CN116173048A - 棉子糖及其衍生物在胶质母细胞瘤治疗中的应用 - Google Patents

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CN116173048A CN202310060104.0A CN202310060104A CN116173048A CN 116173048 A CN116173048 A CN 116173048A CN 202310060104 A CN202310060104 A CN 202310060104A CN 116173048 A CN116173048 A CN 116173048A
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Abstract

本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，具体机制主要是棉子糖或其衍生物通过介导细胞周期G1/G2阻滞，进而诱导胶质瘤细胞衰老，促进细胞凋亡，最终达到治疗胶质瘤的作用。

Description

棉子糖及其衍生物在胶质母细胞瘤治疗中的应用
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及棉子糖或其衍生物在治疗胶质瘤疾病中的应用。
背景技术
胶质瘤是颅内最常见的原发性恶性肿瘤，约占全部颅内肿瘤的80％，全球发病率约为7/10万。而其中，又以胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM；WHO IV级)恶性程度最高，占所有胶质瘤发病患者中60％～70％。而在我国，GBM年发病率约为3～3.5/10万，具有高发病率以及高死亡率等特点。虽然过去的几十年中，全球关于GBM的研究取得了一定的进展，但由于GBM本身复杂的发病机制及恶性侵袭能力，导致GBM患者目前仍缺乏有效且安全的治疗措施，疾病预后极差，其中位生存时间仅约15月左右。
目前关于GBM的治疗手段主要包括手术、放疗以及化疗在内的综合性治疗，但GBM欧洲多中心癌症联合治疗5年临床数据显示(EORTC–NCIC trial)，即使在如此综合性治疗状况下，GBM患者的2年总体生存期仅为27.2％，而5年总体生存期甚至低到9.8％。替莫唑胺作为目前胶质瘤治疗的一线用药，有证据表明可以通过诱导GBM的细胞衰老，从而治疗部分MGMT(O6-DNA methylguanine-methyltransferase)启动子甲基化阳性患者。但这仅仅是将这部分患者的2年总体生存期提高至48.9％，5年总体生存期提高至13.8％，总体收效甚微。且对于MGMT启动子甲基化阴性的患者，替莫唑胺的治疗效果则仍令人唏嘘。加之，血脑屏障(blood brain barrier，BBB)作为中枢神经系统的天然屏障，具有阻止大分子物质穿透阻隔的极强“防御”能力，这也导致多种疗效显著的抗肿瘤药物难以在中枢神经系统肿瘤治疗当中“物尽其用”。因此，寻找新型、安全、有效且高效通过血脑屏障的抗肿瘤药物，在GBM患者的治疗中具有十分重要的价值。
细胞衰老(Cellular Senescence)，是指细胞从一个活性的生长状态转变为不可逆转的生长停滞状态。研究表明细胞衰老与肿瘤的发生、发展以及治疗密切相关。肿瘤细胞往往具有衰老障碍，表现出无限增殖的能力，从而导致细胞的恶性增生。细胞周期调控机制的紊乱是衰老障碍的主要原因，而细胞周期中的G1/S期有可能是衰老的关键调控点。研究表明当细胞内的DNA受紫外线、化学物质等损伤后，在DNA未修复之前，细胞滞留于G1期，不进入S期。如在S期DNA复制不完全或G2期纺锤体形成不好，则细胞无法进入M期，从而出现细胞增殖阻滞。其中，P21作为G1/S期的主要调控因子，可以介导细胞周期阻滞，参与细胞衰老的发生发展。有学者指出P21可通过抑制细胞CDK活性从而抑制RB和转录因子(E2F)的磷酸化过程进而诱导细胞的生长停滞，参与细胞衰老的过程。此外P21还可以通过与细胞核里的细胞增殖和抗原(PCNA)结合，阻断DNA的复制，从而诱导细胞衰老。因此我们除了可以通过程序性死亡来抑制肿瘤形成外，还可以通过衰老阻止细胞分裂，进而抑制肿瘤的发生。
天然产物对于新药的发现与设计、合成具有非常重要的意义，也是生物活性物质和创新药物的重要来源，已批准上市的药物例如紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Docetaxel)、长春瑞滨(Vinorelbine)、羟基喜树碱(camptothecin)、青蒿素(Artemisinin)等都是天然产物的衍生物或其类似物。天然产物作为药物来源开发具有独特作用，从中有可能筛选出高效低毒的先导化合物，从而开发出治疗疾病的新型药物，减轻患者痛苦和改善患者生活质量。
棉子糖(Raffinose)是一种不可消化的短链寡糖，是由半乳糖，葡萄糖和果糖组成的三糖，可在许多植物中找到。Raffinose(Melitose)可以被α-半乳糖苷酶(α-GAL)水解为D-半乳糖和蔗糖。目前对于棉子糖及其五水化合物五水棉子糖(D(+)-Raffinosepentahydrate，RP)的研究主要集中在非肿瘤相关领域。在肿瘤相关性疾病中，胶质瘤尤其是GBM中的治疗作用及其深入机制却鲜有研究。
