KR20100051032A - 산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
산삼 또는 인삼을 포함한 인삼류의 형성층 유래 식물줄기세포주를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산삼 또는 인삼을 포함하는 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액은 천연물 유래 조성물로서 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 효과적으로 암의 성장에 직접 관여하여 생체내에서 암세포 사멸시킴으로써 종양 형성 및 성장을 억제하거나 경감시키는 항암활성을 나타내므로, 암의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.
인삼류, 산삼, 인삼, 형성층, 암
Description
본 발명은 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 현대인의 사망원인에서 가장 큰 비중을 차지하고 있는 질환 중 하나로 여러가지 원인에 의해 정상세포가 유전자의 돌연변이로 인하여 발생하며, 정상적인 세포의 분화, 성장 형태를 따르지 않는 종양 중 악성인 것을 말한다.
현재까지 악성종양인 암을 치료하는 방법으로는 주로 3가지 치료법 즉, 외과적인 수술, 방사선 치료 및 화학요법 중 한 가지 또는 이들의 조합을 통해 치료되고 있다. 구체적으로, 외과적 수술은 질병 조직을 대부분 제거하는 방법으로서, 이러한 외과적 수술은 특정 부위, 예를 들면 유방, 결장 및 피부에 위치한 종양을 제 거하는데는 매우 효과적이지만, 척추와 같은 일부 부위에 있는 종양을 치료하거나 분산성 종양을 치료하기에는 부적절하며, 경우에 따라서는 장기를 제거해야 하는 등의 부작용과 전이를 방지할 수 없는 문제가 있었다,
방사선 치료는 급성염증성 질환, 양성 또는 악성 종양, 내분비기능장애 및 알레르기성 질환 등에 사용되며, 일반적으로는 급속히 분열하는 세포로 구성된 악성종양에 효과적으로 사용되고 있는데, 방사선의 치료에 따라 정상조직의 기능 약화 또는 상실, 치료 후 치료부위에 피부질환 발생우려 및 장기의 발육이 진행되는 소아의 경우 지능발달 지연 또는 골 발육 장애 등 심각한 부작용을 초래할 수 있으며 치료시 환자의 고통을 수반한다는 문제가 있었다.
화학요법의 경우도 마찬가지로, 암세포의 복제 또는 대사를 교란시킴으로써 유방, 폐 및 정소의 암을 치료하는데 널리 이용되고 있으나, 항암제가 암세포에만 작용하는 것이 아니고 환자의 정상세포에도 독성을 발휘하는 부작용이 알려져 있다. 화학요법의 부작용 중 대부분은 심한 경우, 입원을 요하거나 통증을 치료하기 위하여 진통제를 필요로 하기도 한다.
따라서 암의 성장을 억제하고 사멸시키는 항암활성을 가지는 새로운 약물연구 및 제재개발에 많은 연구가 수행되어 왔으며, 특히 부작용이 적은 천연물에서의 항암물질의 개발에 관한 연구에 관심이 집중되고 있다.
이에 본 발명자들은 기존 항암제의 부작용을 최소화하고 암의 발전 메카니즘에 관여하여 우수한 항암활성을 나타내는 천연물 유래 항암 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 산삼 및 인삼을 포함한 인삼류의 형성층에서 유도된 동질적인 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액이 암세포 사멸활성을 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 기존 암 치료제의 부작용을 최소화한 암의 예방 및 치료 활성을 나타내는 천연물 유래 조성물을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다:
(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및
(b) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
본 발명은 또한, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품을 제공한다.
본 발명은 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액은 천연물 유래 조성물로서 기존 약물 치료제의 부작용을 최소화하여 인체에 안전하면서도, 효과적 으로 암의 성장에 직접 관여하여 생체내에서 암세포 사멸시킴으로써 종양 형성 및 성장을 억제하거나 경감시키는 항암활성을 나타내므로, 암의 예방, 치료 및 증상완화에 유용하다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명의 상세한 설명 등에서 사용되는 주요 용어의 정의는 다음과 같다.
본원에서 "형성층(cambium)"이란 식물의 줄기와 뿌리를 굵어지게 해서 식물이 부피생장을 할 수 있도록 하는 조직이다. 형성층은 세포분열이 가장 활발하게 일어나는 분열조직으로써 식물조직배양의 절편체로 사용 시 세포의 고속 및 대량생산이 가능하다고 보고되어 있다 (대한민국 등록특허 제0533120호).
본원에서 "파쇄물"이란 세포를 detergent 등을 이용한 화학적 방법 또는 물리적 방법 등으로 파쇄하여 얻은 세포 용해물을 의미하며, 세포주의 "추출물"이란 세포를 용매에 녹여 분리한 물질로, 증류 또는 증발을 이용하여 농축될 수 있다. 본원에서 세포주는 배양조건에 의하여 분화되거나 유용물질의 생산능 및/또는 분비능이 향상된 세포주를 모두 포함하는 개념이며, 세포주의 "배양액"이란 세포를 배 양시킨 다음, 세포를 제외하고 남은 세포 배양용액을 의미한다.
본원에서 "선천적인 미분화 상태(innately undifferentiated)"란 탈분화 과정을 거쳐 미분화 상태로 존재하는 것이 아닌, 본래부터 분화 전 상태를 유지하는 것을 말한다.
본 발명은 일 관점에서, 인삼류(Panax ginseng)의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 있어서, 인삼류(Panax ginseng)는 산삼 또는 인삼을 포함하며 (Lian M.L. et al., J. Plant Biology, 45: 201, 2002; Han J.Y. et al., J. Plant Biology, 49:26, 2006; Teng W.L. et al., Tissue and Organ Culture, 68:233, 2002), 이때, 본 발명에서 상기 산삼 또는 인삼은 노지삼 또는 조직배양삼류(부정근 및 부정근 유래 세포주)를 포함한다.
