CN107043775B - 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种能促进棉花侧根发育的sgRNA，该sgRNA的靶标序列分别由SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成，两个靶标序列也可结合在一起使用。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑系统抑制棉花精氨酸酶基因的表达。与野生型植株相比，本发明通过沉默棉花精氨酸酶基因所得的基因编辑植株，其根系的侧根数明显增多，根表面积明显增大，No含量增加，提高了棉花对氮素和其他营养物质的吸收和利用，对于提高棉花纤维产量和质量、以及提高棉花的抗逆性均有重要意义。

Description

一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种能促进棉花侧根发育的sgRNA，还涉及利用CRISPR/Cas9基因编辑技术促进棉花侧根发育的方法。
背景技术
植物根系在植物水分和氮素的吸收，碳的存贮以及支撑地上部分等生理活动中起着重要作用；同时，植物根系也是植物应对生物和非生物胁迫的重要功能器官。棉花根系是典型的直根系，包括主根和侧根。侧根的发育对于根系的功能有着重要的作用。侧根数增加，可使根表面积增加，进一步促进整个植株的发育，最终达到增加棉花纤维产量的目的。尤其在土地干旱或贫瘠条件下，根系的发育起着至关重要的作用。因此，增加侧根数，以及增大根表面积，不仅能扩大棉花的可种植面积，使其适应在干旱和贫瘠的土地上生长，而且对提高棉花的纤维产量和纤维品质具有重要意义。
精氨酸(Arg)是植物体内一种重要的氨基酸，它不仅是构成蛋白的重要成分和氮素储藏运输的关键分子，与植物氮素利用效率密切相关，而且是合成一氧化氮(NO)、脲、多胺等重要分子的前体。NO是促进根系发育的重要信号分子，在植物体内，NO可由Arg经一氧化氮合酶(NOS)催化合成(Correa等.Planta,2004,218:900-905)。而NOS的活性受精氨酸酶(ARG)活性的影响，当ARG活性增高时，NOS活性降低，原因是它们有着共同的底物Arg。在拟南芥中，argah1-1和argah2-1沉默的突变体植物体内NO含量增加，并且导致侧根和不定根数增加，突变体植株侧根的数量较野生型增长了一倍(Teresita,Plant Physiol,2008,147:1936-1946)。在陆地棉中过表达水稻精氨酸酶基因(OsARG)，使得转基因棉花中NO含量降低，并抑制其侧根的生长(Meng等.PLoS ONE,2015,10(11):e0141530)。
CRISPR/Cas9是一种新型高效的基因编辑技术，已广泛应用于特定位点的基因编辑。与之前的锌指核酸酶(Zinc-finger nuclease,ZFN)和转录激活因子样效应子核酸酶(Transcriptionactivator-like effector nucleases,TALEN)基因编辑技术相比，由于其载体构建方法简单、编辑效率高、操作上更灵活便捷，在水稻、小麦、玉米、高粱、烟草和拟南芥等植物基因修饰研究中已得到广泛应用。
陆地棉(Gossypium hirsutum Linn.)是异源四倍体作物，其染色体包含A和D两个染色体组，大多数基因为多拷贝。棉花精氨酸酶基因是棉花氮素利用相关的重要基因，该基因在陆地棉染色体上存在两个拷贝(在A和D两个染色体组中各一个拷贝)，两个拷贝的基因序列同源性达到90％以上。由于棉花中色素和多酚类物质含量较多，棉花原生质体获得较难，并且转化效率低，不能有效验证sgRNA是否具有引导Cas9酶进行基因编辑的活性，限制了CRISPR/Cas9技术在棉花中的应用。
经检索，未发现利用CRISPR/Cas9技术调控棉花侧根发育的报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种能促进棉花侧根发育的CRISPR/Cas9系统的靶标序列。
本发明另一目的在于提供上述靶标序列在抑制作物精氨酸酶基因表达上的用途。
本发明第三目的在于提供上述靶标序列在促进作物侧根发育上的用途
本发明第四目的在于提供一种能促进棉花侧根发育的sgRNA。
本发明地五目的在于提供上述sgRNA在抑制作物精氨酸酶基因表达上的用途
本发明第六目的在于提供上述sgRNA在促进作物侧根发育上的用途。
本发明第七目的在于提供一种CRISPR/Cas9基因编辑表达载体。
本发明第八目的在于提供利用上述sgRNA促进棉花侧根生长发育的方法。
本发明第九目的在于提供一种侧根数多的棉花品种的育种方法。
实现本发明的技术方案如下：
一种能促进棉花侧根发育的CRISPR/Cas9系统的靶标序列，所述的靶标序列为sgRNA1或/和sgRNA2；其中所述的sgRNA1由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的sgRNA2由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；其所述序列如下：
