CN100425125C - 一种紫菜快速育种的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种紫菜快速育种的方法，它通过根据繁殖类型来选择紫菜叶片材料，以排除遗传干扰这一关键步骤，并通过无菌处理和酶解，获得单细胞或原生质体，然后将单细胞或原生质体挑出置于灭菌处理过的96孔酶标板或培养板，培养并诱导该单细胞或原生质体发生染色体自然加倍，形成纯和的二倍体细胞，并发育成丝状体，再按照常规方法诱导所获得的丝状体形成壳孢子囊枝，诱导并放散壳孢子，再形成叶状体，根据性状指标和分子标记，筛选优良样本，利用筛选的优良样本，即可获得具有所需性状的可稳定遗传的紫菜新品种；利用该方法获得的新品种完全纯和，后代不发生孟德尔分离，完全体现亲本性状，是真正遗传学和育种学上的纯系。

Description

一种紫菜快速育种的方法

技术领域

本发明涉及一种紫菜育种的方法，尤其是涉及一种紫菜快速育种的方法。

背景技术

人工栽培的紫菜如同陆地上种植的小麦、水稻和玉米一样，也是一种作物，虽然栽培历史相对短暂，但人工栽培紫菜等海藻产出投入比远高于一般的传统农业。紫菜是目前世界上经济价值最高的一种栽培海藻，其产值约占全世界人工栽培海藻的总产值的三分之二。紫菜的育种，就是如何选育出具有优良叶状体性状的适宜品种，即能够在同样的海况条件和栽培技术条件下获得更高产量和质量的优良品系。这种优良性状必须具有稳定的遗传性，并需经过生产实践的反复检验才能够得到确认。育种是海洋藻类生产的核心，也是当前海洋农业科学发展的前沿，对推动整个产业的发展意义重大。

紫菜生活史由配子体世代--叶状体(n)和孢子体世代--丝状体(2n)组成。叶状体成熟后产生雌雄生殖器官果胞(n)及精子囊器。精子(n)放散后使果胞细胞受精，成为受精果胞(2n)，经有丝分裂形成果胞子。果胞子脱离藻体钻入石质基质中(自然条件下多为贝壳)，萌发成丝状体。丝状体是紫菜的渡夏形式。丝状体发育一段时间，经过壳孢子囊枝、双分孢子等阶段，分裂产生壳孢子。秋季气温骤降，壳孢子放散，附着于自然或人工生长基上萌发成叶状体(n)幼苗。在从丝状体到叶状体的过程中发生减数分裂，但是其具体发生位置仍存在争议。除有性生殖外，紫菜还有单孢子、无配孢子、内生孢子等多种无性生殖方式。

每年从自然种群或栽培群体中优选具有优良性状的紫菜成熟藻体作为种藻，再由种藻取得果孢子或者采用腐烂法、分块法或酶解后组织块培养的方式获得目标样本的丝状体，接种贝壳，大量培养贝壳丝状体，是目前紫菜育种中最常用且传统的方法。奈良轮条斑紫菜和大叶甘紫菜就是由日本生产者在多年的生产中优选出来并有藻类学家确认的。后来紫菜生产发展到一定阶段，对于产品的质量、色泽、味道和香味等提出了更高的要求。日本利用杂交方法从两个条斑紫菜的色素突变体得到子一代叶状体，从中选取重组的野生型细胞组织、培育出一种更好的紫菜品系“晓光号”，并在生产上应用。有关紫菜抗逆性育种工作也正在开展。这种方法得到的果孢子(2n)往往是群体自然受精的结果，实际上是一个群体遗传物质的集合，群体中等位基因高度杂合，通过减数分裂形成壳孢子，发育成叶状体(n)就会发生性状分离，仍旧难以实现稳定和高度一致的良种化栽培。

90年代起，科学家开始利用紫菜营养细胞进行苗种生产试验，在方宗熙、戴继勋，唐延林等《紫菜细胞的酶法分离和在水产养殖中的应用》(海洋科学，1986，10(3)：46-47)及专利号分别为：85104059、91107320、和96116039.X的中国专利文献中有相关的报道。但是该过程仅从营养体到营养体，严格意义上讲只是种苗生产的一种先进方式。由于紫菜叶状体多为嵌合体，而且在生产中难以控制异体受精，所以不能保证自体繁殖二代的种系纯和与稳定。

