CN117531018A - 一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物及其应用，所述用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物包括紫檀芪和PD‑1抑制剂。本申请发现采用紫檀芪和PD‑1抑制剂进行联用，发现能起到协同增效意料不到的技术效果：单用药物组无法诱导半数以上的小鼠获得长期的存活，PTE和PD‑1抗体双药组可以使得大部分小鼠获得长时程的生存获益。PTE与PD‑1抗体联合组使得肿瘤生长停滞或者使得肿瘤消退，使得杀伤性CD8+T在GBM微环境免疫浸润。PTE与PD‑1抗体联合组小鼠肿瘤几乎完全消退，且联用的效果显著优于任何单药组。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物及其应用。
背景技术
胶质母细胞瘤是星形细胞肿瘤中恶性程度最高的胶质瘤，属WHOⅣ级。肿瘤位于皮质下，成浸润性生长，常侵犯几个脑叶，并侵犯深部结构，还可经胼胝体波及对侧大脑半球。发生部位以额叶最多见，其他依次为颞叶/顶叶，少数可见于枕叶/丘脑和基底节等。胶质母细胞瘤可原发于脑实质内，亦可呈继发性。继发性胶质母细胞瘤多数由间变性星形细胞瘤进一步恶变而来，少部分可由混合性胶质瘤、少枝胶质瘤或室管膜瘤演变而成。
肿瘤免疫治疗极大革新了肿瘤的治疗现状和发展方向。研究者试图寻找新的治疗胶质瘤的方法，近年来免疫检查点阻断(ICBs)治疗的出现作为一种新型免疫治疗策略，在包括黑色素瘤和非小细胞肺癌在内的许多实体瘤中显示出了希望。然而，相对上述的一些免疫刺激型“热”肿瘤，在免疫抑制型“冷”肿瘤GBM的治疗中尽管使用了多种免疫治疗策略，但临床上单一的免疫疗法目前尚未显示出显著疗效，仅有很少部分的患者能获得治疗益处。这可能是由于胶质瘤独特的免疫抑制所致。
因此如何开发一种降低恶性胶质瘤肿瘤的免疫治疗抵抗、提高肿瘤免疫治疗反应率的药物是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明目的是提供一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，通过细胞焦亡激活剂紫檀芪和PD-1抑制剂药物联用，起到了协同增效的治疗效果。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，所述用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物包括：
紫檀芪和PD-1抑制剂。
进一步地，所述PD-1抑制剂包括PD-1抗体、靶向PD-1的小分子抑制剂中的至少一种。
进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
进一步地，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。
进一步地，所述药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
在本发明的第二方面，提供了紫檀芪和PD-1抑制剂组成的组合物在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
1、本发明提供的一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，采用紫檀芪和PD-1抑制剂进行联用，发现能起到协同增效意料不到的技术效果：
(1)如图2所示，评估PTE(紫檀芪)、PD-1抗体以及PTE联合PD-1抗体对模型小鼠生存率的影响：单用药物组无法使得半数以上的小鼠获得长期的存活，PTE和PD-1抗体双药组可以使得大部分小鼠获得长时程的生存获益。
(2)单用PD-1抑制剂(PD-1抗体组)和单用细胞焦亡激活剂(PTE紫檀芪)治疗组，均一定程度抑制了GL261细胞形成的肿瘤的生长；而PTE与PD-1抗体联合组使得肿瘤生长停滞或者使得肿瘤消退，少数肿瘤完全消失，使得杀伤性CD8+T细胞浸润。在实验终止时取出小鼠肿瘤组织也发现，PTE与PD-1抗体联合组小鼠肿瘤几乎完全消退，且联用的效果显著优于任何单药组。
(3)相较于单独使用PTE或PD-1抗体的任何一组，联合治疗组均表现出抗肿瘤相关促炎因子的显著高表达。且联合治疗表现出更加明显的肿瘤细胞焦亡激活，说明增强的细胞焦亡可增强抗肿瘤的效应。
