CN101773072B - 一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域。包括取适合长度的花蕾，进行4℃低温预处理24h，消毒后采用挤压法使小孢子游离，过滤并离心，将纯化的小孢子悬浮在的液体培养基中，32.5℃高温热激处理24h后转移到25℃黑暗培养15-20天；出现肉眼可见的胚状体后，置于光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体，待胚状体转绿后接到继代培养基上萌发然后转移到生根培养基上生根，获得完整的再生植株；然后开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中；利用该方法进行培养，获得较高频率的胚状体，所获得的单倍体再生植株既是良好的育种材料，也是进行分子标记和遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究的理想材料。

Description

一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法

一、技术领域

本发明一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，属于生物技术领域，专用于组织培养获得再生植株。

二、技术背景

结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)是十字花科芸薹属二年生植物，在我国栽培面积广，适应性强，营养价值高，耐贮运，深受广大人民喜爱，是国内市场和出口创汇的主要蔬菜之一。目前生产上应用的杂交种主要是通过将国外引进的材料多代自交分离纯化，选育自交不亲和系培育出来的，一般需要分离6～8代。由于甘蓝是绿体春化型作物，不易加代，使得育种周期长，并且连续自交多代后存在植株衰退现象。这些因素制约着我国甘蓝优良品种选育工作的开展。

采用组织培养技术，开展结球甘蓝游离小孢子培养和单倍体育种研究，能够为优良种质资源获得和新品种的培育创建一条新的有效途径。游离小孢子培养作为人工诱导单倍体的有效途径，具有实用性。小孢子培养具有单细胞、单倍体和较高胚胎发生率及较高同步性等特点，不仅可作为重要的细胞筛选系统和基因转移的受体，而且也是获得纯合双单倍体的快捷方法。采用游离小孢子培养技术比采用传统的自交纯化方法省时约2～3年，大大提高了育种效率，缩短了育种周期。由于小孢子培养技术不但可以加快育种进程，而且可以提高选择效率利用游离小孢子培养技术可以尽快获得单倍体和纯合双单倍体材料，有利于丰富基因库。除此之外，游离小孢子培养还可以为植物性状的分子标记、作图、基因定位、基因克隆和转基因等提供大量低成本的实验材料。目前，国内的小孢子培养研究主要集中于甘蓝型油菜和白菜等植物上，结球甘蓝的小孢子培养研究相对滞后。主要问题是效率较低，进展缓慢，与应用于实际育种尚有一定距离。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，建立结球甘蓝游离小孢子培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，用于结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株，同时为结球甘蓝遗传育种和分子标记和遗传图谱绘制研究、基因克隆和转基因等研究提供材料。

技术方案

本发明是一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，由如下步骤实现：

1)小孢子培养

1.1取材  结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)实验材料种植于江苏省农科院蔬菜研究所日光温室。盛花初期取2.1～6.0mm长度的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱低温处理1～3d；

1.2消毒  用体积比75％酒精消毒60s，接着再用质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗3次待用；

1.3小孢子分离  将消毒后的花蕾置于已灭菌的研钵中，加入少量pH为5.8的小孢子游离B5-13培养基为洗液，采用挤压法游离小孢子，然后用450目尼龙网过滤，将滤液收集于离心管，1000r·min^-1离心5min，弃上清液，再加入小孢子游离培养基离心，重复3次；所述的B5-13培养基为在B5培养基中还加入130mg/L蔗糖；

4小孢子培养  清洗后的小孢子悬浮在pH6.2的液体培养基1中，调整小孢子密度为1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1，并加入100μL含有0.5g·L-1琼脂糖和10g·L-1活性炭的水悬浮液，分装于6cm直径的玻璃培养皿中，每皿2mL，用Parafilm膜封口。32.5℃恒温培养箱热激处理24h，然后于25℃条件下静止黑暗培养15～20天，出现胚状体(图1)；所述的液体培养基1为pH6.2的大量元素元素减半的NLN-13培养基，其中还加入0.05mg·L^-1 6-BA、20mg·L^-1 AgNO₃和0.05mg·L^-1 2，4-D；

