CN107281177B

CN107281177B - 促进造血干细胞归巢和植入的方法

Info

Publication number: CN107281177B
Application number: CN201610231085.3A
Authority: CN
Inventors: 李艳华; 裴雪涛; 陈小芳; 张博文; 何丽娟
Original assignee: South China Institute Of Biomedicine
Current assignee: South China Institute Of Biomedicine; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2020-01-14
Anticipated expiration: 2036-04-13
Also published as: CN107281177A

Abstract

本发明提出了一种促进造血干细胞归巢和植入的方法、咖啡酸苯乙酯在制备药物中的用途、一种促进造血干细胞归巢和植入的试剂盒以及一种药物组合物。本发明实施例的以咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成分的药物组合物具有显著促进造血干细胞归巢和植入的作用。

Description

促进造血干细胞归巢和植入的方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及促进造血干细胞归巢和植入的方法、咖啡酸苯乙酯在制备药物中的用途、促进造血干细胞归巢和植入的试剂盒以及药物组合物。

背景技术

造血干细胞移植临床上主要用于治疗血液淋巴系统恶性肿瘤疾病，且已有几十年之久，但是该治疗方法的成功率至目前为止仅有40-70％。自供者造血干细胞移植进入受者体内后，需经血液循环、跨越骨髓微血管内皮细胞、内皮细胞下移行、归巢至骨髓微环境中、适应骨髓微环境、重新增殖，最后重新进入受者血液循环，以达到造血重建的目的。从造血干细胞移植至造血重建的过程中，研究发现影响造血干细胞移植成功的主要因素有造血干细胞归巢效率低、植入延迟及移植抗宿主病等。但是至目前为止，还未有促进造血干细胞归巢和植入的药物应用于临床。

咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester，CAPE)是蜂蜜提取物蜂胶中的一种活性组分，在民间有几千年的药用历史，其分子式为C₁₇H₁₆O₄，分子量284.31，不溶于水，溶于有机溶剂如DMSO。根据文献报道，CAPE具有多种药理学作用，如抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化及抗缺血—再灌注损伤等。CAPE的效应主要机制有以下三种：减少或诱导氧化反应以调节肿瘤的氧化还原反应的平衡；抑制肿瘤细胞血管生成酶金属基质蛋白酶2、9的活性；调节信号通路，如抑制逆转录因子NF-κB或不通过Fas配体的效应活化Fas；通过降低体内外环氧化酶基因的表达以抑制环氧化酶活性，阻断前列腺素和白三烯的合成，从而发挥抗炎效应。CAPE的邻苯二酚环形结构与清除氧自由基作用相关，其抗氧化作用部分原因是清除细胞自由基，部分原因是促进抗氧化剂的生成，如血红素加氧酶-1(Hemeoxygenase，HO-1)。如前述CAPE一方面具有清除自由基的作用，一方面有促进抗氧化反应的作用，在此基础上有文献报道CAPE有抗缺血-再灌注损伤的能力，而且CAPE诱导HO-1的表达是关键性机制。

然而，咖啡酸苯乙酯(Caffeic acid phenethyl ester，CAPE)的相关功能仍有待进一步研究。

发明内容

本申请是基于发明人对以下问题和事实的发现而提出的：

CAPE诱导缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor，HIF-1α)蛋白的表达且延缓HIF-1α蛋白的降解，另外，发明人发现分离的人脐血单个核细胞培养1周，经CAPE处理后，HIF-1α、HO-1及SCF的mRNA水平明显升高。同时，发明人发现，以上机制及数据中提到的HO-1、SCF及HIF1α与造血干细胞的归巢和植入均密切相关。为此，发明人经过大量的实验，研究验证了CAPE与造血干细胞归巢和植入的关系，发现CAPE具有显著促进造血干细胞归巢和植入的功能。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种促进造血干细胞归巢和植入的方法。所述方法包括：为移植了造血干细胞的个体给药咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐。发明人经过大量的实验发现，本发明实施例所提出的方法可促进造血干细胞的归巢和植入。

