CN105385649A - 一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法。以甜叶菊组培苗幼嫩叶片为材料，通过控制质壁分离时间、纤维素酶Onozuka？R-10、半纤维素酶Hemicellulase、离析酶Macerozyme？R-10的配比及浓度、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离甜叶菊叶片原生质体最适合的条件。本发明所述方法获得的游离原生质体数量较多，活性较高，是一种简便、快捷制备甜叶菊叶片原生质体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，属于生物技术领域。
背景技术
甜叶菊（SteviarebaudianaBertoni）作为一种理想的甜味剂和功能性保健产品，已为食品和医药领域研究和开发的热点。我校甜叶菊课题组已对甜叶菊品种选育、多倍体诱变、组培快繁、种子质量、高产栽培等进行了较为系统的研究，目前尚未见有关甜叶菊叶片原生质体制备方面的研究报道，而甜叶菊原生质体的分离与制备是甜叶菊原生质体融合、原生质体培养再生植株、基因的瞬时表达及蛋白的亚细胞定位等研究奠定基础。
发明内容
发明目的：提供一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法。
技术方案：本发明通过调节质壁分离时间、酶种类及配比、酶解液中甘露醇浓度、酶解液pH、酶解时间等因素，筛选出分离甜叶菊叶片原生质体最适宜的因素。其目的是这样实现的，一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，具体包括以下实施方式：
（1）样品挑选：取甜叶菊组培苗上的幼嫩叶片；
（2）将叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液（CPW+13%Mannitol）的培养皿中进行质壁分离处理；
（3）将经过质壁分离处理的叶条转移至盛有酶解液的培养皿中，于摇床上黑暗条件下进行酶解，一段时间当酶解液中已无完整叶片细条溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体。
根据上述方法，其特征在于，所述材料优选甜叶菊组培苗上的幼嫩叶片。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中酶解液的成分为CPW+Mannitol+0.1%MES+0.5%、纤维素酶OnzukaR-10+0.4%、半纤维素酶Hemicellulase+0.4%、离析酶MacerozymeR-10。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中酶解液中的甘露醇浓度为9%。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液pH优选6.2。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中摇床的转速优选50rpm。
根据上述方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解时间优选4h。
有益效果：本发明所述的一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，本方法简单实用，分离材料易于获得；酶解方法简单，获得的原生质体数量多且活性高。本项技术将为甜叶菊叶片原生质体的细胞研究、基因瞬时表达与蛋白亚细胞定位、原生质体培养和植株再生等奠定基础。
附图说明
图1甜叶菊组培苗叶片原生质体示意图；
图2同一视野在白光下FDA染色的梭梭同化枝组培甜叶菊苗叶片原生质体示意图；
图3同一视野在激发光蓝光下FDA染色的梭梭同化枝组培甜叶菊苗叶片原生质体示意图。
具体实施方式
为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明作进一步详述，这些实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。
实验材料：甜叶菊组培苗的幼嫩叶片。
实施例中，CPW溶液的配方为：
原生质体分离：
（1）取组培甜叶菊苗上的幼嫩叶片，备用；
（2）将上述叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于质壁分离液中质壁分离处理4h；
（3）将经过质壁分离处理的甜叶菊叶条转移至酶解液中、温度28℃、转速为50rpm、黑暗条件下酶解4h，酶解液成分为：细胞原生质体清洗液CPW+9%甘露醇+0.1%MES+0.5%纤维素酶OnozukaR-10+0.4%半纤维素酶Hemicellulase+0.4%离析酶MacerozymeR-10，pH为6.2；
（4）将步骤（3）中分离得到的叶片原生质体进行检测：取10μL原生质体溶液加入1μL0.1%的FDA染液混合均匀，用血球计数板制片后置于荧光显微镜下观察，在白光下观察原生质体的数量，然后切换至激发光下观察视野中发绿色荧光的原生质体数量，原生质体产量（原生质体产量=25个方格内原生质体总数/0.1×1000×10个/g·FW）为1.85×107个/g·FW，存活率为93.37%。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种快速制备甜叶菊叶片原生质体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）样品筛选：取甜叶菊组培苗的幼嫩叶片；
（2）将选取的幼嫩叶片用刀片切成0.5-1mm的细条，置于盛有质壁分离液（CPW+13%Mannitol）的培养皿中进行质壁分离处理；
（3）将经过质壁分离处理的叶条转移至盛有酶解液的培养皿中，置于摇床上（50rpm）黑暗条件下进行酶解，当溶液转为绿色后，将溶液制片于显微镜下观察，视野下会出现大量圆形的原生质体。
2.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，所述材料为组培甜叶菊幼苗的幼嫩叶片。
3.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液组合为CPW+Mannitol+0.1%MES+0.5%、纤维素酶OnzukaR-10+0.4%、半纤维素酶Hemicellulase+0.4%、离析酶MacerozymeR-10。
4.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中酶解液中的甘露醇浓度为9%。
5.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解液pH为6.2。
6.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中摇床的转速为50rpm。
7.根据权利要求书1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中的酶解时间为4h。
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