JP2019526271A

JP2019526271A - シトシンデアミナーゼによるｄｎａでの塩基編集確認方法

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Publication number: JP2019526271A
Application number: JP2019514036A
Authority: JP
Inventors: キム，デシク
Original assignee: Toolgen Inc; Seoul National University R&DB Foundation
Current assignee: Toolgen Inc; SNU R&DB Foundation
Priority date: 2016-09-13
Filing date: 2017-09-13
Publication date: 2019-09-19
Also published as: EP3530737A1; KR102026421B1; KR20180029937A; WO2018052247A1; US20200131536A1; US11920151B2; EP3530737A4

Abstract

（１）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、（２）ガイドＲＮＡ、および（３）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を含む、ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）用組成物、これを用いたシトシンデアミナーゼによるＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）生成方法、シトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が導入されたＤＮＡの核酸配列分析方法、およびシトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法が提供される。【選択図】図４ａ

Description

（１）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、（２）ガイドＲＮＡ、および（３）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を含む、ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）用組成物、これを用いたシトシンデアミナーゼによるＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）生成方法、シトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が導入されたＤＮＡの核酸配列分析方法、およびシトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法に関するものである。

Ｃａｓ９−連結されたデアミナーゼ（Ｃａｓ９−ｌｉｎｋｅｄｄｅａｍｉｎａｓｅ）は、遺伝的障害を誘発する点突然変異を矯正するか、人間および他の真核細胞に目的とする単一ヌクレオチド変異を導入するように標的化された方式（ｔａｒｇｅｔｅｄｍａｎｎｅｒ）で単一ヌクレオチド転換を可能にする。しかし、このようなＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム全般（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ）にかけた標的特異性はまだ多く知られていない。

プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼは、以下の４種類が報告されている：
１）ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する触媒的に欠乏したＣａｓ９（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔＣａｓ９；ｄＣａｓ９）またはＤ１０ＡＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）と、ラットのシチジンデアミナーゼであるｒＡＰＯＢＥＣ１を含む塩基エディター（ＢａｓｅＥｄｉｔｏｒｓ；ＢＥｓ）；２）ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９と、ウミヤツメウナギ（ｓｅａｌａｍｐｒｅｙ）の活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＩＤ）オーソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）であるＰｍＣＤＡ１または人間ＡＩＤを含むＴａｒｇｅｔ−ＡＩＤ；３）ＭＳ２−結合タンパク質に融合された過活性化されたＡＩＤ変異体を募集するためにＭＳ２ＲＮＡヘアピンに連結されたｓｇＲＮＡｓとｄＣａｓ９を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｘ；および４）ジンク−フィンガータンパク質またはＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｓ；ＴＡＬＥｓ）がシチジンデアミナーゼに融合されたもの。

ＤＮＡ結合モジュールとシチジンデアミナーゼ（ｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ）から構成されたプログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼはＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成せず、ゲノムで標的化されたヌクレオチド置換または塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）を可能にする。標的部位に小さい挿入または欠失（ｉｎｄｅｌｓ）を誘導するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびＺＦＮｓのようなプログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）ヌクレアーゼとは異なり、プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼは、標的部位での数個のヌクレオチド（ｗｉｎｄｏｗｏｆｓｅｖｅｒａｌｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）内で、ＣをＴ（Ｕ）に（またはより低い頻度で、ＣをＧまたはＡに変換）変換させる。プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼは人間の細胞、動物および植物で遺伝疾患を誘発する点突然変異を矯正するか、単一塩基多型性（ＳＮＰ）を生成することができる。

プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼによる塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）に対する広範囲な関心にもかかわらず、プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム全体に対する標的特異性を分析することができる手段が開発されたことがない。したがって、プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム全体に対する標的特異性を分析して、プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼの塩基編集効率、非標的サイト（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔ）などを分析することができる手段の開発が必要である。

本明細書ではプログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム全体に対する標的特異性を分析することができる手段、およびこれを通じてプログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼの塩基編集効率、非標的サイト、非標的効果などを分析することができる手段が提供される。

一例は、（１）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、またはシトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、（２）ガイドＲＮＡ、および（３）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を含む、ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）用組成物を提供する。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；および
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理する段階
を含む、ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）生成方法を提供する。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；および
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階
を含む、前記シトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が導入されたＤＮＡの核酸配列分析方法を提供する。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階；および
（ｉｖ）前記分析によって得られた核酸配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）で前記二重鎖切断部位を確認する段階
を含む、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法を提供する。

本明細書ではＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑを修正して人間ゲノムでＣａｓ９ニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）とデアミナーゼ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ）から構成された塩基エディター（例えば、ＢａｓｅＥｄｉｔｏｒ３；ＢＥ３）の特異性を評価した。ゲノムＤＮＡをＤＮＡ修飾酵素（ＤＮＡ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇｅｎｚｙｍｅｓ）の混合物およびＢＥ３で試験管内で処理してウラシル含有部位でＤＮＡ二重鎖切断（ＤＮＡｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）を生成することを確認した。本明細書で提供されるデアミナーゼを用いたＤＮＡ二重鎖切断方法およびこれを用いた核酸配列分析方法によって、ＢＥ３非標的サイトを全体ゲノムシークエンシングデータを用いて計算的に確認することができる。また、前記方法によって、ＢＥ３は高度に特異的であり、人間ゲノムでただ１８±９位置のみでシトシン−ウラシル転換を誘導するのを確認することができる。一方、本明細書で提供されるＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（ｄｉｇｅｓｔｅｄ−ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）方法によるデアミナーゼを用いたＤＮＡ二重鎖切断方法およびこれを用いた核酸配列分析方法は０．１％の置換頻度でＢＥ３非標的サイトを捕捉するに十分に敏感である。その結果、ＢＥ３およびＣａｓ９の非標的部位は多くの場合に異なるため、ゲノム全般的な特異性に対する独立的な評価が必要であるのが分かる。

