漂洗，并且使用含有5％BSA、1％山羊血清和0.1％Triton X的PBS溶液冻结。FITC标记抗CD45抗体(Invitrogen)在1μg/ml 5％BSA及PBS中培养2小时。FITC标记IgG2b同型抗体(Invitrogen)在相同浓度下被用来作为阴性对照组。细胞核通过Heochst33342(Invitrogen)的1∶25,000稀释进行培养而观测。使用配有单色电荷耦合相机(ORCA ER；Hamamatsu)、倒置显微镜(IX51；Olympus)以及Slidebook软件(v5.0，Intelligent Imaging)在40X(UPLFL物镜，1.3NA；Olympus)顺序地扑捉图像。图像通过使用Photoshop CS3(Adobe)进行虚拟着色、叠加和拼合。荧光的定量是通过使用Image J(vl.43)来进行。

细胞迁移检测：血清刺激的趋化性使用Millicell(12mm直径8μm孔隙；Millipore)小室的操作如先前所述49。膜的两侧均涂有纤连蛋白(10μg/ml)，且趋化性是通过向较低的小室添加10％FBS来进行刺激的。数据点代表来自至少两个独立实验的三个迁移小室的细胞(9视野)计数。对于划伤愈合运动性检测(scratch-wound closure motility assays)，细胞被接种到纤连蛋白涂覆(10μg/ml)的玻璃底12孔培养板(MatTek)并且血清饥饿处理(0.5％FBS)16小时。细胞由吸液管尖端划痕，用磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate buffered saline，PBS)清洗，且重新注满含有或者不含有FAK抑制剂(1μM)的10％FBS培养基。延时系列其是在37℃带湿气及CO₂调节的条件下使用10X物镜于自动模式(Olympus 1X81)通过每隔10分钟直到22小时进行图像捕获而得到的。细胞的迁移轨迹和距离是通过使用Image J跟踪原子核随时间的位置来测量的。

细胞生长和凋亡检测：对于细胞生长分析，粘附的或悬浮的细胞经过在指定的时间段用PND-1186处理，通过限制的胰蛋白酶处理来收集为单份的细胞悬浮液，用70％的乙醇固定，用离心法收集，并且用PBS洗涤。细胞颗粒被重悬浮于含有碘化丙啶(PI)(10μg/ml)、无DNase的RNAse(100μg/ml，Qiagen)的300μL PBS中，然后在37℃培养并搅拌1小时。试样是用流式细胞仪(FACSCalibur，Becton-Dickinson)来分析的，而细胞周期分析是利用ModFit LT3.2软件(Verity software House)进行的。作为衡量细胞凋亡程度的亚二倍体DNA含量是通过文献中²⁹所述的PI染色来测定。对于细胞凋亡分析，粘附的或悬浮的细胞是用PND-1186处理并按前述的方法收集，由藻红蛋白(PE)标记的膜联蛋白V结合和7-氨基-放线菌素(7-AAD)反应性(BD Pharmingen)进行染色，并在1小时内用流式细胞仪分析。基于细胞自体荧光(负)十字孢碱处理(正)的控制设置了象限门(quadrant gates)。细胞凋亡是按照膜联蛋白V阳性细胞的百分比进行计算。在软琼脂检测中，细胞凋亡是通过对至少200个细胞的视测来进行量化的，并被确定为膜起泡或细胞收缩。细胞凋亡还可以通过免疫印迹用裂解胱天蛋白酶3抗体在在蛋白质裂解物中中反应性的表现来检测。

IL-6ELISA：两百万4Tl细胞被接种并且在10％FBS中扩散4小时，此后，加入DMSO(对照)或指定浓度的PND-1186。1小时后，重组肿瘤坏死因子-α(TNFg eBioScience)被加入(10ng/ml)，并且在24小时之后，调节过的培养基中的IL-6水平通过使用抗鼠IL-6ELISA试剂盒(eBioScience)测定。

肿瘤中细胞凋亡的检测：将新鲜肿瘤组织在最佳切削温度(OptimalCutting Temperature，OCT)复合物(TissueTEK)中迅速冷冻，用冷冻切片机(Leica 3050S)切成薄片(7μM)，并置于载玻片上。切片用3％的多聚甲醛进行固定，在含有0.1％Triton的PBS中渗透3分钟，并用PBS中的8％山羊血清在室温下阻断60分钟。对于活化的胱天蛋白酶3的测定，切片用胱天蛋白酶3抗体(1∶200稀释于PBS中的2％山羊血清)在4℃培育18小时，用PBS冲洗，并用异硫氰酸荧光素标记的抗兔和TOPRO-3(蓝)进行培育以用于DNA检测。切片在具有1.4NA 60X油物镜、采用30μm针孔设置的Nikon Eclipse Cl共聚焦显微镜下成像，并使用EZ-Cl 3.50软件(Nikon)进行分析。肿瘤细胞凋亡也是通过末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记(TUNEL)染色法，用四甲基若丹明(tetramethylrhodamine，TMR)试剂盒按照制造商的说明(Roche)来测量的。整个肿瘤切片的明视野和荧光图像是通过使用配有INFINITY1-3C：彩色数码相机和4X物镜的Zeiss M2-Bio Stereo显微镜获得的。