发明内容
针对上述问题，发明人意外发现棉子糖及其衍生物可以通过介导细胞周期G1/G2阻滞，进而诱导胶质瘤细胞衰老，促进细胞凋亡，最终达到治疗胶质瘤疾病的作用。
一方面，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，其中棉子糖或其衍生物的结构如式(I)或式(II)所示。其中，式(I)所示的化合物为棉子糖(Raffinose)，而式(II)所示的化合物为五水棉子糖(D(+)-Raffinosepentahydrate，RP)。
Figure BDA0004061102780000041
在另一优选的实施方案中，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，其中所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类可以为I级、II级、III级或IV级胶质瘤。按照WHO中枢神经系统肿瘤分类，胶质瘤分级分别为：Ⅰ级，以毛细胞型星形细胞瘤为主，约占胶质瘤的5％，良性，可治愈；Ⅱ级，主要为星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤，约占胶质瘤的25％，低度恶性；Ⅲ级，主要为间变性星形细胞瘤，约占胶质瘤的15％-25％，多由Ⅱ级演变而来，中度恶性；IV级特指胶质母细胞瘤，恶性程度高，占胶质瘤1/3左右。其中，I级和II级为偏良性的恶性肿瘤，III级是纯恶性肿瘤，IV级是最恶性的肿瘤。在临床上，能用来治疗胶质母细胞瘤的药物都可以用来治疗另外三个级别的胶质瘤。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，其中所述的棉子糖或其衍生物制备为药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的棉子糖或其衍生物以及药学上可接受的载体。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，其中棉子糖或其衍生物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物形式使用。该药物组合物含有0.1％-99％，优选为0.5％-90％、1％-80％或5％-50％的棉子糖或其衍生物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
本发明的药物组合物可以制备成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂、糖浆或类似剂型形式口服给药，或制备为注射剂、粉针剂、软膏剂、栓剂或类似剂型非肠胃给药。这些药物制剂可通过使用本领域熟知的辅助剂，如粘合剂，赋形剂，稳定剂，崩解剂，矫味剂，润滑剂等等以普通方法生成，也可以制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
虽然剂量随症状和病人的年龄，疾病或失调的性质及严重性和给药的途径和方式而变，但对成年病人口服给药的情况来说，棉子糖或其衍生物正常给药为每天总剂量1至1000mg，优选为5至500mg，更优选为50-150mg，可以为单剂量或者为分剂量形式给药；例如每日一次、二次或三次；对于静脉注射的情况，每天可以分一至三次给用0.1至100mg，优选为0.5至50mg的剂量。
在另一优选的实施方案中，本发明涉及棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途，所述用途包括将治疗有效量的本发明所述的棉子糖或其衍生物给予需要治疗的受试者。术语“受试者”包括人类和非人哺乳动物，诸如非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马等，优选的受试者为人类患者。
棉子糖(Raffinose)是由半乳糖、果糖和葡萄糖螯合而成的三糖化学结构，广泛存在于多种天然农作物中，如豆类、卷心菜、西兰花和生姜等。此外，棉子糖作为一种天然化合物，具有毒副作用小，易获取且可通过血脑屏障等优势。有证据表明，棉子糖对多种人类疾病具有良好的药用价值，具有抗过敏、抗肥胖、抗糖尿病和预防非酒精性脂质积累、改善肠道微生物以及抑制铜绿假单胞菌生物膜形成等作用。棉子糖的化学结构式为：
Figure BDA0004061102780000071
发明人发现，棉子糖在免疫和癌症治疗中同样发挥着重要作用。有证据显示，棉子糖可促进抗原提呈细胞中IL-12表达，提高CD4+T细胞分泌IL-2并上调INF-γ，发挥机体免疫系统的防御及抑瘤功能。而IL-12的表达，则对肠癌，淋巴瘤，黑色素瘤以及胶质瘤等疾病治疗具有积极的促进作用。此外，棉子糖还可通过mTOR非依赖途径，诱导HaCaT细胞发生自噬性死亡，最终抑制细胞增殖。而随着医用化学技术的不断进步，五水棉子糖(D(+)-Raffinose pentahydrate，RP)作为棉子糖的五水化合物具有更好的药物稳定性，能长期保存，且保持较高的药物活性效价(其结构式如II所示)，使其具有更为广阔的应用前景。
Figure BDA0004061102780000072