まず、ＤＮＡに二重鎖切断を誘発しないシトシンデアミナーゼを用いてＤＮＡに二重鎖切断を生成する技術が提供される。

一例は、（１）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、またはシトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、（２）ガイドＲＮＡ、および（３）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を含む、ＤＮＡ二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）用組成物を提供する。前記組成物は、シトシンデアミナーゼを使用してＤＮＡ二重鎖切断を誘導するのに使用できる。

前記シトシンデアミナーゼは、ヌクレオチドに存在する塩基であるシトシン（例えば、二重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡに存在するシトシン）をウラシルに変換（Ｃ−ｔｏ−ＵｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｏｒＣ−ｔｏ−Ｕｅｄｉｔｉｎｇ）させる活性を有する全ての酵素を意味するものであって、標的部位の配列（標的配列）のＰＡＭ配列が存在する鎖に位置するシトシンをウラシルに変換させる。一例で、前記シトシンデアミナーゼは人間、猿などの霊長類、ラット、マウスなどのげっ歯類などのような哺乳類に由来したものであり得るが、これに制限されるわけではない。例えば、前記シトシンデアミナーゼはＡＰＯＢＥＣ（“ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＢｍＲＮＡｅｄｉｔｉｎｇｅｎｚｙｍｅ、ｃａｔａｌｙｔｉｃｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−ｌｉｋｅ”）ファミリーに属する酵素のうちから１種以上選択されてもよく、例えば、下記からなる群より１種以上選択されてもよいが、これに制限されるわけではない：

ＡＰＯＢＥＣ１：人間（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ）ＡＰＯＢＥＣ１（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１２９１４９５．１、ＮＰ＿００１６３５．２、ＮＰ＿００５８８０．２など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿００１３０４５６６．１、ＮＭ＿００１６４４．４、ＮＭ＿００５８８９．３など）、マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＡＰＯＢＥＣ１（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１１２７８６３．１、ＮＰ＿１１２４３６．１など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿００１１３４３９１．１、ＮＭ＿０３１１５９．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ２：人間ＡＰＯＢＥＣ２（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００６７８０．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００６７８９．３など）、マウスＡＰＯＢＥＣ２（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿０３３８２４．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００９６９４．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１２５７３４０．１、ＮＰ＿００４８９１．４など；遺伝子（ｍＲＮＡｏｒｃＤＮＡ、以下、同一）（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿００１２７０４１１．１、ＮＭ＿００４９００．４など）、マウス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１１５３８８７．１、ＮＰ＿００１３３３９７０．１、ＮＰ＿０８４５３１．１など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿００１１６０４１５．１、ＮＭ＿００１３４７０４１．１、ＮＭ＿０３０２５５．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿０５５３２３．２など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿０１４５０８．２など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡＰＯＢＥＣ３Ｅ）：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｄ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿６８９６３９．２など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿１５２４２６．３など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿６６０３４１．２、ＮＰ＿００１００６６６７．１など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＮＭ＿１４５２９８．５、ＮＭ＿００１００６６６６．１など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿０６８５９４．１、ＮＰ＿００１３３６３６５．１、ＮＰ＿００１３３６３６６．１、ＮＰ＿００１３３６３６７．１など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＮＭ＿０２１８２２．３、ＮＭ＿００１３４９４３６．１、ＮＭ＿００１３４９４３７．１、ＮＭ＿００１３４９４３８．１など）；

ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ：人間ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１１５９４７４．２、ＮＰ＿００１１５９４７５．２、ＮＰ＿００１１５９４７６．２、ＮＰ＿８６１４３８．３など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＮＭ＿００１１６６００２．２、ＮＭ＿００１１６６００３．２、ＮＭ＿００１１６６００４．２、ＮＭ＿１８１７７３．４など）；

ＡＰＯＢＥＣ４（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＡＰＯＢＥＣ３Ｅ）：人間ＡＰＯＢＥＣ４（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿９８２２７９．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿２０３４５４．２など）；マウスＡＰＯＢＥＣ４（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿００１０７４６６６．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００１０８１１９７．１など）；および

活性化誘導シチジンデアミナーゼ（Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄｃｙｔｉｄｉｎｅｄｅａｍｉｎａｓｅ；ＡＩＣＤＡまたはＡＩＤ）：人間ＡＩＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１３１７２７２．１、ＮＰ＿０６５７１２．１など；遺伝子（前に記載されたタンパク質順にこれをコードする遺伝子を記載する）：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＭ＿００１３３０３４３．１、ＮＭ＿０２０６６１．３など）；マウスＡＩＤ（タンパク質：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＰ＿０３３７７５．１など；遺伝子：ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．ＮＭ＿００９６４５．２など）など。

本明細書に使用されたものとして、標的特異的ヌクレアーゼは、遺伝子はさみ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）とも呼ばれ、目的とするゲノムＤＮＡ上の特定位置を認識して切断することができる全ての形態のエンドヌクレアーゼをひっくるめて称する。

例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、標的遺伝子の特定配列を認識しヌクレオチド切断活性を有して標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄ／ｏｒｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができる全てのヌクレアーゼから選択された１種以上であり得る。

例えば、前記標的特異的ヌクレアーゼは、
ゲノム上の特定標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子に由来したＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断ドメインが融合されたＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ）；
ジンク−フィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）；
メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）；
微生物免疫系であるＣＲＩＳＰＲに由来したＲＧＥＮ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ；例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）；
Ａｇｏホモログ（Ａｇｏｈｏｍｏｌｏｇ、ＤＮＡ−ｇｕｉｄｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）
などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