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주는 (a) 선천적 미분화 상태(innately undifferentiated)임; 및 (c) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타내는 것을 특징으로 한다. 또한, 추가적으로 (a) 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재함; (b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스(shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및 (c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨을 특징으로 할 수 있다. 아울러, 상기 세포주는 동질적인 세포주(homogeneous cell line)임을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 할 수 있다:
(a) 인삼류의 형성층 함유 조직을 수득하는 단계;
(b) 상기 수득된 형성층 함유 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,
이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및
(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
이때, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 삼투 스트레스 공정은 형성층 특이적으로 세포주를 유도하기 위한 것으로서, 바람직하게는 상기 IAA 또는 IBA를 포함하는 배지에서 배양하기 전에 수행하여 형성층 이외의 일반 조직, 즉, 피층(cortex), 사부(phloem), 목부(xylem), 수(pith)에서는 분열능을 잃어 추후 IAA 또는 IBA와 같이 형성층분열 특이적인 호르몬을 처리하여 배양하는 경우 괴사되도록 한다. 이때 삼투제는 0.5~2M의 함량으로 처리하고, 냉장 또는 상온에서 16시간 내지 24시간 동안 삼투 스트레스를 가한 후, 처리한 삼투 스트레스를 제거하는 것이 바람직하나, 삼투제의 농도, 처리 시간 및 온도는 식물체별, 조직별 상태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 (b) 단계에 있어서, 상기 IAA 또는 IBA는 0.1~5㎎/ℓ의 함량으로 포함되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 (c) 단계는 바람직하게는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4- D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 한다. 이때, 상기 2,4-D, 피클로람 및 IBA 중 어느 하나는 바람직하게는 1~5mg/L, 더욱 바람직하게는 2mg/L의 함량으로 사용한다.
본 발명에서 사용한 배지는 통상의 식물 조직 배양을 위한 배지로써, 일례로 N6배지, SH배지, MS 배지, AA 배지, LS 배지, B5배지, WPM 배지, LP배지, White배지, GD배지, DKW배지, DCR 배지 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 저급알코올 등 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것을 특징으로 할 수 있다. 이때, 저급알코올은 메탄올, 에탄올 등 탄소수가 1 내지 5인 알코올을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서는 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주 추출물을 췌장암 세포주, 폐암세포주, 간암세포주, 대장암 세포주, 유방암 세포주, 자궁경부암 세포주, 피부암 세포주 및 전립선암 세포주에 처리하여 상기 모든 암세포주에 대하여 사멸효과가 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주 배양액의 유방암 세포주와 췌장암 세포주에 대하여 사멸효과가 있음을 확인하였다.
아울러, 본 발명의 또 다른 실시예에서는 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주를 림프암, 폐암, 직장암 및 위암 등의 암환자에게 경구투여한 후 PET-CT를 촬영한 결과, 인삼류의 형성층 유래 세포주가 생체(예를 들어, 환자) 내에서 암세포주를 사멸시킴으로써 종양형성 및 성장을 억제하거나 경감시키는 효과가 있음을 확인하였으며, 백혈병 환자에게 경구투여 후 혈액수치를 측정한 결과, 혈액수치가 정상으로 회복됨을 확인하였다. 즉, 본 발명에 따른 세포주는 이에 한정되지는 않으나, 췌장암, 간암, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 피부암, 전립선암, 림프암, 백혈병, 폐암, 직장암 및 위암의 치료 및 예방에 효과적인 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에서는 상기 세포주 파쇄물를 함유하는 조성물이 암의 예방 및 치료 효과를 나타냄을 제시하는 구체적인 실시예가 없다 하더라도, 상기에서 살펴본 바와 같이 그 세포주, 그 추출물 및 배양액이 암의 예방 및 치료에 활성을 가지는 것을 확인한바, 본 발명에 따른 세포주 파쇄물을 함유한 조성물의 경우에도 암의 예방 및 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다고 할 것이다.
본 발명에 따른 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물은, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 각각 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하여 약학 조성물로 제공될 수 있으며, 상기 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 또는 그 배양액은 질환 및 이의 중증정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절한 약학적으로 유효한 양으로 약학 조성물에 포함될 수 있다.
상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반 응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리톤, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
상기 약학 조성물은 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사 용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 인삼류의 형성층 유래 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품에 관한 것이다.
본원에서 '기능성 식품'이란, 일반 식품에 본 발명에 따른 세포주, 그 세포주의 파쇄물 또는 추출물을 첨가함으로써 식품의 기능성을 향상시킨 것을 의미한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예 는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 하기 실시예에서는 산삼의 형성층 유래 세포주, 그 추출물 및 그 배양액의 암의 예방 및 억제 효과를 확인하였으나, 상기 세포주의 파쇄물을 사용해서도 동일한 결과를 얻을 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 사항이라 할 것이다.
실시예
1: 인삼류의 형성층 유래 세포주의 제조
1-1: 식물재료의 준비
(1) 도 1의 (a)의 A는 본 발명에서 사용한 산삼의 전형적인 모습을 보여준다. 산삼을 준비한 다음, 산삼의 주근부를 사용하기 위해 흐르는 물로 겉표면에 묻어 있는 흙이나 그 외의 오염물질을 제거하고 액체 세제를 이용하여 주근의 표면을 씻어 준 다음, 흐르는 물에 방치를 하였다. 깨끗하게 씻은 조직은 클린벤치 내에 준비된 멸균된 플라스크에 넣고 70% 에탄올로 30초 내지 1분 정도 살균하였다. 그 후 멸균수로 헹궈 주고 1% 내지 1.5% 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite, Junsei, Japan)을 이용하여 5분 내지 15분 정도로 소독액을 처리하였다. 이때, 소독액이 효과적으로 조직 내로 침투하게 하기 위해 TWEEN 20(Polyoxyethylenesorbitan monolaurate, Junsei, Japan)을 몇 방울 정도 떨어뜨려 처리하였다. 이 과정이 마쳐지면 멸균수로 3회 내지 5회 정도로 헹궈 주었다. 이 후에 살균 처리한 조직의 갈변화를 방지하기 위해 항산화제가 포함된 BIM(browning inhibition medium)에 살균된 주근을 넣고 30분 내지 1시간 정도 진탕배양하고 멸균된 여과지에 놓고 물기를 제거하였다.
사용된 BIM의 조성 및 사용농도는 표 1과 같다.
<표 1> BIM 조성 및 사용 농도
구성성분 | 사용농도 |
McCown WPM salt | 1/4 strength |
Sucrose | 1%(w/v) |
PVP(polyvinyl pyrrolidone) | 0.5%(w/v) |
Ascorbic acid | 100㎎/ℓ |
Citric acid | 150㎎/ℓ |
pH 5.8로 보정 |
여기서, 염농도는 전체의 1/4에 해당하는 양만 첨가한다.
그 후, 상기 재료를 갈변이 되는 것을 방지하기 위해 항산화제가 포함된 CS solution (cutting sloution, 표 3)이 담긴 멸균 접시에 놓고, 겉껍질을 얇게 벗겨 내고 반으로 갈라 각 부분에서 분열능이 왕성한 형성층 부분이 포함되게 해서 가로×세로×높이=0.5~0.7cm×0.5~0.7cm×0.2~0.5mm의 크기로 절단을 하였다. 도 1의 (a)의 B는 산삼의 주근부에서 형성층이 포함되도록 상기 크기로 절단을 하여 절편체를 제조한 모습이다.
