KR20110132446A - 키나아제 단백질 결합 억제제 - Google Patents

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스티븐 엔. 호치왈드
데이비드 에이. 오스트로브
윌리암 지. 캔스
엘레나 쿠레노바
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유니버시티 오브 플로리다 리서치 파운데이션, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 세포증식증 (특히, 암)을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료할 수 있는 화합물, 상기 화합물을 식별하고 사용하는 방법, 이의 약학적 조성물 및 키트를 제공한다.

Description

키나아제 단백질 결합 억제제{KINASE PROTEIN BINDING INHIBITOR}
본 발명은 키나아제 단백질 결합 억제제에 관한 것이다.
세포증식증(cell proliferative disorder)는 원하지 않거나 조절되지 않은 세포의 증식을 포함하는 장애이다. 세포증식증의 특정예는 암이다. 암은 전 세계의 심각한 건강 이슈이다. 암은 모든 연령대에, 심지어 태아에도 영향을 미친다. 2007년 국제보건기구(World Health Organization)에 의해 보고된 바와 같이, 암은 모든 사망의 13%를 초래한다. 2007년 전 세계에서 약 760만 명이 암으로 사망하였다. 미국 암협회(American Cancer Society)에 따르면, 이러한 암의 425,000명의 새로운 환자가 미국에서만 올해 진단될 것으로 추정되고 있다.
암은 매우 다양한 기관, 조직 및 세포 유형으로 발생될 수 있다. 용어 "암"은 천 개 이상의 상이한 질병의 모음을 의미한다. 한 예가 췌장의 악성종양인 췌장암이다. 췌장암은 미국에서 암 사망의 네 번째의 주요원인을 설명하는 치명적인 질병이다. 췌장암, 특히 국소 진행성 췌장암의 치료는 약 10-12 개월의 평균 생존율과 함께 치료의 도전을 대표한다. 표준 치료 전략은 방사선 치료 및/또는 화학요법 치료이다. 불행히도, 국소 제어는 각각 36% 및 62%의 1-년 및 2-년 국소적 진행 속도, 및 6.4 개월의 평균 기간의 국소적 진행으로 미약하다. 주요 종양 제어의 실패는 통증, 위배출구 및 십이지장 폐색, 및 상부위장관 궤양 및 출혈과 같은 증상과 관련 있다. 따라서, 개선된 환자의 결과(예를 들어, 전체 생존율, 무병 생존율, 국소 제어, 악영향 및 삶의 질)를 얻을 수 있는 치료방법의 개발이 긴급하다.
국소 부착 키나아제(Focal adhesion kinase, FAK)는 세포와 이의 세포 외 기질 사이에 접촉 지점(국소 부착)에 국한되어 있고 인테그린(integrins), 성장 인자 및 키나아제의 신호전달 경로의 집합점인 비수용체 단백질 티로신 키나아제이다(cLean GW 그 외, Nature Reviews 2005; 5(7):505-15 참조). FAK는 세포의 성장, 생존, 및 이동과 같은 필수의 세포 과정 중재에 중요한 역할을 한다. FAK는 정상 조직에서는 낮은 수치로 발현하나 췌장암 환자에서 대부분의 종양과 같이 많은 암 종류에서 과발현된다{Liu W. 그 외 Carcinogenesis, 2008; 29(6): 1096-107; 및 WO 2005/049852 참조). FAK 유전자의 억제는 췌장암 세포 및 이종이식 모델(xenograft models)의 세포사멸(apoptosis) 및 전이(metastasis)를 용이하게 하는 것으로 보여준다{Liu W. 그 외 Carcinogenesis, 2008; 29(6): 1096-107 참조). 따라서, FAK는 암 치료를 위해 가능한 표적이다. FAK를 표적으로 하는 약물의 개발은 기존의 암 치료에 대한 자연적 보완이 될 것이다.
인슐린-유사 성장인자 1 수용체(Insulin-like Growth Factor 1 Receptor, IGF-1R)는 세포증식에서 중요한 역할을 하고 종양 형성과 관련이 있는 수용체 티로신 키나아제이다{Vincent AM, 그 외, Growth Hormone and IGF Research. 2002;12: 193-197 참조). 이러한 수용체는 인슐린과 분자구조가 유사한 폴리펩티드 단백질 호르몬인 IGF-1의 효과를 중재한다. 다양한 인간 암에서 과발현된 666666 IGF-1R은 세포증식을 촉진시키고, 발아성 변이(oncogenic transformation)를 가능하게 하고 세포사멸을 억제한다. IGF-1/IGF-1R 자가분비환(autocrine loop)은 다양한 인간 종양 세포에서 발현되고, 췌장암을 포함한 여러 가지 종양 종류에서 이러한 축의 활성은 전이를 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, IGF-1R 신호전달의 억제는 많은 동물 모델에서 종양 성장의 억제로 연결되는 것으로 밝혀졌다.
그러나, 본 분야에서 나타나는 데이터는 FAK 및/또는 IGF-1R은 암 치료제 개발을 위한 가능한 표적이 될 수 있다는 것을 제안함에도 불구하고, 아직 원하는 특이성을 갖는 키나아제 억제제를 얻지 못하였다. 특히, 췌장암의 악성도에 대한 FAK 및 IGF-1R의 기여와 관련하여 의학 분야에서는 거의 알려진 정보가 없다.
따라서, 원하는 특이성을 갖는 신규의 암 치료제의 개발 및 암을 치료하는데 있어서 신규의 전략의 개발에 대한 요구가 있다.
본 발명은 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료할 수 있는 화합물, 상기 화합물을 식별하고 사용하는 방법, 이의 약학적 조성물 및 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면은 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법을 제공하고: 상기 방법은 FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 화합물은 FAK-NT와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있다. 다른 구현예는 상기 화합물은 FAK-NT2와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있음을 제공한다.
임의의 구현예에서, 상기 화합물은 a) 2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a, 9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][l,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트; b) 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘}; c) 1,1'-(l,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논; d) 3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 또는 e) 1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산; 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 전구약물이다. 바람직한 예는 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘}, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 전구약물이다.
본 발명은 또한 a) 2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][l,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트; b) 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘}; c) I9T-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논; d) 3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및 e) 1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산로부터 선택된 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 전구약물의 유효량을 암을 앓거나 이에 민감한 대상체에게 투여함으로써 상기 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 화합물의 바람직한 예는 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘}, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르 또는 전구약물이다.
일 구현예에서, 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이이다. 임의의 구현예에서는 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암이다. 일 구현예에서, 암은 췌장암이다.
일 구현예에서, 본 발명의 방법은 대상체에게 추가의 치료제를 투여하는 것을 더 포함한다. 일 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 화학요법제이다. 임의의 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 5-플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 플루오로피리미딘, 뉴클레오시드 시티딘 유사체, NVP-AEW541, 백금 유사체, TAE226, 토포이소머라아제 억제제, 항미세소관제(antimicrotubule agent), 포스파티딜이노시톨 3 키나아제 억제제 (PI3 키나아제 억제제), 프로테아좀 억제제, 비타민 D 유사체, 아라키돈산 경로 억제제, 히스톤 디아시틸레이트 억제제, 및 파프네실트랜스페라제 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 TAE226, NVP- AEW541, 보르트만닌, 또는 LY294002이다.
임의의 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 또는 잘립시스(zalypsis)이다.
다른 구현예에서, 본 발명의 방법은 적어도 하나의 추가의 치료와 함께 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 단계를 더 포함한다. 상기 치료는, 이에 한정되지는 않으나, 수술, 화학요법, 방사선, 면역치료, 단일클론 항체 치료 및 상피세포 성장인자 수용체 치료일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 추가의 치료는 화학요법이다. 다른 구현예는 상기 추가의 치료가 방사선임을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 방법은 화학요법과 방사선의 조합으로 대상체를 치료하는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법을 제공하고: 상기 방법은 IGF-1R 및 AKT 인산화반응을 감소시키고 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 화합물의 예는 본원에 기술되었다.
본 발명의 또 다른 측면은 원하지 않는 세포증식을 조절하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 원하지 않는 세포증식을 일으키는 세포를 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용를 조절할 수 있는 것으로 식별된 화합물과 접촉하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 본원에 기술된 화합물이다
일 측면에서, 본 발명은 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 본원에 기술된 화합물이다.
본 발명은 또한 FAK를 FAK 또는 이의 선택적 도메인과 결합하거나 조합할 수 있는 화합물과 접촉시킴으로써 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 FAK의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 본원에 기술된 화합물이다. 다른 구현예는 상기 화합물은 FAK 아미노 말단 부분 (NT2)과 결합하거나 조합할 수 있다.
다른 측면에서, FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절하는 방법은 IGF-1R을 IGF-1R 또는 이의 선택적 도메인과 결합하거나 조합할 수 있는 화합물과 접촉하는 것을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다. 화합물의 예는 본원에 기술되었다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 IGF-1R의 키나아제 도메인과 결합하거나 조합할 수 있다.
본 발명은 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하기 위한 키트를 또한 제공한다. 특히, 상기 키트는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 키트에 포함되는 화합물은 본원에 기술된 화합물이다. 상기 세포증식증은 암이다. 임의의 구현예에서, 상기 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이이다. 임의의 구현예에서, 상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암이다. 특정예는 췌장암이다.
임의의 구현예에서, 상기 키트는 추가의 치료제를 더 포함한다. 임의의 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 상기 기술된 약제이다.
본 발명은 또한 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 상기 조성물은 FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함한다. 일 구현예에서, 상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암이다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 본원에 기술된 화합물이다. 상기 약학적 조성물은 추가의 치료제를 더 포함할 수 있다. 상기 추가의 치료제의 예는 본원에 기술되었다.
본 발명은 또한 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인에 결합하는 화합물, 또는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물을 설계, 평가 및 식별하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 구현예는 본원에 기술되었다.
본 발명은 신규의 암 치료제로서 소분자 억제제를 제공한다. 이러한 억제제는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절(예를 들어, 억제 또는 방해)할 수 있다. 본 발명의 억제제는 적어도 하나의 다음의 기능을 갖는다: 암세포의 생존 가능성(예를 들어, 흑색종암 세포)을 감소시키는 기능, 암세포증식(예를 들어, 흑색종암 세포)을 억제시키는 기능, 세포사멸을 유도하는 기능, 키나아제의 활성을 억제시키지 않으면서 Akt의 활성을 저하시키는 기능, 및 흑생종암 이종이식에서 성장을 감소시키는 기능.
도 1은 FAK와 IGF-1R 단백질 구조 간의 단백질 풀 다운 분석법(pull down assay)의 결과를 나타낸다;
도 2는 NSC 344553와 24시간 동안 처리된 세포 용해물(cell lystate) (C8161 흑색종암 세포로부터)에 대한 면역침강 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 3은 C8161 흑색종암 세포 상에 테스트된 75 μM의 NSC 344553의 면역침강 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 4는 1 μM의 NSC 344553로 처리된 C8161 흑색종암 세포의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 5는 5 μM의 NSC 344553 및 PI3 키나아제 억제제로 24시간 동안 처리된 C8161 흑색종암 세포의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 6은 NSC 344553로 72시간 동안 처리된 췌장암 및 흑색종암 세포의 세포 생존 가능성 분석 결과를 나타낸다;
도 7은 IGF-1R +//- 세포 상의 2 μM NSC 344553 처리의 효과를 나타낸다;
도 8은 FAK +//- 세포 상의 NSC 344553 처리의 효과를 나타낸다;
도 9는 NSC 344553로 처리된 Panc-1 암세포에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다;
도 10은 FAK 야생형 세포와 귀무돌연변이 세포 및 IGF-1R 야생형 세포와 귀무돌연변이 세포(null cell) 상의 NSC 344553 처리의 MTT 세포 타이터(titer) 96 분석 결과를 나타낸다;
도 11은 MTT 분석을 이용한 NSC 344553로 처리된 A375 및 C8161 흑색종암 세포에 대한 세포 생존 가능성 결과를 나타낸다;
도 12는 NSC 128687로 24시간 동안 처리된 췌장암(MiaPaCa-2) 세포에 대한 면역침강 및 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 13은 72-시간 NSC 250435 처리에 대한 MiaPaCa-2 암세포의 투여량-의존성 곡선을 나타낸다;
도 14는 NSC 344553로 처리된 흑색종(A375 및 C8161) 및 췌장(Panc-1 및 MiaPaCa-2) 암세포에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다;
도 15는 FAK와 IGF-1R의 상호작용, INT2-31(NSC 344553)의 구조 및 FAK와 IGF-1R의 상호작용의 분열의 컴퓨터 모형구조(in silico) 모델링을 나타낸다. A. FAK와 IGF-1R 간의 상호작용의 제안된 사이트는 컴퓨터 모델링을 기반으로 보여준다. INT2-31는 FAK와 IGF-1R 간의 상호작용의 사이트에 해당하는 FAK(aa 127-243) 상의 포켓에서 모델링된다. INT2-31의 구조는 오른쪽 상단에서 보여준다. B. INT2-31 투여량의 증가와 함께 IGF-lRb의 GST-FAK-NT2 풀 다운은 감소하였다. C. INT2-31 투여량의 증가와 함께 FAK와 IGF-1R의 공면역침강(coimmunoprecipitation)은 C8161 흑색종암 세포에서 감소하였다. D. INT2-31 투여량의 증가와 함께 FAK와 IGF-1R의 공면역침강은 A375 흑색종암 세포에서 감소하였다. FAK에 대한 IGF-1R의 비율을 나타내는 덴시토미트리(densitometry)는 하기 도 15B, 15C 및 15D의 웨스턴 블롯에서 보여준다. 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다.
도 16은 흑색종암 세포의 생존 가능성 및 증식에 대한 INT2-31의 효과를 나타낸다. A. INT2-31는 72시간에 걸쳐 투여량 의존성 방식으로 정상 멜라닌 세포 및 3개의 흑색종암 세포주의 세포 생존 가능성을 억제하였다. B. 3개의 흑색종암 세포주 및 멜라닌 세포에서의 FAK, IGF-1R, Akt 및 ERK의 발현. C. INT2-31 또는 TAE 226(이중의(dual) FAK 및 IGF-1R 키나아제 억제제)의 증가 투여의 존재하에서 A375 흑색종암 세포(좌) 및 C8161 흑색종암 세포(우)의 CSFE 세포증식 분석. D. INT2-31 또는 TAE 226의 존재하에서 C8161 흑색종암 세포의 수. 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다.
도 17은 INT2-31의 효과는 FAK 및 IGF-1R 특이성을 나타낸다. A. FAK shRNA과 함께 FAK의 넉다운을 나타내는 웨스턴 블롯. B. 모세포 및 감염되지 않은 세포(mock transfected cell)와 비교하여 FAK 넉다운 C8161 세포에서 INT2-31 처리에 대한 증가된 효과를 나타내는 MTT 분석. C. FAK 특이성. 귀무돌연변이 섬유아세포(null fibroblasts)와 비교하여 FAK 야생형 세포에서 INT2-31(31) 또는 NVP AEW541 (IGF-1R 키나아제 억제제, NVP)의 증가된 효과를 보여주는 MTT 분석. *p<0.05 D. IGF-lR 특이성. 귀무돌연변이 섬유아세포와 비교하여 IGF-1R 야생형 세포에서 INT2-31(31) 또는 NVP AEW541(IGF-1R 키나아제 억제제, NVP)의 증가된 효과를 보여주는 MTT 분석. *p<0.05. 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다.
도 18은 INT2-31은 분리(detachment) 및 세포사멸을 유도함을 나타낸다. A. 5 μM INT2-31로 72시간 처리된 세포의 분리에 있어서 작으나 두드러지지 않은 증가이다. 48h 및 72h에서 TAE (TAE 226)와 함께 더 큰 효과를 관찰하였다(*p<0.05 vs 대조군). B. INT2-31 처리된 세포의 호쉿 염색(Hoescht staining). C. INT2-31 또는 TAE 226의 48시간 처리와 함께 활성화된 카스파아제 3/7 검출. D. 세포사멸 경로의 생화학적 표지자의 웨스턴 블롯 분석. 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다.
도 19는 INT2-31는 키나아제 활성을 억제하지 않고 IGF 의존성 Akt 활성을 제거하고 FAK-IGF-1R-의존성 신호전달을 방해함을 나타낸다. C8161의 신호전달에 대한 IGF-1 촉진의 존재하에서 및 부재하에서 INT2-31의 증가 투여량의 효과 A. A375 B. 및 SK-MEL-28 C. 24시간 후 세포. 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다. D. INT2-31는 12개의 키나아제의 키나아제 활성을 두드러지게 억제하지 않았다. E. C8161 세포는 6-웰 플레이트에 플레이팅 되고 5 μM INT2-31과 24, 48, 및 72 시간 동안 처리되었다. F. 및 G. FAK-NT2 부분의 과발현은 IGF-1 유도된 AKT의 인산화반응을 감소시킨다. C8161 세포는 FAK N-말단(FAK NTl, FAK NT2 및 FAK NT3)의 3개의 GFP 부분과 함께 감염되었다.
도 20은 INT2-31가 종양 p-Akt 및 흑색종암 이종이식(xenograft)의 성장을 감소시킨다. 동물은 피하로 A. C8161 또는 B. A375 종양 세포로 접종되었고, 비경구적으로 주사를 통한 PBS와 비교하여, 15 mg/kg의 INT2-31로 처리되었다. 동물 체중은 하기 성장곡선에서 보여준다(* p<0.05). 종양 성장 도면은 3 회 수행된 실험 중 대표적인 것이다. C. INT2-31, 15 mg/kg으로 처리된 C8161 종양의 Ki67 염색, vs PBS 대조군. 반응성 세포의 퍼센트는 좌측 상단 그래프에서 보여준다. 염색의 강도는 좌측 하단 그래프에서 보여준다(* p<0.05). 실험 종료 시 들뜬상태의 종양의 TUNEL 염색은 우측에서 보여준다 (* p<0.05). D. 생체 내에서 AKT의 인산화반응에 있어서 INT2-31(15 mg/kg)의 효과. p-Akt/Akt/GAPDH의 비율의 농도분석(Densitometric analysis)은 하기 도면에서 보여준다. 이는 PBS 대조군과 비교하여 INT2-31로 처리된 동물로부터의 종양의 p-Akt/Akt 비율이 현저히 감소되었음을 나타낸다. E. 종양 샘플로부터의 FAK 및 IGF-1R의 공면역침강에 있어서, INT2-31의 효과. 더 낮은 그래프는 FAK 신호에 대한 IGF-1R의 비율의 덴시토미트리를 보여준다.
도 21은 식도암 세포가 화학요법에 민감하였음을 나타낸다. INT2-31, 5-FU 또는 이의 조합의 증가되는 농도로 72시간 동안 처리된 A) KYSE70 및 B) KYSE140 식도암 세포주의 생존 가능성을 나타내는 MTT 분석.
도 22는 췌장암 세포가 화학요법에 민감하였음을 나타낸다. A) INT2-31, 5-FU 또는 이의 조합의 증가되는 농도로 72시간 동안 처리된 Panc-1 세포주의 생존 가능성을 나타내는 MTT 분석.
도 23은 직접적 식도암 환자 #5 샘플에 대한 INT2-31의 효과. A) INT2-31의 증가하는 농도는 식도암 환자 #5 세포의 생존 가능성을 억제함을 보여주는 MTT 분석. B) 식도암 환자 #5 이종이식은, 비경구적으로 주사를 통한 PBS와 비교하여, 50 mg/kg의 INT2-31로 처리되었다. 상기 처리는 종양 이식 후 10일째 시작되었다. 동물 체중은 하기 성장곡선에서 보여준다. * p<0.05 C) Ki67 항체로 염색된 반응성 세포의 퍼센트는 처리 vs 대조군 이종이식에서 보여준다. * p<0.05.
도 24는 동위 췌장암 마우스 모델에 있어서 INT2-31의 효과. A) Miapaca-2 이종이식은, 비경구적으로 주사를 통한 PBS와 비교하여, 50 mg/kg의 INT2-31으로 처리되었다. 상기 처리는 종양 이식 후 7일 째 시작되었다.
본 출원은 2009년 3월 12일 출원된 미국 가출원 제 61/210,053 호에 대한 우선권주장 출원이다. 이 출원은 모두 본 출원 명세서의 내용에 참고로서 포함된다.
본 발명의 일 부분은 NIH(National Institutes of Health)/NCI 그랜트인 그랜트 제 CA 1 13766(S.N. H.) 호에 의해 지원되었다. 정부는 본 발명의 일정 권리를 갖는다.
본 발명은 암세포의 생존 가능성을 억제하거나 세포사멸을 증가시킬 수 있는 신규의 암 치료제로서의 화합물을 제공한다. 일 측면은 본 발명의 화합물은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절(예를 들어, 억제)할 수 있는 것이다. 다른 측면은 본 발명의 화합물은 FAK 및/또는 IGF-1R의 상호작용 사이트(들)를 타켓팅(예를 들어, 연결되거나 또는 결합하는)하여, FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있는 것이다. 본 발명은 또한 FAK 및/또는 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있는 화합물을 제공한다.
본 발명은 또한 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하기 위하여 본 발명의 화합물을 사용하는 방법을 제공한다. 임의의 구현예에서, 세포증식증은 암이다.
본 발명은, 적어도 일부분, 암세포(예를 들어, 췌장암 세포)에서 FAK는 IGF-1R와 물리적으로 상호작용한다는 발견에 기초한다. FAK과 IGF-1R 간의 상호작용은 두 키나아제의 인산화반응 상태에 의존하고, 이 중 하나의 키나아제의 티로신 인산화반응의 억제는 상기 상호작용을 억제하는 것으로 보인다(W. Liu 그 외, Carcinogenesis, 29, 6, 2008, 1096-1107 참조).
GST 및 HIS 태그 및 정제된 단백질의 비-세포 기반의 분석을 수행하였다. 그 결과 직접적 물리적 상호작용이 FAK 아미노 말단 부분(NT) (더욱 특이적으로, NT2)과 IGF-1R의 키나아제 도메인 사이에 존재함을 나타낸다(도 1). 이러한 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용은 췌장암 세포를 포함하여 암세포에 대한 중요한 생존 신호를 제공하는 것으로 보인다.
본 발명에 따르면, 구조분석과 함께 컴퓨터 모델링을 수행하였다. 리핀스키 법칙(Lipinski rule)을 따르는 정확히 알려진 구조를 갖는 약 250,000의 소분자 화합물을 DOCK5.1 컴퓨터 프로그램을 사용하여 100개의 상이한 방향으로 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용의 사이트에 도킹하였다. FAK NT2에 결합하고 IGF-1R와의 상호작용을 방해하는 가장 높은 확률을 갖는 소분자를 NCI/DTP(National Cancer Institute Developmental Therapeutics Program)로부터 기능적 테스트를 하기 위하여 수득하였다. FAK와 IGF-1R의 상호작용 사이트를 타켓팅하는 주요 화합물을 식별하였다. 주요 화합물은 그 후 정제된 FAK와 IGF-1R 단백질 간의 결합을 방해하는 능력, 암세포의 생존 가능성을 억제하는 능력, IGF-1R 및 AKT 인산화반응을 감소시키는 능력 및/또는 세포사멸을 유도하는 능력에 대한 여러 세포-기반 분석으로 평가하였다. 식도암(KYSE 140), 췌장암(Panc-1), 및 흑색종암(C8161)을 포함하여 여러 암세포주를 몇몇 주요 화합물과 테스트하였다. 초기 결과는 주요 화합물, 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘}이 생체 내에서 종양 세포의 생존 가능성을 억제하고, FAK와 IGF-1R 신호전달을 변경하고 및 종양 성장을 억제함을 보여주었다.
본 발명은 신규의 암 치료제로서 소분자 억제제를 제공한다. 이러한 억제제는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절(예를 들어, 억제 또는 방해)할 수 있다. 본 발명은 또한 암을 치료하기 위한 신규의 효과적인 치료 전략을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 억제제는 적어도 하나의 다음의 기능을 갖는다: 암세포의 생존 가능성(예를 들어, 흑색종암 세포)을 감소시키는 기능, 암세포증식(예를 들어, 흑색종암 세포)을 억제시키는 기능, 세포사멸을 유도하는 기능, 키나아제의 활성을 억제시키지 않으면서 Akt의 활성을 저하시키는 기능, 및 흑생종암 이종이식에서 성장을 감소시키는 기능.
I.정의
발명의 설명 전에 본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위하여, 특정 용어를 먼저 편의를 위해 정의 및 수집되었다.