一具体例で、前記標的特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９タンパク質（ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９）、Ｃｐｆ１タンパク質（ＣＲＩＳＰＲｆｒｏｍＰｒｅｖｏｔｅｌｌａａｎｄＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ１）などのようなタイプＩＩおよび／またはタイプＶのＣＲＩＳＰＲシステムに伴うエンドヌクレアーゼからなる群より選択された１種以上であってもよい。この場合、前記標的特異的ヌクレアーゼは、ゲノムＤＮＡの標的部位に案内するための標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡを追加的に含んでもよい。前記ガイドＲＮＡは生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、例えばオリゴヌクレオチド二重鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。前記標的特異的ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡに結合されたリボ核酸−タンパク質複合体を形成（ＲＮＡ−ＧｕｉｄｅｄＥｎｇｉｎｅｅｒｅｄＮｕｃｌｅａｓｅ）してリボ核酸タンパク質（ＲＮＰ）形態で作用できる。

Ｃａｓ９タンパク質はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。

Ｃａｓ９タンパク質または遺伝子情報はＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。例えば、前記Ｃａｓ９タンパク質は、
ストレプトコッカスｓｐ．（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．）、例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＱ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１）（コード遺伝子：配列番号２２９）；
カンピロバクター属、例えば、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９タンパク質；
ストレプトコッカス属、例えば、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）またはストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｕｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９タンパク質；
ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９タンパク質；
パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、例えば、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓ９タンパク質；
フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、例えば、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）由来の例えばＣａｓ９タンパク質
などからなる群より選択された一つ以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

Ｃｐｆ１タンパク質は前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新たなＣＲＩＳＰＲシステムのエンドヌクレアーゼであって、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さくｔｒａｃｒＲＮＡが必要なく、単一ガイドＲＮＡによって作用できる。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊富なＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列を認識しＤＮＡの二重鎖を切断して粘着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ；ｃｏｈｅｓｉｖｅｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）を生成する。

例えば、前記Ｃｐｆ１タンパク質はカンジダツス（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ）属、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシドミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダツスメタノプラズマ（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来のものであってもよく、例えば、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷＣ２０１１＿ＧＷＣ２＿４４＿１７）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＣ２０１７）、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｉｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＧＷ２０１１＿ＧＷＡ＿３３＿１０）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｓｐ．（ＢＶ３Ｌ６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｍａｃａｃａｅ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＮＤ２００６）、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａｄｉｓｉｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａｂｏｖｏｃｕｌｉ（２３７）、Ｓｍｉｉｈｅｌｌａｓｐ．（ＳＣ＿ＫＯ８Ｄ１７）、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａｉｎａｄａｉ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ＭＡ２０２０）、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ（Ｕ１１２）、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａｔｅｒｍｉｔｕｍ、ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｉｂａｃｔｅｒ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｌｉｇｅｎｓなどの微生物由来のものであってもよいが、これに制限されるわけではない。

前記標的特異的エンドヌクレアーゼは、微生物から分離されたものまたは組換え的方法または合成的方法などのように人為的または非自然的生産されたもの（ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）であってもよい。一例で、前記標的特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、など）は、組換えＤＮＡによって作られた組換えタンパク質であってもよい。組換えＤＡＮ（ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＤＮＡ；ｒＤＮＡ）は多様な有機体から得られた異種または同種遺伝物質を含むために分子クローニングのような遺伝子組換え方法によって人工的に作られたＤＮＡ分子を意味する。例えば、組換えＤＮＡを適切な有機体で発現させて標的特異的エンドヌクレアーゼを生産（ｉｎｖｉｖｏまたはｉｎｖｉｔｒｏ）する場合、組換えＤＮＡは、製造しようとするタンパク質をコードするコドンのうちから前記有機体に発現するに最適化されたコドンを選択して再構成されたヌクレオチド配列を有するものであり得る。

前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼはＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失した標的特異的エンドヌクレアーゼを意味するものであって、例えば、エンドヌクレアーゼ活性を喪失しニッカーゼ活性を有する不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼ活性とニッカーゼ活性を全て喪失した不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼのうちから選択された１種以上であってもよい。前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼがニッカーゼ活性を有するものである場合、前記シトシンがウラシルに変換されると同時または順序と関係なく順次に、シトシンがウラシルに変換された鎖またはその反対鎖（例えば、反対鎖）で切断（ｎｉｃｋ）が導入される（例えば、ＰＡＭ配列の５’末端方向に３番目のヌクレオチドと４番目のヌクレオチドの間に切断（ｎｉｃｋ）が導入される）。このような標的特異的エンドヌクレアーゼの改変（突然変異）は少なくとも触媒活性を有するアスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｓｐａｒｔａｔｅｒｅｓｉｄｕｅ；例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス由来Ｃａｓ９タンパク質の場合、１０番目位置のアスパラギン酸（Ｄ１０）残基など）が任意の他のアミノ酸で置換されたＣａｓ９の突然変異を含むものであってもよく、前記他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

本明細書に使用されたものとして、前記‘他のアミノ酸’は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、バリン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジン、ライシン、前記アミノ酸の公知された全ての改変体のうち、野生型タンパク質が元来変異位置に有するアミノ酸を除いたアミノ酸のうちから選択されたアミノ酸を意味する。

