CN107593447B - 一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法，所述方法对种子进行预处理后，解剖种子脱除种皮，获得完整饱满种胚；将获得的种胚诱导为无菌苗，再继代增殖诱导获得丛生苗，然后将丛生苗用无菌接种刀分切开获得单芽苗，单芽苗接种于生根培养基中培养得到生根种苗。本发明获得的毛叶山桐子种苗生长势旺盛、成苗率高，品质高，不易发生退化，且培育时间和循环周期较短，从种胚直播培养至获得生根苗仅需57‑73天，大大节约了效益成本；另外，本发明提供的方法简单易行，各诱导培养基、增殖培养基和生根培养基配方简单、可操作性和可重复性高。本发明成功解决了毛叶山桐子种苗繁育效率低的困难，实现了种苗工厂化生产，市场应用前景较好。
Description
技术领域
本发明属于毛叶山桐子种植技术领域，尤其涉及一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法。
背景技术
毛叶山桐子(学名：Idesia polycarpaMaxim.var.vestitaDiels)是大风子科山桐子属落叶乔木，是山桐子变种之一，具速生特性。与山桐子相比，毛叶山桐子果实产量大、含油率高、油质好、可食用，果实盛产期长达50年以上，盛产期单株干果产量达75Kg以上，干果含油率38％以上，它既可生产优质的食用油，也是提取亚油酸、亚麻酸、维生素以级制作生物柴油和高级润滑油、护肤皂、保健品的上佳原料。毛叶山桐子树高达10～15米，树干通直，木质细致，且其挂果期长，果实鲜红及橙红色，所以极具较大的经济价值、生态价值和观赏价值，开发利用前景广阔。
毛叶山桐子在我国分布广泛，主要分布于陕西、甘肃、河南三省的南部和中南区二省、华东六省、华南二省及西南区三省等省区。目前成功的育苗方法主要有在室外进行的常规大田种子育苗、扦插育苗和嫁接育苗，但在自然条件下种子育苗发芽率、繁殖率、成苗率均较低，且幼苗易染病害；扦插和嫁接一方面幼树依赖于种子育苗，另一方面种苗繁殖速度、成苗效果不高且生长缓慢，难以满足市场需求，另外需消耗大量的人工、土地成本，大大制约了毛叶山桐子的广泛推广和利用。因此快速工厂化批量育苗是开发利用毛叶山桐子的关健。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法，本发明能快速生产毛叶山桐子优质种苗，提高种苗的繁殖速度和成苗效率，实现种苗工厂化生产，且可保证种苗质量和整齐度，解决了毛叶山桐子种苗缺乏问题。
本发明的技术方案如下：一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法，所述方法对种子进行预处理后，解剖种子脱除种皮，获得完整饱满种胚；将获得的种胚诱导为无菌苗，再继代增殖诱导获得丛生苗，然后将丛生苗用无菌接种刀分切开获得单芽苗，单芽苗接种于生根培养基中培养得到优质且整齐一致的生根种苗。
进一步地，所述种子的预处理包括：
外植体洗涤与消毒选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，采用洁净纱布包裹好种子外植体，置入1％(w/w)洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面灰尘和蜡质附着物，然后采用自来水冲洗，转移到无菌滤纸上稍稍吸去表面水分，再置于70％(v/v)乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1％(w/w)氯化汞溶液浸泡10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇动1次；氯化汞溶液消毒结束用无菌水漂洗1-2次后取出，无菌滤纸稍稍吸干表面水分；
种子二次软化将消毒后的种子放入1.5～2.5％(v/v)过氧化氢溶液浸泡10-15分钟进行种子种皮第一次软化，后用无菌水漂洗1-2次，取出再放入2.0～3.0mol/L氢氧化钠溶液浸泡15-20分钟进行种子种皮第二次软化。
作为优选，第一软化和第二次软化均在4-8℃条件下进行，每隔5-8分钟轻轻摇动1次，软化完成后用无菌水漂洗4-6次后备用；本发明采用低温软化的目的在于：一可破休眠，二可保护种胚活性，提高萌发率。
所述种胚的获得过程如下：超净工作台中放置无菌体式显微镜，体式显微镜上置无菌解剖盘；将预处理后的种子置于无菌解剖盘上，调整适当的放大倍数，用锋利解剖刀在种子尾端中部轻轻划一下，后用尖头镊子小心往两边轻轻脱除种皮，并注意避免损伤胚根，甄选出乳白色、硬实、带光泽、无病虫症状的完整种胚。
毛叶山桐子无菌种子剥除种皮获得种胚，利于直观早期甄选健康成熟种子及其生活力评估，剥除种皮后呈现乳白色、硬实、完整、带光泽、无病虫症状的种胚生活力和成苗率高。