용어 "투여" 또는 "투여하는"은 본 발명의 화합물을 의도하는 기능을 수행하기 위하여 대상체에 공급하는 루트를 포함한다. 사용될 수 있는 투여 루트의 예는 주사 (피하, 정맥, 비경구적으로, 비경구적으로, 척수강내), 경구투여, 흡입투여, 직장투여 및 경피투여를 포함한다. 약학적 제형은 각각의 투여 루트에 적합한 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 이러한 제형은 정제 또는 캡슐 형태로, 주사, 흡입, 안약, 연고, 좌약 등에 의해, 주사, 주입 또는 흡입에 의해; 로션 또는 연고에 의해 국부적으로; 및 좌약에 의해 직장 투여될 수 있다. 경구 투여가 바람직하다. 주사는 볼루스일 수 있고 지속 주입될 수 있다. 투여의 루트에 따라, 본 발명의 화합물은 이의 의도된 기능을 수행하는 활성에 해롭게 영향을 미칠 수 있는 자연 조건으로부터 보호하기 위하여 선택된 물질로 코팅되거나 처리될 수 있다. 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 상기 기재된 다른 약제와 또는 약학적으로 허용가능한 담체 또는 둘 다와 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 다른 약제를 투여하기 전, 다른 약제와 동시에, 또는 다른 약제를 투여한 후에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 생체 내에서 이의 활성의 대사 산물로 또는 보다 활성의 대사 산물로 전환될 수 있는 전구약물 형태로 투여될 수 있다.
용어 "알킬"은 선형의 알킬 그룹, 분쇄형의 알킬 그룹, 시클로알킬 (알리시클릭) 그룹, 알킬 치환된 시클로알킬 그룹, 및 시클로알킬 치환된 알킬 그룹과 같은 포화 지방족 그룹의 라디칼을 의미한다. 용어 알킬은 또한 탄화수소 골격구조의 하나 또는 그 이상의 탄소를 대체하는 산소, 질소, 황 또는 인 원자를 포함할 수 있는 알킬 그룹도 포함한다. 임의의 구현예에 있어서, 선형의 또는 분쇄형의 알킬은 이의 골격구조에서 30 또는 그 이하, 26 또는 그 이하, 또는 20 또는 그 이하, 또는 4 또는 그 이하의 탄소 원자를 갖는다. 또한, 시클로알킬은 이의 고리 구조에서 3-10 개(예를 들어, 3, 4, 5, 또는 6개)의 탄소 원자를 갖는다.
탄소 수가 달리 명시되지 않는 한, 본원에 사용된 "저급 알킬"은 상기 정의된 바와 같은 알킬 그룹을 의미하나, 선형 또는 분쇄형일 수 있는 골격구조에서 1 내지 10개의 탄소 원자, 또는 1 내지 6개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4개의 탄소 원자를 가진다. 저급 알킬 그룹의 예는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, tert-부틸, 헥실, 헵틸, 옥틸 등을 포함한다. 일 구현예에 있어서. 용어 "저급 알킬"은 골격 구조에서 C1-C4 알킬과 같은 4 또는 그 이하 탄소 원자를 갖는 선형의 알킬을 포함한다.
용어 "세포사멸"은 다세포 생물에서 발생될 수 있는 예정 세포사(programed cell death, PCD)의 과정을 의미한다. 예정 세포사는 특징적인 세포 형태 및 죽음을 야기하는 일련의 생화학적 이벤트, 특히 다양한 형태학적 변화, 예를 들어 막의 비대칭 및 고정화의 손실과 같은 세포막의 변화, 세포 추축, 핵분해(nuclear fragmentation), 염색질 응축, 및 염색체 DNA 분해를 야기하는 생화학적 이베트를 포함한다.
용어 "~와 조합(연결)하여"는 단백질에서 화학적 객체 또는 화합물, 또는 이의 일부분과 바인딩 포켓 또는 바인딩 사이트 간의 근접 조건을 의미한다. 조합은 또한 비-공유결합(여기서, 병렬 배치가 수소결합 또는 반데르발스 결합 또는 정전기적 상호작용에 의해 효과적으로 선호된다)일 수도 있고 공유결합일 수도 있다.
본원에서 사용되는 용어 "바인딩 포켓"은 모양의 결과로 다른 화학적 객체 또는 화합물과 선호적으로 결합된 분자 또는 분자 복합체의 영역을 의미한다.
용어 본 발명의 화합물의 "생물학적 활성"은 본 발명의 화합물에 의해 반응 세포에 나타나는 모든 활성을 포함한다. 이는 이러한 화합물에 의한 유전체 및 비-유전체 활성을 포함한다.
용어 "생물학적 조성물" 또는 "생물학적 샘플"은 세포 또는 바이오폴리머를 포함하거나 이로부터 유도되는 조성물을 의미한다. 세포-함유 조성물은 예를 들어, 포유류 혈액, 농축 적혈구, 농축 혈소판, 농축 백혈구(leukocyte concentrates), 혈액세포 단백질, 혈장, 혈소판-농축 혈장, 농축 혈장, 임의의 혈장 분획으로부터의 침전물, 임의의 혈장 분획으로부터의 상청액, 혈장 단백질 분획, 정제된 또는 부분적으로 정제된 혈액 단백질 또는 다른 성분, 혈청, 정액, 포유류의 초유, 유즙, 침, 태반 추출물, 냉동 침전물, 냉동 상청액, 세포 용해액(cell lysate), 포유류 세포 배양 또는 배지, 발효 생성물, 복수(ascites fluid), 혈액세포로부터 유래된 단백질, 및 정상 또는 형질전환 세포에 의해 세포 내에서 생성된 생성물 (예를 들어, 재조합 DNA 또는 단일클론 항체 기술에 의해)를 포함한다. 생물학적 조성물은 무세포일 수 있다. 일 구현예에 있어서, 적합한 생물학적 조성물 또는 생물학적 샘플은 적혈구 세포 현탁액이다. 몇몇 구현예에 있어서, 혈액세포 현탁액은 포유류 혈액세포를 포함한다. 바람직하게는, 혈액세포는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 염소, 양 또는 돼지로부터 얻을 수 있다. 일 구현예에 있어서, 혈액세포 현탁액은 적혈구 및/또는 혈소판 및/또는 백혈구 및/또는 골수 세포를 포함한다.
용어 "암"은 세포 그룹이 조절되지 않은 성장, 침습, 및 전이를 나타내는 일종의 질병을 의미한다. 상기 용어는 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 암의 바람직한 예는 유방암, 방광암, 결장암 및 직장암, 대장암, 피부 흑색종암, 지궁내막암, 신장암, 폐암 암, 난소암, 췌장암, 골육종, 전립선암, 림프종, 백혈병, 피부암, 갑상선암 및 육종을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
용어 "세포증식증"은 원하지 않는 또는 조절되지 않은 세포의 증식과 관련되는 장애를 포함한다. 이러한 장애의 예는 종양 또는 암 (예를 들어, 폐암 (소세포 및 비-소세포), 갑상선암, 전립선암, 췌장암, 유방암 또는 대장암), 육종 또는 흑색종암을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
용어 "화학요법"은 세포를 사멸하는 화학물질에 의한 질병, 특히 미생물 세포 또는 암의 치료를 의미한다. 본 출원에서, 상기 용어는 암을 치료하는데 사용되는 항암치료제 또는 이러한 약물을 세포독성 표준화된 처리 샘플에 조합을 의미한다.
용어 "키랄"은 거울상 이미지의 파트너와 포개지지 않는 특성을 갖는 분자를 의미하는 반면, 용어 "비키랄(achiral)"은 거울상 이미지의 파트너와 포개지는 분자를 의미한다.
용어 "세포독성" 및 "독성"은 세포에 독성이 되는 자질을 의미한다. 독성 물질은 화학물질, 면역세포 또는 여러 형태의 독(venom)일 수 있다.
용어 "부분입체이성질체"는 2 또는 그 이상의 비대칭의 중심을 갖고 서로 거울상 이미지가 아닌 입체이성질체를 의미한다.
용어 "원격 전이(distance metastasis)"는 하나의 기관에서 다른 비-인접 기관의 일부 또는 림프 또는 혈액을 통한 일부로의 질병의 확산을 의미한다. 본 발명의 목적을 위하여, 용어 "전이"는 혈류를 통해 원발성 종양으로부터 확산하고, 림프 및 혈관으로 들어가고, 순환하고 신체의 다른 정상 조직 내에 성장하기 위해 정착할 수 있는 암세포를 의미한다.
용어 "유효량"은 "치료학적 유효 항증식량" 또는 "예방학적 유효 항증식량"을 의미한다. 용어는 원하는 결과를 얻기 위해 요구되는 투여량으로 요구되는 시간 동안의 효과적인 양을 포함하고, 예를 들어 세포증식증을 치료하는데 충분한 양을 의미한다. 본 발명의 화합물의 유효량은 대상체에 원하는 반응을 나타내기 위해 대상체의 질환의 상태, 나이 및 체중 및 본 발명의 화합물의 활성과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 투여 계획은 최적의 치료효과를 제공하기 위하여 조절될 수 있다. 유효량은 또한 본 발명의 화합물의 독성 또는 해로운 효과(예를 들어, 부작용)가 치료적으로 유익한 효과보다 더 큰 유효량일 수 있다.
본 발명의 화합물의 치료학적 유효량(즉, 유효 투여량)은 약 0.001 내지 약 100 mg/kg 체중의 범위일 수 있다. 임의의 실시예는 약 0.01 내지 30 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중, 약 1 내지 10 mg/kg 체중, 약 2 내지 9 mg/kg 체중, 약 3 내지 8 mg/kg 체중, 약 4 내지 7 mg/kg 체중, 약 5 내지 6 mg/kg 체중이다. 본 기술분야의 숙련자에 있어서 예를 들어 대상체의 질환 또는 장애의 심각성, 사전 치료, 일반적인 건강 및/또는 나이 및 존재하는 다른 질환과 같은(그러나 이에 제한되지 않음) 특정 요소가 대상체의 효과적인 치료를 위하여 요구되는 투여량에 영향을 줄 수 있음은 자명하다. 또한, 본 발명의 화합물의 치료학적 유효량으로 대상체의 치료는 단일 치료를 포함하거나, 또는 지속적 치료를 포함할 수 있다. 일 실시에에 있어서, 대상체는 본 발명의 화합물을 매일 1회 약 0.001 내지 100 mg/kg 체중의 범위로 치료될 수 있다. 치료에 사용되는 본 발명의 화합물의 유효량은 특정 치료 과정에 걸쳐 증가할 수도 감소할 수도 있음은 자명할 것이다.
용어 "거울상 이성질체"는 서로 포개지지 않은 화합물의 2개의 입체이성질체를 의미한다. 2개의 거울상 이성질체의 등몰의 혼합물을 "라세미체 혼합물" 또는 "라세미체"라고 한다.
용어 "상피세포 성장인자 수용체 치료"는 상피세포 성장인자 수용체(EGFR)를 표적으로 하는 암 치료를 의미한다. EGFR는 상피성 종양에서 주로 발현되는 수용체 티로신 키나아제 수용체이다. 병원에서 사용되는 임의의 항-EGFR 약제는 예를 들어, 제피티닙 및 엘로티닙을 포함한다.
용어 " FAK 결합 파트너"는 FAK(예를 들어, 전체 길이, N-말단, C-말단, 카르복시 말단, 키나아제 도메인, FERM 도메인, FAT 도메인)와 함께 복합체가 되는 단백질(본원에 기술된 단백질 포함하여)을 의미한다.
용어 "항상성(homeostasis)"은 생물체 내의 환경에서 정적 또는 일정한 상태의 유지를 의미하는 현상이다.
용어 "이성질체" 또는 "입체이성질체"는 동일한 화학구조를 가지나, 공간적으로 원자 또는 그룹의 배열이 다른 화합물을 의미한다.
용어 "면역치료"는 치료될 대상체의 면역 시스템을 조절함으로서 암을 치료하는 치료를 의미한다. 임의의 구현예에서, 암 치료에 사용되는 면역치료는 대상체의 신체 내에서 종양 특이성 후천성 면역반응을 촉진하는 것을 목표로 한다.
용어 "개선된 생물학적 특성"은 생체 내에서 활성효과를 증가시키는 본 발명의 화합물에 내재되어 있는 임의의 활성을 의미한다. 일 구현예에 있어서, 상기 용어는 감소된 세포독성과 같이 임의의 본 발명의 화합물의 질적으로 또는 양적으로 개선된 치료학적 특성을 의미한다.
용어 "유사분열의 재앙(mitotic catastrophe)"은 DNA 손상 또는 비정상적 스핀들 형성의 결과 분열 시 발생하는 세포사의 형태를 의미한다. 이는 분열로의 진행을 정상적으로 억제하여, 치료가 될 때까지 파국적인 이벤트를 억제하는 상이한 체크포인트 메카니즘(특히, p53)의 조절장애와 관련이 있다. 이는 세포사를 초래하는 소핵형성 및 핵 분할로 이르게한다.
용어 "조절하다"는 예를 들어, 본 발명의 화합물에 노출에 대한 세포증식의 능력, 예를 들어, 적어도 동물의 소집단의 세포의 세포증식 억제에 있어서 증가 또는 감소시켜 원하는 최종 결과, 예를 들어 치료 결과를 얻는 것을 의미한다.
용어 "단일클론 항체 치료"는 선택적으로 표적 암세포에 단일클론 항체(또는 mAb)를 사용하는 치료이다. 목적은 악성종양 세포를 공격하기 위하여 대상체의 면역 시스템을 촉진시키고 선택적 세포 수용체를 차단함으로써 종양 성장을 억제하는 것이다. 상기 치료의 예는 방사선 면역치료법, 항체-지향성 효소 전구약물 치료법, 면역-리포솜을 이용한 약물 및 유전자 치료법을 포함한다. 임의의 치료제 단일클론 항체는 알렘투주맙(alemtuzumab), 베바시주맙, 세투시맙, 에파리주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 111인-카프로맙(111in-capromab), 임시로맙(imciromab), 파니투무맙(panitumumab), 겜투주맙 오조가마이신(gemtuzumab ozogamicin), 리툭시맙(rituximab), 토시투모맙(tositumomab), 및 트라스투주맙(trastuzumab)을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
용어 " FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절(또는 억제) 할 수 있는 화합물을 얻는(수득하는)"에서의 "얻는(수득하는)"은 화합물을 구매, 합성 또는 습득하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 문장 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 경구 및 국소 투여 이 외의 투여를 의미하고, 일반적으로 주사, 및 정맥, 근육내, 동맥내, 척수강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 기관지내, 피하, 피하내, 관절내, 피막하, 자주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입에 의한 투여를 의미하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "전구약물" 또는 "전구-약물"은 생체 내에서 대사작용할 수 있는 부분을 갖는 화합물을 의미한다. 일반적으로 전구약물은 약물을 활성화하기 위하여 에스테르가수분해효소 또는 다른 메카니즘에 의해 생체 내에서 대사작용을 한다. 전구약물 및 이의 사용예는 본 기술분야에 잘 알려져 있다(예를 들어, Berge 외. (1977) "Pharmaceutical Salts", J. Pharm . Sci . 66:1-19 참조). 전구약물은 화합물의 최종 분리 및 정제과정 중에, 또는 별도로 유리산 형태 또는 히드록시 형태의 정제된 화합물을 적합한 에스테르화 약제와 반응시켜 제조될 수 있다. 히드록실 그룹은 카르복실산 처리하여 에스테르로 변환될 수 있다. 전구약물 부분의 예는 치환된 및 비치환된, 분쇄형의 또는 비분쇄형의 저급 알킬 에스테르 부분(예를 들어, 프로피온산 에스테르), 저급 알케닐 에스테르, 디-저급 알킬-아미노 저급-알킬 에스테르(예를 들어, 디메틸아미노에틸 에스테르), 아실아미노 저급 알킬 에스테르 (예를 들어, 아세틸옥시메틸 에스테르), 아실옥시 저급 알킬 에스테르(예를 들어, 피발로일옥시메틸 에스테르), 아릴 에스테르(페닐 에스테르), 아릴-저급 알킬 에스테르(예를 들어, 벤질 에스테르), 치환된(예를 들어, 메틸, 할로, 또는 메톡시 치환기로) 아릴 및 아릴-저급 알킬 에스테르, 아미드, 저급-알킬 아미드, 디-저급 알킬 아미드, 및 히드록시 아미드를 포함한다. 임의의 구현예에서, 전구약물 부분은 프로피온산 에스테르 및 아실 에스테르이다. 생체 내에서 다른 메커니즘을 통하여 활성 형태로 전환하는 전구약물도 또한 포함된다.
용어 화합물의 "예방학적 유효량"은 세포증식을 예방 또는 치료하는데 있어서 이를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체에게 단일 또는 복수의 투여로 효과적인 본 발명의 화합물 또는 본원에 기술된 화합물의 양을 의미한다.
용어 "방사선 치료"는 악성 세포를 조절할 수 있는 치료의 일 부분으로 이온화 방사선의 의료용 사용을 의미한다. 임의의 예는 방사선 치료는 근치적 또는 보조적 암 치료로 사용된다.
용어 "감소된 독성"은 본 발명의 화합물이 생체 내 투여되었을 때 발생하는 임의의 원하지 않는 부작용의 감소를 의미한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본 발명의 화합물의 비교적으로무독성의 무기산 부가염 또는 유기산 부가염을 의미한다. 예를 들어, S. M. Berge, 그 외 "Pharmaceutical Salts," J. Pharm . Sci. 1977, 66, 1-19 참조. 약학적으로 허용가능한 염은 염기 역할을 하는 주 화합물을 무기산 또는 유기산과 반응하여 염, 예를 들어 염산염, 황산염, 인산염, 메탄 술폰산염, 캠퍼 술폰산염, 옥살산염, 말레산염, 숙신산염 및 시트르산염을 형성함으로써 얻을 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 또한 산 역할을 하는 주 화합물은 적합한 염기와 반응하여 염, 예를 들어 나트륨염, 칼륨염, 칼슘염, 마그네슘염, 암모늄염 및 염소염을 형성한다. 본 기술분야의 숙련자에 있어서 본 발명의 화합물의 산 부가염은 본 발명의 화합물과 적합한 무기산 또는 유기산을 임의의 공지의 방법을 통해 반응시킴으로써 얻을 수 있음은 자명하다. 또한, 본 발명의 화합물의 알칼리 및 알카리 토금속염은 본 발명의 화합물과 적합한 염기를 다양한 공지의 방법으로 통해 반응시킴으로써 얻는다.
본 발명의 화합물의 대표적 염은 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 예를 들어 무기 또는 유기 산 또는 염기로부터 형성되는 기존의 무독성염 및 제4급 암모늄염을 포함한다. 예를 들어, 이러한 산 부가염은 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 비술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캠포레이트, 캠포술포네이트, 시나메이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로클로라이드, 하이드로브로마이드, 하이드로이오디드, 2-히드록시에탄술포네이트, 이타코네이트, 락테이트, 말레이트, 만델레이트, 메탄 술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 술포네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 및 운데카노에이트를 포함한다. 염기 염은 칼륨염 및 나트륨염과 같은 알카리 금속염, 칼슘염 및 마그네슘염과 같은 알카리 토금속염 및 디시클로헥실아민 및 N-메틸-D-글루카민과 같은 유기염과 함께 암모늄염을 포함한다. 또한, 염기성의 질소함유 그룹은 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 클로라이드, 브로마이드 및 아이오드과 같은 저급 알킬 할라이드; 디메틸, 디에틸, 및 디부틸 술페이트와 같은 디알킬 술포네이트; 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 클로라이드, 브로마이드 및 아이오드와 같은 긴사슬 할라이드, 벤질 및 펜에틸 브로마이드와 같은 아라알킬 할라이드 등의 약제와 함게 4급화될 수 있다.
용어 "용매화물"은 고체상태에서 본 발명의 화합물과 용매의 복합체를 포함하는 것을 의미한다. 용매화물의 예는 본 발명의 화합물과 에탄올 또는 메탄올의 복합체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 수화물은 특정 형태의 용매화물이고, 여기서 용매는 물이다.
용어 "대상체"는 인간 또는 비-인간 동물과 같이 세포증식증을 앓거나 또는 본 발명의 화합물의 투여로 혜택을 받을 수 있는 생물체를 포함한다. 바람직한 인간은 본원에 기술된 바와 같이 세포증식증 또는 관련된 상태를 앓거나 또는 이에 걸리기 쉬운 인간 환자를 포함한다. 용어 본 발명의 "비-인간 동물"은 포유류, 예를 들어 마우스와 같은 설치류, 및 비-영장류, 예를 들어, 양, 개, 소, 닭, 양서류, 파충류 등과 같은 비-포유류인 모든 척추동물을 포함한다.
용어 "세포증식증에 민감한(걸리기 쉬운)"은 암과 같은 세포증식 장애의 발병 위험에 있는 대상체, 즉 암 바이러스로 바이러스 감염을 앓고 있는 대상체, 이온화 방사선 또는 발암성 화합물에 노출된 대상체, 암에 대한 가족 또는 병력을 가지고 있는 대상체 등을 포함함을 의미한다.
본원에서 사용되는 문장 "전신적 투여," "전신적으로 투여된", " 말초적 투여" 및 "말초적으로 투여된"은 본 발명의 화합물, 약물 또는 다른 물질이 예를 들어, 피하 투여와 같이 환자의 시스템으로 투여되어 신진대사 및 다른 공정이 수행되는 것을 의미한다.
용어 본 발명의 화합물의 "치료학적 유효량"는 단일 또는 복수의 투여에 있어서 세포증식 및/또는 세포증식증의 증상 억제에 효과적이거나, 또는 세포증식증을 가진 환자의 생존 가능성을 이러한 치료를 받지 않았을 때 예상되는 것보다 연장할 수 있는 약물의 양을 의미한다.
키랄 중심의 명명법에 대하여, 용어 "d" 및 "l" 배열은 IUPAC 권고(Recommendations)에 의해 정의된 바와 같다. 용어의 사용으로, 부분입체이성질체, 라세미체, 에피머 및 거울상이성질체가 제조의 입체화학을 기술하기 위하여 사용될 것이다.
II . 본 발명의 화합물
일 측면에서, 본 발명은 세포증식증, 특히 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료할 수 있는 화합물을 제공한다. 일 구현예에서, 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암이다. 본 발명의 화합물은 FAK 및/또는 IGF-1R 활성을 직접적으로 또는 간접적으로 조절(예를 들어, 억제)할 수 있다. 일 구현예에서, 본 발명은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물; 및 이의 약학적으로 허용가능한 에스테르, 염, 및 전구약물을 제공한다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 특히 본원에 기술된 다음의 화합물을 포함한다: 1).2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로 [2,3:4,5][l,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트(또는 "NSC 128687"):
Figure pct00001
2).4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} (또는 "NSC 344553"):
Figure pct00002
3).1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논(또는 "NSC 250435"):
Figure pct00003
4).3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산(또는 "NSC 243620"):
Figure pct00004
5).l-아미노프로판-l,3-디일디포스폰산 (또는 "NSC 133881"):
Figure pct00005

상기 화합물의 각각의 화학적 이름 및 구조는 화합물의 모든 부분입체 이성질체를 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 수화물, 용매화물, 포접 화합물, 동소체, 및 전구약물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 하나 또는 그 이상의 비대칭 중심을 포함할 수 있으므로, 라세미체 및 라세미체 혼합물, 단일 거울상 이성질체, 각각의 부분입체 이성질체 및 부분입체 이성질체 혼합물로서 발생할 수 있다. 이러한 화합물의 이성질체의 형태는 본 발명에 포함된다. 본 발명의 화합물은 복수의 토토머 형태(tautomeric form)로 표시될 수 있고, 이러한 경우, 본 발명은 본원에 기술된 화합물의 모든 토토머 형태도 포함한다. 이러한 화합물의 모든 토토머 형태도 본 발명에 포함된다. 본원에 기술된 화합물의 결정 형태도 본 발명에 포함된다.
자연적 발생의 또는 합성의 이성질체는 본 기술분야에 알려진 방법에 의해 분리될 수 있다. 두 거울상 이성질체의 라세미체 혼합물의 분리 방법은 키랄 정지상을 이용한 크로마토그래피를 포함한다(예를 들어, "Chiral Liquid Chromatography," WJ. Lough, Ed. Chapman 및 Hall, New York (1989) 참조). 거울상 이성질체는 또한 기존의 해상기법(resolution technique)에 의해 분리될 수도 있다. 예를 들어, 부분입체이성질체의 염의 형성 및 분별결정을 사용하여 거울상 이성질체를 분리할 수도 있다. 카르복시산의 거울상 이성질체의 분리를 위하여, 부분입체이성질체의 염을 브루신, 퀴닌, 에페드린, 스트리크닌, 등과 같은 거울이성질체적으로 순수한 키랄 염기를 첨가하여 형성할 수 있다. 또한, 부분입체이성질체의 에스테르는 메탄올과 같은 거울상이성질체적으로 순수한 키랄 알코올로 생성될 수 있고, 그 후, 부분입체이성질체의 에스테르를 분리 및 가수분해하여 유리(free), 거울상이성질체적으로 풍부한 카르복시산을 얻을 수 있다. 아미노 화합물의 광학 이성질체의 분리를 위하여, 캠포술폰산, 타타르산, 만델산, 또는 젖산과 같은 술폰산 또는 키랄 카르복시산의 첨가로 부분입체이성질체의 염을 형성할 수 있다.