一例で、前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが改変Ｃａｓ９タンパク質である場合、改変Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質（例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＱ９９ＺＷ２（ＮＰ＿２６９２１５．１））にＤ１０位置での突然変異（例えば、他のアミノ酸で置換）が導入されエンドヌクレアーゼ活性が喪失されニッカーゼ活性を有する改変Ｃａｓ９、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にＤ１０位置での突然変異（例えば、他のアミノ酸で置換）とＨ８４０位置に突然変異（例えば、他のアミノ酸で置換）が全て導入されエンドヌクレアーゼ活性およびニッカーゼ活性を全て喪失した改変Ｃａｓ９タンパク質などからなる群より選択された１種以上であってもよい。例えば、前記ＣＡｓ９タンパク質のＤ１０位置での突然変異は、Ｄ１０Ａ突然変異（Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸のうちの１０番目のアミノ酸であるＤがＡで置換された突然変異を意味する；以下、Ｃａｓ９に導入された突然変異は同様な方法で表記される）であってもよく、前記Ｈ８４０位置での突然変異はＨ８４０Ａ突然変異であってもよい。

前記シトシンデアミナーゼと不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは直接またはペプチドリンカーを通じて互いに融合された融合タンパク質（例えば、Ｎ−末端からＣ−末端方向にシトシンデアミナーゼ−不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの順に位置するか（即ち、シトシンデアミナーゼのＣ−末端に不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが融合される）、不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ−シトシンデアミナーゼの順に位置が配置（即ち、不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼのＣ−末端にシトシンデアミナーゼが融合される）されてもよい）形態で使用（または前記組成物に含まれる）されるか、精製されたシトシンデアミナーゼと不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの混合物形態で使用（または前記組成物に含まれる）されるか、シトシンデアミナーゼコード遺伝子と不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子が全て含まれた（例えば、前記二つの遺伝子は前述の融合タンパク質をコードするように含まれる）一つのプラスミド形態で使用（または前記組成物に含まれる）されるか、シトシンデアミナーゼコード遺伝子と不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子をそれぞれ別個のプラスミドに含まれているシトシンデアミナーゼ発現プラスミドと不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ発現プラスミドの混合物形態で使用（または前記組成物に含まれる）されてもよい。一具体例ではＮ−末端からＣ−末端方向にシトシンデアミナーゼ−不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの順に位置する融合タンパク質、または不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ−シトシンデアミナーゼの順に位置する融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするようにシトシンデアミナーゼコード遺伝子と不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子が一つのプラスミドに含まれている形態で使用されてもよい。

前記プラスミドは、前記シトシンデアミナーゼコード遺伝子および／または不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を挿入し、これを宿主細胞内で発現させることができる発現システムを含む全てのプラスミドであり得る。前記プラスミドは目的遺伝子発現のための要素（ｅｌｅｍｅｎｔｓ）を含むものであって、複製原点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｒｉｇｉｎ）、プロモーター、作動遺伝子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）、転写終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）などを含むことができ、宿主細胞のゲノム内への導入のための適切な酵素部位（例えば、制限酵素部位）および／または任意に宿主細胞内への成功的な導入を確認するための選別マーカおよび／またはタンパク質への翻訳のためのリボソーム結合部位（ｒｉｂｏｓｏｍｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ；ＲＢＳ）および／または転写調節因子などを追加的に含むことができる。前記プラスミドは当業界で使用されるプラスミド、例えば、ｐｃＤＮＡシリーズ、ｐＳＣ１０１、ｐＧＶ１１０６、ｐＡＣＹＣ１７７、ＣｏｌＥ１、ｐＫＴ２３０、ｐＭＥ２９０、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ８／９、ｐＵＣ６、ｐＢＤ９、ｐＨＣ７９、ｐＩＪ６１、ｐＬＡＦＲ１、ｐＨＶ１４、ｐＧＥＸシリーズ、ｐＥＴシリーズ、ｐＵＣ１９などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。前記宿主細胞は、前記シトシンデアミナーゼによって塩基編集または二重鎖切断を導入しようとする細胞（例えば、人間細胞などのような哺乳類細胞を含む真核細胞）または前記シトシンデアミナーゼコード遺伝子および／または不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を発現してシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを発現することができる全ての細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉなど）のうちから選択され得る。

前記ガイドＲＮＡは前記シトシンデアミナーゼと不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの混合物または融合タンパク質を標的部位に案内する役割を果たすものであって、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、および単一ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅｇｕｉｄｅＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）からなる群より選択された１種以上であってもよく、具体的にｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、またはｃｒＲＮＡまたはその一部とｔｒａｃｒＲＮＡまたはその一部がオリゴヌクレオチドリンカーで連結された単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの具体的配列は使用された標的特異的エンドヌクレアーゼの種類またはその由来微生物などによって適切に選択することができ、これはこの発明の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に分かる事項である。

標的特異的エンドヌクレアーゼとしてストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質を使用する場合、ｃｒＲＮＡは下記の一般式１で表され得る：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（Ｘ_ｃａｓ９）_ｍ−３’（一般式１）

上記一般式１中、
Ｎ_ｃａｓ９は標的化配列、即ち、標的遺伝子（ｔａｒｇｅｔｇｅｎｅ）の標的部位（ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）の配列によって決定される部位（即ち、標的部位の配列と混成化可能な配列である）であり、ｌは前記標的化配列に含まれているヌクレオチド数を示すものであって、１７〜２３または１８〜２２の整数、例えば、２０であってもよく；
前記標的配列の３’方向に隣接して位置する連続する１２個のヌクレオチド（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ；配列番号２３０）を含む部位はｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｘ_ｃａｓ９はｃｒＲＮＡの３’末端側に位置する（即ち、前記ｃｒＲＮＡの必須的部分の３’方向に隣接して位置する）ｍ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｍは８〜１２の整数、例えば、１１であってもよく、前記ｍ個のヌクレオチドは互いに同じであるか異なってもよく、それぞれ独立してＡ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群より選択され得る。

一例で、前記Ｘ_ｃａｓ９はＵＧＣＵＧＵＵＵＵＧ（配列番号２３１）を含むことができるが、これに制限されない。

また、前記ｔｒａｃｒＲＮＡは下記の一般式２で表され得る：
５’−（Ｙ_ｃａｓ９）_ｐ−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式２）