所述种胚诱导为无菌苗的过程如下：无菌条件下将获得的完整种胚直播于诱导培养基上暗培养7-10天启动培养，诱导幼胚萌发，然后转入光培养培养12-16天获得伸长的完整无菌苗。
所述种胚诱导为无菌苗的暗培养条件为培养温度23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％；光培养条件在暗培养条件基础上附加光照强度1500-2000lx，光照时间每天12-16小时；所述诱导培养基为WPM基本培养基中添加6-苄基腺嘌呤0.2-0.3毫克/升，萘乙酸0.05-0.1毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
所述无菌苗继代增殖诱导丛生苗的过程如下：无菌条件下将获得的无菌苗用锋利无菌接种刀切成1～1.5cm长、带节的茎段接种到增殖培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000lx，光照时间每天12-16小时的条件下继代增殖培养，培养20-25天可获得大量丛生苗，增殖倍数达4-6倍；
所述增殖培养基为WPM基本培养基中添加玉米素0.5-1.0毫克/升，萘乙酸0.2-0.5毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
所述单芽苗生根过程如下：无菌条件下将增殖诱导得到的丛生苗用无菌接种刀将单棵苗分切开获得单芽苗，注意单芽苗茎基部切平，接种于生根培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000lx，光照时间每天12-16小时的条件下进行生根培养，培养18-22天可获得完整有根苗，每株苗生根条数3-6根；
所述生根培养基为WPM基本培养基中添加吲哚乙酸0.2-0.3毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
本发明的特点如下：本发明采用毛叶山桐子种胚利用组织培养技术诱导直接成苗，避免了愈伤组织诱导和愈伤分化二个步骤，且有效避开了应用叶片、茎段等为外植体易发生的愈伤分化困难的组培难题，大大缩短了种苗培育时间和循环周期，从种胚直播培养至获得生根苗仅需57-73天，比叶片诱导的130-135天缩短62-73天，比茎段诱导缩短20-32天，大大节约了效益成本；本发明以毛叶山桐子种子为外植体，通过种胚的剥离和前期甄选，有效保证了所培养种源胚的优质，使幼胚萌发率达到100％，直接幼胚苗增殖倍数达4-6倍，生根率达100％，加快了毛叶山桐子优质种苗培育速度，并能在短时间内获得批量种苗产品。
种胚诱导成苗前，首先对种子进行洗涤去除种子表面灰尘、油脂和蜡质等，然后再进行消毒。由于毛叶山桐子种子的种皮致密且较厚，难以直接获得种胚，故需要采用过氧化氢和氢氧化钠进行二次软化后再解剖剥除种皮。软化时温度宜为4-8℃，利于种子破除休眠和保持种胚活力，提高种胚萌发效率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明获得的毛叶山桐子种苗生长势旺盛、成苗率高，种苗一致性和整齐度好，品质高，不易发生退化，且培育时间和循环周期较短，从种胚直播培养至获得生根苗仅需57-73天，大大节约了效益成本；另外，本发明提供的方法简单易行，各诱导培养基、增殖培养基和生根培养基配方简单、可操作性和可重复性高。成功解决了毛叶山桐子种苗繁育效率低的困难，实现了种苗工厂化生产，市场应用前景较好。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
实施例1
(1)外植体处理与消毒
选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，用洁净纱布包裹好种子，置入1％(w/w)洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面灰尘和蜡质等附着物，自来水漂洗3-4次后线状自来水流水冲洗20-25分钟，转移到无菌滤纸上稍稍吸表面水分，后置于70％(v/v)乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1％(w/w)氯化汞溶液浸泡10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇动1次。上述0.1％(w/w)氯化汞溶液处理完成用无菌水漂洗1-2次后取出，无菌滤纸稍稍吸干表面水分。
(2)种子二次软化
步骤(1)处理好种子放入20％(v/v)过氧化氢溶液浸泡10-15分钟进行第一次种子种皮软化，后用无菌水漂洗1-2次后取出放入3摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡15-20分钟进行第二次种子种皮软化。两次软化均在在4-8℃条件下进行，每隔5-8分钟轻轻摇动1次。软化完成后用无菌水漂洗4-6次后备用。
