CN103981216A - 一种骨干质粒载体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种骨干质粒载体，在该骨干质粒载体中：向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框位于同一双元载体中，向导RNA表达框由小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子依次构成；Cas9核酸酶表达框由ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子依次构成。本发明还提供了由所述骨干质粒载体构建的含有靶标序列的重组载体，用于作物基因打靶的应用。

Description

一种骨干质粒载体及应用

技术领域

本发明属于作物基因工程领域，具体涉及到一种用于作物基因打靶的骨干质粒载体及其在基因改造中的应用。

背景技术

我国是一个农业大国，主要农产品的持续稳定增产对保障我国粮食安全具有十分重要的战略意义。种子是粮食生产的源头，优良的品种是确保农业高产、优质、稳产的重要基础。随着国民经济的不断发展，人口数目的持续增加和极端天气的频繁出现，加快品种改良对稳定农产品产量并满足时代发展对现代农业的需要至关重要。从上世纪中叶开始，以常规杂交选择为代表的传统育种技术培育了大量优良的品种，为农作物持续增产起到了重要作用。但随着重要基因资源不断的消耗，传统育种技术的瓶颈效应愈加显著。由于传统育种技术所具有的受生殖隔离限制、易受不良基因连锁影响、不同优势形状叠加的理论不清楚和周期长、成本高等不足，严重影响了突破性品种的选育速度。随着生物技术的不断发展，使用现代分子生物学手段直接精确改造形状相关基因，发展具有简单、快速、高效的新型改良手段，能够有效克服传统技术的不足，从而保障农作物品种持续和可持续的改良。

基因打靶技术是目前被认为最具有潜力的分子育种手段之一。基因打靶方法包括同源重组技术、锌指核酸酶技术(ZFN)和类转录因子激活物技术(TALEN)，和最近发展出CRISPR/Cas9技术等。其中，前三者都具有打靶效率低，基因工程载体构建复杂，周期长，成本高等技术问题，影响了基因打靶技术在作物育种改良过程中的实用性。而CRSIPR/Cas9系统具有通量高、操作简单、打靶效率高等优点，是一种理想的基因打靶方法。目前，在酵母、人类细胞、小鼠、果蝇、大鼠、斑马鱼等物种中都已成功实现了基因组的CRISPR/Cas9定向基因打靶。在植物中，也有利用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑的研究。但是，在关于水稻方面的研究中，目前有限的报道主要侧重于机理研究，尚没有对作物CRISPR/Cas9载体工程化优化改造，使之适于简单快速操作的报道。

发明内容

本发明提供了一种用于作物基因打靶的基因工程骨干载体，其能够用于进行简单、快捷的基因打靶。

具体而言，一方面，本发明提供了一种骨干质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

另一方面，本发明提供一种骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq ID No.1第1987至8635位所示。

优选地，所述向导RNA表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子，其中，所述小麦TaU3p启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至631位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1853至1936位所示，Poly-T终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如SeqID No.1第1987至4018位所示，Cas9编码序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第4037至8308位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第8309至8635位所示。

优选地，所述骨干质粒载体还包括T-DNA的左、右边界序列，其中所述左边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第10884至10907位所示，所述右边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示；所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界和所述右边界之间。

优选地，在所述骨干质粒载体的骨架上具有卡那霉素抗性基因结构。

本发明的骨干质粒载体文中称为pHUN4c22。

另一方面，本发明提供一种利用所述的骨干质粒载体构建重组载体的方法，其特征在于，所述构建方法包括：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，以整合到所述骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA，

其中，所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中为碱基A、G、C、T中的任意一个。X优选为19或20。

优选地，所述构建方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-AGCG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-(N)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中所述正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N)_X具有反向互补特征；

用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，用所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过Kana霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于作物目的基因打靶的重组载体。

另一方面，本发明提供一种所述重组载体在作物基因打靶中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

将所述重组载体转入作物细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，对目的基因的双链靶标片段进行剪切，诱发作物细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。向导RNA由能够与所述靶标片段互补结合的RNA片段和sgRNA骨架片段连接而成，所述sgRNA骨架片段可与Cas9核酸酶结合。所述向导RNA中能与所述靶标片段互补结合的RNA片段为能与所述5’-(N)_X-NGG-3’中(N)_X互补结合的RNA片段。所述sgRNA骨架片段为由SEQ ID No.1中第1574至1657位核苷酸所示DNA转录出来的RNA片段。所述Cas9核酸酶为由SEQ ID No.1中第3758至7888位核苷酸所示DNA转录的RNA片段翻译而成的蛋白质。