sgRNA1：5’-TCTTACCCTTATTCGGGAGA-3’(SEQ ID No.1)；
sgRNA2：5’-CTTTGCCCTCTCCCGAATAA-3’(SEQ ID No.2)。
上述靶标序列优选为sgRNA1。
本发明还提供了上述靶标序列在抑制作物精氨酸酶基因表达上的应用。
本发明还提供了上述靶标序列在促进作物侧根发育上的应用。
所述的靶标序列是指sgRNA1或sgRNA2；其中所述的sgRNA1由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的sgRNA2由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成。
所述的作物是指棉花、大豆或油菜等直根系作物。
所述的棉花是指陆地棉(Gossypium hirsutum Linn.)；如R18等。
所述的靶标序列sgRNA1和sgRNA2均来自棉花精氨酸酶基因(GhARG)第一个外显子。
本发明还提供了一种能促进棉花侧根发育的sgRNA，其靶标序列为sgRNA1或/和sgRNA2；其中所述的sgRNA1由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的sgRNA2由SEQ IDNo.2所示的核苷酸序列组成。
所述的sgRNA包括靶标序列和与Cas9酶结合的通用核酸序列。所述的靶标序列是指sgRNA1或sgRNA2。
本发明还提供了上述sgRNA在抑制作物精氨酸酶基因表达上的应用。
本发明还提供了上述sgRNA在促进作物侧根发育上的应用。
所述的sgRNA的靶标序列为sgRNA1或sgRNA2。
所述的作物是指棉花、大豆或油菜等直根系作物。
所述的棉花是指陆地棉(Gossypium hirsutum Linn.)；如R18等。
本发明还提供了含有上述sgRNA的表达盒，包括在靶标序列的上游添加烟草NtU6启动子，在靶标序列的下游添加CRISPR/Cas9基因编辑系统中通用的与Cas9酶结合的42bp发卡结构序列以及40bp终止子；所述的靶标序列是指sgRNA1或sgRNA2。
本发明还提供了一种CRISPR/Cas9基因编辑表达载体(pBIGFP-Cas9-gRNA1或pBIGFP-Cas9-gRNA2)，该表达载体由GFP和Cas9融合基因的表达盒与上述含有sgRNA的表达盒同时插入pBI21植物表达载体构建而成；其中所述的含有sgRNA的表达盒由烟草NtU6启动子和40bp sgRNA终止子调控表达；所述的GFP和Cas9融合基因的表达盒是将Cas9基因与绿色荧光蛋白(GFP)基因融合形成GFP-Cas9融合基因，在其两端各加一个核定位信号(NLS)序列，融合基因由35S启动子和35S终止子调控表达。
本发明还提供了一种促进棉花侧根生长发育的方法，包括抑制棉花精氨酸酶基因的表达。
上述方法中所述的抑制棉花精氨酸酶基因表达是通过对棉花中精氨酸酶基因进行基因编辑实现的。
上述方法中所述的基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现的。
上述方法中所述的CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列是sgRNA1或sgRNA2；所述的sgRNA1由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成；所述的sgRNA2由SEQ ID No.2所示的核苷酸序列组成；
sgRNA1：5’-TCTTACCCTTATTCGGGAGA-3’(SEQ ID No.1)；
sgRNA2：5’-CTTTGCCCTCTCCCGAATAA-3’(SEQ ID No.2)。
所述的棉花精氨酸酶基因的登录号分别为:GALV01045531和XM_016842747。
上述促进棉花侧根生长发育的方法，包括如下步骤：
(1)设计靶标序列sgRNA1或sgRNA2，按照SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列分别人工合成靶标序列sgRNA1或sgRNA2；
(2)sgRNA表达盒的构建：sgRNA表达盒由烟草NtU6启动子、靶标序列(sgRNA1或sgRNA2)和CRISPR/Cas9基因编辑系统中通用的42bp Cas9酶结合的发卡结构序列以及40bp终止子序列组成；通过分段人工合成单链DNA片段然后退火形成互补双链DNA的方式，将完整的sgRNA表达盒克隆连接于表达载体上，具体方法为：依据pBI121的酶切位点，在靶标序列sgRNA1或sgRNA2的5’端添加4个碱基TCGA，分别获得SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，将SEQ ID No.3或SEQ ID No.5反向互补分别得到sgRNA1或sgRNA2的反向序列，在其反向序列5’端引入4个碱基CTAG分别获得序列SEQ ID No.4或SEQ ID No.6，人工合成SEQ ID No.3～6；将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4退火，或将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6退火，分别形成双链DNA片段；
