CN102577962A - 一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法 - Google Patents

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张振超
潘跃平
戴忠良
姚悦梅
秦文斌
肖燕
潘永飞
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Zhenjiang Ruifan Agricultural Gardening Co Ltd
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Zhenjiang Institute of Agricultural Sciences Jiangsu Hilly Area
Zhenjiang Ruifan Agricultural Gardening Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种提高农作物胚胎出生率的培养方法，尤其是一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，属于植物培养技术领域。本发明利用小孢子培养技术将结球甘蓝和油菜小孢子共同培养，使结球甘蓝的出胚率显著提高，解决了结球甘蓝小孢子培养胚胎发生频率低的问题。

Description

一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法
技术领域
本发明涉及一种提高农作物胚胎出生率的培养方法，尤其是一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，属于植物培养技术领域。
背景技术
结球甘蓝(B rassica oleracea L. var. Capitata)是十字花科、芸薹属的植物，为甘蓝（Brassica oleracea L.）的变种。又名卷心菜、洋白菜、包菜等。结球甘蓝具有耐寒、抗病、适应性强、易储耐运、产量高、品质好等特点，在我国各地普遍栽培，在蔬菜栽培和供应中占有重要地位。对蔬菜的周年供应起很大的作用。并且大量的出口到国外，在蔬菜出口贸易中也占有相当重要地位。目前，我国结球甘蓝主栽品种大部分被日本、韩国等国外的公司所垄断，具有自主知识产权的品种较少，究其原因是因为我国结球甘蓝育种资源很少、开发利用不够，未配制出良好的品种。传统的育种方法主要是对市场上表现好的结球甘蓝品种进行多代自交分离，来获得其亲本，然后用于育种实践当中，然而，传统的多代自交分离的方法一般需要5-6年的时间才能选育到一个纯合的亲本材料，但其表现是否优良、能否与其它材料组配，以及配制出来的杂交种表现能否得到认可还需要3-4年的时间。近年来，针对传统方法出现的游离小孢子培养方法可以在1-2年内快速获得双单倍体纯系，比传统的方法缩短了3-4年的时间，从而大大缩短育种进程，同时，隐性性状也易于表达，丰富了育种资源。因此，结球甘蓝小孢子培养技术在优良自交系的创制和提高新品种选育的效率等方面具有重要作用。
在芸薹属作物中，自从Lichter（1982）首次报道油菜游离小孢子培养成功获得再生植株以来，很多国内外学者对此小孢子培养技术进行了大量深入的研究应用，并取得了一些成果。关于结球甘蓝游离小孢子培养最早见于Lichter（1989）和Takahata（1990）的报道，随后国内外学者在这一培养技术上开展了一系列的研究和改进，在提高结球甘蓝小孢子胚胎发生频率方面的研究也做了大量深入的研究，取得了一些成果。随后，严准等（1999，）、唐青林等（2000）、刘艳玲等（2006）、袁素霞（2009）等人也有报道，但结球甘蓝小孢子胚胎发生的效率普遍不高，对难出胚的品种来说，培养效果很不理想。有关芸薹属游离小孢子培养的大量研究表明，供体植株的基因型对小孢子胚胎发生的影响极为重要，它不仅影响产胚率，而且也影响胚的质量（Chuong et al.,1988），限制了小孢子培养技术在结球甘蓝遗传育种和基础研究中的进一步应用。虽然人们在提高结球甘蓝游离小孢子出胚率的影响因素方面做了一些研究工作，但是结球甘蓝游离小孢子出胚率仍旧不高，且在一些基因型中很难获得胚状体（方淑桂等，2005a，2005b；刘艳玲等，2006；陆瑞菊等，2006），严重妨碍了游离小孢子培养技术的实际应用，因此，寻找一种简便有效的提高结球甘蓝难出胚基因型品种出胚率的方法具有重要的实践意义。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的缺陷，提出一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，采用难出胚的结球甘蓝与易出胚的油菜花蕾按一定数目配比共培养，从而促进结球甘蓝小孢子出胚，提高小孢子培养的出胚率。
一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，包括以下步骤：
步骤一，取结球甘蓝和油菜花序上的花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理； 
