CN108704139A - 一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物技术领域，具体是一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合，由腺苷和Akt抑制剂组成。本发明优点在于：通过使用本发明的药物，可以激活胰腺癌细胞内凋亡级联信号，同时削弱胰腺癌细胞利用衰老信号耐受药物杀伤的机制，从而抑制胰腺癌在体内增殖；本发明使用Akt抑制剂提高胰腺癌对外源腺苷敏感性的同时，保持了较低的药物毒性，为胰腺癌的治疗提供了新的策略。

Description

一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体地说，是一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合。

背景技术

胰腺癌是一种在全球范围内较为常见、致死性极高的恶性肿瘤。其病人中位生存期仅3-6个月，而5年生存率不足5％。在全球范围内，胰腺癌每年造成超过200000人死亡。2010年的统计数据显示，当年中国国内胰腺癌致死人数为57735人，已经超过同年美国地区的胰腺癌致死病例数。从全球范围来看，尽管由于我国胰腺癌发病率及死亡率相对较低，但我国胰腺癌死亡率与患病率比例却达到0.89，明显高于北美、澳大利亚等胰腺癌高发区，这表明我国胰腺癌的诊断和治疗平均水平相对滞后。为了应对胰腺癌发病率及死亡率的升高，改进胰腺癌治疗手段迫在眉睫。

目前，手术切除是现有治疗方法中唯一可能实现胰腺癌治愈的手段。但胰腺癌增殖、转移迅速，其疗应用范围及疗效均不理想。实际应用中，仅15％-20％的病人确诊后适于接受手术。并且大部分接受手术切除的病人最终都将复发胰腺癌，其术后中位生存期在17-27个月，5年生存率也仅仅只有20％。因此，基于细胞毒性药物的辅助化疗成为了近年来胰腺癌治疗的研究重点。现阶段临床较为常用的胰腺癌化疗药物主要包括5-氟尿嘧啶、吉西他滨、卡培他滨、奥沙利铂、紫杉醇等细胞毒性药物以及厄洛替尼等针对EGFR受体的靶向药物。其中，结合5-氟尿嘧啶、奥沙利铂、亚叶酸钙和伊立替康联合治疗的 FOLFIRINOX治疗方案在临床研究中表现出了最优疗效，使未接受手术的病人中位生存期达到11.1个月，相对吉西他滨单药治疗延长了4.3个月。但是，现有常用的胰腺癌治疗药物及联合方案总体毒性较大，对于进展迅速并易形成恶病质的胰腺癌治疗效果有限。因此寻找新的胰腺癌治疗药物是当前肿瘤治疗研究领域的重点之一。

腺苷是一种由腺嘌呤与核糖经β-N9糖苷键连接形成的核苷复合物，在人体细胞内外广泛分布。腺苷作为嘌呤能信号途径的重要分子及ATP代谢产物，参与了诸多细胞生理过程。由于血液中的腺苷具有短暂扰乱心脏节律并减缓心率的功能依赖，因此它已经成为临床上治疗阵发性室上心动过速以及心胸麻醉时抗心律失常的常用药物。近年来腺苷及其受体系统在肿瘤研究领域也越来越受到重视。大量文献显示外源腺苷能够对肝癌、胃癌及结肠癌细胞发挥显著杀伤作用。但腺苷以及腺苷与其他小分子化合物联用用于制备胰腺癌治疗药物目前还未见报道。

发明内容

本发明在前期研究中已经发现1mM浓度以上的外源腺苷能够通过激活 Caspase 8和Caspase 9等细胞内外凋亡信号途径杀伤胰腺癌细胞，具有进入临床应用的巨大潜力。然而胰腺癌作为恶性程度最高的肿瘤之一，其耐药性是临床治疗领域提高药物疗效、改善病人预后的关键障碍。通常，胰腺癌能够在药物作用一段时间后通过下调细胞膜上的核苷转运蛋白及形成致密基质层等方法，迅速降低肿瘤局部药物浓度，来耐受化疗的杀伤作用。而据本发明前期研究，腺苷对胰腺癌细胞的杀伤作用对其外源浓度较为依赖，因此筛选合适的小分子化合物与腺苷联用，对于联合腺苷制备胰腺癌治疗药物具有重要价值。

本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种小分子化合物与腺苷联合制备治疗胰腺癌药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