(3)将Cas9蛋白基因序列连接到pBI121载体上，并在其序列前插入绿色荧光蛋白(GFP)基因序列，形成GFP-Cas9融合基因序列，在其前后两端各加一个核定位信号(NLS)序列，由35S启动子和35S终止子启动和终止转录；
(4)将步骤(2)所得的含有靶标序列sgRNA的双链DNA片段与步骤(3)中所得的GFP-Cas9融合基因序列串联到同一个载体上，形成CRISPR/Cas9基因编辑表达载体；分别命名为pBIGFP-Cas9-gRNA1或pBIGFP-Cas9-gRNA2。
(5)将步骤(4)所得的基因编辑表达载体导入农杆菌，利用农杆菌介导的棉花遗传转化，将表达载体转入棉花，筛选获得棉花精氨酸酶基因(GhARG)发生突变而沉默表达的转基因植株，即获得侧根数增多的棉花植株。
所述棉花精氨酸酶基因(GhARG)的登录号:GALV01045531和XM_016842747)；所述GhARG是指棉花中编码精氨酸酶的基因。
本发明还提供一种增加棉花侧根数的方法，包括抑制棉花中精氨酸酶基因(GhARG)的表达。
本发明还提供一种侧根数多的棉花品种的育种方法，以上述方法获得的侧根数多的棉花品种为亲本之一，通过杂交或回交的方法，在后代中选择侧根数多的材料，选择4～5代，即可获得新的侧根数多的棉花品种。
与现有技术相比，本发明具有的优点和有益效果：本发明分别利用棉花精氨酸酶基因(GhARG)第一个外显子设计获得两个sgRNA(其靶标序列为sgRNA1或sgRNA2)，单独或两个sgRNA组合使用均可以实现对棉花基因组中精氨酸酶基因进行基因编辑，造成移码突变，从而敲除精氨酸酶基因。与野生型相比，本发明获得的GhARG定点编辑棉花株系侧根数显著增加，根表面积增大，NO含量增加，提高了棉花对氮素和其他营养的吸收和利用，本发明对于提高棉花纤维产量和质量、以及提高棉花的抗逆性均有重要意义。
附图说明
图1.本发明靶标位点序列(sgRNA1和sgRNA2)示意图。
图2.pBIGFP-Cas9-sgRNA1/sgRNA2表达载体示意图。
图3.部分转化pBIGFP-Cas9-sgRNA1愈伤系编辑效率检测电泳图谱；其中1-15为转化pBIGFP-Cas9-sgRNA1的愈伤系，WT为野生型。
图4.部分转化pBIGFP-Cas9-sgRNA2愈伤系编辑效率检测电泳图谱；其中1-15为转化pBIGFP-Cas9-sgRNA2的愈伤系，WT为野生型。
图5.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株在高氮(HN)条件下的根系扫描图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图6.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株在低氮(LN)条件下的根系扫描图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图7.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株在高氮(HN)和低氮(LN)条件下侧根数测定结果的柱形图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图8.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株在高氮(HN)和低氮(LN)条件下根表面积测定结果柱形图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图9.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株精氨酸酶活性测定柱形图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图10.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株NO含量测定柱形图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
图11.转pBIGFP-Cas9-sgRNA1的T1代植株NOS活性测定柱形图；其中WT为野生型，L24为T1代植株材料，L28为T1代植株材料。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步的解释和说明，但不对本发明的范围构成限制。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1 棉花精氨酸酶(ARG)基因GhARG靶标序列的获得
