CN115869302A

CN115869302A - 包含gsdme激动剂和gsdmd激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用

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Publication number: CN115869302A
Application number: CN202310175480.4A
Authority: CN
Inventors: 邹天乐; 张贤彬; 巩鹏; 张瑾泽; 张薇; 王妍
Original assignee: Shenzhen University General Hospital
Current assignee: Shenzhen University General Hospital
Priority date: 2023-02-28
Filing date: 2023-02-28
Publication date: 2023-03-31
Anticipated expiration: 2043-02-28
Also published as: CN115869302B

Abstract

本发明公开了包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物及在制备胰腺肿瘤焦亡药物中的应用，其中GSDME激动剂为东莨菪内酯，GSDMD激动剂为3,4,5‑三甲氧基肉桂酸，二者组合作用下分别通过同时激动胰腺肿瘤细胞中Caspase‑3/GSDME以及Caspase‑1/GSDMD的活性，协同促进胰腺肿瘤细胞焦亡，进而增强彼此杀伤胰腺肿瘤的作用。该组合物相对于单一成分用药具有显著的协同增效作用，为制备新型抗肿瘤药物，缓解胰腺癌患者的痛苦提供了新的选择。

Description

包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用

技术领域

本发明涉及制药领域，具体涉及包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物及在促胰腺肿瘤焦亡药物中的应用。

背景技术

吉西他滨等传统化疗药物主要通过引起肿瘤细胞发生凋亡或者坏死而发挥抗肿瘤作用。当化疗药物进入肿瘤细胞后，其可以激活半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartate-specific protease，Caspase）家族Caspase3，Caspase 7和Caspase 9等蛋白的活性，进而引起肿瘤细胞核破裂，质膜起泡，细胞皱缩，形成凋亡小体，细胞发生凋亡和坏死。

在既往研究中，有学者发现与传统的细胞凋亡和坏死不同，当肿瘤细胞发生炎症反应时，细胞核保持完整，而细胞不断肿胀膨大，并且在细胞内会出现许多气泡状突出物，直至细胞膜破裂形成碎片，这种细胞死亡方式被定义为细胞焦亡。这种新型的细胞死亡方式为抗肿瘤药物的研发开辟了新天地。但是目前现有技术中关于胰腺肿瘤细胞焦亡分子机制的研究较少，而关于调控肿瘤细胞焦亡的药物的研究更是少之又少。当机体受到微生物或内源性刺激后，caspase-1/3/4/5/11被激活，GSDMD活化，在膜上形成孔隙，细胞肿胀，最终导致质膜破裂，大量内源性物质被释放，导致细胞焦亡。GSDMD被认为是典型的细胞焦亡蛋白，细胞焦亡本质上是由GSDMD蛋白介导的细胞炎性坏死，与多种病理生理过程紧密相关。然而现有技术中一般是针对如何抑制GSDMD所介导的细胞焦亡的研究较多，因为GSDMD被激活后的细胞焦亡的炎症性坏死在本领域人员看来对人体是有害的，对于如何诱正确诱导并应用于肿瘤细胞的焦亡却没有相关研究。

在现有技术中，CN112831479B公开了一种用于序列特异性蛋白酶检测的分子开关，虽然该专利公开了GSDME和GSDMD两种蛋白，但是在此申请中所解决的问题是提高序列特异性蛋白酶检测的信噪比，并不涉及如何同时激活GSDME和GSDMD两种通道蛋白的表达。CN114569722B则揭示了GSDMD依赖的血小板焦亡的病理过程，同时发现血小板焦亡是由于血浆中异常增加的S100A8/A9通过上调TLR4信号通路诱导产生，但并不涉及具体某种物质将Caspase 1/GSDMD通道蛋白激活表达为GSDMD-N，更不涉及Caspase3/GSDME通道蛋白相关表达情况。

东莨菪内酯（Scopoletin、7-羟基-6-甲氧基香豆素、简称SP）存在与多种植物中。现有文献Yuan C, Wang MH, Wang F, Chen PY, Ke XG, Yu B, Yang YF, YouPT, Wu HZ.Network pharmacology and molecular docking reveal the mechanism ofScopoletinagainst non-small cell lung cancer表明：东莨菪内酯用于治疗肿瘤具有一定的疗效，但是尚未有文献报道其在治疗胰腺肿瘤中的作用。此外，3,4,5-三甲氧基肉桂酸（3,4,5-Trimethoxy cinnamic acid，简称TCA）是从远志中分离得到的苯丙素类化合物，具有抗应激作用，能够延长动物的睡眠时间，其在治疗肿瘤中的效果尚不明确。

