CN105063083B - 防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括：步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后将F1代植株作为父本与转基因株系杂交得到F2代，从F2代中筛选含有外源报告基因的杂合株系即为所需水稻工程保持系，其中，纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为育性调控基因的突变体株系。本发明还公开了防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用。

Description

防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法及其应用

技术领域

本发明涉及防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法及其应用。

背景技术

水稻杂种优势利用是提高水稻产量最有效的途径。“三系法”杂交水稻对种质资源利用率低以及“两系法”杂交水稻杂交制种安全性约束是影响杂交水稻种植推广面积进一步扩大的重要因素。发明新的育种技术，开发出对种质资源利用率高、杂交制种安全的水稻杂种优势利用方法是杂交水稻发展的方向。普通隐性核不育材料不育性稳定、杂交制种安全，易于配制高产、优质、多抗组合；共同的缺点是无法实现不育系种子的批量繁殖。

针对隐性核雄性不育材料的繁殖问题，育种家也先后提出多种解决方案，主要包括：(1)根据雄性不育机理，通过施加缺失的代谢中间物质(如氨基酸、黄酮、脂肪酸等物质)，使突变不育株恢复育性而得以繁殖；(2)在雄性不育株中，利用条件控制(如诱导性)启动子驱动育性恢复基因表达，给予适合的启动子表达条件时，育性恢复基因表达，育性恢复而得以繁殖；而不给予适合启动子表达的条件时，育性恢复基因不表达，即为不育系。此外，也可以利用条件控制启动子驱动作物内源育性基因的抑制因子表达而达到上述同样的目的。以上这些方案在不同作物的实际生产中得到了不同程度的应用，但由于不育系的育性转换不能被完全精确地控制，或者不育系中含有转基因成分并因而造成杂交种中含有转基因等问题，都没有得到广泛的应用。

随着分子设计育种思想和技术的进步，开发能够精确控制的不带转基因成分的不育系的繁殖技术，成为分子设计杂交育种技术领域亟需解决的问题。1993年6月11日，国外生物技术公司PLANT GENETIC SYSTEM提出了一项PCT专利申请，该专利提出以下技术思想：在隐性雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因、花粉致死(败育)基因以及筛选标记基因(如荧光蛋白基因)三套元件，可以获得该雄性不育植株的保持系，保持系通过自交就可以实现不育系和保持系的繁殖。2002年，Perez-Prat等人提出，可以通过在纯合的雄性不育植株中导入连锁表达的育性恢复基因和筛选标记基因两套元件，由此获得该雄性不育植株的保持系，保持系与不育株杂交即可繁殖不育系和保持系。两种方法提出了利用精确的分子生物技术手段，解决隐性核雄性不育基因及不育材料的应用问题，为开展分子设计杂交育种提供了技术框架。相比较而言，三元件系统考虑到花粉逃逸和转基因生态风险的问题，较双元件系统思路更加缜密。2006年，美国杜邦先锋公司在三元件系统技术思路基础上，首先在玉米中实现了基于核不育突变材料的种子生产技术，并命名为Seed ProductionTechnology(SPT)技术。2010年9月，在中国科技部“国家高技术研究发展计划”的支持下，三元件系统技术思想在水稻中得到了证实和应用，并被称之为“智能不育杂交育种技术”或“第三代杂交水稻技术”。通过项目的实施，将有力推动智能不育分子设计技术在作物育种中的研究应用，使我国在水稻杂交育种领域继续保持国际领先优势，为促进生物育种产业的发展提供技术和产品支持。

从思路上来说，SPT技术几乎完美，既可以实现普通核不育系的繁殖，又可以消除人们对于转基因风险的担忧，因为杂交后代植株中没有外源的转基因元件，不存在转基因生物安全问题。但是在实际操作过程中会遇到以下几个问题：(1)转化受体取材受到限制，因为互补载体要转化到不育植株中去，因此只有选择不育水稻植株的幼穗诱导愈伤组织；取材受到很大限制，并且有效取材时间很短；(2)育性恢复基因的导入对突变不育株的表型恢复并不十分理想，对于后续的制种产量影响很大。原因可能与载体序列在受体基因组上的插入位点有关，侧翼序列的特征对育性恢复基因的表达水平可能会有影响。

发明内容

本发明的一个目的克服现有技术的不足，并提供至少后面将说明的优点。

针对存在的问题，我们对SPT技术进行了思路创新，利用最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统将筛选报告基因(红色荧光蛋白基因，DsRed)表达元件和花粉致死基因(ZmAA1)表达元件定点插入到育性调控基因的侧翼序列，实现育性恢复基因和筛选报告基因、花粉致死基因的紧密连锁。