(3)种胚解剖与甄选
超净工作台中放置无菌体式显微镜，体式显微镜上置无菌解剖盘。步骤(2)软化好的种子置于无菌解剖盘上，调整好适当的放大倍数，用锋利解剖刀在种子尾端中部轻轻划一下，后用尖头镊子小心往两边轻轻脱除种皮，并注意避免损伤胚根，甄选出乳白色、硬实、带光泽、无病虫症状的完整种胚。
(4)诱导无菌苗
无菌条件下将步骤(3)获得完整种胚直播于诱导培养基上暗培养7-10天启动培养诱导幼胚萌发，萌发率为100％，后转入光培养培养12-16天获得伸长的完整无菌苗。所述暗培养条件为培养温度23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％；光培养条件为暗培养条件附加光照强度1500-1700lx，光照时间每天12-16小时。所述诱导培养基为WPM基本培养基添加6-苄基腺嘌呤0.25毫克/升，萘乙酸0.5毫克/升，蔗糖25克/升，琼脂6.0克/升，pH值调为5.6-5.8。
(5)完整无菌苗继代增殖诱导丛生苗
无菌条件下将步骤(4)获得的无菌苗用锋利无菌接种刀切成1～1.5cm长、带节的茎段接种到增殖培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-2500lx，光照时间每天12-16小时的条件下继代增殖培养，培养20-25天可获得大量丛生苗，增殖倍数达4-6倍。所述增殖培养基为WPM基本培养基添加玉米素0.5毫克/升，萘乙酸0.2毫克/升，蔗糖30克/升，琼脂6.0克/升，pH值调为5.8。
(6)单芽苗壮苗生根
无菌条件下将步骤(5)得到的增殖苗丛用锋利无菌接种刀以单棵苗分切开获得单芽苗，注意单芽苗茎基部切平，接种于生根培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-2500lx，光照时间每天12-13小时的条件下进行生根培养，培养18-20天可获得完整有根苗，每株苗生根条数3-6根，生根率达100％。所述生根培养基为WPM基本培养基添加吲哚乙酸0.3毫克/升，蔗糖30克/升，琼脂6.0克/升，pH值调为5.6。
实施例2
(1)外植体处理与消毒
选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，用洁净纱布包裹好种子，置入1％(w/w)洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面灰尘和蜡质等附着物，自来水漂洗3-4次后线状自来水流水冲洗20-25分钟，转移到无菌滤纸上稍稍吸表面水分，后置于70％(v/v)乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1％(w/w)氯化汞溶液浸泡10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇动1次。上述0.1％(w/w)氯化汞溶液处理完成用无菌水漂洗1-2次后取出，无菌滤纸稍稍吸干表面水分。
(2)种子二次软化
步骤(1)处理好种子放入20％(v/v)过氧化氢溶液浸泡10-15分钟进行第一次种子种皮软化，后用无菌水漂洗1-2次后取出放入3摩尔/升氢氧化钠溶液浸泡15-20分钟进行第二次种子种皮软化。两次软化均在在4-8℃条件下进行，每隔5-8分钟轻轻摇动1次。软化完成后用无菌水漂洗4-6次后备用。
(3)种胚解剖与甄选
超净工作台中放置无菌体式显微镜，体式显微镜上置无菌解剖盘。步骤(2)软化好的种子置于无菌解剖盘上，调整好适当的放大倍数，用锋利解剖刀在种子尾端中部轻轻划一下，后用尖头镊子小心往两边轻轻脱除种皮，并注意避免损伤胚根，甄选出乳白色、硬实、带光泽、无病虫症状的完整种胚。
(4)诱导无菌苗
无菌条件下将步骤(3)获得完整种胚直播于以WPM为基本培养基的诱导培养基上暗培养7-10天启动培养诱导幼胚萌发，萌发率为100％，后转入光培养培养12-16天获得伸长的完整无菌苗。所述暗培养条件为培养温度23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％；光培养条件为暗培养条件附加光照强度1800-2000lx，光照时间每天12-16小时。所述诱导培养基为WPM基本培养基添加6-苄基腺嘌呤0.2毫克/升，萘乙酸0.1毫克/升，蔗糖25克/升，琼脂6.5克/升，pH值调为5.8。
(5)完整无菌苗继代增殖诱导丛生苗