到目前为止，我国栽培紫菜，除近年从日本引进的几个试养品种外，基本上仍属于未经遗传改良的自然群体。对紫菜进行的遗传学及分子生物学研究表明，紫菜的遗传多样性水平较高，等位基因非常丰富，参见贾建航，王萍，金德敏等.《RAPD标记在紫菜遗传多样性检测和种质鉴定中的应用》(植物学报，2000，42(4)：403-407)和杨锐，刘必谦，骆其君等.《坛紫菜的扩增片段长度多态性(AFLP)》(高技术通讯2002，1：83-86)。而且，由于生产性贝壳丝状体培养大都分散进行，难以保证原种的纯度，参见费修绠《紫菜的苗种生物学基础》(曾呈奎主编：《经济海藻种质种苗生物学》，山东科技出版社，pp153：50-90，ISBN 7-5331-2145-7，1999)。此外，作物的遗传选育至一个新品系的形成都需要经过漫长的筛选、繁育、验证、纯化、保种等过程。这些问题给紫菜遗传育种与种质保存带来了难度。

专利号为03141442的中国发明专利公开了一种坛紫菜良种选育方法，通过化学或物理人工诱变法获得坛紫菜的变异细胞，用生物工具酶将变异细胞单个分离并将其培养成完整叶状体。依据叶状体的主要光合色素和色素蛋白质含量的高低和它们相互间的比值，游离氨基酸含量高低，生长速度，藻体的厚薄和色泽等指标，筛选出优良突变体叶状体，并将它们再次酶解获得单离体细胞进行再生培养。将获得的幼小叶状体单个分离，培养至大叶状体，利用单性生殖获得纯系丝状体。优良品系的纯系丝状体的F1代叶状体，其优良性状经遗传稳定性分析和综合品质测定后，对优良品系的纯系自由丝状体进行扩增培养，并移植于贝壳内使之成为贝壳丝状体，随后，进行用贝壳丝状体进行大田采苗和养殖试验。经大田试验证明为性状稳定的优良品系，以自由丝状体的方式进行长期保存和推广应用。该发明与现有紫菜大田良种选育技术相比，具良种选育速度快，选育面广，获得品系纯，优良性状稳定，良种保存和使用方便等优点。但该发明的方法也需要在2～3年的时间内才能获得可被生产使用的优良品系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种紫菜快速育种的方法，它利用紫菜细胞发育的特点，迅速完成从原始材料到将育种目标落实到具体性状上的过程，可获得稳定的紫菜遗传种质，并大大缩短紫菜育种的时间、简化育种过程。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种紫菜快速育种的方法，其特征在于它包括以下步骤：1)根据繁殖类型来选择紫菜叶片材料，以排除遗传干扰：紫菜叶片材料为雌雄异体的紫菜类型，最好选取雄叶片；紫菜叶片材料为雌雄分区分布形式，则可采用雄性部分，或基部未分化区域；紫菜叶片材料为雌雄间或分布，则应选取未成熟叶片；2)对选择出的紫菜叶片材料，采用日光暴晒法、洗刷法清除杂藻，并结合碘化钾浸泡经抗生素进行无菌处理，然后利用酶解法将上述紫菜叶片材料进行酶解，获得单细胞或原生质体；3)将单细胞或原生质体挑出置于灭菌处理过的96孔酶标板或培养板，培养并诱导该单细胞或原生质体发生染色体自然加倍，形成纯和的二倍体细胞，并发育成丝状体；4)按照常规方法诱导所获得的丝状体形成壳孢子囊枝，诱导并放散壳孢子，再形成叶状体；5)根据性状指标和分子标记，筛选优良样本；6)利用筛选的优良样本，重复步骤1)和步骤2)，获得具有所需性状的可稳定遗传的紫菜种苗新品种。

步骤4)中诱导形成壳孢子后，也可将待选幼苗隔离培养，以进一步排除遗传干扰，避免遗传混杂。

在步骤4)获得叶片的基础上，还可以再通过物理化学诱导、转基因操作等诱变育种的方法，并重复步骤1)至步骤5)。

步骤5)中的性状指标包括：抗逆性指标过氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)、过氧化物酶(POD)及抗性相关酶组成与含量、细胞膜脂肪酸成分与含量、游离氨基酸以及藻体蛋白质成分与含量、光合作用效率，生产性指标包括：藻体色泽、厚度、得菜率、成熟时间和特殊营养成分含量，分子标记包括：随机扩增片段多态性(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、简单重复序列(SSR)、单链构象多态性(SSCP)、单核苷酸多态性(SNP)、和序列特征扩增区域(SCAR)等及其他相关分子标记。