本发明的第一方面，提供腺苷和Akt抑制剂联用在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

进一步的，所述的Akt抑制剂为GSK690693、MK-2206HCL、Perifosine、Ipatasertib。

更优选的，所述的Akt抑制剂为GSK690693，可购自selleck公司。

优选的，所述的Akt抑制剂为GSK690693；所述的腺苷和Akt抑制剂 GSK690693的药物浓度比例为1mM：1-10μM。

进一步的，所述的腺苷和Akt抑制剂联用强烈抑制肿瘤组织内Ki67表达，同时显著激活Caspase 3。

进一步的，所述的腺苷和Akt抑制剂联用抑制P21导致的细胞衰老、促进凋亡信号。

进一步的，Akt抑制剂GSK690693与腺苷联用可增强腺苷的胰腺癌细胞毒性。

本发明的第二方面，提供一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合，由腺苷和Akt抑制剂组成。

进一步的，所述的Akt抑制剂为GSK690693、MK-2206HCL、Perifosine、Ipatasertib。

更优选的，所述的Akt抑制剂为GSK690693，可购自selleck公司。

进一步的，所述的腺苷和Akt抑制剂GSK690693的药物浓度比例为1mM： 1-10μM。

本发明的第三方面，提供Akt抑制剂在制备胰腺癌对外源腺苷增敏剂中的应用。

进一步的，所述的Akt抑制剂为GSK690693、MK-2206HCL、Perifosine、Ipatasertib。

更优选的，所述的Akt抑制剂为GSK690693，可购自selleck公司。

进一步的，所述的Akt抑制剂GSK690693明显增强腺苷诱导的Caspase 3 剪切及Ki67表达。

进一步的，所述的Akt抑制剂GSK690693促进腺苷诱导的凋亡关键蛋白 Caspase3、Caspase 9及PARP的剪切激活并抑制p21的蛋白堆积。

本发明的第四方面，提供腺苷和Akt抑制剂联用在制备抑制肿瘤组织内 Ki67表达，同时激活Caspase 3的药物中的应用。

本发明的第五方面，提供腺苷和Akt抑制剂联用在制备抑制P21导致的细胞衰老、促进凋亡信号的药物中的应用。

本发明的第六方面，提供腺苷和Akt抑制剂联用在制备促进Caspase 3、 Caspase9及PARP的剪切激活并抑制p21的蛋白堆积的药物中的应用。

本发明优点在于：

1、通过使用本发明的药物，可以激活胰腺癌细胞内凋亡级联信号，同时削弱胰腺癌细胞利用衰老信号耐受药物杀伤的机制，从而抑制胰腺癌在体内增殖；

2、本发明使用Akt抑制剂GSK690693提高胰腺癌对外源腺苷敏感性的同时，保持了较低的药物毒性，为胰腺癌的治疗提供了新的策略。

附图说明

图1A：在结晶紫染色实验中，1mM腺苷对胰腺癌细胞株SW1990及BxPC3 的细胞活性均存在显著的抑制作用。

图1B：在SA-β-Gal染色实验中，1mM腺苷显著诱导胰腺癌细胞衰老而 p21干扰后可抑制该过程。

图2A：在CCK8实验中，干扰p21增强了1mM腺苷对胰腺癌细胞活性的抑制作用。

图2B：在流式细胞检测Caspase 3剪切状态实验中，干扰p21促进了腺苷诱导的Caspase 3剪切激活比例。

图2C：免疫印迹检测显示，p21干扰促进了Caspase 3下游蛋白PARP的剪切。

图3A：CCK8细胞活性检测实验中，GSK690693与腺苷在SW1990及 BxPC3细胞中以不同浓度比例联用可增强腺苷的胰腺癌细胞毒性。

图3B：在利用Talalay-Chou中效方程检测GSK690693与腺苷联合作用实验中，两种药物在一定浓度范围比例下表现出协同增敏的作用。

图3C：免疫印迹检测显示，GSK690693能够促进腺苷诱导的凋亡关键蛋白Caspase3、Caspase 9及PARP的剪切激活并抑制p21的蛋白堆积。

图4A：在小鼠原位胰腺癌模型中，GSK690693与腺苷联用组中GFP标记的胰腺癌肿瘤荧光面积明显小于腺苷单用组；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

图4B：在小鼠原位胰腺癌模型中，GSK690693与腺苷联用组中GFP标记的胰腺癌肿瘤荧光面积明显小于腺苷单用组；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

图4C：在小鼠原位胰腺癌模型中，GSK690693和腺苷单独用药及联用组的瘤体积增殖曲线；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

图4D：在小鼠原位胰腺癌模型中，第42天的瘤体积大小统计示意图；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

图5A：免疫组织化学染色显示，在小鼠原位胰腺癌组织切片中， GSK690693明显增强腺苷诱导的Caspase 3剪切及Ki67表达；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

图5B：免疫印迹检测显示，在小鼠原位胰腺癌组织中，GSK690693明显增强腺苷诱导的Caspase 3剪切；其中，NC:对照组,Ade:腺苷组,GSK:Akt抑制剂组，A+G：腺苷加Akt抑制剂组。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、实验方法