본 발명의 화합물을 수득하는 방법은 구매, 합성 또는 습득하는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물을 합성하는 것은 본 기술분야의 숙련자의 수단 내이다. 부산물 생성의 최소화가 필요한 경우, 반응 조건을 최적화하는 방법은 본 기술분야에 알려져 있다. 상기 방법은 또한 추가로 본원에 기술된 단계의 전 또는 후에, 본원의 화합물을 궁극적으로 합성할 수 있도록 하기 위하여 적합한 보호기를 추가 또는 제거하기 위한 단계가 더 포함될 수 있다. 또한, 원하는 화합물을 얻기 위하여 다양한 합성 단계를 다른 순서로 수행할 수 있다. 응용 가능한 화합물을 합성하기에 유용한 합성 화학 변환 및 보호기 방법(보호 및 탈보호)은 본 기술분야에 공지되어 있고 예를 들어, 다음에 기재된 것들을 포함한다: R. Larock, Comprehensive organic Transformations, VCH Publishers (1989); T. W. Greene and P.G.M. Wuts, Protective Groups in organic Synthesis, 3rd Ed., John Wiley 및 Sons (1999); L. Fieser 및 M. Fieser, Fieser and Fieser's Reagents for organic Synthesis, John Wiley 및 Sons (1994); 및 L. Paquette, ed., Encyclopedia of Reagents for organic Synthesis, John Wiley and Sons (1995) 및 이의 후속 판.
다른 측면에서, FAK 또는 이의 선택적 도메인에 연결되거나 결합하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해하는 화합물을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 FAK의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 IGF-1R 또는 이의 선택적 도메인에 연결되거나 결합하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해하는 화합물을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다.
본 발명은 또한 IGF-1R 및 AKT 인산화반응을 감소시키고, 암세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 세포증식증을 치료하기 위한 화합물 스크리닝에 유용한 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 예를 들어, FAK, FAK의 도메인, IGF-1R의 도메인을 포함한다. 일 구현예는 상기 FAK 도메인은 FAK-NT를 포함함을 제공한다. 다른 구현예는 FAK 도메인이 FAK-NT2임을 제공한다. 또 다른 구현예에서, IGF-1R의 도메인은 IGF-1R의 키나아제 도메인을 포함한다.
이러한 폴리펩티드는 녹색형광 단백질과 같은 감지 가능한 리포터 부분과 융합되거나 또는 형광 라벨, 방사성 동위원소(radiolabel) 등과 같은 감지 가능한 테그로 표지된 바인딩 포켓 부분과 같은 융합 단백질일 수 있다. 이러한 융합 단백질은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
임의의 이론에 의한 구속됨이 없이, 본 발명의 화합물은 암세포의 생존 가능성을 억제하여 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료할 수 있다.
III . 본 발명의 화합물의 용도
본 발명은 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 임의의 구현예에서, 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 또는 고형 종양의 원격 전이이다. 바람직한 예는 췌장암, 흑색종암, 및 식도암이다.
본 발명의 일 측면은 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하기 위하여 본 발명의 화합물 및 이의 조성물을 사용하는 방법을 제공한다. 세포증식증의 특정예는 암이다. 일 구현예에서, 본 발명의 방법은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여, 원하지 않는 세포증식 또는 세포증식증을 앓고 있는 또는 이에 민감한 대상체를 치료하는 단계를 포함한다.
본 발명의 화합물의 유효량은 대상체의 질병/장애(이의 발생 정도 또는심각성)를 감소하기에 충분한 양이다. 본 발명의 화합물의 유효량은 단일 또는 지속 투여(투여량)로 제공될 수 있다. 본 발명의 화합물의 유효량은 일반적으로 사례별로 의사에 의해 결정되고 본 기술분야의 숙련자의 능력 내이다.
투여는 제약분야에서 알려진 임의의 투여 루트에 의한 투여일 수 있다. 대상체는 세포증식증(예를 들어, 암) 진단을 받았거나, 세포증식증 발병 위험에 있을 수 있거나, 세포증식증의 증상을 보이거나, 또는 세포증식증에 걸릴 가능성이 높은 환경에 예상된 또는 비예상된 노출 전에 예방 치료를 필요로 할 수 있다. 세포증식증(예를 들어, 암) 치료를 필요로 하는 이러한 대상체의 식별은 본 기술분야의 숙련자의 능력 및 지식 내이다. 본 발명의 방법에 의해 치료될 수 있는 세포증식증 발병 위험에 있는 대상체의 임의의 식별 방법은 가족력 및 대상체의 질병/장애 상태의 발병과 관련되는 위험 요소의 존재와 같이 본 기술 분야에서 자명하다. 본 기술분야의 의사는 예를 들어, 임상 테스트, 물리적 실험 및 병력/가족력을 이용하여 이러한 후보 대상체를 용이하게 식별할 수 있다.
임의의 구현예에서, 상기 대상체는 예를 들어 인간과 같은 영장류인 포유류이다.
임의의 구현예는 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이임을 제공한다. 일 구현예에서, 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암이다.
본 발명은 또한 본 기술분야에 잘 알려진 방법(예를 들어, 종양 크기측정 또는 세포증식증이 암인 경우 종양 마커의 스크리닝)에 의해 세포증식증(특히, 암)의 사전 처리 정도를 결정하는 단계 및 대상체에게 본 발명의 화합물의 유효량을 투여하는 단계를 포함하는 대상체의 치료 효능을 평가 또는 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 화합물의 투여 후 적당한 기간 후(예를 들어, 1 day, 1 주, 2 주, 1 개월, 6 개월), 상태의 정도를 다시 측정한다. 질병/장애의 정도 또는 심각성의 조절(예를 들어, 감소)은 치료의 효능을 나타낸다. 질병/장애의 정도 또는 심각성은 치료하는 동안 주기적으로 측정된다. 예를 들어, 상태의 정도 또는 심각성은 치료의 효능을 추가적으로 평가하기 위하여 몇 시간마다, 몇 일마다, 몇 주마다 체크될 수 있다. 질병/장애의 정도 또는 심각성의 감소는 치료가 효과적임을 나타낸다. 기술된 방법은 본 발명의 화합물의 치료로부터 혜택을 볼 수 있는 환자를 스크리닝하거나 선택하는데 사용될 수 있다.
질병의 조절이 대상체가 상기 치료에 유리한 임상 반응을 가지는 것으로 나타나는 경우, 대상체는 상기 화합물로 치료될 수 있다. 예를 들어, 상기 대상체는 본 화합물의 치료학적 유효량을 투여받을 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 화합물의 유효량과 하나 또는 그 이상의 추가의 치료제의 조합으로 이를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 치료제의 예는 암을 치료하는 것으로 알려진 약물, 예를 들어, 항암제, 항세포증식제, 및 화학요법제를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 치료제는 화학요법제이다. 다른 구현예는 상기 약제가 5-플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 플루오로피리미딘, 뉴클레오시드 시티딘 유사체, NVP-AEW541, 백금 유사체, TAE226, 토포이소머라아제 억제제, 항미세소관제, PD 키나아제 억제제, 프로테아좀 억제제, 비타민 D 유사체, 아라키돈산 경로 억제제, 히스톤 디아틸레이트 억제제, 및 파프네실트랜스페라제 억제제를 포함함을 제공한다.
상기 치료제의 예는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 및 잘립시스를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
사용될 수 있는 다른 치료제는 Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th Edition, Eds. T.R. Harrison 그 외 McGraw-Hill N. Y., NY; 및 the Physicians Desk Reference 62nd Edition 2008, Oradell New Jersey, Medical Economics Co.에서 볼 수 있고, 이의 내용은 본 출원 명세서의 내용에 전체로 참고로써 포함된다. 본 발명의 화합물 및 추가의 치료제(들)는 동일한 약학적 조성물로 또는 다른 약학적 조성물로(동시에 또는 다른 시간에) 대상체에게 투여될 수 있다.
본 발명의 방법은 대상체에게 하나 또는 그 이상의 항세포증식 치료로 치료하는 것을 더 포함할 수 있다. 특히 상기 치료는 암 치료이다. 기존의 암 치료는 수술, 화학요법, 방사선, 면역치료, 단일클론 항체 치료 및 상피세포 성장인자 수용체 치료를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 상기 암 치료의 일 예는 방사선 치료이다. 다른 예는 화학요법이다. 일 구현예는 상기 방법은 대상체를 화학요법과 방사선의 조합으로 치료하는 것을 포함함을 제공한다.
본 발명의 방법은 배양세포에서 예를 들어, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 밖(ex vivo)에서, 또는 동물 대상체에 존재하는 세포에서, 예를 들어 생체 내에서 수행될 수 있다. 본 발명의 화합물은 형질전환 세포, 종양 세포주 등과 같은 증식세포의 일차배양을 사용하여 시험관 내에서 먼저 테스트될 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 화합물의 효과는 동물 모델을 사용하여 생체 내에서 특성화할 수 있다.
본 발명은 또한 조절되지 않은 세포의 증식을 조절(예를 들어, 억제)하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명의 화합물을 조절되지 않은 세포증식을 하는 세포와 접촉하는 단계를 포함한다. 상기 화합물은 FAK의 활성, IGF-1R의 활성, 또는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 직접적으로 또는 간접적으로 조절할 수 있다. 본 발명의 화합물과 세포 간의 접촉은 세포증식을 억제하거나 세포사멸을 유도한다. 세포를 접촉하거나 본 발명의 화합물을 대상체에게 투여하는 것은 세포 또는 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 하나의 방법이다.
일 구현예에서, 상기 접촉은 생체 외에서 예를 들어, 상기 화합물을 세포를 둘러싸는 유동체, 예를 들어 세포가 살아 존재하는 성장 배지에 첨가함에 의해 일 수 있다. 상기 접촉은 또한 상기 화합물을 세포에 직접적으로 접촉하는 것일 수 있다. 또한, 상기 접촉은 예를 들어, 생체 내에서 대상체를 통해 상기 화합물의 통과에 의해 일 수 있다; 예를 들어, 투여 후, 투여 루트에 따라 상기 화합물은 소화관 또는 혈류를 따라 통과할 수 있거나, 또는 치료를 필요로 하는 세포에 직접적으로 적용되거나 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료할 수 있는 화합물을 식별하는 방법을 제공한다. 특히 상기 화합물은 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 FAK 및/또는 IGF-1R를 본 발명의 화합물로 접촉함으로써 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절하는 방법을 제공한다. 임의의 구현예에서, 상기 화합물은 FAK 및/또는 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다. 다른 구현예는 우성-열성 구조(dominant-negative construct, FAK-CD) 또는 siRNA(small interfering RNA)를 사용하는 것을 더 포함할 수 있다. 임의의 구현예에서, 본 발명의 화합물은 FAK 또는 이의 선택적 도메인과 연결되거나 결합하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있다. 일 구현예는 상기 화합물은 FAK의 티로신 인산화반응을 억제할 수 있음을 제공한다. 일 구현예는 상기 화합물은 FAK 아미노 말단 부분(NT2)과 결합하거나 조합할 수 있음을 제공한다.
다른 구현예는 본 발명의 화합물은 IGF-1R 또는 이의 선택적 도메인에 연결되거나 결합하여 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 방해할 수 있음을 제공한다. 일 구현예는 상기 화합물은 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제함을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 IGF-1R의 키나아제 도메인과 결합하거나 조합할 수 있다.
본 발명의 방법은 우성-열성 구조(FAK-CD) 또는 siRNA(small interfering RNA)을 사용하는 것을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 IGF-1R 및 AKT 인산화반응을 감소시키고 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 화합물을 식별하는 방법을 또한 제공한다.
상기 방법은 테스트 화합물의 존재하에서 및/또는 부재하에서 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 결정구조(선택적으로 아포 형태(apo form)또는 복합 형태)를 얻는 단계 또는 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 결정구조(선택적으로 아포 형태(apo form)또는 복합 형태)와 관련된 정보를 얻는 단계를 포함할 수 있다. 이러한 선택적 도메인의 예는 FAK NT2 및 IGF-1R의 키나아제 도메인을 포함한다. 화합물은 그 후 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인 및 상기 테스트 화합물 간의 상호작용의 안정화를 예상하기 위하여 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 결정구조의 바인딩 사이트에 컴퓨터 모델화될 수 있다. 일단 잠재적인 조절 화합물이 확인되면, 상기 화합물은 본원에서 확인되는 방법 및 본 기술분야에 알려진 분석법과 같은 세포분석법을 이용하여 스크리닝될 수 있다. 이러한 방법으로 확인된 화합물은 치료제로서 유용하다.
일 구현예에서, 상기 방법은 1) FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인을 테스트 화합물(복합체)와 접촉하는 단계, 및 2) 결합 상호작용을 평가하는 단계, 여기서 대조 수치와 비교하여 상기 복합체의 안정성의 변화는 테스트 화합물이 상기 복합체의 안정성을 조절할 수 있음을 나타내는 것을 포함하는 테스트 화합물을 평가하는 것을 더 포함한다.
일 구현예에서, FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 복합체는 컴퓨터 모형구조로 모델화되거나, 또는 세포 내 복합체일 수 있거나, 세포로부터 분리될 수 있거나, 재조합적으로 발현되거나, 세포 또는 재조합 발현 시스템으로부터 정제 또는 분리되거나, 또는 세포 또는 재조합 발현 시스템으로부터 부분적으로 정제 또는 분리될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 약물 제조에 있어서 본 발명의 화합물을 단독으로 또는 하나 또는 그 이상의 추가의 치료제와 함께, 대상체의 본원에 기술된 질병, 장애 또는 질환의 치료 또는 예방을 위하여 단일 조성물 또는 분리된 투여 형태로의 본 발명의 화합물의 용도를 제공한다. 본 발명의 다른 측면은 대상체의 본원에 기술된 질병, 장애 또는 질환의 치료 또는 예방용의 본 발명의 화합물이다.
본원에 기술된 방법은 대상체가 특정 기술된 치료를 필요로 하는지 확인하는 것을 포함한다. 이러한 치료를 필요로 하는 대상체를 확인하는 것은 대상체 또는 의료 전문가의 판단일 수 있거나, 또는 주관적(예를 들어 소견) 또는 객관적(예를 들어 테스트 또는 진단방법에 의한 측정)일 수 있다.
IV . 투여량
본 발명의 화합물의 적합한 투여량의 결정은 본 기술분야의 숙련자로서 의사 또는 수의사("근무하는 의사")에 의해 공지의 기술을 사용함으로써 및 유사한 환경하에서 얻어진 결과를 관찰함으로써 용이하게 측정될 수 있다
투여량은 의사의 판단에 있어서 환자의 요건: 치료될 질병의 심각성, 치료될 질병의 상태 및 투여될 특정의 화합물에 따라 달라질 수 있다. 치료학적 유효 항증식량 또는 투여량, 및 예방학적 유효 항증식량 또는 투여량을 측정하는데 있어서, 특정 관련된 세포증식 장애; 특정 약제의 약력학 특성 및 이의 투여 방법 및 루트; 원하는 치료기간; 포유류의 종; 이의 크기, 나이, 및 일반적 건강상태; 특정 관련된 질환: 질환의 정도 또는 심각성; 개인 환자의 반응; 투여되는 특정 화합물; 투여 방법; 투여된 제형의 생체이용률; 선택된 투여량 계획; 현재 치료의 종류 (즉, 본 발명의 화합물과 다른 공-투여 치료제와의 상호 작용); 및 기타 관련 상황과 같은 다수의 요소가 의사에 의해 고려되나 이에 제한되지는 않는다.
Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 17th edition, Mack Publishing Company, 및 the Physician's Desk Reference와 같은 표준 교과서는 적합한 조성물 및 투여량을 제조하는데 참고로 사용될 수 있고, 각 문헌은 본 출원 명세서의 내용에 전체로 참고로써 포함된다. 적합한 투여량의 결정은 본 기술분야의 숙련자 내에서 본원에 기술된 용도를 위한 매개 변수가 제공된다.
치료는 소량의 투여량으로 시작될 수 있다. 그 후, 투여량은 최적의 효과를 보일 때까지 작은 단위로 증가될 수 있다. 편리를 위해, 총 투여량은 필요한 경우 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물의 투여량은 하루에 약 0.01 mg 내지 약 5,000 mg으로 다양할 수 있다. 예를 들어, 투여량은 하루에 약 100 mg 내지 약 4000 mg, 또는 약 1000 mg 내지 약 3000 mg일 수 있다. 투여량 범위를 결정하는 것은 본 기술분야의 숙련자의 능력 내이다. 임의의 구현예에서, 본 발명의 화합물의 투여량은 약 0.001 내지 약 100 mg/Kg 체중의 범위일 수 있다. 임의의 범위는 약 0.01 내지 약 30 mg/kg 체중, 약 0.1 내지 20 mg/kg 체중, 약 1 내지 10 mg/kg, 약 2 내지 9 mg/kg, 약 3 내지 8 mg/kg, 약 4 내지 7 mg/kg, 또는 약 5 내지 6 mg/kg 체중이다. 이러한 투여량은, 예를 들어 복수의 투여를 제공받는지, 조직 형태 및 투여 루트, 개인의 상태, 원하는 목적 및 본 기술분야의 숙련자가 알고 있는 다른 요인에 따라서 다양할 수 있다. 투여는 매일 또는 매주 규칙적으로 예를 들어 질병 증세의 감소와 같이 원하는 측정 가능한 변수가 검출될 때까지, 자주 실시될 수 있다. 그 후, 투여는 2주 마다 또는 매달로 감소될 수 있다.
개, 닭, 및 설치류와 같은 동물의 세포증식증의 예방 또는 치료에 효과적인 것으로 측정된 화합물은 인간의 종양 치료에 유용할 수 있다. 인간의 종양을 치료하는 본 기술분야의 숙련자는 동물 연구에서 얻은 데이터를 기반으로 인간에게 상기 화합물의 투여량 및 투여 방법을 알 것이다.
V. 약학적 조성물 및 투여 형태
본 발명은 또한 본 발명의 화합물의 유효량을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 상기 약학적 조성물은 또한 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 세포증식증(예를 들어 암)을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하기 위해 제형화 될 수 있고, 본워에 상기 기재된 바와 같이 질병/장애를 앓거나 또는 이에 민감한 대상체를 치료하기 위한 설명서와 함께 포장될 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 제형을 대상체에게 투여 후, 대상체에게 적어도 12 시간, 24 시간, 36 시간, 48 시간, 1 주, 2 주, 3 주, 또는 4 주 동안 본 발명의 화합물을 지족적인 전달을 제공하는 약학적으로 허용가능한 제형과 같은 약학적으로 허용가능한 제형을 이용하여 대상체에게 투여된다.
임의의 구현예에서, 이러한 약학적 조성물은 대상체에게 국소 또는 경구 투여로 적합하다. 다른 구현예에 있어서, 하기 상세히 기술된 바와 같이, 본 발명의 약학적 조성물은 다음의 적합한 제형화를 포함하여 고체 또는 액체 형태로 투여되기 위해 특별히 제형화될 수 있다: (1) 예를 들어, 드렌치(수용액 또는 비-수용액 또는 현탁액), 정제, 볼루스, 분말, 과립, 페이스트로서 경구 투여; (2) 비경구 투여, 예를 들어, 살균용액 또는 현탁액으로서 예를 들어, 피하, 근육 또는 정맥 주사; (3) 예를 들어, 피부에 적용될 크림, 연고 또는 스프레이로서 국소 투여; (4) 예를 들어, 페서리(pessary), 크림 또는 폼으로서 질내 또는 직장내 투여; 또는 (5) 예를 들어, 상기 화합물을 포함하는 수용액 에어로졸, 리포솜 제형 또는 고형 입자로서 에어로졸.
문장 "약학적으로 허용가능한"은 현명한 의료판단의 범위 내에서, 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 독성, 자극, 알레르기 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하기에 적합한 본 발명의 화합물, 이러한 화합물을 포함하는 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미한다.
문장 "약학적으로 허용가능한 담체"는 대상체의 하나의 기관, 또는 몸의 일부분에서 다른 기관 또는 몸의 다른 일부분으로 화합물을 운반 또는 수송하는데 포함된, 액체 또는 고체 필러, 희석제, 첨가제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 약학적으로-허용가능한 물질, 조성물 또는 운반체를 포함한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 잘 혼합되고 환자에게 해가 되는 않는 의미의 "허용가능한" 이다. 약학적으로-허용가능한 담체로서 사용될 수 있는 물질의 예는: (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당: (2) 옥수수 전분 및 감자전분과 같은 전분; (3) 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스, 및 이의 유도체; (4) 분말형 트래그캔스; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 첨가제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 콩유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (I3) 아가; (14) 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 무발열수(pyrogen-free water); (17) 등장액; (18) 링거액(Ringer's solution); (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충용액; 및 (21) 약학적 제형에 사용되는 기타 비-독성 상용성 물질을 포함한다.
소듐 라우릴술페이트 및 마그네슘 스테아레이트과 같은 습윤제, 윤활제, 및 유화제, 및 착색제, 박리제, 코팅제, 감미제, 항미료 및 향신료, 방부제 및 항산화제가 조성물에 포함될 수 있다. 약학적으로-허용가능한 항산화제의 예는 (1) 아스코르브산, 시스테인 하이드로클로라이드, 소듐 비술페이트, 소듐 메타비술페이트, 소듐 술페이트 등과 같은 수용성 항산화제; (2) 아스코빌 팔미테이트, 부틸화된 히드록시아니솔(BHA), 부틸화된 히드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등과 같은 유용성 항산화제; 및 (3) 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등과 같은 금속 킬레이트제를 포함한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 경구, 비강, 국소(구강 및 설하 포함), 직장, 질내, 에어로졸 및/또는 비경구 투여로 적합한 조성물을 포함한다. 조성물은 다른 제형은 제약 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 유닛 제형으로 편리하게 존재할 수 있다. 단일 투여형태로 제조하기 위하여 담체와 함께 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료 받을 대상체, 투여의 방식에 따라 달라질 수 있다. 단일 투여형태로 제조하기 위하여 담체와 함께 혼합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료학적 효과를 나타내는 상기 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 상기 양은 100 퍼센트에 대하여 약 1 퍼센트 내지 약 99 퍼센트 범위, 바람직하게는 약 5 퍼센트 내지 약 70 퍼센트 범위, 약 10 퍼센트 내지 약 30 퍼센트 범위의 활성성분일 것이다.
이러한 조성물을 제조하는 방법은 본 발명의 화합물을 담체 및, 선택적으로, 하나 또는 그 이상의 추가 성분과 혼합하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 본 발명의 화합물을 액체 담체 또는 미세한 고체 담체 또는 둘 다를 균일하게 조합하고, 필요 시 상기 생성물을 형태화함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 활성 성분으로서 각각 유효량의 본 발명의 화합물을 포함하는 캡슐, 봉지 또는 정제, 로젠지(향미화된 기반, 일반적으로 수크로스 및 아카시아 또는 트레거캔스를 사용하여), 파우더, 과립제, 용액, 또는 수용액 또는 비수용액 내의 용액 또는 현탁액, 또는 수중 유적형 액체의 에멀젼 또는 유중 수적형 액체의 에멀젼, 또는 또는 엘릭시르제 또는 시럽, 또는 캔디(젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아와 같은 비활성 기반을 이용하여) 및/또는 구강세정제 등의 형태일 수 있다. 화합물은 또한 볼루스, 연약 또는 페이스트로 투여될 수도 있다.
경구 투여(캡슐, 정제, 드라제(사탕), 파우더, 과립제 등)에 적합한 고형의 투여 형태에 있어서, 활성성분은 소듐 시트레이트 또는 디칼슘 포스페이트와 같은 하나 또는 그 이상의 약학적으로-허용가능한 담체, 및/또는 다음 중 임의의 성분과 혼합된다: (1) 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 및/또는 규산과 같은 필러 또는 증량제; (2) 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아와 같은 결합제; (3) 글리세롤과 같은 보습제; (4) 아가-아가, 칼슘 카보네이트, 감자 또는 테피오카 전분, 알긴산, 특정의 실리케이트, 및 소듐 카보네이트와 같은 분산제; (5) 파라핀과 같은 용액 지연제; (6) 4차 암모늄 화합물과 같은 흡수 촉진제; (7) 예를 들어, 아세틸 알코올 및 글리세롤 모노스테아레이트와 같은 습윤제; (8) 카오린 및 벤토나이트 클레이와 같은 흡착제; (9) 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고형의 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 술페이트, 및 이의 혼합물과 같은 윤활제; 및 (10) 착색제. 캡슐 및 정제의 경우, 약학적 조성물은 완충제를 포함할 수 있다. 이러한 타입의 고형 조성물은 락토스 또는 젖당과 같은 첨가제 및 고분자량의 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연성 및 경성-충전된 젤라틴 캡슐의 필러로서 사용될 수도 있다.