本发明另一个目的是提供一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，本发明通过CRISPR/Cas9系统将外源报告基因和花粉致死基因整合到野生型水稻的染色体上，解决了转化受体材料受限制的问题、避免了以前转基因的随机整合位点导致的目的基因表达的不确定性、及花粉逃逸和转基因生态风险的问题。

本发明还有一个目的提供防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，本发明的防止基因漂移的水稻工程保持系可用于水稻普通隐性雄性核不育系繁殖中，并且能够避免花粉逃逸和转基因生态风险的问题，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。

为此，本发明提供的技术方案为：

一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括：

步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAA1与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后再取F1代植株作为父本与步骤一中得到的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，在所述步骤二之后还包括：

步骤三、将步骤二中得到的水稻工程保持系自交，以生产水稻普通雄性核不育株系种子和水稻工程保持系种子。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆方法确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述步骤一中，获得含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系的具体方法包括：

1.1分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’-GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’

下游序列：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；

1.2利用CRISPR/Cas9系统将步骤1.1中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

1.3将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1均构建到植物表达载体上得到重组表达载体；

1.4将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；

1.5针对育性调控基因设计一对能够扩增出包含育性调控基因突变位点在内的PCR产物的检测引物，利用该一对检测引物，以表达外源报告基因的转基因植株基因组作为模板进行扩增，若检测到育性调控基因位点为杂合型，则判定该植株为所述水稻工程保持系植株。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述步骤1.3中，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的启动子为水稻胚乳特异性启动子Gt1，其碱基序列如SEQ ID NO.7所示，

所述花粉致死基因ZmAA1的启动子为Pg47启动子，碱基序列如SEQ ID NO.12所示。

较优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述步骤1.5中，所述检测引物的序列为：

上游引物：5’-TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3’

下游引物：5’-CCAACACCAATAATCACATCTCG-3’。

较优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述步骤1.1中的引物序列为：

上游序列：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’

下游序列：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

优选的是，所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法中，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法获得。

本发明至少包括以下有益效果：

本发明通过CRISPR/Cas9系统以普通野生型水稻为转化受体，取材不受限制，外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因、筛选报告基因和花粉致死基因的表达，花粉致死基因表现为雄配子致死，只有带有致死基因片段的配子才会不育，致死基因和报告基因连锁定点整合到育性调控基因的侧翼序列，既可以给育性基因的传递提供荧光线索，又可以保证带有转基因片段的花粉不会逃逸到环境中，以免产生生态污染。避免转基因生态安全风险的存在。

本发明的防止基因漂移的水稻工程保持系通过自交即可产生普通隐性雄性核不育系和保持系种子，在不育系种子的生产中，成本更低、产量也更大。用于水稻育种中，培育后的水稻工程保持系产品可机械化、规模化应用于水稻普通核不育系的繁殖制种中，且过程简单、操作方便。

定义

为了便于理解本发明，定义了大量术语和短语

本发明中的“反向互补”，指通过碱基配对原则关联的核苷酸序列。例如，序列“5’-A-T-G-3’”与序列“5’-C-A-T-3’”反向互补。

术语“基因”是指一种DNA分子，基因是遗传变异的主要物质，是控制生物性状的基本遗传单位，基因中编码RNA或蛋白质的碱基序列成为结构基因，本发明中所称的基因为结构基因。

“野生型基因”是指一种从来源中分离的基因，本发明的“野生型基因”是首先利用水稻不育突变体通过图位克隆方法得到突变基因的位置，然后从水稻野生型中获得该位置处的对应的基因的序列，即为“野生型基因”。而“突变的基因”是指一种基因，与“野生型基因”相比，其具有序列和/或功能性质的修饰(即改变的特征)。

“等位基因”一般指位于一对同源染色体的相同位置上控制着相对性状的一对基因。它可能出现在染色体某特定座位上的两个或多个基因中的一个。本发明中的纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中的育性调控基因与野生型水稻中的育性调控基因为等位基因。

“载体”是指能够转运与其连接的另一个核酸的核酸分子，一种类型的载体是“质粒”，质粒是其他的DNA片段可与其连接的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其可将其他的DNA片段连接至病毒基因组。某些载体整合至宿主细胞基因组中，并得以与宿主基因组一起复制。并且，某些载体能指导与其可操作连接的基因的表达，一般使用的这样的表达载体为质粒形式。在本发明中，可交互使用“质粒”和“载体”。