2)小孢子胚状体的培养和再生植株的获得

2.1胚状体的萌发  出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床培养(60r·min^-1、25℃黑暗下)。胚状体发育到子叶期时转置于25℃、5000Lx、16h·h^-1的光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体(图2)，待胚转绿后转到继代培养基上培养，经过3～4次继代将无根试管苗转移到生根培养基中生根培养；获得再生植株试管苗(图3)；所述的继代培养基为B5培养基+蔗糖20g·L^-1+琼脂12g·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+活性炭0.1mg·mL^-1，pH5.8；所述的生根培养基为B5培养基+蔗糖20g·L^-1+琼脂8g·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，pH5.8；

2.2植株再生  将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中(图4)，其中泥炭、营养土和蛭石的体积比为2∶1∶1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，放于光照培养箱中，保持25℃，12h光照和12h黑暗交替培养，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得所要的植株。

作为一种优化方式所述的取材处理时间为1d，可以提高有利小孢子的出胚率，所述的花蕾的长度为3.1～4.5mm，小孢子胚产量最高，平均每蕾产胚13.3个。

本发明采取将纯化的小孢子于32.5℃高温热激处理24h，然后于25℃条件下静止黑暗培养，可以提高小孢子培养的出胚率。

有益效果

本研究以结球甘蓝为材料，建立了游离小孢子培养与植株再生体系，为结球甘蓝的细胞、基因工程等的深入研究奠定了基础。本发明提供的一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，与现有技术相比具有如下优点和积极效果：

①本发明在分离小孢子前进行花蕾短期的低温预处理，可以提高有利小孢子的出胚率。对不同材料的适宜花蕾经4℃低温处理0d(ck)、1d、2d、3d，进行游离小孢子培养。研究结果表明，经1d低温处理小孢子诱导出胚率均比对照高，平均值为12.06胚/蕾，高出对照9.3胚/蕾；而经2d、3d低温处理的出胚效果较差，平均出胚率分别为6.23胚/蕾和0.30胚/蕾。由此表明，结球甘蓝花蕾4℃低温处理1d可以提高小孢子培养的诱导率，但过长的低温预处理时间，反而会使其诱导出胚率降低。

②本发明采取将纯化的小孢子于32.5℃高温热激处理24h，然后于25℃条件下静止黑暗培养，可以提高小孢子培养的出胚率。试验结果表明，单独在25℃恒温下培养的小孢子没有出现胚状体，而不同温度和时间组合的热激处理，能够刺激小孢子培养出胚，其中32.5℃处理24h效果最好，为有利于出胚的最佳条件。

③本发明活性炭：将高压灭菌后的活性炭悬浮液加入培养基中，使其最终浓度分别为0.05、0.1、0.2mg·L-1，以不加活性炭为对照，观察小孢子培养出胚情况。结果表明，在大量元素元素减半的NLN-13培养基中添加0.1mg/mL活性炭，对不同的基因型出胚率均表现不同程度的促进作用。对于易出胚基因型促进作用不显著，而出胚能力较弱的基因型添加0.1mg/mL活性碳的后诱导率可提高6倍。但是高浓度活性炭阻止胚胎诱导

④本发明在小孢子培养基本培养基中加入适量浓度的不同植物生长调节剂，可以提高游离小孢子培养的出胚率。在培养基中加入不同质量浓度的6-BA、NAA、AgNO3、2，4-D，以不加生长调节剂为对照，观察小孢子培养出胚情况。结果表明，不添加任何调节剂的培养基出胚率相对较低，与产胚量最高的相差近2倍。单独加入0.05mg·L^-1 6-BA或20mg·L^-1 AgNO₃或0.05mg·L^-1 2，4-D均可以提高出胚率。加入NAA则使出胚率降低，说明NAA不利于胚胎发育。同时向培养基中加入0.05mg·L^-1 6-BA、20mg·L^-1 AgNO3、0.05mg·L^-1 2，4-D小孢子出胚率最高，可达10.9胚/蕾。试验结果表明在培养基中同时添加不同浓度的植物生长调节剂，其中添加0.05mg·L^-1 6-BA、20mg·L^-1 AgNO3、0.05mg·L^-1 2，4-D的小孢子出胚率最高，比不添加任何调节剂的出胚率提高1倍多。