进一步的，现有技术中，CN105142638B公开了东莨菪碱（东莨菪内酯）与9,10-二甲氧基-2-(2,4,6-三甲基苯基亚氨基)-3-(N-氨甲酰基-2-氨基乙基)-3,4,6,7-四氢-2H-嘧啶并[6,1-a]异喹啉-4-酮作为组合物治疗哮喘等慢性呼吸道疾病中的应用，该技术虽也有提到东莨菪碱（东莨菪内酯），但其所应用的疾病与本申请的胰腺癌完全不同，也没有涉及肉桂酸。CN112716939B也公开了东莨菪内酯在治疗缺血性心脑血管疾病制剂中的应用，但没有设计如何预防和治疗胰腺癌等相关药物，全文中也不涉及东莨菪内酯调控细胞焦亡的相关蛋白等。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种组合物，包括GSDME激动剂和GSDMD激动剂，用于制备促胰腺肿瘤焦亡药物。

优选地，所述GSDME激动剂为东莨菪内酯，所述GSDMD激动剂为肉桂酸。

优选地，所述GSDME激动剂激动胰腺肿瘤细胞内Caspase-3/GSDME的活性。优选地，所述GSDMD激动剂激动胰腺肿瘤细胞内Caspase-1/GSDMD的活性。

优选地，所述肉桂酸为3,4,5-三甲氧基肉桂酸。本发明的第二方面在于提供一种协同促胰腺肿瘤细胞焦亡的药物组合物，包括东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸。

优选地，所述药物组合物的给药方式包括通过口服、皮下、腹腔或者静脉注射进行给药。

本发明的第三方面在于提供一种药物组合物，包括东莨菪内酯、3,4,5-三甲氧基肉桂酸以及药学上可接受的剂型。

优选地，所述剂型包括口服制剂型或非口服制剂型。

优选地，所述口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒、微囊。

优选地，所述非口服剂型包括注射液、冻干粉针、凝胶、外用制剂或腔道给药制剂。

相比现有技术，本发明的有益效果在于：

1.本发明所提供的GSDME激动剂和GSDMD激动剂作为组合物，在药理学层面针对性地激动胰腺肿瘤细胞中Caspase-3/GSDME蛋白和Caspase-1/GSDMD蛋白的活性，进而促进胰腺肿瘤细胞焦亡。

2.GSDME激动剂和GSDMD激动剂组合用药与单一用药相比，对于促进胰腺肿瘤细胞焦亡具有显著的协同增效作用。

3.揭示了东莨菪内酯可以作为GSDME激动剂，3,4,5-三甲氧基肉桂酸可以作为GSDMD激动剂，在组合用药的前提下对于促进胰腺肿瘤焦亡具有显著的协同增效作用。

4.包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的药物组合物制备工艺简单、经济成本较低，为胰腺肿瘤的预防和治疗提供了新的药物研究选择，为缓解胰腺癌患者的痛苦提供了疗效确切、安全可靠、使用方便的新选择。

附图说明

图1为东莨菪内酯Westernblot检测两种胰腺肿瘤细胞相关蛋白表达条带图；

图2为3,4,5-三甲氧基肉桂酸Westernblot检测两种胰腺肿瘤细胞相关蛋白表达条带图；

图3为不同药物组处理胰腺肿瘤细胞后LDH表达情况箱型图；

图4为东莨菪内酯单一用药处理后胰腺肿瘤细胞增殖曲线图；

图5为3,4,5-三甲氧基肉桂酸单一用药处理后胰腺肿瘤细胞增殖曲线图；

图6为不同药物组处理后胰腺肿瘤细胞增殖箱型图；

图7为AnnexinV-FITCPI染色检测胰腺肿瘤细胞死亡率成像图；

图8为根据流式细胞仪统计的胰腺肿瘤细胞死亡率箱型图；

图9为根据流式细胞仪统计的胰腺肿瘤细胞焦亡率成像图；

图10为不同药物组处理后胰腺肿瘤细胞死亡率箱型图；

图11为不同药物组处理后小鼠小动物活体成像图；

图12为不同药物组处理后所分离下来的小鼠胰腺肿瘤记录图；

图13为不同药物组处理后小鼠胰腺肿瘤重量统计箱型图。

具体实施方式

本发明公开了包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物及在促胰腺肿瘤焦亡药物中的应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

根据本发明的一些实施方式，所述药物组合物可以为液体制剂，例如注射液；也可以为冻干粉针剂，实施给药时与液体辅料混合，配制成液体制剂。所述液体制剂可以但不限于用于皮下、肌肉或静脉注射给药，也可以但不限于通过喷雾给药到肺脏、或通过喷雾经肺脏给药到其它脏器组织（如肝脏）。优选地，所述药物组合物用于静脉注射给药。

适于本发明方法的给药途径包括局部给药和全身给药。可通过本领域已知的任何合适途径向受试者给药，所述途径包括但不仅限于：口服或胃肠外途径，包括静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、经皮给药、直肠给药和口服给药（包括口腔含化给药和舌下给药）。适于本发明方法的给药剂量可为本领域常规的剂量，所述剂量可以根据各种参数、尤其是受试者的年龄、体重和性别来确定。可基于由细胞培养分析和动物研究得到的数据得出人用剂量的范围。对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