发明人通过系统实验设计，意外发现棉子糖或其五水化合物RP药物对GBM细胞的体外增殖具有明显抑制作用，可有效抑制肿瘤细胞的扩增。RP药物可体外诱导GBM细胞出现细胞凋亡，发明人采用175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，发现随着RP药物干预细胞的作用时间逐渐增加，RP药物可显著诱导凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-CASPASE9的表达，同时下调抗凋亡相关蛋白BCL2的表达，肿瘤细胞的凋亡情况显著增加，早期和晚期凋亡细胞在细胞总体比例中明显增加。发明人还收集了6例人原代GBM组织样本，在体外分离肿瘤样本组织进行培养，同时采用RP药物干预0-36小时。结果显示，随着药物作用时间的延长，RP药物能显著降低人原代GBM样本的细胞活性。
动物实验显示，RP药物可抑制裸鼠颅内原位胶质母细胞瘤的生长能力，未见明显药物毒副作用所致的脏器损伤。表明RP药物在体内同样可以抑制GBM细胞的肿瘤增殖能力，且对其他器官组织的毒副作用低。
进一步的研究发现，RP药物可能通过调控P21/Cell cycle信号通路，从而进一步抑制GBM细胞的活性。发明人通过175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，在药物作用48小时后进行高通量RNA测序分析。将三种GBM细胞株内因RP药物作用产生明显差异性改变的基因进行韦恩图交汇分析，结果显示共1664个基因在RP干预前后出现差异表达。而将这1664个基因进行KEGG分析后发现，其中有26个关键基因参与到Cell Cycle信号通路的调控当中(其中P21的改变情况最为显著)，既RP干预后，药物对肿瘤细胞Cell Cycle信号通路存在最为显著的调控情况，三个GBM细胞株出现明显P21基因表达水平的上调。
发明人通过siRNA干预技术，下调三个GBM细胞株内P21的表达，并通过蛋白免疫印迹实验进行结果确认。结果表明，下调P21的表达可抑制GBM细胞的增殖，部分逆转RP的药物作用。这有力证明RP是通过显著促进P21的蛋白表达，抑制细胞周期蛋白RB的磷酸化过程，诱导肿瘤细胞出现细胞周期性阻滞现象。
基于上述的实验结果，本发明首次发现棉子糖或其衍生物是通过介导细胞周期G1/G2阻滞，进而诱导胶质母细胞瘤衰老，促进胶质母细胞瘤凋亡，最终达到抑制胶质母细胞瘤的作用。这一发现是现有技术中所从未报道的，这也提示棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质母细胞瘤药物中的用途，这对于增加临床治疗GBM患者的替代方案，改善患者生存预后具有十分重要的医疗价值。在临床上，棉子糖或其衍生物能用来治疗IV级胶质母细胞瘤，相应也自然可以应用于治疗恶性程度稍低的I级、II级或III级胶质瘤。
本发明提供了棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途。兹将本发明的技术方案总结如下：
1、棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途。
2、根据技术方案1所述的用途，其特征在于：所述棉子糖或其衍生物选自棉子糖(Raffinose)或五水棉子糖(D(+)-Raffinose pentahydrate，RP)，其结构式如下所示：
Figure BDA0004061102780000101
3、根据技术方案1所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类分别为I级、II级、III级或IV级胶质瘤。
4、根据技术方案3所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类为Ⅰ级毛细胞型星形细胞瘤。
5、根据技术方案3所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类为Ⅱ级星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤。
6、根据技术方案3所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类为Ⅲ级间变性星形细胞瘤。
7、根据技术方案3所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类为IV级胶质母细胞瘤。
8、根据技术方案1-7任一项所述的用途，其特征在于：其中所述的棉子糖或其衍生物制备为药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的棉子糖或其衍生物以及药学上可接受的载体。
9、根据技术方案1-7任一项所述的用途，其特征在于：其中所述的棉子糖或其衍生物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物形式使用。
10、根据技术方案8所述的用途，其特征在于：其中所述的药物组合物含有0.1％-99％的棉子糖或其衍生物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