<표 2> CS(cutting solution)
구성성분 | 사용농도 |
PVP(Polyvinyl pyrrolidone) | 0.5%(w/v) |
Ascorbic acid | 100㎎/ℓ |
Citric acid | 150㎎/ℓ |
(2) 생물반응기(bioreactor)에서 유지 중인 100년 된 산삼부정근을 준비하고 역시 표 2의 CS solution이 담긴 멸균접시에 놓고 역시 상기와 동일한 방법으로 형성층을 포함하는 절편체를 수득하였다.
1-2: 산삼
주근부
형성층 포함
절편체에의
삼투제의 처리
실시예 1-1에서 제조된 절편체에서, 분화된 조직 즉, 사부, 목부, 수 등은 괴사시키고 분열조직인 형성층만을 생존시키기 위해 삼투 스트레스를 처리하였다. 상기 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1, 표 3)에 블로팅(blotting)을 하여 1M 수크로오즈(Duchefa, Netherland) 용액이 담긴 플라스크에 넣어 냉장상태에서 16~24시간 동안 삼투스트레스를 처리한 후 0.05M 수크로오즈 용액(sucrose solution)에서 5분간, 0.1M sucrose 용액에서 5분간 처리하여 고농도의 sucrose에 의한 스트레스를 해제하였다. 그 후 상기 삼투 스트레스가 해제된 형성층 포함 절편체를 여과지가 깔린 전치상 배지(배지 1)에 올려서 물기를 제거하였다.
<표 3> 전치상 배지(배지 1) 조성
조성 | mM | ㎎/ℓ | |
Macroelements | Ca(NO3)2 | 2.35 | 471.26 |
NH4NO3 | 5 | 400 | |
MgSO4·7H2O | 1.5 | 180.54 | |
K2SO4 | 5.68 | 990 | |
CaCl2·2H2O | 0.65 | 72.5 | |
KH2PO4 | 1.25 | 170 | |
조성 | μM | ㎎/ℓ | |
Microelements | MnSO4·4H2O | 131.94 | 22.3 |
ZnSO4·7H2O | 29.91 | 8.6 | |
Na2MoO4·2H2O | 1.03 | 0.25 | |
H3BO3 | 100.27 | 6.2 | |
CuSO4·5H2O | 1.0 | 0.25 | |
FeNa-EDTA | 100 | 36.7 | |
Vitamin | Glycine | 26.64 | 2.0 |
myo-Inositol | 554.94 | 100 | |
Nicotinic acid | 4.06 | 0.5 | |
Pyridoxine-HCl | 2.43 | 0.5 | |
Thiamine-HCl | 2.96 | 1.0 |
1-3: 산삼의 형성층 포함
절편체에서
형성층 기원의 동질적인 세포주 유도
형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 유도하기 위하여, 상기 실시예 1-2에서 삼투 스트레스를 처리한 절편체를 세포주 유도 배지 (배지 2, 표 4)에 치상하였다. 치상에 사용된 배지는 하기 <표 5>에 수록된 바와 같다. 치상된 절편체는 22±1℃ 암조건에서 배양하였다.
<표 4> 형성층 기원의 동질적인 세포주 유도를 위한 배지 조성(배지 2)
조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
Salt | Full strength WPM |
Sucrose | 3%(w/v) |
IAA(Indole-3-acetic acid) | 2㎎/ℓ |
pH | 5.8 |
Gelrite | 0.3%(w/v) |
Ascorbic acid | 100㎎/ℓ |
Citric acid | 150㎎/ℓ |
이때, 삼투 처리를 하지 않고 바로 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체에서는 <표 5>에 수록된 바와 같이 치상 초기(2~3일 내)에 빠르게 형성층 중심으 로 노랗게 반응을 보이다가 시간이 지나면서 절편체 전체가 노랗게 변하는 양상을 보였다. 형성층 중심의 노란 반응을 보인 절편체를 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지(배지 3)에 계대를 하여 계속적인 동질적인 세포주 유도 및 증식을 시도하였으나 갈변 양상이 심화되었고, 시간이 경과해도 갈변 반응외에 어떤 반응도 보이지 않았다.
반면, 삼투 처리를 하고 해제를 한 후 동질적인 세포주 유도배지에 치상한 절편체는 <표 5>에 기재된 바와 같이, 다른 조직에서는 세포가 유도되지 않고 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도됨이 관찰되었다. 즉, 삼투 처리를 한 후, 해제를 하여 치상한 절편체에서는 배양 3~7일 사이에 절편체의 형성층 부위가 연노랑색으로 변하기 시작하였다. 이로부터 약 7~14일 후 연노랑색으로 변한 부위에서 동글동글한 세포주가 유도됨을 관찰하였다. 이때, 노지산삼의 형성층 포함 절편체 및 산삼부정근의 형성층 포함 절편체 모두 동일한 결과가 관찰되었다. 도 1의 (a)의 C는 산삼의 형성층 포함 절편체 중 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주가 유도된 모습을 나타낸다.
한편, 삼투 처리를 한 절편체를 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주 유도배지가 아닌 통상적인 인삼, 산삼 등 인삼류 배양에서 사용하는 2,4-D를 포함하는 배지를 사용하였을 때는 배양 7~10일 사이에 절편체의 전체 부분이 노랑색으로 변하기 시작해서 이로부터 약 7~14일 후 전체 절단면에서 세포가 유도됨이 관찰되었다.
<표 5> 삼투 처리 한 절편체와 처리하지 않은 절편체의 반응 비교
처리별 | 무처리 | 16시간 처리 | 20시간 처리 | 24시간 처리 |
양상 | 치상 초기에 형성층 중심으로 노란 반응이 진행되면서 이런 반응이 절편체 전체로 퍼지는 경향을 보였음. 그 후 형성층을 포함한 절편체 전체적으로 갈변 반응이 심하게 진행되어 더 이상 형성층 특이적 분열능을 갖는 동질적인 세포주 유도는 나타나지 않았음 | 형성층에서만 특이적으로 세포가 유도됨이 관찰됨. 삼투 스트레스 처리 시간을 달리하여 처리한 결과, 서로 유사한 결과를 보였음. 즉, 상기 처리 시간별 반응물간 큰 차이는 보이지 않음. |
1-4: 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주의 증식
상기 실시예 1-3에서 유도된 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 이용하여 증식에 사용하였다. 배지는 하기 <표 6>에 제시된 기본 염(salt) 조성을 바탕으로 <표 7>에 제시된 대로 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주의 증식 최적 배지를 사용하였다. 이때, <표 7>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 증식에 사용하였다.
