CN112586349A - 一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法。本发明提供的一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，利用未成熟的白木通种子为外植体进行诱导体细胞胚，主要有以下优点：1）未成熟种子的合子胚具有较高的细胞全能性，比较容易诱导体细胞胚胎发生过程，其次未成熟种子在果肉中处于一种相对无菌环境，组培染菌率低；2）诱导体细胞胚胎发生起始过程以及继代增殖均不需要添加任何外源植物激素，在MS培养基中便可进行起始诱导和继代增殖；3）通过体细胞胚胎发生途径，体细胞胚增殖效率高，在短时间内可获得大量白木通无菌苗；4）诱导出的体细胞胚能发育成完整的植株，体细胞胚为单细胞起源，具有嵌合率低、变异率低等优势。

Description

一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法
技术领域
本发明属于白木通组织培养领域，具体涉及一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法。
背景技术
白木通（Akebia trifoliata ssp. australis）为木通科（Lardizabalaceae）木通属（Akebia）的多年生木质藤本植物。我国是白木通的分布中心，其分布范围十分广泛，北至陕西、山西、河南，南至云南、广东、广西。其果实通常在农历八月成熟，成熟时果皮沿腹线裂开，因此也被成为“八月瓜”、“八月炸”，又因其形似野生香蕉，也被称为“野香蕉”等。白木通果实不仅美味多汁、香甜可口，还含有丰富的可溶性糖、淀粉、粗蛋白、粗纤维、Vc、矿物质以及17种氨基酸等营养元素（李丽等，2010）。白木通作为传统中药材在我国已有两千多年的应用历史，其根、茎、叶、果均可入药，具有消炎利尿、除湿镇痛、通经下乳等功效。目前白木通已经作为一种药食两用的新型水果进行了综合开发利用，市场对于白木通优良种苗的规模化生产提出了巨大需求，而目前白木通种苗多来自野生资源，种苗品质参差不齐，难以满足市场需求。
在白木通优良种苗生产中可以利用扦插法，但存在成活率低，生根困难，生产受季节影响大等问题，因此通过组织培养是进行种苗规模化生产以及获得脱毒苗的重要途径。申请号为“CN201510334457.0”的专利申请公开了一种白木通快速繁殖的方法，将白木通带芽茎段进行消毒处理后，转入培养基中诱导腋芽，将诱导出的腋芽切下并转移到增殖培养基中，获得的健壮增殖腋芽接种到生根培养基中进行诱导生根，将获得的幼苗进行炼苗并移栽。该方法主要包括外植体的消毒、初代培养、增殖培养、生根培养及炼苗移栽等环节，该体系利用白木通带芽茎段为外植体存在脱毒率低，存在易褐化，增殖效率低等问题。
体细胞胚胎发生（somatic embryogenesis，SE）是植物体细胞再生双极结构并发育成体细胞胚的过程，是一种植物重要的再生途径。在植物组织培养中，通过愈伤组织诱导幼苗通常需要三到四步来诱导产生芽和根，而体细胞胚胎发生的体外诱导可以通过体细胞直接诱导成幼苗，因此体细胞胚胎发生途径是一种简单便捷，快速高效的途径。然而通过体细胞胚胎发生途径诱导幼苗因物种不同而有较大差异，许多植物通过该途径诱导不出幼苗或者效果较差，目前关于白木通通过体细胞胚胎发生途径诱导幼苗还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有白木通组培技术的染菌率高，增殖效率低等问题，提供一种简单高效的获得白木通无菌苗的方法。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，
一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其步骤包括，
（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果实，经处理，从果肉中取出未成熟的种子；