将所述重组载体转入作物细胞的方法为：向作物细胞直接导入重组载体的DNA序列，具体如PEG介导的原生质体瞬时转化或农杆菌介导的愈伤组织稳定转化；使所述细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶的方法为：向作物细胞直接导入重组载体的DNA序列，其中包括sgRNA表达框和Cas9表达框。所述sgRNA表达框在水稻细胞中由其中小麦TaU3p启动子驱动向导RNA序列表达出向导RNA，所述Cas9表达框在作物细胞中由其中ZmUBI启动子驱动植物偏好密码子改造的Cas9基因序列表达出Cas9核酸酶。

本发明的骨干质粒载体还可以包括潮霉素抗性基因表达框。

另一方面，本发明提供一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含所述重组载体。

在一种优选实现方式中，基因工程骨干质粒载体是包含T-DNA边界序列的双元载体，在T-DNA左、右两个边界内，包含3个表达框，分别是潮霉素抗性基因表达框、Cas9基因表达框和向导RNA表达框，在T-DNA边界外的载体骨架序列中，包含卡那霉素抗性基因等结构。所述向导RNA(sgRNA)表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子，其中，小麦TaU3p启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至631位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1853至1936位所示，Poly-T终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1937至1944位所示；SpR基因两端分别存在反向排列的BsaI内切酶识别位点(剪切位点如Seq ID No.1第628位和1853位所示)，用于插入靶标片段；Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1987至4018位所示，Cas9编码序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第4037至8308位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第8309至8635位所示。

所述再生植株，由转化的作物细胞或组织，如原生质体或愈伤组织分化再生而来。

本发明可获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的作物植株。

所述再生植株为由转化的作物细胞或组织再生的植株；可再生的作物包括水稻、小麦、玉米、大麦、高粱或燕麦等，优选为水稻。

本发明预先将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，同时在靶标序列插入位置预置了壮观霉素抗性基因，在重组载体构建过程中，仅需一次酶切连接，在壮观霉素反向筛选和骨干质粒载体的骨架上的卡那霉素正向筛选的作用下，可以高效简洁的获得完整的打靶重组载体。同时，将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，相对于分别转化，可以提高转入完整CRSIPR/Cas9系统的效率。为了提高植物内的打靶效率，在本发明中，采用了具有强驱动活性的小麦TaU3p启动子表达sgRNA和可在多种作物中都能实现高表达的玉米ZmUBI启动子驱动植物化改造的Cas9基因的组合，本申请的发明人发现，这种组合可达到在多种植物细胞内稳定高效的对靶标序列的剪切的目的。利用本发明的骨干质粒载体，能够简单地构建重组载体，进而对植物，尤其是单子叶禾本科作物进行定向的基因打靶。

在一种实现方式中，本发明的骨干质粒载体的核苷酸序列如下所示(与Seq ID No.1相同)：

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附图说明

图1为本发明的用于作物CRISPR/Cas9基因工程的骨干载体pHUN4c22的载体示意图；

图2为应用pHUN4c22-BEL重组载体转入原生质体对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示为野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；

图3为应用pHUN4c22-BEL重组载体通过PEG介导转入原生质体后再生植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示为野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量；

图4为应用pHUN4c22-BEL重组载体通过农杆菌介导的稳定转化获得的转基因植株中对水稻内源BEL基因定点突变测序检测的部分结果图，其中WT表示野生型基因，“-”表示发生了删除突变的序列，“+”表示发生了插入突变的序列，“-/+”后边的数字表示删除或插入的核苷酸数量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

骨干质粒载体的设计

本发明设计了这样的骨干质粒载体，其包括向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，向导RNA表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子。Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子。可选地，该骨干质粒载体还包括T-DNA的左、右边界序列；向导RNA表达框和Cas9表达框位于所述左边界和所述右边界之间。需要说明的是上述序列是该骨干质粒载体的特有部分，其还可以包括一些常规载体所具有的一般结构，这里不再累述。Seq ID NO.1中示出了本发明所设计的骨干质粒载体的一种实现方式。该载体可以采用现有技术中的常规方式来构建。

为了方便针对特定目的基因CRSIPR/Cas9打靶重组载体的构建，本骨干载体预先将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，同时在靶标序列插入位置预置了壮观霉素抗性基因，采用这种构造，在后续重组载体构建过程中，仅需一次酶切连接，将靶标序列置换壮观霉素基因，重组载体可在壮观霉素反向筛选和骨干质粒载体的骨架上的自身卡那霉素正向筛选下得到快速有效筛选，因此，利用骨干载体中的这种设计策略，可以高效简洁的获得完整的打靶重组载体。同时，将向导RNA表达框和Cas9表达框整合在同一载体骨架上，相对于分别转化，可以提高转入完整CRSIPR/Cas9系统的效率。