<표 6> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지의 기본 salt 조성
조성 | mM | mg/L | |
Macroelements | CaCl2ㆍ2H2O | 2.99 | 332.02 |
KH2PO4 | 1.25 | 170 | |
KNO3 | 18.79 | 1900 | |
MgSO4 | 1.5 | 180.54 | |
NH4NO3 | 20.61 | 1650 | |
조성 | uM | mg/L | |
Microelements | CoCl2·6H2O | 0.11 | 0.025 |
CuSO4·5H2O | 0.1 | 0.025 | |
FeNa-EDTA | 100 | 36.7 | |
H3BO3 | 100.27 | 6.2 | |
KI | 5.0 | 0.83 | |
MnSO4·4H2O | 100 | 16.9 | |
Na2MoO4·2H2O | 1.03 | 0.25 | |
ZnSO4·7H2O | 29.91 | 8.6 | |
Vitamins | Glycine | 26.64 | 2.0 |
myo-Inositol | 554.94 | 100 | |
Nicotinic acid | 4.06 | 0.5 | |
Pyridoxine-HCl | 2.43 | 0.5 | |
Thiamine-HCl | 0.3 | 0.1 |
<표 7> 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주 분리 및 증식 최적 배지 조성(배지 3)
조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
Salt | Full strength MS |
Sucrose | 3%(w/v) |
IBA (Indole-3-butyric acid) 또는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) | 2mg/L |
pH | 5.8 |
Gelrite | 0.3%(w/v) |
Ascorbic acid | 100mg/L |
Citric acid | 150mg/L |
도 1의 (a)의 C에 나타난 바와 같이 삼투 스트레스 처리와 배지 2를 사용하여 형성층에서만 특이적으로 동질적인 세포가 유도된 후, <표 7>에 제시된 배지 3으로 계대한 결과, 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포가 계속적으로 분열·증식하여 배양 약 10~20일 후에 형성층 기원의 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 분리할 수 있었다. 이렇게 분리된 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 동일 배지 에서 배양하여 분열능을 갖는 동질적인 세포주를 다시 증식시켰다. 도 1의 (a)의 D는 분리된 형성층 특이적 동질적인 세포주를 <표 7>에 제시된 배지 3에서 증식시킨 모습이다.
1-5: 분리된 세포주의 특성관찰
상기 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주를 하기 <표 8>의 액상 배지가 함유된 플라스크에 넣어 암조건에서 25±1℃에서 100rpm의 회전 교반기(shaker)에서 배양하였다. 계대배양 주기는 2주일로 고정함으로써 배양세포가 항상 대수생장기 상태에서 높은 활력을 유지할 수 있도록 하였다. 이때, <표 8>에서 2,4-D는 노지산삼의 형성층으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에, IBA는 산삼부정근으로부터 유도된 동질적인 세포주의 배양에 사용하였다.
한편, 인삼의 자엽 유래 캘러스(callus)도 <표 8>의 배지 4에서 배양하여 본 발명에 따른 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주와 비교하였다.
<표 8> Suspension medium in Panax ginseng . (배지 4)
조성 및 조건 | 사용농도 및 조건 |
Salt | Full strength MS |
Sucrose | 3%(w/v) |
IBA (Indole-3-butyric acid) 또는 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) | 2mg/L |
pH | 5.8 |
먼저 세포 응집정도(biological microscope CX31, Olympus, Japan)를 살펴 볼 때, <표 9>와 같이 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세 포주는 현탁배양 시 95%이상의 단세포 수준으로 존재함을 관찰할 수 있었고, 본 발명에 따른 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 역시 60%이상이 단세포 수준으로 존재함을 관찰되어, 본 발명에 따른 세포주는 현탁배양 시 단세포 수준으로 존재하는 특징이 있음을 확인할 수 있었다. 또한, 도 1(b)의 A에 나타난 바와 같이, 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 세포주 및 IBA를 처리한 부정근의 형성층 유래 세포주 모두 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 관찰할 수 있었으며, 미분화상태임을 확인할 수 있었다. 그러나, 이에 반하여 인삼 자엽 유래 캘러스 (callus, 생물자원센터 KCTC PC10224)를 관찰한 결과, 도 1(b)의 B에 나타난 바와 같이, 다수개의 액포가 관찰되지 않고 하나의 큰 액포가 관찰된 것으로 나타났다.
<표 9> The type of cell aggregates of Panax ginseng long-term cultures
Large cell aggregates | Moderate cell aggregates | Small cell aggregates | Single cell population | Explant source |
90% | 7% | 2% | 1% | cotyledon |
0 | 0 | 5% | 95% | cambium (2,4-D처리시) |
5% | 10 | 25% | 60% | cambium (IBA 처리시) |
Large cell aggregates, size higher than 1.5×103㎛; Moderate cell aggregates 1×103㎛; Small cell aggregates 4×102㎛<size< 1×103㎛ |
한편, 대량 배양 가능성을 살펴보기 위하여, 3L의 내용적을 갖는 공기 부양식 생물반응기(airlift bioreactor, 성원사이텍, Korea)에서 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 캘러스와 본 발명에 따른 산삼의 형성층 유래 동질적인 세포를 배양하였다. 배지는 <표 8>의 액상배지를 사용하였고, 암조건에서 25±1°C로 일정하게 유지하였다.
그 결과, <표 10>에 나타난 바와 같이, 인삼의 자엽(cotyledon) 유래 배양물의 배가시간(doubling time)은 플라스크에서는 21일인데 반해 반응기(reactor)에서는 28일로 길어졌다. 즉, 플라스크에서 배양 시 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도에서도 3~5배 정도의 높은 증식율을 보임을 확인하였으며, 대량 반응기에서는 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 5~9배의 높은 증식율을 보임을 확인하였다. 이것은 반응기 내에서의 생장고리 생성과 배양중의 식물 배양체 응집성과 세포벽이 단단하여 전단에 대한 민감성으로 세포 생존율(cell viability)이 급격히 감소한 것이 원인인 것으로 판단되었다.
한편, 본 발명에 따른 2,4-D를 처리한 노지산삼의 형성층 유래 동질적인 세포 배양물의 배가시간은 3~4일로, IBA를 처리한 산삼부정근의 형성층 유래 동질적인 세포 배양물의 배가시간은 5~6일로, 모두 플라스크와 반응기 사이에 차이가 없거나 오히려 단축되었다. 형성층 유래 동질적인 세포 배양물은 생물반응기 내의 생장고리 면적을 아주 작게 형성하고, 배양기에 간단한 자극을 주어 배지를 움직여주면 내벽의 링(ring)이 간단하게 해소되었다. 또한 응집이 작고, 많은 액포(vacuole)를 가지고 있어 전단에 대한 민감성이 약하여 세포 생존율(cell viability)의 감소를 가져오지 않았다.