（2）将未成熟种子沿背腹线纵切成半，将种子切面朝上放置于MS固体培养基中进行诱导体细胞胚胎发生，获得诱导体细胞胚；
（3）将诱导出的体细胞胚转移至MS固体培养基中进行继代增殖培养，获得增殖体细胞胚；
（4）将增殖体细胞胚转移至成苗培养基中诱导成苗；
（5）将获得的幼苗进行炼苗，炼苗后进行移栽，进而获得白木通再生苗。
为了获得更好的技术效果，步骤（1）中，所述处理包括果实处理和种子处理；
为了获得更好的技术效果，所述果实处理包括采集表面无病斑未成熟的白木通果实，用毛刷将果实表面污渍刷净并将其放入洗洁精溶液中浸泡 20min，然后用蒸馏水冲洗3-5 次，再用滤纸将果实表面水分吸干，之后将表面清洗后的果实放入超净工作台，取出果实中未成熟的种子；
为了获得更好的技术效果，所述种子处理包括将取出的种子用无菌水冲洗3-5次，随后用75%的酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗2-3次，接着用0.1%（w/v）HgCl2溶液浸泡7min，再用无菌水冲洗3次，最后将种子用无菌滤纸将表面水分吸干后备用；
为了获得更好的技术效果，步骤（2）中，所述诱导具体为在MS培养基中添加7.0g/L的琼脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0，以每个培养基放置6粒种子为一组，诱导时间40天，诱导温度25±2℃，光照时间12h，光照强度为1500lx，诱导体细胞胚胎发生，获得诱导体细胞胚，每组重复10次；
为了获得更好的技术效果，步骤（3）中，所述继代增殖培养包括将起始产生的处于子叶期的体细胞胚从合子胚上分离出来，放置于MS培养基中进行继代培养至少三轮，每轮产生的体细胞胚用于下一轮的体细胞胚继代培养，MS培养基中添加7.0g/L的琼脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0；
为了获得更好的技术效果，步骤（4）中，所述成苗培养基为1/2 MS+0.5mg/L 6-BA+7.0g/L 琼脂+30.0 g/L蔗糖，pH值为5.8-6.0；
为了获得更好的技术效果，步骤（5）中，所述炼苗为将子叶和根系发育良好的幼苗转移至穴盘中，在温室大棚放置2个月进行炼苗，温度在30±3度，湿度在75±5；
为了获得更好的技术效果，所述穴盘的组成为重量比河沙：有机肥=3:1的混合物。
本发明提供的一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，利用未成熟的白木通种子为外植体进行诱导体细胞胚，主要有以下优点：
1）未成熟种子的合子胚具有较高的细胞全能性，比较容易诱导体细胞胚胎发生过程，其次未成熟种子在果肉中处于一种相对无菌环境，组培染菌率低；
2）诱导体细胞胚胎发生起始过程以及继代增殖均不需要添加任何外源植物激素，在MS培养基中便可进行起始诱导和继代增殖，简单便捷；
3）通过体细胞胚胎发生途径，体细胞胚增殖效率高，在短时间内可获得大量白木通无菌苗；
4）诱导出的体细胞胚能发育成完整的植株，不需要经过愈伤阶段、诱导生根阶段；体细胞胚为单细胞起源，具有嵌合率低、变异率低等优势。
附图说明
图1为本发明白木通未成熟的种子照片；
图2为本发明未成熟种子接种一周的照片；
图3为本发明未成熟种子诱导出体细胞胚的照片；
图4为本发明体细胞胚继代培养初期的照片；
图5为本发明体细胞胚继代培养2周后的照片；
图6为本发明三轮继代培养后得到的无菌苗照片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1
一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其步骤包括，
步骤（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果实，经处理用解剖刀从果肉中取出未成熟的种子，所述处理包括果实处理和种子处理；