(一)试剂

GSK690693购自selleck公司。

腺苷购自Sigma-Aldrich公司，使用含10％胎牛血清的培养基溶解。DMEM 培养基、RPMI-1640培养基、Opti-MEM培养基、胎牛血清、碘化丙啶、 Lipofectamine^TM RNAiMax转染试剂购自Thermo Fisher Scientific公司。DTT、溴酚蓝、结晶紫、蛋白酶抑制剂Cocktail、衰老相关β-gal染色试剂盒、多聚甲醛购自Sigma-Aldrich公司。RIPA裂解液、PMSF、30％丙烯酰胺、1M Tris溶液(pH8.8/pH6.6)、过硫酸铵、TEMED、ROS检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。ECL显色液购自北京康为试剂生物科技有限公司。PVDF膜购自Millipore公司。Biostep蛋白标准分子量购自上海天能科技有限公司。BSA 蛋白定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。Cell Counting Kit(CCK8) 购自东仁化学科技上海有限公司。Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自东仁化学科技上海有限公司。Caspase 3激活检测试剂盒购自Biovision公司。8-CPT、 DMPX、Alloxan、MRS1523、EHNA、Forskolin、SQ22.536、Dipyridamole购自Selleck中国。羟丙基-β-环糊精购自生工生物工程(上海)有限公司。

(二)细胞培养

本发明应用的两种胰腺癌细胞株SW1990及BxPC购自美国ATCC。其中 SW1990使用含10％的灭活胎牛血清的DMEM孵育，而BxPC3使用含10％灭活胎牛血清的RPMI1640孵育，置于37℃、95％空气、5％CO2湿度培养箱中培养。隔日换液，细胞汇合度至90％时使用胰酶消化传代。

(三)siRNA转染

依据合成siRNA的剂量，加入适量DEPC水配制为20nM浓度，-20℃保存备用。将处于对数生长期、状态良好的细胞消化计数，向培养皿中加入适量细胞，使24h后转染前皿中细胞汇合度达到80％-90％。转染流程：以60mm 培养皿为例。准备两支分别加入500μL无血清Opti-MEM培养基的离心管，其中一支再加入10μL Lipofectamine RNAiMax，轻柔吹打混匀后室温放置5min；另一只加入10μLsiRNA工作液。将两支液体混合、吹打混匀并在室温下孵育 20min。随后，弃去待转染培养皿中培养基，加入1mL上述混合液及3mL无双抗含10％胎牛血清的培养基，移入细胞培养箱静置24h。转染后细胞处理：细胞转染24h后，弃去培养基及转染试剂，消化细胞并计数。依据目标将细胞重新种板用于后续实验。

(四)CCK8实验

将位于对数生长期、状态良好细胞按上述步骤消化重悬并计数。按照2000 个/100μL的浓度将原始细胞悬液稀释。充分混匀后将100μL细胞悬液加入96 孔板中，轻微震荡均匀后放入5％二氧化碳培养箱中37℃静止24h。在各次实验中，保留仅加入100μL培养基、无细胞的本底检测孔。若需检测药物对细胞增殖的影响，则配置药物。在细胞静置贴壁24h后，吸弃原培养基，加入含有相应浓度药物的新培养基，继续培养细胞并将此时记为药物处理起点。待进入检测时间点后，将提前4℃融化并避光保存的CCK8试剂取出，向各检测孔中加入10μL。水平快速震荡96孔板，将CCK8试剂与培养基充分混合后，将细胞放回培养箱中静置3h。随后使用Infinite200Pro检测记录各孔中450nm处吸光度OD450。将各孔OD450扣除本底检测孔数值后，计算与阴性对照组的百分比，所得数值即为各孔细胞标准化细胞活性。

(五)结晶紫染色实验

将位于对数生长期的细胞消化计数。按10000个/2mL的浓度将原始细胞悬液稀释。充分混匀细胞后向24孔板各孔中加入1mL单细胞悬液。轻柔震荡使细胞均匀分布后放入细胞培养箱静置24h。随后后按上述步骤加入药物进行处理，并随后继续培养72h天、。将6孔板取出后快速吸弃培养基，并各孔加入1mL PBS缓冲液洗涤两次。尽量吸弃各孔残液后，加入1-2mL 4％多聚甲醛，室温固定15min。随后弃去多聚甲醛，加入无水乙醇配制的1％结晶紫染液，染色10min后，迅速倒去染液。使用去离子水4mL反复轻柔洗涤各孔3-5次，期间注意避免直接冲击细胞使之脱落。洗涤完成后将24孔板置于室温干燥。使用宏观正置显微镜拍照，并统计各孔克隆数量。

(六)Caspase 3剪切激活流式检测

将待检测细胞消化离心后用PBS缓冲液离心洗涤2次，再与含有 FITC-DEVD-FMK染色缓冲液混合，在37℃培养箱中避光孵育30min。随后4℃ 1000rpm离心5min弃去上清，并使用PBS缓冲液洗涤细胞3次。最后用300μL PBS缓冲液重悬细胞，并用CyAn ADP流式细胞仪在488nm激光检测剪切后 Caspase 3信号强度。