步骤二，在灭菌后的混合花蕾中加入B5洗涤培养基后研磨
成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入35～45ml的NLN-13诱导培养基、8～12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；
步骤三，将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下32～33 ℃热激处理1～3天后，移至黑暗、温度为 25±2 ℃的条件下培养20～30天，得到子叶型胚状体；
步骤四，将子叶期胚状体接种至胚状体固体分化培养基中，每天光照15±3小时、温度23±3℃下培养，直至分化，得到再生芽； 
步骤五，切取所述再生芽转接至生根培养基培养出苗后，按常规方法进行炼苗和移栽，得到再生植株；
步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。
其中，所述步骤一，取花序上单核晚期至双核早期的花蕾，结球甘蓝花蕾的花瓣和花药长度比为0.8～1.2，油菜花蕾的花瓣和花药长度比为0.5～0.75。所述的结球甘蓝和油菜共培养花蕾中结球甘蓝花蕾与油菜花蕾的用量一般不作特别的限定，为了达到更好的效果，优选油菜花蕾的数量大于结球甘蓝花蕾的数量。灭菌采用本领域常规的灭菌方法，可采用灭菌液将混合花蕾灭菌10～20分钟，无菌水冲洗干净后得到无菌的混合花蕾。所采用的灭菌液为0.1%（质量百分浓度）升汞溶液。以1L升汞溶液计，组成为：1g的升汞和1L无菌水。
所述的B5洗涤培养基为： B5液体培养基1L和蔗糖30 g组成，pH 6.0～6.2；高温高压灭菌，备用。所述的NLN-13诱导培养基由NLN液体培养基1L和蔗糖130 g组成，pH 6.0～6.2，微孔滤膜过滤灭菌，备用；所述的活性炭混合液由NLN液体培养基1L、琼脂糖2～5g和1g活性炭组成，高温高压灭菌，备用。进一步地，所述的B5液体培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 169.5mg, KNO3 2500mg，(NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 500mg，MnSO4·4H2O 10mg, H3BO3 3mg, ZnSO4·7H2O 2mg, KI 0.75mg, Na2MoO4·2H2O 0.25mg, CuSO4·5H2O 0.025mg, CoCl2·6H2O 0.025mg, Na2-EDTA 37.3mg, FeSO4·7H2O 27.8mg, CaCl2.2H2O 150mg, VB1 10mg, VB6 1mg, VPP 1mg, 肌醇 100mg 和余量的蒸馏水；所述的NLN液体培养基，以1L计，由KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg， MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，VB5 5mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水组成。
所述的沉淀重复以下操作1～2次：在沉淀中加入B5洗涤培养基，研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液。重复操作后所得的沉淀中依次加入NLN-13诱导培养基和活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液。所述过滤得沉淀步骤进行1～2次，所述小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0.8×105～1.2×105个/mL；采用45μm无菌滤网，离心的条件为：500～900 rpm/min离心3～5min。
所述步骤三中，热激处理后小孢子混合悬浮液移至避光、温度为 25±2 ℃的条件下培养20～30天期间，当肉眼可见胚状体时，再于相同条件下进行振荡培养，使小孢子胚生长健壮。
所述步骤四中，所述胚状体固体分化培养基由B5培养基1L、蔗糖20g和琼脂10～12g组成， pH5.8～6.1，高温高压灭菌。当所述的胚状体较大时可切成多块后接种。
所述步骤五中生根培养基由MS培养基1L 、蔗糖或白砂糖20～30g和琼脂7～9g组成，pH 5.8～6.0。其中，所述的MS培养基，以1L计，由NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水组成。
移栽时用清水洗净组培苗根部的培养基，后植于育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养5～10天后移栽。通过给予一定的缓冲环境，以更好地使在生长环境较好的实验室里生长的组培苗适应较严酷的自然环境。
鉴定采用本领域常用的植株形态鉴定法鉴定区分结球甘蓝和油菜植株，并利用流式细胞仪对小孢子植株进行倍性分析、鉴定。