小鼠肿瘤的研究：六至八周大的雌性C57B16和BALB/c小鼠取自Harlan Laboratories(Indianapolis，IN)，并且按照国际实验动物护理评估与认证协会(the Association for the Assessment and Accreditation for LaboratoryAnimal Care，International)的指南安置于无病菌的环境。所有体内研究是根据经核准的机构实验动物护理与使用规程(institutional experimental animalcare and use protocol)来进行的。生长的肿瘤细胞通过限制的胰酶消化法来收获，用PBS洗涤，并在注射前使用ViCeIl XR(Beckman)计数。细胞活性通过台盼蓝排斥实验(trypan blue exclusion)测量为＞95％。对于皮下肿瘤生长，将1×10⁶mCherry标记的在100μLPBS中的4Tl细胞注射到Balb/C小鼠的后肋部。8天之后，将相同体积肿瘤(使用游标卡尺测量并以长度×宽度2/2来确定)的小鼠进行分组(n＝8每组)，并且将溶解在聚乙二醇400(PEG400)于PBS(1∶1)的PND-1186以每12小时30mg/kg或100mg/kg的剂量在颈部进行皮下注射(100μl)。对照组动物接受PEG400：PBS注射，并且在第13天，使用Olympus OV100活体荧光分子成像系统(IntravitalFluorescence Molecular Imaging System)对肿瘤进行原位成像，肿瘤被切除并称重，一半冷冻于OCT，且一半溶解于蛋白裂解缓冲剂中以进行FAK磷酸化分析。对于ID8卵巢癌肿瘤的生长，在PBS中的0.8mL 1×10⁷ID8细胞被经腹腔注射到C57B16小鼠。经过11天后，0.5mg/mL PND-1186溶于5％蔗糖水中以供饮用，而对照组接受5％蔗糖(n＝8每组)。继续实施不限量自由采食30天，之后，小鼠被实施安乐死，收集腹水，通过离心分离(2000rpm达5分钟)获得细胞，用吸量管测量细胞体积，然后将细胞溶解于蛋白质裂解缓冲液以进行免疫印迹分析。

PND-1186的药物动力学(PK)评价：关于静脉注射(i.v.)，对小鼠给予载体即在10％DMSO、10％Tween 80和80％水中的2mg/kg PND-1186。关于腹腔内注射(i.p.)，小鼠被给予50％PEG400的PBS中的30或100mg/kgPND-1186。关于口服(p.o.)给药，小鼠被给予水中的100mg/kg PND-1186。血样是通过末端心脏穿刺进行采集，其中，针对口服给药，是在0.5，1，2，4，8，12，24和48h的时点进行，而针对腹腔注射和静脉注射，是在0.083，0.25，0.5，1，2，4，8，12，24和48h的时点进行。每个时点使用3只小鼠。关于自由采食给药，血样是使用每组5只小鼠在7天之后采集的。样品被采集于装有0.05ml 0.5M EDTA的试管中，在室温下以900xg离心15分钟，然后血浆被收集。PND-1186的含量是通过高效液相色谱(HPLC)和质谱分析来测定的(补充方法)。

PND-1186的药效学(PD)评价：4Tl细胞被注入到Balb/c小鼠的侧腹并让其长成肿瘤(300-400mm³)达10天。载体(50％PEG400于PBS)，30或10mg/kg PND-1186是经腹腔注射到小鼠，而小鼠在1、3、6和12h时点被处死。每组使用5只小鼠。肿瘤被切除并使用Pro200组织均化器(ProScientific)在含有1％Triton-X 100、50mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、10％甘油(glycerol)、1.5mM MgCl₂、1mM EGTA、10mM焦磷酸钠(sodiumpyrophosphate)、100mM NaF、1mM原钒酸钠(sodium orthovanadate)、10μg/ml亮肽素(leupeptin)、10μg/ml抑肽酶(aprotinin)的细胞裂解缓冲剂中被均质化。裂解液中的蛋白质浓度使用二辛可酸试剂盒(bicinchoninicacid kit)(Thermo)来测定。同等的蛋白裂解物采用SDS-PAGE来分解并通过免疫印迹法进行分析。

凋亡检测：悬浮的细胞经过PND-1186处理，采集，用荧光素标记的膜联蛋白V结合染色(30分钟)，并在1小时内使用流式细胞仪进行分析。基于在细胞自体荧光(负)十字孢碱处理(正)的控制设置了象限门(quadrantgates)。细胞凋亡被计算成膜联蛋白V阳性细胞的百分比。

原位乳腺癌模型：将10μL PBS中的一百万个4Tl或MDA-MB-231细胞通过Hamilton注射器注射到8-10周大小鼠的T4乳腺脂肪垫中。当肿瘤可被触觉时(对于4Tl为24-48小时，而对于MDA-MB-231为12天之后)开始进行PND-1186治疗(经口灌喂或自由采食)。肿瘤每3-4天用数码游标卡尺测量，而肿瘤体积(mm³)则通过公式计算：V＝axb²/2(a＝长度，mm；b＝宽度，mm)。体重每周测量以评估毒性。肺、脾和原发肿瘤经手术切除并称重。肿瘤切片在蛋白裂解缓冲剂中进行均质化处理以用于免疫印迹检测或者置于最佳切削温度(OCT)复合物(Tissue TEK)，在液氮中冷冻，利用低温恒温器(Leica 3050S)切成薄片(7μM)，并被放置于载玻片上。