(七)SA-β-Gal染色实验

使用2％-4％多聚甲醛固定细胞，PBS洗涤两次后弃去。将β-gal与X-Gal 混合染液加入细胞中，在非5％二氧化碳培养箱中37℃孵育12h后取出使用无相差视野拍照或弃去染液加入PBS，4摄氏度保存。

(八)免疫印迹分析

细胞裂解及蛋白收集：将接受处理的细胞消化后，1000rpm 4℃离心5min，弃去终止用培养基，用PBS缓冲液重悬、离心洗涤一次后，吸弃上清，置于冰上。按比例向RIPA细胞裂解液中加入PMSF、蛋白酶抑制剂Cocktail，充分混匀后加入收集到的细胞中。反复吹打重悬细胞并置于冰上孵育30min，每 10min高速震荡细胞裂解液。随后将细胞裂解液4℃12000rpm离心10min，收集上清，置于冰上。BCA蛋白定量：4℃融化天根BCA定量试剂盒中BSA标准液(2μg/μL)。按表1配制标准曲线蛋白溶液。

表1：BSA标准液

将各浓度标准品25μL加入96孔板中，同时将收集的蛋白溶液取5μL与 20μL裂解液混合后也加入96孔板。按50:1的比例混合试剂盒中工作液A及工作液B，向每孔中加入200μL混合液。将96孔板放置于37℃恒温培养箱(无二氧化碳)中孵育30min，随后用Infinite200Pro检测各孔562nm处吸光度。依据标准品吸光度绘制标准曲线，并计算各样品蛋白浓度。向各组蛋白溶液按比例加入6×上样缓冲溶液，充分混匀后100℃煮样变形15min。将样品保存于 -20℃。

SDS-PAGE不连续胶配制：按“表配置对应胶”(表2)中配方按顺序配制合适浓度的SDS-PAGE分离胶。向玻璃胶板夹层中加入4.5mL未凝固的分离胶，并使用75％乙醇溶液封闭凝胶上侧界面。待胶体凝固后，完全弃去、风干乙醇，加入配制好的浓缩胶，并插入15孔梳子。待其凝固后，用保鲜膜包裹放置于4℃冰箱保存。

表2：SDS-PAGE不连续分离胶配方

SDS-PAGE电泳：将配制好的SDS-PAGE不连续胶取出，结合 Mini-PROTEAN Tetra设备组装为电泳系统。分别在凝胶槽内外侧分别加入按比例稀释10×电泳缓冲溶液，使内侧溶液液面高于凝胶上界面，而外侧溶液液面高于其下界面。同时冰上融化蛋白样品，100℃再次煮样5min。待蛋白样品降至室温，将其高速震荡均匀。上样时，拔去凝胶内梳子，根据各样品蛋白浓度按顺序向各孔中加入30μg蛋白样品和蛋白分子标准量。各孔间样品体积差异较大的，用1×上样缓冲液补齐。随后接通电源，恒压80V电泳30min后改用恒压120V电压分离蛋白1h。

PVDF膜蛋白转移：电泳结束后，取出凝胶。切除分离胶部分后，余下凝胶一侧紧贴经甲醇处理的PVDF膜，一同按正确电场位置置入Bio-rad转膜槽中。倒入预冷的转膜缓冲液工作液直至没过PVDF膜上缘。将装置外槽没入冰水中，接通电源，恒定电流180mA转膜2h。

免疫印迹：转膜结束后，取出PVDF膜，用5％脱脂奶粉TBST溶液室温封闭非特异性结合位点2h。弃去封闭缓冲液，加入由5％BSA缓冲液配制的一抗，并放于4℃环境，钟摆式摇床震荡孵育过夜。次日，弃去一抗，TBST 洗涤三次，每次5min。再使用对应的5％BSA缓冲液配制的二抗孵育PVDF 膜。室温孵育2h后，弃去二抗。TBST洗涤三次，每次5分钟。

蛋白检测：抗体标记完毕后，配制ECL显色底物，并均匀覆盖PVDF膜表面。使用LAS生物发光成像仪检测目标蛋白位置ECL底物反应后释放的光子，选择合适曝光时间，并保存图像为Tiff格式。

(九)小鼠原位胰腺癌模型给药实验

实验动物及模型建立：6-8周龄雌性BALB/c裸鼠30只。分为4组，对照组及治疗组1-3，每组7只裸鼠。给药起始时间：裸鼠胰腺癌原位肿瘤模型建立，建模后第二天即开始治疗(即原位种植后第7-10天可开始加药)。

给药剂量：对照组：分两针分别予相应体积的10％HPBCD及4％DMSO/ 40％HPBCD混合溶液，隔天一次，每次每种溶液各100μL；治疗组1：50mg/kg 腺苷及100μL 4％DMSO/40％HPBCD混合溶液；治疗组2：100μL的HPBCD 溶液及20mg/kg GSK690693；治疗组3：每次50mg/kg腺苷及20mg/kg GSK690693。