즉, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주는 대량배양을 위한 생물 반응기에서 교반작용에 따른 전단 스트레스에 대하여 낮은 민감성을 가지므로, 생물반응기 내에서 급속 대량 생장이 가능함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 형성층 유래 동질적인 세포주가 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 전단스트레스에 대하여 5~9배의 낮은 민감성을 가짐을 알 수 있었다.
<표 10> 액체 현탁배양 및 생물 반응기에서의 산삼 형성층 유래 동질적인 세포주와 자엽 세포의 배가 시간
Explant source | Doubling time (day) | |
flask | bioreactor | |
cotyledon | 21 | 28 |
cambium (2,4-D 처리시) | 5 | 3~4 |
cambium (IBA 처리시) | 7 | 5~6 |
한편, 이질적인 세포주인 인삼 자엽(cotyledon) 유래 캘러스(생물자원센터, KCTC PC10224)와 형성층 유래 동질적인 세포주에 대하여 동결보존을 실시하였다. 현탁배양물은 배양 6일에서 8일 된 것을 사용하며, 동결보존제는 0.5M glycerol(DUCHEFA, The Netherlands)과 0.5M DMSO(DUCHEFA, The Netherlands)와 1M sucrose(DUCHEFA, The Netherlands) 포함된 배지이고, 5ml cryovial(Duran, USA)에 옮겼다. 동결보존제에 처리되는 세포 접종량은 200mg/ml 이다. 동결보존제 처리된 현탁세포는 30분간 냉동고에 유지한 다음 deep freezer에 3시간 보관 후 액체질소에 침지시켜 냉동시켰다.
그 후 해빙을 위하여 액체질소에 20분 이상 유지된 배양세포를 꺼내어 40℃ 항온수조에 넣고 1~2분간 해동시켰다. 세포 재생장을 위해, 세포 현탁액을 무균상태의 깔때기 및 여과지를 사용하였다. 여과된 세포는 filter paper가 포함된 고형 생장배지상에 적용시키고 30분간 실온에서 안정화 시킨 다음, 다시 신선한 고형생장배지로 다시 옮겨졌다.
그 결과, 인삼 자엽 유래 이질적인 세포주는 재생장을 하지 않는 반면, 형성층 유래 동질적인 세포주는 4주 후 재생장을 시작하여 증식하는 양상을 보였고 증식률 상에 있어서 동결보존 전 후 차이를 보이지 않았다.
실시예
2: 산삼의 형성층 유래 세포주의 건조 및 추출물 제조
실시예 1의 산삼부정근의 형성층 유래 세포주로부터 다음과 같이 건조 및 추출하였다.
(1) 건조 세포주의 제조
(i) 배양액을 제거시킨 세포주를 동결건조 또는 열풍건조 하였다.
(ⅱ) 상기 건조된 세포주는 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 얻었다.
(2) 증류수 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 증류수를 가하여 24시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 증류수 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 증류수 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.
(3) 에탄올 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 에탄올를 가하여 24시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 에탄올 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 에탄올 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.
(4) 메탄올 추출물의 제조
(ⅰ) 배양액을 제거시킨 세포주 및 열풍건조, 동결건조 세포주 500g에 5000ml의 메탄올를 가하여 24시간 교반시키면서 추출하여 얻었다.
(ⅱ) 상기 용해 후, 3,000g에서 10분간 원심분리시켜 상층액을 취함으로써 메탄올 가용성물질을 얻었다.
(ⅲ) 상기에서 얻은 메탄올 가용성물질을 회전진공농축기를 이용하여 감압 농축하였다.
실험예
1: 인삼류의 형성층 유래 세포주의
in
vitro
세포증식억제효과
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주의 암세포주의 증식억제효과를 확인하기 위하여, 암세포주 8종에 대하여 상기 실시예 2의 (4)의 메탄올 추출물을 첨가하여 억제효율을 측정하였다.
실험에 사용한 세포주는 한국세포주은행(KCLB)에서 제공된 AsPC-1 (pancreatic cancer), A549 (lung cancer), SK-Hep1 (liver cancer), HT-29 (colon cancer), MDA-MB-231 (breast cancer), HeLa (cervical cancer), A375P (skin melanoma), DU-145 (prostate cancer)를 사용하였으며, 배양액은 10%의 송아지 혈청을 함유한 RPMI1640 과 DMEM 배지를 사용하였다.
먼저, 각 세포주를 세포의 성장속도에 따라서 농도를 다르게 96-well plate에 seeding한 다음, 16~24시간동안 37℃에서 배양한 후, 상기 실시예 2의 (4)의 메탄올 추출물과 대조군으로서 산삼배양근 추출물을 12가지 dose로 단계 희석하여 처리하였다. 산삼배양근 추출물은 본 발명에 따른 세포주와 통상의 산삼조직과의 효과 비교를 위한 것으로 동결건조한 산삼배양근을 상기 실시예 2의 (4)와 동일한 방법으로 메탄올 추출물을 제조하여 사용하였다.
72시간 후에 각 well에 15 ㎕ MTT dye solution (Promega)을 넣은 후 37℃에서 4시간 방치한 뒤 solublization solution/stop mix을 한 well당 100 ㎕씩 처리해 37℃에 밤새도록 두었다. 생성된 colored formazan product가 완벽히 solublization됨을 확인한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정한 흡광도는 용매처리군에 대한 백분율로 계산하여, 용매처리군과 비교할 때 50%의 흡광도의 감소를 나타내는 검체의 농도(EC50)로 표시하여 제시하였다.
그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주의 추출물은 산삼부정근 추출물에 비하여 현저하게 적은 농도에서 8종의 암세포주의 증식을 억제시키는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 산삼배양근 추출물의 경우 고농도에서도 세포 증식저해 활성이 미약하여 EC50을 구할 수 없었던 대장암 세포주에 대해서도 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주의 추출물은 증식억제활성을 나타내었다.
따라서, 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주는 산삼배양근 추출물에 비하여 현저하게 높은 암세포주 억제활성을 가지는 것으로 나타나, 우수한 항암제로서 유용하게 사용될 수 있음을 제시하였다.
실험예
2: 인삼류의 형성층 유래 세포주 배양액의
in
vitro
세포증식억제효과 (2)
추가적으로 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주 배양액의 암세포주에 대한 사멸효과를 살펴보기 위하여, 다음의 실험을 수행하였다.