2、本发明提供的一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物未见明显单药及药物组合毒性，安全性高：使用紫檀芪(80、160、240mg/kg，灌胃给药)、PD-1抗体(10mg/kg，腹腔注射)，以及紫檀芪联合PD-1抗体治疗，在该药物浓度和注射方式下，在小鼠模型总未见明显单药及药物组合毒性。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为PTE(紫檀芪)体外诱导GBM细胞焦亡结果图。其中，图1A、1B、1C分别为PTE抑制U87MG、U251、GL261细胞活力，图1D为常规化疗药TMZ对U87MG的影响。；图1E为高内涵共聚焦成像对细胞进行持续48h的形态学观察发现，PTE处理的U87MG、GL261细胞早期表现出凋亡特征，随后出现大量细胞肿胀、吐大气泡的特征，这是细胞焦亡的典型特征；图1F为U87MG、G261细胞焦亡的局部放大图；图1G为PTE处理GBM细胞后caspase1、caspase3及caspase9蛋白裂解情况以及GSDMD、GSDME活化情况，提示PTE处理激活了GSDME依赖的细胞焦亡。
图2为PTE的体内激活细胞焦亡抑制胶质瘤结果图。其中，图2A为体内实验的流程图，分别为模型组、替莫唑胺治疗组、紫檀芪高、中、低剂量组，图2B为给药结束时观察到的各组肿瘤大小以及肿瘤重量，图2C为不同处理组的小鼠的生存情况，图2D为不同组别小鼠的体重变化趋势图。图2E为PTE激活体内GSDME介导的细胞焦亡的蛋白印迹图，图2F为PTE促进体内IFN-γ、HMGB1、TNF-α、IL-1β炎症因子表达，提示了PTE可激活肿瘤炎性微环境。
图3为PTE与PD-1抗体联合治疗胶质瘤的结果图。其中，图3A为PTE与PD-1抗体联合治疗胶质瘤的流程图；图3B为PTE、PD-1抗体以及联合用药对小鼠生存情况的影响结果。
图4为PTE与PD-1抗体联合抑制体内胶质瘤细胞的效果图。其中图4A为小动物活体成像结果，其中荧光强度反应肿瘤的大小。图4B为各组小鼠的肿瘤荧光强度的动态统计图。图4C为治疗结束时，小鼠的肿瘤大小以及肿瘤重量。
图5为PTE联合PD-1抗体激活炎症因子与细胞焦亡的结果图。其中，图5A为PTE联合PD-1抗体较PTE及PD-1抗体单独处理组激活了更强的促炎因子包括IFN-γ、HMGB1、TNF-α、IL-1β，图5B为PTE联合PD-1抗体进一步在体内激活细胞焦亡，图5C为PTE联合PD-1抗体在体内诱导杀伤性CD8+T细胞在GBM微环境免疫浸润。
图6为PTE联合PD-1抗体在体内应用的安全性评估图。其中，图6A为通过HE染色评估连续给药后高剂量PTE后，小鼠的心、肝、脾、肺和肾的病理表现，图6B为评估PTE联合PD-1抗体对AST、ALT、γ-GT、Bun、Cre肝肾指标的影响，图6C为HE染色评估PTE联合PD-1抗体对肝、肾组织的损伤情况。
图7为PTE(紫檀芪)联合PD-1D抗体抑制胶质瘤的作用机制图。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。
本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，包括：紫檀芪和PD-1抑制剂。
紫檀芪，别名3,5-二甲氧基-4'-羟基二苯乙烯、(E)-3,5-二甲氧基-4'-羟基苯乙烯、(E)-4-[2-(3,5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-苯酚和4-[(1E)-2-(3,5-二甲氧基苯基)-乙烯基]-苯酚，分子式为C16H16O3，分子量为256.30，是一种来源于紫檀、蓝莓、葡萄和花榈木等植物的有效成分。紫檀芪有抗癌、抗炎、抗氧化和镇痛剂的作用。紫檀芪(PTE，纯度＞98％)购自上海源叶生物科技有限公司(中国上海)，溶解于DMSO中，并在完全培养基中稀释至所需浓度。其结构式如下：
本申请发明人通过实验发现紫檀芪对胶质瘤细胞有显著杀伤作用，主要是紫檀芪在体内外诱导胶质瘤细胞GSDME依赖的焦亡，紫檀芪激活细胞焦亡的执行蛋白GSDME蛋白。通过体内实验，优选紫檀芪的体内作用浓度为150～170mg/kg，优选为160mg/kg。
所述PD-1抑制剂包括PD-1抗体、靶向PD-1的小分子抑制剂中的至少一种。
