CN1869202A - 一种不结球白菜游离小孢子培养技术 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子培养技术，属于生物技术领域，专用于不结球白菜游离小孢子培养。包括取材、消毒，接种小孢子密度为1×10^5－6个/ml，置于35℃高温诱导24～48h，25℃黑暗条件下培养暗培养15～20d、植株再生与继代培养、移栽，采用培养基中加入质量比0.1％的秋水仙素处理或在移栽时用质量比0.1％的秋水仙素浸泡幼根使得染色体加倍。应用此技术，诱导不结球白菜基因型成功率达68.5％，平均每个花蕾诱导胚4～10个，最高可达92个以上。

Description

一种不结球白菜游离小孢子培养技术

一、技术领域

本发明涉及一种不结球白菜游离小孢子培养技术，属于生物技术领域，专用于不结球白菜游离小孢子培养。

二、技术背景

不结球白菜(Brassica campestris ssp.chinensis Makino)，俗称青菜、小白菜、油菜(北方)，系我国原产，占长江中下游各大、中城市蔬菜总复种面积的30～40％，并具有营养丰富、生长快速、适应性广、成本低等特点。近年来，北方地区种植面积增长迅速，日、美及欧洲一些国家也广泛引种栽培。栽培品种中杂交一代的比重逐年增加，而游离小孢子培养技术可以为杂优育钟快速提供纯系(DH系)亲本材料，同时，得到的DH群体可以成为共享的永久遗传作图群体。

小孢子是高等植物生活史中雄配子发育进程中的短暂而重要的阶段，游离小孢子培养是在单细胞水平上获得纯系的培养方法。在芸薹属作物中，德国人Lichter(1982)首次从甘蓝型油菜上成功进行游离小孢子培养，并发现其胚胎诱导率及再生植株产量远高于花药培养。1989年，日本学者Sato首次获得大白菜游离小孢子培养的再生植株。我国这方面的研究起步较晚，但随着研究的深入，近年来，已开始利用游离小孢子培养技术进行双单倍体育种。栗根义等(1993)对大白菜游离小孢子培养的相关技术进行了研究，建立了较完善的技术体系，并利用该技术育成大白菜、甘蓝、花椰菜系列新品种；曹鸣庆(1992)首次报道不结球白菜游离小孢子培养获得成功，卢钢(2001)报道不结球白菜和芜菁杂种小孢子培养获得成功；但都没有对不结球白菜游离小孢子培养技术进行系统研究，培养效率低。为实现工厂化生产双单倍体(DH)纯系，使这一新技术能成功应用于育种实践，尤其为构建遗传图谱而建立双单倍体(DH)群体，是不结球白菜游离小孢子培养技术的最主要目标。

三、发明内容

技术问题：本发明目的在于针对上述现有技术中不结球白菜游离小孢子存在的培养效率低问题，提供一种不结球白菜游离小孢子培养技术，获得了双单倍体纯系。

技术方案：

本发明一种不结球白菜游离小孢子培养技术，包括：

从取材、消毒、接种、高温诱导、暗培养、植株再生与继代培养、移栽、加倍等，到获得双单倍体纯系。

取材：选取无病害的供植体上2～3mm长的花蕾，外观特征为花瓣、花药长度比为1/2～4/5，镜检此时小孢子处于单核靠边期，为培养的最佳时期，将花蕾保湿置于4℃冰箱中保存待用；

消毒：用75％的酒精消毒30s，然后用0.1％的HgCl₂消毒5min，最后用无菌水冲洗3次待用；

接种：把消毒后的花蕾置于10ml离心管中加入B₅液体培养基3～5ml用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，用400目虑网过滤，然后800rpm离心5min，弃上清，重复3次，最后加入含有质量比13％蔗糖的NLN培养基，把小孢子分装于培养皿中，密度1×10^5-6个/ml；

高温诱导：将接种后的小孢子立即置于35℃高温下黑暗处理24～48h；

暗培养：将高温处理后的小孢子置于25℃黑暗条件下继续培养，15～20d后可以看到有胚状体出现；

植株再生与继代培养：胚状体生长15d以后，挑选生长较好的子叶型胚及时转于生芽培养基中培养(生长较慢的小胚及畸形胚可以转入新的含有质量比13％蔗糖的NLN培养基中继续培养)，25d以后，转于生根培养基中生根；

移栽：试管苗生根较好时，选择天气凉爽的秋季移栽于营养钵中，经过炼苗以后，可以定植于大田；

加倍：可以采用在培养基中加入质量比浓度为0.1％的秋水仙素处理加倍，也可以采用质量比浓度为0.1％的秋水仙素在移栽时浸泡幼根处理加倍。

有益效果：本发明提供了一种不结球白菜游离小孢子培养技术，培养的小孢子获得了双单倍体纯系。

用本发明的游离小孢子培养(IMC)技术创造新纯系(1～2年)可代替传统多代自交(6～8年)方法，加速育种进程，育种周期缩短1/2(原10～12年，现5～7年)；获得的纯系是经过单倍体加倍而得来的，在理论上是100％纯合的；比花药培养诱导效率提高5～10倍；诱导基因型成功率68.5％，平均每花蕾诱导胚4～10个，最高可达92个以上。

