CN105695461B - 一种小麦旗叶特异表达的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小麦旗叶特异表达的启动子及其应用。所述启动子是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成或者是将SEQ ID No.1所示的核苷酸经过一个或几个碱基的取代、缺失、添加所衍生的可以特异诱导外源基因在小麦旗叶特异表达的核苷酸序列。将该核苷酸序列应用于植物基因工程，可以诱导外源基因在小麦旗叶中特异表达。
Description
技术领域
本发明涉及植物基因工程和植物遗传育种领域，特别涉及小麦旗叶特异表达基因NAC transcription factor 1(NAM-B1)的启动子及其应用。
背景技术
植物是人类赖以生存和发展的物质基础，植物生产是第一性的生产，植物品种是植物生产的物质基础，改良植物品种的过程称为植物育种。植物基因工程和植物遗传育种相结合是现代农业的发展方向。获得具有优质，高产，高抗病抗逆性和其它特殊性状的植物品系是农业发展的目标和推动力，将转基因技术应用于植物遗传育种是现代植物育种技术发展的新动力，转基因技术就是将人工分离和修饰过的外源基因导入到目的生物体的基因组中，从而达到改造生物性状的目的。
在该技术中的关键环节是要将外源基因置于合适的启动子之后才能引导该基因在目的生物体基因组中表达。启动子是指位于功能基因上游的一段能使基因进行转录的脱氧核糖核酸(DNA)序列。启动子可以被RNA聚合酶辨认，并起始转录，启动子在决定基因表达的时空模式中起着主要的作用。目前常用的转基因启动子主要是泛素(ubiquitin)启动子和烟草花叶病毒35s启动子等组成型表达启动子，对于小麦转基因，该类启动子可以有效地诱导外源基因在小麦中表达，但是该类启动子诱导外源基因的表达没有器官和组织的特异性，在小麦的各个器官和组织该启动子都会诱导外源基因表达，这就限制了该启动子的应用价值，我们进行转基因育种时通常需要将我们导入的外源基因在小麦特定的发育阶段和器官表达，这是该类启动子所无法实现的。
本发明中我们从野生二粒小麦基因组中分离了小麦旗叶特异表达基因NACtranscription factorl(NAM-B1)的启动子序列，小麦NAM-B1基因属于植物NAC转录因子基因家族，该基因在旗叶特异表达，将该启动子应用于转基因小麦，可以诱导功能基因在小麦旗叶特异的表达。利用这一启动子的这种功能，我们可以提供一种在转基因小麦的旗叶中特异表达外源基因的方法，为现代遗传育种技术的发展提供新的动力。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够特异诱导外源基因在小麦旗叶表达的启动子。
为了这一目的，本发明人从野生二粒小麦基因组中分离了小麦旗叶特异表达基因NAC transcription factorl(NAM-B1)的启动子序列，小麦NAM-B1基因属于植物NAC转录因子基因家族，该基因在旗叶中特异性表达。本发明人将分离得到的启动子应用于转基因小麦，成功地诱导了功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
由此，在本发明的第一方面，本发明提供一种小麦旗叶特异表达的启动子，所述启动子是由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成或者是将SEQ ID No.1所示的核苷酸经过一个或几个碱基的取代、缺失、添加所衍生的能够特异诱导外源基因在小麦旗叶特异表达的核苷酸序列。
优选地，所述启动子的核苷酸序列为SEQ ID No.1。
在本发明的第二方面，本发明提供包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列作为启动子的表达盒，所述表达盒能够使连接在所述表达盒中的目的基因在小麦旗叶中特异性表达。
优选地，本发明提供包含上述表达盒的重组载体，所述重组载体能够使连接在所述重组载体中的目的基因在小麦旗叶中特异性表达。
优选地，所述载体是能够在小麦中表达的载体，例如pCAMBIA1301载体。
这种载体可以是农杆菌双元表达载体或者通过其它方式转入受体植物基因组的植物表达载体，在该启动子后面添加需要在小麦旗叶中特异表达的外源基因的编码核苷酸序列，诱导该基因在小麦旗叶中特异表达。也可以通过在编码序列的下游导入各种表达标签来表达纯化蛋白。另外根据具体的实验材料和方法还可以在载体上添加不同的抗性基因来应对不同的筛选方式。