除非特别说明，本发明提供的含有东莨菪内酯的药物组合物的制备方法中所用材料或试剂均可由市场购得。

生物原料：MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞系、PDA胰腺肿瘤细胞系、东莨菪内酯（7-羟基-6-甲氧基香豆素，拉丁名Scopoletin，简称SP，PubChemCID 5280460）、3,4,5-三甲氧基肉桂酸（拉丁名3,4,5-Trimethoxy cinnamic acid，简称TCA，PubChemCID 735755）、C57BL/6小黑鼠等。

试剂：二甲基亚砜（DMSO）、细胞培养液、胰酶、生理盐水、膜联蛋白结合缓冲液（Annexin V Binding Buffer）、细胞凋亡检测染液（Annexin V-FITC染液）、PI染液、上样缓冲液（BindingBuffer）、细胞固定液（FixDenat solution）、二抗（Anti-BrdU-PODworkingsolution）、洗涤液（Washing solution）、底物溶液（Substrate solution）、95%浓硫酸、BrdU标签液（BrdUsolution）、细胞固定液（FixDenat solution）、二抗（Anti-BrdU-POD workingsolution）等。

实验仪器及耗材：酶标仪、96孔板、移液枪、离心管、手术刀、缝合线、高速离心机等、流式细胞仪。

实施例一：

1实验目的：检测GSDME激动剂（东莨菪内酯）和GSDMD激动剂（3,4,5-三甲氧基肉桂酸）在单一用药及联合用药条件下对胰腺肿瘤细胞焦亡通路的影响。

2实验背景：当胰腺肿瘤细胞发生焦亡的时候，Caspase-1和Caspase-3等焦亡蛋白被切割为CleavedCaspase-1和Cleaved Caspase-3，随后Cleaved Caspase-1和CleavedCaspase-3可以分别切割导致细胞焦亡的执行蛋白GSDMD和GSDME，被切割后的GSDMD和GSDME蛋白分别形成GSDMD-N和GSDME-N，上述形成的GSDMD-N和GSDME-N可以导致细胞穿孔，最终导致胰腺肿瘤细胞焦亡，因此通过Western blot实验检测GSDMD和GSDME两种蛋白的激活情况，即可初步判断胰腺肿瘤细胞是否发生焦亡。

3实验方法 3.1肿瘤细胞前处理：(1)将装有肿瘤细胞的细胞冻存管从液氮罐中取出，随后立即放置于37°C水浴锅中，反复摇晃使其迅速解冻；

(2)待肿瘤细胞解冻为液体后，将细胞连同细胞冻存管一起转移至超净工作台内；(3)利用移液枪，将上述细胞悬浮液转移至装有10mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养基的离心管中，按照1300 rmp，离心5分钟；(4)弃掉上清，向离心管中加入5mL DMEM完全培养基，重悬细胞后，将其缓慢吹匀，随后将其转移至细胞培养皿中，放置于37℃，5%CO₂的培养箱内培养。

(5)待细胞生长至对数期后，利用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤肿瘤细胞；(6)使用0.025%的胰酶孵育肿瘤细胞，在此过程中，实验操作者需不断用手指敲打细胞培养皿的边缘，使肿瘤细胞被消化为单个细胞；

(7)利用细胞培养基终止胰酶消化，利用细胞计数板计算肿瘤细胞数目；

(8)按照每孔2.4×10⁴个细胞，将胰腺肿瘤细胞种植于6孔板中。

3.2配置对比溶液：

称取500mg东莨菪内酯，将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL的东莨菪内酯母液；称取500mg3,4,5-三甲氧基肉桂酸，将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL3,4,5-三甲氧基肉桂酸溶液的母液，随后按照表1方案配置相应浓度的溶液。

表1.不同用药组溶液配方表

用药组溶液	DMEM(mL)	DMSO(mL)	SP(mL)	TCA(mL)
					Sham	7.2	0.8	/	/
SP(2.5mg/mL)	7.2	0.4	0.4	/
					TCA(2.5mg/mL)	7.2	0.4	/	0.4
SP+TCA	7.2	/	0.4	0.4

待细胞生长24小时后，将上述Sham组、SP组、TCA组、SP+TCA组按照2mL/孔添加到6孔板中，孵育6孔板中的肿瘤细胞24小时。

3.3信号通路蛋白检测实验：

(1)使用移液枪去除6孔板中的培养基，利用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤6孔板中所有的肿瘤细胞；

(2)将150μL含有50mMTris (pH7.4)、150mM NaCl、1% Triton X-100、1%sodiumdeoxycholate、0.1% SDS以及sodium orthovanadate、sodium fluoride、EDTA和leupeptin等抑制剂的细胞裂解液分别添加至上述不同分组的肿瘤细胞内，利用细胞刮快速刮取培养基中的细胞，将含有细胞碎片以及蛋白质的细胞裂解液收集至Sham组、SP组、TCA组、SP+TCA组相应的离心管中；