“重组载体”是指已连接了基因的表达载体。在本发明中，可交互使用“重组质粒”和“重组载体”。

引物，又名引子。是一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链，在引物的3’-OH上，核苷酸以二酯链形式进行合成，因此引物的3’-OH，必须是游离的。之所以需要引物是因为在DNA合成中DNA聚合酶仅仅可以把新的核苷酸加到已有的DNA链上。引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。DNA上携带有编码蛋白质氨基酸信息的核苷酸序列的链称为正义链，又称编码链。另一条链核苷酸序列与正义链互补，称为反义链。一般将与正义链互补的一个引物成为上游引物，与反义链互补的一个引物称为下游引物。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为本发明其中一个实施例中防止基因漂移的水稻工程保持系的构建过程原理流程图。

图2为CRISPR/Cas9系统中的pP1C.2载体的质粒图谱。

图3为CRISPR/Cas9系统中的pP1C.1载体的质粒图谱。

图4为pJIT163-hGFP载体的质粒图谱。

图5为pSB130M载体的质粒图谱。

图6为转基因水稻PCR产物检测凝胶电泳图，其中T为转基因株系的扩增结果，CK为阳性对照。

图7(a)为转基因株系的稻穗照片。

图7(b)为转基因水稻种子的照片。

图8(a)为本发明其中一个实施例中有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系的一次花粉碘染实验中的部分结果图。

图8(b)为本发明其中一个实施例中有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系的又一次花粉碘染实验中的部分结果图。

图9为本发明其中一个实施例中只转入了外源报告基因的单基因系统的种子生产的流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

本发明提供一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，包括：

步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAA1与育性调控基因能够紧密连锁遗传；以及，之后进入步骤二，

步骤二、将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后再取F1代植株作为父本与步骤一中得到的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系。

本发明通过CRISPR/Cas9系统以普通野生型水稻为转化受体，取材不受限制，外源片段的定点整合综合考虑了育性调控基因、筛选报告基因和花粉致死基因的表达，花粉致死基因表现为雄配子致死，只有带有致死基因片段的配子才会不育，致死基因和报告基因连锁定点整合到育性调控基因的侧翼序列，既可以给育性基因的传递提供荧光线索，又可以保证带有转基因片段的花粉不会逃逸到环境中，以免产生生态污染。避免转基因生态安全风险的存在。

作为优选，在所述步骤二之后还包括：

步骤三、将步骤二中得到的水稻工程保持系自交，以生产水稻普通雄性核不育株系种子和水稻工程保持系种子。

作为优选，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。当然，在反向遗传学的研究中，如果已明确了育性调控基因在染色体上的位置，则不需要此步骤。

作为优选，所述步骤一中，本发明利用CRISPR/Cas9系统获得含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，具体方法包括：

1.1分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’-GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’(SEQ ID NO.1)

下游序列：5’-AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’；(SEQ ID NO.2)

1.2利用CRISPR/Cas9系统将步骤1.1中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

1.3将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1均构建到植物表达载体上得到重组表达载体；

1.4将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；

1.5针对育性调控基因设计一对能够扩增出包含育性调控基因突变位点在内的PCR产物的检测引物，利用该一对检测引物，以表达外源报告基因的转基因植株基因组作为模板进行扩增，若检测到扩增PCR产物片段为杂合序列，则判定该植株为所述水稻工程保持系植株。

作为优选，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的启动子为水稻胚乳特异性启动子Gt1，其碱基序列如SEQ ID NO.7所示，

所述花粉致死基因ZmAA1的启动子为Pg47启动子，碱基序列如SEQ ID NO.12所示。

作为优选，在本发明的其中一个实施例中，当该育性调控基因为EAT1基因时，所述步骤1.5中，所述检测引物的序列为：

上游引物：5’-TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3’(SEQ ID NO.14)

下游引物：5’-CCAACACCAATAATCACATCTCG-3’(SEQ ID NO.15)。

作为优选，在本发明的其中一个实施例中，所述育性调控基因为水稻EAT1基因。

作为优选，所述步骤1.1中的引物序列为：

上游序列：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’(SEQ ID NO.3)

下游序列：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO.4)。

作为优选，为便于观察，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、红色荧光蛋白标记基因、绿色荧光蛋白基因、或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，所述水稻工程保持系由任一所述的方法获得。

