CN109022343B - 一种人参干细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人参干细胞的制备方法，包括取样、制备干细胞原生质体、离体培养、看护培养、单细胞克隆培养及继代培养步骤，本发明可以有效地分离和培养人参的干细胞，也可以为其它块茎及根茎类植物干细胞的分离提供一个新的可行途径。本发明培养的人参干细胞具有无限分裂的能力，生长速度快，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供了基础，可以显著减少生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞的技术领域，尤其涉及一种人参干细胞的制备方法，同时也可以用于其它块根类植物干细胞的分离方法。
背景技术
人参是我国珍贵的中药材，有长期的使用历史并为大众认可。从药用植物人参中提取的药用成份对于多种疾病的治疗和营养保健有着重要的应用价值和前景。由于人参生长周期长，占用耕地；且生产过程中易受环境污染、病虫害的影响，所以传统的人参种植已经不能满足市场的需求。
通过离体悬浮培养人参的细胞来生产相关的药用成份，这种方法不受人参生长季节的限制就可以通过规模化生产来获得大量的人参细胞。通常取人参的根茎或叶片为外殖体在特定培养基上培养，经过脱分化阶段诱导成具有分裂能力的愈伤细胞，进一步将该细胞悬浮培养来生产人参的药用成份。
目前已有的技术在分离人参细胞时，均采用已经分化的组织器官为外殖体，通过离体培养阶段的培养（脱分化过程）将其诱导为具有分化能力的愈伤细胞。但这种细胞的本质是来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，抗逆能力不强。在工业化量产过程中，经常会出现细胞系退化，分裂能力弱，很难进行超大体积的培养。
通过分离与培养人参的干细胞来生产相关的药用成份，因为人参干细胞是未分化的细胞，具有无限的分裂能力，所以悬浮培养中如果采用干细胞将可以避免脱分化体细胞的缺点，容易进行超大体积的培养，降低成本，提高效益。因为干细胞与体细胞的生理状态不同而对生长素的响应也不同，已经报道的人参干细胞分离方法是通过将人参块根切片，然后直接将人参切片放置在含有生长素的培养基上诱导形成层干细胞的增殖，并同时希望干细胞周围的体细胞不会被诱导增殖，从而获得纯的干细胞系。
因为人参块根切片对外源生长素的响应会因为品种、年龄、季节、生理状态等因素而改变，在实际操作中，用较低浓度的生长素处理人参块根切片能够诱导形成层干细胞增殖的比率非常低，通常需要处理数千个切片才会有个别切片的形成层干细胞被诱导增殖，这导致要做大量的工作。如果用较高浓度的生长素又会诱导形成层干细胞与周围的体细胞同时增殖，从而导致无法分离出干细胞。甚至有些品种的人参对任何浓度的生长素均无反应。以已有的人参干细胞分离技术虽然步骤简单，但实际操作中很难掌握生长素的用量，导致成功率低。
有鉴于此，本发明人研究和设计了一种新的人参干细胞的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人参干细胞的制备方法，以解决现有技术人参干细胞分离技术很难掌握生长素的用量，导致操作难度大、成功率低的不足。
为了实现上述目的，本发明解决其技术问题所采取的技术方案是：
一种人参干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取样：取新鲜的人参根茎，在超净工作台上用体积分数为70%的乙醇溶液，灭菌30秒，然后用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，消毒10分钟，再用无菌水清洗3遍；在培养皿上将人参根茎切成切片；在根茎切片上人参形成层呈现一圈深黄色，在体式显微镜下在该深黄色圈周围小心切割，将该深黄色圈切下来，截成切段；
优选地，所述人参根茎切成厚度为3毫米的切片。
优选地，所述切段大小为长4 mm，宽2mm 。
步骤二、制备干细胞原生质体：将上述切段浸泡在含有以下质量分数：纤维素酶0.2%-1.6%、果胶酶0.2%-1.5%与甘露醇8%-16%的酶解液中，在室温下孵育20小时,制得含有干细胞原生质体的细胞群；
优选地，所述酶解液包括以下质量分数的组分：0.8%纤维素酶、0.8%果胶酶、12%甘露醇与86.4%的蒸馏水。
优选地，取部分酶解后的液体用中性红染色并于显微镜下镜检，判断是否成功分离出干细胞原生质体，其特点是干细胞原生质体内部有大量的被染色的液泡，而从体细胞分离的原生质体通常只有一个巨大的液泡；镜检证明干细胞原生质体分离成功，即可进行下一步；
步骤三、离体培养：将含有干细胞原生质体的细胞群进行离体培养，培养基为含有1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸与0.5 mg/L的6-氨基腺嘌呤的液体MS培养基，经过2天培养后，得到细胞壁再生的含有干细胞的细胞群；