在本发明的第三方面，本发明提供SEQ ID No.1所示的核苷酸序列或包含SEQ IDNo.1所示的核苷酸序列作为启动子的表达盒或重组载体在小麦育种的应用。在所述应用中，将用于改良小麦性状的外源功能基因连接到所述表达盒或重组载体中，使其处在所述启动子的控制下进行表达，然后将连接有所述外源基因的所述表达盒或所述重组载体转染到小麦植株中，从而使得所述外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达，筛选具有所述外源功能基因的功能的转基因小麦，进而起到改良小麦性状的作用。具体地说，可以改良小麦对光合作用产物的利用率。例如在旗叶特异表达光合产物的输出基因，可以提高光合产物的输出效率，从而增加小麦产量，但本发明并不限定于此种应用。
在本发明的第四方面，本发明提供一种培育小麦品种的方法，所述方法包括将用于改良小麦性状的外源功能基因连接到本发明第二方面所述的表达盒或重组载体中，使所述外源功能基因处在本发明第一方面所述的启动子的控制下进行表达，然后将连接有所述外源基因的所述表达盒或所述重组载体转染到小麦植株中，从而使得所述外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达，然后筛选具有所述外源功能基因的功能的转基因小麦，进而起到改良小麦性状的作用。
本领域技术人员应该理解，如果外源功能基因不是小麦来源的，为了使其在小麦中充分表达，可以按照小麦密码子应用偏好进行密码子优化，在不改变外源功能基因所编码的氨基酸序列的前提下，优化其核苷酸序列使其能够在小麦中充分表达。关于密码子优化的技术是本领域技术人员所熟知的。另外，关于将表达盒或重组载体转染到小麦植株中的方法也是本领域的常规方法，例如，可以利用农杆菌介导的转染技术等。
在本发明的第五方面，本发明还提供包含本发明第二方面所述的表达盒或重组载体的重组细胞，其中所述细胞选自微生物细胞或真菌细胞，例如，但不限于，大肠杆菌细胞，农杆菌细胞等。
附图说明
从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中：
图1：根据Triticum turgidum ssp.Dicoccoides(野生二粒小麦)克隆BAC409D13(NCBI序列号DQ871219)，设计特异引物分离克隆了旗叶特异表达基因NAM-B1的启动子序列(1.5kb)凝胶电泳检测。泳道1为分子量标记，其他泳道为NAM-B1启动子序列的PCR扩增产物。
图2：小麦NAM-B1基因启动子诱导GUS基因表达的农杆菌转化载体PNAM-B1：：GUS构建示意图。
图3：T0代转基因小麦PCR鉴定结果。泳道1、2、4、5、6、7为转基因阳性植株；泳道3为转基因阴性植株；泳道8为阴性植株对照：泳道9为以水为模板的PCR负对照。
图4：转基因小麦PNAM-B1：：GUS不同器官和组织的GUS染色结果。a：PNAM-B1：：GUS旗叶；b：野生型旗叶：c：PNAM-B1：：GUS根；d：PNAM-B1：：GUS茎；e：PNAM-B1：：GUS营养叶。
具体实施方式
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的实验方法，如果没有特殊说明，均为常规实验方法。实验所用到的试剂盒实验仪器，如无特殊说明，均可在生物仪器和试剂公司购买到。
实施例1.小麦NAM-B1基因启动子诱导GUS基因在小麦旗叶中特异表达
1根据Triticum turgidum ssp.dicoccoides(野生二粒小麦)克隆BAC409D13(NCBI序列号DQ871219)，设计特异引物分离克隆了旗叶特异表达基因NAM-B1的启动子序列(1.5kb)(图1)。
2小麦NAM-B1基因启动子诱导GUS基因农杆菌重组表达载体PNAM-B1：：GUS的构建
NAM-B1启动子用加NotI酶切位点的上游引物和加PvuII酶切位点的下游引物扩增，PCR产物回收后，与pGEM-Teasy载体(购自promega公司)连接，测序正确后得到pGEM-NAM-B1载体，再通过酶切，连接，转化的方法将NAM-B1启动子插入到农杆菌转化载体B52(中国科学院遗传与发育生物学研究所，可参见Binary Agrobacterium vectors for planttransformation，M Bevanin，Nucleic Acids Research(1984)12(22)：8711-8721。)的gus基因上游，得到PNAM-B1：：GUS农杆菌重组表达载体。图2所示为构建的农杆菌重组表达载体PNAM-B1：：GUS示意图；
3以冻融法将重组表达载体PNAM-B1：GUS转入农杆菌EHA105(中国科学院遗传与发育生物学研究所)；
3.1挑取农杆菌EHA105单菌落于2ml YEP培养基(1升YEP培养基成分：酵母提取物1g(购自oxoid公司)，蛋白胨10g(购自oxoid公司)，蔗糖5g(购自北京化工厂公司)，MgSO4.7H2O 1.027g(购自北京化工厂公司)，调整PH为7.0。含Rif2 0mg/ml(购自inalco公司))中28℃过夜活化；
3.2取2ml过夜菌液接种于50ml YEP培养基中28℃生长至OD600约等于0.5左右(4hr)；