给药方案：隔天腹腔注射给药(给药1天，停药1天)，每天一次，研究过程共计给药21次。(注：治疗组动物，根据体重计算每日的给药剂量)。

数据收集：每三天一次利用成像系统检测各组动物原位肿瘤面积的大小，并记录数据；仪器观察肝脏、胃、十二指肠、肠系膜等组织器官有无转移病灶；测量动物体重并记录；若有动物死亡，记录动物的死亡日期及有无转移病灶，并-80摄氏度保存肿瘤组织；实验第43天(最后一次给药后第二天)，眼球取血，室温3000rpm离心10min，取上清，-80摄氏度保存；原位胰腺癌组织分为三部分：a.-80摄氏度保存；b.OCT包埋剂包埋；c.福尔马林固定；取部分脏器组织(肝脏、肺脏、胃、十二指肠等)，福尔马林固定。

药物配置方法及给药剂量：a、40％HPBCD混合溶液：以每次45只小鼠，每只体重20g为例，每20g体重使用100μL 40％HPBCD。即称取1.8g HPBCD，溶于4.5mL无菌PBS中。振荡混匀。用于溶解GSK690693时参照下述步骤配制；用于对照组给药时，按体积比加入4％DMSO混匀即可。10％HPBCD。以每次45只小鼠，每只体重20g为例，每20g体重使用100μL 10％HPBCD。即称取0.45g HPBCD，溶于4.5mL无菌PBS中。振荡混匀即可。(可用于腺苷溶解或对照组给药。)b、GSK690693药物用量：GSK690693 200mg，分4管包装(50mg/管)。

药物溶解与冻存：由于该抑制剂难以再次分装，因此每启用一管时需要首先用DMSO将整管药物溶解，再取所需剂量溶于40％HPBCD，用于给药。余下DMSO溶解的药物应冻存在-20℃环境，以备下次使用。

药品配制：以单次给药为例(每20g体重给药0.4mg/100μL)如下：取单支GSK690693，小心开管后加入500μL DMSO，使用Vortex反复振荡摇匀使药物彻底溶解。小鼠称重后计算HPBCD用量。以每只小鼠20g，共22只小鼠计，单次给药共需40％HPBCD溶液2.2mL作为药物1。按小鼠体重计算 GSK690693用量。以每只小鼠20g，共20只小鼠计，单次给药共需8.8mg，即从溶解药物中取88μL作为药物2，加入2.112mL的40％HPBCD后Vortex 混匀(总体积为2.2mL)。此时溶液应呈乳浊液状态，可按相应体积给药作为药物3。(该溶液长时间放置后可能存在沉淀，给药前应注意再次混匀。)余下药物应迅速冻存于-20℃环境。实际实验中共16只小鼠需给予GSK690693，本例中包含两只冗余小鼠的剂量。

二、实验结果

(一)外源腺苷能够同时诱导胰腺癌细胞增殖抑制及p21依赖的衰老

腺苷作为一种由腺嘌呤及核糖通过β-N9糖苷键连接形成的核苷酸，在人体细胞内外都存在广泛分布。在大部分组织的胞外环境中，腺苷浓度基本稳定保持在30-200nM左右。外源腺苷对肿瘤的杀伤作用主要应当来自于其浓度异常引起的腺苷相关代谢及信号通路紊乱。为验证外源高浓度腺苷对胰腺癌的杀伤作用，本发明首先将该药物按一定浓度梯度(0.01mM，0.03mM，0.1mM， 0.3mM，1mM，3mM及10mM)与两株来自ATCC细胞库的胰腺癌细胞系SW1990及BxPC3进行孵育处理，并在加入后72h分别用结晶紫染色方法检测相应浓度下细胞活力。从图(1A)中本发明发现在较低浓度时(0.01-0.3mM)，腺苷对两株胰腺癌细胞都未表现出明显杀伤。而当腺苷浓度升高至1mM及以上浓度时，细胞就表现出明显的增殖抑制。同时，SA-β-Gal染色实验表明(图 1B)，在1mM腺苷作用时，胰腺癌细胞发生明显衰老，而在腺苷处理前预先通过siRNA干扰p21表达能够显著抑制衰老表型的形成。该结果表明，在腺苷抑制胰腺癌细胞增殖过程中伴随着p21依赖的细胞衰老。