作为一种具体的实施方式中，InVivoMAb anti-mouse PD-1(CD279)，克隆号：RMP1–14,购自BioXCell公司.PD-1抗体的体内作用浓度为5-10mg/kg。
本申请发明人通过实验发现紫檀芪和PD-1抑制剂联用能够对胶质母细胞瘤起到协同增效的治疗效果。紫檀芪和PD-1抑制剂的添加比例可采用任意比例均可。
为了评估紫檀芪对小鼠原位胶质瘤模型肿瘤的影响，因此我们使用GL261-Luc细胞建立了胶质瘤原位肿瘤模型。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物进行详细说明。
实施例1、紫檀芪诱导胶质瘤细胞焦亡效应
1、CCK8细胞活力实验检测PTE在GBM细胞系中的(半抑制浓度)IC50值
复苏U87MG、GL261、U251细胞，培养至对数生长期后传代至96孔板中，预设每个梯度浓度5孔重复，每孔4000个细胞，12h贴壁后更换为含PTE浓度梯度(40、80、120、160μmol·L-1)的培养基共培养细胞，其中含0.1％DMSO培养基作为空白对照组。24、48、72h后，根据CCK-8试剂操作说明，加入CCK-8检测液，继续培养2h后，使用SpectraMax 190酶标仪(Molecular Devices,USA)测量450nm处的吸光度，使用GraphPad 8.3.0软件统计PTE作用于U87MG、GL261、U251细胞的IC50。细胞活力(％)＝[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)]×100。其中A(加药)：具有细胞、CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度；A(空白)：具有培养基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度；A(0加药)：具有细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。
由图1A、B、C可知：PTE对U87MG及U251细胞的24、48、72h半抑制浓度(IC50)分为122.9、86.22、74.23μmol·L-1以及111.1、92.43、64.96μmol·L-1，对GL261半抑制浓度(IC50)分别为135.0、79.39、60.56μmol·L-1，提示PTE对胶质瘤细胞有明确的抑制作用。因此后续优选IC50附近的40、80、120μmol·L-1作为实验的低中高浓度。
由图1D可知：通过使用胶质瘤常规化疗药物替莫唑胺(TMZ)处理U87MG细胞，发现其IC50显著高于PTE，说明PTE的对GBM细胞的抑制作用明显优于TMZ
由上述的CCK-8实验结果表明，PTE在40、80、120、160μmol·L-1浓度下给药24、48、72h均可以抑制U87MG、GL261、U251细胞的活性，且抑制作用随PTE浓度的增加而增加。
2、药物处理后的细胞形态学观察
为了进一步探讨PTE(紫檀芪)诱导GBM细胞何种形式的细胞死亡，我们首先进行了药物处理后的细胞形态学观察：将U87MG和GL261细胞接种到96孔板中，每孔3000个细胞。然后用80μmol·L-1处理细胞，并使用Operetta CLS共聚焦高内涵成像分析系统(PerkinElmer，美国)进行检测。每4小时拍照一次(比例尺：100微米)，观察48小时。
由图1E、F可知：通过高内涵共聚焦成像连续观测GBM细胞48h，观察80μmol·L-1的PTE处理的U87MG、GL261细胞的形态变化，PTE处理的U87MG、GL261细胞早期表现出凋亡特征，随后出现大量细胞肿胀、吐大气泡的特征，这是细胞焦亡的典型特征
由于主要存在caspase-1/NLRP3/GSDMD途径及caspase-3/GSDME途径介导的焦亡，故通过Western bolt实验检验了GSDME和GSDMD介导的2条关键途径的蛋白表达情况，这里我们使用顺铂(DDP)作为阳性药物对照，既往的研究表明顺铂等化疗药物可显著激活caspase-3/GSDME依赖的细胞焦亡。
3、蛋白质印迹实验