利用NCBI在线数据库查找棉花精氨酸酶基因GhARG并下载，依据Wagner JC等(Nature Methods,2014,11(9):915-8)sgRNA设计方法，在棉花精氨酸酶(GhARG)基因第一个外显子序列设计靶标序列，根据靶向位点、错配碱基数、错配位置等进行优化，共获得两个靶点序列，分别命名为sgRNA1和sgRNA2(图1)。
sgRNA1：5’-TCTTACCCTTATTCGGGAGA-3’(SEQ ID No.1)；
sgRNA2：5’-CTTTGCCCTCTCCCGAATAA-3’(SEQ ID No.2)。
实施例2、CRISPR/Cas9基因编辑系统表达载体构建
按照如下方法进行：
(1)在实施例1中所得的sgRNA1序列的3’端添加烟草NtU6启动子，5’端添加与Cas9酶结合的发卡结构和终止子序列，组合成完整的表达盒。根据载体pBI121的酶切位点，在表达盒的5’端引入额外的4个碱基TCGA获得序列3(见SEQ ID No.3)，将序列3(SEQ ID No.3)反向互补得到sgRNA1的反向序列，在其反向序列5’端引入4个碱基CTAG，获得序列4(见SEQID No.4)。
序列3：
5’-TCGACATAGCGATTGTCTTACCCTTATTCGGGAGAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’(SEQ ID No.3)
序列4:
5’-CTAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA TTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTCCCGAATAAGGGTAAGACAATCGCTATG-3’(SEQ ID No.4)
按照上述同样方法，获得sgRNA2靶标序列的相应序列5(SEQ ID No.5)和序列6(SEQ ID No.6)
序列5:
5’-TCGACATAGCGATTGCTTTGCCCTCTCCCGAATAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3’(SEQ ID No.5)
序列6:
5’-CTAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTA TTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAACTTATTCGGGAGAGGGCAAAGCAATCGCTATG-3’(SEQ ID No.6)
(2)依据步骤(1)中设计的序列，送交生工生物工程(上海)股份有限公司合成序列3(SEQ ID No.3)和序列4(SEQ ID No.4)。然后将序列3和序列4退火合成双链DNA片段。具体操作如下：序列3和序列4的DNA单链加水溶解至10μM，各取5μL于PCR管中，运行PCR程序，95℃5min；90℃1min，85℃1min；80℃1min；75℃1min；70℃1min；随即放入65℃水中自然冷却至室温，最终获得包含sgRNA1的双链DNA片段，将所得双链DNA稀释30倍备用。
按照上述同样方法，将序列5和序列6退火，获得有关sgRNA2靶标序列相应的双链DNA片段。
(3)pBI21GFP-Cas9表达载体的构建
本发明所用的Cas9酶为Ⅱ型Cas核酸酶，为了能够在活细胞中实时监测Cas9酶表达量，本发明将GFP基因与Cas9基因融合表达。为了能够提高GFP：Cas融合蛋白核定位效率，在融合基因两端分别加一个核定位信号(NLS)序列。包含两个NLS的融合基因ORF，由35S启动子和35S终止子调控表达。利用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切融合基因表达盒和pBI21，连接后获得pBI21GFP-Cas9载体。反应体系为：融合基因表达盒1μL，pBI121载体3μL，T4连接酶(购自NEB公司)1μL，T4连接酶Buffer 1μL,H2O 4μL。16℃过夜连接，得连接产物pBI21GFP-Cas9载体。
将100μL E.Coli感受态(购自全式金公司Trans1-T1感受态)加入连接体产物中，冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上3min。加入500μL液体LB培养基，37℃、200rpm摇床培养1小时使菌体复苏。用移液器接入含有Kan抗性的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
挑取单菌落于500uL含有50ng/L卡那霉素的LB液体培养基中震荡培养8h(37℃，250rpm)。随机挑取5个卡那霉素抗性阳性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司测序验证。测序结果中GFP:Cas9融合基因表达盒正确的克隆子，即为pBI21GFP-Cas9表达载体。
(4)CRISPR/Cas9基因编辑表达载体构建