시료로는 상기 실시예 2의 (4)의 세포주 추출물 제조 시 제거한 배양액을 사용하였으며, 암세포주로는 한국세포주은행(KCLB)에서 제공된 MDA-MB-231 (breast cancer)과 AsPC-1 (pancreatic cancer)를 사용하였으며, 배양액은 10%의 송아지 혈청을 함유한 RPMI1640 과 DMEM 배지를 사용하였다.
먼저, 2종의 암세포주를 세포의 성장속도에 따라서 농도를 다르게 96-well plate에 seeding한 다음, 16~24시간 동안 37℃에서 배양한 후, 상기 배양액을 12가지 dose로 단계 희석하여 처리하였다. 72시간 후에 각 well에 15 ㎕ MTT dye solution (Promega)을 넣은 후 37℃에서 4시간 방치한 뒤 solublization solution/stop mix을 한 well당 100 ㎕씩 처리해 37℃에 밤새도록 두었다. 생성된 colored formazan product가 완벽히 solublization됨을 확인한 후 570nm에서 흡광도를 측정하였으며, 측정한 흡광도는 용매처리군에 대한 백분율로 계산하여, 용매처리군과 비교할 때 50%의 흡광도의 감소를 나타내는 검체의 농도(EC50)로 표시하여 제시하였다.
그 결과, MDA-MB-231 (breast cancer)과 AsPC-1 (pancreatic cancer)에 대하여 각각 >7.57mg/ml, >1.0 mg/ml의 EC50 값을 얻을 수 있었으며, 이에 본 발명에 따른 세포주뿐만 아니라, 본 발명에 따른 세포주의 배양액 역시 암세포주에 대한 사멸효과를 가짐을 확인할 수 있었다.
실험예
3: 인삼류의 형성층 유래 세포주의 암 예방 및 치료 효과의 확인
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주의 암 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 암으로 진단된 환자에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 세 번(아침, 점심 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 경구투여하였으며, 구체적인 투여량 및 기간은 이하와 같다. 한편, 투약 중 부작용은 없는 것으로 확인되었다.
1-1: 림프암 환자에 대한 투여
2004년 1월 9일자 림프암으로 진단받은 환자 (김**씨, 1957년생, 여)에 대하여 2개월간 1일 3g씩 경구투여하였으며 투여기간 중 다른 항암치료는 병행하지 않았다. 인체 내에서 암세포를 사멸시키는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 2개월 후 각각 한양대학교 병원에서 PET-CT를 촬영하여 대비관찰하였다.
그 결과, 도 3 나타난 바와 같이, 투여 전 시트 촬영 결과 좌측 복강 및 골반강에서 광범위하게 비정상적으로 대사가 증가된 부분이 나타나고 오른쪽 신장과 심막 및 복막에서 악성종양(malignant)가 확인된 것 (도 3 A, C)과 달리, 2개월간 본 발명에 따른 세포주를 투여한 후 촬영한 결과 광범위한 비정상적으로 대사가 증가된 부위가 사라졌음을 확인할 수 있었다 (도 3 B, D).
따라서, 상기 실험결과는 본 발명에 따른 세포주가 암세포를 사멸시켜 암을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 나타내었다.
한편, 일반적으로 항암제 복용 시 항암제 독성에 의해 간수치와 신장수치가 비정상적으로 증가하는 부작용이 보고되는바, 상기 투여기간 동안 다음과 같이 정기적으로 간수치 및 신장수치를 측정하였다. 표 11에서 T. Bil, ALP, AST, ALT, LDH는 간수치 측정자이고, BUN, CRE는 신장수치 측정자로 모두 한양대병원에서 측정되었다. 이때, BUN 및 CRE는 세럼 크레아틴 측정법(Folin-Wu 법)에 의하여 측정되었으며, AST, ALT 및 LDH는 ATBA-200FR, HITACHI 7170 Auto Analyze를 사용하여 측정하였고, ALP는 세럼 (serum) 측정방법으로, T.Bil는 아산셋트 빌리루빈 측정용 시액을 이용하여 측정하였다.
<표 11>
정상치 | 투여 1달 후 | 투여 38일 후 | 투여 45일 후 | 투여 75일 후 | 투여 105일 후 | |
BUN | 7~20 (mg/ml) | 17 | 11 | 14 | 9 | 13 |
CRE | 0.6~1.8(mg/ml) | 0.9 | 0.9 | 1.0 | 0.9 | 1.1 |
T.Bil | 0.2~1.2(mg/ml) | 0.3 | 0.2 | 0.2 | 0.4 | 0.2 |
ALP | 30~110(U/L) | 79 | 78 | 71 | 76 | 75 |
AST | 5~40(U/L) | 10 | 10 | 18 | 14 | 17 |
ALT | 5~45(U/L) | 15 | 11 | 23 | 16 | 13 |
LDH | 60~200(U/L) | 127 | 117 | 139 | 156 | 144 |
그 결과, 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 세포주 복용시 간 및 신장 수치가 정상적으로 유지가 된 것으로 관찰된바, 본 발명에 따른 세포주가 독성이 없음을 확인할 수 있었다.
1-2:
급성골수성백혈병
환자에 대한 투여
급성골수성백혈병으로 진단받은 환자(이**씨, 1995년생, 여)에 대하여 8개월간 1일 3g씩 경구투여하였다. 또한, 인체 내에서 암을 치료하는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 1개월 후 각각 백혈구치 및 혈소판치를 celldyn3000 자동 혈액 측정기(Abbott, wiesbaden, Germany)를 이용하여 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 측정하였다.