根据本发明的实施例，上述促进造血干细胞归巢和植入的方法还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，基于所述个体的总重量，所述咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量是0.3mg/kg～3.0mg/kg。发明人发现，咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐用量低于0.3mg/kg，其促进造血干细胞归巢和植入不显著，用量高于3.0mg/kg,其促进造血干细胞归巢和植入的作用强度不会随着咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量的增多而显著增强。咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量在0.3mg/kg～3.0mg/kg，其可显著促进造血干细胞的归巢和植入。

在本发明的第二方面，本发明提出了咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于促进造血干细胞的归巢和植入。发明人经过大量的实验发现，咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐可促进造血干细胞的归巢和植入，进而发明人发现，利用咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐制备药物，所得药物可用于有效促进造血干细胞的归巢和植入。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种促进造血干细胞归巢和植入的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐。本发明实施例所提出的包括咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐的试剂盒，可有效促进造血干细胞的归巢和植入。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物用于促进造血干细胞的归巢和植入，所述药物组合物含有：

咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成份。本发明实施例的含有咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成份的药物组合物可有效促进造血干细胞的归巢和植入。

根据本发明的实施例，上述药物组合物还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述药物组合物进一步包括：药学上可以接受的赋形剂。本发明实施例的药物组合物可以与药学上可接受的赋形剂结合，从而被制备成各种剂型。以咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成份的药物组合物的各种剂型，可进一步有效促进造血干细胞的归巢和植入。

根据本发明的实施例，所述药物组合物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。各种剂型的药物组合物以可以预期的给药方式给药，进而进一步有效促进造血干细胞的归巢和植入。

附图说明

图1是根据本发明实施例的咖啡酸苯乙酯对辐射清髓后小鼠生存率的影响；

图2-1是根据本发明实施例的咖啡酸苯乙酯对造血干细胞形成集落的影响；以及

图2-2是根据本发明实施例的咖啡酸苯乙酯对造血干细胞归巢效率的影响。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

促进造血干细胞归巢和植入的方法

在本发明的第一方面，本发明提出了一种促进造血干细胞归巢和植入的方法。该方法包括：为移植了造血干细胞的个体给药咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐。发明人经过大量的实验发现，本发明实施例所提出的方法可促进造血干细胞的归巢和植入。

根据本发明的实施例，基于所述个体的总重量，所述咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量是0.3mg/kg～3.0mg/kg。发明人发现，咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐用量低于0.3mg/kg，其促进造血干细胞归巢和植入不显著，用量高于3.0mg/kg,其促进造血干细胞归巢和植入的作用强度不会随着咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量的增多而显著增强。咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的用量在0.3mg/kg～3.0mg/kg，其可进一步显著促进造血干细胞的归巢和植入。

咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途

在本发明的第二方面，本发明提出了咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于促进造血干细胞的归巢和植入。发明人经过大量的实验发现，咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐可促进造血干细胞的归巢和植入，进而发明人发现，利用咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐制备药物，所得药物可用于有效促进造血干细胞的归巢和植入。

促进造血干细胞归巢和植入的试剂盒

在本发明的第三方面，本发明提出了一种促进造血干细胞归巢和植入的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐。本发明实施例所提出的包括咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐的试剂盒，可有效促进造血干细胞的归巢和植入。

药物组合物

在本发明的第四方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物用于促进造血干细胞的归巢和植入，该药物组合物含有：咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成份。本发明实施例的含有咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐作为活性成份的药物组合物可有效促进造血干细胞的归巢和植入。

根据本发明的一些实施例，包含本发明的咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的药物组合物还可以包括药物上可接受的载体，且药物组合物的剂型和给药方式不受特别限制。对于口服给药，该药物上可接受的载体可以包括粘合剂，润滑剂，崩解剂，赋形剂，增溶剂，分散剂，稳定剂，悬浮剂，着色剂和芳香剂。对于注射制剂，药物上可接受的载体可以包括缓冲剂，防腐剂，止痛剂，增溶剂，等渗压剂(isotonic agent)和稳定剂。对于局部给药的制剂，药物上可接受的载体可以包括碱，赋形剂，润滑剂和防腐剂。本发明的药物组合物可以与上述的药物上可接受的载体结合被制备成各种剂型。例如，对于口服给药，药物组合物可以被制备成小片，片剂，胶囊，酏剂，混悬液，糖浆或薄片。对于注射制剂，药物组合物可以被制备成例如一次剂量的剂型的安瓿或例如多剂量容器的单元型剂型。药物组合物还可以被制备成溶液，悬浮液，药片，药丸，胶囊和长效制剂。