정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 추가의 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제(예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕괴제(예를 들어, 소듐 스타치 글리콜레이트 또는 가교된 소듐 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성 또는 분산제를 이용하여 제조될 수 있다. 성형된 정제는 불활성 액체 희석제로 촉촉해진 파우더 활성 성분의 혼합물을 적합한 기계로 성형함으로써 제조될 수 있다.
드라제(사탕), 캡슐 및 과립제와 같은 본 발명의 약학적 조성물의 정제 및 다른 고형의 투여 형태는 선택적으로, 장용성 코팅 및 본 제약-화학분야에 잘 알려진 다른 코팅과, 코팅 및 쉘로 스코어링되거나 제조될 수 있다. 이들은 또한 활성 성분의 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위하여 예를 들어, 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 폴리머 매트릭스, 리포솜 및/또는 미소구체를 다양한 비율로 사용하여 활성 성분을 서서히 또는 조절된 방출을 위하여 제형화될 수 있다. 이는 또한 박테이아-정착된 필터(bacteria-retaining filter)를 통해 여과함으로써, 또는 멸균제를 멸균수 또는 다른 멸균 주사가능한 매개물에 용해될 수 있는 멸균된 고형의 조성물의 형태로 사용 바로 전에 혼합함으로써 멸균될 수 있다. 이러한 조성물은 선택적으로 불투명화제를 포함할 수 있고, 위장관의 특정 부분에서 선택적으로 지연방식으로, 단지 활성 성분(들)만을 방출하거나, 우선적으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 조성물을 저장하는 예는 폴리머성 물질 및 왁스를 포함할 수 있다. 활성 성분은 또한 적합하다면, 하나 또는 그 이상의 상기 기술된 첨가제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다.
본 발명의 화합물의 경구 투여용 액체 투여 형태는 약학적으로-허용가능한 유화제, 마이크로유화제, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함한다. 활성 성분 이 외, 액체의 투여 형태는 본 기술분야에서 보통 사용되는 물 또는 다른 용매와 같은 특정의 비활성 희석제, 에틸 알코올, 이소프로필 알코올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 땅콩유, 옥수수유, 미생물유, 올리브유, 피마자유 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 솔비탄의 지방산 에스테르, 및 이의 혼합물과 같은 유화제 및 용해제를 포함한다.
희석제와 함께, 경구 조성물은 습윤제, 유화제 및 현탁화제, 감미제, 향미료, 착색제, 착향제 및 방부제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.
현택액은 활성의 본 발명의 화합물과 함께 예를 들어, 에톡시화된 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 솔비톨 및 솔비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트래그캔스, 및 이의 혼합물과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
직장내 또는 질내 투여를 위한 본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물과 상온에서 고체형태이나 체온에서 액체상태이어서 직장 또는 질내에서 녹아서 활성성분을 방출하는, 예를 들어, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌약 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 또는 그 이상의 적합한 무자극성 첨가제 또는 담체를 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌약으로 존재할 수 있다.
질내 투여에 적합한 본 발명의 조성물은 본 기술분야에 알려진 적합한 담체를 포함하는 페사리, 탐폰, 크림, 젤, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형을 포함한다. 본 발명의 화합물의 국소 또는 경피투여의 투여 형태는 파우더, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피투여를 위한 투여 형태는 파우더, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 젤, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성의 본 발명의 화합물은 약학적으로-허용가능한 담체, 임의의 방부제, 완충제, 또는 필요에 따라 분사제와 함께 멸균 조건하에서 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 젤은 본 발명의 화합물 이 외, 동물성 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트래그캔스, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 아연 산화물, 또는 이의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 수 있다.
파우더 및 스프레이는 본 발명의 화합물 이 외, 락토스, 탈크, 규산, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 및 폴리아미드 파우더, 또는 이의 혼합물과 같은 첨가제를 포함할 수 있다. 스프레이는 추가로 클로로플루오로탄화수소와 같은 일반적 분사제 및 부탄 및 프로판과 같은 휘발성의 비치환된 탄화수소를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물은 에어로졸에 의해 투여될 수도 있다. 상기 화합물을 포함하는 수용성 에어로졸 제형, 리포좀 제형 또는 고형입자의 제형이 바람직하다. 비수용성 현탁액(예를 들어, 플루오로탄소 분사제)이 사용될 수 있다. 초음파 분무기가 바람직하고 그 이유는 약제를 파괴하고 화합물의 분해를 야기시킬 수 있는 노출을 최소화하기 때문이다.
일반적으로, 수용 에어로졸은 수용액 또는 현탁액의 약제와 기존의 약학적으로-허용가능한 담체와 안정화제를 제형화하여 제조한다. 담체 및 안정화제는 특정 화합물의 요건에 따라 달라지나, 일반적으로 비이온성 계면활성제(트윈(Tweens), 플루로닉(Pluronics), 또는 폴리에틸렌 글리콜), 혈청 알부민과 같은 무해의 단백질, 솔비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 글리신과 같은 아미노산, 완충제, 염, 당 또는 당 알코올을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장액으로부터 제조된다.
경피투여 패치는 몸으로 본 발명의 화합물의 조절된 전달을 제공하기 위한 추가의 장점을 갖는다. 이러한 투여 형태는 약제를 적합한 매개체에 용해 또는 분산하여 제조될 수 있다. 흡수촉진제가 피부를 통한 활성 성분의 전달을 증가시키기 위하여 사용될 수도 있다. 이러한 전달 속도는 속도 조절막을 제공하거나 폴리머 매트릭스 또는 젤에 활성성분을 분산함으로써 조절될 수 있다.
점안 제형, 눈연고, 파우더, 용액 등은 본 발명의 범위 내에 포함된다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 약학적 조성물은 하나 또는 그 이상의 본 발명의 화합물과 하나 또는 그 이상의 약학적으로-허용가능한 무균의 등장수용액 또는 비수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀션, 또는 사용 전 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액으로 재구성 될 수 있는 멸균 파우더를 포함하고, 여기서 상기 용액 및 분산액은 항산화제, 완충제, 세균발육 저지제, 수용자의 피와 등장화하는 제제를 만드는 용질 또는 현탁화제 또는 증점제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수용성 및 비수용성 담체는 물, 에탄올, 폴리올(글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 등과 같은), 및 적합한 이의 혼합물, 올리브유와 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 유기 에스테르를 포함한다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용함으로써, 분산액의 경우 요구되는 입자 크기를 유지함으로써, 및 계면활성제를 사용함으로써 적합한 유동성을 유지할 수 있다.
이러한 조성물은 방부제, 습윤제, 유화제, 및 분산제와 같은 보조제를 포함할 수 있다. 미생물의 활성의 억제는 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르빈산, 등을 포함함으로써 보장될 수 있다. 조성물 내에 당, 소듐 클로라이드 등과 같은 등장화제를 포함하는 것이 바람직하다. 또한, 주사가능한 약학적 형태의 지속되는 흡수는 암모늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 약제를 포함함으로써 제공될 수 있다.
몇몇의 경우, 약물의 효과를 지속시키기 위하여 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 늦추는 것이 바람직하다. 이는 낮은 수용성을 갖는 결정질 또는 비결정질의 액체 현탁액의 사용으로 얻을 수 있다. 약물의 흡수 속도는 결정의 크기 및 결정의 형태에 따른 용해속도에 좌우된다. 또한, 비경구적으로-투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 운반체내의 약물을 용해 또는 현탁화함으로써 얻는다.
주사가능한 데포(depot) 형태는 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해성 폴리머 내의 본 발명의 화합물의 마이크로 캡슐 매트릭스를 형성함으로써 얻는다. 폴리머에 대한 약물의 비 및 특정의 사용된 폴리머의 특성에 따라, 약물의 방출 속도는 조절될 수 있다. 다른 생분해성 폴리머의 예는 폴리(오르소에스테르) 및 폴리(안히드리드)를 포함한다. 데포 주사가능한 제형은 약물을 체조직과 혼합되는 리포좀 또는 마이크로에멀션 내에 트랩핑하여 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물이 약물로써 인간 및 동물에게 투여될 때, 이는 단독으로 또는 예를 들어, 0.1 내지 99.5%(보다 바람직하게는, 0.5 내지 90%)의 활성성분과 약학적으로-허용가능한 담체와 혼합으로 포함하는 약학적 조성물로 투여된다.
선택된 투여 루트에 상관없이, 적합한 수화물의 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 약학적으로-허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 약학적 조성물 내의 활성성분의 실제 투여 수준 및 시간은 환자에 독성 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 형태에 대해서 원하는 치료적 반응을 얻기에 충분한 활성성분의 유효량을 얻기 위하여 달라질 수 있다. 구현예에서, 투여량의 범위는 하루에 0.1 내지 10 mg 이다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자가 견딜 수 있고 심각한 부작용을 일으키지 않는 최대량이다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 체중 1kg 당 약 0.001 mg 내지 약 100 mg, 약 0.001 내지 약 10 mg/kg 또는 약 0.001 mg 내지 약 100 mg/kg의 농도로 투여된다. 투여량 범위에 대한 다른 예는 상기 기술되었다.
본 발명의 약학적 조성물은 또한 상기 기술된 바와 같이 추가의 치료제를 더 포함할 수 있다. 일 구현 예에서, 상기 추가의 치료제는 화학요법제이다. 다른 구현예에서는, 상기 추가의 치료제는 5-플루오로우라실(5-FU), 젬시타빈, 플루오로피리미딘, 뉴클레오시드 시티딘 유사체, NVP-AEW541, 백금 유사체, TAE226, 토포이소머라아제 억제제, 항미세소관제, PI3 키나아제 억제제, 프로테아좀 억제제, 비타민 D 유사체, 아라키돈산 경로 억제제, 히스톤 디아시틸레이트 억제제, 및 파프네실트랜스페라제 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다.
추가의 치료제의 임의의 예는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 및 잘립시스이나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 화합물이 인간 및 동물에게 약제로서 투여되는 경우, 이는 단독으로 또는 예를 들어, 0.1 내지 99.5%(또는 0.5 내지 90%)의 활성성분과 약학적으로-허용가능한 담체와 혼합으로 포함하는 약학적 조성물로 투여될 수 있다.
선택된 투여 루트에 상관 없이, 적합한 수화물의 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 약학적 조성물은 기존의 본 기술분야에서 잘 알려진 방법에 의해 약학적으로-허용가능한 투여 형태로 제형화된다.
본 발명의 약학적 조성물 내의 활성성분의 실제 투여 수준 및 시간은 환자에 독성 없이, 특정 환자, 조성물 및 투여 형태에 대해서 원하는 치료적 반응을 얻기에 충분한 활성성분의 유효량을 얻기 위하여 달라질 수 있다.
VI . 키트
본 발명은 또한 본원에 기술된 장애/질병을 치료하기 위한 키트를 제공한다. 본 발명의 전형적 키트는 본원에 기술된 화합물, 약학적 제형 또는 이의 조합 및 사용 설명서를 포함한다. 사용 설명서는 투여량, 전달 방법, 키트의 저장 등에 대한 정보를 포함한다. 임의의 구현예에서, 상기 키트는 본 발명의 화합물, 제형 또는 조합을 투여하는 설명서를 포함한다. 키트는 설명서 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하기 위한 정보를 포함할 수 있다. 임의의 구현예에서, 상기 키트는 세포증식증을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 설명서를 포함할 수 있다. 일 구현예에서, 장애는 암이다. 임의의 예는 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이임을 제공한다. 특정예는 췌장암, 흑색종암, 및 식도암이다.
일 구현예에서, 키트는 대상체의 세포증식증을 치료 또는 예방하기 위한 사용 설명서를 포함한다. 상기 설명서는 투여량, 전달 방법, 키트의 저장 등에 대한 정보를 포함한다.
키트에 포함된 화합물의 유효량은 상기 기술한 바와 같다. 일반적으로 본 발명의 화합물의 유효량은은 치료될 대상체의 심각한 부작용을 일으키는데 필요한 양보다 적은 투여량이다. 임의의 예는 상기 키트는 약 0.001 mg/Kg 내지 약 100 mg/Kg의 투여량의 본 발명의 화합물을 포함함을 제공한다.
몇몇 구현예는 키트는 추가의 치료제를 더 포함함을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 화학요법제이다. 다른 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 5-플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 플루오로피리미딘, 뉴클레오시드 시티딘 유사체, NVP-AEW541, 백금 유사체, 토포이소머라아제 억제제, TAE226, 항미세소관제, PI3 키나아제 억제제, 프로테아좀 억제제, 비타민 D 유사체, 아라키돈산 경로 억제제, 히스톤 디아시틸레이트 억제제, 및 파프네실트랜스페라제 억제제로 구성된 군으로부터 선택된다. 임의의 구현예에서, 상기 추가의 치료제는 TAE226, NVP-AEW541, 보르트만닌, 또는 LY294002이다.
추가의 치료제의 예는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 및 잘립시스를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 키트는 본 발명의 화합물을 투여하는데 사용되는 장치를 더 포함할 수 있다. 이러한 장치의 예는 정맥주사 삽입장치, 주사기, 드립백, 패치, 국소용 젤, 펌프, 광분해, 자동인젝터 및 흡입기로부터 보호를 위한 용기를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명의 키트는 하나 또는 그 이상의 활성성분을 투여하는데 사용될 수 있는 약학적으로 허용가능한 운반체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 활성성분이 비경구 투여를 위해 재구성되어야 하는 고형 형태로 제공되는 경우, 키트는 상기 활성성분을 피경구 투여에 적합한 미립자 없는 멸균수를 형성하도록 용해될 수 있는 봉쇄된 용기의 적합한 운반체를 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 운반체의 예는: 주사 USP용 물; 이에 한정되지 않는 소듐 클로라이드 주사, 링거 주사(Ringer's Injection), 덱스트로오스 주사, 덱스트로오스 및 소듐 클로라이드 주사, 및 락테이트된 링거 주사와 같은 수용성 운반체; 및 이에 한정되지 않는 옥수수유, 면실유, 땅콩유, 참깨유, 에틸 올레이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트와 같은 비-수용성 운반체를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 하나 또는 그 이상의 본 발명의 키트는 함께 포장될 수 있다. 예를 들어, 세포증식증(예를 들어 암)을 위한 치료의 효능을 평가하기 위한 키트는 본 발명에 따른 세포증식증을 위해 치료된 대상체의 진행 상황을 모니터링하는 키트와 함께 포장될 수 있다.
VII . 스크리닝 방법 및 시스템
다른 측면에서, 본 발명은 본원에서 확인된 바인딩 포켓 또는 유사한 형태의 동족체 바인딩 포켓의 하나 또는 둘 다의 구조 좌표를 포함하는 기계 판독가능한 저장매체를 제공한다. 이러한 데이터로 인코딩된 저장매체는 이러한 바인딩 포켓을 포함하는 분자 또는 분자 복합체의 3-D 그래픽 표현(three-dimensional graphical representation)를 스크린 또는 유사한 시청장치에 표시할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바인딩 포켓에 결합하는 화합물의 설계, 평가 및 확인방법을 제공한다. 그리하여, 컴퓨터는 바인딩 포켓을 포함하는 분자 또는 분자 복합체의 3-D 그래픽 구조를 생성한다.
다른 구현예에 있어서, 본 발명은 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 구조 좌표에 의해 정의된 분자 또는 분자 복합체의 3-D 표현, 또는 상기 분자 또는 분자 복합체의 동족체(homologue)의 3-D 표현를 생성하는 컴퓨터를 제공하고, 여기서 상기 동족체는 아미노산의 골격 원자로부터 2.0 이하(보다 바람직하게는 1.5 이하) 옹스트롬의 평균평방근편차(root mean square deviation)를 갖는 바인딩 포켓을 포함한다. 일 구현예에서, 구조는 FAK 아미노 말단 부분 (NT), 또는 IGF-1R의 키나아제 도메인의 좌표를 사용하였다. 다른 구현예에서, 구조는 FAK-NT2의 좌표를 사용하였다.
바람직한 구현예에서, 컴퓨터 또는 컴퓨터 시스템은 본 기술분야에서 공지의 성분, 예를 들어 U.S. 특허 제5,978,740 및/또는 제6,183,121(본원에 참고로써 포함되는)에 기술된 바를 포함할 수 있다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템은 CPU(central processing unit), 작업 메모리(예를 들어, RAM (random-access memory) 또는 "코어" 메모리일 수 있는), 대용량 저장 메모리(하나 또는 그 이상의 디스크 드라이브 또는 CD-ROM 드라이브와 같은), 하나 또는 그 이상의 CRT(cathode-ray tube) 또는 LCD(liquid crystal display) 디스플레이 단말기, 하나 또는 그 이상의 키보드, 하나 또는 그 이상의 인풋 라인(input line), 및 하나 또는 그 이상의 아웃풋 라인(output line)을 포함하는 컴퓨터를 포함할 수 있고, 전체는 기존의 시스템 버스에 의해 연결된다.
본 발명의 기계 판독가능한 데이터는 모뎀 또는 데이터 라인과 연결된 모뎀을 사용하여 컴퓨터에 입력될 수 있다. 이와 달리 또는 추가로, 인풋 하드웨어는 CD-ROM 드라이브, 디스크 드라이브 또는 플래쉬 메모리를 포함할 수 있다. 디스플레이 단말기와 함께, 키보드는 인풋 장치처럼 사용될 수도 있다.
컴퓨터에 아웃풋 라인에 의해 결합된 아웃풋 하드웨어는 기존의 장치에 의해 유사하게 구현될 수 있다. 예를 들어, 아웃풋 하드웨어는 QUANTA 또는 PYMOL와 같은 프로그램을 이용하여 본 발명의 바인딩 포켓의 그래픽 표현을 표시하는 CRT 또는 LCD 디스플레이 단말기를 포함할 수 있다. 아웃풋 하드웨어는 또한 추후 사용을 위한 시스템 아웃풋을 저장하기 위하여 프린트, 또는 디스크 드라이브를 포함할 수 있다.
작동 시, CPU는 다양한 인풋 및 아웃풋 장치의 사용을 조절하고, 대용량 저장장치로부터 데이터 접속 및 작업 메모리로 및 작업 메모리로부터의 접속을 조절하고, 및 데이터처리 단계의 순서를 결정한다. 시판용 소프트웨어를 포함하여 많은 수의 프로그램이 본 발명의 기계-판독가능한 데이터를 처리하는데 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 기계-판독가능한 데이터를 저장하기 위한 자기 저장 매체(magnetic storage medium)는 종래의 것일 수 있다. 자기 데이터 저장 매체는 상기 기술된 컴퓨터 시스템과 같은 시스템에 의해 수행될 수 있는 기계-판독가능한 데이터와 인코딩될 수 있다. 매체는 극성 또는 방향이 자석으로 변경될 수 있는 자구(magnetic domain)를 포함하고, 한면 또는 양면에 종래의 적합한 기판 및 일반적인 적합한 코팅을 갖는 종래의 플라피 디스켓 또는 하드 디스크일 수 있다. 매체는 또한 디스크 드라이브 또는 다른 데이터 저장 장치의 스핀들을 수용하기 위해 오프닝(미도시)을 가질 수 있다.
매체의 자구는 본원에 기재된 컴퓨터 시스템과 같은 시스템에 의한 실행을 위하여 종래의 방법으로 본원에 기재된 기계 판독가능한 데이터를 인코딩하기 위하여 편광되거나 지향된다.
광학적으로 판독가능한 데이터 저장 매체는 또한 기계-판독가능한 데이터, 또는 컴퓨터 시스템에 의해 수행될 수 있는 명령(instruction) 세트와 인코딩될 수 있다. 매체는 종래의 CD-ROM(compact disk read only memory) 또는 광학적으로 판독가능하고 광-자기적으로 기록가능한 광자기 매체(magneto-optical disk)와 같은 재기록 가능 매체일 수 있다.
잘 알려진 바와 같이, CD-ROM의 경우, 코팅 디스크는 반사되고, 기계-판독가능한 데이터를 인코딩하기 위하여 복수의 피트를 찍는다. 피트의 배열은 코팅의 표면에서 레이저 빛을 반사하여 읽힌다. 바람직하게는 실질적으로 투명한 보호 코팅은 반사 코팅의 상부에 제공된다.
잘 알려진 바와 같이, 광-자기 디스크의 경우, 데이터-기록 코팅은 피트는 없으나, 복수의 자구를 가지고, 레이저에 의해 특정 온도 이상으로 가열되는 경우, 자구의 극성 또는 방향은 자기로(magnetically) 변환될 수 있다. 도메인의 방향은 코팅으로부터 반사되는 레이저 빛의 편극을 측정함으로써 읽을 수 있다. 도메인의 배열은 상기 기술한 바와 같이 데이터를 인코딩한다.
해당 좌표를 바인딩 포켓을 포함하는 분자 또는 분자 복합체의 3-D 구조로 번역하기 위한 소프트웨어 프로그램화된 컴퓨터와 함께 사용되는 경우, 구조 데이터는 약물 전달과 같은 다양한 목적으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서, DOT는 분자 또는 분자 복합체의 예측을 위해 사용된는 소프트웨어이다. DOT는 번역되고 제 2의 분자를 중심으로 회전된 한 분자의 체계적 리지드-바디 조사(rigid-body search)를 수행한다. 이러한 조사로 생성된 모든 배열의 분자간 에너지는 정전기 에너지 및 반데르발스 에너지의 총 합으로써 계산된다. 이러한 에너지 용어는 푸리에 변환(Fast Fourier Transforms, FFT)로 효과적으로 계산되는 상관 함수(correlation function)로 측정된다. 일반적 실행에서, 두 분자의 약 108억 배열에 대한 에너지는 몇 시간 내에 계산될 수 있다.
예를 들어, 상기 데이터에 의해 인코딩된 구조는 화학적 객체(chemical entities)와 관련하는 기능을 위해 전산모사(computationally)로 평가될 수 있다. FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 바인딩 포켓과 관련하는 화학적 객체는 잠재적인 약물 후보자이다. 임의의 FAK 도메인은 FAK-NT이다. 일 구현예에서, 상기 데이터에 의해 인코딩된 구조는 FAK-NT2, 또는 IGF-1R의 키나아제 도메인으로 조절된다. 다른 구현예에서, 상기 데이터에 의해 인코딩된 구조는 FAK aa 126-243 또는 IGF-1R aa 959-1266로 조절된다. 상기 데이터에 의해 인코딩된 구조는 컴퓨터 스크린 상에 그래픽의 3-D 표현으로 표시될 수 있다. 이는 구조의 육안 검사뿐만 아니라 화학적 객체와의 구조관계를 육안 검사로 허용한다.
따라서, 다른 구현예에 따르면, 본 발명은 a) FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 바인딩 포켓을 포함하는 분자 또는 분자 복합체. 또는 b) 상기 분자 또는 분자 복합체의 동족체와 조합하는 화학적 객체의 잠재성을 평가하기 위한 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 동족체는 아미노산의 골격 원자로부터 2.0(보다 바람직하게는 1.5)이하의 옹스트롬의 평균평방근편차를 갖는 바인딩 포켓을 포함한다.
상기 방법은:
i) 화학적 객체 및 분자 또는 분자 복합체의 바인딩 포켓 사이의 피팅 작업(fitting operation)을 수행하기 위하여 연산 수단을 사용하는 단계; 및
ii) 화학적 객체 및 바인딩 포켓 사이의 연관 관계를 수량화하기 위하여 피팅 작업의 결과를 분석하는 단계를 포함한다. 본원에 사용되는 용어 "화학적 객체"는 화학적 화합물, 적어도 2개의 화학적 화합물의 복합체, 및 상기 화합물 또는 복합체의 프래그먼트를 의미한다.
볼 발명에 따르면, FAK, 및 IGF-1R 간의 상호작용 사이트와 결합 또는 조합하는, 또는 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인에 결합 또는 이를 억제하는 화합물의 설계는 일반적으로 여러 가지 요인에 대한 고려를 포함한다. 먼저, 객체는 물리적으로 및 구조적으로 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인, 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트의 전부 또는 일부와 조합될 수 있어야 한다. 이 같은 조합에 있어서 중요한 비-공유 분자 상호작용은 수소결합, 반데르발스 상호작용, 소수성 상호작용 및 정전기 상호작용을 포함한다. 둘째로, 이러한 객체는 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인, 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트와 직접적으로 조합하도록 하는 구조를 추정할 수 있어야 한다. 객체의 특정 부분이 이러한 조합에 직접적으로 참여하지 않을지라도, 상기 개체의 이러한 부분은 분자의 전체적 구조에 여전히 영향을 미칠것이다. 결국, 이는 효능에 큰 영향을 가질 것이다. 이러한 구조적 요건은 화학 바인딩 포켓의 전체 또는 일부, 또는 바인딩 포켓 또는 이의 동족체와 직접적으로 상호작용하는 여러가지 화학적 객체를 포함하는 객체의 기능성 그룹 사이의 간격과 관련하는 화학적 객체의 전체적인 3-D 구조 및 방향을 포함한다.
FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인, 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용에 대한 잠재적인 억제 또는 결합 효과는 컴퓨터 모델링 기술의 사용으로 인해 이의 실제 합성 및 테스트 전에 분석될 수 있다. 주어진 객체의 이론적 구조가 상기 객체와 표적 바인딩 포켓 사이의 상호작용 및 조합을 불충분히 제안할 경우, 객체의 테스트는 제거된다. 그러나, 컴퓨터 모델링이 강한 상호작용을 나타내는 경우, 분자는 합성되고 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인에 결합하는 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트과 조합하는 이의 능력에 대해 테스트될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 분자는 FAK-NT(또는 FAK-NT2), 또는 IGF-1R의 키나아제 도메인에 결합하는 능력에 대해 테스트될 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 FAK aa 126-243 및/또는 IGF-1R aa 959-1266에 결합하는 능력을 위하여 선택된다. 본원에 기술된 또는 본 기술분야에 잘 알려진 분석을 사용하여 예를 들어, FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 활성을 억제하기 위한 또는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절하기 위한 분자의 능력을 테스트함으로써 또얻을 수 있다. 이러한 방식으로 이용할 수 없는 화합물의 합성은 피할 수 있다.
FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 잠재적 억제제 또는 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용의 잠재적 억제제는 일련의 단계에 의해 전산모사로 평가될 수 있고, 화학적 객체 또는 프래그먼트는 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인, 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트와 조합하는 능력에 대하여 스크리닝되고 선택된다. 일 구현예에서, 상기 잠재적 억제제는 FAK-NT (또는 FAK-NT2) 도메인, 또는 the IGF-1R의 키나아제 도메인과의 조합 능력에 대해 평가될 수 있다. 예를 들어, FAK aa 126- 243 및/또는 IGF-1R aa 959-1266는 이러한 공정에서 사용될 수 있다.
본 기술분야의 숙련자는 화학적 객체 또는 프래그먼트를 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인, 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트와 조합하는 능력에 대해 스크리닝하기 위하여 여러가지 방법 중 하나를 사용할 수 있다. 예를 들어, 이러한 공정은 FAK, IGF-1R, 이의 선택적 도메인, 또는 FAK와 IGF-1R의 복합체의 구조, 또는 기계-판독가능한 저장 매체로부터 생성된 유사한 형태를 정의하는 다른 좌표를 기반으로 컴퓨터 스크린 상에서 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인(예를 들어, FAK NT2 도메인, 또는 IGF-1R의 키나아제 도메인), 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트의 육안 점검에 의해 시작할 수 있다. 선택된 프래그먼트 또는 화학적 객체는 그 후 상기 정의된 바와 같은 바인딩 포켓 내에서 다양한 방향으로 배치될 수 있거나 도킹될 수 있다. 도킹은 Quanta 및 DOCK와 같은 소프트웨어, 그 후 CHARMM 및 AMBER와 같은 표준 분자 역학 역장(standard molecular mechanics force fields)과 함께 에너지 최소화 및 분자 동역학을 사용하여 얻을 수 있다.
전문적인 컴퓨터 프로그램(예를 들어, 본 기술분야에 알려진 및/또는 시판되는 및/또는 본원에 기술된 바와 같이)은 프래그먼트 또는 화학적 객체를 선택하는 과정에서 지원할 수 있다.
일단 적합한 화학적 객체 또는 프래그먼트가 선택되면, 이들은 단일 화합물 또는 복합체로 조립될 수 있다. 조립은 표적 바인딩 포켓의 구조 좌표에 관하여 컴퓨터 스크린 상에 표시된 3-D 이미지에서 프래그먼트 사이의 관계의 육안 점검에 의해 진행될 수 있다.
바인딩 포켓의 억제제를 상기 기술한 바와 같이 한번에 프래그먼트 또는 화학적 객체를 단계적으로 만들기 위한 과정 대신에, 빈 바인딩 사이트 또는 공지의 억제제(들)의 임의의 부분(들)을 선택적으로 포함하는 바인딩 사이트를 사용하여 일률적으로 또는 "처음부터(de novo)" 설계될 수 있다. 본 기술분야에 알려진 많은 새로운 리간드 설계법이 있고, 이 중 몇몇은 시판되고 있다(예를 들어, 미주리주 세인트 루이스의 트리포사(Tripos Associates)로부터 시판되는 LeapFrog).
다른 분자 모델링 기법은 본 발명에 따라 사용될 수 있다[예를 들어, N. C. Cohen 외., "Molecular Modeling Software and Methods for Medicinal Chemistry, J. Med. Chem., 33, pp. 883-894 (1990); 또한 M. A. Navia 및 M. A. Murcko, "The Use of Structural Information in Drug Design", Current Opinions in Structural Biology, 2, pp. 202-210 (1992) 참조; L. M. Balbes 외, "A Perspective of Modern Methods in Computer-Aided Drug Design", in Reviews in Computational Chemistry, Vol. 5, K. B. Lipkowitz 및 D. B. Boyd, Eds., VCH, New York, pp. 337-380 (1994) 참조; 또한, W. C. Guida, "Softward For Structure-Based Drug Design", Curr. Opin. Struct. Biology, 4, pp. 777-781 (1994) 참조].
일단 화합물이 설계되고 선택되면, 객체가 바인딩 포켓에 결합할 수 있는 효능은 전산모사 평가(computational evaluation)에 의해 테스트되고 최적화될 수 있다.
특정 컴퓨터 소프트웨어는 화합물 변형 에너지 및 정전기 상호작용을 평가하기 위하여 본 기술분야에서 사용가능하다. 이러한 용도의 프로그램의 예는 AMBER; QUANTA/CHARMM (Accelrys, Inc., 위스컨신의 메디슨) 등이다. 이러한 프로그램은, 예를 들어, 시판용 그래픽 워크스테이션을 이용하여 구현될 수 있다. 다른 하드웨이 시스템 및 소프트웨어 패캐지는 본 기술분야의 숙련자에 알려질 것이다.
다른 기술은 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같은 화합물의 가상 라이브러리(virtual libraries)의 컴퓨터 모형구조(in silico) 스크리닝을 포함한다. 수 천의 화합물을 용이하게 스크리닝할 수 있고 가장 가상의 화합물을 추가의 스크리닝(예를 들어, 합성 및 생체 외 테스트에 의한)을 위해 선택할 수 있다. 소분자 데이터 베이스는 FAK, IGF-1R, 또는 이의 선택적 도메인의 바인딩 포켓에 전체로 또는 일 부분으로 결합할 수 있거나 또는 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용 사이트와 조합할 수 있는 화학적 객체 또는 화합물에 대해 스크리닝할 수 있다. 이 같은 스크린에서, 바인딩 사이트에 대한 이러한 객체의 핏팅 질은 형상 보완성(shape complementarity) 또는 계산된 상호작용 에너지에 의해 판단될 수 있다.
실시예
본 발명의 범주를 제한하지 않으면서 본 발명을 도시하기 위한 하기의 실시예를 통해 본 발명이 더 기술된다.
재료
세포주 및 배양 - Panc-1 및 MiaPaca-2 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 입수하였다. Panc-1 세포는 10% 소태아혈청(FBS) 및 1 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium) 에서 유지되었다. MiaPaca-2 세포는 10% FBS, 2.5% 말혈청, 및 1 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지에서 유지되었다. L.3.6 pl 세포주는 텍사스 대학 MD 앤더슨 암센터로부터 입수하였으며, 10% FBS, 1 ㎍/ml 페니실린/스트렙토마이신, 비타민, 1 mmol/1 소듐 피루베이트(sodium pyruvate), 2 mmol/1 L-글루타민, 및 비필수 아미노산으로 보충된 변형 이글스 배지(Eagle's medium)에서 유지되었다. 모든 세포주들은 5% CO2 가습 배양기에서 37 ℃로 배양되었다.
LacZ 또는 FAK (Ad-FAK-CD) 아미노산 693-1052를 코딩하는 우성 음성(dominant-negative) FAK 컨스트럭트를 포함하는 재조합 아데노바이러스는 노스캐롤라이나 대학의 유전자 치료 센터 바이러스 벡터 코어 기구(Gene Therapy Center Virus Vector Core Facility)에서 증폭되었다.
A375, SK-MEL-28 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(Rockville, MD)에서 입수하였다. C8161, FAK +/+ 및 FAK -/- 마우스의 배아 섬유아세포(MEF) 세포주는 William Cance 박사(로즈웰 파크 암 연구소(Roswell Park Cancer Institute), 버팔로(Buffalo), NY) 로부터 제공받았다. IGF-1R +/+ 및 -/- MEFs 는 Renato Baserga (코마스 제퍼슨 대학(Thomas Jefferson University), 필라델피아(Philadelphia), PA)에 의해 제공되었다.
멜라닌세포는 라이프 셀 테크놀로지(Lifeline Cell Technology)사로부터 입수하였으며, 더마라이프(DermaLife®) M 멜라닌세포 배양 배지(라이프 셀 테크놀로지, 워크스빌(Walkersville), MD)에서 유지되었다.
식도암 세포주
TE 및 KYSE 그룹 세포주는 Yutaka Shimada 박사 (토야마 대학(University of Toyama), 토야마, 일본)로부터 입수하였다. 식도암 세포주(Esophageal cancer lines)는 10% FBS, 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 RPMI 1640 배지에서 유지되었다. 모든 세포주는 37 ℃에서 5% CO2 가습 배양기에서 배양되었다.
췌장암 세포주
As-PCl, Bx-PC3, Panc-1 및 MiaPaca-2 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (락빌(Rockville), MD)으로부터 입수하였다. Panc-1 세포는 10% 소태아혈청(FBS) 및 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지에서 유지되었다. MiaPaca-2 세포는 10% FBS, 2.5% 말혈청(horse serum) 및 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지에서 유지되었다. 상기 As-PCl 및 Bx-PC3 세포주는 10% FBS, 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지되었다. 인간 췌장관 상피세포(human pancreatic duct epithelial (HPDE) cells) 는 Carol Otey 박사(노스 캐롤라이나 대학, 차펠 힐(Chapel Hill), NC)로부터 입수하였으며, L-글루타민, EGF&BPE 및 소이빈 트립신 억제제(soy bean trypsin inhibitor) (깁보/인비트로겐(Gibco/Invitrogen), 칼스배드(Carlsbad), CA)로 보충된 케라틴 세포-SFM 무혈청 배지(깁보/인비트로겐, 칼스배드, CA)에서 유지되었다. 모든 세포주는 5% CO2 가습 배양기에서 37 ℃로 배양되었다.
기타 세포주
FAK 넉아웃 마우스 배아 섬유아세포(embryonic fibroblast cells) (FAK -/- MEFs)는 William Cance 박사(로즈웰 파크, 버팔로, NY)로부터 입수하였으며, 10% 소태아혈청(FBS) 및 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지에서 유지하였다. IGF-1R 넉아웃 마우스 배아 섬유아세포(IGF-1R-/- MEF)는 Renato Baserga 박사(킴멜 암센터(Kimmel Cancer Center), 토마스 제퍼슨 대학, 필라델피아, PA)로부터 입수하였으며, 10% 소태아혈청(FBS) 및 1 ㎍/ml 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지에서 유지되었다. IGF-1R-/- 클론은 200 mg/ml의 히그로마이신(Hygromycin) B를 이용하여 선별하였다. MCF7, MCF10A 및 BT474 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC, 락빌, MD)에서 입수하였다. BT474는 10% 소태아혈청 및 인슐린 250 ug/ml으로 보충된 RPMI-1640에서 유지되었다. MCF7 세포는 10% 소태아혈청, 1X 비필수 아미노산(셀그로(Cellgro), 헌돈(Herndon), VA), 1 mM 소듐 피루베이트 및 500 ㎍/ml 인슐린으로 보충된 변형 최소 이글스 배지(Modified minimum Eagle's media)에서 유지되었다. 불멸화된 인간 유선 상피 세포주(immortalized human mammary epithelial cell line) MCF10A는 5% 말혈청(horse serum), 하이드로코티손(hydrocortisone) (0.5 ㎍/ml), 인슐린 (10 ㎍/ml), 표피성장인자(epidermal growth factor) (20 ng/ml), 및 페니실린-스트렙토마이신(100 ㎍/ml each)으로 보충된 둘베코 변형 이글스 배지 및 F12 배지 (DMEM-F 12)의 1:1 혼합액에서 배양되었다.
시약 및 항체: FAK siRNA는 다마콘 RNA 테크놀로지(Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO))로부터 입수하였다. NVP-AEW 541 및 TAE226 는 노바티스(Novartis (East Hanover, NJ))로부터 입수하였다. 항-FAK 모노클로날(4.47) 및 항-포스포(phospho)-티로신 모노클로날(4Gl0) 항체는 업스테이트(Upstate (Lake Placid, NY))로부터 입수하였다. 항-IGF-1R 항체는 칼바이오켐(Calbiochem (San Diego, CA))으로부터 입수하였다. 항-포스포-FAK (Tyr397) 및 항-포스포-Src 항체는 바이오소스(Biosource (Camarillo, CA))로부터 입수하였다. 항-포스포-EGFR, 항-EGFR, 항-포스포-Akt, 항-Akt, 항-포스포-ERKl/2, 항-ERKl/2, 항-사이씬 Bl 및 항-오로라(Aurora) B 는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology (Beverly, MA))에서 입수하였다. 항-카스파제 3 및 항-PARP 항체는 BD 바이오사이언스(BD Biosciences (San Jose, CA, catalogue #61 1038))로부터 입수하였다. 항-액틴 항체는 시그마(Sigma (St Louis, MO))로부터 입수하였다. 항-글리세랄알데히드 3-포스페이트 데하이드로기나제(GAPDH) 항체는 어드밴스드 이뮤노케미칼(Advanced Immunochemical (Long Beach, CA))로부터 입수하였다. 그리고, 실험에 사용된 다른 IGF-1R 및 FAK의 단백질 컨스트럭트는 발명자의 실험실에서 제조되었다.
TAE226은 노바티스(Novartis (East Hanover, NJ))로부터 입수하였다. 항-FAK (4.47) 및 항-포스포-티로신 모노클로날(4Gl0) 항체는 업스테이트(Upstate (Lake Placid, NY))로부터 입수하였다. 항-FAK(C20) 및 항-IGF-1Rb 항체(C20)는 산타 크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA))로부터 입수하였다. 항-His 및 항-GST 항체는 시그마(Sigma (Saint Louis, MS))로부터 입수하였다. 항-포스포-IGF-1 R 및 항-IGF-1R 항체는 칼바이오켐(Calbiochem (San Diego, CA))으로부터 입수하였다. 항-포스포-FAK (Tyr397) 는 바이오소스(Biosource (Camarillo, CA)) 로부터 입수하였다. 항-카스파제 8, 항-카스파제 9, 항-포스포-Akt, 항-Akt, 항-포스포-ERKl/2, 항-ERKl/2 항체는 셀 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology(Beverly, MA))로부터 입수하였다. BD 바이오사이언스(BD Biosciences) (Catalogue #61 1038, San Jose, CA로부터의 항-카스파제 3/7 및 항-PARP 항체는 전장(full length)을 인식하며, PARP의 비절단형(uncleaved form)이다다. 항-b-액틴 항체는 시그마(Sigma (St Louis, MO))로부터 입수하였다. 항-글리세랄알데히드 3-포스페이트 데하이드로기나제(GAPDH) 항체는 어드밴스드 이뮤놀로지(Advanced Immunochemical(Long Beach, CA)) 로부터 입수하였다.
MTT 시약은 포로메가(Promega (Madison, WI))로부터 입수하였다. CFSE 는 몰리큘라 프로브(Molecular Probes (Eugene, OR))로부터 입수하였다. TAE226 는 노바티스(Novartis(East Hanover, NJ))로부터 입수하였다. 젬시타빈(Gemcitabine (Gemzar))은 일라이 릴리(Eli Lilly (Indianapolis, IN, USA))로부터 입수하였다. 5-플루오로우라실(5-FU)은 시그마-알드리치 캐미칼(Sigma-Aldrich Chemical, Poole, UK)로부터 입수하였다. 재조합 인간 IGF-I는 R&D(Minneapolis, MN)로부터 입수하였다. 항-FAK 모노클로날(4.47) 및 항-포스포-티로신 모노클로날(4G10) 항체는 업스테이트(Lake Placid, NY)로부터 입수하였다. 항-FAK(C20) 항체 및 항-IGF-1Rb 항체(C20)는 산타크루즈 바이오테크놀로지(Santa Cruz, CA)로부터 입수하였다. 항-His 항체 및 항-GST 항체는 시그마(Saint Louis, MS)로부터 입수하였다. 항-포스포-IGF-1R 및 항-IGF-1R 항체는 칼바이오켐(San Diego, CA)로부터 입수하였다. 항-포스포-FAK(Tyr397) 및 항-포스포-Src 항체는 바이오소스(Camarillo, CA) 로부터 입수하였다. 항-src, 항-카스파제 8, 항-카스파제 9, 항-포스포-Akt, 항-Akt, 항-포스포-ERKl/2, 항-ERK 1/2는 셀 시그널링 테크놀로지(Beverly, MA)로부터 입수하였다. 항-카스파제 3/7 및 항-PARP 항체는 BD 바이오사이언스 (Catalogue #61 1038, San Jose, CA) 로부터 입수하였다. 이 PARP 항체는 전장(full length)을 인식하며, PARP의 비절단형(uncleaved form of PARP)이다. 항- b-액틴 항체는 시그마 (St Louis, MO)로부터 입수하였다. 항-글리세랄알데히드 3-포스페이트 데하이드로기나아제(GAPDH) 항체는 어드밴스드 이뮤노테크놀로지(Long Beach, CA)로부터 입수하였다.
세포 생존율 ( MTT ) 및 CFSE 증식 분석: 세포를 96-웰 접시에 넣고 부착될 수 있도록 밤새 배양하였다. 세포의 처리 후, 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 분석(CellTiter 96(R) Aqueous, Promega, Madison, WI)을 통해 세포 생존율을 측정하였다.
이탈율 분석(detachment assays)에 있어서는, 이탈 및 부착된 세포가 각각 수확된 다음 헤모사이토메터(hemocytometer)로 계수되었다. 이탈된 세포의 백분율은 이탈된 세포수를 총 세포수로 나누어서 계산하였다.
CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색하기 위해, 1 x 107/ml 세포가 PBS에 현탁된 다음, 37 ℃에서 5분 동안 l0 μM 의 CFSE로 배양되었다. 염색된 세포는 배지만으로, 또는 억제제를 포함하는 배지로 24, 48, 및 72시간 동안 배양되었으며, 고정된 다음, FACS 칼리버 사이토메터(Calibur cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA))로 분석되었다.
컴퓨터 도킹( Computational Docking ): FAK N-말단 도메인의 결정구조 (22) 및 IGF-1R(PDB 1P40A) (23) 키나제 도메인이 상기 기술한 바와 같이 컴퓨터를 이용한 그들의 상호작용의 분자 모델링에 사용되었다. 국립암센터(National Cancer Institute)의 데이터베이스인 NCI/DTP (Developmental Therapeutics Program)로부터 입수된 화합물 NSC344553(INT2-31)의 3-D 좌표가 FAK(아미노산 127-243)의 아미노 말단 및 IGF-1R (21)의 세포질 내 영역의 예상 인터페이스 상에 도킹되었다. 모든 도킹 계산은 캘리포니아 대학-샌프란시스코 DOCK 5.1 프로그램으로 수행되었으며, FAK (37)의 표적 부위를 나타내는 구(spheres)의 세트를 갖는 소분자 구조를 지향(orient)하기 위한 클릭-매칭 알고리듬(clique-matching algorithm)을 이용하였다. 표적 부위에서 NSC344553에 대해 100개의 지향(orientation)이 생성되었으며, 컴퓨터 프로그램 그리드-기반 스코어링 기능을 이용하여 스코어링 되었다. 도킹 계산은 플로리다 대학 하이 퍼포먼스 컴퓨팅 수퍼컴퓨팅 클러스터 (http:hpc.ufl.edu)상에서 수행되었다. NSC 344553이 FAK-NT2에 결합하는 모든 양태에 있어서의 분자간 에너지는 정전기력 및 반데르발스 에너지의 합으로 계산되었다. 이들 에너지 용어는 상관함수로 평가되었으며 패스트 푸리에 변환(Fast Fourier Transforms)으로 효과적으로 계산되었다.
GST -융합 단백질의 제조: FAK-GST 플라스미드 컨스트럭트 (pGEX 벡터)는 Elena Kurenova 박사(로즈웰 파크 암 연구소(Roswell Park Cancer Institute), 버팔로(Buffalo), NY)로부터 제공되었다. His-태그된태그된 IGF-1R 단백질은 블루 스카이 바이오테크롤로지(Blue Sky Biotechnology(워체스터(Worchester), MA))로부터 입수하였다. 상기 GST-융합 단백질(FAK 단편)은 BL21 (DE3) 대장균에서 0.2 mM 이소프로필 b-D-갈락토피라노시드(IPTG)와 함께 6시간 동안 37 ℃에서 배양되어 발현되었다. 상기 세균은 초음파로 용혈되었으며, 상기 융합 단백질은 글루타치온-세파로스 4B 비드 (GE Healthcare, NJ)로 정제되었다.
풀-다운 분석( Pull - down assay ): 풀 다운 결합 분석을 위해, His-태그된태그된 IGF-1R 단편 단백질(200 ng)은 글루타치온-세파로스 4B 비드 상에 부착된 GST로 초기 세정되었다. 상기 초기 세정된 His-태그된 단백질은 0.2 ㎍의 글루타치온-세파로스 4B 비드 상에 부착된 GST-FAK 융합 단백질과 함께 1시간 동안 4 ℃에서 배양된 후, 3X PBS로 세척되었다. 동일한 양의 GST-융합 단백질이 각각의 결합 분석에 사용되었다. 결합한 단백질은 6x 램리(Laemmli) 버퍼에서 끓인 후 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅으로 분석되었다.
면역침강 및 웨스턴 블롯: 세포는 얼음으로 냉각된 1x PBS로 2회 세척되었으며, 및 20 mM 트리스(Tris), pH 7.4, 150mM NaCl, 1% NP-40, 5mM EDTA 애시드, 프로테아제 억제제(컴플리트TM 프로타아제 억제제, 로슈(Roche), NJ) 및 포스파타제 억제제(칼비노켐(Calbiochem), CA)를 포함하는 버퍼에서 용혈되었다. 면역침강을 위해서, 100-200 ㎍의 총 세포 추출물이 각 샘플로 사용되었다. 상기 추출물은 1 ㎍의 항체와 4 ℃에서 밤새 배양되었다. 그런 다음, 25 μl의 단백질 A/G-아가로즈 비드가 첨가되었으며, 샘플들은 2시간 동안 4 ℃에서 배양되었다. 상기 침강물은 용혈버퍼로 4회 세척되었으며, 30 ㎍의 단백질을 포함하는 샘플들은 SDS-PAGE로 분석되었다. 웨스턴 블롯에서 나타나는 밴드의 강도는 사이언 이미지 분석 소프트웨어 프로그램(scion image analysis software program)으로 측정되었다.
세포의 짧은 헤어핀 RNA 형질주입( Transfection ): 대조군 shRNA (비감염된(mock)) 및 FAK shRNAs 는 오픈 바이오시스템스(Open Biosystems)로부터 입수되었다. 인간 FAK에 대한 짧은 헤어핀 RNAs 의 염기서열은 다음과 같다: (5'- CCGGCCGATTGGAAACCAACATATACTCGAGTATATGTTGGTTTCC AATCGTTTTG-3' ; 5'-CCGGGCCC AG AAG AAGG A ATC AGTTCTCG AG AACTGATTCTTCTTCTGGGCTTTTTG-S') 및 대조군 shRNA (비감염된) (5'-TCCGAACGTGTCACGTTCTCTTGAAACGTGACACGTTCGGAGA-3').
세포의 형질주입(2xlO<5> 세포/웰)을 위해 세포는 형질주입 하루 전 6-웰 배양접시의 2ml의 배지에 접종되었다. 제조사의 프로토콜에 따라, 세포는 리포펙타민(Lipofectamine) 2000 시약(인비트로겐(Invitrogen), CA)을 이용하여 형질주입되었다.
GFP -융합된 FAK 컨스트럭트 및 형질주입
FAK-NTl(a.a. 1-126), FAK-NT2(a.a. 127-243), 및 FAK-NT3(a.a. 244- 415) 가 유전자 특이적 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭되었으며 pEGFP- C2 벡터(클로네테크(Clonetech), 마운틴뷰(Mountain View), CA)에 클로닝되었다. 모든 염기서열은 자동 시퀀서(ICBR Sequencing Facility, 플로리다 대학)로 분석되었다. FAK 단편을 과발현시키기 위해, 플라스미드 pEGFP-F AK-NTl, pEGFP-FAK-NT2 및 pEGFP- FAK-NT3를 리포펙타민 2000(인비트로겐, CA)으로 제조사의 지시에 따라 세포에 형질주입되었다.