将处理过的细胞或组织在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解，通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。将细胞用5％牛血清白蛋白在室温(RT)下封闭1小时，并用TBST洗涤3次。PVDF膜在一抗溶液(根据抗体说明书稀释最佳浓度)中于4℃下孵育过夜，然后在室温下与荧光素偶联的二抗溶液(1：1000)孵育2小时。所有蛋白质均使用蛋白质印迹底物进行可视化。检测焦亡相关蛋白GSDME及GSDMD的活化情况。
图1G的结果显示：与空白组相比，PTE处理的U87MG、GL261细胞出现了caspase-3、GSDME蛋白活化(cleaved caspase-3、GSDME-N)表达水平上升，而GSDMD-N、caspase-1蛋白未见明显活化，这提示PTE主要诱导了caspase-3/GSDME介导的焦亡通路而非GSDMD介导的焦亡通路，紫檀芪是一种有效的细胞焦亡诱导剂。
实施例2、动物实验评估联合用药的治疗效果
C57BL/6J小鼠购自湖北医药学院实验动物中心(中国湖北)，并按照美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南饲养。本研究的实验方案经湖北医药学院实验动物福利伦理审查委员会审查通过(湖北医药学院动物(福利)第2023号-实验005号)。
1、细胞的培养：小鼠胶质瘤细胞GL261-luc生长在含有10％FBS、100μU/ml的青霉素及0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基中；所有细胞株均置于5％二氧化碳，37℃恒温密闭式孵箱(相对湿度95％)内培养传代，大约2-3天传代一次，取对数生长期的细胞用于小鼠成瘤实验。
2、小鼠胶质瘤模型构建：将上述培养的GL261-luc消化为单细胞悬液，通过小动物立体定位仪系统，将2×105的GL261细胞注射到小鼠的右侧半球尾状核位置(定位Bregma点前0.5mm、旁开2mm、深3mm)，大约一周后通过小动物活体成像仪系统观察成瘤情况。实验采用随机、单盲设计，将成瘤后小鼠随机分为4组，每组10只小鼠。其中5只小鼠用于生存统计，5只小鼠用于后续实验。小鼠接种肿瘤后1周开始给药处理。
3、筛选合适的PTE体内给药浓度
分组情况：对照组，TMZ(替莫唑胺)组，PTE低、中、高剂量组。
药物剂量：PTE 80mg/kg、PTE 160mg/kg、PTE 240mg/kg分别对于低中高剂量组，灌胃给药，PTE与0.5％的CMC-Na(上海源叶生物科技有限公司)配制成混悬液；替莫唑胺30mg/kg，灌胃给药；PTE每日给药一次；替莫唑胺每日给药一次。
给药期间每周监测体重、小动物活体成像检测荧光强度，当小鼠出现精神萎靡、驼背、体重减轻30％或观察期满40天视为治疗终止，记录观察时间，后续计算生存率。实验结束时取肿瘤称重、测量，观察小鼠生存情况，并绘制生存曲线，评估治疗效果，筛选合适的PTE体内给药浓度。
由图2B、2C可知：采用低、中、高剂量的紫檀芪以及胶质瘤常规化疗药物替莫唑胺连续给药治疗4-5周,PTE治疗组以及TMZ治疗组肿瘤大小均较对照组减小，PTE治疗组肿瘤大小较TMZ组缩小更显著；对于小鼠的存活时间，PTE治疗组明显长于对照组和TMZ治疗组小鼠。
由图2D可知：对照组和TMZ治疗组小鼠在治疗后期表现出一定程度的体重下降(图2B)，且该两组小鼠在治疗后期出现明显的行动迟钝以及弓腰驼背状态，说明替莫唑胺的治疗对小鼠肿瘤并不理想。
由图2E可知：紫檀芪作为一种焦亡诱导剂在体内激活了GSDME介导的肿瘤细胞焦亡，而替莫唑胺治疗组小鼠肿瘤并未见肿瘤组织发生焦亡相关蛋白活化。
由图2F可知：紫檀芪作为一种焦亡诱导剂在体内促进肿瘤组织IFN-γ、HMGB1、TNF-α、IL-1β等炎症因子表达，提示刺激了肿瘤的炎症微环境
4、评估联合用药的治疗效果
带荧光素酶标记的小鼠胶质瘤细胞GL261-luc，紫檀芪(分析标准品,HPLC≥98％)，体内级抗小鼠PD-1单克隆抗体(抗原表位为RMP1-14)，免疫健全的6-7周龄的C57bl/6J品系小鼠，小动物活体成像仪器。
(1)细胞的培养：小鼠胶质瘤细胞GL261-luc生长在含有10％FBS、100μU/ml的青霉素及0.1mg/ml链霉素的DMEM完全培养基中；所有细胞株均置于5％二氧化碳，37℃恒温密闭式孵箱(相对湿度95％)内培养传代，大约2-3天传代一次，取对数生长期的细胞用于小鼠成瘤实验。