本发明采用难出胚的结球甘蓝与易出胚的油菜花蕾按一定数目比例共培养的方法，以易出胚的材料带动难出胚的材料出胚，使结球甘蓝的出胚率显著提高，所共培养结球甘蓝出胚率最高达27.7个/蕾，而对照结球甘蓝出胚率最高仅为2.4个/蕾，经植株形态鉴定及流式细胞仪检测发现，在相同的条件下混合培养最后得到15株结球甘蓝小孢子苗，而单独培养的对照株数为1株。其有益效果是：解决了结球甘蓝小孢子培养胚胎发生频率低的问题，提高了小孢子培养技术的利用效率。
具体实施方式
结球甘蓝和油菜共培养花蕾中结球甘蓝花蕾与油菜花蕾的用量一般不作特别的限定，为了达到更好的效果，优选油菜花蕾的数量大于结球甘蓝花蕾的数量，详见以下实施例。
实施例一
（1）本实施例中结球甘蓝和油菜花序采摘自镇江农科所试验田，品种不限。
（2）培养基配制：包括小孢子不同培养阶段的培养基，其组分与各组分在每升培养基中所含的重量为：
B5洗涤培养基：B5液体培养基1L+蔗糖30 g/L，pH 6.0，高温高压灭菌；其中，B5液体培养基，以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 169.5mg, KNO3 2500mg，(NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 500mg，MnSO4·4H2O 10mg, H3BO3 3mg, ZnSO4·7H2O 2mg, KI 0.75mg, Na2MoO4·2H2O 0.25mg, CuSO4·5H2O 0.025mg, CoCl2·6H2O 0.025mg, Na2-EDTA 37.3mg, FeSO4·7H2O 27.8mg, CaCl2.2H2O 150mg, VB1 10mg, VB6 1mg, VPP 1mg, 肌醇 100mg 和余量的蒸馏水。
NLN-13诱导培养基：NLN液体培养基1L+蔗糖130 g/L，pH 6.0，过滤灭菌；
其中，NLN液体培养基，以1L计，由KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 
500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg， MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，维生素B5 5mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水组成。
胚状体固体分化培养基：B5培养基+蔗糖20 g/L，琼脂10 g/L，pH 6.0，高温高压灭菌；
生根培养基：MS培养基+蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，pH 5.8，高温高压灭菌；
其中，MS培养基，以1L计，由NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水组成。
本实施例按以下方法培养结球甘蓝：    
步骤一，摘取结球甘蓝花序和油菜花序上生长健康、无病虫害、单核晚期至双核早期的花蕾作为小孢子培养的供体植株，其中，结球甘蓝的花瓣和花药长度比为0.8、油菜的花瓣和花药比为0.5、将两种花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理：用1g升汞+1L无菌水配制成灭菌液；把油菜和结球甘蓝混合花蕾放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒10分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗3次后，备用；
步骤二，在超净工作台上将15个（混合花蕾总数，其中油菜花蕾10个）灭菌后的结球甘蓝和油菜混合花蕾一并置于无菌烧杯中，加入10mlB5洗涤培养基，用平头玻璃棒挤碎后研磨成悬浮液，将悬浮液用45μm无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，600rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5洗涤培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13诱导培养基40ml、再加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖5g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的浓度为1×105个/mL的小孢子混合悬浮液；
步骤三，将小孢子悬浮液分装到60mm塑料无菌培养皿中，每60mm培养皿加4ml小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm膜封口，后置于32.5℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理1天；后取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养；至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养20天，得到子叶型胚状体并发育成熟；