发明不是针对某一个具体基因的，只要是普通雄性核不育基因都可以采用本发明的方法进行种质创造。如图1所示，本发明采用如下的思路实现：

1)准备纯合隐性水稻普通雄性核不育材料(基因型为aa)，采用图位克隆的方法定位并克隆所述水稻不育系的育性调控基因A(可通过遗传互补试验验证该基因的功能)

2)根据克隆的基因的在水稻基因组上的具体位置，分析该基因上下游的序列，选择设计外源报告基因的整合位点，送公司合成后连接到打靶载体pP1C.1上。整合位点要保证外源报告基因插入后与育性调控基因能紧密连锁，共分离。

3)将荧光筛选标记基因(DsRed)表达元件和花粉致死基因(ZmAA1)表达元件连接到植物表达载体pSB130M(含双T-DNA)上，得到载体pSB130M-DsRed-ZmAA1。筛选报告基因表达元件包括水稻胚乳特异性启动子、荧光基因全长读码框和终止子序列。花粉致死基因(ZmAA1)表达元件包括花粉特异性启动子、花粉致死基因全长读码框和终止子序列

4)采用农杆菌介导转基因方法将打靶载体pP1C.1和供体载体pSB130M-DsRed-ZmAA1共转化到水稻野生型(基因型为AA)中。通过PCR方法筛选到已成功定点整合筛选报告基因和花粉致死基因的转基因植株(基因型为AA^DsRed+ZmAA1)。通过野生型植株(AA)与不育突变体(aa)的杂交，获得F1植株(Aa)，然后作为父本与转基因T0代植株(AA^DsRed+ZmAA1)杂交，F1后代出现四种基因型，分别为(AA)、(Aa)、(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)，其中基因型为(A^DsRed+ZmAA1a)植株作为保持系自交就可以生产不育系(aa)和保持系(A^DsRed+ZmAA1a)种子，实现不育系和保持系种子的繁殖，并利用荧光分选技术快速分离不育系与保持系两种类型的种子。

实施例1

各种水稻组织培养基配方

诱导培养基NB：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 0.1mg/L，蔗糖33.5g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0

继代培养基J3：MS大量盐分，10倍B5微量盐分，J3铁盐FeSO₄·7H₂O 41.8mg/L，Na₂EDTA 55.9mg/L，DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100mg/L)，谷胺酰氨0.3g/L，脯氨酸0.5g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0

共培养基NBM：N6大量盐分，B5微量盐分，N6铁盐，B5维生素，水解酪蛋白0.8g/L，2，4-D 2.5mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，乙酰丁香酮0.1mM，调节pH 5.6

筛选培养基J3S：继代培养基J3，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L，潮霉素50mg/L

预分化培养基Y：N6大量，CuSO₄ 3mg/L，N6铁盐，B5维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.3g/L，BA 3mg/L，NAA 1mg/L，蔗糖30g/L，山梨醇20g/L，琼脂粉8.5g/L，pH 6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L

分化培养基D：N6大量盐分，10倍B5微量盐分，D铁盐(FeSO₄·7H₂O 55.9mg/L，Na₂EDTA 74.5mg/L)，DL维生素，谷胺酰氨0.5g/L，脯氨酸0.5g/L，水解酪蛋白0.8g/L，BA2mg/L，IAA 0.2mg/L，NAA 0.2mg/L，KT 2mg/L，麦芽糖30g/L，琼脂粉8.5g/L，调节pH 6.0，头胞霉素500mg/L，羧变青霉素400mg/L

生根培养基R：MS盐分和维生素，蔗糖15g/L，IAA 0.5mg/L，NAA 0.5mg/L，琼脂粉8g/L，pH 6.0

在本实施例中，该育性调控基因为EAT1(LOC_Os04g51070)基因，纯合隐性水稻普通雄性核不育突变体中的序列和野生型的相比，发生了碱基插入。通过CRISPR/Cas9系统实现定点插入，将报告基因定点插入到育性调控基因侧翼序列，理论上是百分之百连锁。在水稻中，如果连锁率为99％，则报告基因和育性恢复基因的物理距离为250×10³(约250Kb)，本实施例中整合位点选择在育性基因下游1000bp范围内，即1kb之内，两个基因之间没有间隔，遗传表现共分离。