⑤本发明成功获得再生植株(图3)。再生植株驯化后移栽成活(图4)。本发明建立了结球甘蓝游离小孢子细胞培养再生体系，成功获得植株并移栽成活，可用于结球甘蓝小孢子培养获得再生植株，同时为结球甘蓝的细胞、基因工程提供获得再生植株的技术。

⑥盛花初期取2.1～3.0、3.1～4.0、4.1.～5.0、5.1～6.0mm长度的花蕾，进行分离，取沉淀物用醋酸洋红染色，在显微镜下观察计数视野中小孢子发育各个时期的比例，比较不同长度花蕾的小孢子胚胎发生能力。结果表明，取花蕾长度为3.1.～4.0mm时，小孢子胚产量最高，平均每蕾产胚13.3个。

注6-BA为6-苄氨基腺嘌呤，2，4-D为4-dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D。

四、附图说明

图1结球甘蓝胚状体

图2结球甘蓝子叶胚

图3小孢子胚分化成苗图

图4小孢子植株

五、具体实施方案

本发明所提供的结球甘蓝游离小孢子培养和植株再生的方法，其实施方案如下：

实施例1

1小孢子培养

1.1取材  结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)实验材料种植于江苏省农科院蔬菜研究所日光温室；盛花初期取2.1～6.0mm长度的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱低温预处理1～3d。

1.2消毒  用体积比75％酒精消毒60s，接着再用质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗3次待用。

1.3小孢子分离  将消毒后的花蕾置于已灭菌的研钵中，加入少量pH为5.8的小孢子游离培养B5-13液体培养基为洗液，采用挤压法游离小孢子，然后用450目尼龙网过滤，将滤液收集于离心管，1000r·min^-1离心5min，弃上清液，再加入小孢子游离培养基离心，重复3次。

1.4小孢子培养  将清洗后的小孢子悬浮在1/2NLN-13+0.05mg·L^-1 6-BA+20mg·L^-1 AgNO₃+0.05mg·L^-1 2，4-D+，pH6.2的培养基中，调整小孢子密度为1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1。分装于6cm直径的玻璃培养皿中，每皿3mL，用Parafilm膜封口。于32.5℃恒温培养箱热激处理24h，然后于25℃条件下静止黑暗培养15～20d，观察出现胚状体情况。

2小孢子胚状体的培养和再生植株的获得

2.1胚状体的萌发  出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床培养(60r·min^-1、25℃黑暗下)。胚状体发育到子叶期时转置于25℃、5000Lx、16h·h^-1的光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体(图2)，待胚转绿后转到B5+蔗糖20g·L^-1+琼脂12g·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+活性炭0.1mg·mL^-1，PH5.8的继代培养基上培养，经过3-4次继代将无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，生根培养基配方为：B5+蔗糖20g·L^-1+琼脂8g·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，PH5.8。获得再生植株试管苗(图3)。

2.1植株再生  将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中(图4)，其中泥炭、营养土和蛭石的体积比为2∶1∶1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，放于光照培养箱中，保持25℃，12h光照和12h黑暗的条件，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得植株。

附：培养基配方

实施例2

1小孢子培养

1.1取材  结球甘蓝(Brassica oleracea var.capitata)实验材料种植于江苏省农科院蔬菜研究所日光温室；盛花初期取3.1.～4.0mm mm长度的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱低温预处理1d。

1.2消毒  用体积比75％酒精消毒60s，接着再用质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗3次待用。

1.3小孢子分离  将消毒后的花蕾置于已灭菌的研钵中，加入少量pH为5.8的小孢子游离培养B5-13液体培养基为洗液，采用挤压法游离小孢子，然后用450目尼龙网过滤，将滤液收集于离心管，1000r·min^-1离心5min，弃上清液，再加入小孢子游离培养基离心，重复3次。