将步骤(2)中得到的双链DNA片段与步骤(3)pBIGFP-Cas9载体用KpnI和ApaI进行双酶切，并用T4连接酶进行连接，获得pBIGFP-Cas9-sgRNA1表达载体。反应体系为：DNA片段1μL，pBIGFP-Cas9表达载体3μL，T4连接酶(购自NEB公司)1μL，T4连接酶Buffer 1μL,H2O 4μL。16℃过夜连接，并用于转化大肠杆菌。
取100μL E.Coli感受态(购自全式金公司Trans1-T1感受态)加入链接产物中，冰浴30min，42℃热激45s，迅速置于冰上3min。加入500μL液体LB培养基，37℃、200rpm摇床培养1小时使菌体复苏。用移液器接入含有Kan抗性的固体LB培养基上，37℃培养过夜。
挑取单菌落于500uL含有50ng/L卡那霉素的LB液体培养基中震荡培养8h(37℃，250rpm)。随机挑取5个卡那霉素抗性阳性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司测序验证。测序结果中GFP:Cas9融合基因表达盒和sgRNA1序列正确的克隆子，即为CRISPR/Cas9基因编辑表达载体，命名为pBIGFP-Cas9-sgRNA1。
按照上述同样方法，获得靶标序列sgRNA2的CRISPR/Cas9基因编辑表达载体pBIGFP-Cas9-sgRNA2。
实施例3、棉花转基因植株的获得
包括如下步骤：
1、将实施例2中所得的表达载体pBIGFP-Cas9-sgRNA1导入农杆菌GV3101(农杆菌GV3101由中国农业科学院生物技术研究所提供)，获得含有基因编辑表达载体的农杆菌。具体步骤如下：将实施例1中所得的10ng表达载体pBIGFP-Cas9-sgRNA1加入100μL农杆菌GV3101感受态中，冰上放置30min，液氮冷冻10min，42℃热激90s，冰上放置3min；加入700μL液体YEB培养基，28℃、200rpm摇床培养6小时使菌体复苏。用移液器接入含有壮观霉素和卡纳霉素抗性的固体YEB培养基上，28℃培养2天。挑取单菌落于500uL含有50ng/L卡那霉素的YEB液体培养基中于28℃、250rpm震荡培养10h。随机挑取5个卡那霉素抗性阳性克隆子，送交生物工程(上海)股份有限公司进行测序验证。测序结果中GFP:Cas9融合基因表达盒和sgRNA1或sgRNA2序列正确的克隆子，即为含有CRISPR/Cas9基因编辑表达载体的农杆菌。
按照上述同样的方法，将表达载体pBIGFP-Cas9-sgRNA2导入农杆菌GV3101，获得含有sgRNA2的基因编辑表达载体的农杆菌。
2、农杆菌介导的遗传转化以及转基因植株的获得
以陆地棉R18(R18由陆地棉Coker312选育获得，由中国农业科学院生物技术研究所提供)为受体，以步骤1中所得的含有pBIGFP-Cas9-sgRNA1农杆菌侵染棉花下胚轴，通过组织培养获得转基因T0代再生植株。其具体步骤如下：
(1)取饱满、干净的R18棉花种子，用无水乙醇消毒5min，然后用无菌ddH2O漂洗一遍；之后用30％双氧水消毒4-6小时，再用无菌ddH2O漂洗3次，去除多余的双氧水。将种子浸泡在无菌水中过夜萌发，去除种皮并播种于MS培养基上培养一周。
(2)挑取含有CRISPR/Cas9基因编辑表达载体的农杆菌单菌落于500uL含有50ng/L卡那霉素的YEB液体培养基中，于28℃、250rpm下震荡培养10h。在4℃、1500rpm下离心，收集菌体，并用MS液体培养基重悬，获得OD600nm＝0.3-0.6的农杆菌悬液。用于侵染棉花下胚轴。
(3)取步骤(1)中棉花幼苗的下胚轴，切成5mm左右小段，用步骤(2)中所得的农杆菌悬液侵染30min，于添加200mg/L卡纳霉素和500mg/L羧卞青霉素的1/2MS培养基上培养筛选，长出的愈伤组织在添加200mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上继代培养，一个月继代一次，直至胚性愈伤组织长出幼芽。取健壮幼芽转移至1/2MS固体培养基上培养2-3周诱导生根。发育完整的再生苗经过炼苗后移至土壤中继续生长。
按照上述步骤(1)、(2)、(3)所述方法，以陆地棉R18为受体，以步骤1中所得的含有pBIGFP-Cas9-sgRNA2农杆菌侵染棉花下胚轴，通过组织培养获得转基因T0代再生植株。
实施例4、基因编辑效率检测鉴定
1、愈伤组织GhARG基因编辑效率检测鉴定
(1)实施例3中的农杆菌侵染一个月后，分别随机取15个其转化pBIGFP-Cas9-sgRNA1的愈伤组织，提取基因组DNA用于检测编辑效率。以基因编辑位点上下游分别设计正向和反向引物进行PCR扩增，由于两个编辑位点(sgRNA1和sgRNA2)在基因组距离非常近，所以设计一对引物(Fp和Rp)即可以同时鉴定两个编辑位点的编辑效率。当基因组发生基因编辑而导致染色体发生断裂，同时由于细胞内非同源重组修复导致靶标位点基因组序列发生插入或者缺失突变而改变了靶标位点的基因组序列，进一步改变了PCR产物序列。同时，由于靶标位点序列含有一个BslI酶切位点，所以当基因发生编辑时，PCR产物中BslI酶切位点也发生了突变，导致PCR产物不能被BslI酶消化。