(2)小鼠胶质瘤模型构建：将上述培养的GL261-luc消化为单细胞悬液，通过小动物立体定位仪系统，将2×105的GL261细胞注射到小鼠的右侧半球尾状核位置(定位Bregma点前0.5mm、旁开2mm、深3mm)，大约一周后通过小动物活体成像仪系统观察成瘤情况。实验采用随机、单盲设计，将成瘤后小鼠随机分为4组，每组10只小鼠。其中5只小鼠用于生存统计，5只小鼠用于后续实验。小鼠接种肿瘤后1周开始给药处理。
(3)采用PTE、PD-1抗体以及PTE联合PD-1抗体连续给药治疗，给药过程如图2所示。
分组情况：对照组，PTE单药组，PD-1抗体单药组，PTE和PD-1抗体双药组药物剂量：PTE 160mg/kg(根据本课题前期研究优选的最适浓度)，灌胃给药，PTE与0.5％的CMC-Na(上海源叶生物科技有限公司)配制成混悬液；PD-1抗体10mg/kg，腹腔注射给药；PTE每日给药一次；PD-1抗体每三天给药一次；联合组根据上述频次给药。
(4)给药期间每周监测体重、小动物活体成像检测荧光强度，当小鼠出现精神萎靡、驼背、体重减轻30％或观察期满40天视为治疗终止，记录观察时间，后续计算生存率。观察小鼠生存情况，并绘制生存曲线，评估治疗效果。根据小鼠的生存情况的观察和记录，结果如图3B所示。
由图3B可知：
对照组小鼠在接种肿瘤后，会在40天内全部死亡，中位生存期为24天，40天实验终止时存活比率为0只(存活)/5只(总数)，即小鼠全部死亡。
PTE单药组为35天，40天时存活比率为1只(存活)/5只(总数)；PD-1抗体单药组为31天，40天时存活比率为1只(存活)/5只(总数)；PTE和PD-1抗体双药组40天时存活比率为4只(存活)/5只(总数)。
单用药物组无法诱导半数以上的小鼠获得长期的存活，PTE和PD-1抗体双药组可以使得大部分小鼠获得长时程的生存获益。
(5)小鼠接种肿瘤后1周开始给药处理。分别在接种给药第1天、第14天和第28天的时候分别对小鼠进行了活体荧光成像分析。如图4A、图4B所示，通过小动物活体成像观测发现，对照组小鼠在接种肿瘤后，小鼠肿瘤随着时间推移，呈现荧光强度不断增强，提示在没有药物干预的情况，GL261细胞形成的肿瘤会不断恶性增殖、扩大。
由图4A、图4B可知：单用PD-1抗体组和单用PTE治疗组，均一定程度抑制了GL261细胞形成的肿瘤的生长；而PTE与PD-1抗体联合组使得肿瘤生长停滞或者使得肿瘤消退，少数肿瘤完全消失。由图4C可知：在实验终止时取出小鼠肿瘤组织发现，PTE与PD-1抗体联合治疗组小鼠肿瘤几乎完全消退，且联用的效果显著优于任何单药组。
实施例3、肿瘤组织水平的焦亡相关蛋白检测及抗肿瘤因子检测
PTE通过抑制GBM细胞增殖，诱导GBM发生细胞焦亡来发挥抗肿瘤作用。由于激活肿瘤细胞焦亡可触发抗肿瘤免疫反应的特殊作用，可增强免疫治疗的效果。故我们进一步评估联合用药增强抗肿瘤效应的机制。
新鲜荷瘤脑组织中分离肿瘤组织，部分置于-80℃液氮中冷藏，以备后续westrenblot实验及荧光定量PCR实验。具体方法如下：
1、将处理过的组织在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液中充分裂解，离心收取上清，将上清与loading buffer按照合适比例配匀，通过100℃煮沸5-10分钟使蛋白变性，通过BCA检测蛋白浓度，此后用-80℃保存处理好的蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离并转移到PVDF膜上。将细胞用5％牛血清白蛋白在室温(RT)下封闭1小时，并用TBST洗涤3次。PVDF膜在一抗溶液(根据抗体说明书稀释最佳浓度)中于4℃下孵育过夜，然后在室温下与荧光素偶联的二抗溶液(1:1000)孵育2小时。所有蛋白质均使用蛋白质印迹底物进行可视化。检测各处理组胶质瘤组织焦亡相关关键蛋白(CASP3、C-CASP3、GSDME、GSDME-N)的表达情况。
由图5B可知，联合治疗表现出更加明显的肿瘤细胞焦亡激活，说明PTE联合PD-1抗体增强的细胞焦亡可明显增强抗肿瘤的效应。
2、分离不同不同处理组的肿瘤组织，Trizol提取总RNA，测定总RNA浓度及纯度。根据制造商的方案，使用All-in-One First-Strand Synthesis MasterMix(with dsDNase)试剂盒(F0202，兰博利德，中国)反转录并合成cDNA。获得的cDNA作为后续qPCR实验的模板。相关因子的相对表达标准化为β-actin，2-ΔΔCT值标准化为对照水平。本工作中使用的引物序列列于表1中。
