CN112553243B - CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用，技术方案是，本发明在上海生工合成目的序列xCas9，并通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401‑Cas9上，获得高效编辑载体pHSE401‑xCas9，其序列如SEQ ID NO.1所示。同时本发明在棉花原生质体和愈伤中验证载体pHSE401‑xCas9编辑效率，结果显示，本发明在棉花原生质体中验证pHSE401‑xCas9的编辑效率高于pHSE401‑Cas9；在棉花愈伤中验证pHSE401‑xCas9的编辑效率高于pHSE401‑Cas9。本发明在棉花中首次成功建立了CRISPR/xCas9基因编辑系统，该系统显示出较高的编辑效率，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及陆地棉基因组的高效编辑方法。
背景技术
CRISPR/Cas主要存在于古生物菌和细菌中，是细菌和古生物菌在抵御外来病毒和噬菌体入侵的过程中不断迚化而来的一种获得性免疫防御机制。目前，CRISPR/Cas9系统是应用最多和最成熟的基因编辑系统，已广泛应用于动植物的细胞基因编辑，研究人员在应用过程中不断改进完善并展开了具有针对性的基因组编辑工作，创制目标突变体，进行基因功能的研究。
SpCas9核酸酶可以在多种细胞和生物体中进行有效的基因编辑，可以识别经典的5'-NGG-3'PAM序列，但是此PAM序列不管是在哺乳动物还是植物中都是有限的，所以这极大的限制了Cas9的目标选择范围。而Cas9的变体xCas9 3.6可以在哺乳动物细胞内识别5'-NG-3'、5'-GAA-3'和5'-GAT-3'三种模式的PAM序列，基因编辑范围至少提高了4倍。并且xCas9 3.6在哺乳动物细胞内检测出有较高的编辑效率和较低的脱靶效应。因此，xCas93.6不仅具有广泛的PAM序列兼容性，同时具有高度的DNA靶向特异性。
不同物种微生物的Cas核酸酶识别的PAM序列不同，如：金黄色酿脓葡萄球菌Cas9(Staphylococcus aureus Cas9,SaCas9)识别的PAM序列为5'-NNGRRT-3'、脑膜炎双球菌Cas9(Neisseria meningitidis Cas9,NmeCas9)识别的PAM序列为5'-NNNNGATT-3'、空肠弯曲杆菌Cas9(Campylobacter jejuni Cas9,CjCas9)识别的PAM序列为5'-NNNNACAC-3'、毛螺科菌Cpf1(Lachnospiraceae bacterium Cpf1,LbCpf1)和氨基酸球菌Cpf1(Acidaminococcus sp Cpf1,AsCpf1)识别的PAM序列为5'-TTTV-3'等，所以研究者们选择使用不同物种微生物的Cas9蛋白或者其它类型的效应蛋白用于基因编辑，避免因PAM序列的限制而不能对目标基因进行编辑。
发明内容
本发明的目的是提供一种陆地棉基因组的高效编辑方法，特别是构建一种适用于陆地棉的碱基编辑系统。本发明基于pCBC-DT1T2和pHSE401载体构建了融合xCas9核酸酶的适用于棉花遗传转化系统的碱基编辑系统。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9，所述载体pHSE401-xCas9的序列如SEQ ID NO.1所示。
一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9的构建方法，获得目的序列xCas9，随后通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9上，得到载体pHSE401-xCas9。
具体方法为：
(1)以pUC57-xCas9为模板，利用引物xCas-F/R进行TKS扩增，获得xCas9扩增片段；
(2)对载体pHSE401-Cas9进行双酶切，酶切位点采用XbaⅠ和SacI，得到pHSE401-Cas9酶切产物；
(3)连接目的基因xCas9扩增片段和pHSE401-Cas9酶切产物，转入大肠杆菌感受态，并获得阳性克隆，即为载体pHSE401-xCas9。
一种基于载体pHSE401-xCas9构建编辑靶基因GFP的方法，包括以下步骤：
(1)利用外源GFP蛋白作为sgRNA靶基因，预测GFP基因的sgRNA序列，并分析靶序列在棉花中的脱靶效率，选择高效编缉的sgRNA序列；
(2)以pCBC-DT1T2为模板进行PCR扩增得到PCR产物，即sgRNA靶基因表达盒；
(3)建立酶切-连接体系，将PCR产物与pHSE401-xCas9连接，转入大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，测序，序列正确的质粒命名为pHSE401-xCas9-GFP。
一种载体pHSE401-xCas9在陆地棉基因组编辑中的应用。
一种载体pHSE401-xCas9在陆地棉遗传转化系统的碱基编辑中的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明在上海生工合成目的序列xCas9，并通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9上，获得高效编辑载体pHSE401-xCas9。
2、本发明在棉花原生质体中验证pHSE401-xCas9的编辑效率高于pHSE401-Cas9。
3、本发明在棉花愈伤中验证pHSE401-xCas9的编辑效率高于pHSE401-Cas9。
附图说明
图1为编辑载体pHSE401-Cas9示意图。
图2为中间载体CRISPR系统表达盒的结构示意图。
图3为扩增表达盒的PCR反应后的电泳结果图。
图4左侧图为pHSE401-Cas9-GFP，pHSE401-xCas9-GFP在原生质体中的编辑效果荧光图，右侧图为编辑效率统计图(纵坐标为百分比)。
图5为pHSE401-Cas9-GFP，pHSE401-xCas9-GFP在愈伤中的编辑效果荧光图。
图6为pHSE401-Cas9-GFP，pHSE401-xCas9-GFP在愈伤中的编辑效率对比图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1：获得pHSE401-xCas9载体
由上海生工将目的序列xCas9合成到载体pUC57上，命名为：pUC57-xCas9，xCas9序列是SEQ ID NO.1中的第3224bp-第7324bp，随后将目的序列xCas9通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9(图1)上，得到pHSE401-xCas9载体。
具体操作如下：(1)分析pHSE401-Cas9载体，选择合适的双酶切位点XbaⅠ和SacⅠ，基因引物F/R两端设计含载体上大约20bp碱基的同源臂及酶切位点序列xCas-F/R，按照表1扩增体系，表2反应程序获得xCas9片段，扩增引物序列为：
xCas-F：5’-CGATACTCGAGTAATCTAGATGGATTACAAGGACCACGA-3’(SEQ ID NO.2)
xCas-R：5’-CGAACGAAAGCTCTGAGCTCACTTCTTTTTCTTAGCCTGTCCGG-3’(SEQ IDNO.3)
表1 TKS扩增体系
PCR反应程序中，延伸时间设为30s(延长时间根据目的基因片段长度及1min扩增1000bp原则而定)，具体如表2：
表2 PCR反应程序
对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳(128v，25min)，试剂盒进行胶回收，得到xCas9扩增片段。
(2)对pHSE401-Cas9载体进行双酶切，酶切位点采用Xba Ⅰ和SacI。酶切体系如表3。
表3 Cutsmart酶切体系
37℃恒温培养箱酶切2-3h，以未切pHSE401-Cas9载体为对照进行琼脂糖凝胶电泳(130v，25min)，对切开的载体进行胶回收，得到pHSE401-Cas9酶切产物。
(3)目的基因片段与酶切载体同源重组并转入大肠杆菌感受态
根据诺唯赞公司Exnase II重组体系连接胶回收后的目的基因片段和酶切载体，重组体系如表4。
表4重组体系