所述的引物Fp和Rp如下：
Fp:
5’-CAAAGCACGCACAAGTTCTCCCTAGTAACAATATTATTATTATAAATTTCAAAAGGGTTAAAATGGAATGGAAAAAAAC-3’(SEQ ID No.7)；
Rp：5’-GAGACTGGGACTGTTCATACAAGGCACG-3’(SEQ ID No.8)。
其中PCR反应体系(50uL)：dNTP 3uL；Buffer 5uL；Fp 2uL；Rp 2uL；模版2uL；Tag1uL；ddH2O 35uL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃30s，35个循环；72℃5min。
(2)愈伤组织基因编辑效率检测。取步骤(1)中的PCR扩增产物，用BslI进行酶切；然后将所得酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，以酶切和没有酶切的R18非转基因基因组PCR产物为对照，对比分析电泳图中不同愈伤组织基因组DNA PCR产物中酶切条带和不能酶切的条带光密度比值计算基因编辑效率，即基因编辑效率为单一样本中不能酶切条带光密度值与不能酶切条带和酶切开条带光密度值之和的比值。
(3)愈伤组织基因编辑类型检测。取步骤(1)中得到的不同样本PCR扩增产物进行TA克隆后，选20-30个单克隆进行测序。
结果发现基因编辑表达载体pBI-Cas9-gRNA1在目标靶点均成功的发生了编辑。酶切PCR产物电泳图光密度分析表明，随机抽取的15个sgRNA1愈伤组织编辑位点的编辑效率为10～98％(见图3)。sgRNA1的编辑效率高，15个愈伤系中有5个(见图3，sgRNA1泳道5，6，7，9，14)编辑效率达到80-98％。选择sgRNA1的愈伤系进行继代并获得再生植株。
同时，PCR产物测序结果表明所选15个愈伤系中的GhARG均有编辑，并且在A和D两个染色体组上GhARG的均被编辑，证明本发明的sgRNA是有效的。然而由于愈伤组织可能并非由同一个细胞分裂而来，所以编辑类型较复杂，包括碱基的插入和删除等多种类型，同时也有未编辑的野生型序列。
按照上述同样方法，对转化pBIGFP-Cas9-sgRNA2的愈伤组织进行基因编辑效率的检测，结果(见图4)sgRNA2中只有3个愈伤系(图4，sgRNA2泳道1，7和13)的基因编辑效率超过70％。
2、对T0代再生植株的鉴定
T0代再生植株line1-15，均来自sgRNA1转化的愈伤系经过继代产生的再生苗，提取再生植株的DNA，按照上述步骤1的方法进行鉴定。
提取T0代再生植株line1-15基因组DNA进行PCR检测，测序结果表明陆地棉R18A和D两个染色体组上的精氨酸酶基因Gh_A05G2143和Gh_D05G2397均被编辑。序列比对分析表明两个基因编辑后，产生了不同的序列突变，导致在同一个转基因植株内产生多个不同的基因编辑类型。
3、对T1代植株的鉴定
分别对T0代编号为line6和line9的转基因植株进行田间自交选育，获得T1代植株材料L24和L28。按照步骤1所述的的方法对不同转基因植株基因组DNA进行PCR扩增，测序分析靶点的编辑类型。结果发现，T1代植株中两个拷贝的精氨酸酶基因Gh_A05G2143和Gh_D05G2397均发生了基因编辑，且基因编辑类型比亲本T0代材料明显减少，证明CRISPR/Cas9基因编辑可以遗传，其基因编辑类型也随着自交代数的增加而减少并趋于纯合。
实施例5T1代植株的根系表型的观测试验
1、根系表型的分析
取T1代植株L24和L28的种子以及对照(非转基因R18)种子，用无水乙醇消毒5min，然后用无菌ddH2O漂洗一次，再用30％双氧水消毒4-6小时，接着用无菌ddH2O漂洗3次，将种子浸泡在无菌ddH2O中过夜，待种子萌发后去除种皮，分别于低氮培养基LN(不含氮1/2MS培养基)和高氮培养基HN(1/2MS培养基添加2.475g/L NH4NO3)上培养，在28℃，光照16h和黑暗8h条件下培养一周。培养一周后，随机挑取L24和L28以及野生型每个株系取三棵幼苗作为重复实验，将根系从培养基中取出，用水冲去残留培养基，利用WinRHIZO植物根系扫描系统扫描根系图片并计算侧根数及根表面积。
结果(见图5、图6、图7和图8)在不同氮素含量水平下，L24和L28转基因棉花植株的侧根数和根表面积均较野生型有所增加。在高氮条件下，L24和L28的侧根数分别比野生型增加了25％和46％，根表面积分别增加了52％和74％。表明转基因棉花中由于基因编辑导致精氨酸酶基因发生突变，抑制了精氨酸酶基因的表达，进一步促进棉花侧根数和根表面积的增加。
实施例6T1代植株的精氨酸酶活性检测试验
利用精氨酸酶活性检测试剂盒(sigma公司)检测转基因棉花中精氨酸酶活性。其检测原理为：精氨酸酶催化精氨酸生成尿素和鸟氨酸，尿素可与底物进行显色反应，通过测定产物的OD值来计算精氨酸酶的活性，具体步骤如下：
(1)取T1代植株L24和L28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1mL细胞和组织裂解液(含磷酸酶抑制剂)(上海碧云天生物技术有限公司)；然后在13000×g离心10min，取上清得到酶粗提取液；