<표 12>
백혈구 | 혈소판 | |
정상치 | (4,000~10,000 /mm3) | (141,000~316,000/mm3) |
9월 1일 | 600 | 73000 |
9월 2일 | 500 | 42000 |
9월 3일 | 400 | 24000 |
9월 4일 | 400 | 52000 |
9월 5일 | 500 | 36000 |
9월 6일 | 400 | 22000 |
9월 7일 | 500 | 16000 |
9월 8일 | 500 | 58000 |
9월 9일 | 300 | 40000 |
9월 10일 | 300 | 27000 |
9월 11일 | 400 | 40000 |
9월 12일 | 600 | 26000 |
9월 13일 세포주 투여 개시일 | 300 | 13000 |
9월 14일 | 400 | 51000 |
9월 15일 | 400 | 33000 |
9월 16일 | 400 | 16000 |
9월 17일 | 400 | 50000 |
9월 18일 | 600 | 30000 |
9월 19일 | 1000 | 23000 |
9월 20일 | 1700 | 18000 |
9월 21일 | 1400 | 57000 |
9월 22일 | 6700 | 41000 |
9월 23일 | 3900 | 45000 |
9월 26일 | 3400 | 121000 |
9월 27일 | 4400 | 117000 |
9월 28일 | 3400 | 142000 |
9월 29일 | 3000 | 164000 |
10월 2일 | 3000 | 165000 |
10월 17일 | 4400 | 200000 |
그 결과, 도 4 및 표 12에 나타난 바와 같이, 투여 전 백혈구의 수치가 2,000/mm3이었음에 반하여 투여 9일 후 백혈구 수치가 급격히 증가하여 투여 약 1개월 후에는 백혈구 수치와 혈소판치 모두 정상범위내로 관찰되었다 (백혈구 수치 정상범위: 4,000~10,000 /mm3 ; 혈소판치 정상범위: 141,000~316,000/mm3).
따라서, 본 발명에 따른 세포주의 투여가 백혈병을 치료하고 그 증상을 완화하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
1-3: 급성림프구 백혈병 환자에 대한 투여
급성림프구 백혈병으로 진단받은 환자(최**씨, 2001년생, 남)에 대하여 14개월간 1일 3g씩 경구투여하였다. 또한, 인체 내에서 암을 치료하는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 14개월 후 각각 혈색소치를 celldyn3000 자동 혈액 측정기(Abbott, wiesbaden, Germany)를 이용하여 제조사가 제시한 설명서의 측정방법에 따라 측정하였다.
<표 13>
혈색소치 | |
(정상치) | (13.6~17.4 gm/dl) |
투여 전 | 3.6 gm/dl |
투여 후 | 12.8 gm/dl |
그 결과, 표 13에 나타난 바와 같이, 투여 전에 비하여 혈색소치가 모두 증가하여 정상범위로 나타났다.
백혈병은 분화과정의 한 단계가 정지되어 분화되지 않고 미성숙 세포가 증식하는 것으로, 이에 면역학적 표현형이 일정한 미성숙세포가 증식한다 (전인상, Medical postgraduates 33, 2005). 이에 급성 림프구성 백혈병은 백혈구 전구세포인 미성숙 세포의 암성증식(癌性增殖)에 의해 정상혈구가 감소하게 되고 이로 인하여 빈혈, 출혈, 감염 등이 흔히 나타나고, 장기에 침윤하여 뼈의 통증, 간 및 비장의 비대 등이 나타나며 장기손상을 가져오게 된다. 상기 투여 전 혈색소치가 3.6gm/dl에 불과한 것으로 나타난바, 이는 환자가 극심한 빈혈상태에 있음을 나타내는데 본 발명에 따른 세포주의 투여 후 12.8gm/dl의 정상치로 증가한바 백혈병으 로 인한 증상이 개선되었음을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 세포주의 투여가 백혈병의 증상을 완화하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
한편 상기 경구투여 시 항암치료가 병행하여 이루어졌으나, 본 발명에 따른 세포주 투여 전인 최초 백혈병 진단 후 지속적으로 이루어졌으므로, 항암치료가 투여 전 또는 투여 후의 데이터를 비교하는 데 있어 영향은 미치지 않은 것으로 판단된다.
1-4: 폐암환자에 대한 투여
(1) 2006년 7월 3일자 폐암으로 진단받은 환자 (윤**씨, 1939년생, 여)에 대하여 약 13개월간 1일 3g씩 경구투여하였으며 투여기간 중 다른 항암치료는 병행하지 않았다. 인체 내에서 암세포를 사멸시키는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 13개월 후 각각 서울대병원에서 PET-CT를 촬영하여 대비관찰하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 투여 전(도 5A) 및 투여 후(도 5B)를 대비한 결과 투여에 따라 불투명도(opacity)가 감소된 것으로 확인되었으며, 이에 종양의 넓이가 감소된 것으로 판단되었다.
따라서, 상기 실험결과는 본 발명에 따른 세포주가 암세포를 사멸시켜 암을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 나타내었다.
(2) 추가적으로 항암제(아바스틴, 제넨텍)를 투여 중인 62세의 폐암환자 (J***씨, 1946년생, 남)에 대하여 본 발명에 따른 세포주를 1일 3g씩 약 3개월간 투여하였다. 암세포주 사멸효과를 관찰하기 위하여, CT 촬영으로 종양의 직경을 측정하였다.
그 결과, 종양의 직경을 측정한 결과 투여 전 7㎝에서 5.6㎝로 종양의 크기가 감소한 것으로 확인되었다. 이에 본 발명에 따른 세포주는 암을 사멸시키는 효과가 있음을 확인하였다.
한편, 상기 경구투여 시 항암제인 아바스틴의 투여가 병행되었으나, 본 발명에 따른 세포주 투여 전인 아바스틴 단독 투여 시 종양이 계속적으로 크기가 증가한바, 항암치료가 투여 전 또는 투여 후의 데이터를 비교하는 데 있어 영향은 미치지 않은 것으로 판단된다.
1-5: 직장암환자에 대한 투여
2007년 11월 13일자 직장암으로 진단받은 환자 (권**씨, 1949년생, 여)에 대하여 1일 3g씩 경구투여하였으며, 투여기간 중 다른 항암치료는 병행하지 않았다. 인체 내에서 암세포를 사멸시키는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 49일 후 각각 전북대 병원에서 PET-CT를 촬영하여 대비관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 투여 전(도 6A) 및 투여 후(도 6B)를 대비한 결과 투여에 따라 투여 전 사진의 붉은 원으로 표시된 부분의 불투명도(opacity)가 감소된 것으로 확인되었다. 즉, 암세포주가 사멸된 것으로 나타났다.
따라서, 상기 실험결과는 본 발명에 따른 세포주가 암세포를 사멸시켜 암을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 나타내었다.
1-6: 위암 환자에 대한 투여
2007년 10월 5일자 위암으로 진단받은 환자 (이**씨, 1967년생, 남)에 대하여 1일 3g씩 경구투여하였으며, 투여기간 중 다른 항암치료는 병행하지 않았다. 인체 내에서 암세포를 사멸시키는 효과를 확인하기 위하여 투여 전 및 투여 4개월 후 각각 울산병원에서 gastro-fiberscope로 확인하여 투여 전 및 투여 후의 종양의 크기를 대비관찰하였다.