(3)利用超声波细胞破碎仪裂解步骤（2）离心管中的肿瘤细胞2分钟，然后在15000rmp离心机中，离心10分钟；

(4)保留步骤(3)中离心管的上清液作为蛋白样本溶液，利用BCA法（bicinchoninic acid）检测蛋白浓度；

(5)取步骤(4)中的蛋白样本溶液120μL，加入上样缓冲液（loading buffer），在100°C条件下金属浴10分钟，使蛋白变性，得蛋白样品。

(6)利用PAGE凝胶快速制备试剂盒配制分离胶和浓缩胶，步骤包括：取等体积下层胶溶液和下层胶缓冲液将其混匀后，向其中加入40μL的改良型促凝剂，混匀后，将上述溶液注入制胶玻璃板中，使液面和短玻璃板上沿之间的距离比梳齿长0.5厘米，随后加入适量水，覆盖于下层胶之上。待下层胶凝固后，倒去上层的水。随后，取等体积上层胶溶液和彩色上层胶缓冲液，混匀。向其中加入10μL的改良型促凝剂，混匀；将该溶液注入制胶玻璃板中，插入梳齿；待上层胶凝固后，拔去梳齿。

(7)根据蛋白样品的浓度，计算每个泳道上样体积，将步骤(6)中的蛋白样品加至相应的泳道，按照90V，30min和120V，60min的电泳条件，进行电泳。

(8)电泳结束后，将适度大小的蛋白胶覆于滤纸上，并且将甲醇浸泡活化后的PVDF膜盖于胶上，随后在其表面覆盖滤纸和海绵，将其置于转膜槽中，进行转膜；转膜结束后，将膜转移至含有50mL1×TBST和含有5%的2.5g脱脂奶粉的溶液中，室温下在摇床上孵育封闭1小时。

(9)用TBST轻轻洗去残留在膜上的牛奶，分别将其置于Caspase-3、GSDME、Caspase-1和GSDMD等一抗中孵育，过夜；一抗孵育结束后，用TBST在室温下洗涤三次，每次10分钟；室温下，孵育二抗1小时。

(10)将200μL化学发光液滴加于保险膜上，并将PVDF膜正面覆盖其上，使膜能均匀孵育，1分钟后，使用蛋白转印成像仪显影。

4实验结果及分析：

图1为东莨菪内酯处理胰腺肿瘤细胞后，用Western blot检测细胞蛋白表达的条带图。图2为3,4,5-三甲氧基肉桂酸处理胰腺肿瘤细胞后，用Westernblot检测细胞蛋白表达的条带图，两组条带图谱表明：

东莨菪内酯单一用药可以显著上调细胞内CleavedCaspase-3蛋白的表达，进而引起GSDME裂解为GSDME-N，导致胰腺肿瘤细胞焦亡；然而东莨菪内酯对于Caspase-1/GSDMD信号通路的活性的激活效果不显著。

而3,4,5-三甲氧基肉桂酸单一用药对于Caspase-3/GSDME信号转导通路活性的激活效果不显著，然而显著上调胰腺肿瘤细胞内Caspase-1/GSDMD的活性，进而引起肿瘤细胞发生焦亡。

综上所述，利用东莨菪内酯孵育肿瘤细胞后，可以引起肿瘤细胞的Caspase-3/GSDME信号通路被激活；利用3,4,5-三甲氧基肉桂酸孵育肿瘤细胞后，可以引起肿瘤细胞的Caspase-1/GSDMD信号通路被激活。两条信号通路的激活都促进了胰腺肿瘤细胞的焦亡，因此将东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸进行混合，同时孵化肿瘤细胞，能将Caspase-3/GSDME和Caspase-1/GSDMD两条信号通路同时激活，协同促进腺肿瘤细胞的焦亡。

实施例二：

焦亡信号蛋白(LDH)检测实验：

1实验背景及目的：当肿瘤细胞发生焦亡的时候，细胞内的乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）会从肿瘤细胞当中释放至培养基中，因此检测LDH的释放量就可以证明在不同的用药前提下，肿瘤细胞的焦亡情况。

2.实验过程

2.1前处理实验：

对于肿瘤细胞的前处理步骤与Caspase-3/GSDME和Caspase-1/GSDMD通道蛋白一致，此处不赘述。

2.2检测胰腺肿瘤细胞中LDH实验：

2.2.3实验步骤：

(1)待细胞生长至对数期后，利用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤肿瘤细胞，随后用0.025%的胰酶孵育肿瘤细胞，在此过程中，不断用手指敲打细胞培养皿的边缘，使肿瘤细胞被消化为单个细胞。

(2)利用细胞培养基终止胰酶消化，利用细胞计数板计算肿瘤细胞数目。随后，按照每孔2×10³个细胞，将其种植于96孔细胞培养板中。

(3)将上述细胞培养板放置于37℃，5%CO₂的培养箱内培养24小时后，随后按照表2方案配置下述溶液：

表2.检测LDH含量不同用药组溶液配方表（SP:TCA=1:1）

用药组溶液	DMEM(mL)	DMSO(mL)	SP(mL)	TCA(mL)
					Sham	1.8	0.2	/	/
SP(2.5mg/mL)	1.8	0.1	0.1	/
					TCA(2.5mg/mL)	1.8	0.1	/	0.1
SP+TCA	1.8	/	0.1	0.1