用于水稻BEL基因打靶的重组载体的制备。

1.1，选择水稻BEL基因(LOC_Os03g55240)中第505-526位的核苷酸序列CGAGGTCCGCGCCATGGTGCGG，(下划线部分为所述5’-(N)_X-NGG-3’结构中NGG部分)，作为打靶位点。

1.2，按所选择靶位点合成(华大基因公司)正向寡核苷酸链(BEL KO1P1)和可与之互补的反向寡核苷酸链(BEL KO1P2)，

具体序列为：

BEL KO1P1:AGCGCGAGGTCCGCGCCATGGTG；

BEL KO1P2:AAACCACCATGGCGCGGACCTCG。

其中未被下划线标注的部分为上述靶位点中去除NGG的序列或互补序列，下划线部分为用于连接载体的粘性末端。

1.3，经过退火程序，将BEL KO1P1和BEL KO1P2两链退火形成具有粘性末端的双联DNA，作为构建重组载体的插入片段。

1.4，用BsaI内切酶(NEB公司)在37℃酶切pHUN4c22载体2小时，65℃失活酶切体系10分钟，作为构建重组载体的骨架片段。

1.5，用T4连接酶(NEB公司)将重组载体骨架片段和插入片段相连，转入大肠杆菌中。通过选择具有卡那霉素抗性且不具壮观霉素抗性的菌斑，获得阳性转化子。经测序验证后，提取阳性质粒，构成用于水稻BEL基因CRISPR/Cas9打靶的重组载体质粒，命名为pHUN4c22-BEL。

原生质体瞬时转化介导的水稻BEL基因打靶。

2.1，利用PEG法将pHUN4c22-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，水稻原生质体转化具体过程参考了文献Zhang等A highly efficient rice greentissue protoplast system for transient gene expression and studyinglight/chloroplast-related processes.Plant Method(2011).中公开的实验方法。

2.2，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，在水稻原生质体转化后48小时提取其基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为：

Bel KO1genome check FP:CAGAGTCACAGAAACACATCAC

Bel KO1genome check RP:CTTCCTCCTGACGCCGAACACG

2.3，所获PCR扩增片段经电泳回收后，将其克隆至pEASY-T载体(全式金公司)，用M13F引物测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测90个克隆中，49个克隆携带BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为54.4％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图2所示。

2.4，利用PEG法将pHUN4c22-BEL质粒转化至水稻日本晴原生质体，并获得再生水稻植株。水稻原生质体转化和植株再生具体过程参考了文献Hayashimoto等A Polyethylene Glycol-Mediated Protoplast TransformationSystem for Production of Fertile Transgenic Rice Plants.Plant Physiology(1990).中公开的实验方法。

2.5，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获34棵再生植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述Bel KO1genome check FP和Bel KO1genome check RP。

2.6，以Bel KO1genome check FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测34棵植株中，6棵植株带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为17.6％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图3所示(图2和3中，阴影部分为目标靶位)。

农杆菌稳定转基因介导的水稻BEL基因打靶。

3.1，利用冻融法将pHUN4c22-BEL重组载体转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(安徽省农业科学院农业部转基因生物产品成分监督检验测试中心水稻组保存)，获得阳性克隆。

3.2、将成熟种子去掉颖壳后，用70％酒精浸泡种子1min，倒掉酒精。用含有1滴Tween20的50％次氯酸钠(原液有效氯浓度大于4％)溶液浸泡种子40min(150r/min)。倒掉次氯酸钠，无菌水洗5遍至溶液澄清，无次氯酸钠味道。无菌水浸泡种子过夜。用解剖刀种子的沿糊粉层将胚剥下，将胚接种于愈伤诱导培养基上。30℃下暗培养11天后将愈伤与胚乳及胚芽分离，将去芽的状态良好、分裂旺盛的初级愈伤组织进行预培养3～5天后用于农杆菌转化。

3.3、采用上述转入了重组表达载体的根癌农杆菌进行农杆菌介导的遗传转化，该遗传转化、转化子筛选及转基因植株再生等参照Yongbo Duan(Yongbo Duan，Chenguang Zhai，et al.An efficient and high-throughputprotocol for Agrobacterium mediated transformation based on phosphomannoseisomerase positive selection in Japonica rice(Oryza sativa L.)[J].Plant CellReport，2012.DOI10.1007/s00299-012-1275-3.)等提出的方法。共获得29株pHUN4c22-BEL植株(pHUN4c16-BEL转基因水稻植株)。