上記一般式２中、
６０個のヌクレオチド（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ；配列番号２３２）で表された部位はｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分であり、
Ｙ_ｃａｓ９は前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分の５’末端に隣接して位置するｐ個のヌクレオチドを含む部位であって、ｐは６〜２０の整数、例えば８〜１９の整数であってもよく、前記ｐ個のヌクレオチドは互いに同じであるかまたは異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択され得る。

また、ｓｇＲＮＡは前記ｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部位を含むｃｒＲＮＡ部分と前記ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０個ヌクレオチド）を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分がオリゴヌクレオチドリンカーを通じてヘアピン構造（ｓｔｅｍ−ｌｏｏｐ構造）を形成するものであってもよい（この時、オリゴヌクレオチドリンカーがループ構造に該当する）。より具体的に、前記ｓｇＲＮＡはｃｒＲＮＡの標的化配列と必須的部分を含むｃｒＲＮＡ部分とｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分を含むｔｒａｃｒＲＮＡ部分が互いに結合された二重鎖ＲＮＡ分子で、ｃｒＲＮＡ部位の３’末端とｔｒａｃｒＲＮＡ部位の５’末端がオリゴヌクレオチドリンカーを通じて連結されたヘアピン構造を有するものであってもよい。

一例で、ｓｇＲＮＡは、下記の一般式３で表され得る：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（オリゴヌクレオチドリンカー）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３）

上記一般式３中、（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌは標的化配列であって、前記一般式１で説明したとおりである。

前記ｓｇＲＮＡに含まれるオリゴヌクレオチドリンカーは３〜５個、例えば４個のヌクレオチドを含むものであってもよく、前記ヌクレオチドは互いに同じであるかまたは異なってもよく、Ａ、Ｕ、ＣおよびＧからなる群よりそれぞれ独立して選択され得る。

前記ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、５’末端（即ち、ｃｒＲＮＡのターゲティング配列部位の５’末端）に１〜３個のグアニン（Ｇ）を追加的に含んでもよい。

前記ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡの必須的部分（６０ｎｔ）の３’末端に５個〜７個のウラシル（Ｕ）を含む終結部位を追加的に含んでもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列は、標的ＤＮＡ上のＰＡＭ（ＰｒｏｔｏｓｐａｃｅｒＡｄｊａｃｅｎｔＭｏｔｉｆ配列（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＣａｓ９の場合、５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））の５’に隣接して位置する約１７個〜約２３個または約１８個〜約２２個、例えば２０個の連続する核酸配列であってもよい。

前記ガイドＲＮＡの標的配列と混成化可能なガイドＲＮＡの標的化配列は前記標的配列が位置するＤＮＡ鎖（即ち、ＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである）が位置するＤＮＡ鎖）の相補的な鎖のヌクレオチド配列と５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、または１００％の配列相補性を有するヌクレオチド配列を意味するものであって、前記相補的鎖のヌクレオチド配列と相補的結合が可能である。

本明細書で、標的部位の核酸配列は、標的遺伝子の該当遺伝子部位の二つのＤＮＡ鎖のうちのＰＡＭ配列が位置する鎖の核酸配列で表示される。この時、実際にガイドＲＮＡが結合するＤＮＡ鎖はＰＡＭ配列が位置する鎖の相補的鎖であるので、前記ガイドＲＮＡに含まれている標的化配列は、ＲＮＡ特性上ＴをＵに変更することを除いて、標的部位の配列と同一な核酸配列を有するようになる。したがって、本明細書で、ガイドＲＮＡの標的化配列と標的部位の配列（または切断部位の配列）はＴとＵが相互変更されることを除いて同一な核酸配列で表示される。

前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ形態で使用（または前記組成物に含まれる）されるか、これをコードするＤＮＡを含むプラスミド形態で使用（または前記組成物に含まれる）されてもよい。

前記ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）は、前記シトシンデアミナーゼによってシトシンから変換されたウラシルを除去し、および／または前記ウラシルが除去された位置にＤＮＡ切断を導入する役割を果たす全ての物質を含むことができる。

一例で、前記ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、およびこれらの組み合わせを含む。一例で、前記ウラシル−特異的除去試薬は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩまたはウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの組み合わせを含むものであってもよい。

ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）はＤＮＡに存在するウラシル（Ｕ）を除去してＤＮＡの突然変異誘発（ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を防止する作用を果たす酵素であって、ウラシルのＮ−グリコシル結合（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌｉｃｂｏｎｄ）を切断することによって塩基除去修復経路（ｂａｓｅ−ｅｘｃｉｓｉｏｎｒｅｐａｉｒ（ＢＥＲ）ｐａｔｈｗａｙ）を開始するようにする役割を果たす全ての酵素のうちから１種以上選択され得る。例えば、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼは、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＡＤＸ４９７８８．１、ＡＣＴ２８１６６．１、ＥＦＮ３６８６５．１、ＢＡＡ１０９２３．１、ＡＣＡ７６７６４．１、ＡＣＸ３８７６２．１、ＥＦＵ５９７６８．１、ＥＦＵ５３８８５．１、ＥＦＪ５７２８１．１、ＥＦＵ４７３９８．１、ＥＦＫ７１４１２．１、ＥＦＪ９２３７６．１、ＥＦＪ７９９３６．１、ＥＦＯ５９０８４．１、ＥＦＫ４７５６２．１、ＫＸＨ０１７２８．１、ＥＳＥ２５９７９．１、ＥＳＤ９９４８９．１、ＥＳＤ７３８８２．１、ＥＳＤ６９３４１．１など）、人間ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００３３５３．１、ＮＰ＿５５０４３３．１など）、マウスウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＮＰ＿００１０３５７８１．１、ＮＰ＿０３５８０７．２など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