为了进行4Tl肿瘤转移分析，将肺在PBS中漂洗，使用OVl00小动物成像系统(Small Animal Imaging System)(Olympus)获取背部和腹部的荧光图像。对于所有图像，设定mCherry荧光的共同阈值，并通过使用ImageJ软件确定每个肺中微小肿瘤的平均像素密度从而计算肺转移性负载。对转移性肿瘤负载(转移性损害的数量或平均像素体积)进行确定，并根据分布数据进行分组(可忽略的、中度的、高度的)。在成像之后，肺被固定于鲍音液(Bouin’s solution)(Sigma)，用石蜡包埋，切片，利用苏木精-伊红(H&E)染色进行组织学评价。图像的获取是利用具有微分干涉差配置的Olympus 1X81倒置显微镜以及使用Slidebook(v5.0)软件的OlympusDP71数码彩色相机。为了进行MDA-MB-231肿瘤转移研究，将1∶1的OCT无菌水溶液通过25号针头经气管注射使肺部膨胀。将肺切除，包埋入OCT，并在液氮中冷冻。每叶肺肿瘤转移的均数通过对在H&E的切片(n＝ll叶对于蔗糖和n＝13叶对于PND-1186)的肺病变进行计数而确定。

实验性转移检测：在静脉注射(经尾静脉)稳定表达mCherry荧光蛋白的0.5百万(在100μl PBS中)MDA-MB-231细胞之前的14和2h的时点，对十二周大的裸鼠进行给药口服150mg/kg PND-1186或水(载体)。为了确定实验的肿瘤转移负载，肺在细胞注射后1和6小时被移除，在PBS中漂洗，并使用OVl00成像系统获取背加腹荧光图像。对于所有图像设定mCherry荧光的共同阈值，且通过Image J计算总荧光肺面积。

统计方法：组别之间的显著差异是通过使用单向方差分析(one-wayANOVA)的杜奇事后检测(Tukey post hoc)方法来测定的。配对数据之间的差异是通过使用未配对双尾的学生t检验(student′s t-test)或双尾的曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)来测定的。转移例之间的差异是采用双尾的费希尔确切检验(Fisher′s exact test)来测定的。所有统计分析采用了GraphPad Prism软件(version5.0b，GraphPad Software，San Diego，CA)。p值＜0.05被认为是显著的。

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针对本发明，为了本领域技术人员能够实施和使用，本文进行了相当细致的描述和举例，然而，各种替代、修改和改进方案对于本领域技术人员来说显然并不脱离本发明权利要求的主旨和范围。

本文中所提及的所有专利和出版物在此作为参考被引用纳入，其程度就如同各自的出版物被专门或个别地注明，被全文纳入本文。

本文中所采用的术语和表达是作为描述性而不是限制性的，并且这些术语和表达的使用并无意排除任何与之表明和描述的特征或其部分相等同特征，从而应当认识到，在本发明的权利要求范围之内各种不同的修改是可能的。因此，应理解为，虽然本发明已经具体地披露了优选的实施例和可选择的特征，但对本领域技术人员而言，依据本文所披露的概念可能采用各种修改和变化，其均被视为落在本发明所附权利要求的范围之内。

Claims (11)

1.一种促进患者肿瘤中细胞凋亡或抑制患者体内肿瘤转移或两者兼有的方法，其包括将有效量的粘附斑激酶(Focal Adhesion Kinase)抑制剂施用于有需要的患者，其中所述抑制剂是下式所述的化合物：

或其药学上可接受的盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述促进细胞凋亡对于肿瘤患者导致抑制肿瘤生长，抑制肿瘤转移或促进肿瘤细胞凋亡，或其任何组合。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤是恶性肿瘤。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述肿瘤包括乳腺癌或卵巢癌。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是以包含药学上可接受的赋形剂的制剂施用于所述患者。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是通过口服给药施用于所述患者。

7.根据权利要求1所述的方法，其中所述抑制剂是通过肠外给药施用于所述患者。

8.根据权利要求1所述的方法，其包括在一定的时间里以能够提供有益效果的持续时间和频率对所述患者多次地施用所述抑制剂。

9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括将有效量的第二药物施用于患者。

10.一种粘附斑激酶(Focal Adhesion Kinase)抑制剂用于制备药物的用途，其中所述药物用来促进肿瘤细胞中的细胞凋亡，或抑制患者体内的肿瘤转移，或两者兼而有之，其中所述抑制剂包括如下式所述的化合物：

或其药学上可接受的盐。

11.根据权利要求10所述的用途，其中所述促进细胞凋亡导致抑制肿瘤生长，或抑制肿瘤转移，或促进肿瘤细胞凋亡，或其任何组合。

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