体系配制完成后，37℃水浴30min后置于冰上5min。随后按照常规方法转入大肠杆菌感受态，并获得阳性克隆，即为pHSE401-xCas9载体，其序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2：基于U6-sgRNA为骨架的基因编缉载体构建
利用外源GFP蛋白作为sgRNA靶基因，并根据CRISPRscan在线分析工具(http://www.crisprscan.org/？page＝sequence)预测GFP基因的sgRNA序列，同时根据在线软件(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)分析靶序列在棉花中的脱靶效率，最后选择高效编缉的sgRNA序列，其序列为：
sgEGFP-1：5’-ATACCCAGATCATATGAAG-3’(SEQ ID NO.4)
sgEGFP-2：5’-CAGCTGCTGGGATTACACA-3’(SEQ ID NO.5)
以pCBC-DT1T2载体为模板进行四引物PCR扩增得到目的序列(序列如SEQ ID NO.6所示)，最终获得sgRNA靶基因表达盒(如图2所示)。其中，扩增引物为-BsF/-BsR和-F0/-R0，具体引物序列为：
BsF-GFP：5’-ATATATGGTCTCGATTGATACCCAGATCATATGAAGGTT-3’(SEQ ID NO.7)
F0-GFP：5’-TGATACCCAGATCATATGAAGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’(SEQ ID NO.8)
R0-GFP：5’-AACTGTGTAATCCCAGCAGCTGCAATCTCTTAGTCGACTCTAC-3’(SEQ ID NO.9)
BsR-GFP：5’-ATTATTGGTCTCGAAACTGTGTAATCCCAGCAGCTGCAA-3’(SEQ ID NO.10)
PCR反应体系见表5，PCR反应条件见表6。
表5目标序列的PCR反应体系
表6 PCR反应条件
凝胶电泳观察PCR条带是否正确(图3)，然后利用凝胶回收试剂盒(购自OMEGA公司，货号D2500-02)将PCR产物纯化。随后建立酶切-连接体系(如表7所示)进行连接，转化到大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆进行测序，阳性菌落鉴定引物为U626-IDF和U629-IDR，测序引物为U626-IDF和U629-IDF。
阳性检测和测序引物序列为：
U626-IDF：5’-TGTCCCAGGATTAGAATGAC-3’(SEQ ID NO.11)
U629-IDF：5’-TTAATCCAAACTACTGCAGCTAC-3’(SEQ ID NO.12)
U629-IDR：5’-GTTGATGGATCGAAAGAAGAGGGT-3’(SEQ ID NO.13)
将序列正确的质粒命名为pHSE401-Cas9-GFP，pHSE401-xCas9-GFP质粒。
表7酶切-连接反应体系
实施例3：检测在原生质体中的编辑效率
1、GFP转基因苗的培养：
将棉花种子放置于培养基中，置于温度25±2℃，暗培养10d左右。
2、原生质体分离：
1)取棉花幼嫩的叶片，用刀片将其中间部分切成0.5-1mm的细丝，将其放入50ml酶液中，真空泵抽真空30min，压强约15kpa，取出后静置消化5h。
注：酶解温度要保持在20-25℃，且要避光，酶解完轻轻摇晃酶解液，使原生质体释放出来。
2)加50ml W5溶液稀释酶解产物，用75μm尼龙滤膜过滤酶解液于圆底离心管中(50ml)。
注：尼龙滤膜要浸泡在75％(v/v)酒精里，用时要用水冲洗，再用W5溶液浸泡2min再过滤。
3)23℃，离心力100g，升3RPM r/min降3RPM r/min，离心3min，弃上清。
4)用10ml W5溶液轻轻悬浮，冰上放置30min；原生质体逐渐沉降，弃上清。
5)加适量MMG溶液悬浮，至于冰上，待转化。
3、原生质体转化
1)加20μg pHSE401-Cas9-GFP，pHSE401-xCas9-GFP质粒分别于2ml离心管，用去尖的枪头吸取200μl原生质体加入离心管中轻弹混匀，静止3-5min，再加250μl PEG4000，轻弹混匀，避光诱导(最好在25℃左右恒温箱中)转化30min；
2)加800μl W5溶液(室温)颠倒混匀，离心力80g，升3RPM r/min降3RPM r/min，离心3min，弃上清；
3)加1ml WI溶液，颠倒混匀，23℃培养过夜。
转化12h后，通过荧光显微镜观察绿色荧光的分布，结果如图4所示，pHSE401-Cas9-GFP中绿色荧光明显较多，pHSE401-xCas9-GFP的荧光较少，并且通过对同一大小的视野下进行统计，发现pHSE401-xCas9-GFP中发光原生质体少于pHSE401-Cas9-GFP，这说明pHSE401-xCas9的编辑系统效率高于pHSE401-Cas9的编辑系统。
实施例4：农杆菌介导的遗传转化
将脱绒的棉花种子(品种为可过表达GFP转基因苗)用质量浓度0.1％次氯酸钠杀菌，无菌水清洗数次后放入无菌苗培养基中，28℃暗培养7d；将下胚轴切成小茎段，用活化后的含有pHSE401-xCas9-GFP和pHSE401-Cas9-GFP载体的农杆菌侵染，弃菌液，并吹干(pHSE401-xCas9-GFP和pHSE401-Cas9-GFP分别侵染500个切断)；将下胚轴平铺在共培养培养基中，放入光照培养室，培养20-30d后对pHSE401-xCas9-GFP和pHSE401-Cas9-GFP的愈伤组织进行检测(图5)。取少量愈伤用CTAB的方法提取DNA，初步判断阳性愈伤，随后对阳性愈伤进行荧光检测，统计阳性愈伤的发光情况，在100块阳性愈伤中，pHSE401-xCas9-GFP编辑效率约为60％左右(针对NGG PAM序列)，pHSE401-Cas9-GFP编辑效率约为40％(针对NGGPAM序列)(图6)，因此证明pHSE401-xCas9-GFP的编辑效率大于pHSE401-Cas9-GFP。
本发明在棉花中首次成功建立了CRISPR/xCas9基因编辑系统，该系统显示出较高的编辑效率，它将成为棉花功能基因组研究新的重要的技术手段。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院棉花研究所
<120> CRISPR/xCas9基因编辑系统在棉花中的应用
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 16437
<212> DNA
<213> 亚洲棉（Gossypium arboreum）
<400> 1
taaacgctct tttctcttag gtttacccgc caatatatcc tgtcaaacac tgatagttta 60
aactgaaggc gggaaacgac aatctgatcc aagctcaagc tgctctagca ttcgccattc 120
aggctgcgca actgttggga agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg 180
gcgaaagggg gatgtgctgc aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca 240
cgacgttgta aaacgacggc cagtgccaag cttcgacttg ccttccgcac aatacatcat 300
ttcttcttag ctttttttct tcttcttcgt tcatacagtt tttttttgtt tatcagctta 360
cattttcttg aaccgtagct ttcgttttct tctttttaac tttccattcg gagtttttgt 420
atcttgtttc atagtttgtc ccaggattag aatgattagg catcgaacct tcaagaattt 480
gattgaataa aacatcttca ttcttaagat atgaagataa tcttcaaaag gcccctggga 540
atctgaaaga agagaagcag gcccatttat atgggaaaga acaatagtat ttcttatata 600
ggcccattta agttgaaaac aatcttcaaa agtcccacat cgcttagata agaaaacgaa 660