前記エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは前記ウラシルが除去されたヌクレオチドを除去する役割を果たすものであって、前記ウラシルＤＮＡグリコシラーゼによって損傷されたウラシルを二重鎖ＤＮＡから除去するＮ−グリコシラーゼ（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）活性と前記損傷されたウラシル除去から発生した脱プリン部位（ａｐｕｒｉｎｉｃｓｉｔｅ；ＡＰｓｉｔｅ）の３’および５’末端を切断するＡＰ−リアーゼ（ＡＰ−ｌｙａｓｅ）活性を全て有する全ての酵素のうちから１種以上選択され得る。例えば、前記エンドヌクレアーゼＶＩＩＩは、人間エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＢＡＣ０６４７６．１、ＮＰ＿００１３３９４４９．１、ＮＰ＿００１２４３４８１．１、ＮＰ＿０７８８８４．２、ＮＰ＿００１３３９４４８．１など）、マウスエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＢＡＣ０６４７７．１、ＮＰ＿０８２６２３．１など）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏｓ．ＯＢＺ４９００８．１、ＯＢＺ４３２１４．１、ＯＢＺ４２０２５．１、ＡＮＪ４１６６１．１、ＫＹＬ４０９９５．１、ＫＭＶ５５０３４．１、ＫＭＶ５３３７９．１、ＫＭＶ５００３８．１、ＫＭＶ４０８４７．１、ＡＱＷ７２１５２．１など）などからなる群より選択された１種以上であってもよいが、これに制限されるわけではない。

他の例で、不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼとしてストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にＤ１０Ａ突然変異とＨ８４０Ａ突然変異が全て導入された改変Ｃａｓ９タンパク質のようにエンドヌクレアーゼ活性だけでなくニッカーゼ活性も喪失された不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを使用する場合、二重鎖切断のために、一側鎖のウラシルが除去されて単一鎖として存在するＤＮＡの単一鎖領域を特異的に分解（単一鎖部位の両末端のホスホジエステル結合を切断）するエンドヌクレアーゼを追加的に含んでもよい。前記ＤＮＡの単一鎖領域を特異的に分解するエンドヌクレアーゼは、Ｓ１ヌクレアーゼ（アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来；例えば、ＣａｔａｌｏｇｎｕｍｂｅｒＭ５７９１（Ｐｒｏｍｅｇａ）など）、マングビーンヌクレアーゼ（Ｍｕｎｇｂｅａｎｎｕｃｌｅａｓｅ）などからなる群より選択された１種以上であってもよい。

このようなシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼおよびウラシル−特異的除去試薬の処理によってシトシンデアミナーゼによってシトシンからウラシルに塩基変換（塩基編集）が起こった部位に二重鎖切断が生成される（図４ａ参照）。このように生成されたＤＮＡ切断断片は互いに延長された末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｅｎｄ）を有する。その後、任意に末端修復（ｅｎｄｒｅｐａｉｒ）過程が起こってもよく、これによってｂｌｕｎｔｅｄｅｎｄｅｄＤＮＡ断片（二重鎖）が生成されてもよい（図４ａ参照）。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；および
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理する段階
を含む、シトシンデアミナーゼを使用してＤＮＡに二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）を生成する方法を提供する。

このようにシトシンデアミナーゼを使用してＤＮＡに二重鎖切断を生成（または導入）することによって、ゲノムＤＮＡまたはＤＮＡの標的部位でシトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ、即ち、ＣからＵへの変換）が起こった位置、シトシンデアミナーゼの塩基編集効率などを分析することができ、これを通じて、シトシンデアミナーゼの標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）配列に対する特異性、非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）配列などを確認（または測定）することができる。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；および
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階
を含む、シトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が導入されたＤＮＡの核酸配列分析方法を提供する。

他の例は、
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドをガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階；および
（ｉｖ）前記分析によって得られた核酸配列データで前記二重鎖切断部位を確認する段階
を含む、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法を提供する。

前記シトシンデアミナーゼ、不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、プラスミド、ガイドＲＮＡおよびウラシル−特異的除去試薬は前述のとおりである。

前記方法は細胞内または試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で行われるものであってもよく、例えば、試験管内で行われるものであってもよい。より具体的に、前記方法の全ての段階が試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で行われるか、前記段階（ｉ）は細胞内で行われ、前記段階（ｉｉ）以後の段階は前記段階（ｉ）が行われた細胞から抽出されたＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）を使用して試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で行われるものであってもよい。

前記段階（ｉ）はシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ（またはこれらのコード遺伝子）とガイドＲＮＡを細胞に形質感染させるか、または前記細胞から抽出されたＤＮＡに接触（例えば、共に培養）させ、ガイドＲＮＡによって標的化される標的部位内でシトシンからウラシルへの変換およびＤＮＡ切断（ｎｉｃｋ）発生を誘導する段階である。前記細胞はシトシンデアミナーゼによる塩基編集を導入しようとする全ての真核細胞のうちから選択されたものであってもよく、例えば、人間細胞を含むほ乳動物細胞のうちから選択され得る。前記形質感染はシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を含むプラスミドを通常の全ての手段によって細胞に導入させることによって行われ、例えば、前記プラスミドの細胞への導入は電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リポフェクションなどによって行われ得るが、これに制限されるわけではない。

一具体例で、前記段階（ｉ）は、前記細胞（シトシンデアミナーゼによる塩基編集（塩基編集部位、塩基編集効率など）を確認しようとする細胞から抽出されたＤＮＡをシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質）およびガイドＲＮＡと共に培養することによって行われ得る（ｉｎｖｉｔｒｏ）。前記細胞から抽出されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｅＤＮＡ）または標的遺伝子または標的部位を含むＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ）増幅産物であってもよい。