11、根据技术方案10所述的用途，其特征在于：其中所述的药物组合物含有0.5％-90％、1％-80％或5％-50％的棉子糖或其衍生物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
12、根据技术方案8所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物制备成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂、糖浆或类似剂型形式口服给药，或制备为注射剂、粉针剂、软膏剂、栓剂或类似剂型非肠胃给药，或制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
13、根据技术方案1-7任一项所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物给药为每天总剂量1至1000mg，以单剂量或者为分剂量形式给药。
14、根据技术方案13所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物给药为每天总剂量5至500mg，以单剂量或者为分剂量形式给药。
15、根据技术方案13所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物给药为每天总剂量50-150mg，以单剂量或者为分剂量形式给药。
16、根据技术方案1-7任一项所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物为静脉注射给药，每天分一至三次给药0.1至100mg。
17、根据技术方案16所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物为静脉注射给药，每天分一至三次给药0.5至50mg。
18、根据技术方案1-7任一项所述的用途，其特征在于：所述用途包括将治疗有效量的棉子糖或其衍生物给予需要治疗的受试者。
19、根据技术方案18所述的用途，其特征在于：所述的受试者包括人类和非人哺乳动物。
20、根据技术方案19所述的用途，其特征在于：所述的受试者为非人哺乳动物，选自非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马。
附图说明
附图1：RP药物对GBM细胞的体外增殖具有明显抑制作用。其中：
(A)发明人通过采用不同浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，对其干预48小时后的细胞活性进行CCK8实验。结果表明，随着药物浓度的增加，RP对GBM细胞株的毒性作用逐渐增强，对GBM细胞的抑制作用呈浓度依赖性改变。其中，U251细胞株抑制作用最为显著。
(B)发明人采用RP药物作用于三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，对其细胞活性抑制率达到50％时的药物浓度分别为(A172，左，174.1μM；U251，中，165.5μM；U87，右，186.3μM)。发明人将在后续实验中采用该浓度进行实验。
(C)发明人采用175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，在不同时间点对细胞活性进行CCK8实验检测。结果表明，随着药物作用的时间增加，RP对GBM细胞株的活性抑制作用具有时间持续性。
(D)发明人采用不同浓度RP药物干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，对其干预48小时后的细胞单克隆结果进行检测。结果表明，RP对GBM细胞株的增殖能力具有明显抑制作用。可有效抑制肿瘤细胞的扩增。**P<0.01，***P<0.001。
附图2：RP药物可体外诱导GBM细胞出现细胞凋亡。其中：
(A)发明人采用175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，在24-72小时后对细胞凋亡情况进行流式细胞检测。结果表明，随着RP药物干预细胞的作用时间逐渐增加，肿瘤细胞的凋亡情况显著增加，早期和晚期凋亡细胞在细胞总体比例中明显增加。
(B)发明人采用175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，在0-72小时后对细胞凋亡相关蛋白表达情况进行蛋白免疫印迹实验检测。结果表明，随着时间的推移，RP药物可显著诱导凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-CASPASE9的表达。同时，下调抗凋亡相关蛋白BCL2的表达。
附图3：RP药物在体内同样可以抑制GBM细胞的肿瘤增殖能力，且对其他器官组织的毒副作用低。其中：
(A)裸鼠颅内原位成瘤后，对实验鼠进行RP药物的腹腔注射治疗(25mg/kg，隔日一次，5次)，在药物注射完成后对小鼠进行肿瘤组织的活体成像实验。实验结果表明，RP药物可抑制裸鼠颅内原位胶质母细胞瘤的生长能力。
(B)在对载瘤裸鼠进行解剖后，对其不同组织器官进行HE染色实验。结果显示，阴性对照组(NC)，阴性对照RP用药组(NC+RP)，无RP药物处理的载瘤组(Tumor)以及RP药物处理的载瘤组(Tumor+RP)四组裸鼠在心肝脾肺肾脑胃肠等脏器中，未见明显药物毒副作用所致的脏器损伤。