gctgagttta tatacagcta gagtcgaagt agtgattggg agaccaaccc agtggacata 720
agcctgttcg gttcgtaagc tgtaatgcaa gtagcgtatg cgctcacgca actggtccag 780
aaccttgacc gaacgcagcg gtggtaacgg cgcagtggcg gttttcatgg cttgttatga 840
ctgttttttt ggggtacagt ctatgcctcg ggcatccaag cagcaagcgc gttacgccgt 900
gggtcgatgt ttgatgttat ggagcagcaa cgatgttacg cagcagggca gtcgccctaa 960
aacaaagtta aacatcatgg gggaagcggt gatcgccgaa gtatcgactc aactatcaga 1020
ggtagttggc gtcatcgagc gccatctcga accgacgttg ctggccgtac atttgtacgg 1080
ctccgcagtg gatggcggcc tgaagccaca cagtgatatt gatttgctgg ttacggtgac 1140
cgtaaggctt gatgaaacaa cgcggcgagc tttgatcaac gaccttttgg aaacttcggc 1200
ttcccctgga gagagcgaga ttctccgcgc tgtagaagtc accattgttg tgcacgacga 1260
catcattccg tggcgttatc cagctaagcg cgaactgcaa tttggagaat ggcagcgcaa 1320
tgacattctt gcaggtatct tcgagccagc cacgatcgac attgatctgg ctatcttgct 1380
gacaaaagca agagaacata gcgttgcctt ggtaggtcca gcggcggagg aactctttga 1440
tccggttcct gaacaggatc tatttgaggc gctaaatgaa accttaacgc tatggaactc 1500
gccgcccgac tgggctggcg atgagcgaaa tgtagtgctt acgttgtccc gcatttggta 1560
cagcgcagta accggcaaaa tcgcgccgaa ggatgtcgct gccgactggg caatggagcg 1620
cctgccggcc cagtatcagc ccgtcatact tgaagctaga caggcttatc ttggacaaga 1680
agaagatcgc ttggcctcgc gcgcagatca gttggaagaa tttgtccact acgtgaaagg 1740
cgagatcacc aaggtagtcg gcaaataatg tctagctaga aattcgttca agccgacgcc 1800
gcttcgcggc gcggcttaac tcaagcgtta gatgcactaa gcacataatt gctcacagcc 1860
aaactatcag gtcaagtctg cttttattat ttttaagcgt gcataataag ccggtctcgg 1920
ttttagagct agaaatagca agttaaaata aggctagtcc gttatcaact tgaaaaagtg 1980
gcaccgagtc ggtgcttttt tttgcaaaat tttccagatc gatttcttct tcctctgttc 2040
ttcggcgttc aatttctggg gttttctctt cgttttctgt aactgaaacc taaaatttga 2100
cctaaaaaaa atctcaaata atatgattca gtggttttgt acttttcagt tagttgagtt 2160
ttgcagttcc gatgagataa accaataagc ttgcatgcct gcaggtcaac atggtggagc 2220
acgacacact tgtctactcc aaaaatatca aagatacagt ctcagaagac caaagggcaa 2280
ttgagacttt tcaacaaagg gtaatatccg gaaacctcct cggattccat tgcccagcta 2340
tctgtcactt tattgtgaag atagtggaaa aggaaggtgg ctcctacaaa tgccatcatt 2400
gcgataaagg aaaggccatc gttgaagatg cctctgccga cagtggtccc aaagatggac 2460
ccccacccac gaggagcatc gtggaaaaag aagacgttcc aaccacgtct tcaaagcaag 2520
tggattgatg tgataacatg gtggagcacg acacacttgt ctactccaaa aatatcaaag 2580
atacagtctc agaagaccaa agggcaattg agacttttca acaaagggta atatccggaa 2640
acctcctcgg attccattgc ccagctatct gtcactttat tgtgaagata gtggaaaagg 2700
aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct 2760
ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag 2820
acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg 2880
atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc 2940
atttggagag gacctcgacc tcaacacaac atatacaaaa caaacgaatc tcaagcaatc 3000
aagcattcta cttctattgc agcaatttaa atcatttctt ttaaagcaaa agcaattttc 3060
tgaaaatttt caccatttac gaacgatact cgagtaatct agatggatta caaggaccac 3120
gacggggatt acaaggacca cgacattgat tacaaggatg atgatgacaa gatggctccg 3180
aagaagaaga ggaaggttgg catccacggg gtgccagctg ctgacaagaa gtactccatc 3240
ggcctcgaca tcggcaccaa cagcgtcggc tgggcggtga tcaccgacga gtacaaggtc 3300
ccgtccaaga agttcaaggt cctgggcaac accgaccgcc actccatcaa gaagaacctc 3360
atcggcgccc tcctcttcga ctccggcgag acggcggagg cgacccgcct caagcgcacc 3420
gcccgccgcc gctacacccg ccgcaagaac cgcatctgct acctccagga gatcttctcc 3480
aacgagatgg cgaaggtcga cgactccttc ttccaccgcc tcgaggagtc cttcctcgtg 3540
ggtgaggaca agaagcacga gcgccacccc atcttcggca acatcgtcga cgaggtcgcc 3600
taccacgaga agtaccccac tatctaccac cttcgtaaga agcttgttga ctctactgat 3660
aaggctgatc ttcgtctcat ctaccttgct ctcgctcaca tgatcaagtt ccgtggtcac 3720
ttccttatcg agggtgacct taaccctgat aactccgacg tggacaagct cttcatccag 3780