其中，根据本发明的一些具体示例，适合药物配方的载体中赋形剂和稀释液的可以包括：乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨糖醇，甘露醇，木糖醇，赤藻糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯橡胶，藻酸盐，凝胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，羟基苯甲酸甲酯，羟苯丙酯，滑石，硬脂酸镁和矿物油。

根据本发明的另一些实施例，本发明的药物组合物中还可以包括填充剂，抗凝血剂，润滑剂，保湿剂，芳香剂和防腐剂。

根据本发明的实施例，本发明的药物和药物组合物能够促进造血干细胞的归巢和植入，因而，本发明的咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐药物以及包含咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐的药物组合物可以给移植了造血干细胞的个体给药，促进造血干细胞在被移植个体中的归巢和植入。

在本文中所使用的术语“给药”指将预定量的物质通过某种适合的方式引入病人。本发明的药物及药物组合物可以通过任何常见的途径给药，只要它可以到达预期的组织。给药的各种方式是可以预期的，包括腹膜，静脉，肌肉，皮下，皮层，口服，局部，鼻腔，肺部和直肠，但是本发明不限于这些已举例的给药方式。然而，由于口服给药时，口服给药的组合物的活性成分应该被包被或被配制以防止其在胃部被降解。优选地，本发明的组合物可以注射制剂被给药。此外，本发明的药物组合物可以使用将活性成分传送到靶细胞的特定器械来给药。

本发明的药物组合物的给药频率和剂量可以通过多个相关因素被确定，该因素包括要被治疗的疾病类型，给药途径，病人年龄，性别，体重和疾病的严重程度以及作为活性成分的药物类型。根据本发明的一些实施例，日剂量可分为适宜形式的1剂、2剂或多剂，以在整个时间段内以1次、2次或多次给药，只要达到治疗有效量即可。

术语“治疗有效量”是指化合物足以显著改善某些与疾病或病症相关的症状的量，也即为给定病症和给药方案提供治疗效果的量。例如，在造血干细胞的归巢和植入的治疗中，任何促进造血干细胞的归巢和植入的药物或化合物应当是治疗有效的。

术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗，包括但不限于将含本文所述的药物或药物组合物给予有需要的个体。

根据本发明的实施例，本发明的药物或药物组合物可与常规治疗方法和/或疗法相结合使用，或者可与常规治疗方法和/或疗法分开使用。当本发明的药物或药物组合物在采用与其它药物的联合疗法中给药时，它们可序贯地或同时地给予个体。或者，本发明的药物组合物可包含本发明实施例的咖啡酸苯乙酯或其药学上可以接受的盐、药学上可接受的载体或药学上可接受的赋形剂以及本领域已知的其它治疗药或预防药的组合。

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1

按照以下步骤，检测咖啡酸苯乙酯对辐照清髓及骨髓移植后小鼠生存率的影响：

1、分离小鼠骨髓细胞

C57BL/6J品系小鼠(该品系小鼠造血干细胞表达CD45.2标志物，可通过流式细胞仪检测鉴别)购自北京维通利华公司，雄性，5周龄，体重16～18g。稳定状态一周以上后，选择6-8周龄的小鼠进行实验。

小鼠脊椎脱臼处死，取出股骨和胫骨，并用含2％胎牛血清(Gibco)的PBS反复冲洗骨髓腔，获得的细胞悬液以2000rpm离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用PBS重悬，使用小鼠外周血淋巴细胞分离液(购自中国医学科学院生物医学工程研究所灏洋生物联合实验室，货号LST1092)进行细胞分层，于20～24℃，2000rpm的条件下离心25min，慢升慢降，吸取白膜层，并用PBS重悬，2000rpm离心5分钟，洗涤细胞，一共洗涤3遍，最后用PBS重悬细胞，获得骨髓细胞悬液，备用。