无菌条件下将步骤(4)获得的无菌苗用锋利无菌接种刀切成1～1.5cm长、带节的茎段接种到增殖培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2500-3000lx，光照时间每天12-16小时的条件下继代增殖培养，培养20-25天可获得大量丛生苗，增殖倍数达4-6倍。所述增殖培养基为WPM基本培养基添加玉米素1.0毫克/升，萘乙酸0.5毫克/升，蔗糖28克/升，琼脂6.0克/升，pH值调为5.8。
(6)单芽苗壮苗生根
无菌条件下将步骤(5)得到的增殖苗丛用锋利无菌接种刀以单棵苗分切开获得单芽苗，注意单芽苗茎基部切平，接种于生根培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2500-3000lx，光照时间每天15-16小时的条件下进行生根培养，培养20-22天可获得完整有根苗，每株苗生根条数3-6根，生根率达100％。所述生根培养基为WPM基本培养基添加吲哚乙酸0.20毫克/升，蔗糖25克/升，琼脂6.0克/升，pH值调为5.6-5.8。
对比例1以种子为外植体组培法
(1)外植体处理与消毒
选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，用洁净纱布包裹好种子，置入1％(w/w)洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面蜡质层、灰尘等附着物，自来水漂洗3-4次后线状自来水流水冲洗20-25分钟，转移到无菌滤纸上稍稍吸表面水分，后置于70％(v/v)乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1％(w/w)氯化汞溶液浸泡10-15分钟，接着用20％(v/v)过氧化氢溶液浸泡10-15分钟，在0.1％(w/w)氯化汞溶液、20％(v/v)过氧化氢溶液处理期间每隔2-3分钟摇动1次。上述20％(v/v)过氧化氢溶液处理完成用无菌水漂洗3-5次后取出，无菌滤纸稍稍吸干表面水分，获得无菌种子外植体。
(2)诱导无菌苗
无菌条件下将步骤(1)获得无菌种子接种于以MS为基本培养基的诱导培养基上，置于培养室中诱导培养，培养20-25天无菌种子萌发启动，种子萌发率为89％，培养30-40天获得伸长的完整无菌苗。所述培养条件为培养温度23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度1500-2000lx，光照时间每天12-16小时。所述诱导培养基为MS基本培养基添加6-苄基腺嘌呤0.3-0.5毫克/升，萘乙酸0.05-0.1毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
(3)无菌苗继代增殖诱导丛生苗
无菌条件下将步骤(2)获得的无菌苗用锋利无菌接种刀切成1～1.5cm长、带节的茎段接种到增殖培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000lx，光照时间每天12-16小时的条件下继代增殖培养，培养20-25天可获得大量丛生苗，增殖倍数达4-6倍。所述增殖培养基为MS基本培养基添加6-苄基腺嘌呤0.4-0.6毫克/升，6-糖基氨基嘌呤0.4-0.6毫克/升，萘乙酸0.2-0.5毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
(4)单芽苗壮苗生根
无菌条件下将步骤(3)得到的增殖苗丛用锋利无菌接种刀以单棵苗分切开获得单芽苗，注意单芽苗茎基部切平，接种于生根培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000lx，光照时间每天12-16小时的条件下进行生根培养，培养18-22天可获得完整有根苗，每株苗生根条数3-6根，生根率达92％。所述生根培养基为1/2MS基本培养基添加吲哚乙酸0.2-0.3毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
对比例2
选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，用洁净纱布包裹好种子，置入1％(w/w)洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面灰尘和蜡质等附着物，自来水漂洗3-4次后线状自来水流水冲洗20-25分钟，转移到无菌滤纸上稍稍吸表面水分，后置于70％(v/v)乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1％(w/w)氯化汞溶液浸泡10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇动1次。上述0.1％(w/w)氯化汞溶液处理完成用无菌水漂洗4-6次后无菌滤纸稍稍吸干表面水分备用。