步骤四、看护培养：将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群转移到看护培养基上进行培养；看护培养基是由添加0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基，在该培养基上铺一层由人参块根诱导而来的愈伤细胞，在这层愈伤细胞上铺一层滤纸，然后将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群铺在该层滤纸上；在温度22℃，黑暗的条件下，培养1个月，可以观察到滤纸上有若干个单细胞克隆长出；
步骤五、单细胞克隆培养：将单细胞克隆挑出并转移到含有0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基上进一步培养，待生长到较大的细胞团块时，取部分细胞用中性红染色后镜检，干细胞内有大量的被染色的小体积的液泡；
步骤六、继代培养：将得到的干细胞进一步在含有0.5 mg/L 萘乙酸、4.0 mg/L 吲哚丁酸、50.0 mg/L草酸钾的MS培养基上进一步培养， 培养条件为22℃、黑暗下生长，这样就可以在短时间内获得大量的人参干细胞。
由于本发明采用了上述的技术方案，使得本发明具有以下有益效果：本发明可以有效地分离和培养人参的干细胞，也可以为其它块茎及根茎类植物干细胞的分离提供一个新的可行途径。干细胞具有无限分裂的能力，生长速度快，抗逆能力强，为超大体积的液体悬浮培养提供基础，可以显著减少生产成本。
附图说明
图1为本发明的人参根茎切片图；其中，箭头所指处是颜色较深的环状的形成层，干细胞位于此处。
图2为本发明的酶解后的原生质体图；其中，箭头所指处是中性红染色的具有多个小液泡的干细胞原生质体，而相邻的两个细胞是具有大液泡的体细胞。
图3为本发明分离的原生质体再生细胞壁之后的看护培养，滤纸上可见大小不同的由单细胞增殖而成的细胞群落。
图4为本发明看护培养后得到的干细胞克隆的鉴定结果；其中，具有多个小液泡的细胞为用中性红染色鉴定的干细胞克隆。
具体实施方式
实施例1
本发明揭示了一种人参干细胞的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、取样：取新鲜的人参根茎，在超净工作台上用体积分数为70%的乙醇溶液，灭菌30秒，然后用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，消毒10分钟，再用无菌水清洗3遍；将人参根茎切成厚度为3毫米的切片；在根茎切片上人参形成层呈现一圈深黄色，如图1所示，在体式显微镜下用解剖刀沿着该深黄色圈周围小心切割，将该深黄色圈切下来，截成长4 mm，宽2mm 的切段；
步骤二、制备干细胞原生质体：将上述切段浸泡在含有以下质量分数：0.8%纤维素酶、0.8%果胶酶、12%甘露醇与86.4%的蒸馏水的酶解液中，在室温下孵育20小时,制得含有干细胞原生质体的细胞群；
优选地，取部分酶解后的液体用中性红染色并于显微镜下镜检，判断是否成功分离出干细胞原生质体，其特点是干细胞原生质体内部有大量被染色的小体积液泡，而从体细胞分离的原生质体通常只有一个巨大的液泡；如图2所示，镜检证明干细胞原生质体分离成功，即可进行下一步；
步骤三、离体培养：将含有干细胞原生质体的细胞群进行离体培养，培养基为含有1.0 mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸与0.5 mg/L的6-氨基腺嘌呤的液体MS培养基，经过2天培养后，得到细胞壁再生的含有干细胞的细胞群；
步骤四、看护培养：将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群转移到看护培养基上进行培养，如图3所示；看护培养基是由添加0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基，在该培养基上铺一层由人参块根诱导而来的愈伤细胞，在这层愈伤细胞上铺一层滤纸，然后将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群铺在该层滤纸上（如图3所示）；在温度22℃，黑暗的条件下，培养1个月，可以观察到滤纸上有若干个单细胞克隆长出；
步骤五、单细胞克隆培养：将单细胞克隆挑出并转移到含有0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基上进一步培养，待生长到较大的细胞团块时，取部分细胞用中性红染色后镜检，干细胞内有很多密集而体积小的液泡，如图4所示；