附图4：RP药物可抑制人原代GBM细胞的体外活性。
(A)发明人收集了6例人原代GBM组织样本，在体外分离肿瘤样本组织进行培养，同时采用RP药物干预0-36小时。结果显示，随着药物作用时间的延长，RP药物能显著降低人原代GBM样本的细胞活性。***P<0.001。
附图5：RP药物可能通过调控P21/Cell cycle信号通路，从而进一步抑制GBM细胞的活性。其中：
(A)发明人通过175μM浓度的RP干预三种GBM细胞株(A172，U251，U87)，在药物作用48小时后进行高通量RNA测序分析。发明人对三个细胞株RP处理后，相较于阴性对照组(未采用RP处理的细胞)出现显著差异，且差异倍数大于2倍以上，具有统计学差异(P<0.05)的基因进行火山图统计，红色代表药物处理后出现表达上调的基因，绿色代表药物处理后出现表达下调的基因。
(B)发明人将三种GBM细胞株内，因RP药物作用，产生明显差异性改变的基因进行韦恩图交汇分析，尝试探究在三种GBM细胞中，具有共同作用的关键调控通路。其结果显示，共1664个基因在RP干预前后出现差异表达。而将这1664个基因进行KEGG分析后发现，其中有26个关键基因参与到Cell Cycle信号通路的调控当中，既RP干预后，药物对肿瘤细胞Cell Cycle信号通路存在最为显著的调控情况。
(C)Cell Cycle信号通路中，RP干预前后出现显著差异的26个基因详细信息。
(D)26个差异基因在Cell Cycle信号通路中KEGG图，紫色字体为差异基因作用位点。
(E-F)发明人对26个差异基因进行RP药物干预后细胞RNA及蛋白水平的验证分析，其中P21的改变情况最为显著。在qPCR结果中可见(E)，RP药物干预后，三个GBM细胞株出现明显P21基因表达水平的上调。而在蛋白免疫印迹实验中(F)，同样可见，RP干预后，P21的蛋白表达在三个GBM细胞株中出现显著上调。
附图6：下调P21的表达可抑制GBM细胞的增殖，部分逆转RP的药物作用。
(A)发明人通过siRNA干预技术，下调三个GBM细胞株内P21的表达，并通过蛋白免疫印迹实验进行结果确认。结果显示，相较于siControl(阴性对照)组，RP可显著促进P21的蛋白表达，抑制细胞周期蛋白RB的磷酸化过程，诱导肿瘤细胞出现细胞周期性阻滞现象。而siP21则可有效下调P21在GBM细胞株内的表达情况，部分逆转RP药物对P21的促表达作用，同时促进RB的磷酸化过程，诱导细胞进入细胞周期，脱离细胞周期阻滞现象，防止细胞衰老。
(B)发明人通过siRNA干预技术，下调三个GBM细胞株内P21的表达，部分逆转RP药物对P21的促表达作用，对干预后的细胞活性进行CCK-8检测。其结果显示，下调P21表达后，可部分逆转RP对GBM细胞的抑制作用，部分促进细胞的活性恢复。
具体实施方式
实施例1棉子糖(Raffinose)的制备
使用PH为8的70％甲醇循环逆流萃取脱脂棉粕7次得到脱酚液，取5L脱酚液通过截留分子量为800Da的纳滤膜得到透过液。将透过液上固相萃取柱，使用200L柱装填150ml中性氧化铝填料，上柱液为2BV，流速为1.0BV/h。过柱完毕后使用2BV的95％甲醇淋洗，再使用1.5BV去离子水洗脱，得到洗脱液，向洗脱液中加入0.2％活性炭，PH值调至5-6，加热至50℃搅30min，过滤后得到脱色液。向脱色液中加入45％乙醇，温度降至10℃结晶14h，过滤得到棉子糖晶体，晶体用少量95％乙醇冲洗后80℃烘干，得到棉子糖。
实施例2五水棉子糖的制备
使用PH为8的70％甲醇循环逆流萃取脱脂棉粕7次得到脱酚液，取5L脱酚液通过截留分子量为800Da的纳滤膜得到透过液。将透过液上固相萃取柱，使用200L柱装填150ml中性氧化铝填料，上柱液为2BV，流速为1.0BV/h。过柱完毕后使用2BV的95％甲醇淋洗，再使用1.5BV去离子水洗脱，得到洗脱液，向洗脱液中加入0.2％活性炭，PH值调至5-6，加热至50℃搅30min，过滤后得到脱色液。向脱色液中加入45％乙醇，温度降至10℃结晶14h，过滤得到五水棉子糖晶体。本实验中所用RP药物为重结晶后溶入二甲基亚砜(DMSO)，形成10mM原液分装后，储存于-80℃冰箱备用。
实施例3GBM细胞的培养。
将三种GBM细胞株(A172，U251，U87)培养在含有10％热灭活胎牛血清(FBS)和100U/ml青霉素/链霉素的完全Dulbecco’s modified Eagle medium(DMEM)中，置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中培养，待细胞进入对数生长期后，收集细胞，进行后续实验。
实施例4CCK8实验
浓度依赖：取对数生长期的细胞，调整浓度至104个细胞/100μl至离心管。用7种不同浓度(0mM、50mM、100mM、150mM、200mM、250mM、300mM)的RP干预。并接种在96孔板中，每孔加入100μl。置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中培养48小时。待达到目标时间后，加入90ml新鲜的DMEM完全培养基以及10ml CCK8溶液，摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中继续培养2小时。用酶标仪测定每孔波长为450nm的吸光度值，代入公式计算出相对的细胞增殖毒性并绘制曲线。(图1A:随着药物浓度的增加，RP对GBM细胞株的毒性作用逐渐增强，对GBM细胞的抑制作用呈浓度依赖性改变。其中，U251细胞株抑制作用最为显著。)