前記段階（ｉｉ）は、前記段階（ｉ）でウラシルに改変された塩基を除去してＤＮＡ二重鎖切断を生成する段階である。より具体的に、前記段階（ｉｉ）は、前記段階（ｉ）で得られた反応物にウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、およびこれらの組み合わせを処理（接触）する段階によって行われ得る。ウラシルＤＮＡグリコシラーゼとエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを全て処理（接触）する場合、同時に処理するか、順序に関係なく順次に処理してもよい。前記処理（接触）する段階は、前記段階（ｉ）で得られた反応物をウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩと共に培養する段階によって行われ得る。

前記段階（ｉｉ）の反応物は、前記段階（ｉ）が細胞内で行われた場合（即ち、細胞を形質感染させて行われた場合）、前記形質感染された細胞から分離されたＤＮＡを含むものであってもよく、前記段階（ｉ）が細胞から抽出（分離）されたＤＮＡに対して試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）行われたものである場合、前記シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡ処理された分離されたＤＮＡを含むものであってもよい。

他の例で、前記段階（ｉ）で不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼとしてストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にＤ１０Ａ突然変異とＨ８４０Ａ突然変異が全て導入された不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを使用する場合、前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼはエンドヌクレアーゼ活性だけでなくニッカーゼ活性も喪失したので、二重鎖切断のために、前記段階（ｉｉ）以後および段階（ｉｉｉ）以前に、一側鎖のウラシルが除去されて単一鎖として存在するＤＮＡの単一鎖領域を特異的に分解（単一鎖部位の両末端を切断）するエンドヌクレアーゼを処理する段階（段階（ｉｉ−１））を追加的に含んでもよい（図２２のａ参照）。前記ＤＮＡの単一鎖領域を特異的に分解するエンドヌクレアーゼはＳ１ヌクレアーゼであってもよいが、これに制限されるわけではない。

任意に、前記段階（ｉ）遂行（または完了）後段階（ｉｉ）遂行前に、段階（ｉ）で使用されたシトシンデアミナーゼ、不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、および／またはガイドＲＮＡを除去する段階を追加的に含んでもよい。

前記シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡと共に使用されて配列特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有するので大部分標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）に作用するが、標的配列以外の部位に標的配列と類似の配列がどの程度存在するかによって非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）に作用する副作用が発生することもある。本明細書で、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）とは、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの標的部位ではないが、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが活性を有する位置をいう。即ち、標的位置以外の、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼによって塩基編集および／または切断される位置をいう。一例で、前記非標的位置はシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼに対する実際非標的位置だけでなく非標的位置になる可能性がある位置まで含む概念として使用され得る。前記非標的位置はこれに制限されるわけではないが、試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）でシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼによって切断される標的位置以外の全ての位置を意味することができる。

シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが標的位置以外の位置でも活性を有することは多様な原因によって引き起こされ得る。例えば、標的部位に対して設計された標的配列とヌクレオチドミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）水準が低くて、標的配列と配列相同性の高い標的配列以外の配列（非標的配列）の場合、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが作動する可能性がある。前記非標的配列はこれに制限されるわけではないが、標的配列と１個〜６個、１個〜５個、１個〜４個、１個〜３個、１個〜２個、または１個のヌクレオチドミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する配列（遺伝子部位）であってもよい。

ミスマッチ配列でシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが作動する場合、ゲノム内で望まない遺伝子の突然変異を引き起こすことがあって、深刻な問題が引き起こされることがある。よって、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの標的位置での活性に劣らず非標的配列を正確に検出して分析する過程も非常に重要であると言え、これは非標的効果なく標的位置にのみ特異的に作動するシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを開発することに有用に使用され得る。

本発明の目的上、前記シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは生体内（ｉｎｖｉｖｏ）および試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で活性を有することができるので、試験管内でＤＮＡ（例えば、ゲノムＤＮＡ）の非標的位置を検出することに使用でき、これを生体内で適用した時、前記検出された非標的位置（非標的配列を含む遺伝子上位置（部位））と同一な位置にも活性を有するのを予想することができる。

前記段階（ｉｉｉ）は前記段階（ｉｉ）で切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階であって、通常の全ての核酸配列分析方法によって行われ得る。例えば、前記段階（ｉ）で使用された分離されたＤＮＡがゲノムＤＮＡである場合、前記核酸配列分析は全体ゲノムシークエンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）によって行われ得る。全体ゲノムシークエンシングを行う場合、標的部位の配列と相同性を有する配列を探して非標的位置であると予測する間接的な方法と異なり、全体ゲノム水準で実質的に標的特異的ヌクレアーゼによって切断される非標的位置を検出することができるので、より正確に非標的位置を検出することができる。

本明細書に使用されたものとして、“全体ゲノムシークエンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＷＧＳ）”は、次世代シークエンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による全長ゲノムシークエンシングを１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘの形式で様々な倍数でゲノムを読む方法を意味する。“次世代シークエンシング”はチップ（Ｃｈｉｐ）基盤およびＰＣＲ基盤ペアードエンド（ｐａｉｒｅｄｅｎｄ）形式で全長ゲノムを断片化し、前記断片を化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいて超高速でシークエンシングを行う技術を意味する。

前記段階（ｉｖ）は前記段階（ｉｉｉ）で得られた塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）でＤＮＡが切断された位置を確認（または決定）する段階であって、シークエンシングデータを分析して標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）と非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）を簡便に検出することができる。前記塩基配列データからＤＮＡが切断された特定位置を決定することは多様な接近方法で行うことができ、本明細書では前記位置を決定するための様々な合理的な方法を提供する。しかし、これは本発明の技術的思想に含まれる例示に過ぎず、本発明の範囲がこれら方法によって制限されるわけではない。