（1.1）果实处理：在7-8月份，采集表面无病斑未成熟的白木通果实，用毛刷将果实表面污渍刷净并将其放入洗洁精溶液中浸泡 20min，然后用蒸馏水冲洗 3-5 次，再用滤纸将果实表面水分吸干；之后将表面清洗后的果实放入超净工作台，用解剖刀和解剖针取出果实中未成熟的种子；
（1.2）种子处理：将取出的种子用无菌水冲洗3-5次，随后用75%的酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗2-3次，接着用0.1%（w/v）HgCl2溶液浸泡7min，再用无菌水冲洗3次，最后将种子用无菌滤纸将表面水分吸干后备用。
步骤（2）将未成熟种子沿背腹线纵切成半，将种子切面朝上放置于MS固体培养基中进行诱导体细胞胚胎发生，具体地：
所述诱导具体为：将未成熟种子沿背腹线纵切成半，将种子切面朝上放置于 MS固体培养基中，MS培养基中添加7.0g/L的琼脂和30.0g/L 的蔗糖，pH值5.8-6.0，以每个培养基放置6粒种子为一组，诱导时间40天，诱导温度25±2℃，光照时间12h，光照强度为1500lx，诱导体细胞胚胎发生，获得诱导体细胞胚，每组重复10次；合子胚在MS固体培养基上，经过40天的诱导，在合子胚根部开始长出体细胞胚；
步骤（3）将诱导出的体细胞胚转移至MS 固体培养基中进行继代增殖培养，获得增殖体细胞胚，具体地：
所述继代增殖培养包括将起始产生的处于子叶期的体细胞胚从合子胚上分离出来，放置于MS培养基中进行至少三轮继代培养，每轮产生的体细胞胚用于下一轮的体细胞胚继代培养，MS 培养基中添加 7.0g/L 的琼脂和 30.0 g/L 的蔗糖，pH 值 5.8-6.0；
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
由表1可知，由合子胚起始诱导体细胞胚，其起始诱导率为22.5%，将获得的体细胞胚用于继代增殖培养，其诱导率最高可达到96.2%，随着轮回继代次数的增加，其诱导率有所降低，但依然保持较高的诱导率；
步骤（4）将增殖体细胞胚转移至成苗培养基中诱导成苗；所述成苗培养基为1/2MS+0.5mg/L 6-BA +7.0g/L琼脂+30.0g/L蔗糖，pH值为5.8-6.0；
步骤5、将获得的幼苗进行炼苗并移栽，进而获得白木通再生苗，具体地：
所述炼苗为将子叶和根系发育良好的幼苗转移至穴盘中（穴盘的配比为重量比河沙：有机肥=3:1），放入温室大棚进行炼苗，之后移栽，进而获得白木通再生苗。
对比例
中国发明专利申请“CN201510334457.0”的专利申请公开了一种白木通快速繁殖的方法，将白木通带芽茎段进行消毒处理后，转入培养基中诱导腋芽，将诱导出的腋芽切下并转移到增殖培养基中，获得的健壮增殖腋芽接种到生根培养基中进行诱导生根，将获得的幼苗进行炼苗并移栽。该方法主要包括外植体的消毒、初代培养、增殖培养、生根培养及炼苗移栽等环节，该体系利用白木通带芽茎段为外植体存在脱毒率低，存在易褐化，增殖效率低等问题。
将本申请实施例与对比例进行比较，具体参数见表2，
Figure DEST_PATH_IMAGE004
；
由表2可知，本发明与对比例所采用的的诱导途径不同，本发明采用的诱导途径为体细胞胚胎发生途径，对比例采用的诱导途径为器官发生途径；本发明采用的外植体为白木通未成熟种子，对比例采用的外植体为带芽茎段；本发明的污染率和褐化率分别为1.7%和2.5%，对比例最优条件的污染率和褐化率分别为2.3%和55.0%；本发明的起始诱导率为22.5%，将诱导出的体细胞胚继续诱导体细胞胚胎发生，诱导率则高达96.2%，对比例最优条件的诱导率为81.3%；本发明诱导出的体细胞胚可以继续进行诱导体细胞胚，每轮的增殖系数大约为42.5，增殖数量为每轮诱导出的体细胞胚数量*增值系数，远大于对比例的4.3；本发明体细胞胚的生根率为89.0%，对比例的生根率为82.2%。
实验结果：图1为从果肉中剥离出的未成熟白木通种子；图2为未成熟种子接种于MS培养基1周后合子胚的照片；图3为合子胚在培养6周后诱导出体细胞胚；图4为在图3中剥离出的体细胞胚继代培养1周的照片；图5为图4中的体细胞胚继续继代培养2周后的照片；图6为经过三轮继代培养后得到的无菌苗，可以明显看出每个体细胞胚具有完整的子叶和根部。