(二)P21介导的衰老拮抗了腺苷诱导的胰腺癌细胞凋亡

为了明确p21介导的衰老与腺苷诱导的胰腺癌增殖抑制之间的关键，本发明依据P21是否被干扰及培养基中是否加入腺苷，将两株细胞分别分为四组，即siNC(P21正常表达且腺苷水平正常)、siP21(P21低表达而腺苷水平正常)、 siNC+Ado(P21正常表达但加入腺苷)和siP21+Ado(P21低表达并加入腺苷)。上述四组中，加入腺苷48-72h后，细胞活性显著下降；而在加入腺苷的组别中，如果胰腺癌细胞低表达P21，则其细胞活性将进一步被抑制(图2A)。由于在CCK8中检测中由于腺苷1mM浓度下对胰腺癌细胞的杀伤作用可能遮掩 P21干扰后的作用，本发明再次使用流式细胞术检测了Caspase 3剪切活化的状态(图2B)。在该实验中，相对于单独使用腺苷时，将P21沉默与外源腺苷结合后，胰腺癌的中Caspase 3激活水平提高了10％-15％。对应于Caspase 3 剪切活化的升高，其下游靶蛋白PARP的剪切在给药48h后也被相应的提高(图 2C)。这表明P21是腺苷杀伤胰腺癌的过程中推动细胞进入衰老状态并拮抗凋亡信号的关键蛋白。为了提高腺苷对胰腺癌细胞的杀伤作用，探明P21蛋白上下游信号将可能为本发明打破P21耐药机制提供合适的靶点。

(三)Akt抑制剂GSK690693能够协同增敏腺苷对胰腺癌细胞的杀伤作用

由于胞内p21蛋白水平及活性受到多种激酶的磷酸化调控，因此，本发明使用小分子库对能够影响腺苷对胰腺癌杀伤作用的激酶抑制剂进行筛选，并发现Akt抑制剂GSK690693能够明显促进1mM腺苷对胰腺癌的杀伤。该抑制剂作为ATP结构类似物，能够竞争性抑制Akt活性。将它与腺苷联合处理两株胰腺癌细胞后，GSK690693分别在SW1990及BxPC3中表现出了不同浓度下的腺苷增敏作用：在SW1990细胞中1μM的GSK690693与1mM腺苷联用即可；在BxPC3中10μM该药物与1mM腺苷才有明显促增殖抑制的效果(图 3A)。为了验证GSK690693与腺苷的协同作用，本发明依据Talalay-Chou中效方程设计并检测了GSK690693与腺苷在固定浓度比的前提下，多浓度单独或联合用药后腺苷对胰腺癌细胞的杀伤作用。在汇总相应数据后，本发明依据 Chou-Talalay联合指数方程将GSK690693与腺苷的协同作用量化，并做Fa-CI 图(Fa：受药物影响细胞比例；CI：联合指数)。在该图中，CI值低于1时可认为两种药物间存在协同效应，相反，CI大于1时可认为两种药物间存在拮抗作用(表3和表4)。从SW1990及BxPC3各自的Fa-CI图来看，本发明所验证的药物浓度组合恰好落在协同效应区段，并且两种药物间协同效应对各自药物浓度范围有一定要求(图3B)。

表3：Akt抑制剂GSK690693增敏腺苷对胰腺癌细胞BxPC3的联合指数

表4：Akt抑制剂GSK690693增敏腺苷对胰腺癌细胞SW1990的联合指数

在明确本发明所用GSK690693及腺苷的浓度组合确实存在协同效应后，本发明进一步检测了细胞中凋亡蛋白及Akt下游蛋白的变化情况。在图3C中可以看到，Akt蛋白由于功能被抑制，其磷酸化被反馈性上调。这与过往该抑制剂的研究结论完全相同。而单独使用相应浓度的GSK690693抑制剂并不能在对应细胞中诱发细胞凋亡，但当其与腺苷联合时，凋亡信号激活程度要强于单独使用腺苷。此外，与本发明前期推测一致，当Akt活性被抑制后，腺苷诱导的P21堆积被显著抑制，这与P21干扰后腺苷促凋亡效果增强的现象基本相符(图3C)。据此，本发明认为Akt稳定P21蛋白以拮抗腺苷诱导的凋亡。

(四)GSK690693在小鼠胰腺癌原位模型中增敏腺苷对胰腺癌增殖的抑制作用

本发明将稳定表达EGFP的BxPC3细胞种入28只小鼠的胰体及胰尾连接处。在BxPC3细胞原位种植10天后，本发明将小鼠按照是否给予腺苷或 GSK690693治疗分为四组，并开始通过腹腔注射给予治疗药物：溶于羟丙基-β- 环糊精的腺苷(50mg/kg)及GSK690693(20mg/kg)进行治疗。每两次给药间隔一天。同时，每次给药前，使用小动物实时荧光检测系统拍摄小鼠体内肿瘤荧光图像。通过统计各检测时间点荧光面积大小，本发明得到了小鼠体内胰腺癌增殖的实时图像及曲线，如图4A及图4C。在给予腺苷及GSK690693治疗的实验组中，小鼠体内胰腺癌平均荧光面积明显小于对照组小鼠，同时其肿瘤增殖速率慢于对照组个体；而在腺苷及GSK690693联合治疗组中，其胰腺癌荧光面积和增殖速率相对单独给药的两组进一步显著降低。在给药42天后，治疗结束。小鼠体内瘤块被取出，并分别在白光及荧光激发的条件下拍照记录其瘤体大小。对其荧光面积的分析显示在治疗终点，联合治疗小组体内肿瘤体积显著小于其他单独治疗组个体的肿瘤(图4B及图4D)。此外，相比于腺苷，GSK690693在单独治疗过程中显示出了个体间较大的差异性，而与腺苷连用后，个体间差异减小，治疗效果增强。