与现有技术相比，本发明的优点在于：1)严格筛选起始材料，排除了遗传杂合干扰；本发明方法建立在紫菜单细胞无性繁殖的基础上，针对繁殖方式不同的紫菜类形分别采取以未经遗传分化叶片的体细胞的或者典型的雄性叶片(或区域)中的体细胞(n)为起始材料，通过分离单细胞或原生质体隔离培养，诱导染色体加倍形成丝状孢子体(2n)，尽量避免使用雌性部分，并排除可能因为偶然发生异体受精造成所获得丝状体杂和的情况，确保基因组纯和，保证在以后的繁殖中性状不分离，培育出遗传学和育种学意义上的纯系，能够满足紫菜遗传育种对原初基础材料的需求；2)育种周期短；该发明仅通过两次诱导加倍技术，即可获得稳定遗传的种质，不仅快速排除因为原初材料多种性状杂和不利于筛选的困难，而且能减少性状稳定遗传所需要的子代数，将性状迅速固定在新纯系，而且由于基因完全纯和，所以所得种质在推广过程中也不会发生分离，完全保留优良性状，从而大大加快紫菜纯系育种的进程，传统大田良种选育周期长达5年，专利03141442的育种周期需要2-3年，本发明获得稳定遗传种系的时间仅需要二代时间，即1年内可完成多个筛选周期，经济效益和社会效益都将十分明显；3)快速制备遗传育种的初始材料，应用广泛；本发明不仅适用于野生样本、已有栽培样本、还适用于利用物理化学方法诱导、转基因操作产生的新紫菜样本，而且本发明中物理化学诱导、转基因操作都是建立在一次纯系制备的基础之上，可以排除多基因杂合造成的干扰，使得诱导性状和转基因性状的显现背景更加均一和清晰，无论是进行育种和其他生物学研究都具有较大优势。利用本发明的方法获得的新品种完全纯和，后代不发生孟德尔分离，完全体现亲本性状，是真正遗传学和育种学上的纯系。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

对XSKC-M-50、XSKC-M-51、XSKC-M-52、XSKC-M-53四个利用本发明方法置备的坛紫菜纯系，进行快速育种的实验，其过程包括下列步骤：

1)取雄性坛紫菜叶片，将边缘部分切除，取中心未成熟区域，利用日光暴晒法、清洗法清除杂藻，用0.7％碘化钾溶液和1％青霉素溶液分别浸泡10分钟，用消毒海水多次冲洗，备无菌操作使用，在灭菌EPPENDORF管(一种专用试管)中将其剪碎为1mm²左右小片；

2)利用1％海螺酶，用NaCl和葡萄糖调整渗透压分别为1.5mol/L和2mol/L，将步骤1)处理的样品于20℃酶解，在显微镜下，将获得的单细胞或原生质体用毛细玻璃针挑出，置于灭菌96孔酶标板或培养板上于光照培养箱中隔离培养，培养液为：加营养盐海水，其中含N-4ppm、P-0.4ppm，开始一周培养条件为20℃左右、光强1500lux、光周期L∶D＝12∶12；然后加营养盐海水，其中含N-4ppm、P-0.8ppm，培养条件为20℃左右、光强1500lux、光周期L∶D＝14∶10，培养单倍的叶状体单细胞或者原生质体发育形成丝状体；

3)在26℃，光强1500lux、光周期L∶D＝8∶16，诱导2)所获得的丝状体形成壳孢子囊枝，诱导并放散壳孢子，形成——XSKC-M-5系列叶状体，由于来自坛紫菜雄性叶片，肯定不会出现异体受精情况，得到的必为纯和丝状体，后代不发生分离；叶状体培养无需隔离培养；

4)经过对几个坛紫菜纯系分别进行上述的培养步骤后，得到各自的叶状体，以HML、农户自备种二个生产用坛紫菜系为对照，检测各个坛紫菜系的叶状体生长指标，得到如表1所示的结果。对这些叶状体进行耐高温实验，实验温度分别为：18℃、22℃、25℃、28℃、35℃。当培养温度超过适温20℃后，随着温度升高，各个品系的耐热性能有很大的差别。综合各个品系在25℃、28℃、35℃的表现为参照，其耐热性能由强到弱的顺序是XSKC-M-52、XSKC-M-51、HML、自备种、XSKC-M-53、XSKC-M-50；对这些品系进行热激后，观察总蛋白含量和成分变化，二天内XSKC-M-51的过氧化物歧化酶(SOD)的活性较大，可见该纯系对温度的影响产生的应激反应速度较快；总体来看各坛紫菜系的生理生化变化都是从低到高然后再降低的一个过程，一般在第三和第四天出现一个峰值，可见此时酶活性最大，藻体耐热性也最强；用上海生工的随机引物(产品编号：s-206、s-207、s-214、s-220、s-226、s-230、s-235、s-236、s-237、s-243、s-246、s-248等)对各个坛紫菜系DNA样品进行了随机扩增片段多态性研究，获得各个系的特征性指纹图谱(见表2)；表2中1-6分别为：XSKC-M-50、XSKC-M-51、XSKC-M-52、XSKC-M-53、HML和自备种。