ctcgtccaga cctacaacca gctcttcgag gagaacccta tcaacgcttc cggtgtcgac 3840
gctaaggcga tcctttccgc taggctcgct aagtccaggc gtctcgagaa cctcatcgcc 3900
cagctccctg gtgagaagaa gaacggtctt ttcggtaacc tcatcgctct ctccctcggt 3960
ctgaccccta acttcaagtc caacttcgac ctcgctgagg acaccaagct tcagctctcc 4020
aaggatacct acgacgatga tctcgacaac ctcctcgctc agattggaga tcagtacgct 4080
gatctcttcc ttgctgctaa gaacctctcc gatgctatcc tcctttcgga tatccttagg 4140
gttaacactg agatcactaa ggctcctctt tctgcttcca tgatcaagcg ctacgacgag 4200
caccaccagg acctcaccct cctcaaggct cttgttcgtc agcagctccc cgagaagtac 4260
aaggagatct tcttcgacca gtccaagaac ggctacgccg gttacattga cggtggagct 4320
agccaggagg agttctacaa gttcatcaag ccaatccttg agaagatgga tggtactgag 4380
gagcttctcg ttaagcttaa ccgtgaggac ctccttagga agcagaggac tttcgataac 4440
ggcatcatcc ctcaccagat ccaccttggt gagcttcacg ccatccttcg taggcaggag 4500
gacttctacc ctttcctcaa ggacaaccgt gagaagatcg agaagatcct tactttccgt 4560
attccttact acgttggtcc tcttgctcgt ggtaactccc gtttcgcttg gatgactagg 4620
aagtccgagg agactatcac cccttggaac ttcgagaagg ttgttgacaa gggtgcttcc 4680
gcccagtcct tcatcgagcg catgaccaac ttcgacaaga acctccccaa cgagaaggtc 4740
ctccccaagc actccctcct ctacgagtac ttcacggtct acaacgagct caccaaggtc 4800
aagtacgtca ccgagggtat gcgcaagcct gccttcctct ccggcgacca gaagaaggct 4860
atcgttgacc tcctcttcaa gaccaaccgc aaggtcaccg tcaagcagct caaggaggac 4920
tacttcaaga agatcgagtg cttcgactcc gtcgagatca gcggcgttga ggaccgtttc 4980
aacgcttctc tcggtaccta ccacgatctc ctcaagatca tcaaggacaa ggacttcctc 5040
gacaacgagg agaacgagga catcctcgag gacatcgtcc tcactcttac tctcttcgag 5100
gatagggaga tgatcgagga gaggctcaag acttacgctc atctcttcga tgacaaggtt 5160
atgaagcagc tcaagcgtcg ccgttacacc ggttggggta ggctctcccg caagctcatc 5220
aacggtatca gggataagca gagcggcaag actatcctcg acttcctcaa gtctgatggt 5280
ttcgctaaca ggaacttcat ccagctcatc cacgatgact ctcttacctt caaggaggat 5340
attcagaagg ctcaggtgtc cggtcagggc gactctctcc acgagcacat tgctaacctt 5400
gctggttccc ctgctatcaa gaagggcatc cttcagactg ttaaggttgt cgatgagctt 5460
gtcaaggtta tgggtcgtca caagcctgag aacatcgtca tcgagatggc tcgtgagaac 5520
cagactaccc agaagggtca gaagaactcg agggagcgca tgaagaggat tgaggagggt 5580
atcaaggagc ttggttctca gatccttaag gagcaccctg tcgagaacac ccagctccag 5640
aacgagaagc tctacctcta ctacctccag aacggtaggg atatgtacgt tgaccaggag 5700
ctcgacatca acaggctttc tgactacgac gtcgaccaca ttgttcctca gtctttcctt 5760
aaggatgact ccatcgacaa caaggtcctc acgaggtccg acaagaacag gggtaagtcg 5820
gacaacgtcc cttccgagga ggttgtcaag aagatgaaga actactggag gcagcttctc 5880
aacgctaagc tcattaccca gaggaagttc gacaacctca cgaaggctga gaggggtggc 5940
ctttccgagc ttgacaaggc tggtttcatc aagaggcagc ttgttgagac gaggcagatt 6000
accaagcacg ttgctcagat cctcgattct aggatgaaca ccaagtacga cgagaacgac 6060
aagctcatcc gcgaggtcaa ggtgatcacc ctcaagtcca agctcgtctc cgacttccgc 6120
aaggacttcc agttctacaa ggtccgcgag atcaacaact accaccacgc tcacgatgct 6180
taccttaacg ctgtcgttgg taccgctctt atcaagaagt accctaagct tgagtccgag 6240
ttcgtctacg gtgactacaa ggtctacgac gttcgtaaga tgatcgccaa gtccgagcag 6300
gagatcggca aggccaccgc caagtacttc ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag 6360
accgagatca ccctcgccaa cggcgagatc cgcaagcgcc ctcttatcga gacgaacggt 6420
gagactggtg agatcgtttg ggacaagggt cgcgacttcg ctactgttcg caaggtcctt 6480
tctatgcctc aggttaacat cgtcaagaag accgaggtcc agaccggtgg cttctccaag 6540
gagtctatcc ttccaaagag aaactcggac aagctcatcg ctaggaagaa ggattgggac 6600
cctaagaagt acggtggttt cgactcccct actgtcgcct actccgtcct cgtggtcgcc 6660
aaggtggaga agggtaagtc gaagaagctc aagtccgtca aggagctcct cggcatcacc 6720
atcatggagc gctcctcctt cgagaagaac ccgatcgact tcctcgaggc caagggctac 6780
aaggaggtca agaaggacct catcatcaag ctccccaagt actctctttt cgagctcgag 6840