3.35k rpm离心5分钟；
3.4在10ml 0.15M NaCl中悬浮细胞；
3.55krpm离心5分钟，悬浮细胞于20ml冰预冷的CaCl2，即制得农杆菌感受态细胞；
3.6加1ug DNA于200ul农杆菌感受态细胞中，冰上放置30分钟；
3.7液氮中冷冻1分钟；
3.837℃水浴融化农杆菌细胞；
3.9加1ml YEP培养基，28℃摇床培养2-4hr(低速)；
3.10离心1分钟，悬浮农杆菌细胞在100ul YEP培养基中；
3.11取出菌液于含有相应抗生素的YEP平板上涂板(AMP+Rif)，28℃培养2-3天，所长菌落即为含有PNAM-B1：：GUS重组表达载体的农杆菌。
4农杆菌介导的小麦转化
小麦转化受体的准备
小麦幼胚愈伤组织的诱导培养：取小麦栽培种科农199(国审麦2006017，中国科学院遗传与发育生物学研究所)开花后12-15天的幼穗，用70％乙醇浸约10-15min，无菌水冲洗3-4次，剥取幼嫩种子，挑出0.5-1.5mm大小的幼胚，置于诱导培养基上，25℃暗培养，约10-15天后，选择淡黄色结构致密的愈伤组织转到继代培养基上，在相同条件下继代培养。以后每两周继代培养一次。挑选继代培养5-7天、色泽淡黄的愈伤组织共培养。
农杆菌的培养
将含有PNAM-B1：：GUS重组表达载体的农杆菌EHA105在含有100mg/LKan和50mg/LStr的YEP平板上划线，28℃黑暗培养3天，挑取单克隆于加有同样抗生素的液体YEP中培养12-24h，然后以1∶50(v/v)的比例于同样的液体YEP(50ml)中进行扩大培养4-5小时，5000rpm离心5min收集菌液，用液体AAM培养基(20ml)重新悬浮，置于28度摇床轻微振荡培养30min-3h，该农杆菌悬浮液即可用于转化小麦愈伤。
小麦愈伤组织与农杆菌的共培养
挑选状态较好(继代培养5-7天、色泽淡黄)的愈伤组织放入50ml无菌三角瓶中，加入准备好的农杆菌悬浮液，置于28℃摇床轻微振荡培养20min。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，25℃黑暗培养2-3天。
抗性愈伤组织的筛选
将共培养后的愈伤组织放在含有10mg/L草丁膦(PPT，购自sigma公司)和250mg/L的头孢霉素(cef，购自sigma公司)的筛选培养基上，26℃暗培养15天，转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选15天。大部分愈伤组织在筛选后10天左右褐化，然后在褐化组织的边缘重新生长出乳白色的抗性愈伤组织。
抗性愈伤组织的分化
从经两轮筛选后长出的抗性愈伤组织中，挑选乳黄色致密的抗性愈伤组织先转至含有10mg/L PPT和250mg/L cef的预分化培养基上暗培养7-15天，然后转至分化培养基上15h/d光照条件下培养，一般经过6-10天就会有绿点出现。20-30天后进一步分化出小苗。
生根、壮苗和移栽
当抗性愈伤组织分化的芽长至约2cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10cm，根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。
组织培养与转化过程中用到的培养基如下：
表1.MS基本培养基
共培养培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/l)+水解干络素(200mg/l)+2mg/l 2，4-D+蔗糖(30g/l)+0.7％琼脂+200mM AS
愈伤诱导、继代培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/l)+水解干络素(200mg/l)+2mg/l 2，4-D+蔗糖(30g/l)+0.7％琼脂+200mM AS
筛选培养基：MS基本培养基+GLn(146mg/l)+水解干络素(200mg/l)+2mg/l 2，4-D+蔗糖(30g/l)+0.7％琼脂+200mM AS+3-5mg/lBialaphos+150mg/l Timentin
预分化培养基：MS基本培养基+0.5mg/l IAA+0.5mg/16-BA+蔗糖(25g/l)+0.7％琼脂+150g/l Timentin
分化培养基：MS基本培养基+0.5mg/l IAA+1.0mg/16-BA+蔗糖(25g/l)+0.7％琼脂+150g/l Timentin
壮苗培养基：1/2MS基本培养基+0.5mg/l IAA+0.2mg/16-BA+蔗糖(20g/l)+0.7％琼脂+1mg/l多效唑
生根培养基：1/2MS基本培养基+0.2mg/l IAA+蔗糖(20g/l)+0.7％琼脂
5转基因植株的PCR检测
转基因植株的DNA提取(CTAB小量提取法)