本发明利用白木通未成熟种子为外植体，可以在不加任何外源植物激素的MS培养基中进行诱导体细胞胚胎发生过程，同时可以在MS培养基中进行多次继代增殖培养，诱导出的体细胞胚经过成苗培养基培养可以发育成完整植株。采用本发明可以大量获得白木通无菌苗，而且简单便捷，快速高效。此外，本发明利用未成熟种子为外植体具有染菌率低、材料易得等特点。本发明不仅为白木通的工厂化育苗提供了一条途径，而且还为今后白木通的基因编辑以及研究细胞全能性的分子机制提供了可能。

Claims (9)

1.一种通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其步骤包括，
（1）摘取7-8月份未成熟的白木通果实，经处理，从果肉中取出未成熟的种子；
（2）将未成熟种子沿背腹线纵切成半，将种子切面朝上放置于MS固体培养基中进行诱导体细胞胚胎发生，获得诱导体细胞胚；
（3）将诱导出的体细胞胚转移至MS固体培养基中进行继代增殖培养，获得增殖体细胞胚；
（4）将增殖体细胞胚转移至成苗培养基中诱导成苗；
（5）将获得的幼苗进行炼苗，炼苗后进行移栽，进而获得白木通再生苗。
2.如权利要求1所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述处理包括果实处理和种子处理。
3.如权利要求2所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，所述果实处理包括采集表面无病斑未成熟的白木通果实，用毛刷将果实表面污渍刷净并将其放入洗洁精溶液中浸泡 20min，然后用蒸馏水冲洗 3-5 次，再用滤纸将果实表面水分吸干，之后将表面清洗后的果实放入超净工作台，取出果实中未成熟的种子。
4.如权利要求2所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，所述种子处理包括将取出的种子用无菌水冲洗3-5次，随后用75%的酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗2-3次，接着用0.1 w/v %HgCl2溶液浸泡7min，再用无菌水冲洗3次，最后将种子用无菌滤纸将表面水分吸干后备用。
5.如权利要求1所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述诱导具体为在MS培养基中添加7.0g/L的琼脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0，以每个培养基放置6粒种子为一组，诱导时间40天，诱导温度25±2℃，光照时间12h，光照强度为1500lx，诱导体细胞胚胎发生，获得诱导体细胞胚，每组重复10次。
6.如权利要求1所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述继代增殖培养包括将起始产生的处于子叶期的体细胞胚从合子胚上分离出来，放置于MS培养基中进行继代培养至少三轮，每轮产生的体细胞胚用于下一轮的体细胞胚继代培养，MS培养基中添加7.0g/L的琼脂和30.0g/L的蔗糖，控制pH值5.8-6.0。
7.如权利要求1所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述成苗培养基为1/2 MS+0.5mg/L 6-BA +7.0g/L 琼脂+30.0 g/L蔗糖，pH值为5.8-6.0。
8.如权利要求1所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述炼苗为将子叶和根系发育良好的幼苗转移至穴盘中，在温室大棚放置2个月进行炼苗，温度在30±3度，湿度在75±5%。
9.如权利要求8所述通过体细胞胚胎发生途径快速繁殖白木通幼苗的方法，其特征在于，所述穴盘的组成为重量比河沙：有机肥=3:1的混合物。
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