aacggtcgta agaggatgct ggcttccgct ggtgtgctcc agaagggtaa cgagcttgct 6900
cttccttcca agtacgtgaa cttcctctac ctcgcctccc actacgagaa gctcaagggt 6960
tcccctgagg ataacgagca gaagcagctc ttcgtggagc agcacaagca ctacctcgac 7020
gagatcatcg agcagatctc cgagttctcc aagcgcgtca tcctcgctga cgctaacctc 7080
gacaaggtcc tctccgccta caacaagcac cgcgacaagc ccatccgcga gcaggccgag 7140
aacatcatcc acctcttcac gctcacgaac ctcggcgccc ctgctgcttt caagtacttc 7200
gacaccacca tcgacaggaa gcgttacacg tccaccaagg aggttctcga cgctactctc 7260
atccaccagt ccatcaccgg tctttacgag actcgtatcg acctttccca gcttggtggt 7320
gataagcggc cagcggcgac gaagaaggcg gggcaggcga agaagaagaa gtgagctcag 7380
agctttcgtt cgtatcatcg gtttcgacaa cgttcgtcaa gttcaatgca tcagtttcat 7440
tgcgcacaca ccagaatcct actgagtttg agtattatgg cattgggaaa actgtttttc 7500
ttgtaccatt tgttgtgctt gtaatttact gtgtttttta ttcggttttc gctatcgaac 7560
tgtgaaatgg aaatggatgg agaagagtta atgaatgata tggtcctttt gttcattctc 7620
aaattaatat tatttgtttt ttctcttatt tgttgtgtgt tgaatttgaa attataagag 7680
atatgcaaac attttgtttt gagtaaaaat gtgtcaaatc gtggcctcta atgaccgaag 7740
ttaatatgag gagtaaaaca cttgtagttg taccattatg cttattcact aggcaacaaa 7800
tatattttca gacctagaaa agctgcaaat gttactgaat acaagtatgt cctcttgtgt 7860
tttagacatt tatgaacttt cctttatgta attttccaga atccttgtca gattctaatc 7920
attgctttat aattatagtt atactcatgg atttgtagtt gagtatgaaa atatttttta 7980
atgcatttta tgacttgcca attgattgac aacgaattcg taatcatggt catagctgtt 8040
tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacaac atacgagccg gaagcataaa 8100
gtgtaaagcc tggggtgcct aatgagtgag ctaactcaca ttaattgcgt tgcgctcact 8160
gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 8220
ggggagaggc ggtttgcgta ttggctagag cagcttgcca acatggtgga gcacgacact 8280
ctcgtctact ccaagaatat caaagataca gtctcagaag accaaagggc tattgagact 8340
tttcaacaaa gggtaatatc gggaaacctc ctcggattcc attgcccagc tatctgtcac 8400
ttcatcaaaa ggacagtaga aaaggaaggt ggcacctaca aatgccatca ttgcgataaa 8460
ggaaaggcta tcgttcaaga tgcctctgcc gacagtggtc ccaaagatgg acccccaccc 8520
acgaggagca tcgtggaaaa agaagacgtt ccaaccacgt cttcaaagca agtggattga 8580
tgtgaacatg gtggagcacg acactctcgt ctactccaag aatatcaaag atacagtctc 8640
agaagaccaa agggctattg agacttttca acaaagggta atatcgggaa acctcctcgg 8700
attccattgc ccagctatct gtcacttcat caaaaggaca gtagaaaagg aaggtggcac 8760
ctacaaatgc catcattgcg ataaaggaaa ggctatcgtt caagatgcct ctgccgacag 8820
tggtcccaaa gatggacccc cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac 8880
cacgtcttca aagcaagtgg attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca 8940
atcccactat ccttcgcaag acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag 9000
gacacgctga aatcaccagt ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc 9060
tgtcgatcga ccatggggat tgaacaagat ggattgcacg caggttctcc ggccgcttgg 9120
gtggagaggc tattcggcta tgactgggca caacagacaa tcggctgctc tgatgccgcc 9180
gtgttccggc tgtcagcgca ggggcgcccg gttctttttg tcaagaccga cctgtccggt 9240
gccctgaatg aactccagga cgaggcagcg cggctatcgt ggctggccac gacgggcgtt 9300
ccttgcgcag ctgtgctcga cgttgtcact gaagcgggaa gggactggct gctattgggc 9360
gaagtgccgg ggcaggatct cctgtcatct caccttgctc ctgccgagaa agtatccatc 9420
atggctgatg caatgcggcg gctgcatacg cttgatccgg ctacctgccc attcgaccac 9480
caagcgaaac atcgcatcga gcgagcacgt actcggatgg aagccggtct tgtcgatcag 9540
gatgatctgg acgaagagca tcaggggctc gcgccagccg aactgttcgc caggctcaag 9600
gcgcgcatgc ccgacggcga ggatctcgtc gtgacacatg gcgatgcctg cttgccgaat 9660
atcatggtgg aaaatggccg cttttctgga ttcatcgact gtggccggct gggtgtggcg 9720
gaccgctatc aggacatagc gttggctacc cgtgatattg ctgaagagct tggcggcgaa 9780
tgggctgacc gcttcctcgt gctttacggt atcgccgctc ccgattcgca gcgcatcgcc 9840
ttctatcgcc ttcttgacga gttcttctga gcgggactct ggggttcgga tcgatcctct 9900