그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 투여개시 시(도 7 (a)) 종양의 크기는 7㎝이었으나, 투여 4개월 후(도 7 (b)) 측정한 결과 2㎝로 측정되어 종양의 크기가 크게 감소한 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 세포주가 암세포주를 사멸시켜 암을 예방 및 치료하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
실험예
4: 인삼류의 형성층 유래 세포주의 암 예방 및 치료 효과의 확인 (2)
본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 세포주의 암 예방 및 치료 효과를 확인하기 위하여, 추가적으로 폐암 환자에 대하여 상기 실시예 2의 (1)에서 제조된 동결건조 세포주 분쇄물을 파우더 형태로 투여하였다. 복용은 하루에 세 번 (아침, 점심 및 저녁) 1g씩 물에 용해한 형태로 경구투여하였다. 투여로 인한 부작용은 없 는 것으로 나타났다.
2008년 7월 1일 투여를 시작한 다음, 1년여 후인 2009년 7월 15일 산삼 형성층 유래 세포주의 투여에 따른 효과를 확인하기 위하여 계명대학교 동산의료원에서 흉부 CT를 촬영하였으며, 그 결과 투여 전 26×20mm의 크기이었던 LLL lateral basal segment에 관찰되던 침상형의 종괴(spiculated mass) 크기가 14×14mm의 크기로 크게 감소한 것으로 관찰되었다. 또한, 양쪽 폐에서 다수의 전이성 결절(multiple metastatic nodules)의 크기가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이에 본 발명에 따른 인삼류의 형성층 유래 동질적인 세포주는 암종괴의 크기를 감소시켜 암을 치료하고 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
제조예 1: 약학제제 제조예
제제예 1. 정제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 100㎎을 옥수수 전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합하여 통상의 정제제조방법에 따라 제조하였다.
제제예 2. 캡슐제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 500㎎을 연질 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 3. 시럽제의 제조
실시예 1에서 제조된 세포주 1g, 이성화당 10g, 만니톨 5g, 적량의 정제수의 함량으로 통상적인 액제제의 제조방법에 따라 100㎖의 시럽제를 제조하였다.
제제예 4. 주사제의 제조
실시예 2에서 제조된 세포주 추출물 200㎎을 폴리옥시에틸렌 수소화 카스트로 오일을 함유하는 생리 식염수 200㎎에 가열 용해시켜 혼합 추출물을 0.1%의 농도로 함유하는 주사제를 제조하였다.
제조예 2: 기능성 식품의 제조 - 기능성 음료의 제조
제조예 1.
실시예 1에서 제조한 세포주 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
제조예 2.
실시예 2에서 제조한 세포주 추출물 200㎎을 96㎖의 물에 용해시킨 후 보조제로서 비타민 C 500㎎, 교미제로서 구연산, 올리고당을 각각 1g 가하고, 보존재로서 나트륨벤조에이트 0.05g을 가한 후 정제수를 가하여 전량을 100㎖로 만들어 기능성 음료를 제조하였다.
이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 세포주의 유도과정(a)과, 산삼의 형성층 유래 세포주((b)A) 및 인삼의 자엽 유래 캘러스세포주(생물자원센터, KCTC PC10224)를 나타내는 사진이다.
도 2는 산삼 형성층 유래 세포주(U2)와 산삼배양근 추출물의 8종의 암세포주에 대한 세포증식억제활성을 EC50 값으로 나타낸 것이다(HCC: Hepatocellular carcinoma; -: Not evaluated).
도 3은 림프암 환자에 있어서 산삼 형성층 유래 세포주의 투여 전(A 및 C)과 투여 후(B 및 D)의 PET-CT 촬영 사진이다.
도 4는 급성골수성백혈병 환자에 있어서, 산삼 형성층 유래 세포주의 투여기간에 따른 백혈구 및 혈소판 수치를 나타내는 그래프이다.
도 5는 폐암 환자에 있어서 산삼 형성층 유래 세포주의 투여 전(A)과 투여 후(B)의 PET-CT 촬영 사진이다.
도 6은 직장암 환자에 있어서 산삼 형성층 유래 세포주의 투여 전(A)과 투여 후(B)의 PET-CT 촬영 사진이다.
도 7은 위암 환자에 있어서 산삼 형성층 유래 세포주의 투여 전((a))과 투여 후((b))의 gastro-fiberscope으로 촬영한 사진이다.
Claims (10)
- 인삼류(Panax ginseng)의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및(b) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
- 제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스 (shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
- 제1항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물:(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
- 제3항에 있어서, 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 추출물은 증류수, 알코올, 아세톤, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군에서 선택된 용매를 이용하여 추출된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 췌장암, 간암, 대장암, 유방암, 자궁경부암, 피부암, 전립선암, 림프암, 백혈병, 폐암, 직장암 및 위암 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 치료용 조성물.
- 인삼류의 형성층에서 유도되고, 다음의 특성을 가지는 세포주, 그 파쇄물, 그 추출물 및 그 배양액 중 어느 하나 이상을 함유하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:(a) 선천적 미분화 상태 (innately undifferentiated)임; 및(b) 다수개의 액포(vacuole)를 가지는 형태학적 특징을 나타냄.
- 제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 특성을 추가로 가지는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:(a) 현탁배양 시 단세포 상태로 존재함;(b) 인삼류의 형성층 이외의 조직 유래 세포주에 비하여 생물반응기에서 전단 스트레스 (shear stress)에 대해 낮은 민감성을 가짐; 및(c) 인삼류의 형성층 이외 조직 유래 세포주에 비하여 생장속도가 빠르고, 안정하게 배양됨.
- 제7항에 있어서, 상기 세포주는 다음의 단계를 포함하는 분리방법에 의하여 수득된 것임을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품:(a) 인삼류의 형성층 함유 저장근 조직을 수득하는 단계;(b) 상기 수득된 형성층 함유 저장근 조직을 IAA(Indole-3-acetic acid) 또는 IBA(Indole-3-butyric acid)를 포함하는 배지에서 배양하여 형성층 유래 세포주를 유도하는 단계,이때, 상기 배양의 수행 중 또는 배양 전단계 또는 후단계에서 상기 형성층 함유 저장근 조직에 삼투 스트레스를 가하는 것을 특징으로 함; 및(c) 상기 유도된 형성층 유래 세포주를 회수하는 단계.
- 제9항에 있어서, 상기 (c) 단계는 유도된 형성층 유래 세포주를 2,4-D(2,4-dichlorophenoxyacetic acid), 피클로람(picloram) 및 IBA 중 어느 하나 이상을 포함하는 배지에서 증식시킨 다음, 형성층 유래 세포주를 회수하는 것을 특징으로 하는 암의 예방 또는 개선용 기능성 식품.
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