整合位点的设计和合成具体包括：

1、分析育性调控基因EAT1下游序列，设计引物F和R

分析育性基因下游序列1000bp范围内，在该区序列中找到NGG(N为A，T，C或G)，最好是AGG，取NGG前面的20bp作为target序列。

Target序列的正链在5′加GCAA，负链在5’加AAAC。

其中上游的GCAA，下游的CAAA为Bbs I酶切形成的粘性末端。

即：

其中一个整合位点的合成引物为；

上游F：5’-GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT-3’(SEQ ID NO.3)

下游R：5’-AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC-3’(SEQ ID NO.4)

将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。

2、线性化pP1C.2载体，pP1C.2载体的图谱如图2所示

使用Bbs I酶切pP1C.2(氨苄抗性)载体，回收3.2kb的片段；

3、重组pP1C.2载体的构建

将引物上下游(SEQ ID NO.3和4)正负链oligos(100μM)等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。

然后EcoR I、Nhe I双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp的DNA片段；

4、重组pP1C.1载体的构建

pP1C.1载体的图谱如图3所示，使用EcoR I、Xba I双酶切pP1C.1(卡那霉素抗性)载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bp DNA片段与酶切后的pP1C.1进行T4DNA酶连接，转化大肠杆菌，得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR/Cas9系统植物基因整合载体。后续进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，然后与pSB130M-DsRED-ZmAA1载体共转化水稻愈伤组织，筛选阳性克隆，测序验证，整合位点分析等。

实施例2

水稻Gt1启动子的克隆和连接

以水稻基因组DNA为模板，利用引物GT1-F：5-aaAAGCTTCACCCTCAATATTTGG-3(含HindIII酶切位点)(SEQ ID NO.5)，GT1-R：5-aaGGATCCGTTGTTGTAGGACTAATG-3(含BamH I酶切位点)(SEQ ID NO.6)，通过PCR克隆扩增得到Gt1启动子的基因序列，Gt1启动子的碱基序列如SEQ ID NO.7所示，其中，

PCR扩增体系及程序如下：

PCR扩增反应程序：94℃预变性5min；然后以94℃变性，40s；52℃退火，40s；72℃延伸，2min，共进行35个反应循环，最后72℃延伸10min。

电泳检测PCR结果，回收目的片段，并与pMD18-T克隆载体16℃连接。连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落，过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆。选取阳性克隆(含质粒pMD18-T-Gt1)送公司测序，得到测序正确的pMD18-T-Gt1载体。

连接

将测序正确的载体pMD18-T-Gt1用HindIII与BamH I双酶切，回收Gt1片段，如图4所示的pJIT163-hGFP用HindIII与BamH I双酶切，回收载体片段，得到的载体片段与Gt1片段连接，获得中间载体pJIT163-Gt1-hGFP。

DsRed片段的连接

红色荧光蛋白基因利用引物

DsRed-F：5’-CGGGATCCATGGCCTCCTCCGAGAACGT-3’(SEQ ID NO.9)

DsRed-R：5’-CGGAATTCCTACAGGAACAGGTGGTGGC-3’(SEQ ID NO.10)

利用如上引物，以本实验室保存的克隆有红色荧光蛋白基因的pMD-18T-DsRed载体为模板，株进行PCR扩增得到碱基序列如SEQ ID NO.8所示的红色荧光蛋白基因。PCR扩增体系及程序如下：

红色荧光基因PCR扩增反应程序：

94℃预变性5min；然后以94℃变性40s；53℃退火40s；72℃延伸45s，进行共30个循环；最后72℃延伸10min。

回收红色荧光基因PCR产物，

红色荧光蛋白基因的碱基序列如SEQ ID NO.8所示，用BamH I和EcoR I中间载体pJIT163-Gt1-hGFP和回收的PCR产物，回收载体片段和DsRed基因片段，两个片段用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆。即为pJIT163-Gt1-DsRed载体。

DsRed表达元件连接到植物表达载体pSB130M

pSB130M质粒图谱如图5所示，用HindIII和Sal I双酶切pSB130M和用Hind III和Xho I双酶切pJIT163-Gt1-DsRed(Sal I和Xho I为同尾酶)，分别回收载体片段和Gt1-DsRed-CaMV Term片段，两片段用T4连接酶16℃过夜连接，连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒酶切鉴定阳性克隆，得到pSB130M-Gt1-DsRED-CaMVTerm载体。