agctagagtc gatcgacaag ctcgagtttc tccataataa tgtgtgagta gttcccagat 9960
aagggaatta gggttcctat agggtttcgc tcatgtgttg agcatataag aaacccttag 10020
tatgtatttg tatttgtaaa atacttctat caataaaatt tctaattcct aaaaccaaaa 10080
tccagtacta aaatccagat cccccgaatt aattcggcgt taattcagta cattaaaaac 10140
gtccgcaatg tgttattaag ttgtctaagc gtcaatttgt ttacaccaca atatatcctg 10200
ccaccagcca gccaacagct ccccgaccgg cagctcggca caaaatcacc actcgataca 10260
ggcagcccat cagtccggga cggcgtcagc gggagagccg ttgtaaggcg gcagactttg 10320
ctcatgttac cgatgctatt cggaagaacg gcaactaagc tgccgggttt gaaacacgga 10380
tgatctcgcg gagggtagca tgttgattgt aacgatgaca gagcgttgct gcctgtgatc 10440
accgcggttt caaaatcggc tccgtcgata ctatgttata cgccaacttt gaaaacaact 10500
ttgaaaaagc tgttttctgg tatttaaggt tttagaatgc aaggaacagt gaattggagt 10560
tcgtcttgtt ataattagct tcttggggta tctttaaata ctgtagaaaa gaggaaggaa 10620
ataataaatg gctaaaatga gaatatcacc ggaattgaaa aaactgatcg aaaaataccg 10680
ctgcgtaaaa gatacggaag gaatgtctcc tgctaaggta tataagctgg tgggagaaaa 10740
tgaaaaccta tatttaaaaa tgacggacag ccggtataaa gggaccacct atgatgtgga 10800
acgggaaaag gacatgatgc tatggctgga aggaaagctg cctgttccaa aggtcctgca 10860
ctttgaacgg catgatggct ggagcaatct gctcatgagt gaggccgatg gcgtcctttg 10920
ctcggaagag tatgaagatg aacaaagccc tgaaaagatt atcgagctgt atgcggagtg 10980
catcaggctc tttcactcca tcgacatatc ggattgtccc tatacgaata gcttagacag 11040
ccgcttagcc gaattggatt acttactgaa taacgatctg gccgatgtgg attgcgaaaa 11100
ctgggaagaa gacactccat ttaaagatcc gcgcgagctg tatgattttt taaagacgga 11160
aaagcccgaa gaggaacttg tcttttccca cggcgacctg ggagacagca acatctttgt 11220
gaaagatggc aaagtaagtg gctttattga tcttgggaga agcggcaggg cggacaagtg 11280
gtatgacatt gccttctgcg tccggtcgat cagggaggat atcggggaag aacagtatgt 11340
cgagctattt tttgacttac tggggatcaa gcctgattgg gagaaaataa aatattatat 11400
tttactggat gaattgtttt agtacctaga atgcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt 11460
ttcgttccac tgagcgtcag accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt 11520
ttttctgcgc gtaatctgct gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg 11580
tttgccggat caagagctac caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca 11640
gataccaaat actgtccttc tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt 11700
agcaccgcct acatacctcg ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga 11760
taagtcgtgt cttaccgggt tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc 11820
gggctgaacg gggggttcgt gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact 11880
gagataccta cagcgtgagc tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga 11940
caggtatccg gtaagcggca gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg 12000
aaacgcctgg tatctttata gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt 12060
tttgtgatgc tcgtcagggg ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt 12120
acggttcctg gccttttgct ggccttttgc tcacatgttc tttcctgcgt tatcccctga 12180
ttctgtggat aaccgtatta ccgcctttga gtgagctgat accgctcgcc gcagccgaac 12240
gaccgagcgc agcgagtcag tgagcgagga agcggaagag cgcctgatgc ggtattttct 12300
ccttacgcat ctgtgcggta tttcacaccg catatggtgc actctcagta caatctgctc 12360
tgatgccgca tagttaagcc agtatacact ccgctatcgc tacgtgactg ggtcatggct 12420
gcgccccgac acccgccaac acccgctgac gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca 12480
tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg 12540
tcatcaccga aacgcgcgag gcagggtgcc ttgatgtggg cgccggcggt cgagtggcga 12600
cggcgcggct tgtccgcgcc ctggtagatt gcctggccgt aggccagcca tttttgagcg 12660
gccagcggcc gcgataggcc gacgcgaagc ggcggggcgt agggagcgca gcgaccgaag 12720
ggtaggcgct ttttgcagct cttcggctgt gcgctggcca gacagttatg cacaggccag 12780
gcgggtttta agagttttaa taagttttaa agagttttag gcggaaaaat cgcctttttt 12840