2、咖啡酸苯乙酯(CAPE)的配制及使用

咖啡酸苯乙酯(购自Sigma，货号C8221-1G)用5％二甲基亚砜(购自Sigma，货号D2656-100ml)、20％丙二醇、0.2％乳化剂T-80及75％生理盐水配制成0微克/ml、60微克/ml、300微克/ml及600微克/ml的溶液，现配现用。

咖啡酸苯乙酯溶液通过腹腔注射入小鼠体内。

3、造血干细胞归巢和植入对辐射清髓后小鼠生存率影响的检测

C57BL/6J品系小鼠稳定状态一周后，选择周龄(6-8周)及体重(20-22g)的小鼠，随机分为4组，行Co60照射，剂量为9.5Gy，照射后18-20小时内，尾静脉移植1中新鲜分离的同批次小鼠骨髓细胞悬液，每只移植2.5×10⁵个细胞。在照射前20-24小时、照射后0小时及移植后0小时，4组小鼠分别腹腔注射0mg/kg、0.3mg/kg、1.5mg/kg、3.0mg/kg按2中配制的咖啡酸苯乙酯溶液。观察小鼠生存情况，并记录。

实验结果如图1所示，结果显示注射越高浓度咖啡酸苯乙酯的小鼠生存率越高。小鼠辐照清髓后行造血干细胞移植，移植细胞量少，有近50％的死亡，但经过咖啡酸苯乙酯处理后，小鼠的生存率得到不同程度的提高，且在3.0mg/kg时达到了93.75％。这表明咖啡酸苯乙酯在造血干细胞的归巢和植入方面有一定的促进作用，小鼠造血重建并存活。

实施例2

按照以下步骤，检测咖啡酸苯乙酯促进小鼠造血干细胞归巢的影响：

1、照射清髓后移植及腹腔注射小分子化合物咖啡酸苯乙酯

C57BL/6J品系小鼠稳定状态一周后，选择周龄(6-8周)及体重(20-22g)的小鼠，随机分为3组，每组4只作为受者，分别标记为空白组、对照组及实验组，行Co60照射，剂量9.5Gy。照射后18-20小时内，同批次小鼠作为造血干细胞的提供者，按实施施例1中的方法制备新鲜骨髓细胞悬液，每只对照组及实验组小鼠的尾静脉移植1×10⁷个细胞。在照射前20-24小时、照射后0小时及移植后0小时，空白组、对照组及实验组小鼠分别腹腔注射0mg/kg、0mg/kg及3.0mg/kg按照实施例1中的方法配制的咖啡酸苯乙酯溶液。

2、分离小鼠骨髓细胞

移植后20-24小时，颈椎脱臼法处死空白组、对照组及实验组小鼠，同时处死同批次正常小鼠2只，按施例1中的方法制备骨髓细胞悬液，分别标记为空白组、对照组、实验组及正常组。

3、骨髓细胞悬液种植集落

低吸附24孔板中，每孔加集落培养基(MethoCult^TMGF M3434，STEMCELLTechnologies公司)500微升，每孔种植细胞量为空白组1×10⁶、对照组5×10⁵个、实验组5×10⁵个及正常组5×10⁴个个细胞。种植后第7天，使用倒置显微镜观察并计算集落数。

辐照清髓后小鼠经移植造血干细胞后的24小时内，采集受者小鼠的骨髓单个核细胞，使用全集落培养基培养后，观察各组小鼠的集落数，如图2-1所示，实验组形成的总集落数明显高于对照组，实验组红系集落(BFU-E)、粒-巨核系(GM)及红-粒-巨核混合系(GEMM)集落的数量均高于对照组。另外，如图2-2所示，根据公式计算归巢效率【(1e6个细胞实验组/对照组形成的集落数-1e6个细胞空白组形成的集落数)/1e6个细胞正常组形成的集落数】，得出实验组的归巢效率明显高于对照组。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.咖啡酸苯乙酯或其药学上可接受的盐在制备药物中的用途，其特征在于，所述药物用于促进造血干细胞移植24小时内的归巢和植入。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物进一步包括药学上可以接受的赋形剂。

3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物呈片剂、注射剂、粉剂、酏剂、胶囊、混悬液、糖浆、药丸或薄片。