步骤四，将子叶型胚状体接种至胚状体分化培养基中，在每天16小时光照、25℃下培养3周至形成胚状体，将胚状体切成3块大小一致的块，接种至分化培养基中在相同条件下继续培养至分化，得到再生芽；
步骤五，切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25℃下进行生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗3天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养10天后移栽，得到再生植株； 
步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。
对比实验：
    采用结球甘蓝生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，其余方法与上述步骤相同，得到的结球甘蓝植株作为对照植株。
分析检测：
取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞仪进行倍性分析，检测实施例植株与对照植株倍性。
结果：混合培养结球甘蓝出胚率为18.3个/蕾，而对照结球甘蓝出胚率仅为2.4个/蕾；经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，混合培养最后得到13株结球甘蓝小孢子苗，而对照结球甘蓝花蕾单独培养的对照株数为1株。
实施例二
本实施例中培养基与实施例一的培养基差别如下， B5液体培养基1L+蔗糖30g/L，pH6.0，高温高压灭菌；NLN-13诱导培养基：NLN-13液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH 6.1，过滤灭菌；胚状体固体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂11 g/L，pH 6.0，高温高压灭菌；生根培养基：MS培养基+白糖20g/L，琼脂7g/L，pH 5.9，高温高压灭菌；
本实施例按以下方法培养结球甘蓝：
步骤一，摘取结球甘蓝花序和油菜花序上生长健康、无病虫害、单核晚期至双核早期的花蕾作为小孢子培养的供体植株，结球甘蓝花序的花瓣和花药长度比为1.2、油菜花序的花瓣和花药长度比为为0.75、将两种花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理：用1g升汞+1L无菌水配制成灭菌液；把油菜和结球甘蓝混合花蕾放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒11分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗4次后，备用； 
步骤二，在超净工作台上将14个（混合花蕾总数，其中油菜花蕾8个）灭菌后的结球甘蓝和油菜混合花蕾一并置于无菌烧杯中，加入10mlB5洗涤培养基，用平头玻璃棒挤碎后研磨成悬浮液，将悬浮液用45μm无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，900rpm/min离心3min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10ml B5洗涤培养基，按上述方法再离心1次，弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13诱导培养基40ml、再加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖2g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的浓度为0.8×105个/mL的小孢子混合悬浮液；
步骤三，将小孢子悬浮液分装到90mm塑料无菌培养皿中，每培养皿加10ml小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm膜封口，后置于33℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理2天；取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养；至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养30天，得到子叶型胚状体并发育成熟；
步骤四，将子叶型胚状体接种至胚状体分化培养基中，在每天16小时光照、25℃下培养2周至形成胚状体，将胚状体直接接种至胚状体固体分化培养基中在相同条件下继续培养至分化，得到再生芽；