ctcttttata tcagtcactt acatgtgtga ccggttccca atgtacggct ttgggttccc 12900
aatgtacggg ttccggttcc caatgtacgg ctttgggttc ccaatgtacg tgctatccac 12960
aggaaacaga ccttttcgac ctttttcccc tgctagggca atttgcccta gcatctgctc 13020
cgtacattag gaaccggcgg atgcttcgcc ctcgatcagg ttgcggtagc gcatgactag 13080
gatcgggcca gcctgccccg cctcctcctt caaatcgtac tccggcaggt catttgaccc 13140
gatcagcttg cgcacggtga aacagaactt cttgaactct ccggcgctgc cactgcgttc 13200
gtagatcgtc ttgaacaacc atctggcttc tgccttgcct gcggcgcggc gtgccaggcg 13260
gtagagaaaa cggccgatgc cgggatcgat caaaaagtaa tcggggtgaa ccgtcagcac 13320
gtccgggttc ttgccttctg tgatctcgcg gtacatccaa tcagctagct cgatctcgat 13380
gtactccggc cgcccggttt cgctctttac gatcttgtag cggctaatca aggcttcacc 13440
ctcggatacc gtcaccaggc ggccgttctt ggccttcttc gtacgctgca tggcaacgtg 13500
cgtggtgttt aaccgaatgc aggtttctac caggtcgtct ttctgctttc cgccatcggc 13560
tcgccggcag aacttgagta cgtccgcaac gtgtggacgg aacacgcggc cgggcttgtc 13620
tcccttccct tcccggtatc ggttcatgga ttcggttaga tgggaaaccg ccatcagtac 13680
caggtcgtaa tcccacacac tggccatgcc ggccggccct gcggaaacct ctacgtgccc 13740
gtctggaagc tcgtagcgga tcacctcgcc agctcgtcgg tcacgcttcg acagacggaa 13800
aacggccacg tccatgatgc tgcgactatc gcgggtgccc acgtcataga gcatcggaac 13860
gaaaaaatct ggttgctcgt cgcccttggg cggcttccta atcgacggcg caccggctgc 13920
cggcggttgc cgggattctt tgcggattcg atcagcggcc gcttgccacg attcaccggg 13980
gcgtgcttct gcctcgatgc gttgccgctg ggcggcctgc gcggccttca acttctccac 14040
caggtcatca cccagcgccg cgccgatttg taccgggccg gatggtttgc gaccgctcac 14100
gccgattcct cgggcttggg ggttccagtg ccattgcagg gccggcagac aacccagccg 14160
cttacgcctg gccaaccgcc cgttcctcca cacatggggc attccacggc gtcggtgcct 14220
ggttgttctt gattttccat gccgcctcct ttagccgcta aaattcatct actcatttat 14280
tcatttgctc atttactctg gtagctgcgc gatgtattca gatagcagct cggtaatggt 14340
cttgccttgg cgtaccgcgt acatcttcag cttggtgtga tcctccgccg gcaactgaaa 14400
gttgacccgc ttcatggctg gcgtgtctgc caggctggcc aacgttgcag ccttgctgct 14460
gcgtgcgctc ggacggccgg cacttagcgt gtttgtgctt ttgctcattt tctctttacc 14520
tcattaactc aaatgagttt tgatttaatt tcagcggcca gcgcctggac ctcgcgggca 14580
gcgtcgccct cgggttctga ttcaagaacg gttgtgccgg cggcggcagt gcctgggtag 14640
ctcacgcgct gcgtgatacg ggactcaaga atgggcagct cgtacccggc cagcgcctcg 14700
gcaacctcac cgccgatgcg cgtgcctttg atcgcccgcg acacgacaaa ggccgcttgt 14760
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catatgtcgt aagggcttgg ctgcaccgga atcagcacga agtcggctgc cttgatcgcg 14880
gacacagcca agtccgccgc ctggggcgct ccgtcgatca ctacgaagtc gcgccggccg 14940
atggccttca cgtcgcggtc aatcgtcggg cggtcgatgc cgacaacggt tagcggttga 15000
tcttcccgca cggccgccca atcgcgggca ctgccctggg gatcggaatc gactaacaga 15060
acatcggccc cggcgagttg cagggcgcgg gctagatggg ttgcgatggt cgtcttgcct 15120
gacccgcctt tctggttaag tacagcgata accttcatgc gttccccttg cgtatttgtt 15180
tatttactca tcgcatcata tacgcagcga ccgcatgacg caagctgttt tactcaaata 15240
cacatcacct ttttagacgg cggcgctcgg tttcttcagc ggccaagctg gccggccagg 15300
ccgccagctt ggcatcagac aaaccggcca ggatttcatg cagccgcacg gttgagacgt 15360
gcgcgggcgg ctcgaacacg tacccggccg cgatcatctc cgcctcgatc tcttcggtaa 15420
tgaaaaacgg ttcgtcctgg ccgtcctggt gcggtttcat gcttgttcct cttggcgttc 15480
attctcggcg gccgccaggg cgtcggcctc ggtcaatgcg tcctcacgga aggcaccgcg 15540
ccgcctggcc tcggtgggcg tcacttcctc gctgcgctca agtgcgcggt acagggtcga 15600
gcgatgcacg ccaagcagtg cagccgcctc tttcacggtg cggccttcct ggtcgatcag 15660
ctcgcgggcg tgcgcgatct gtgccggggt gagggtaggg cgggggccaa acttcacgcc 15720
tcgggccttg gcggcctcgc gcccgctccg ggtgcggtcg atgattaggg aacgctcgaa 15780
ctcggcaatg ccggcgaaca cggtcaacac catgcggccg gccggcgtgg tggtgtcggc 15840
ccacggctct gccaggctac gcaggcccgc gccggcctcc tggatgcgct cggcaatgtc 15900