(五)GSK690693在小鼠胰腺癌原位模型中增强腺苷诱导的凋亡信号

在记录小鼠原位胰腺癌模型中的肿瘤大小后，每个瘤块被各取一部分用于多聚甲醛固定后免疫组织化学检测。如图5A所示，本发明分别使用抗体标记并检测了各组切片中反映细胞增殖状态的Ki67及凋亡关键的蛋白Caspase 3的剪切激活。在对照组中，Ki67强烈高表达而Caspase 3基本无明显剪切；单独使用腺苷或GSK690693治疗后，小鼠体内胰腺癌的Ki67表达部分减弱，同时 Caspase 3开始出现剪切激活；而将小鼠进行联合治疗后，其肿瘤组织内Ki67 表达被强烈抑制，同时Caspase 3显著激活(图5A)。

作为对胰腺癌阻滞免疫组化检测的补充，本发明将各小鼠肿瘤分部液氮冻存后研磨、破碎并收集其蛋白进行Western Blot检测。在得到各组Caspase 3、 P21及Akt磷酸化条带后，为了排除小鼠个体差异，本发明将各样品蛋白检测条带的灰度值与内参蛋白Actin灰度值相比后得到其相对内参表达量并进行统计分析。结果显示，Caspase 3的激活水平与免疫组化结果一致。同时 GSK690693用药后，肿瘤组织中Akt磷酸化水平与体外实验结果一样，出现补偿性上调。而由于个体间差异，P21蛋白水平变化在四组小鼠中无显著差异的，但在腺苷及GSK690693联合治疗后存在回归本底表达水平的趋势(图5B)。

上述结果表明，腺苷在小鼠原位模型中对胰腺癌具有显著治疗效果，并且 Akt抑制剂与腺苷联用能降低胰腺癌细胞对腺苷的耐受，促进腺苷诱导的细胞程序性死亡。腺苷及GSK690693联合治疗的方案具有临床应用的潜力和价值。

三、讨论

通过上述研究，本发明发现了Akt-P21信号对调控腺苷处理后胰腺癌细胞衰老和凋亡命运转换的重要功能。其中，Akt作为PI3K下游介导mTOR等蛋白磷酸化激活的关键蛋白，是由高迁移率蛋白HMGB-1激活并经NF-κB、 CREB、Foxo Head蛋白及Bad介导胰腺癌耐药的关键基因([1].Feng X,C Wu, M Yang,et al.Role of PI3K/Akt signal pathway onproliferation of mesangial cell induced by HMGB1[J].Tissue Cell,2016,48(2):p.121-125.)。已有研究报道，在高表达Akt的MIA PaCa-2胰腺癌细胞系中使用Akt抑制剂后能够诱导细胞凋亡并增敏吉西他滨和紫杉醇，而在BxPC3及PANC1等Akt低表达细胞中则未观察到该效应([2].Fahy B N,M G Schlieman,S Virudachalam,et al.Inhibition ofAKT abrogates chemotherapy-induced NF-kappaB survival mechanisms:implications for therapy in pancreatic cancer[J].J Am Coll Surg,2004,198(4):p. 591-599.[3].Kagawa S,S Takano,H Yoshitomi,et al.Akt/mTOR signaling pathwayis crucial for gemcitabine resistance induced by Annexin II in pancreaticcancer cells[J].J Surg Res,2012,178(2):p.758-767.)。而在本发明的研究中，Akt 新型抑制剂GSK690693在1-10μM浓度下能轻微抑制体外胰腺癌细胞增殖，但并未显著诱导细胞凋亡；而在体内研究中，GSK690693按照20mg/kg剂量给药时已能够导致Caspase 3激活。这表明，Akt在胰腺癌细胞的增殖与耐药过程中都有重要功能。此外，在小鼠模型中，单独使用GSK690693治疗BxPC3 细胞增殖形成的原位胰腺癌后，小鼠个体间瘤体体积差异非常明显。本发明推测这可能是由于在Akt低表达的BxPC3细胞中，GSK690693抑制Akt激酶活性后刺激其磷酸化水平补偿性升高的负反馈调节放大了个体间药物浓度及代谢水平的差异，从而导致最终治疗效果间的差异。值得注意的是，在将 GSK690693与腺苷联合后，小鼠体内的瘤体不仅平均体积减小，并且其个体差异也相对缩小。这表明腺苷帮助稳定了GSK690694对Akt的抑制功能。