花粉致死基因ZmAA1表达元件直接由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，ZmAA1基因启动子采用Pg47启动子，核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，ZmAA1基因其终止子序列采用In2-1终止子序列，核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。在ZmAA1表达元件序列两端各增加了一个Pml I酶切位点，通过酶切回收，同时，载体pSB130M-Gt1-DsRED-CaMVTerm用Sma I酶切，回收，之后两片段T4连接酶21℃三小时连接(单酶酶切产物连接，时间不宜过长)，Sma I和Pml I酶切后都产生平末端，因此可以连接。连接产物经热激法转化感受态细胞Ecoli.DH5α，挑取单克隆菌落过夜培养，提取质粒pSB130M-DsRed-ZmAA1酶切鉴定阳性克隆。后续进行重组载体pSB 130M-DsRed-ZmAA1转化农杆菌。

实施例3

采用农杆菌介导转基因方法将打靶载体重组载体pP1C.1和供体载体pSB130M-DsRed-ZmAA1共转化到水稻野生型(基因型为AA)中。

农杆菌介导转化

水稻愈伤组织的诱导和继代培养

分别挑选健康籽粒剥去颖壳，置于37℃培养箱过夜。种子取出后放入灭菌的三角瓶中，先用体积分数为75％的乙醇表面灭菌5min，用无菌水冲洗1次，0.1％HgCl消毒12min，用无菌水冲洗5次，再放入次氯酸钠原液消毒40min，无菌水冲洗5次，于灭菌的滤纸上晾干，然后接种到诱导培养基上(NB)，让胚的一半接触培养基。每皿20粒，置于25～26℃下暗培养，以诱导愈伤组织。20天后，挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，去除谷粒和愈伤中的芽头转到继代培养基J3上，这时候谷粒中营养已经被吸收而变软，继代培养1～2次，每次20天。

划LB板(以农杆菌EHA105为例，培养基为LB+Kan 50mg/L+CHL 34mg/L+RIF 50mg/L)活化农杆菌EHA105，两天后挑取单菌落划LB板(EHA105为LB+Kan 50mg/L+CHL34mg/L+RIF50mg/L)全皿，28℃培养48小时备用，将农杆菌洗到50ml液体的共培养基(NBM+As 0.1mM)中，调OD600＝0.5；从没继代或继代1～2次的愈伤组织中挑选表面干爽、结构致密的愈伤组织，于无菌的滤纸上风干至表面发白；将愈伤组织转移至菌液中浸泡30min，每隔5min摇晃一次。菌水冲洗5次至液体不浑浊，用灭菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤表面发白。将愈伤组织转移到共培养基(NBM+As 0.1mM)上，其上有用液体的共培养基浸湿的滤纸，注意一个培养皿中不能放太多的愈伤组织，保证愈伤组织充分与无菌滤纸接触，25～26℃下暗培养3天；3天后，将愈伤组织转入已灭菌的三角瓶中，用无菌水冲洗5次至液体不浑浊，再用加有500mg/L头胞霉素和400mg/L羧苄青霉素的无菌水浸泡30min，每隔5min摇晃一次。用无菌滤纸吸干水分，于灭菌的滤纸上风干至愈伤组织表面发白，转移到筛选培养基J3S；结束两次筛选后将筛选培养基中长出抗性愈伤的愈伤组织整体转移到预分化培养基(Y+500mg/L头胞+400mg/L羧苄青霉素)上，置于光照培养箱中，培养条件为：25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx，3～7天陆续有愈伤组织变绿；将预分化培养基中变绿的愈伤组织转移到分化培养基(DL+500mg/L头胞霉素+400mg/L羧苄青霉素)上，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养，每20天更换一次培养基；当分化出的绿苗高约5～8cm时，转移到生根培养基(R)上，促进根的生长，置于25～26℃，14h光照培养，光强1000～1500lx光照培养。3～4周后，打开瓶盖加入蒸馏水，室内炼苗3-5天，用自来水将附在幼苗上的培养基冲洗干净，移栽到装有泥土的小盘子里，待幼苗成活再移入桶子或实验田中，培养至成熟。

PCR鉴定转基因植株(使用红色荧光蛋白基因的扩增引物)

提取再生苗水稻叶片DNA，利用PCR技术鉴定阳性植株。本发明采用SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的两条引物序列并采用如上扩增红色荧光蛋白基因的PCR反应条件和反应体系进行鉴定。

如图6所示，从图6中可以看出，在转化成功的转基因植株中可以扩增出红色荧光蛋白基因。

另外，为进一步确认出红色荧光蛋白基因确实定点插入到靶位点区域，与育性调控基因连锁，本发明的申请人利用SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物序列，可选用宝生物(工程)大连有限公司的LA Taq酶，或者东洋坊(上海)生物科技有限公司的KOD酶，以转基因植株DNA为模板，扩增红色荧光蛋白基因。