四、具体实施方式

实施例1  不结球白菜游离小孢子培养技术，包括：

1.基因型：乌塌菜(N32)、暑绿(N20)、黄帮(N30)，分别来自湖北、江苏和辽宁，其中乌塌菜是常规种，暑绿和黄帮是杂交种，均可在市场买到。

2.取材：2004年4月5、20号2次选取长度为2～3mm的花蕾，将花蕾用保湿置于4℃冰箱中保存。

3.消毒：用75％的酒精消毒30s，然后用0.1％的升汞消毒5min，最后用无菌水冲洗3次待用。

4.接种：把消毒后的花蕾置于10ml离心管中，加入B₅液体培养基5ml用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，用400目虑网过滤，然后800rpm离心5min，弃上清，重复3次。最后加入含有质量比为13％蔗糖的NLN液体培养基，把含小孢子的培养基分装于培养皿中。

5.高温诱导：接种以后立即置于35℃高温下黑暗处理24h。

6.暗培养：高温处理后置于25℃黑暗条件下继续培养，15～20d后可以看到有胚状体出现，30d以后统计出胚数。

7.植株再生与继代培养：胚状体生长15d以后，挑选生长较好的子叶型胚及时转于生芽培养基(B5+0.2mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA)、中培养(生长较慢的小胚及畸形胚转入新的含有质量比为13％蔗糖的NLN培养基中继续培养)，25d以后，转于生根培养基(B5+0.02mg/L NAA)中生根；

8.移栽：试管苗生根较好时，9月15、25号分两次移栽于营养钵中，炼苗10d以后，定植于大田；

9.染色体加倍：采用上述继代过程中在培养基中加入质量比浓度0.1％的秋水仙素处理加倍，或者在移栽时浸泡幼根处理加倍。

实施结果如下：

1.胚诱导率：表1结果表明，3个基因型均能诱导出胚，不同基因型的胚诱导率差异显著，暑绿(南京农业大学对外提供)平均每花蕾诱导出的胚数为4.4个，黄帮(沈阳农业大学对外提供)可达75.5个，乌塌菜(南方地方品种)为27.1个。

                表1  三种基因型出胚情况

基因型代号	暑绿(N20)	黄帮(N30)	乌塌菜(N32)
				接种花蕾数(个)出胚数(个)平均(个/蕾)	502204.4	50377575.5	50135527.1

2.胚状体成苗情况：从表2可以看出，不同基因型胚状体成苗率不同，其中N20和N32差异不大，分别为26.8％和26.4％，但是与N30的差异显著，N30的胚状体成苗率达到53.2％。

             表2  三种基因型胚状体成苗情况

基因型代号	暑绿(N20)	黄帮(N30)	乌塌菜(N32)
				出胚数(个)成苗数(棵)成苗率(％)	2205926.8	377520753.2	135535826.4

实施例2  不结球白菜游离小孢子培养技术，基因型、取材、消毒、接种、高温诱导、暗培养、植株再生与继代培养、移栽同实施例1，采用质量比浓度为0.1％的秋水仙素浸泡灌根处理8h使得染色体加倍，从表3可以看出，不同基因型单倍体试管苗加倍率亦不相同，其中N20与N32加倍率差异不大，分别为64.4％和59.5，而N30的加倍率为32.9％，与前两者差异显著。

            表3  三种基因型单倍体试管苗加倍情况

基因型代号	暑绿(N20)	黄帮(N30)	乌塌菜(N32)
				成苗数(棵)加倍数(棵)加倍率(％)	593864.4	2076832.9	35821359.5

Claims (2)

1.一种不结球白菜游离小孢子培养技术，包括：

取材：选取处于单核晚期至双核早期的干净无污染花蕾，将花蕾保湿置于4℃冰箱中保存；

消毒：选取花蕾用75％的酒精消毒30s，然后用质量比为0.1％的HgCl₂消毒5min，最后用无菌水冲洗3次待用；

接种：把消毒后的花蕾置于离心管中加入B5液体培养基用玻璃棒轻轻挤压使小孢子游离出来，用400目虑网过滤，然后800rpm离心5min，弃上清，重复3次，最后加入NLN液体培养基，使小孢子密度达到1×10^5-6个/ml，获得小孢子悬浮液；

高温诱导：把小孢子悬浮液分装于培养皿中，立即置于35℃高温下黑暗处理24～48h；

暗培养：将上述高温诱导处理后的小孢子悬浮液置于25℃黑暗条件下培养，15～20d后可以看到有胚状体出现；

植株再生与继代培养：胚状体生长15d以后，挑选子叶型胚转于生芽培养基中培养，25d以后，转于生根培养基中生根；

移栽：生根的试管苗移栽于营养钵中练苗，经过练苗以后，定植于大田；

染色体加倍：采用在上述生芽培养基、生根培养基中分别加入质量比浓度为0.1％的秋水仙素处理使得染色体加倍，或者在移栽时采用质量比浓度为0.1％的秋水仙素浸泡幼根处理8h使得染色体加倍。

2、根据权利要求1所述一种不结球白菜游离小孢子培养技术，其特征在于，接种所用NLN液体培养基含有质量比为13％的蔗糖。