5)利用经步骤4)筛选的优良样本XSKC-M-52、XSKC-M-51，重复步骤1)和步骤2)就获得具有所需耐热性状的可稳定遗传的新品种。用分子标记进行检验得知，利用该方法制备的XSKC-M-52，XSKC-M-51是具有较好耐热性的紫菜纯系。

表1各个坛紫菜系的生长指标

	1	2	3	4	5	6
								XSKC-M-50	XSKC-M-51	XSKC-M-52	XSKC-M-53	HML	自备种
个体数(个)	36	34	30	31	32	49
							长(cm)	15.36±4.19	11.35±3.73	14.66±6.29	17.39±5.04	10.84±3.41	15.88±5.32
宽(cm)	2.93±1.64	1.84±1.06	2.15±1.13	2.79±1.13	4.03±1.91	1.67±1.14
							平均鲜重(mg)	526.11	128.53	250.67	337.00	296.25	156.55
平均干重(mg)	15.32	3.89	8.09	10.52	9.26	3.20
							干/鲜重(％)	2.86	3.03	3.23	3.13	3.13	2.04
性状特征	生长迅速易老化	生长较快品质较好	生长较快品质较好	生长较快品质较好	生长快产量高	混杂个体差异大

表2：6个坛紫菜系特异性标记的指纹图谱

特异性标记	1	2	3	4	5	6
							s-206(1868)	0	0	0	0	1	0
s-207(1311)	0	0	0	0	1	0
							s-230(4998)	0	1	0	0	0	0
s-230(2034)	0	1	0	0	0	0
							s-230(1394)	0	0	0	0	0	1
s-220(1839)	0		0	1	0	0
							s-236(1520)	1	0	0	0	0	0
s-246(2901)	0	0	1	0	0	0
							s-248(1264)	0	0	0	0	0	1
s-235(4417)	0	0	0	0	0	1
							s-235(1429)	0	0	0	0	0	1
s-243(3774)	0	0	0	0	0	1

Claims (3)

1、一种紫菜快速育种的方法，其特征在于它包括以下步骤：1)根据繁殖类型来选择紫菜叶片材料，以排除遗传干扰：紫菜叶片材料为雌雄异体的紫菜类型，选取雄叶片；紫菜叶片材料为雌雄分区分布形式，则采用雄性部分或基部未分化区域；紫菜叶片材料为雌雄间或分布，则选取未成熟叶片；2)对选择出的紫菜叶片材料，采用日光暴晒法和洗刷法清除杂藻，用碘化钾溶液和青霉素溶液分别浸泡10分钟，用消毒海水冲洗，然后利用1％海螺酶将上述紫菜叶片材料进行酶解，获得单细胞或原生质体；3)将单细胞或原生质体挑出置于灭菌处理过的96孔酶标板或灭菌处理过的培养板上隔离培养，培养并诱导单细胞或原生质体发生染色体自然加倍，形成纯和的二倍体细胞，并发育成丝状体；4)按照常规方法诱导所获得的丝状体形成壳孢子囊枝，诱导并放散壳孢子，再形成叶状体；5)根据性状指标和分子标记，筛选具有所需性状的优良样本；6)利用筛选的样本，重复步骤1)和步骤2)，进一步获得具有所需性状的稳定遗传的紫菜种苗新品种。

2、如权利要求1所述的紫菜快速育种的方法，其特征在于步骤4)中诱导形成壳孢子后，将待选幼苗隔离培养，以进一步排除遗传干扰，避免遗传混杂。

3、如权利要求1所述的紫菜快速育种的方法，其特征在于步骤5)中的性状指标指：(1)抗逆性指标：过氧化物歧化酶、酯酶和过氧化物酶的组成与含量，(2)细胞膜脂肪酸、游离氨基酸和藻体蛋白质的成分与含量，(3)光合作用效率和，(4)生产性指标：藻体色泽、厚度、得菜率和成熟时间；分子标记指：随机扩增片段多态性、扩增片段长度多态性、简单重复序列、单链构象多态性、单核苷酸多态性和序列特征扩增区域。