表1-引物序列
qPCR的实验结果由图5A可知，PTE诱导的焦亡在体内增强了HMGB1、IFN-γ、TNF-α、IL-1β等抗肿瘤促炎因子在GBM中的表达。将PTE与PD-1抗体联用后发现这些促炎因子的表达进一步升高，相较于单独使用PTE或PD-1抗体的任何一组，联合治疗组均表现出抗肿瘤相关促炎因子的显著高表达。
3、对于小鼠肿瘤浸润淋巴细胞，首先收集肿瘤组织，使用IV型胶原酶及DNase I进行组织消化，收集细胞然后重悬并用FIXABLE VIABILITY DYE EF506进行死活细胞染色，并用CD16/CD32抗体封闭进行FCR阻断。通过CD8+T细胞用CD45、CD3、CD8抗体标记。使用流式细胞仪(Sony 3800，日本)测量细胞并使用SA3800软件版本2.0.4.14073进行分析。流式细胞术的实验结果由图5C可知，PTE治疗提高了肿瘤浸润CD8+T的比例，由于CD8+T细胞是体内杀伤肿瘤的主要免疫细胞，故该结果提示PTE一定程度增加抗肿瘤免疫效应。将PTE与PD-1抗体联用后的进一步增加了肿瘤浸润CD8+T的占比，提示联合联合用药更强的发挥了抗肿瘤免疫效应。
实施例4、体内安全性评估
1、对荷瘤小鼠分组和健康分组处理，处理终止后开展血生化检测、脏器切片HE染色评估体内安全性。准备小动物体重器；苏木精-伊红染料；组织切片机。
2、小鼠体重监测在分组后开始，每隔4天检测一次。各组小鼠处理终止后心脏取血，离心，取血清，-80℃保存，通过ALT、AST、GGT、BUN、Cr检测试剂盒说明书进行检测分析。
3、肿瘤组织、脑组织以及心、肝、肺、脾、肾组织置于4％多聚甲醛固定24h，后转入10％中性福尔马林固定液以备组织切片。取重要器官(脑、心、脾、肝、肺和肾)的石蜡切片(4μm)，脱蜡、复水并修复抗原。石蜡切片用伊红和苏木精染色，通过HE染色评估药物对重要脏器的损伤情况。苏木精-伊红(H&E)染色：麻醉处死小鼠，分离肿瘤组织，制成石蜡切片；脱蜡，脱蜡二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10分钟；覆水，100％、90％、80％、70％酒精各5分钟，冲洗5分钟；苏木精染色5分钟；5％乙酸分化1分钟；伊红染色1分钟；脱水：70％、80％、90％、100％酒精各10秒，二甲苯1分钟，可以在通风橱自然晾干再封片，约5分钟左右；滴上中性树胶，封片。
由图6A，图6C可知，通过重要脏器病理检测，包括心、肝、脾、肺、肾，苏木精-伊红(H&E)染色的结果显示未见明显的病理学异常和变化。且在PTE治疗组的脾脏组织中白髓面积比模型组及TMZ治疗组增加,脾小体增大，生发中心明显。以上的结果证明，使用紫檀芪(80、160、240mg/kg，灌胃给药)、PD-1抗体(10mg/kg，腹腔注射)，以及紫檀芪联合PD-1抗体治疗，在该药物浓度和注射方式下，在小鼠模型总未见明显单药及药物组合毒性。
由图6B可知：AST、ALT、γ-GT、Bun、Cre结果也提示PTE与PD-1联合应用对肝肾指标无影响。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物包括：
紫檀芪和PD-1抑制剂。
2.根据权利要求1所述的用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述PD-1抑制剂包括PD-1抗体、靶向PD-1的小分子抑制剂中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的辅料和载体。
4.根据权利要求3所述的用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述辅料包括填充剂、崩解剂、粘合剂、赋形剂、稀释剂、润滑剂、甜味剂和着色剂中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的用于治疗胶质母细胞瘤的药物组合物，其特征在于，所述药物的剂型包括颗粒剂、片剂、丸剂、胶囊剂、注射剂或分散剂中的至少一种。
6.紫檀芪和PD-1抑制剂组成的组合物在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。
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