세포주에 대한 안정적인 형질도입
췌장암 세포주, Panc-1 및 Mia paca-2의 감염은, Lung-ji Chang 박사의 연구실에서 수행되었다. 루시퍼라제 발현을 위한 렌티바이러스 벡터가 RD-0637 및 RD-0633 프로토콜로 플로리다 대학에 등록되었다.
췌장암 세포주들은 트립신으로 처리되고 카운트되었다. 상기 세포는 이후 24-웰 트레이에 넣어져 60-80% 컨플루언트(confluent)에 이르기까지 37 ℃에서, 가습상태의 5% CO2-95% 대기 조건으로 배양되었다. 각각의 웰에 대해, 렌티바이러스 입자를 포함하는 10 μl의 반딧불(firefly) 루시퍼라제 및 적색 형광 단백질 (RFP)이 배지에 첨가되었다. 혼합을 위해 가볍게 상기 접시를 흔든 다음, 37 ℃로 가습 배양기에서 5% CO2 조건으로 배양되어 최적의 형질도입이 효과적으로 일어나도록 하였다. 4시간 후 바이러스를 포함하는 배지는 신선한 배지로 교체되었다. RFP의 발현 및 세포의 플로우 사이토메트릭 분류(flow cytometric sorting)를 기반으로, 형질도입된 세포의 순수한 군집을 수득하였다.
이탈율 분석: 세포는 배양접시에 넣어져 화합물의 존재 또는 부재 하에서 24, 48, 및 72시간 동안 배양된 후, 이탈 및 부착된 세포가 헤모사이토메터로 카운트되었다. 이탈의 백분율은 이탈된 세포수를 총 세포수로 나누어서 계산되었으며, 실험은 3회 중복 실시되었다.
세포사멸 분석: 처리 후, 이탈 및 부착된 세포는 수집 및 카운트된 다음, APO-BRDU 키트 (BD Pharmingen, San Diego, CA)를 이용하여 터미널 유리딘 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 (terminal uridine deoxynucleotidyl transferase (TUNEL)) 분석을 위해 준비되었으며, FACS 카리버 사이토메터 (Becton Dickinson, San Jose, CA)로 분석되었다. 또한, 사멸된 세포는 Hoechst 33342 염색(l ㎍/ml)으로 분석되었다. 사멸된 세포의 백분율은 사멸된 세포수의 총 세포수에 대한 비율로 계산하였다. 카스파제 3/7의 활성화 측정을 위해, 2000 세포는 2% 젤라틴 코팅 플레이트의 유리 바닥 상에 플레이팅되어 형광의 활성이 공초점 현미경으로 관찰되었다.
Hoechst 염색
또한, 사멸(apoptotic)된 세포는 Hoechst 염색에 의해서도 분석하였다. 상기기술된 바와 같이 준비된 세포에 Hoechst 33342 (1 ㎍/ml)가 추가되었으며, 10분 동안 상온의 암실에서 배양된 후, 시료는 유리 커버슬립에 설치 되었다. 상기 슬라이드는 자이스(Zeiss) 현미경 상에서 사멸세포의 핵을 관찰되었다. 사멸된 세포의 백분율은 사멸된 세포의 총 세포수에 대한 비율로 계산되었다. 샘플마다 300 세포를 초과하여 분석되었다.
카스파제 3/7 사멸( Apoptosis ) 분석
처리된 세포에서 세포사멸의 확인으로 활성화된 카스파제 3/7 효소를 검출하기 위하여, Apo-ONE(R) 카스파제-3/7 시약 키트(프로메가(Promega), 매디슨(Madison), WI)가 사용되었다. 2000 세포는 96-웰 유리 바닥 플레이트에 놓여지고 각기 다른 농도의 화합물로 처리되었다. 처리 후, 24, 48 및 72시간 후, 세포는 10 μL의 전형광(profluorescent) 카스파제-3/7 컨센서스 기질, 로다민(rhodamine 110 비스-(N-CBZ-L-아스파르틸-L-글루타밀-L-발일-아스파르틱 애시드 아미드) (Z- DEVD-R110)로, 30분 동안 상온의 암실에서 배양되었다. 카스파제-3/7 효소에 의해 DEVD 펩티드 기질의 서열에서 아스파테이트 잔기의 C-말단 부위에서 절단 시, 로다민 110이 498nm의 파장에서 여기될 때 형광을 나타낸다. 상기 에미션(emission) 최대값은 521nm이다. 생성된 형광 산물의 양은 샘플 내에 존재하는 활성 카스파제 3/7의 양과 상응한다. 이미지화는 LAS-AF 이미징 소프트웨어를 사용하는 라이카 TCS SP5 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로, 40x 오일 대물렌즈를 이용하였다.
키나제 프로파일러 스크리닝( Kinase Profiler Screening ): 키나제 특이성 스크리닝은 인비트로젠의 셀렉트스크린(Invitrogen's SelectScreen®) 키나제 프로파일링 서비스를 이용하였다
http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/ Services/Discoverv-Research/SelectScreen-Profiling-Service/SelectScreen- Kinase-Profiling-Service.html. 상기 스크리닝은 l μM 화합물, INT2-31, 10 μM ATP, 및 키나제 기질을 이용하여 Z'-LYTE(TM) 키나제 분석법에 따른 10개의 재조합 키나제에 대해 수행되었다. PI3 키나제 활성을 위해, l00 μM ATP 및 키나제 기질이 인비트로젠 아탑타(Invitrogen Adapta(R)) 유니버셜 키나제 에세이 프로토콜을 통해 사용되었다.
누드 마우스 생체 내에서의 종양의 성장( Tumor Growth in Nude Mice in vivo ): 6주령의 무흉선(athymic), 암컷 누드 마우스를 Harlan 연구실로부터 구매하였다. 상기 마우스는 동물 사육시설에서 유지되었으며, 모든 실험은 NIH 동물-사용 가이드라인에 따라 IACUC가 승인하는 프로토콜 하에서 수행되었다. 5x106의 흑색종 세포를 피하(subcutaneously) 주입하였다. 종양의 크기가 100 mm3에 이르면, 상기 INT2-31을 21일 동안 매일 15 mg/kg의 양으로 복강주사하였다. 종양의 직경은 캘리퍼로 측정되었으며, 종양의 부피는 mm3단위로 [(너비)2 x 길이]/2의 공식을 이용하여 측정되었다. 실험의 막바지에, 종양의 무게 및 부피를 측정하였다.
흑색종 이종이식
흑생종 연구를 위해, 플로리다 대학 IACUC 는 하기의 프로토콜을 승인하였다(IACUC Study #200801077). 흑색종 세포는 5 x 106으로 피하주사 되었다. 상기 종양의 크기가 100 mm3에 이르면, 상기 INT2-31을 21일 동안 매일 15 mg/kg의 양으로 복강주사 하였다. 종양의 직경은 캘리퍼로 측정되었으며, 종양의 부피는 mm3단위로 [(너비)2 x 길이]/2의 공식을 이용하여 측정되었다. 실험의 막바지에, 종양의 무게 및 부피를 측정하였다.
환자 대상체 및 이종이식
본 연구에 있어서의 인간을 대상체로 하는 이용은 검토된 연구를 위한 고형의 식도암 및 췌장암 조직을 얻기 위한 한 가지 목적이었으며, 플로리다 대학 헬스 센터 인스티튜션 리뷰 보드(IRB)로부터 프로토콜 # 276-2008 및 321-2005 하에서 특별한 승인을 이미 취득하였다.
인간 식도암 및 췌장암 환자로부터의 종양샘플에 대해서는 플로리다 대학 IACUC가 하기의 프로토콜(IACUC Study# 2000902767)을 승인하였다. 총 25명의 환자로부터, 10개의 췌장암 및 15개의 식도암이 동정되어 누드 마우스에게 이식되었다. 최초에는 플로리다 대학 샌즈(Shands) 병원의 외과적 시료로부터 인간의 췌장암 및 식도암에 대한 신선한 작은 절편(0.3 x 0.3 x 0.3 cm)을 얻었으며, 각 환자에 대해 2마리씩 그룹을 이룬 마우스에 피하이식되었다. 식도암 시료에 있어서, 이식된 시료 중 하나가 1.5cc에 이르면, 이는 절제되어 작은 절편(0.3 x 0.3 x 0.3 cm)으로 나누어 졌으며, 다른 10마리의 마우스에 피하이식되었다. 종양이 ~ 100 mm3에 이르면, 각 그룹당 5마리씩 하기의 그룹으로 무작위 분류되었다.
그룹 1 : 대조군: 무처리.
그룹 2: INT2-31 (화합물 31): 21일 동안 50 mg/kg/하루의 양으로 50 μL 를 복강투여(i.p administration). 이 약물은 이전에 본 발명자의 연구실에서 테스트된 바 있으며, 상기 양에서 측정가능한 독성은 없었음.
마우스는 종양의 접종 후 30~40일 후 안락사되었으며, 종양 및 조직이 수집되었다. 본 발명자의 피하모델에서 종양증식의 억제에 대해서는, 종양의 부피(길이 x 너비 x 높이 p/6) 및 체중을 주말과 휴일을 포함하여 매일 측정함으로써 종양의 증식 및 제반 임상학적 상태를 모니터링 하였으며, 체중의 감소 및 고통, 스트레스, 또는 이상 행동 및 생리에 대한 수치들도 고려하였다. 실험은 대조군 평균 종양 부피가 1.5cc일 때 종료되었다(약 30~40일).
항종양활성은 T/C% ((실험군 동물의 평균 종양부피 증가량/대조군 동물의 평균 종양부피 증가량)x100)로 표현되었다.
췌장암의 정위모델 ( Orthotopic model )
췌장암의 정위모델을 위해 플로리다 대학 IACUC는 하기의 프로토콜을 승인하였다(IACUC Study# 2000801506). 췌장암 세포주 Mia paca-2 및 Panc-1 세포는 이종이식의 생체 내의 이미징을 위한 루시퍼라제-RFP(적색 형광단백질) 리포터 유전자를 이용하여 안정적으로(stably) 형질주입되었다.
이후의 확장(expansion) 및 RFP 양성 세포에 대한 분리를 통해, 세포는 배양액 내에서 확장되었으며, 5x106 의 종양세포가 20마리 마우스의 췌장으로 이식되었다. 세포의 췌장 내 이식을 위해, 마우스는 제공된 ACS를 이용하는 이소플루란(Isoflurane)으로 마취되어 설치류의 마취 기구에서 유지되었다. 외과적인 멸균상태 하에서, 피부, 복벽(abdominal wall) 및 복막(peritoneum)의 1.0 cm 절제를 통해, 비장(spleen)을 리트랙트(retract)하여 세포를 29-게이지 주사바늘을 이용하여 30 μL 부피로 췌장의 꼬리부분에 주사하였다. 상기 복벽 및 복막은 5.0 흡수성 외과 봉합사로 봉합되었으며, 피부는 의료용 접착제(dermabond)로 접합되었다. 술후 진통(Postoperative analgesia)에는 0.05 mg/kg의 부프레노르핀(buprenorphine)을 술후 8~12시간마다 피하투여되었다. 종양이 ~ 100 mm3에 이르면, 각 그룹의 3마리씩, 하기의 4그룹으로 마우스들이 무작위 분류되었다:
- 그룹 1 : 대조군: 무처리.
- 그룹 2: 겜시타빈(Gemcitabine): 40 mg/kg으로 50 μL 씩 3주간 매 5 일마다 복강투여.
- 그룹 3: INT2-31: 15 mg/kg/일로 50 μL씩 복강투여
- 그룹 4: 겜시타빈 및 INT2-31 처리의 조합
마우스는 복강주사에 앞서 사지가 결박되었다. 마우스는 종양의 접종 후 6주차에 안락사되었으며, 종양 및 조직이 수집되었다. 하기에 기술된 바와 같이, 마우스는 IVIS 루미나 이미져(lumina imager)로 매주 이미지화되었으며, 종양의 크기는 생물발광(bioluminescent) 신호로 측정되었다.
마우스의 생체수준 이미징( In Vivo Imaging of Mice )
생물발광 표지를 발현하는 모든 종양함유 마우스에 대해 비침습식 이미징이 수행되었다. 상기 IVIS 루미나 플랫폼은 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 종양에 사용되었다. 상기 이미징을 완수하기 위해, 마우스는 제공된 ACS를 이용하는 이소플루란으로 마취되어 설치류 마취 기구에서 유지되었다. 생활 이미지 수득(Living Image acquisition) 및 분석 소프트웨어(Version 2.11, Xenogen)를 구비한 극저온으로 냉각된 IVIS 이미징 시스템(Xenogen)이 마우스의 생물발광 신호를 탐지하는데 사용되었다. 루시퍼라제 리포터 유전자를 발현하는 종양을 가진 마우스에 대해서는, 이미징 이전에, 복강 또는 피하로 루시페린(Xenogen Corp., Alameda, Calif.)이 kg 체중 당 150 mg의 양으로 25-27 g 주사바늘을 이용하여 100 μL 로 주입되었다. 상기 주사 영역은 일반적인 외과적 소독약으로 세정되었으며, 모든 용액들은 멸균상태로서 플로리다 대학의 약물 규정을 만족시켰다. 10분 후, 상기 마우스는 상기와 같이 마취되었고, 가열된 샘플 선반에 놓여졌다. 이미징 시스템은 우선 챔버 내에서 낮은 광량으로 사진을 얻었으며; 이후 발광성 이미지를 얻었다. 모든 마우스 종양 모델에 대해 1분의 취합시간(integration time)이 주어졌다. 생활 이미지 소트프웨어는 마우스로부터 얻어진 총 생물발광 신호(광자의 숫자에 대해)를 취합하는데 사용되었다. IVIS 이미징 시스템의 시험관 수준에서의 검출 한계는 1,000 ES-2/luc 세포이다.
각 동물은 6주간의 기간 동안 1주 이하로 연구되었다. 발광신호에 근거하여 종양의 크기는 손쉽게 측정되었다. 42일차 또는 종양의 크기가 1.5cc에 이르면, 마우스는 안락사되었다.
면역조직화학( Immunohistochemistry ): 이종이식된 종양 조직은 10% 포르말린으로 고정되었으며, 파라핀에 임베딩되었다. Ki-67 염색을 위해, 시료들은 탈파라핀화되고, 항원이 제거된 후, 1차 항체, Ki-67(Dako M7240)가 1:200 농도로 4<0>C에서 철야 배양되었다. 상기 조직은 색소원(chromogen) DAB으로 염색되었으며, 헤마톡실린 및 1% TBS로 대비염색(counterstain)되었다.
사멸세포(apoptotic cell)에 대한 평가를 위해, 제조사의 지시에 따라 Dead EndTM Calorimetric TUNEL System(프로메가(Promega), 메디슨, WI)을 이용한 염색이 수행되었다. 사멸세포의 백분율은 고배율(high power field)에서 적어도 400개의 세포를 카운트하여 측정하였다.
통계적 분석: 유의성 검증에 Student's t-테스트가 사용되었다. 데이터간의 차이는 p<0.05일 때 유의적인 것으로 간주되었다.
ELISA 테스트
두 가지 다른 효소-연관 면역용매(immunosorvent) 분석이 IGF-1R 베타 서브유닛 및 FAK-NT 간의 결합을 연구하기 위해 수행되었다. 첫 번째 분석은 고정화된 FAK-NT와 IGF-1R 간의 상호작용을 포함하였으며; 두 번째 분석은 고정화된 IGF-1R과 FAK-NT간의 상호작용을 포함하였다.
첫 번째 경우에, 96-마이크로타이터 플레이트의 웰(well)은 50 μl의 PBS (염화나트륨 137 mM, KCl 2.7 mM, Na2HPO4 4.3 mM, KH2PO4 1.4 mM)에 정제된 FAK의 GST-융합 FERM 도메인에 의해 4 ℃에서 철야로 코팅되었다. 이후 웰은 세척용액(PBS, 0.05% 트윈)으로 세척되고, 200 μl의 블로킹 용액(PBS, 1% BSA)으로 3시간 동안 37 ℃에서 블로킹되었다. 세척용액으로 3회 세척한 후, 화합물이 있거나 없는 상태에서, 0.2 μM의 정제된 IGF-1R 전장 단백질을 포함하는 100 μl의 결합용액(PBS, 0.05% 트윈, 1% BSA)이 상기 웰에 첨가되었으며, 37 ℃에서 1시간 동안 반응되었다. 웰은 다시 3회 세척된 후, 200 ng/ml의 1차 항체 항-IGF-1R(sc-613 싼타 크루즈(Santa Cruz))을 포함하는 100 μl의 결합용액이 추가되고, 1시간 동안 37 ℃에서 배양되었다. 3회의 추가 세척 후, 2차 HRP 항-토끼 항체를 포함하는 100 μl의 동일한 용액이 첨가되어 37 ℃에서 1시간 더 배양되었다. 마지막으로, 100 μl의 ABTS 기질(2,2'-아지노비스[3-에틸벤조티아졸린-6-설포닉 애시드]-디암모니움 염)이 적용되었으며, 상기 플레이트는 양성 대조군이 색깔의 강도가 최고치를 나타내고, 음성 대조군이 비특이적 반응을 일으키지 않을 (6-10 분)때까지 암실에서 유지되었다. 상기 ELISA 플레이트는 450 nm에서 바이오텍 ELISA 리더로 스캐닝 되었다.
두 번째 분석을 위하여, IGF-1R이 웰에 고정화되어 FAK-NT와 배양된 것을 제외하고는 동일한 방법이 사용되었다. 1차 항체 항-FAK-4.47(05-537, 업스테이트(Upstate))가 결합 반응을 밝히기 위해 사용되었다.
바이아코어 ( BIACORE ) 분석
FAK 및 IGF-1R의 상호작용 부위를 표적으로 하는 소분자 화합물의 열동학적 결합 파라미터(thermodynamic binding parameters)를 규명하기 위해 ELISA와 연계하여 바이아코어 Tl00 테크놀로지가 사용되었다.
모든 실험은 바이아코어 Tl00 옵티컬 바이오센서를 이용하여 수행되었다(http://www.biacore.com). 시리즈 S CM5 센서칩, N-히드록시숙시니미드(hydroxysuccinimide)(NHS), N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필) 카보디이미드(EDC), 에탄올아민 HCl, 및 기기에 특이적인 소모품 및 악세서리들은 플로리다 대학의 ICBR로부터 제공되었다.
FAK - NT 고정화
FAK 및 IGF-1R 모두에 대해 센서칩을 재사용하기 위해, 항-마우스 2차 항체가 센서칩 표면에 고정화되었다. 이는 상기 1차 항체가 표면 상에 리간드 단백질을 고정화하도록 하는데 사용되도록 하고, 또한 상기 칩 표면에 단백질을 고정화시키는 동안 단백질의 상호작용 부위가 가려질 가능성을 제거하기 위한 것이다.
고정화 과정은 헤페스-버퍼드 샐린(Hepes-buffed saline) (HBS: 10 mM 헤페스 및 150 mM 염화나트륨, pH 7.4)을 전개용액(running buffer)으로 사용하여 진행되었다. 센서칩 표면은 우선 100 μl/분의 유속으로 100 mM 염산, 50 mM 수산화나트륨, 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 각각으로 각각 6-초(6-s) 펄스로 전처리되었다. 항-마우스 항체 표면은 아민-커플링화학을 이용하여 30 ℃, 10 μl/분 유속으로 준비되었다. NHS/EDC는 표면을 활성화시키기 위해 15분 동안 주사되었으며, 100 μg/ml 항체 (10 mM 소듐 아세테이트에 용해된, pH 4.5)가 10분 동안 주사되었고, 마지막으로 에탄올아민이 잔여 활성 그룹을 블로킹하기 위해 7분 동안 주사되었다. 이러한 고정화과정을 통해 고정화된 항체 5000 내지 7000 레조넌스 유닛(resonance unit, RU)이 얻어졌다. 고정화 이후에, 상기 기기는 분석 전개 용액(analysis running buffer) (50 mM Tris-HCl, 150 mM 염화나트륨, 10 mM MgCl2, 0.1% 트윈 20, 0.1% Brij-35, 및 5% 디메틸 술폭시드 [DMSO], pH 8.0)으로 강하게 프라임(prime)되었다. 항-마우스 항체의 고정화 이후, 100 μg/ml 마우스-항-FAK 4.47 항체(05-537, 업스테이트) (10 mM 소듐 아세테이트에 용해된, pH 4.5)가 10분 동안 주사되었으며, 센서칩 표면은 결합하지 않은 항체를 제거하기 위해 100 mM 염산, 50 mM 수산화나트륨, 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 각각으로 유속 100 μl/분에서 3회 5-초 펄스 처리되었다. 이러한 고정화 과정을 통해, 고정화된 1차 항체 15000 내지 20000 레조넌스 유닛(RU)이 얻어졌다. 마지막으로, 200 ㎍/ml FAK-NT(10 mM 소듐 아세테이트에 용해된, pH 4.5)가 10분 동안 주사되었으며 센서칩 표면은 100 mM 염산, 50 mM 수산화나트륨, 및 0.1% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 각각으로 유속 100 μl/분에서 3회 5-초 펄스 처리되었다. 이러한 고정화 과정을 통해 고정화된 FAK-NT의 30000 내지 40000 레조넌스 유닛(RU)이 얻어졌다.
IGF -1R의 포집
IGF-1R의 분획은 사용 시까지 -80 ℃에서 동결보존되었다. 갓 준비된, 200 ㎍/ml IGF-1R (10 mM 소듐 아세테이트에 용해된, pH 4.5)이 10분 동안 주사되었으며, 결합하지 않은 단백질은 상기 용액을 패스트 디솔팅 컬럼(50 mM Tris-HCl, 150 mM 염화나트륨, 및 10 mM 염화마그네슘으로 평형화된, pH 8.0)에 2차례 통과함으로써 제거하였다. 상기 포집 과정을 통해 FAK-NT 표면에 통상 2000- 4000 RU)의 밀도가 25 ℃에서 얻어졌다. 1차 항체가 레퍼런스로 사용된 표면에 결합되었다.
분석물 용액( analyte solution )의 제조
보존용액(stock solution)으로, 화합물은 100% DMSO에 10 mM 농도로 용해되었으며; 분석 바로 직전에 DMSO 및/또는 전개용액에 상기 화합물 스톡은 추가적으로 희석되었다. 상기 분석물 및 전개용액의 DMSO 함량을 정확히 맞추기 위해, 50 μl의 제 2 보존용액을 1ml의 50 mM Tris-염산, 150 mM 염화나트륨, 10 mM 염화마그네슘, 0.1% 트윈 20, 및 0.1% Brij-35(pH 8.0)에 첨가하여 분석용으로 선택된 고농도 보다 9배 더 높은 화합물 농도가 되도록, 화합물을 DMSO에 희석함으로써 저농도의 제 2 보존용액을 준비하였다. 이 출발 농도(starting concentration)가 분석 전개용액에 9배 희석됨으로써 고농도가 얻어졌다. 제조된 샘플에 대한 추가의 9배 희석으로 저농도를 제조하였다. 고농도와 저농도 분석물의 농도상의 오류는 약 3.0%가 되도록 계산되었다.
분석 파라미터 ( Analysis parameters )
각각의 온도 하에서, 5개의 용액 블랭크(blank)가 기기를 완전히 평형상태로 만들기 위해 우선 주사되었다. 50 μl/분의 유속으로, 화합물은 30 내지 60초 동안 주사되었으며 해리(dissociation)는 1 내지 20분 동안 모니터링되었다. (상기 선택된 주사 및 해리시간은 예비 결합 테스트에서 결정되었다.) 강하게 결합된 복합체에 대해서는, 재생단계(regeneration step)가 요구되었다. 4 내지 11 ℃에서, 상기 표면은 60% 에틸렌글리콜로; 16 내지 18 ℃에서는 40% 에틸렌 글리콜로; 22 내지 28 ℃에서는 30% 에틸렌 글리콜로; 및 32 내지 39 ℃에서는 50 mM Tris-염산, 150 mM 염화나트륨, 10% 에틸렌 글리콜, 15 mM ATP, 15 mM 염화마그네슘, 5% DMSO, 및 0.1% 트윈 20 (pH 8.0)으로 10회 100-초 펄스로 재생되었다. 데이터 수집율은 10 Hz였다.