(1)剪取适量再生植株叶片装于1.5ml离心管中，加入液氮碾磨成粉末状；
(2)加入600μl 65℃预热的裂解缓冲液{1.3％CTAB(Hexadecyl TrimethylAmmonium Bromide，十六烷基三甲基溴化铵，购自Amresco公司)，133mmol/L Tris-HClpH8.0(Tris购自Amresco公司，HCl购自北京化工厂)，13mmol/L EDTA(购自Amresco公司)，0.93mol/L NaCl(购自北京化工厂)，0.66％PVP 3600(购自Amresco公司)，0.18mol/Lβ-巯基乙醇(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)}，65℃水浴40min，期间翻转混匀2-3次；
(3)加入800μl氯仿∶异戊醇(24∶1v/v)混合液，翻转25次以上，室温静置5min，12,000rpm离心15min(25℃)，将上清转入1.5ml的离心管中，加0.6体积的预冷的异丙醇，缓慢翻转30次，混匀，静置10min，12,000rpm，离心10min(RT)，弃上清，于沉淀中加入1ml 75％的乙醇洗涤，12,000rpm离心1min。倒掉上清液，通风干燥20min；
(4)加100μl TE缓冲液(含Rnase A 20μg/ml)溶解DNA(4℃，30min以上)，置于-20℃保存。
转基因植株的PCR检测
PCR反应体系如表2.所示，引物1和引物2为GUS基因特异的一对引物。
GUS-QC-F：5′-ATGTTACGTCCTGTAGAAACCCCAA-3‘
GUS-QC-R：5′-TCATTGTTTGCCTCCCTGCTGC-3‘
PCR反应程序为：94℃预变性2min；94℃变性30sec，Tm值复性45sec，72℃延伸2min，30个循环；72℃延伸10min。
表2.用于鉴定转基因植株的PCR反应体系(20μl)
结果如图3所示，1、2、4、5、6、7为转基因阳性植株；3为转基因阴性植株；8为阴性植株对照：9为以水为模板的PCR负对照。
6转基因小麦的GUS染色
分离阳性转基因小麦的根、茎、叶等组织和器官置于1.5ml离心管内，加入适量的GUS染色液，37℃温育16-24小时(具体时间以染色充分为准)，用70％乙醇脱色及保存。结果如图4所示，只在旗叶中检测到GUS基因表达，在其它的组织和器官中未见到GUS基因表达。
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。
Claims (8)
1.一种培育小麦品种的方法，所述方法包括将用于改良小麦性状的外源功能基因连接到包含SEQ ID No.1所示的启动子的表达盒或包含SEQ ID No.1所示的启动子的重组载体中，使所述外源功能基因处在SEQ ID No.1所示的启动子的控制下进行表达，然后将连接有所述外源基因的表达盒或重组载体转染到小麦植株中，从而使得所述外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达，然后筛选具有所述外源功能基因的功能的转基因小麦，进而起到改良小麦性状的作用。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达盒能够使连接在所述表达盒中的外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述重组载体是能够在小麦中表达的载体，并且能够使连接在所述载体中的外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述转染通过农杆菌进行。
5.SEQ ID No.1所示的小麦旗叶特异表达的启动子在培育小麦品种中的应用，其中，在所述应用中，将用于改良小麦性状的外源功能基因连接到包含SEQ ID No.1所示的启动子的表达盒或包含SEQ ID No.1所示的启动子的重组载体中，使所述外源功能基因处在SEQID No.1所示的启动子的控制下进行表达，然后将连接有所述外源基因的所述表达盒或所述重组载体转染到小麦植株中，从而使得所述外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达，然后筛选具有所述外源功能基因的功能的转基因小麦，进而起到改良小麦性状的作用。
6.根据权利要求5所述的应用，其中所述表达盒能够使连接在所述表达盒中的外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
7.根据权利要求5所述的应用，其中所述重组载体是能够在小麦中表达的载体，并且能够使连接在所述载体中的外源功能基因在小麦旗叶中特异性表达。
8.根据权利要求5所述的应用，其中所述转染通过农杆菌进行。
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