如果外源序列定点整合，则扩增产物为6400bp左右，产物包含红色荧光蛋白基因和花粉致死基因所有表达元件，如果没有定点整合，则扩增产物为129bp。

同时，可以通过测序的方法鉴定(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)两种不同类型的种子，其中一种鉴定杂合体的方法是在突变位点附近设计引物扩增突变位点序列，如果该种子是杂合子，则其测序结果中会有双峰出现。

比如，验证EAT1基因突变位点用的检测引物为：

EAT1m-F：5’-TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3’(SEQ I D NO.14)

EAT1m-R：5’-CCAACACCAATAATCACATCTCG-3’(SEQ ID NO.15)

转化成功的转基因株系的表型图如图7(a)和7(b)所示，其中，如图7(a)为转基因株系的稻穗照片，图7(b)为转基因水稻种子的照片。如图8(a)和图8(b)所示，展示了转化成功转基因株系的花粉碘染实验的两次实验结果，图中正常染色的花粉粒为可育花粉粒，没有染色的花粉为不育花粉。(正常花粉含有淀粉，可正常染色，不育花粉不含淀粉，不着色，所以显微镜视野下，染色的花粉为正常的，不染色的花粉为败育花粉。)证明了转基因株系花粉半不育，说明致死基因工作了，50％的雄配子因为含有转基因的片段而表现不育。

转基因植株T0代为AA^DsRed+ZmAA1自交分析，如下表1所示：

表1转基因植株T0代为AA^DsRed+ZmAA1自交

实施例4

采用农杆菌介导转基因方法将打靶载体pP1C.1和供体载体pSB130M-DsRed-ZmAA1共转化到水稻野生型(基因型为AA)中。通过PCR方法筛选到已成功定点整合筛选报告基因和花粉致死基因的转基因植株(基因型为AA^DsRed+ZmAA1)后。通过将野生型植株(AA)与不育突变体(aa)的杂交，获得F1植株(Aa)，然后将F1植株(Aa)作为父本与转基因T0代植株(AA^{DsRed +ZmAA1})杂交，F1后代出现四种基因型，分别为(AA)、(Aa)、(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)，首先挑选出带荧光的种子，(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)。再通过测序的方法鉴定(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)两种不同类型的种子，把带荧光的种子进行发芽单株提取DNA，在突变位点附近设计引物进行扩增(产物需包含突变位点序列)，扩增产物送测序，如果测序结果有双峰情况出现，即为A^DsRed+ZmAA1a基因型。因突变位点杂合，产物不唯一，所以测序结果出现双峰。

其中基因型为(A^DsRed+ZmAA1a)植株作为保持系自交就可以生产不育系(aa)和保持系(A^DsRed+ZmAA1a)种子，实现不育系和保持系种子的繁殖，并利用荧光分选技术快速分离不育系与保持系两种类型的种子。

花粉致死基因表现为雄配子致死，只有带有致死基因片段的配子才会不育，致死基因和报告基因连锁定点整合到育性调控基因的侧翼序列，既可以给育性基因的传递提供荧光线索，又可以保证带有转基因片段的花粉不会逃逸到环境中，以免产生生态污染。避免转基因生态安全风险的存在。

转基因植株T0代AA^DsRed+ZmAA1作为母本与Aa杂交分析情况，请见下表2：

表2转基因植株T0代AA^DsRed+ZmAA1作为母本与Aa杂交分析

杂交后代A^DsRed+ZmAA1a自交分析情况，请见下表3：

表3杂交后代A^DsRed+ZmAA1a自交分析

本发明对SPT技术进行了思路创新，利用最新的基因组编辑技术CRISPR/Cas9系统将外源报告基因(红色荧光蛋白基因，DsRed)表达元件和花粉致死基因定点插入到育性调控基因的侧翼序列，实现育性基因、花粉致死基因和色选报告基因的连锁。通过将野生型植株(AA)与不育突变体(aa)的杂交，获得F1植株(Aa)，然后将F1植株(Aa)作为父本与转基因T0代植株(AA^DsRed+ZmAA1)杂交，F1后代出现四种基因型，分别为(AA)、(Aa)、(A^DsRed+ZmAA1A)和(A^DsRed+ZmAA1a)，(A^DsRed+ZmAA1a)即为可防止基因漂移的水稻工程保持系，与只定点转入了外源报告基因的单基因系统相比，本发明的两基因系统相比如图9所示的单基因系统而言，单基因系统不育系种子生产通过杂交获得，后代1∶1分离，而本发明的双基因系统不育系种子生产通过自交获得，后代也是1∶1分离，如表4所示。因此，在不育系种子生产上，本发明的水稻工程保持系更方便，成本更低，产量也更大一些。