(4)将上述溶液添加至相应的细胞培养板中，再次将其置于37℃，5%CO₂的培养箱内培养24小时。

(5)孵育24小时后，将细胞培养板置于离心机中，在400g下，离心5分钟，弃上清。

(6)加入150μL经PBS稀释后的LDH释放试剂，适当摇匀后，将其继续置于细胞培养箱中孵育1小时。

(7)将上述细胞培养板再次置于离心机中，在400g下，离心5分钟，离心结束后，取上清液120μL，加入到一新的96孔板相应孔中，随即检测细胞培养皿中LDH的含量，相关数据记录在表格3中，结果如表3及图3所示。

表3.不同用药条件下肿瘤细胞释放的LDH含量统计表（SP:TCA=1:1）

药物种类	实验1	实验2	实验3	实验4	平均数	标准差
							Sham	8.16	10.23	12.31	6.5	9.30	2.52
2.5mg/mL SP	27.7	25.85	26.8	20.32	25.17	3.32
							SP+TCA	70.56	72.61	77.32	79.81	75.08	4.24
2.5mg/mL TCA	24.21	27.64	22.31	23.61	24.44	2.27

2.2.4LDH检测实验结果分析

从表3以及图3可以看出，相对于东莨菪内酯与3,4,5-三甲氧基肉桂酸单一用药，将两者进行混合后，肿瘤细胞释放乳酸脱氢酶(LDH)的含量明显高于单一用药组，都显示出极显著增加(SP+TCA: SP=75.08:25.17，P<0.01；SP+TCA:TCA=75.08:24.44，P<0.01)。

LDH检测实验的实验结果进一步证明了东莨菪内酯联合3,4,5-三甲氧基肉桂酸同时打开了Caspase-3/GSDME和Caspase-1/GSDMD两条通道蛋白，促进胰腺肿瘤细胞焦亡，胰腺肿瘤细焦亡越彻底，所产生的代谢物质乳酸脱氢酶(LDH)就越多，在本实施例所公开的实验当中得到证实。

综上所述，从LDH含量检测的实验中也可以得出实验结论：东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸混合用药后，对于促进肿瘤细胞焦亡具有显著的协同增效作用。

实施例三：

检测胰腺肿瘤细胞死亡率。

1实验目的：利用流失细胞仪检测肿瘤细胞在不同的用药前提下的死亡率。

2实验方法：

2.1肿瘤细胞的前处理实验：

(1)将装有肿瘤细胞的细胞冻存管从液氮罐中取出，随后立即放置于37°C水浴锅中，反复摇晃使其迅速解冻；

(2)待肿瘤细胞解冻为液体后，将细胞连同细胞冻存管一起转移至超净工作台内；(3)利用移液枪，将上述细胞悬浮液转移至装有10mL含10%胎牛血清的DMEM完全培养基的离心管中，按照1300 rmp，离心5分钟；(4)弃掉上清，向离心管中加入5mLDMEM完全培养基，重悬细胞后，将其缓慢吹匀，随后将其转移至细胞培养皿中，放置于37℃，5%CO₂的培养箱内培养。

(8)按照每孔3×10⁴个细胞，将胰腺肿瘤细胞种植于96孔板中。

2.2配置对比溶液：

称取500mg东莨菪内酯（Scopoletin，SP），将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL的东莨菪内酯母液；随后称取500mg 3,4,5-三甲氧基肉桂酸（3,4,5-Trimethoxycinnamicacid，TCA），将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL 3,4,5-三甲氧基肉桂酸溶液的母液，随后按照表4-6方案配置相应浓度的对比溶液。(1)SP(东莨菪内酯)单一用药实验组：

表4.东莨菪内酯单一用药溶液配方表

用药组溶液	DMEM(mL)	DMSO(mL)	SP(mL)	TCA(mL)
					Sham	1.8	0.2	/	/
SP(2.5mg/mL)	1.8	0.1	0.1	/
					SP(5mg/mL)	1.8	0.2	/	/

(2)TCA(3,4,5-三甲氧基肉桂酸)单一用药实验组：

表5.3,4,5-三甲氧基肉桂酸单一用药溶液配方表

用药组溶液	DMEM(mL)	DMSO(mL)	SP(mL)	TCA(mL)
					Sham	1.8	0.2	/	/
TCA(2.5mg/mL)	1.9	0.1	0.1	/
					TCA (5mg/mL)	1.8	0.2	/	/

(3)混合对照组（SP、TCA单一用药与混合用药）：

表6.混合用药组溶液配方表

用药组溶液	DMEM(mL)	DMSO(mL)	SP(mL)	TCA(mL)
					Sham	1.8	0.2	/	/
SP(2.5mg/mL)	1.8	0.1	0.1	/
					TCA (2.5mg/mL)	1.8	0.1	/	0.1
SP+TCA	1.8	/	0.1	0.1