P21作为Cip/Kip周期调控蛋白家族的一员，其蛋白序列中多个位点的丝氨酸/苏氨酸都能够被Akt磷酸化并影响其亚细胞定位、蛋白功能及泛素化降解状态。在本发明的研究中，信号轴上游蛋白Akt对于腺苷处理后P21蛋白堆积有着重要的作用。依据文献报道，Akt对于维持P21蛋白水平的方式主要依靠它对P21蛋白第146位丝氨酸磷酸化功能([4].LiY,D Dowbenko,L A Lasky. AKT/PKB phosphorylation of p21Cip/WAF1enhancesprotein stability of p21Cip/WAF1and promotes cell survival[J].J Biol Chem,2002,277(13):p. 11352-11361.[5].Rossig L,A S Jadidi,C Urbich,et al.Akt-dependent phosphorylation of p21(Cip1)regulates PCNA binding andproliferation of endothelial cells[J].Mol Cell Biol,2001,21(16):p.5644-5657.)。当P21发生 Ser146磷酸化时，它与泛素化降解相关蛋白的结合被抑制，从而提高了它的蛋白稳定性。同时Akt还能够磷酸化P21第145位苏氨酸，而该位点的磷酸化抑制了P21与PCNA的结合，促进了后者诱导的DNA合成。当两个事件同时发生时，细胞就处于P21堆积并维持增殖活性的状态下。一般认为，这是Akt 诱导P21堆积形成紫杉酚耐药性的主要机制。在本发明的研究中，外源腺苷处理的胰腺癌细胞内Akt抑制后P21蛋白水平的迅速下降表明上述丝氨酸磷酸化机制同样存在与腺苷作用过程中。但在P21堆积及下调两种情况下，衰老细胞比例的变化也表明P21同样参与了周期组织和细胞衰老，这说明在腺苷作用时 Akt对P21的功能以146位磷酸化为主。

此外，在胰腺癌细胞中加入外源腺苷后P21蛋白水平对细胞最终进入衰老状态还是凋亡程序有着重要的决定作用。在现有研究中，药物引起的肿瘤细胞衰老状态对治疗效果及耐药性的影响还没有定论。但部分实验数据显示，衰老细胞能够通过DNA损伤相关分泌程序及衰老信号分泌小体向胞外释放IL6及 IL8等炎症信号从而塑造促进耐药的肿瘤微环境([6].Sharpless N E,C J Sherr. Forging a signature of in vivo senescence[J].Nat Rev Cancer,2015,15(7):p. 397-408.[7].Childs B G,D J Baker,J L Kirkland,et al.Senescence and apoptosis: dueling or complementary cell fates？[J].EMBORep,2014,15(11):p.1139-1153. [8].Gordon R R,P S Nelson.Cellular senescenceand cancer chemotherapy resistance[J].Drug Resist Updat,2012,15(1-2):p.123-131.)。同时，在肺癌中的研究还报道了进入衰老状态的细胞通过上调表达Cdc2重新恢复增殖能力。因此，将腺苷与Akt抑制剂GSK690693联用抑制P21导致的细胞衰老、促进凋亡信号是更为稳妥有效的胰腺癌腺苷治疗方案。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.腺苷和Akt抑制剂联用在制备治疗胰腺癌药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的腺苷和Akt抑制剂联用在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的Akt抑制剂为GSK690693；所述的腺苷和GSK690693的药物浓度比例为1mM：1-10μM。

3.根据权利要求1所述的腺苷和Akt抑制剂联用在制备治疗胰腺癌药物中的应用，其特征在于，所述的腺苷和Akt抑制剂联用抑制肿瘤组织内Ki67表达，同时激活Caspase 3；所述的腺苷和Akt抑制剂联用抑制P21导致的细胞衰老、促进凋亡信号。

4.一种具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合，其特征在于，由腺苷和Akt抑制剂组成。

5.根据权利要求4所述的具有协同作用的胰腺癌治疗药物组合，其特征在于，所述的Akt抑制剂为GSK690693；所述的腺苷和GSK690693的药物浓度比例为1mM：1-10μM。

6.Akt抑制剂在制备胰腺癌对外源腺苷增敏剂中的应用。

7.根据权利要求6所述的Akt抑制剂在制备胰腺癌对外源腺苷增敏剂中的应用，其特征在于，所述的Akt抑制剂为GSK690693；所述的腺苷和GSK690693的药物浓度比例为1mM：1-10μM。

8.腺苷和Akt抑制剂联用在制备抑制肿瘤组织内Ki67表达，同时激活Caspase 3的药物中的应用。

9.腺苷和Akt抑制剂联用在制备抑制P21导致的细胞衰老、促进凋亡信号的药物中的应用。

10.腺苷和Akt抑制剂联用在制备促进Caspase 3、Caspase 9及PARP的剪切激活并抑制p21的蛋白堆积的药物中的应用。