步骤五，切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25℃下进行生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗5天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养7天后移栽，得到再生植株； 
步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。
对比实验：
    采用结球甘蓝生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，其余方法与上述步骤相同，得到的结球甘蓝植株作为对照植株。
分析检测：
取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞仪进行倍性分析，检测实施例植株与对照植株倍性。
结果：混合培养结球甘蓝出胚率为21.3个/蕾，而对照结球甘蓝出胚率仅为2.8个/蕾；经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，混合培养最后得到14株结球甘蓝小孢子苗，而对照结球甘蓝花蕾单独培养的对照株数为0株。
实施例三
本实施例中培养基与实施例一的培养基差别如下， B5液体培养基1L+蔗糖30g/L，pH6.0，高温高压灭菌；NLN-13培养基：NLN-13液体培养基1L+蔗糖130g/L，pH 6.1，过滤灭菌；胚状体固体分化培养基：B5培养基+蔗糖20g/L，琼脂12 g/L，pH 6.0，高温高压灭菌；生根培养基：MS培养基+白糖20g/L，琼脂7g/L，pH 5.9，高温高压灭菌；
本实施例按以下方法培养结球甘蓝：
步骤一，摘取结球甘蓝花序和油菜花序上生长健康、无病虫害、单核晚期至双核早期的花蕾作为小孢子培养的供体植株，结球甘蓝花序的花瓣和花药长度比为1.1、油菜花序的花瓣和花药长度比为0.75、将两种花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理：用1g升汞+1L无菌水配制成的灭菌液；把混合花蕾放入无菌培养皿中，加入灭菌液，放到摇床上摇动进行表面消毒12分钟，再在超净工作台上用无菌水荡洗5次后，备用；
步骤二，在超净工作台上将16个（混合花蕾总数，其中油菜花蕾11个）灭菌后的结球甘蓝和油菜混合花蕾一并置于无菌烧杯中，加入10mlB5洗涤培养基，用平头玻璃棒挤碎后研磨成悬浮液，将悬浮液用45μm无菌滤网过滤到50ml离心管中，盖紧，700rpm/min离心5min，离心后倒掉上清液，往沉淀中加入10mlB5洗涤培养基，按上述方法再离心2次，弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入NLN-13诱导培养基40ml、再加入由NLN-13液体培养基+琼脂糖3.5g/L+1g/L活性炭配制、高温灭菌而成的活性炭混合液10滴，得到小孢子的浓度为1.2×105个/mL的小孢子混合悬浮液；
步骤三，将小孢子悬浮液分装到60mm塑料无菌培养皿中，每60mm培养皿加4ml小孢子混合悬浮液，加盖后用parafilm膜封口，置于32.5℃恒温生化培养箱里、黑暗条件下热激处理3天；取出置于25℃恒温培养箱中、黑暗条件下继续培养；至肉眼可见胚状体时，置于25℃摇床上、黑暗条件下摇动培养25天，得到子叶型胚状体并发育成熟；
步骤四，将子叶型胚状体接种至胚状体固体分化培养基中，在每天16小时光照、25℃下培养2.5周至形成胚状体，将胚状体切成2块大小一致的块，再接种至分化培养基中在相同条件下继续培养至分化，得到再生芽；
步骤五，切取生长健康的再生芽接种至生根培养基上，在每天16小时光照、25℃下进行生根培养；3周后将根生长健壮的苗进行炼苗4天；移栽时用清水洗净组培苗根部培养基，然后把植株植于蔬菜育苗专用基质穴盘，塑料膜罩住保湿，在温室中培养9天后移栽，得到再生植株； 
步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。
对比实验：
    采用结球甘蓝生长健康、无病虫害的花序作为小孢子培养的供体植株，其余方法与上述步骤相同，得到的结球甘蓝植株作为对照植株。
分析检测：
取再生植株的嫩叶，用美国BD公司的BD FACSCalibur流式细胞仪进行倍性分析，检测实施例植株与对照植株倍性。
结果：混合培养结球甘蓝出胚率为17.6个/蕾，而对照结球甘蓝出胚率仅为1.3个/蕾；经肉眼观察及流式细胞仪检测发现，混合培养最后得到17株结球甘蓝小孢子苗，而对照结球甘蓝花蕾单独培养的对照株数为3株。
 
本发明方法共培养结球甘蓝出胚率最高达21.3个/蕾，而对照结球甘蓝出胚率最高仅为2.8个/蕾，经植株形态鉴定及流式细胞仪检测可知，在相同的条件下混合培养最多可以得到17株结球甘蓝小孢子苗，而单独培养的对照株数为3株。用本发明的方法解决了结球甘蓝小孢子培养胚胎发生频率低的问题，提高了小孢子培养技术的利用效率。
除上述实施外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，包括以下步骤：
步骤一，取结球甘蓝和油菜花序上的花蕾进行混合，得到甘蓝和油菜的混合花蕾，进行灭菌处理； 