超净工作台中放置无菌体式显微镜，体式显微镜上置无菌解剖盘。灭菌好的种子置于无菌解剖盘上，调整好适当的放大倍数剥除种皮，种皮硬且较滑导致剥除较困难，稍用力解剖种子易飞出解剖盘外，完整种胚解剖率低于20％，且有损伤，到此失败。
Claims (1)
1.一种毛叶山桐子种胚直接成苗的方法，其特征在于，所述方法对种子进行预处理后，解剖种子脱除种皮，获得完整饱满种胚；将获得的种胚诱导为无菌苗，再继代增殖诱导获得丛生苗，然后将丛生苗用无菌接种刀分切开获得单芽苗，单芽苗接种于生根培养基中培养得到优质且整齐一致的生根种苗；
所述种子的预处理包括：外植体洗涤与消毒选择健康饱满、无损伤的毛叶山桐子种子为外植体，采用洁净纱布包裹好种子外植体，置入1%w/w洗衣粉溶液中边浸泡边轻轻搓洗种子2-3分钟，以去除表面灰尘和蜡质附着物，然后采用自来水冲洗，转移到无菌滤纸上稍稍吸去表面水分，再置于70%v/v乙醇溶液处理25-30秒，再用0.1%w/w氯化汞溶液浸泡10-15分钟，期间每隔2-3分钟摇动1次；氯化汞溶液消毒结束用无菌水漂洗1-2次后取出，无菌滤纸稍稍吸干表面水分；
种子二次软化： 将消毒后的种子放入1.5~2.5%v/v过氧化氢溶液浸泡10-15分钟进行种子种皮第一次软化，后用无菌水漂洗1-2次，取出再放入2.0~3.0mol/L氢氧化钠溶液浸泡15-20分钟进行种子种皮第二次软化；第一软化和第二次软化均在4-8℃条件下进行，每隔5-8分钟轻轻摇动1次，软化完成后用无菌水漂洗4-6次后备用；
所述种胚的获得过程如下：超净工作台中放置无菌体式显微镜，体式显微镜上置无菌解剖盘；将预处理后的种子置于无菌解剖盘上，调整适当的放大倍数，用锋利解剖刀在种子尾端中部轻轻划一下，后用尖头镊子小心往两边轻轻脱除种皮，并注意避免损伤胚根，甄选出乳白色、硬实、带光泽、无病虫症状的完整种胚；
所述种胚诱导为无菌苗的过程如下：无菌条件下将获得的完整种胚直播于诱导培养基上暗培养7-10天启动培养，诱导幼胚萌发，然后转入光培养培养12-16天获得伸长的完整无菌苗；
所述种胚诱导为无菌苗的暗培养条件为培养温度23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％；光培养条件在暗培养条件基础上附加光照强度1500-2000 lx，光照时间每天12-16小时；所述诱导培养基为WPM基本培养基中添加6-苄基腺嘌呤0.2-0.3毫克/升，萘乙酸 0.05-0.1毫克/升，蔗糖 25-30克/升，琼脂 6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8；
所述无菌苗继代增殖诱导丛生苗的过程如下：无菌条件下将获得的无菌苗用锋利无菌接种刀切成1～1.5cm长、带节的茎段接种到增殖培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000 lx，光照时间每天12-16小时的条件下继代增殖培养，培养20-25天可获得大量丛生苗，增殖倍数达4-6倍；所述增殖培养基为WPM基本培养基中添加玉米素0.5-1.0毫克/升，萘乙酸0.2-0.5毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8；
所述单芽苗生根过程如下：无菌条件下将增殖诱导得到的丛生苗用无菌接种刀将单棵苗分切开获得单芽苗，注意单芽苗茎基部切平，接种于生根培养基中，在培养温度为23℃-25℃，空气相对湿度30％-60％，光照强度2000-3000 lx，光照时间每天12-16小时的条件下进行生根培养，培养18-22天可获得完整有根苗，每株苗生根条数3-6根；所述生根培养基为WPM基本培养基中添加吲哚乙酸0.2-0.3毫克/升，蔗糖25-30克/升，琼脂6.0-6.5克/升，pH值调为5.6-5.8。
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| CN106234222A (zh) * | 2016-08-05 | 2016-12-21 | 江苏农林职业技术学院 | 一种山桐子叶片组织培养方法 |
| CN106973796A (zh) * | 2017-06-01 | 2017-07-25 | 广东鼎峰生态农业开发有限公司 | 一种毛叶山桐子的组织培养育苗方法 |
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2017
- 2017-10-20 CN CN201710985813.4A patent/CN107593447B/zh active Active
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