cagtaggtcg cgggtgctgc gggccaggcg gtctagcctg gtcactgtca caacgtcgcc 15960
agggcgtagg tggtcaagca tcctggccag ctccgggcgg tcgcgcctgg tgccggtgat 16020
cttctcggaa aacagcttgg tgcagccggc cgcgtgcagt tcggcccgtt ggttggtcaa 16080
gtcctggtcg tcggtgctga cgcgggcata gcccagcagg ccagcggcgg cgctcttgtt 16140
catggcgtaa tgtctccggt tctagtcgca agtattctac tttatgcgac taaaacacgc 16200
gacaagaaaa cgccaggaaa agggcagggc ggcagcctgt cgcgtaactt aggacttgtg 16260
cgacatgtcg ttttcagaag acggctgcac tgaacgtcag aagccgactg cactatagca 16320
gcggaggggt tggatcaaag tactttgatc ccgaggggaa ccctgtggtt ggcatgcaca 16380
tacaaatgga cgaacggata aaccttttca cgccctttta aatatccgtt attctaa 16437
<210> 2
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgatactcga gtaatctaga tggattacaa ggaccacga 39
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cgaacgaaag ctctgagctc acttcttttt cttagcctgt ccgg 44
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein）
<400> 4
atacccagat catatgaag 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein）
<400> 5
cagctgctgg gattacaca 19
<210> 6
<211> 626
<212> DNA
<213> 绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein）
<400> 6
atatatggtc tcgattgata cccagatcat atgaaggttt tagagctaga aatagcaagt 60
taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttt 120
gcaaaatttt ccagatcgat ttcttcttcc tctgttcttc ggcgttcaat ttctggggtt 180
ttctcttcgt tttctgtaac tgaaacctaa aatttgacct aaaaaaaatc tcaaataata 240
tgattcagtg gttttgtact tttcagttag ttgagttttg cagttccgat gagataaacc 300
aatattaatc caaactactg cagcctgaca gacaaatgag gatgcaaaca attttaaagt 360
ttatctaacg ctagctgttt tgtttcttct ctctggtgca ccaacgacgg cgttttctca 420
atcataaaga ggcttgtttt acttaaggcc aataatgttg atggatcgaa agaagagggc 480
ttttaataaa cgagcccgtt taagctgtaa acgatgtcaa aaacatccca catcgttcag 540
ttgaaaatag aagctctgtt tatatattgg tagagtcgac taagagattg cagctgctgg 600
gattacacag tttagagacc aataat 626
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atatatggtc tcgattgata cccagatcat atgaaggtt 39
<210> 8
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tgatacccag atcatatgaa ggttttagag ctagaaatag c 41
<210> 9
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
aactgtgtaa tcccagcagc tgcaatctct tagtcgactc tac 43
<210> 10
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
attattggtc tcgaaactgt gtaatcccag cagctgcaa 39
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
tgtcccagga ttagaatgac 20
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ttaatccaaa ctactgcagc tac 23
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gttgatggat cgaaagaaga gggt 24
Claims (6)
1.一种适用于陆地棉的基因编辑载体pHSE401-xCas9，其特征在于，所述载体pHSE401-xCas9的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9的构建方法，其特征在于，获得目的序列xCas9，随后通过同源臂重组克隆到目标载体pHSE401-Cas9上，得到载体pHSE401-xCas9。
3.根据权利要求2所述载体pHSE401-xCas9的构建方法，其特征在于，具体方法为：
（1）以pUC57-xCas9为模板，利用引物xCas-F/R进行扩增，获得xCas9扩增片段；引物xCas-F序列如SEQ ID NO.2所示，引物xCas-R序列如SEQ ID NO.3所示；
（2）对载体pHSE401-Cas9进行双酶切，酶切位点采用XbaⅠ和SacI，得到pHSE401-Cas9酶切产物；
（3）连接目的基因xCas9扩增片段和pHSE401-Cas9酶切产物，转入大肠杆菌感受态，并获得阳性克隆，即为载体pHSE401-xCas9。
4.一种基于如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9构建编辑靶基因GFP的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）利用外源GFP蛋白作为sgRNA靶基因，预测GFP基因的sgRNA序列，并分析靶序列在棉花中的脱靶效率，选择高效编缉的sgRNA序列；
（2）以pCBC-DT1T2 为模板进行PCR 扩增得到PCR产物，即sgRNA靶基因表达盒；
（3）建立酶切-连接体系，将PCR产物与pHSE401-xCas9连接，转入大肠杆菌感受态，挑取阳性克隆，测序，序列正确的质粒命名为pHSE401-xCas9-GFP。
5.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9在陆地棉基因组编辑中的应用。
6.一种如权利要求1所述载体pHSE401-xCas9在陆地棉遗传转化系统的碱基编辑中的应用。
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| 基于优化 sgRNA 系统提高海岛棉 CRISPR/Cas9 基因组编辑功效的研究;李继洋 等;《作物学报》;20191231;第45卷(第10期);第1522-1534页 * |
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