时间依赖：取对数生长期的细胞，调整浓度至104个细胞/100μl至离心管。并分为RP组(浓度175mM)及DMSO(加入体积同RP)对照组。将两组细胞接种在96孔板中，每孔加入100μl。置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中培养0、12小时、24小时、36小时、48小时、60小时、72小时。待达到目标时间后，加入90ml新鲜的DMEM完全培养基以及10ml CCK8溶液，摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中继续培养2小时。用酶标仪测定每孔波长为450nm的吸光度值，代入公式计算出相对的细胞增殖毒性并绘制曲线。(图1C:随着药物作用的时间增加，RP对GBM细胞株的活性抑制作用具有时间持续性；图6B:下调P21表达后，可部分逆转RP对GBM细胞的抑制作用，部分促进细胞的活性恢复。)
实施例5克隆形成实验
取对数生长期的细胞，用DMEM完全培养基将细胞浓度调整至500个细胞/2ml。种植至6孔板，每孔2ml。置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中培养10-14天。待细胞呈簇，加入RP(175mM)或DMSO(加入体积同RP)作为对照，摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中继续培养48小时。然后用4％多聚甲醛固定10-15min。再用结晶紫染色15-30min。随后洗去结晶紫放置室温干燥后进行显微镜检查并拍照，计数细胞集落。(图1D:RP对GBM细胞株的增殖能力具有明显抑制作用。可有效抑制肿瘤细胞的扩增。)
实施例6流式凋亡术检测细胞凋亡。
取对数生长期的细胞置于6孔板，每孔加入细胞悬液2ml。摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中继续培养24小时。向6孔板中加入RP(175mM)或DMSO(加入体积同RP)作为对照，摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱中继续培养0、24小时、48小时、72小时。待达到目标时间后，终止培养，得到1×Binding Buffer缓冲液重悬的细胞，并调节细胞浓度至106个细胞/ml。吸取上述细胞悬液100μl至5ml的流式管中。并与5μlAnnexin V-FITC和5μl PI染色液在室温避光的条件下共同孵育15min。孵育完成后向每个流式管中再加入400μl 1×Binding Buffer，轻轻摇晃，并在1小时内进行流式细胞检测。(图2A:随着RP药物干预细胞的作用时间逐渐增加，肿瘤细胞的凋亡情况显著增加，早期和晚期凋亡细胞在细胞总体比例中明显增加。)
实施例7蛋白免疫印迹实验检测相关蛋白表达。
用细胞裂解缓冲液提取细胞裂解液，并用增强BCA蛋白分析试剂盒对裂解液中的蛋白浓度进行定量。每孔上样量约为30-50ug蛋白，并用彩色预染蛋白质分子量标准以判断分子量大小。电泳仪80V冰上电泳30min，待样品到达分离胶时再将电压调至120V 60min，至溴酚蓝到达胶的底部，停止电泳并将分离胶切下，根据凝胶大小剪一块PVDF膜(预先用甲醇浸泡15s至半透明状)和两张滤纸，将其浸入转膜缓冲液中，制作排列为(-)极/海绵垫/滤纸/凝胶/PVDF膜/滤纸/海绵垫(+)的三明治结构，放入转膜槽中，恒流170mA电转120min。转膜结束后，将PVDF膜浸入封闭液中(含5％脱脂牛奶的TBST)，室温孵育2h，然后用TBST洗涤3遍，每次l0min，之后加入用5％BSA以适当比例稀释的一抗4℃孵育过夜；次日，抗体回收，TBST洗涤PVDF膜3次，每次10min；加入二抗，室温孵育2h，TBST洗涤3次，每次l0min，即可进行ECL显色反应。(图2B:随着时间的推移，RP药物可显著诱导凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-CASPASE9的表达。同时，下调抗凋亡相关蛋白BCL2的表达；图5F:RP干预后，P21的蛋白表达在三个GBM细胞株中出现显著上调；图6A:RP可显著促进P21的蛋白表达，抑制细胞周期蛋白RB的磷酸化过程，诱导肿瘤细胞出现细胞周期性阻滞现象。)
抗体试剂使用如下：
Figure BDA0004061102780000201
Figure BDA0004061102780000211
实施例8 裸鼠原位胶质瘤造模。