데이터 분석
스크러버 2(바이오로직 소프트웨어(BioLogic Software), 호주)를 이용하여 가공되고 분석된 바이오센서 데이터는 단순한 1:1 모델 (A + B = AB) 또는 대량전송 텀(mass transport term)을 포함하는 1 :1 상호작용 모델 (Ao = A, A + B = AB)과 일치하였다. 스크러버에서 결정된 평형 이탈 상수(Equilibrium dissociation constants)는 반트 호프 방정식(van't Hoff equation ln(KD) = △H°/RT-△S°/R)과 일치하였다. (통합형태의 사용에도 불구하고 △Cp° 텀을 포함하는 반트호프 방정식이 고려되었으며, ln(KD) 대 1/T 플롯에서의 곡률(curvature)의 부족함은 이러한 접근방법이 불필요했음을 나타낸다.) △H°대 △S°의 비는 마이크로소프트 엑셀의 솔버 매크로(Solver macro)를 이용하여 직접 구하였다. △H°및 △S°값은 엑셀의 회귀 기능을 이용하여 ln(KD) 대 1/T 플롯의 선형 회귀 분석(linear regression analysis)을 통해 간접적으로 결정되었으며, 이 경우 기울기(slope) 및 절편(intercept)은 △H°/R 및 △S°/R에 각각 상응하였다. 솔버에 의한 △H°및 △S°의 피팅 오차는 솔버에이드 (SolverAid (http://www.bowdoin. edu/~rdelevie/excellaneous))로 불리는 다운로드 가능한 매크로를 통해 얻을 수 있었다. 회귀 루틴으로부터의 △H°및 △S°파라미터의 오차는 마이크로소프트 엑셀의 통계적 리드아웃으로부터 직접 구하였다. 상기 두 가지 방법으로부터 얻어진 값들은 잘 일치하였다. 엑셀에서는 △z2=(∂f/∂x)2△x2+(∂f/∂y)2△y2+... 에 따라 표준 오차가 발생하였다. 프로그램된 공식은 우선 다운로드가 가능한 매크로 프로파게이트를 이용하여 체크하였다 (http://www.bowdoin.edu/~rdelevie/ excellaneous에서도 이용가능).
실시예 1
소분자들의 데이터베이스
The NCI/DTP 는 비전매(non-proprietary)의 약 250,000 샘플(즉, 플레이팅 된 화합물의 세트)에 대한 보관소를 유지하고 있으며, 암, 에이즈, 또는 암 또는 에이즈를 앓고 있는 대상을 괴롭히는 기회감염의 치료를 위한 신약의 발견 및 개발을 위한 연구소에 제공한다. NCI/DTP의 플레이팅된 화합물 세트에 대한 3-D 좌표는 MDL SD 형식 (http://www.chm.tu-dresden.de/edv/vamp65/REFERS/vr_03d.htm)으로 얻어지며, DOCK 유틸리티 프로그램 SDF2MOL2에 의해 mol2 형식으로 전환된다. 리간드에 대한 반데르발스, 부분적인 원자의 전하, 및 용매화 에너지 파라미터는 SYBDB를 이용하여 계산되었으며, 플레이팅된 화합물 세트 mol2파일에 추가되었다.
실시예 2
FAK / IGF -1R에 대한 잠재적인 소분자 억제제를 동정하기 위한 데이터베이스 스크리닝
대량처리(high-throuput) 스크리닝을 수행하는 대신, 컴퓨터 모형구조(in silico)(in silico)로 분자수준의 도킹과 기능적 테스트를 조합하는 구조-기반 접근법이 수행되었다. 공지된 3-D 구조의 화합물의 거대한 라이브러리는 인간 FAK (PDB 코드 1K05)의 결정 구조 상의 SPHGEN(UCSF)에 의해 선택된 구조적인 포켓에 위치한다. 약물-유사 특징을 갖는 250,000 개의 소분자 화합물(리핀스키 법칙(Lipinskirule)을 따르는)은 DOCK5.1 컴퓨터 프로그램(UCSF)를 이용한 100가지의 다른 방향성으로 FAK와 IGF-1R 간의 상호작용 부위로 도킹되었다. DOCK의 일반적인 양상은, 수용체 구(sphere)에 대한 정밀한 지향(orienting), AMBER 에너지 계산, GB/SA 용매화 계산, 접촉(contact) 계산, 내부 미결합 에너지 계산, 리간드 유연성, 및 정밀하면서도 뒤틀림이 있는 단순 최소화(rigid and torsional simplex minimization)를 포함한다.
FAK 및/또는 IGF-1R 억제제 화합물을 선택하기 위한 모델을 위해 하기의 서열이 사용되었다.
FAK aa 126-243:
ssvr ekyelahppe ewkyelriry lpkgflnqft edkptlnffy qqvksdymle iadqvdqeia lklgcleirr sywemrgnal ekksnyevle kdvglkrffp kslldsvkak tlr
IGF-1R aa 959-1266:
hrkrnnsrlgng vlyasvnpey fsaadvyvpd ewevarekit msrelgqgsf gmvyegvakg wkdepetrv aiktvneaas mrerieflne asvmkefnch hvvrllgvvs qgqptlvime lmtrgdlksy lrslrpemen npvlappsls kmiqmageia dgmaylnank fvhrdlaarn cmvaedftvk igdfgmtrdi yetdyyrkgg kgllpvrwms peslkdgvft tysdvwsfgv vlweiatlae qpyqglsneq vlrfvmeggl ldkpdncpdm lfelmrmcwq ynpkmrpsfl eiissi
몰당 -17.7kcal의 DOCK 스코어가 제공된 가장 높은 점수의 화합물과, 각 화합물과 상호작용 부위 간의 상호작용의 예측된 결합에너지가 측정된다. 가장 높은 점수를 기록한 화합물은 NCI/DTP로부터 기능적 테스트를 요청 받게 된다. 선택된 소분자 화합물은 식도암(KYSE 140), 흑색종(C8161, A375) 및 췌장암(Panc-1) 세포에서 세포 기반 증식 및 세포사멸 분석을 통해 검증되었다.
NCI/DTP 가 플레이팅한 화합물 세트에 대한 3-D 좌표는 MDL SD 형식으로 얻어지며, DOCK 유틸리티 프로그램 SDF2MOL2에 의해 mol2 형식으로 전환된다. 리간드에 대한 반데르발스, 부분적인 원자의 변화, 및 용매화 에너지 파라미터는 SYBDB를 이용하여 계산되었으며, 플레이팅된 화합물 세트 mol2파일에 추가되었다.
실시예 3
세포증식 분석: 셀타이터 96 수용성 원 용액(aqueous one solution)을 이용한 세포 증식 분석(Cell proliferation assay, Promega)이, 배양 웰에 소량의 상기 원 용액 시약을 직접 첨가하고, 1-4시간 배양한 다음, 분광광도계 플레이트 리더로 490 nm에서의 흡광도를 측정하여 수행되었다. 490 nm 흡광도의 양으로부터 측정된 포르마잔 산물의 양은 배양액 내의 살아있는 세포의 수에 직접적으로 비례하였다.
실시예 4
아데노 바이러스 감염:
세포는 6 x 103 또는 2 x 105의 밀도로 배양 접시에 플레이팅되어 24시간 동안 부착되었다. 상기 세포는 이후 세포당 50-500의 감염 또는 포커스-형성 유닛(FFU)의 바이러스 농도를 갖는 아데노 바이러스로 감염되었다{Golubovskaya,V. 그 외, J. Biol. Chem., 277, 2002, 38978-38987 참조). 이러한 최적의 바이러스 타이터는 세포를 다양한 양의 Ad-GFP로 감염시켜 형광 현미경으로 감염 백분율을 가시화함으로써 측정되었다. 세포당 100 FFU의 Ad-GFP은 95% 감염율을 나타내었다. 세포는 감염 48 또는 72시간 후 추가적인 실험을 위해 사용되었다.
실시예 5
siRNA 형질주입 분석: 세포는 6 x 103의 밀도로 60 mm 직경의 배양 접시에 플레이팅되거나, 2 x 105의 밀도로 100 mm 직경의 배양 접시에 플레이팅되어 24시간 동안 부착되었다. 상기 세포는 1-10 nM의 FAK siRNA 또는 비특이적 siRNA로 리포펙타민 2000(인비트로겐(Invitrogen), 칼스배드(Carlsbad), 캘리포니아)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 형질주입되었다. 몇몇 FAK siRNA의 염기서열은 FAK의 넉다운을 스크린하기 위해 사용되었다. 세포주에서 사용된 FAK siRNA의 염기서열은 5'-GAAGUUGGGUUGUCUAGAAUU-3' 및 5'-GGUUC AAGCUGG AUU AUUUUU- 3'이었다. 세포는 형질주입 후 48-72시간 배양된 후 실험을 위해 사용되었다. siRNA에 의한 FAK 억제는 웨스턴 블롯팅으로 검증되었다. 상기 실험은 3회 반복되었다.
실시예 6
면역침강 및 웨스턴 블롯팅 : 세포는 얼음으로 냉각된 1x포스페이트 버퍼드 셀린(PBS)으로 2회 세척되었으며, 20 mM Tris, pH 7.4, 150 mM 염화나트륨, 1% NP-40, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 프로테아제 억제제(컴플리트TM 프로테아제 억제제 칵테일, 로슈, 넛레이(Nutley), 뉴저지) 및 포스파타제 억제제 (포스파타제 억제제 칵테일 세트 I 및 세트 II, 칼바이오켐(Calbiochem))를 포함하는 얼음 상의 용액 내에서 30분간 용균(lysed)되었다
상기 용해물은 10,000rpm으로 30분간 4 ℃에서 원심분리되어 상층액이 분석되었다. 단백질 농도는 바이오-라드(Bio-Rad) 단백질 분석을 이용하여 결정되었다.
면역침강: 1 mg의 총세포 추출물이 각 샘플로 사용되었다. 상기 추출물은 11 g의 적절한 항체와 4 ℃에서 철야로 배양되었다. 25 마이크로리터의 단백질 A/G-아가로즈 비드(온코진 리서치 프로덕츠(Oncogene Research Products), 라 홀라(La Jolla), 캘리포니아)가 첨가되고 상기 샘플은 4 ℃에서 추가로 2시간 더 교반 배양되었다. 침전물은 용균용액으로 3회 세척되었으며, 40의 μl의 라 램나이(Laemmli) 용액에 현탁되어 35 μl은 웨스턴 블롯팅을 위해 제거되었다.
웨스턴 블롯팅: 30 ㎍의 단백질을 포함하는 끓여진 샘플은 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 통해 분석된 다음, 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(바이오-라드, 허르큘스(Hercules), 캘리포니아)에 이송되었다. 웨스턴 블롯팅은 각 항체에 제공된 프로토콜에 따라 수행되었다. 면역 블롯들은 웨스턴 라이트닝(Western LightningTM) 케미루미네센스 리에이젼트 플러스(PerkinElmer Life Sciences, Waltham, Massachusetts)로 현상되었다. 웨스턴 블롯에 있어서 밴드의 강도는 이미지 분석 소프트웨어 프로그램(image J)으로 측정되었다.
결과: NSC 344553으로 처리된 세포 용해물에 대한 면역침강 및 웨스턴 블롯팅 분석은 도 2 및 도 3에 나타나있다. 도 2는 NSC 344553의 FAK-IGF-1R 상호작용에 대한 효과를 나타내고 있으며, 다양한 양의 NSC 344553으로 테스트된 C8161 흑색종 암세포의 세포 용해물에 대한 면역침강 및 웨스턴 블롯팅에 의해 도시되어 있다. 도 3은 75 μM의 NSC 344553으로 처리된 C8161 흑색종 암세포에 대한 효과를 나타내고 있다. NSC 128687로 처리된 MiaPaCa-2 췌장암 세포에 대한 면역침강 및 웨스턴 블롯팅 분석은 도 12에 나타나 있다.
웨스턴 블롯 분석은 IGF-1, NSC 344553, PI3 키나제 억제제, 또는 NVP-AEW541 ("NVP")로 처리된 흑색종 (C8161 및 A375) 및 췌장암((Panc-1 및 MiaPaca-2) 세포에 대하여 수행되었다(도 4, 5, 7, 8, 9, 및 14 참고).
도 5는 5 μM의 NSC 344553 또는 PI3 키나제 억제제로 처리된 C8161 흑색종 암세포에 대한 효과를 나타내고 있다. 도 7은 IGF-1R에 대한 야생형 및 귀무돌연변이(null) 마우스 배아 섬유아세포에 있어서 24시간 처리군 및 IGF-1 30-분 자극군에 있어서 p-AKT가 감소하는 가장 중요한 효과를 나타내고 있다. 도 8은 FAK 야생형 및 귀무돌연변이 섬유아세포에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타내고 있다. 가장 중요한 효과는 24시간 처리군 및 30분 IGF-1 자극군에 있어서 p-AKT의 감소에서 나타나고 있다. 도 9는 NSC 344553로 처리된 경우의 Panc-1 암세포에 대한 효과를 나타낸다.
실시예 7
세포 생존율 및 이탈율 ( detachment ) 분석: 세포가 siRNA로 형질주입된 후, 3-(4,5-디메틸티아졸2-일)-2,5-디페닐 테트라졸리움 브로마이드(MTT) 분석 (CellTiter 96® AQueous, 프로메가, 매디슨, WI)을 통해 세포 생존율이 측정되었다. 간략하게는, 20 μl의 테트라졸리움 화합물이 각 웰에 첨가되었다. 세포는 이후 37 ℃에서 1시간 동안 배양되었다. 상기 플레이트는 490 nm에서 플레이트 리더기로 해독되어 생존율이 측정되었다. 이탈 분석에 있어서, 이탈된 세포 및 부착된 세포는 각각 수확된 다음 헤모사이토미터로 카운팅되었다. 이탈의 백분율은 이탈된 세포의 수를 총세포의 수로 나누어서 계산하였다.
세포사멸( apoptosis ) 분석: 처리된 이후, 부착 및 이탈된 세포는 수집되고, 카운팅되었으며, 제조사의 지시에 따라 APO-BRDU 키트(BD Pharmingen, San Diego, CA)를 이용한 터미널 유리딘 디옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제(TUNEL) 분석을 위해 준비되었다. 염색된 세포는 형광-활성화 세포 분리-칼리버 플로우 사이토미터(Calibur flow cytometer)(BD Biosciences)로 분석되었다. 샘플 내의 사멸된 세포의 백분율의 계산은 CellQuest 소프트웨어(BD Biosciences)로 완성되었다. 사멸세포는 호쉿(Hoechst) 염색으로 분석되었다. 호쉿 33342(1 1g/ml)이 고정된 세포에 첨가되고 시료는 유리 커버슬립 상에 마운트되었다. 상기 슬라이드는 자이스 현미경 하에서 세포사멸성 핵(apoptotic nuclei)에 대해 관찰되었다. 사멸된 세포의 백분율은 사멸세포의 총세포수에 대한 비율로 계산되었다.
결과: NSC 344553에 대한 MTT 분석(세포 타이터 96) 분석결과는 도 11에 나타나 있으며, 이는 A375 및 C8161 흑색종 암세포에 NSC 344553을 처리할 경우, 처리양에 비례하여(0.05-25 μM의 범위) 암세포의 생존이 억제됨을 나타내고 있다. 도 6은 NSC 344553이 췌장암(Panc-1 및 MiaPaCa-2) 및 흑색종(C8161 및 A375) 암세포의 세포 생존율을 억제함을 나타내고 있다.
도 10은 0.05 μM의 NSC 344553을 FAK 야생형 및 귀무돌연변이 세포 및 IGF-1R 야생형 및 귀무돌연변이 세포에 72시간 처리한 것을 나타낸다. 그 결과는 NSC 344553의 처리로 FAK+/+ 및 IGF-1R+/+ 섬유아세포의 증식이 감소하고, FAK-/- 및 IGF-1R-/- 세포에는 아무런 영향이 없음을 나타내고 있다.
MTT 분석 결과는 NSC 344553의 처리가 AKT의 인산화를 감소시키고, 처리양에 의존적인(0.05-100 μM 범위) 양상으로 PARP의 절단과 연계하여 세포의 생존을 억제하는 것을 나타내고 있다. 또한, 0.05 μM의 NSC 344553은 FAK+/+ 및 IGF-1R+/+ 섬유아세포의 증식을 감소시키고, FAK-/- 및 IGF-1R-/- 세포에 대해서는 영향이 없는 것이 관찰되었다. 보다 중요한 것은, 15 mg/kg의 NSC 344553을 5일 동안 복강 주사한 경우, 누드 마우스의 흑색종의 퇴화(p<0.05)를 효과적으로 유발한 점이다.
NSC 250435에 대한 MTT 분석(세포 타이터 96)은 도 13에 나타나 있으며, 이는 NSC 250435가 A375 및 C8161 흑색종 암세포의 세포 생존을 억제하였음을 나타내고 있다.
실시예 8
클론형성 분석( Clonogenic assay ): 췌장암 세포주 Panc-1, MiaPaca-2, Pane 2.03 및 Pane 3.27이 실험에 사용되었다. 세포의 생존을 정의하기 위해, 클론형성 분석이 세포 생식의 완결성을 검증하기 위해 수행되었다(Chinnaiyan P. et al, Clin. Cancer Res. 2008; 14(17): 5410-5 참조). 상기 클론형성 분석은 모든 형태의 방사선-유발 세포사멸을 감지하며, 따라서 방사성 민감도 분석에 있어서 "황금 기준(gold standard)"으로 알려져 있다. 2가지 약물 농도가 사용되었으며, 이는 1) FAK/IGF-1R 경로를 방해하는데 요구되는 최소량(웨스턴 블롯에 근거) 및 2) 아-최대 활성(sub-maximal activity, (세포 생존율의 20%-50% 감소))을 나타내는 농도이다. 세포는 방사선 조사에 앞서 FAK/IGF-1R 억제제에 24시간 노출되었다(FAK/IGF-1R 활성을 억제하는데 필요한 시간을 웨스턴 블롯으로 결정한 것임). 약물을 포함하는 배지는 (약물이 없는)신선한 배지로 방사선 조사 후 24시간 후에 교체되었다. 콜로니(≥50세포로 정의됨)는 이후 염색되고 방사선 조사후 10-14일에 카운트되었다.
실시예 9
방사선-유도 세포 이동에 대한 FAK / IGF -1R 경로 억제의 효과
세포의 이동을 측정하기 위해, 2-웰 보이든-타입 챔버에서 트랜스웰 이동 분석이 수행되었다. 1 x 105세포/웰이 5-uM 기공(24-웰) 트랜스웰의 상부 챔버에 각각의 배지와 함께 플레이팅 되었으며, 30분 동안 부착되도록 하였다. 상기 세포는 대조군 세포 및 FAK/IGF-1R 억제제에 24시간 동안 전처리된 세포를 포함한다. 처리 조건은, 무처리, RT 단독, FAK/IGF-1R 억제제 단독, 및 RT 및 FAK/IGF-1R 억제제 조합으로 하였다. 세포는 방사선량의 구배(2 Gy, 4 Gy, 6 Gy, 또는 8 Gy)에 따라 노출되었으며 24시간 동안 배양기로 돌아와, 세척되고 고정되었다. 폴리카보네이트 막의 최상층에 남아있는 세포는 면봉으로 제거되었다. 기공을 통해 이동하여 하층의 표면으로 이동한 세포는 에탄올-기반 크리스탈 바이올렛으로 염색되었다. 상기 막은 이후에 마이크로 슬라이드에 마운트되어 카운팅되었다.
실시예 10
면역형광 염색 및 공초점 현미경
세포는 1x PBS 내의 3.7% 파라포름알데히드에서 10분 동안 고정되었으며, 0.5% 트리톤 X-100으로 5분 동안 투과성화(permeabilized)되었다. 세포는 이후 1xPBS로 세척되고, 1xPBS내 25%의 정상 염소 혈청(goat serum)으로 20분 동안 블로킹되었으며, 1차 항체(25 % 염소혈청 내 1:200 희석)로 상온에서 30분간 처리되었다. 1x PBS로 3회 세척한 다음, 세포는 텍사스-레드가 결합된 2차 항체(25 % 염소혈청 내 1:400 희석)로 상온에서 30분간 처리되고, 현미경으로 관찰되기 전 1xPBS로 3회 더 세척되었다. 공면역염색(coimmunostaining) 실험을 위해, 세포는 25% 염소 혈청 내에 1:100으로 희석된 다른 1차 항체와 1시간 동안 배양되었다. 1xPBS로 3회 세척된 다음, 플루오레세인 이소티오시아네이트-결합 2차 항체(1:100 희석)가 커버 슬립에 처리되었다. FAK 및 IGF-1R 항체로 면역염색된 세포는 라이카 공초점 현미경 및 MRC-1024 공초점 레이져 스캐닝 시스템으로 형광신호가 동일 위치(colocalization)를 나타내는지 평가되었다. 테스트 화합물의 존재 또는 부존재 하에서 FAK-CD 또는 FAK siRNA로 처리된 세포는 FAK 항체로 염색되었으며, 자이스 현미경으로 초점 부착연접(focal adhesions)으로부터의 FAK의 이탈 여부가 검증되었다.
결과: 공초점 현미경 분석은 IGF-1R을 갖는 FAK-NT 및 FAK-NT2 컨스트럭트가 동일 위치임을 나타낸다. 오버래핑의 백분율은 FAK-NT 및 FAK-NT2 형질주입에서는 높은데, 이는 IGF-1R과 같은 위치하는 것이 FAK-NT, 보다 상세하게는 FAK-NT2임을 나타낸다. 동일 위치를 나타내는 것은 FAK-NT1, FAK-NT3 및 FAK-CD에서는 낮다. 세포가 NSC 250435의 존재하에서 형질주입되는 경우, FAK-NT, 보다 상세하게는 FAK-NT2와 IGF-1R 간의 상호작용의 백분율은 약 30%까지 유의적으로 감소하였다. 상기 결과는 NSC 250435가 FAK-NT2 및 IGF-1R 간의 상호작용을 방해함을 나타낸다.
실시예 11
FAK / IGF -1R 경로의 방사선-유도 활성화
세포는 타임-코스 방식으로 수집되어 2 Gy 및 10 Gy의 방사선에 노출되었다. 용해물이 수집되어 FAK 및 IGF-1R 모두에 대해 면역침강이 수행되었다. 웨스턴 블롯은 그들 각각의 인산화된 형태에 대해 수행되었다{Liu W. 그 외, Carcinogenesis, 2008; 29(6): 1096-1107 참조). FAK/IGF-1R 키나제 및 소분자 억제제로 세포를 전처리 한 이후에 유사한 연구가 수행된다. FAK/IGF-1R과 연계된 단백질을 정의하기 위해 RT 이후에 질량 분광법이 수행된다. 방사선의 처리가 있는 경우 FAK-IGF-1R 복합체에 결합된 동정된 단백질에 대해서는 이후 FAK/IGF-1R 활성화 및 다운 스트림 신호전달(downstream signaling)에 대한 상대적인 역할을 규명하기 위해 siRNA를 이용한 타켓팅이 진행되었다.
유사분열성 붕괴( Mitotic catastrophe )
이후 세포/핵의 형태 및 상실된 G2/M 체크포인트 활성을 통해 유사분열성 붕괴가 측정되었다(Xu B. 그 외, Molecular 및 Cell Biology, 2002; 22(4): 1049-59) 유사분열성 붕괴는 Hoechst 염색 및 다중-핵 세포의 비율을 정량화하여 현미경적으로 조사되었다(Castedo M., 그 외, Oncogene, 2004; 23(16): 2825-37 참조).
세포주기 체크 포인트 활성화( Cell Cycle Checkpoint Activation )
FAK/IGF-1R 억제제에 노출 및 방사선 조사된 세포에 있어서의 상실된 G2/M 기 어레스트(arrest)는 유세포분석(flow cytometry)으로 관찰되었다. G2/M 기(4n)의 세포를 각각의 M- 및 G2-기로 분리하기 위해, 프로피듐 아이오디드 및 유사분열기 동안 특이적으로 발현되는 인산화된 히스톤 H3를 이용한 이중 라벨링이 수행된다. 이 분석은 세포의 G2 기에서 M기로의 진행 및 G2 체크포인트의 활성화에 있어서 FAK/IGF-1R 경로에 의한 영향에 대한 측정치를 제공한다.
DNA 손상/수리
DNA DSB 및 수리에 대한 연구에 있어서, 히스톤 변이체 H2AX (γH2AX로 불리는)의 인산화형은 DNA 이중가닥의 파손과의 연관성으로 인해 채택되어 왔다. 특히, 방사선의 조사 후 수분 이내에 면역형광으로 γH2AX 의 초점(foci)이 관찰될 수 있으며, 이는 이중가닥의 파손과 직접적인 연관이 있다. 이미 기술한 바와 같이 방사선 조사 24시간 후의 γH2AX의 잔류 레벨(또는 역으로, 초점의 분산)은 방사선 민감도와 상응한다(Banath JP, 그 외, Cancer Res., 2004; 64(19): 7144-9). DNA DSB 수리에 있어서의 FAK/IGF-1R 경로의 억제가 미치는 영향은 gH2AX 초점의 동역학으로 측정될 수 있다(Chinnaiyan P. 그 외, Clin. Cancer Res. 2008; 14(17): 5410-5 참조).