(2)在96孔板中加入反应液(精氨酸和Mn离子溶液)10μL，加入40μL酶粗提取液，37℃反应4h，避光。以未加底物精氨酸的酶液作为阴性对照，分别加入50μL1mM标准工作液和50μL水作为阳性对照和空白对照。
(3)加入与尿素反应的显色试剂200μL，并补加10μL反应液，室温下显色1h。
(4)使用酶标仪读取430nm的OD值(A430)。精氨酸酶的计算公式为：
精氨酸酶活性＝(A样品-A阴性)*(1mM×50×103)/(A标准-A水)*V*T
其中T＝反应时间；V＝样品体积；1mM＝尿素标准品浓度。
结果(见图9)转基因植株L24和L28中的精氨酸酶活性较野生型显著降低，说明T1代植株L24和L28中的精氨酸酶基因的表达受到了抑制。
实施例7T1代植株中NO含量和NOS活性检测试验
(一)NO含量检测：
利用硝酸盐/亚硝酸(NOX)盐检测试剂盒(sigma公司)测定转基因材料中硝酸盐和亚硝酸(NOX)的含量。由于NO在植物体内极不稳定，迅速的转换成NO- 3和NO2 -(NOX)，因此常用测量NOX的含量来表示NO的含量，测定方法便是Griess实验方法。其利用磺胺与NO2的耦合产物在540nm或570nm显色的吸光度值与NO含量成线性关系来计算NO的含量。具体步骤如下：
(1)取T1代转基因植株L24和L28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1mL细胞和组织裂解液(含磷酸酶抑制剂)(上海碧云天生物技术有限公司)，然后在13000×g离心10min，取上清。
(2)以0.1nmol/μL浓度NaNO3标准品分别配制浓度为0，0.0125，0.05，0.1nmol/μL的标准液，绘制标准曲线。
(3)96孔板中加入样品格80μL，样品和标准品孔均加入硝酸还原酶，25℃反应2h，将溶液中NO- 3全部还原为NO2 -。
(4)加入Griess试剂A50μL，25℃反应5min；在加入Griess试剂B50μL，25℃反应10min，使用酶标仪测量540nm吸光度值(A450)。
(5)计算时，将A450带入标准曲线，计算出NOX -(NO2 -+NO3 -)便是NO浓度。
(二)、T1代转基因材料中一氧化氮合成酶(NOS)活性测定：
利用NOS活性检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)检测T1代转基因材料中NOS的活性。NOS可将L-精氨酸分解为L-鸟氨酸和NO，通过一种与NO结合的荧光染料DAF-FMDA，测定生成NO含量，从而计算出NOS相对活性。具体步骤如下：
(1)取T1代转基因植株L24和L28及野生型植株根0.1g，用液氮研磨成粉末，加入1mL细胞和组织裂解液(含磷酸酶抑制剂)(上海碧云天生物技术有限公司)，然后在13000×g离心10min，取上清。
(2)96孔板中加入100μL样品提取液，再加入100μLNOS检测缓冲液(含有NOS检测缓冲液，50μL；超纯水，39.8μL；精氨酸溶液，5μL；NADPH，5μL；DAF-FM DA，0.2μL)，混匀后于37℃孵育1h。
(3)使用荧光酶标仪检测，以没有样品提取液的孔为空白对照，激发波长495nm，发射波长515nm。以野生型NOS活性为1，则转基因株系中NOS的相对活性为(RFU转基因-RFU空白)/(RFUWT-RFU空白)
RFU转基因为转基因株系样品的吸光度值；RFUWT为野生型样品的吸光度值。
结果表明(见图10和图11)转基因植株L24和L28的根中NO含量较野生型显著增加，NOS活性提高，证明转基因棉花中精氨酸酶活性的降低使得NOS活性提高，促使精氨酸的代谢向着合成NO的方向进行，而NO含量的提高促进了植株侧根数和根表面积的增加，从而达到促进棉花根系发育的目的。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 一种能促进棉花侧根发育的sgRNA及其应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 靶标序列sgRNA1
<400> 1
tcttaccctt attcgggaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 靶标序列sgRNA2
<400> 2
ctttgccctc tcccgaataa 20
<210> 3
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列3
<400> 3
tcgacatagc gattgtctta cccttattcg ggagagtttt agagctagaa atagcaagtt 60
aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttt 118
<210> 4
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列4