1.4小孢子培养  将清洗后的小孢子悬浮在液体培养基1(大量元素元素减半的NLN-13培养基+0.05mg·L^-1 6-BA+20mg·L^-1 AgNO₃+0.05mg·L^-1 2，4-D，pH6.2)，调整小孢子密度为1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1；分装于6cm直径的玻璃培养皿中，每皿3mL，用Parafilm膜封口。于32.5℃恒温培养箱热激处理24h，然后于25℃条件下静止黑暗培养15～20d，观察出现胚状体情况。

2小孢子胚状体的培养和再生植株的获得

2.1胚状体的萌发  出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床培养(60r·min^-1、25℃黑暗下)。胚状体发育到子叶期时转置于25℃、5000Lx、16h·h^-1的光照下培养5～7d至出现子叶型胚状体(图2)，待胚转绿后转到B5培养基+蔗糖20g·L^-1+琼脂12g·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+活性炭0.1mg·mL^-1，PH5.8的继代培养基上培养，经过3-4次继代将无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，生根培养基配方为：B5培养基+蔗糖20g·L^-1+琼脂8g·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，PH5.8。获得再生植株试管苗(图3)。

2.1植株再生  将试管苗在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中(图4)，其中泥炭、营养土和蛭石的体积比为2∶1∶1的营养钵中，用塑料薄膜覆盖，放于光照培养箱中，保持25℃，12h光照和12h黑暗的条件，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得植株。

Claims (2)

1.一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，包括以下步骤：

1)小孢子培养

1.1取材 盛花初期取3.1～4.0mm长度的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃处理1～3d；

1.2消毒花蕾 用体积比75％酒精消毒60s，质量比8％的次氯酸钠溶液表面消毒15min，无菌水冲洗；

1.3小孢子分离 将消毒后的花蕾加入pH5.8的小孢子游离B5-13培养基，采用挤压法游离小孢子，然后用450目尼龙网过滤，将滤液收集于离心管，1000r·min^-1离心5min，弃上清液，再加入小孢子游离培养基离心；

1.4小孢子培养 清洗后的小孢子悬浮在pH6.2的液体培养基1中，调整小孢子密度为1×10⁵～2×10⁵个·mL^-1，于32.5℃恒温培养箱热激处理24h，再转移到25℃条件下静置黑暗培养15～20天；其中所述的液体培养基1为pH6.2的大量元素元素减半的NLN-13培养基，其中还加入0.05mg·L^-16-BA、20mg·L^-1AgNO₃和0.05mg·L^-12，4-D；

2)小孢子胚状体的培养和再生植株的获得

2.1胚状体的萌发 出现肉眼可见的胚状体后，置于摇床60r·min^-1、25℃黑暗培养；胚状体发育到子叶期时转置于光照下静置培养5～7d，待胚转绿后转到继代培养基上培养，经过3-4次继代将无根试管苗转移到生根培养基中生根培养，条件为25℃、5000Lx、16h·d^-1；

2.2植株再生 再生株长成含4～5片叶的健壮苗，在培养室内开瓶炼苗，驯化移栽到装有灭菌基质的营养钵中，于25℃下12h光照和12h黑暗交替静置培养，1周后营养钵放置外界阴凉处，逐步炼苗，3周后将其移栽到大田，获得植株；

其中所述的继代培养基为B5+蔗糖20g·L^-1+琼脂12g·L^-1+6-BA0.2mg·L^-1+活性炭0.1mg·mL^-1，pH5.8；生根培养基为B5+蔗糖20g·L^-1+琼脂8g·L^-1+NAA0.2mg·L^-1，pH5.8。

2.根据权利要求1所述的一种结球甘蓝游离小孢子培养获得再生植株的方法，其特征在于所述的灭菌基质是体积比为2∶1∶1的泥炭、营养土和蛭石。 

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