双基因系统不育系种子生产

表4双基因系统不育系种子生产

也可以采用将花粉致死基因和外源报告基因分开转化到植株体内的方法完成本发明的思路，但是，如果分开转化，虽然是定点整合，但有可能插入的不是同一条染色体，而是等位区域(同源染色体有两条)。增加了载体构建过程和植株转化过程的困难，步骤繁琐。而本发明将花粉致死基因和报告基因连锁表达，一是可以防治转基因花粉逃逸，二是更方便不育系种子的生产，降低成本。构建到一个载体上更是可以保证两个基因的连锁，且插入到同一条染色体上。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

Claims (8)

1.一种防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，包括：

步骤一、将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1定点插入到野生型水稻染色体上育性调控基因的侧翼序列，得到含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系，其中，外源报告基因、花粉致死基因ZmAA1与育性调控基因能够紧密连锁遗传，所述育性调控基因为水稻EAT1基因；

其中，获得含有外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1的转基因株系的具体方法包括：

1.1 分析野生型水稻染色体上育性调控基因的上下游序列区域，取该区域内NGG前面的20 bp作为靶位点区域，并设计与该靶位点区域配对的引物序列，在引物上游序列前加GCAA，在引物下游序列前加AAAC，得到引物

上游序列：5’–GCAANNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’

下游序列：5’–AAACNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN–3’；

1.2 利用CRISPR/Cas9系统将步骤1.1中的引物序列构建到pP1C.1载体上得到基因整合载体；

1.3 将外源报告基因和花粉致死基因ZmAA1均构建到植物表达载体上得到重组表达载体；

1.4 将所述重组表达载体和所述基因整合载体共转化野生型水稻，得到转基因植株；以及，

步骤二、取步骤一中得到的转基因株系作为母本，将野生型水稻与纯合隐性水稻普通雄性核不育株系杂交得到F1代植株，之后F1代植株作为父本与作为母本的转基因株系杂交得到F2代，从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系即为所需要的水稻工程保持系，其中，所述纯合隐性水稻普通雄性核不育株系为所述育性调控基因的突变体株系；

从该F2代中筛选含有所述外源报告基因且育性基因位点杂合的株系的具体方法包括：针对育性调控基因设计一对能够扩增出包含育性调控基因突变位点在内的PCR产物的检测引物，利用该对检测引物，以表达外源报告基因的转基因植株基因组作为模板进行扩增，若检测到育性调控基因位点为杂合型，则判定该植株为所述水稻工程保持系植株。

2.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，在所述步骤二之后还包括：

步骤三、将步骤二中得到的水稻工程保持系自交，以生产水稻普通雄性核不育株系种子和水稻工程保持系种子。

3.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，在所述步骤一之前还包括：通过图位克隆确定出纯合隐性水稻普通雄性核不育株系中突变型育性调控基因在染色体上的位置。

4.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，所述步骤1.3中，所述重组表达载体中，所述外源报告基因的启动子为水稻胚乳特异性启动子Gt1，其碱基序列如SEQ ID NO.7所示，

所述花粉致死基因ZmAA1的启动子为Pg47启动子，碱基序列如SEQ ID NO. 12所示。

5.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，所述步骤二中，所述检测引物的序列为：

上游引物：5’-TCATATCATCAACCATCAGTTTAGC-3’

下游引物：5’-CCAACACCAATAATCACATCTCG-3’。

6.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，所述步骤1.1中的引物序列为：

上游序列：5’–GCAAGAGCGAGAGGGGAAGCATTT–3’

下游序列：5’–AAACAAATGCTTCCCCTCTCGCTC–3’。

7.如权利要求1所述的防止基因漂移的水稻工程保持系的创制方法，其特征在于，所述外源报告基因为红色荧光标记基因、、绿色荧光蛋白基因或蓝色荧光标记基因中的任意一种。

8.防止基因漂移的水稻工程保持系在水稻育种中的应用，其特征在于，所述水稻工程保持系由如权利要求1至7任一所述的方法获得。