실시예 12
구조-기반 컴퓨터 모형구조( in silico ) 분자 모델링 및 컴퓨터 도킹
이전의 연구를 통해 FAK의 아미노 말단(aa 127-243, FAK-NT2)은 직접 IGF-1R (aa 959-1266)의 세포질 내 부분과 결합하는 것으로 알려져 왔다(21). NCI 디벨로프멘탈 써라퓨틱 프로그램(Developmental Therapeutics Program)의 데이터 베이스로부터 입수된 화합물들은 DOCK5.1 프로그램을 이용하여 분석되어, 도 15A의 예상된 FAK-NT2/IGF-1R 인터페이스 상에서 FAK-FERM과 가상으로 결합하는 것들이 동정되었다. 상기 인터페이스와 높은 결합 확률을 갖는 화합물들은 FAK과 IGF-1R 간의 상호작용을 억제하는 능력이 있는지 스크리닝되었다. 그 결과, INT2-31 (NSC 344553)이 가장 유력한 FAK/IGF-1R 결합 억제제로 동정되었다. 이 화합물은 377.31 g/mol의 분자량 및 C12H16N3O7PS의 분자식을 갖는다. 그 구조는 도 15A에 나타나 있다. FAK-NT2에 결합하고 있는 INT2-31의 모든 양상에 있어서의 분자 내 에너지는 정전기력 및 반데르발스 에너지의 합으로 계산되었으며, FAK-NT2와의 상호작용의 가장 낮은 에너지는 -16.28의 반데르발스 부하(charge) 및 -33.84의 정전기적 부하를 포함하는 -50.12의 예상 스코어를 포함한다.
실시예 13
INT2 -31은 FAK 와 IGF -1R의 상호작용을 방해함
FAK와 IGF-1R의 단백질-단백질 상호작용을 방해하는 INT2-31의 잠재성은 테그 및 정제된 단백질 컨스트럭트를 이용한 풀다운 분석에서 평가되었다.
INT2-31은 정제된 GST-FAK-NT2 및 IGF-1Rb 간의 결합을 평균 3.96 μM의 IC50가 되도록 투여량 의존성 양상으로 감소시켰다(도 15B). 상기 약물의 효과를 검증하기 위해 시험관 조건에서 2개의 흑색종 세포주가 평가되었다. INT2-31은 FAK에 대한 항체를 이용한 면역침강(도 15C 및 D)을 통해 규명된 바와 같이, 낮은 마이크로몰 농도(각각 2.72 및 3.17 μM의 평균 IC50)로 C8161 및 A375 흑색종 암세포에서 결합을 방해하였다.
또한, 식도암, 췌장암, 및 유방암 세포주의 생존율에 대한 INT2-31의 효과가 분석되고 각 세포주에 대한 IC50 값이 표 1에서 보여주는 바와 같이 측정되었다. 평균 IC50 값을 얻기 위해, 각 세포주는 증가하는 화합물의 농도로 72 시간 동안 3회 반복으로 처리되어, 이들 3회의 독립적인 실험으로부터 평균 IC50 값이 산출되었다. 흑색종의 결과와 유사하게, INT2-31은 정상세포에 비해 암세포에서의 생존율을 보다 더 억제하였다. INT2-31에 대한 세포의 민감도는 다양했으며, 세포의 FAK 및 IGF-1R 발현수준과 직접적으로 상응하였다.
암 세포주에 대한 INT2-31의 IC50값
세포주 [INT2-31] μM
흑색종
멜라닌세포(Melonocyte) 97.3
A375 2.7
C8161 0.5
SK-MEL-28 22.1
식도암
TE3 5.6
TE7 3.2
TE9 3.6
KYSE70 4.6
KYSE 140 2.5
KYSEl 80 19.8
췌장암
HPDE
Panc-1 6.7
Miapaca-2 4.73
AsPCl 16.9
BxPC3 45.6
유방암
MCFl0A 100
MCF7 0.03
BT474 2.39
실시예 14
INT2 -31은 흑색종 세포의 생존율을 감소시킴
흑색종 세포 생존율에 대한 영향을 측정하기 위해, 3개의 인간 흑색종 세포주가 INT2-31의 증가하는 양에 72시간 동안 노출되었으며, 그 결과가 인간 멜라닌세포와 비교되었다. 도 16A에 나타난 바와 같이, INT2-31은 정상세포 보다 암세포에 있어서 생존율을 억제한다. 각 세포주는 증가하는 농도의 화합물로 72시간 동안 3회 반복으로 처리되어 평균 IC50값이 3번의 독립적인 실험으로부터 계산되었다. 3가지 흑색종 세포주 모두 증가된 FAK 및 IGF-1R 발현을 나타내었으며, 정상 인간 멜라닌세포에 비해 증가된 INT2-31 민감도를 나타내었다(도 16B). INT2-31의 효과는 3가지 세포주에 있어서 달랐으며, 가장 적은 민감도를 나타낸 세포주(SK-MEL-28)가 가장 높은 FAK 및 IGF-1R 발현을 나타내는 것으로 볼 때, INT2-31의 효과는 FAK 및 IGF-1R 의 상시적인(constitutive) 활성화와 관련이 있을 수 있다.
실시예 15
INT2 -31은 흑색종 세포증식을 억제하고, FAK 및 IGF -1R의 존재에 의존적인 효과를 나타냄
세포증식에 대한 INT2-31의 효과를 평가하기 위해, CSFE 세포 방해 분석(cell distribution assay)이 수행되었다. 도 16C에 나타난 바와 같이, INT2-31은 C8161 및 A375 세포 모두에서 세포증식을 방해하였으나, 그 효과는 C8161 세포에서 보다 더 높았다. INT2-31 처리에 따른 세포수의 측정결과는 C8161 흑색종 세포의 성장에 대하여 잠재적인 시간과 양에 의존적인 억제를 보여준다(도 16D). 이러한 결과는 MTT 분석(도 16A)에서 나타난 바와 유사하였다.
INT2-31의 효과가 FAK를 발현하는 세포에 특이적임을 나타내기 위해, C8161 세포가 FAK shRNA 컨스트럭트로 형질주입되어 임시적으로(transiently) FAK가 넉다운되도록 하였다(도 17A). FAK shRNA2에 비해 보다 높은 FAK 넉다운 효과 때문에 FAK shRNAl 이 MTT 분석에 사용되었다. FAK shRNA를 발현하는 C8161 세포는 부모세포 및 감염되지 않은(mock) 형질주입세포에 비해 INT2-31의 효과에 유의적으로 덜 민감하였다(도 17B). 이러한 발견은 FAK 야생형 및 귀무돌연변이 섬유아세포의 활용으로 검증되었다. FAK 야생형 섬유아세포는 FAK 귀무돌연변이 섬유아세포에 비해 INT2-31의 효과에 대해 유의적으로 보다 더 민감하였다(도 17C). IGF-1R에 대한 특이성 또한 IGF-1R 이 충분하거나 부족한 섬유아세포에 대한 처리 중에 나타났다. IGF-1R -/- 섬유아세포는 IGF-1R +/+ 세포에 비해 INT2-31의 효과에 유의적으로 덜 민감하였다(p<0.05, 도 17D).
실시예 16
INT2 -31은 세포사멸( aopotosis )을 유발함
이탈된 세포에 대한 INT2-31의 효과가 관찰되었다. C8161 흑색종 세포의 이탈은, 증가하는 농도의 INT2-31의 존재하에서 관찰되었다. 도 18A에 나타난 바와 같이, 단지 7%의 C8161 세포가 5 μM의 INT2-31처리 72시간 후에 플레이트로부터 이탈되었다. INT2-31의 효과는 두 가지의 FAK 및 IGF-1R 키나제 억제제 TAE226 (Novartis, Basel)에 비해 유의적으로 낮았다. INT2-31의 사멸세포에 대한 효과는 5 μM의 양으로 처리 72시간 후 호쉿 양성 세포를 검출하여 관찰한 결과이며, 50%이상의 세포사멸을 유도하는 것으로 나타났다(도 18B). 이는 카스파제 3/7 활성화를 l μM 및 5 μM의 INT2-31 처리 72시간 후에 공초점 현미경으로 관찰하여 검증되었다 (도 18C). 마지막으로, INT2-31의 효과는 웨스턴 블롯으로 평가되었다. 도 18D는 INT2-31처리 48시간 후의 PARP 및 카스파제-9의 절단을 나타낸다. 카스파제 8의 수준에 대해서는 INT2-31의 유의적인 효과는 없었다.
실시예 17
INT2 -31은 키나제 활성의 억제 없이 Akt 의 활성을 감소시킴
FAK 및 IGF-1R 경로에 대한 INT2-31의 효과는 각기 다른 농도 및 처리 시간에 따라 3개 흑색종 세포주에서 분석되었다(도 19). INT2-31처리는, 상시적이고(constitutive) IGF-1 유도의 AKT로의 신호전달에 대한 지속적(consistant)인 억제를 야기한다. 흥미로운 것은, FAK의 상시적인 인산화, 또는 IGF-1R의 상시적인 인산화 또는 IGF-1에 유도된 인산화에 대해 INT2-31는 아무런 유의적인 효과를 나타내지 않는다. 또한, Akt 에 대해 확연한 효과가 있었으나, 높은 처리양에도 모든 세포주에 있어서 p-ERK가 다소 감소한 것으로 보아 ERK에 대한 신호전달에 대한 효과는 적었다. INT2-31의 p-Akt 에 대한 효과는, A375 및 SK-MEL-28 세포의 p-Akt를 감소시키는데 상대적으로 많은 양의 INT2-31이 필요한 (각각 l-5 μM 및 5-10 μM가 필요) 반면, 0.5-l μM의 처리에도 p-Akt 의 유의적인 억제를 나타내는 C8161 세포의 세포성장, 생존율 및 세포사멸에 대한 효과와 연관되어 있다.
Akt 인산화에 대한 INT2-31 처리 시간 코스의 분석을 통해 처리 24시간 후에서 72시간까지 효과가 유지되는 약간의 탈인산화가 규명되었다(도 19E).
결과적으로, FAK, IGF-1R, 인슐린 수용체, VEGFR-1, AKT-1, EGFR, VEGFR-2, c-MET, PDGFRa, p70S6K, Src 및 PI3 키나제 활성에 대한 이 화합물의 효과가 확인되었다(도 19D). l μM의 양에서, 이 화합물은 FAK 또는 IGF-1R의 키나제 활성을 억제하지 않았으며, 다른 어떠한 단백질 키나제도 22% 이상 억제하지 않았다. 따라서, INT2-31은 그들의 키나제 활성에 대한 억제 없이 FAK 및 IGF-1R의 결합을 억제하였으며, 흑색종 세포의 생존율을 투여량과 시간에 의존적인 양상으로 억제하였다.
또한, INT2-31이 FAK의 NT2 (aa 127- 243) 영역에 특이적으로 결합하여 IGF-1R과의 상호작용을 억제하고 Akt의 인산화를 감소시킴을 확인하기 위해, C8161 세포는 FAK N-말단의 3가지 GFP 단편(FAK-NTl, FAK-NT2 및 FAK-NT3)으로 형질주입되었다. 도 19F 및 19G에 나타난 바와 같이, FAK-NT2 단편의 과발현은 FAK-NTl 및 NT3 과발현 세포에 비해 AKT의 IGF-1 유도 인산화를 감소시켰다.
실시예 18
INT2 -31은 종양 p- Akt 및 흑색종의 이종이식에 있어서 성장을 감소시킴
도 20A 및 20B에 나타난 바와 같이, 15 mg/kg의 INT2-31을 21 동안 매일 복강에 주사한 결과, C8161 및 A375 피하종양의 성장이 PBS 대조군이 주사된 대조군 마우스에 비해 유의적으로 감소하였다 (p<0.05). 이 농도에서 상기 약물은 심각한 독성효과를 나타내지 않았으며, 체중에 있어서도 각 그룹의 동물들 간에 유의적이 차이점은 나타나지 않았다. 세포의 증식에 대한 INT2-31의 효과를 생체수준에서 검증하기 위해, C8161 이종이식체가 Ki67 항체 (도 20C)로 염색되었다. Ki67에 반응을 나타내는 세포의 백분율 및 Ki67 염색의 강도는 PBS로 처리(대조군)된 경우에 비해 INT2-31로 처리된 경우에 유의적으로 감소하였다. 또한, 세포사멸이 진행중인 세포의 백분율도 대조군에 비해 INT2-31로 처리된 종양에서 유의적으로 증가하였다(도 20C, p<0.05). 이러한 생체수준의 확립된 데이터는 INT2-31이 세포의 증식을 감소시키고, 암세포의 세포사멸을 증가시킴을 나타낸다. C8161 종양에 있어서 FAK 및 IGF-1R의 생체수준의 상호작용에 대한 INT2-31의 효과는, 처리 및 무처리된 종양에 대한 FAK의 면역침강으로 분석되었다. IGF-1R에 대한 웨스턴 블롯은 FAK 및 IGF-1R의 공-면역침강에서 감소하는 것으로 나타났다. 각 종양에 있어서의 IGF-1R의 FAK에 대한 비율의 밀도계측(Densitometry)은 PBS 처리(0.98 +/- 0.11, p=0.09) 종양 샘플에 대한 INT2-31 처리(0.78 +/- 0.16)시의 감소된 평균비율을 나타낸다. 마지막으로, AKT 활성에 대한 종양 분석이 수행되었으며 p-AKT의 수준이 웨스턴 블롯으로 검출되었다. 분석결과는 PBS 대조군에 대해 INT2-31으로 처리된 동물의 AKT 인산화가 감소하였음을 나타낸다(도 20D). 따라서, 리드 화합물인 INT2-31은 생체수준에서 종양의 성장을 감소시키며, FAK 및 IGF-1R의 생체수준의 상호작용을 방해하고, AKT 인산화의 감소를 유발한다.
실시예 19
INT2 - 31는 화학치료요법에 대하여 암세포를민감하게 함
통상적인 화학치료요법에 대한 세포의 민감도와 Akt 탈-인산화에 대한 INT2-31 효과를 검증하고 상관관계를 밝히기 위해, 식도암 및 췌장암 세포주들에 대한 생존율 및 세포사멸에 대한 조합치료(combination therapies)의 효과가 분석되었다. KYSE 70 및 140 식도암 세포 모두 INT2-31 및 5-FU 처리에 민감성을 나타내었으며, 0.5 및 l μM의 INT2-31은 5-FU와 시너지 효과를 나타내었다(도 21). 췌장암 세포에 있어서, 겜시타빈과 조합된 경우에는 INT2-31은 세포의 생존율에 대해 단지 부가적인 효과만 나타내었지만, INT2-31은 5-FU와 l μM 농도로 화학치료된 경우에는 시너지 효과를 나타내었다 (도 21 및 22).
실시예 20
INT2 -31 처리에 의한 시험관 수준 및 생체 수준에서의 식도암의 생존율 및 증식의 억제
식도암은 FAK 및 IGF-1R을 과발현하는 것으로 보여져 왔다. 이들 단백질의 상호작용을 타겟팅하는 효과를 직접 환자 시료에서 이해하기 위해, 신선한 인간의 조직이 실험을 위해 직접적인 식도암 시료가 마우스 및 조직배양 플레이트에서 성장되는 시스템이 개발되었다. 20개 이상의 종양 및 상응하는 정상 조직 시료가 암환자로부터 채취되었다. 상기 샘플에 대한 면역조직학적 및 웨스턴 블롯 분석은 종양 샘플에 있어서 정상 조직에 비해 증가된 수준의 FAK 및 IGF-1R을 나타내었다. 환자의 시료에 대한 생체 수준의 INT2-31의 효과를 평가하기 위해, 조직배양 플레이트에서 8세대까지 최대한으로 자란 세포에 대한 MTT 분석을 이용하였다. 대표적인 식도암 환자 #5의 MTT 분석 결과는 도 23A에 나타나 있다. 증가하는 농도의 INT2-31은 2.18 μM의 평균 IC50값을 나타내며 효과적으로 세포의 생존율을 감소시켰다.
결과적으로, 식도암 환자 #5 시료의 생체수준의 종양의 성장의 억제를 평가하였다. 상기 섹션에서 기술된 바와 같이, 신선한(fresh) 인간 식도의 선암(adenocarcinoma) 종양 샘플로부터 작은 절편(0.3 x 0.3 x 0.3 cm)이 2마리의 마우스에 피하로 이식되었다. 종양 중 하나가 1.5 cc3에 이르면, 이는 절제되어 작은 크기로 나뉘어져 다른 10마리의 마우스에 피하로 이식되었다. 종양이 ~100mm3에 이르면, 마우스는 각 그룹에 5마리가 되도록 무작위로 2 그룹으로 나뉘어졌다. 도 23B에 나타난 바와 같이, 21일 동안 매일 50 mg/kg의 INT2-31을 복강에 주사한 결과 신선한 식도 선암 종양의 성장이 PBS 대조군을 투여 받은 마우스에 비해 유의적으로 감소하였다(p<0.05). 이러한 농도에서 각 그룹의 동물들 간에 유의적인 체중의 차이는 없어 상기 약물은 심각한 독성 효과는 나타내지 않았다. 세포의 증식에 대한 INT2-31의 생체수준의 효과를 평가하기 위해, 식도암 환자#5시료의 이종이식을 Ki67 항체로 염색하였다. 도 23C에 나타난 바와 같이, 종양에 대한 면역조직학적 염색은 Ki67에 반응하는 세포의 백분율이 PBS 그룹에 비해 INT2-31로 처리된 마우스의 종양에서 유의적으로 감소하였음을 나타낸다. 이는 상기 약물이 암세포의 증식을 감소시킨다는 시험관 수준의 데이터 및 흑색종 모델에 대한 생체 수준의 데이터를 확인시켰다.
실시예 21
INT2 -31 처리로 인한 정위 췌장 이종이식의 억제
INT2-31의 활성 및 특이성을 보다 더 검증하기 위해, 정위(orthotopic) 마우스 모델이 이용되었다. 췌장암 세포주 Mia paca-2 및 Panc-1 세포는 이종이식의 생체수준 이미징을 위한 루시퍼라제-RFP(적색 형광 단백질) 리포터 유전자를 이용하여 안정적으로 형질주입되었다. 확장(expansion) 및 RFP 양성 세포의 분리 후, 세포는 배양에서 확장되어 5x106 종양세포가 14마리의 마우스 췌장으로 이식되었다. 재료 및 방법 섹션에서 기술된 바와 같이, 마우스는 IVIS 루미나 이미져로 매주 이미지화되었으며, 종양의 크기는 생체발광 신호를 통해 측정되었다. 종양의 크기가 ~ 100 mm3에 이르면, 마우스는 각 그룹에 7마리씩 하기의 2 그룹으로 무작위 분류되었다: 대조군 15 mg/kg INT2-31. 도 24에 나타난 것처럼, 50 mg/kg의 Miapaca2 처리 및 21일 동안 15 mg/kg의 INT2-31 주사를 통해, 체중 및 동물의 외관으로 측정되는 어떠한 부작용도 없이 정위 췌장 이종이식물의 성장은 충분히 감소되었다.
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Claims (46)

  1. FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 암을 앓거나 이에 민감한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이인 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암인 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법은 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 추가의 치료제는 화학요법제인 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    상기 추가의 치료제는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 및 잘립시스로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  10. 제 7 항에 있어서,
    상기 추가의 치료제는 5-플루오로우라실 (5-FU), 젬시타빈, 플루오로피리미딘, 뉴클레오시드 시티딘 유사체, NVP-AEW541, 백금 유사체, TAE226, 토포이소머라아제 억제제, 항미세소관제, PI3 키나아제 억제제, 프로테아좀 억제제, 비타민 D 유사체, 아라키돈산 경로 억제제, 히스톤 디아시틸레이트 억제제, 및 파프네실트랜스페라제 억제제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서,
    상기 방법은 수술, 화학요법, 방사선 치료, 면역치료, 단일클론 항체 치료 및 상피세포 성장인자 수용체 치료로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 치료로 상기 대상체를 치료하는 단계를 더 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 방법은 화학요법 및/또는 방사선 치료로 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함하는 방법.
  13. a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산
    으로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효량을 암을 앓거나 이에 민감한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  15. 제 13 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암인 방법.
  16. 제 13 항에 있어서,
    상기 방법은 추가의 치료제를 상기 대상체에게 투여하는 단계를 더 포함하는 방법.
  17. 제 13 항에 있어서,
    상기 방법은 수술, 화학요법, 방사선 치료, 면역치료, 단일클론 항체 치료 또는 상피세포 성장인자 수용체 치료로 상기 대상체를 치료하는 단계를 더 포함하는 방법.
  18. FAK와 FAK 또는 이의 선택적 도메인과 결합하거나 조합할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 화합물은 FAK의 티로신 인산화반응을 억제할 수 있는 방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  21. 제 18 항에 있어서,
    상기 화합물은 FAK 아미노 말단 부분 (NT2)과 결합하거나 조합할 수 있는 방법.
  22. IGF-1R을 IGF-1R 또는 이의 선택적 도메인과 결합하거나 조합할 수 있는 화합물과 접촉하는 단계를 포함하는, FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절하는 방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 화합물은 IGF-1R의 티로신 인산화반응을 억제할 수 있는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  25. IGF-1R 및 AKT 인산화반응을 감소시키고 암세포의 사멸을 유도할 수 있는 화합물을 암을 앓거나 이에 민감한 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 암을 앓거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  27. 제 26 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  28. 조절되지 않는 세포증식을 하는 세포를 FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 세포의 조절되지 않는 세포증식을 조절하는 방법.
  29. 제 28 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  30. 제 29 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  31. FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 세포증식증을 앓고 있거나 이에 민감한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 세포증식증을 앓고 있거나 이에 민감한 대상체를 치료하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  33. 제 32 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 방법.
  34. FAK와 IGF-1R 간의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량을 포함하는, 세포증식증을 앓고 있거나 이에 민감한 대상체 치료용 키트.
  35. 제 34 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 키트:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  36. 제 35 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 키트.
  37. 제 34 항에 있어서,
    상기 세포증식증은 암인 키트.
  38. 제 37 항에 있어서,
    상기 암은 유방암, 기도암, 뇌암, 생식기암, 소화기암, 비뇨기암, 안암, 간암, 피부암, 두경부암, 갑상선암, 부갑상선암 또는 고형 종양의 원격 전이인 키트.
  39. 제 38 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암인 키트.
  40. 제 38 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암인 키트.
  41. 제 34 항에 있어서,
    상기 키트는 추가의 치료제를 더 포함하는 키트.
  42. 제 41 항에 있어서,
    상기 추가의 치료제는 아스파라기나아제, 블레오마이신, 칼세인-AM, 카보플라틴, 카무스틴, 클로람부실, 시스플라틴, 콜라스파아제, 시클로포스파미드, 시타라빈, 데카바진, 닥티노마이신, 다우노루비신, 도세탁셀, 독소루비신 (아드리아마이신), 에피루비신, 에토포시드, ET-743, 엘로티닙, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 제피티닙, 헥사메틸멜라닌, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이리노테칸, 레우코보린, 로무스틴, 메클로레타민, 6-멀캅토퓨린, 메스나, 메토트렉세이트, 미토마이신 C, 미토잔트론, NVP-AEW541, 파크리탁셀, 프레드니솔론, 프레드니손, 프로카바진, 랄록시펜, 로다민-123, 스트렙토조신, TAE226, 타목시펜, 티오구아닌, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데스틴, 및 잘립시스로 구성된 군으로부터 선택되는 키트.
  43. FAK와 IGF-1R 사이의 결합 상호작용을 조절할 수 있는 화합물의 유효량 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 암을 앓거나 이에 민감한 대상체 치료하기 위한 약학적 조성물.
  44. 제 43 항에 있어서,
    상기 화합물은 다음의 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 약학적 조성물:
    a)2-(히드록시메틸)-6-이미노-2,3,3a,9a-테트라히드로-6H-푸로[2,3:4,5][1,3]옥사졸로[3,2-a]피리미딘-3-일 디히드로겐 포스페이트;
    b)4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘};
    c)1,1'-(1,7,9-트리히드록시-8,9b-디메틸-3-옥소-4a-(페닐티오)-3,4,4a,9b-테트라히드로디벤조-[b,d]퓨란-2,6-디일)디에타논;
    d)3-메틸-2,4-디술포펜타디오익산; 및
    e)1-아미노프로판-1,3-디일디포스폰산.
  45. 제 44 항에 있어서,
    상기 화합물은 4-(메틸티오)-7-(5-O-포스포노-D-리보퓨라노실)-{7H-피롤로[2,3-d]피리미딘} 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염인 약학적 조성물.
  46. 제 43 항에 있어서,
    상기 암은 췌장암, 흑색종암, 또는 식도암인 약학적 조성물.
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