步骤六、继代培养：将得到的干细胞进一步继代在含有0.5 mg/L 萘乙酸、4.0 mg/L 吲哚丁酸、50.0 mg/L草酸钾的MS培养基上培养，培养条件为22℃、黑暗下生长，可以在短时间内获得大量的人参干细胞。
实施例2
考查了不同酶浓度对原生质体分离的影响，结果如表1所示，其中当纤维素酶0.8%、果胶酶0.8%与甘露醇12%时，原生质体的产量达到了9.8×103/g 鲜重，存活率达到了95.3%，明显优于其它组。
表1：酶浓度对原生质体分离的影响
| 纤维素酶 | 果胶酶 | 甘露醇 | 产量（×10<sup>3</sup>/g.鲜重） | 存活率（%） |
| 0.2 % | 0.5 % | 8 % | 4.5 | 78.6 |
| 0.2 % | 1.2% | 8 % | 5.5 | 84.3 |
| 0.8 % | 0.2 % | 12 % | 6.2 | 85.6 |
| 0.8 % | 0.8 % | 12 % | 9.8 | 95.3 |
| 1.2 % | 0.2 % | 16% | 5.8 | 87.4 |
| 1.6 % | 1.2 % | 15 % | 6.3 | 88.6 |
总之，本发明不仅将人参块根切片,而且进一步将形成层处的细胞显微切割成很薄的薄片，然后利用酶解的方法将形成层处的干细胞与周围体细胞的原生质体均解离出来，然后再生细胞壁和通过看护培养得到单细胞克隆，再从这些单细胞克隆中鉴定出干细胞系。 本方法虽然步骤较多，但容易施行，同时成功的机率也非常大。
当然，本发明以人参为培养干细胞的对象，其它块根或根茎类植物同样可以参照本发明的技术方案进行相应干细胞的制备。以上所述，仅为本发明较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
Claims (5)
1.一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、取样：取新鲜的人参根茎，在超净工作台上用体积分数为70%的乙醇溶液，灭菌30秒，然后用质量分数为0.1%的氯化汞溶液，消毒10分钟，再用无菌水清洗3遍；在培养皿上将人参根茎切成切片；在根茎切片上人参形成层呈现一圈深黄色，在体式显微镜下用解剖刀沿着该深黄色圈周围小心切割，将该深黄色圈切下来，截成切段；
步骤二、制备干细胞原生质体：将上述切段浸泡在含有以下质量分数：纤维素酶0.2%-1.6%、果胶酶0.2%-1.5%与甘露醇8%-16%的酶解液中，在室温下孵育20小时,制得含有干细胞原生质体的细胞群；
步骤三、离体培养：将含有干细胞原生质体的细胞群进行离体培养，培养基为含有1.0mg/L的2,4-二氯苯氧乙酸与0.5 mg/L的6-氨基腺嘌呤的液体MS培养基，经过2天培养后，得到细胞壁再生的含有干细胞的细胞群；
步骤四、看护培养：将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群转移到看护培养基上进行培养；看护培养基是由添加0.5 mg/L 萘乙酸与4.0 mg/L 吲哚丁酸的MS培养基，在该培养基上铺一层由人参块根诱导而来的愈伤细胞，在这层愈伤细胞上铺一层滤纸，然后将细胞壁再生的含有干细胞的细胞群铺在该层滤纸上；在温度22℃，黑暗的条件下，培养1个月，可以观察到滤纸上有若干个单细胞克隆长出；
步骤五、单细胞克隆培养：将单细胞克隆挑出并转移到含有0.5 mg/L 萘乙酸与4.0mg/L 吲哚丁酸的MS培养基上进一步培养，待生长到细胞团块时，取部分细胞用中性红染色后镜检，干细胞内有相当数量的被染色的液泡；
步骤六、继代培养：将得到的干细胞进一步在含有0.5 mg/L 萘乙酸、4.0 mg/L 吲哚丁酸、50.0 mg/L草酸钾的MS培养基上进一步培养，培养条件为22℃、黑暗下生长，可以在短时间内获得大量的人参干细胞。
2.如权利要求1所述的一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤一中，所述人参根茎切成厚度为3毫米的切片。
3. 如权利要求1所述的一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：所述切段大小为长4mm，宽2mm 。
4.如权利要求1所述的一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，所述酶解液包括以下质量分数的组分：0.8%纤维素酶、0.8%果胶酶、12%甘露醇与86.4%的蒸馏水。
5.如权利要求1所述的一种人参干细胞的制备方法，其特征在于：所述步骤二中，还包括镜检：取部分酶解后的液体用中性红染色并于显微镜下镜检，判断是否成功分离出干细胞原生质体，其特点是干细胞原生质体内部有大量的被染色的液泡，而从体细胞分离的原生质体通常只有一个巨大的液泡；镜检证明干细胞原生质体分离成功，即可进行下一步。
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