<400> 4
ctagaaaaaa agcaccgact cggtgccact ttttcaagtt gataacggac tagccttatt 60
ttaacttgct atttctagct ctaaaactct cccgaataag ggtaagacaa tcgctatg 118
<210> 5
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列5
<400> 5
tcgacatagc gattgctttg ccctctcccg aataagtttt agagctagaa atagcaagtt 60
aaaataaggc tagtccgtta tcaacttgaa aaagtggcac cgagtcggtg cttttttt 118
<210> 6
<211> 118
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 序列6
<400> 6
ctagaaaaaa agcaccgact cggtgccact ttttcaagtt gataacggac tagccttatt 60
ttaacttgct atttctagct ctaaaactta ttcgggagag ggcaaagcaa tcgctatg 118
<210> 7
<211> 79
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Fp
<400> 7
caaagcacgc acaagttctc cctagtaaca atattattat tataaatttc aaaagggtta 60
aaatggaatg gaaaaaaac 79
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> RP
<400> 8
gagactggga ctgttcatac aaggcacg 28

Claims (3)

1.一种sgRNA在促进作物侧根发育上的应用；其特征在于所述的sgRNA的靶标序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示；所述的作物是指棉花、大豆或油菜。
2.一种促进棉花侧根生长发育的方法，其特征在于包括抑制棉花精氨酸酶基因的表达；所述的抑制棉花精氨酸酶基因表达是通过对棉花中精氨酸酶基因进行基因编辑实现的；所述的基因编辑是通过CRISPR/Cas9系统实现的；所述的CRISPR/Cas9系统中，sgRNA的靶标序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
3.权利要求2所述的促进棉花侧根生长发育的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)设计靶标序列sgRNA1或sgRNA2，按照SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示的核苷酸序列分别人工合成靶标序列sgRNA1或sgRNA2；
(2)sgRNA表达盒的构建：sgRNA表达盒由烟草NtU6启动子、sgRNA1或sgRNA2、和CRISPR/Cas9基因编辑系统中通用的42bp Cas9酶结合的发卡结构序列以及40bp终止子序列组成；通过分段人工合成单链DNA片段然后退火形成互补双链DNA的方式，将完整的sgRNA表达盒克隆连接于表达载体上，具体方法为：依据pBI121的酶切位点，在靶标序列sgRNA1或sgRNA2的5’端添加4个碱基TCGA，分别获得SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示的核苷酸序列，将SEQID No.3或SEQ ID No.5反向互补分别得到sgRNA1或sgRNA2的反向序列，在其反向序列5’端引入4个碱基CTAG分别获得序列SEQ ID No.4或SEQ ID No.6，人工合成SEQ ID No.3～6；将SEQ ID No.3和SEQ ID No.4退火，或将SEQ ID No.5和SEQ ID No.6退火，分别形成双链DNA片段；
(3)将Cas9蛋白基因序列连接到pBI121载体上，并在其序列前插入绿色荧光蛋白基因序列，形成GFP-Cas9融合基因序列，在其前后两端各加一个核定位信号序列，由35S启动子和35S终止子启动和终止转录；
(4)将步骤(2)所得的含有靶标序列sgRNA的双链DNA片段与步骤(3)中所得的GFP-Cas9融合基因序列串联到同一个载体上，形成CRISPR/Cas9基因编辑表达载体；分别命名为pBIGFP-Cas9-gRNA1或pBIGFP-Cas9-gRNA2。
(5)将步骤(4)所得的基因编辑表达载体导入农杆菌，利用农杆菌介导的棉花遗传转化，将表达载体转入棉花，筛选获得棉花精氨酸酶基因发生突变而沉默表达的转基因植株，即获得侧根数增多的棉花植株。
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