取对数生长期luciferase-gfp转染的U87细胞，消化，离心(1000rpm，5min，室温)。将Matrigel与PBS按1:1比例混合后重悬细胞，细胞计数，调整细胞浓度至2×108/ml。准备6只6周龄雌性BALB/c(nu/nu)无胸腺裸鼠，麻醉固定头部。对准小鼠前囟，向后向右各移动2cm，通过钻孔工具对进样针所对颅骨表面进行钻孔，钻穿颅骨后形成注射孔。将消毒后的进样针吸取5μl细胞悬液后深入脑组织3.5cm，再提起0.5cm，缓慢注入含有106个细胞的细胞悬液，注入时间为5min。注射完细胞悬液后需静置5min，然后缓慢提出进样针，对伤口进行消毒、粘合。待细胞悬液注入一周后对肿瘤部位进行显像观察，并对所构建的人脑胶质瘤原位模型进行评估。(图3A:RP药物可抑制裸鼠颅内原位胶质母细胞瘤的生长能力。)
实施例9RP给药方式及小鼠组织样本收集
人脑胶质瘤原位模型评估完成后，予以RP溶液腹腔注射，使用剂量要求为25mg/kg，隔日一次，连续注射5次。对照组小鼠予以注射同等剂量的玉米油。待5次给药完成后对肿瘤部位再次进行显像观察，并对RP在体内抑制GBM作用进行评估。
完成实验后组织灌注流程：小鼠麻醉后开胸，暴露充分以利于心脏穿刺及剪开右心耳。心尖插入灌注针头，剪开右心耳，开放静脉血。先灌注生理盐水约100ml，待小鼠两前肢及两肺变白，改灌注4％多聚甲醛。灌注成功的标志为：刚开始灌注时小鼠前肢剧烈抽动，前肢及颈部僵硬。
取脑组织：灌注完成后，剪开皮肤暴露头及颈段，从颈椎处剪断颈髓；分离除去后颈部肌肉；用弯钳仔细剔除颅骨，分离颅骨时注意硬脑膜，避免硬脑膜划伤脑组织；取脑时从延髓开始，慢慢分离颅底组织，以减少对大脑的损伤。
取心及肺组织：灌注完成后，剪开胸部皮肤，暴露胸骨及肋骨。剪断肋骨，暴露肺组织，结扎裸鼠的气管。在结扎处远心端离断气管，及心脏周围血管，将整个肺脏、心脏和结扎的气管一起取出。
最后取出肝、肾、胃、肠组织。随后将取出组织在4％多聚甲醛中4℃过夜，然后转至30％蔗糖溶液中脱水至组织完全沉入液体底部，-80℃储存冻硬。做层厚30μm切片，-80℃储存备用。
实施例10HE染色
组织切片放入二甲苯中脱蜡四次，每次5min。脱蜡后将切片放入无水乙醇洗脱二甲苯三次，每次2min；随后用95％、85％及75％的酒精依次进行组织脱水，每次2min，然后水洗。水洗后将组织切片放入1缸苏木精染色液中染色15min，再依次行水洗、分化、水洗。显微镜下观察染色是否深浅合适，用自来水冲洗蓝化5-10min。蓝化后，将组织切片放入1缸伊红染色液中染色20s-60s，然后用75％、95％及95％依次进行清洗，每次清洗2min，再用无水乙醇洗涤三次，每次洗涤2min。染色完成后，将组织切片分四次放在二甲苯或环保透明剂中进行透明，每次浸泡2min。最后用中性树胶封固组织切片，显微镜下观察、拍照。(图3B:RP对心肝脾肺肾脑胃肠等脏器无明显毒副作用。)
实施例11GBM患者肿瘤样本收集及人原代GBM细胞的获取。
肿瘤样本收集：本研究经温州医科大学附属第一医院临床研究伦理委员会批准(许可：2022-623)，在获得所有患者的书面知情同意书情况下，将2019-2021年在温州医科大学附属第一医院接受手术的6例GBM患者(IV级)纳入本回顾性研究。
肿瘤样本收集：本研究经伦理委员会批准，在获得所有患者的书面知情同意书情况下，将6例GBM患者(IV级)纳入本回顾性研究。取切下的GBM肿瘤组织放置于5ml生理盐水中，置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱。立即准备提取人原代GBM细胞。
人原代GBM细胞提取：肿瘤组织放入含有5ml PBS的培养皿中，用PBS冲洗2-3遍，去除瘤体表面的血丝及杂质。清洗过后放入含有5ml DMEM完全培养基的培养皿中，切割成2-3mm3大小的组织块，离心(1000rpm，5min，室温)。取组织小块置入含有3-4ml胰蛋白酶溶液的培养皿中，消化10min。待胰蛋白酶溶液稍浑浊，取出组织块，置入含有DMEM完全培养基的培养皿中，并在滤网上研磨。研磨后的细胞悬浮液用红细胞裂解液去除红细胞得到原代胶质瘤细胞。最后将原代细胞放入5ml DMEM培养基中，置于37℃5％(v/v)CO2的湿化培养箱培养。(图4A:随着药物作用时间的延长，RP药物能显著降低人原代GBM样本的细胞活性。)
实施例12RNA测序。
取1μg目的mRNA，根据polyA选择方法通过oligo(dT)珠子分离mRNA，首先通过片段化缓冲液进行片段化。其次，使用SuperScript双链cDNA合成试剂盒(Invitrogen，CA)和随机六聚体引物(Illumina)合成双链cDNA。然后根据Illumina的文库构建方案对合成的cDNA进行末端修复、磷酸化和“A”碱基添加。通过2％低范围超琼脂糖上300bp的cDNA目标片段选择文库大小，然后使用Phusion DNA聚合酶(NEB)进行15个PCR循环的PCR扩增。双端RNA-seq测序文库经TBS380定量后，使用Illumina NovaSeq 6000测序仪(2×150bp read length)进行测序。(图5A-C:RP干预后，药物对肿瘤细胞Cell Cycle信号通路存在最为显著。)
实施例13细胞RNA提取及实时荧光定量PCR。