3.4，利用植物基因组小量提取试剂盒(天根生化公司)，提取所获29株pHUN4c16-BEL转基因水稻植株的基因组DNA。以该DNA为模板，用Phusion高保真DNA聚合酶(NEB公司)PCR扩增包含靶标区域的序列，其中PCR扩增所用的引物为上述Bel KO1genome check FP和Bel KO1genome check RP。

3.5，以Bel KO1genome check FP为引物对所获PCR扩增片段直接测序，分析靶标位点的突变。测序结果表明，在所测29株植株中，有20棵植株全部带有BEL基因靶标序列上的突变，突变效率为68.9％；突变的形式包括碱基的插入和/或缺失。部分结果如图4所示。

Claims (9)

1.一种骨干质粒载体，其特征在于，其核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

2.一种骨干质粒载体，其特征在于，所述骨干质粒载体包含向导RNA表达框和Cas9核酸酶表达框，所述向导RNA表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第107至1944位所示，所述Cas9核酸酶表达框的核苷酸序列如Seq IDNo.1第1987至8635位所示。

3.根据权利要求2所述的骨干质粒载体，其特征在于，

所述向导RNA表达框包括：小麦TaU3p启动子、壮观霉素抗性基因SpR、人工合成的sgRNA骨架序列和Poly-T终止子，其中，所述小麦TaU3p启动子的核苷酸序列如Seq ID No.1第107至631位所示，壮观霉素抗性基因SpR的核苷酸序列如Seq ID No.1第691至1701位所示，人工合成的sgRNA骨架序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第1853至1936位所示，Poly-T终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第1937至1944位所示；

所述Cas9核酸酶表达框包括ZmUBI启动子、植物偏好密码子改造后的Cas9编码序列和35s终止子，其中，ZmUBI启动子的核苷酸序列如SeqID No.1第1987至4018位所示，Cas9编码序列的核苷酸序列如Seq ID No.1第4037至8308位所示，35s终止子的核苷酸序列如Seq ID No.1第8309至8635位所示。

4.根据权利要求3所述的骨干质粒载体，其特征在于，

所述骨干质粒载体还包括T-DNA的左、右边界序列，其中所述左边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第10884至10907位所示，所述右边界的核苷酸序列如Seq ID No.1第1至25位所示；所述向导RNA表达框和所述Cas9表达框位于所述左边界和所述右边界之间。

5.利用权利要求1-4中任意一项所述的骨干质粒载体构建重组载体的方法，其特征在于，所述方法包括：

按照目的基因的编码序列，选择双链靶标片段，以整合到所述骨干质粒载体中，与sgRNA骨架序列连接形成带有所述标靶片段的向导RNA，

其中，所述靶标片段位于所述目的基因上，所述双链靶标片段的一条链具有5’-(N)_X-NGG-3’结构，其中(N)_X表示数目为X的一条碱基序列{N₁,N₂……N_x}，N₁,N₂……N_x中的每一个表示碱基A、G、C、T中的任意一个，NGG中的N也为碱基A、G、C、T中的任意一个。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述方法包括：按照靶标序列的核酸排列顺序，分别合成具有5’-AGCG-(N)_X-3’特征的正向寡核苷酸链和具有5’-AAAC-(N)_X-3’特征的反向寡核苷酸链，其中所述正向寡核苷酸链中的(N)_X和反向寡核苷酸中的(N)_X具有反向互补特征；

用BsaI内切酶切开所述骨干质粒载体，用所述正向寡核苷酸链和所述反向寡核苷酸链退火后形成的双链核苷酸替换壮观霉素抗性基因，通过Kana霉素正向选择和壮观霉素负向选择，筛选形成用于作物目的基因打靶的重组载体。

7.根据权利要求5或6所述的方法构建的重组载体在作物基因打靶中的应用，其特征在于，其包括如下步骤：

将所述重组载体转入作物细胞，使细胞同时含有针对靶标基因的向导RNA和Cas9核酸酶；在向导RNA和Cas9核酸酶的共同作用下，对目的基因的双链靶标片段进行剪切，诱发作物细胞自身的DNA修复功能，实现目的基因中靶标片段的随机插入和/或随机缺失。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用用于获得带有目的基因中靶标片段上的随机插入和/或随机缺失的作物植株，其包括利用所述作物细胞再生植株。

9.一种宿主菌，其特征在于，所述宿主菌包含权利要求5中所述的重组载体。