2.3检测肿瘤细胞增殖率：

2.3.1检测步骤：

(1)去除96孔板中的培养基，向96孔板中按照200μL/孔，添加细胞固定液（FixDenatsolution），室温下孵育细胞30分钟；

(2)清除96孔板中的细胞固定液，按照1:100的比例对二抗（Anti-BrdU-PODworking solution）进行稀释，得稀释后的二抗溶液；向96孔板的细胞中按照100μL/孔添加上述二抗，室温下孵育细胞90分钟。

(3)按照1:10的比例，对洗涤液（Washingsolution）进行稀释，得稀释后的洗涤液，随后去除96孔板中的抗体稀释液，并向96孔板中添加上述稀释后的洗涤液300μL/孔，如此洗涤96孔板中的胰腺肿瘤细胞3次。

(4)去除96孔板中的洗涤液，向96孔板中按照100μL/孔加入底物溶液（Substratesolution），在室温下孵育肿瘤细胞5分钟。

(5)孵育完成后，向96孔板中按照2μL/孔加入95%浓硫酸，终止胰腺肿瘤细胞与底物溶液的反应。

(6)反应完成的混合液用酶标仪在450nm处测定其吸光度(OD值)。

2.3.2实验结果：

检测SP(东莨菪内酯)单一用药实验组的OD值，记录在表7中。分别将不同浓度下的东莨菪内酯（0mg/mL、2.5mg/mL、5mg/mL）用移液枪转移进96孔板中，处理胰腺肿瘤细胞，孵育24小时，然后用酶标仪测量其吸光度（OD值），平行重复3次，记录实验在表7中，结果如表7和图4所示。

表7.东莨菪内酯单一用药肿瘤细胞增殖量统计表

溶液浓度	实验1	实验2	实验3	平均数	标准差
						0mg/mL	2.122	2.199	2.046	2.122	0.076
2.5mg/mL	1.948	1.891	2.158	1.999	0.14
						5mg/mL	1.463	1.563	1.488	1.504	0.052

图4为根据表7绘制的曲线图，观察3次平行实验的平均值，可以看出，随着东莨菪内酯溶液的浓度的升高，OD值的平均值从2.122下降至1.505。因此可以得出结论：东莨菪内酯对于抑制胰腺肿瘤细胞增殖具有一定的积极作用，且随着浓度越高，对于胰腺肿瘤细胞增殖的抑制作用就越强。

检测TCA(3,4,5-三甲氧基肉桂酸)单一用药实验组的OD值，记录在表8中，结果如图5所示。

图5为根据表8绘制的曲线图，观察3次平行实验的平均值，可以看出，随着3,4,5-三甲氧基肉桂酸溶液的浓度的升高（从0mg/mL升至5mg/mL），吸光度的平均值从2.745下降至2.399。因此可以得出结论：3,4,5-三甲氧基肉桂酸对于抑制胰腺肿瘤细胞增殖也具有一定的积极作用，且浓度越高，对于胰腺肿瘤细胞增殖的抑制作用就越强。

混合对照组(SP、TCA单一用药与混合用药)检测实验：

平行重复4次，实验数据记录进表9中，结果如图6所示。

图6为根据表9绘制的箱型图，可以看出无论是SP单一用药（平均OD值2.154）还是TCA单一用药（平均OD值2.338），对于抑制胰腺肿瘤细胞的增殖的作用相对于空白对照(Sham)组（平均OD值2.489）效果并不显著（P>0.05）。但是将SP和TCA混合用药后，抑制胰腺肿瘤细胞增殖的作用要显著得多（平均OD值1.201）与2.489、2.154、2.338相比，统计结果都是P<0.05，差异极显著。

因此，通过本实施例中的实验数据可以证明，将东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸组合用药后，对于抑制胰腺肿瘤细胞增殖的作用要远胜于以上两种药物的单一用药，说明东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸组合用药对于抑制胰腺肿瘤细胞增殖具有协同增效作用。

实施例四：

流式细胞仪检测胰腺肿瘤细胞死亡率实验。

1实验目的：利用流式细胞仪，检测东莨菪内酯(SP)和3,4,5-三甲氧基肉桂酸(TCA)在单一用药及混合用药条件下对胰腺肿瘤细胞焦亡作用的影响。

2实验方法：

2.1肿瘤细胞的前处理实验：

(1)将装有胰腺肿瘤细胞(PDA胰腺肿瘤细胞系和MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞系)的细胞冻存管从液氮罐中取出，随后立即放置于37°C水浴锅中，反复摇晃使其迅速解冻；