步骤二，在灭菌后的混合花蕾中加入B5洗涤培养基后研磨成悬浮液，过滤所得滤液经离心、弃上清液得到沉淀，在沉淀中加入35～45ml的NLN-13诱导培养基、8～12滴的活性炭混合液，得到小孢子混合悬浮液；
步骤三，将小孢子混合悬浮液在黑暗条件下32～33 ℃热激处理1～3天后，移至黑暗、温度为 25±2 ℃的条件下培养20～30天，得到子叶型胚状体；
步骤四，将子叶期胚状体接种至胚状体固体分化培养基中，每天光照15±3小时、温度23±3℃下培养，直至分化，得到再生芽； 
步骤五，切取所述再生芽转接至生根培养基培养出苗后，按常规方法进行炼苗和移栽，得到再生植株；
步骤六，根据植株形态，按照田间观察的方法区分结球甘蓝和油菜的再生植株，即得结球甘蓝植株。
2.根据权利要求1所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述步骤一中，取花序上单核晚期至双核早期的花蕾，结球甘蓝花蕾的花瓣和花药长度比为0.8～1.2，油菜花蕾的花瓣和花药长度比为0.5～0.75。
3.根据权利要求1所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述步骤二中，所述的B5洗涤培养基由B5液体培养基1L和蔗糖30g组成；所述的NLN-13诱导培养基由NLN液体培养基1L和蔗糖130 g组成，pH 6.0～6.2；所述的活性炭混合液由NLN液体培养基1L、琼脂糖2～5g和1g活性炭组成。
4.根据权利要求3所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述的B5液体培养基以1L计，组成为：NaH2PO4·2H2O 169.5mg, KNO3 2500mg，(NH4)2SO4 134mg，MgSO4·7H2O 500mg，MnSO4·4H2O 10mg, H3BO3 3mg, ZnSO4·7H2O 2mg, KI 0.75mg, Na2MoO4·2H2O 0.25mg, CuSO4·5H2O 0.025mg, CoCl2·6H2O 0.025mg, Na2-EDTA 37.3mg, FeSO4·7H2O 27.8mg, CaCl2.2H2O 150mg, VB1 10mg, VB6 1mg, VPP 1mg, 肌醇 100mg 和余量的蒸馏水；所述的NLN液体培养基，以1L计，由KNO3 125mg，Ca(NO3)2·4H2O 500mg，MgSO4·7H2O 125mg，KH2PO4 125mg，H3BO3 6.2mg， MnSO4·H2O 18.95mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·2H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，维生素B1 0.5mg，维生素B6 0.5mg，生物素0.05mg，叶酸0.5mg，Na2EDTA 37.3mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸5mg，L-谷氨酰胺800mg，谷胱甘肽30mg，VB5 5mg，丝氨酸100mg和余量的无菌水组成。
5.根据权利要求3所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述过滤得沉淀步骤进行1～2次，所述小孢子混合悬浮液中小孢子的浓度为0.8×105～1.2×105个/mL。
6.根据权利要求1所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述步骤三中，热激处理后小孢子混合悬浮液移至避光、温度为 25±2 ℃的条件下培养20～30天期间，当肉眼可见胚状体时，再于相同条件下进行振荡培养。
7.根据权利要求1所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述步骤四中，所述胚状体固体分化培养基由B5培养基1L、蔗糖20g和琼脂10～12g组成， pH5.8～6.1。
8.根据权利要求1所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述步骤五中生根培养基由MS培养基1L 、蔗糖或白砂糖20～30g和琼脂7～9g组成，pH 5.8～6.0。
9.根据权利要求8所述提高结球甘蓝胚胎出生率的培养方法，其特征在于：所述的MS培养基，以1L计，由NH4HO3 1650 mg，KNO3 1900 mg，CaCl2·2H2O 440 mg，KH2PO4 170 mg，MgSO4·7H2O 370 mg，FeSO4·7H2O 27.8 mg，Na2EDTA 37.3 mg，H3BO3 6.2 mg，MnSO4·H2O 16.9 mg，ZnSO4·7H2O 8.6 mg，Na2MoO4·2H2O 0.25 mg，CuSO4·5H2O 0.025 mg，CoCl2·6H2O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水组成。
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