RNA提取：取对数生长期的待测细胞至EP管，细胞中加入1ml Trizol试剂，待细胞充分裂解，加入200μl体积的氯仿，用漩涡混合器震荡混匀，室温下静置5min。随后离心(10000rpm，15min，4℃)。待离心完成，用移液枪小心吸取最上层水相(约500μl)至新的1.5ml EP管中。加入500μl异丙醇，用漩涡混合器震荡混匀，室温下静置10min。离心(10000rpm，15min，4℃)，取EP管底部的白色沉淀。加入1ml无水乙醇洗涤RNA，重悬，离心(10000rpm，15min，4℃)。再取EP管底部的白色沉淀，室温下干燥5-10min。随后加入20μlDEPC水溶解RNA，待RNA溶解后测量RNA浓度和纯度，提取的RNA样本-80℃冰箱保存，以便用于下一步实验。
实时荧光定量PCR：取1μg RNA至去酶的EP管中，加入DNA消化混合物，室温下静置30min。加入1μl stop solution终止消化，65℃下静置10min。随后加入1μl随机引物(500μg/ml)，70℃下静置5min，待充分反应后取出并立即冰浴5min。等待冰浴结束，加入反转录混合物进行反转录，室温下静置1小时。反转录得到的cDNA用SYBR Premix Ex Taq(PerfectReal-Time)定量试剂盒进行定量PCR。最后按照2-ΔΔCt方法计算目的基因相对表达量。(图5E:RP干预后，P21的基因表达在三个GBM细胞株中出现显著上调。)
RNA引物如下：
P21(正向)：5'-AGGTGGACCTGGAGACTCTCAG-3'；
P21(反向)：5'-TCCTCTTGGAGAAGATCAGCCG-3'。
GAPDH(正向)：5'-CGAAATCCCATCACCATCTTCCAGG-3'；
GAPDH(反向)：5'-GAGCCCCAGCCTTCTCCATG-3'。
DNA消化混合物如下所示：
Figure BDA0004061102780000261
反转录混合物如下所示：
Figure BDA0004061102780000262
定量体系如下：
Figure BDA0004061102780000263
扩增程序：
Figure BDA0004061102780000271
2-ΔΔCt计算方法如下：
Figure BDA0004061102780000272
实施例14 siRNA转染细胞。
配制转染复合物，用120μl 1×riboFECTTMCP Buffer稀释5μl siRNA(20μM)储存，随后加入12μl riboFECTTMCP Reagent，室温孵育15min，制备成转染复合物待用。取对数生长期的细胞，分2组(siP21组以及阴性对照组)，细胞计数后在6孔板中接种细胞，每孔加入细胞悬液2ml。摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2中培养24小时。然后每孔加入1863μl DMEM完全培养基以及转染复合物。摇匀后放入37℃5％(v/v)CO2中继续培养24-48小时。提取各组蛋白，使用蛋白免疫印迹检测目的基因下调水平，用以检测转染效果(图6)。

Claims (10)

1.棉子糖或其衍生物在制备用于治疗胶质瘤疾病药物中的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述棉子糖或其衍生物选自棉子糖(Raffinose)或五水棉子糖(D(+)-Raffinose pentahydrate，RP)，其结构式如下所示：
Figure FDA0004061102770000011
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的胶质瘤根据WHO中枢神经系统肿瘤分类分别为I级、II级、III级或IV级胶质瘤。
4.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：其中所述的棉子糖或其衍生物制备为药物组合物，所述的药物组合物包括治疗有效量的棉子糖或其衍生物以及药学上可接受的载体。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：其中所述的药物组合物含有0.1％-99％的棉子糖或其衍生物，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体。
6.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的药物组合物制备成胶囊剂、片剂、粉剂、粒剂、糖浆或类似剂型形式口服给药，或制备为注射剂、粉针剂、软膏剂、栓剂或类似剂型非肠胃给药，或制备为控释给药剂型、缓释给药剂型、各种微粒给药系统。
7.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：所述的棉子糖或其衍生物给药为每天总剂量1至1000mg，以单剂量或者为分剂量形式给药。
8.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于：所述用途包括将治疗有效量的棉子糖或其衍生物给予需要治疗的受试者。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述的受试者包括人类和非人哺乳动物。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的受试者为非人哺乳动物，选自非人灵长类、绵羊、犬、猫、牛和马。
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