CN103602657B - Eat1基因的应用及恢复eat1基因缺失导致水稻雄性不育的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物工程技术领域中EAT1基因的应用及恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法；所述的EAT1基因编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸，所述的应用是：通过基因变异或抑制表达获得水稻雄性不育株系并可以用来生产种子；本发明还涉及一种恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法，通过引物扩增EAT1基因，使用遗传转化手段转化突变体植株，能够使得突变体恢复到野生型表型。本发明获得的水稻突变体营养生长阶段没有任何异常，但纯合体植株完全不育。如果应用于杂交育种中，可以免除母本去雄的工作，大大提高生产效率，降低人工成本，在农业生产上具有重要的应用。

Description

EAT1基因的应用及恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法

本申请是申请号为201210223656.0，申请日为2012.6.29，发明名称为《水稻雄性不育株系创制的方法及其用途》的分案申请。

技术领域

本发明涉及的是一种生物工程技术领域中的水稻株系创制的方法，具体是一种EAT1基因的应用及恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一，更是我国最重要的粮食作物。中国是世界上最大的稻米生产国和消费国，约有60%以上的国人以稻米为主食。我国水稻年播种面积超过3000万公顷，占世界的20%，占全国粮食作物播种面积的30％；2011年，水稻总产量1.987亿吨，占粮食总产量的42％，单位面积产量比所有粮食作物平均单产高出45％以上；单位面积产量6.35吨/公顷，比全球平均产量3.85吨/公顷高65%。其中一个重要因素就是杂交水稻的广泛种植。

雄性不育系：是指一种雄性退化（主要是花粉退化）但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于三系法品种间杂交优势利用的范畴，这种三系杂交稻一般要比常规水稻增产20%左右，当前仍处于方兴未艾时期。但是，三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限制，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，以期扩展细胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。

发明内容

本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种EAT1基因的应用及恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法；本发明利用EAT1基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。

本发明是通过以下的技术方案实现的，

第一发明，本发明涉及一种EAT1基因的应用，所述的EAT1基因编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸，所述的应用是：通过RNAi抑制EAT1基因表达从而获得水稻雄性不育株系，并用所述水稻雄性不育株系来生产种子。

第二方面，本发明还涉及一种恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法，通过引物扩增EAT1基因，使用遗传转化手段转化突变体植株，能够使得突变体恢复到野生型表型；所述的EAT1基因编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸；

所述方法包括如下步骤：

将含EAT1互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EAT1互补构建含有编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；具体包括如下步骤：

(a)提供携带表达EAT1互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；

(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(c)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。

本发明具有如下的有益效果：本发明通过控制水稻HLH结构域的转录因子EAT1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。

附图说明

图1为pHB载体及EAT1干扰构建示意图。

图2为eat1突变体植株的形态学观察示意图。

图3为互补突变体得到野生型表型示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所述EAT1基因为编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的核苷酸序列。

实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法

1.1通过基因工程或其他手段创制eat1水稻雄性不育株系

本实施例中EAT1基因的编码区序列如SEQ ID NO.3所示。本实施例的eat1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号（又名9522）经过对EAT1基因的RNA干扰或者序列变异获得。

1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆

利用发明人构建的包含育性控制蛋白基因EAT1及其突变基因eat1组成的、本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆(map-based cloning或position cloning)群体，按分子标记定位于1个小的基因组片段内，例如100Kb内。在此基础上，用常规方法分离包含该片段的基因组DNA克隆。经测序和进一步的杂交鉴定确定其中一个含完整水稻雄性生殖发育控制蛋白EAT1。

经全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性EAT1基因全长为3433bp（SEQ ID NO.6，包含调控区和内含子）。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQ ID NO.2所示，编码全长为464个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其序列如SEQ ID NO.3所示。

1.3水稻育性控制蛋白基因的点突变

本实施例的eat1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号（又名9522）经过对EAT1基因的序列变异获得，经过对EAT1突变基因eat1的序列比较，水稻雄性生殖发育控制蛋白的移码和提前终止会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育；本实施例EAT1突变基因是在编码区的2个碱基对缺失（其序列如SEQ ID NO.4所示）引起水稻雄性生殖发育控制蛋白翻译得提前终止和功能丧失。

1.4通过RNAi手段降低水稻品种中的EAT1的表达水平 

为了对EAT1蛋白进行应用，构建了EAT1基因RNAi的载体，并转化野生型9522植株，以期降低EAT1的表达，从而达到改变水稻育性的目的。

从水稻cDNA克隆（EAT1_EST clone）中用引物

EAT1-Ri-F:5’AAGAGCTCGAATTCCCACCTTCAACATCAACTAGA3’和

EAT1-Ri-R:5’AAACTAGTCTGCAGCAATAATCACATCTCGTTCGT3’