(8)按照每孔2.5×10⁵个细胞，将胰腺肿瘤细胞种植于6孔板中。

2.2配置对比溶液：

称取500mg东莨菪内酯（Scopoletin，SP），将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL的东莨菪内酯母液；随后称取500mg 3,4,5-三甲氧基肉桂酸（3,4,5-Trimethoxycinnamicacid，TCA），将其溶解于10mL二甲基亚砜中，得到浓度为50mg/mL的3,4,5-三甲氧基肉桂酸溶液的母液，随后按照表10配置相应浓度的对比溶液。

表10.对比溶液配方表

溶液种类	DMEM(mL)	EMSO(mL)	SP(mg/mL)	TCA(mg/mL)
					Sham	3.6	0.4	/	/
SP(2.5mg/mL)	3.6	0.2	0.2	/
					TCA(2.5mg/mL)	3.6	0.2	/	0.2
SP+TCA	3.6	/	0.2	0.2

2.3流式细胞仪检测PDA胰腺肿瘤细胞系和MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞系的死亡率：

(1)将6孔板中的培养液按照Sham组、SP组、SP+TCA组以及TCA组分别收集到离心管中。(2)利用盐酸盐缓冲生理盐水洗涤肿瘤细胞，随后利用0.025%的胰酶孵育肿瘤细胞，并用移液枪反复吹打肿瘤细胞，直至肿瘤细胞被消化成为单个细胞。

(3)将步骤(2)中收集的细胞培养液转移至相应的细胞培养孔中，进而终止胰酶的消化作用。

(4)将这些细胞悬浮液转移至相应的离心管中，并按照1000rpm，离心5分钟。

(5)待离心结束后，弃掉上清液，随后利用200μL1× Annexin V Binding Buffer重悬离心后的胰腺肿瘤细胞。(6)加入5μL的Annexin V-FITC对步骤(5)中重悬后的胰腺肿瘤细胞进行染色，避光孵育15分钟。

(7)加入0.5μL PI染液对步骤(6)中孵育后的胰腺肿瘤细胞进行染色，避光孵育10分钟。

(8)向步骤(7)中孵育后的胰腺肿瘤细胞补加200μL的1×Binding Buffer上样缓冲液，然后用流式细胞仪检测肿瘤细胞的死亡率，两种胰腺肿瘤细胞系都重复实验5次，所检测的流式细胞图如图7和图9所示。将采集实验数据PDA胰腺肿瘤细胞记录在表11中，结果如图8所示；MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞录在表12中，结果如图10所示。

2.3.1PDA胰腺肿瘤细胞系

图8为根据表11所绘制的箱型图，可以看出在4组实验中，Sham组中PDA胰腺肿瘤细胞系的平均死亡率为20.60%，SP组中胰腺肿瘤细胞的平均死亡率为27.14%，P>0.05，差异不显著；TCA组中胰腺肿瘤细胞的平均死亡率为24.39%，P>0.05，差异不显著；而SP+TCA的平均死亡率为73.46，相对于三个组别（Sham组的20.60%，SP组的27.14%，TCA组的24.39%），P<0.01，差异都显示极显著。

因此，此处可以得出结论：针对PDA胰腺肿瘤细胞系，东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸在单一用药前提下，对于促进该细胞系的死亡具有一定的作用但并不显著(P>0.05)。但是将两者按照1:1的比例混合后，对于促进该细胞系的焦亡具有显著的效果(P<0.01)，显示出优异的协同增效作用。

2.3.2MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞系

图10为为根据表12所绘制的箱型图，可以看出在4组实验中，Sham组中胰腺肿瘤细胞的平均死亡率为15.01%，SP组中胰腺肿瘤细胞的平均死亡率为20.89%，两组数据相比较P>0.05，差异不显著；TCA组中胰腺肿瘤细胞的平均死亡率为19.84%，与Sham组相比较P>0.05，差异也不显著；而SP+TCA的平均死亡率为73.47，相对于其他三个组别，都是P<0.05，差异都显示极显著。

因此，此处可以得出结论：针对MIAPaCa-2胰腺肿瘤细胞系，东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸在单一用药前提下，对于促进该细胞系的死亡具有一定的作用但并不显著(P>0.05)。但是将两者按照1:1的比例混合后，对于促进该细胞系的焦亡具有显著的效果(P<0.05)，显示出优异的协同增效作用。

实施例五：

小鼠胰腺原位移植瘤模型实验。

1.前处理实验：

(1)取6周龄雄性C57BL/6小黑鼠，于实验开始前一周，将其饲养于标准化的动物鼠房内，并且放置适量的食物和水于鼠笼中。

(2)实验当天，利用移液器移除肿瘤细胞培养皿中的细胞培养基，随后，利用磷酸盐缓冲生理盐水洗涤肿瘤细胞，并使用0.025%的胰酶孵育细胞2分钟，在此过程中，不断地用手指敲打细胞培养皿的边缘，直至肿瘤细胞从细胞培养皿的底部脱落下来，并且被消化为单个细胞。

(3)利用含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基，终止胰酶的消化作用。将上述细胞转移至离心管后，按照1300 rmp，离心5分钟。