扩增出EAT1基因编码区序列的第197位至第688位共491bp的特异性片段；将这 个片段分别通过EcoRI/PstI和SacI/SpeI正反向插入连入加入含有水稻Intron序列的pBluescript SK载体；测序验证正确，再用EcoRI和SpeI酶切切下含有EAT1正反向特异性片段和Intron和片段，连入经同样酶切的pHB载体中(图1)。再次测序检验核苷酸序列是否正确，成功构建pHB-EAT1-RNAi质粒。

将含有EAT1基因RNA干扰构建的农杆菌在含有Kan（50μg/μl）的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1%接种量转接入50ml含抗生素的AB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD₆₀₀为0.6至0.8左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、4离心5分钟，收集并重悬于1/3体积的AAM液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。

本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼胚愈伤。取授粉后12-15天的9522未成熟种子经70%乙醇浸泡1分钟后，于NaClO溶液中（与水1:3混合，加2-3滴吐温20）消毒90分钟以上，用无菌水冲洗4-5次，然后用解剖刀和镊子挑出幼胚并接种月N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，4天后可用于转化。将幼胚愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μM。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有25mg/L Hyg的选择培养基上进行选择培养。7-12天后将抗性愈伤组织转到含有50mg/L Hyg的选择培养基上继续筛选。10-12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上培养一周左右，再移至分化培养基上分化(12小时光照/天)。再生的小苗在1/2MS₀H培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。

获得的再生植株移栽成活后以除草剂再次筛选转化植株；阳性植株提取叶片总DNA，经PCR进一步鉴定转化植株。RT-PCR分析阳性植株中EAT1基因的表达水平，表达水平降低到野生型20%以下为有效RNA干扰植株。

1.5EAT1蛋白活性丧失或表达水平导致水稻雄性发育异常

对eat1突变体植株的形态学观察。如图2，野生型和突变型eat1的表型对比显示，野生型花药发育成熟期花药呈黄色（B），其中含有丰富的淀粉粒可被I₂/KI染成蓝色（A，B，C），而eat1突变型花药较野生型略小，呈淡黄色；与野生型花药成熟期相对应的时期已经几乎观察不到花粉粒，剖开药室腔只能看到少数退化的小孢子残留物，更无法被I₂/KI着色。

1.6EAT1表达特征

利用eat1突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定EAT1基因的表达模式（如图3），发现EAT1基因在水稻雄性生殖发育时期有着广泛且显著的表达；除此之外，营养发育过程中的根、茎和叶中也有极微弱的表达。

1.7EAT1基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用

将eat1突变体与籼稻品种9311、龙特甫或广陆矮4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明EAT1基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。

实施例2eat1突变体在水稻制种中的用途

将eat1突变体作为父本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将该植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育不育系，适宜作为杂交组合中的母本。

实施例3恢复eat1突变体雄性不育性状的方法

将编码EAT1基因的基因组核苷酸序列转入突变体eat1植株，能够使突变体恢复到野生型表型。

从水稻日本晴BAC克隆(OSJNba0093F12)中用引物：

EAT1-COM-F:5’AAAAGTCGACCCGAACTGCCGTCTTAATGT3’和

EAT1-COM-R:5’AAAAGGTGACCGCAGTGACCAGATTGAGATAAC3’

扩增出EAT1基因的5225bp的基因组序列片段。

将该片段通过SalI和BstEII插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌EHA105，得到EAT1互补根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105，使用遗传转化手段转化突变体eat1和野生型9522成熟胚愈伤，以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。T₀代获得互补植株，T₀代互补植株可以产生花粉，并被I₂/KI染色，即表现出的野生型表型。

综上所述，本发明通过控制水稻HLH结构域的转录因子EAT1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常、花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。

Claims (2)

1.一种EAT1基因的应用，其特征在于，所述的EAT1基因编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸，所述的应用是：通过RNAi抑制EAT1基因表达从而获得水稻雄性不育株系，并用所述水稻雄性不育株系来生产种子。

2.一种恢复EAT1基因缺失导致水稻雄性不育的方法，其特征在于，通过引物扩增EAT1基因，使用遗传转化手段转化突变体植株，能够使得突变体恢复到野生型表型；

所述的EAT1基因编码如SEQ ID NO.3所示的氨基酸；

所述方法包括如下步骤：

将含EAT1互补构建的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中EAT1互补构建含有编码如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；具体包括如下步骤：

(a)提供携带表达EAT1互补构建载体的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105；

(b)将水稻细胞或组织或器官与步骤(a)中的农杆菌接触，从而使编码如SEQ ID NO.3所示氨基酸的核苷酸转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；

(c)选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，再生，获得水稻植株。