(4)弃掉上清，利用适量的DMEM完全培养基重悬肿瘤细胞，并计算肿瘤细胞的数量。

(5)再次按照1300rmp，离心5分钟后，使用适量的磷酸盐缓冲生理盐水以及基质胶混合液（二者体积比为1:1），将上述肿瘤细胞配制成为0.5×10⁵cells /μL的细胞悬浮液，备用。

(6)使用2.5%的异氟醚对小鼠进行诱导麻醉，待小鼠呼吸频率降低、呼吸深度增加并且眼睑和角膜反射消失，肌肉紧张和反射应答减低以及踏板反射消失时，将异氟醚的浓度调整为1.2%，对其进行持续性麻醉。随后，在小鼠背部皮下注射0.002ml/kg的卡布洛芬，并将青霉素涂抹至小鼠眼部，避免导致干眼症。

(7)利用小鼠剃毛器清除剑突以下至腹股沟以及至左右腋中线的毛发，并用碘伏对皮肤进行局部消毒后，于剑突和腹股沟连线的中点处，自腹中线由左侧至右侧行1cm切口。然后利用棉签探查小鼠腹部，寻找到壶腹部以及胰头。

(8)使用微量注射器，将2.5×10⁵个胰腺肿瘤细胞注射至小鼠胰腺头部，并使用棉棒压迫止血后，逐层缝合小鼠腹部肌肉以及皮肤。再次用碘伏消毒切口后，将其置于配置37°C恒温板的鼠笼中。待其苏醒后，将其转移至相应的鼠笼中。

(9)待术后第4天开始，将小鼠随机分为空白对照组、东莨菪内酯组(SP组)、东莨菪内酯联合肉桂酸组(SP+TCA组)以及3,4,5-三甲氧基肉桂酸组(TCA组)。按照100mg/kg/天的剂量，分别向小鼠腹腔注射相应的溶液，每日检测小鼠体重，并于术后第7天、术后第14天以及术后第21天，利用小动物活体成像技术，检测肿瘤的体积。

(10)待术后第37天，利用异氟醚将小鼠麻醉后，采用颈椎脱臼法处死小鼠。随后，于剑突和腹股沟连线的中点处，自腹中线由左侧至右侧行2cm切口。利用棉棒探查腹腔，自小鼠体内，将胰腺肿瘤连同胰腺和脾脏取出后，仔细分离胰腺肿瘤，并测量胰腺肿瘤重量。需要说明的是，图11是不同药物组处理后小鼠小动物活体成像图，图12是不同药物组处理后所分离下来的小鼠胰腺肿瘤记录图，实验数据记录进表13中，结果如图13所示。

图13为根据表13所记录的小鼠胰腺肿瘤重量统计的箱型图。

可以看出，相对于空白对照组（平均重量为810mg）,东莨菪内酯单一用药（平均重量为760mg）和3,4,5-三甲氧基肉桂酸单一用药（平均重量为676mg），小鼠胰腺肿瘤的生长重量都有一定程度的下降，但并没有达到显著差异（P>0.05）。而将东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸混合成组合液后，小鼠体内的胰腺肿瘤重量生长量明显要小得多（平均重量为306mg，SP+TCA组与SP组、TCA组和Sham组相比，P<0.01），因此从图5的箱型图也可以进一步推测，处于胰腺肿瘤早期阶段甚至是中期阶段，使用含有东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸的组合溶液，对于抑制胰腺肿瘤细胞增殖，促进胰腺肿瘤细胞焦亡都具有积极正面的效果，进一步证明了东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸作为组合药物相对于单一用药具有显著的协同增效作用。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims

1.包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用，其特征在于，所述GSDME激动剂为东莨菪内酯，所述GSDMD激动剂为肉桂酸。

2.如权利要求1所述的包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用，其特征在于，所述东莨菪内酯激动胰腺肿瘤细胞内Caspase-3/GSDME的活性。

3.如权利要求1所述的包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用，其特征在于，所述肉桂酸激动胰腺肿瘤细胞内Caspase-1/GSDMD的活性。

4.如权利要求1所述的包含GSDME激动剂和GSDMD激动剂的组合物在制备胰腺肿瘤细胞焦亡药物中的应用，其特征在于，所述肉桂酸为3,4,5-三甲氧基肉桂酸。

5.一种促胰腺肿瘤细胞焦亡的组合物，其特征在于，包括东莨菪内酯和3,4,5-三甲氧基肉桂酸。

6.如权利要求5所述的促胰腺肿瘤细胞焦亡的组合物，其特征在于，所述组合物的给药方式包括口服、皮下、腹腔或者静脉注射进行给药。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括东莨菪内酯、3,4,5-三甲氧基肉桂酸以及药学上可接受的剂型。

8.如权利要求7所述的药物组合物，其特征在于，所述剂型包括口服制剂型或非口服制剂型。

9.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述口服剂型包括片剂、胶囊、颗粒、微囊。

10.如权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述非口服剂型包括注射液、冻干粉针、凝胶、外用制剂或腔道给药制剂。