例えば、前記切断された位置を決定するための一例として、全体ゲノムシークエンシングを通じて得られた塩基配列データをゲノム上の位置によって整列した場合、５’末端がまっすぐに整列された位置がＤＮＡが切断された位置を意味するものであり得る。前記塩基配列データをゲノム上の位置によって整列する段階は、分析プログラム（例えば、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣなど）を用いて行うことができる。本明細書に使用されたものとして、前記用語“まっすぐな整列”とは、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣなどのプログラムで全体ゲノムシークエンシング結果を分析する時、隣接したワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）のそれぞれに対して、２つ以上の塩基配列データの５’末端がゲノム上の同一な位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）で始まる配列をいう。これによって、前記段階（ｉｉ）で切断されて同一な５’末端を有するようになるＤＮＡ断片がそれぞれシークエンシングされて表されるようになる。

即ち、前記段階（ｉｉ）での切断が標的位置および非標的位置で起こる場合、塩基配列データを整列すれば、共通的に切断された部位はそれぞれその位置が５’末端で始まるのでまっすぐに整列されるが、切断されていない部位には５’末端が存在しないので、整列時、スタッガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）方式で配列され得る。したがって、まっすぐに整列された位置を前記段階（ｉｉ）で切断された部位と見ることができ、これは即ちシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの標的位置または非標的位置を意味するものであり得る。

前記“整列”は、標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）で塩基配列データをマッピングした後、ゲノムで同一位置を有する塩基を各位置に合うように配列することを意味する。したがって、塩基配列データを前記のような方式で整列することができればいかなるコンピュータプログラムも用いることができ、これは当業界に既に知られた公知のプログラムまたは目的に合うように製作されたプログラムのうちから選択され得る。一実施形態ではＩＳＡＡＣを用いて整列を行ったが、これに制限されるわけではない。

整列の結果、前述のように５’末端がまっすぐ整列された位置を探すなどの方法を通じてシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼによってＤＮＡが切断された位置を決定することができ、前記切断された位置が標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）でなければ、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）と判断することができる。言い換えれば、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼの標的位置として設計した塩基配列と同一な配列は標的位置であり、前記塩基配列と同一でない配列は非標的位置と見ることができる。これは前述の非標的位置の定義上自明なのである。前記非標的位置は特に、標的位置の配列と相同性を有する配列から構成されたものであってもよく、具体的に標的位置と１つ以上のヌクレオチドミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する配列、さらに具体的に標的位置（標的配列）と１個〜６個、１個〜５個、１個〜４個、１個〜３個、１個〜２個、または１個のヌクレオチドミスマッチを有するものであってもよいが、これに特に制限されるわけではなく、シチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼが切断できる位置であれば本発明の範囲に含まれ得る。

他の例で、５’末端がまっすぐに整列された位置を探す方法以外にも、５’末端プロットで二重ピークパターンを示す場合、その位置が標的位置でなければ非標的位置と判断することができる。ゲノムＤＮＡ内の各位置に対して同一な塩基の５’末端を構成しているヌクレオチド数を数えてグラフを描く場合、特定位置で二重ピークパターンが示されるようになり、前記二重ピークはシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼによって切断された二重鎖のそれぞれの鎖によって示されるものであるためである。

したがって、前記非標的位置確認方法は、前記段階（ｉｖ）以後に、前記切断された位置が標的位置（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）でない場合、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）と判断する段階を追加的に含んでもよい。

一実施形態で、ゲノムＤＮＡに対して前記段階（ｉ）および（ｉｉ）を行って二重鎖切断した後、全体ゲノム分析（段階（ｉｉｉ））遂行後、これをＩＳＡＡＣで整列して切断された位置ではまっすぐに整列、切断されていない位置ではスタッガード方式で整列されるパターンを確認して、これを５’末端プロットで示した時、切断部位で二重ピークの独特なパターンが示され得る。

さらに、これに制限されるわけではないが、具体的な一例としてワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）に該当する塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）がそれぞれ二つ以上ずつまっすぐに整列される位置を非標的位置であると判断することができ、また２０％以上の塩基配列データがまっすぐに整列され、それぞれのワトソン鎖およびクリック鎖で同一な５’末端を有する塩基配列データの数が１０以上である位置が非標的位置、即ち、切断される位置であると判断することができる。

前記方法は段階（ｉｉｉ）および（ｉｖ）の過程はＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（ｄｉｇｅｓｔｅｄ−ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）であってもよく、より具体的な内容は韓国特許公開第１０−２０１６−００５８７０３号に記載されている（前記文献は本発明に参照として含まれる）。

前述の方法によって、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位（即ち、二重鎖切断部位）、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率または標的特異性（即ち、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集頻度／全体塩基編集頻度）、および／または非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ；シトシンデアミナーゼの塩基編集部位として確認された位置のうちの標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）位置でない位置）を確認（または測定または検出）することができる。

前記非標的位置確認（検出）は、試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）でシチジンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼをゲノムＤＮＡに処理して行われ得る。よって、前記方法を通じて確認（検出）された非標的位置に対して実質的に生体内（ｉｎｖｉｖｏ）でも非標的効果が現れるか確認してみることができる。但し、これは追加的な検証過程に過ぎないので、本発明の範囲に必須的に伴う段階ではなく、必要によって追加的に行われる段階に過ぎない。

本明細書に使用されたものとして、用語“非標的効果（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔ）”は、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）で塩基編集および／または二重鎖切断が起こる水準を意味するためのものであり得る。用語“インデル（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄ／ｏｒｄｅｌｅｔｉｏｎ；Ｉｎｄｅｌ）”は、ＤＮＡの塩基配列で一部塩基が中間に挿入されるか（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）および／または欠失された（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）変異を総称する。

他の例で、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法は、前述のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ方法以外の方法で行うことができる。

例えば、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法はｃｉｒｃｌｅ−ｓｅｑ方法によって行われてもよく、具体的に、下記の段階を含んでもよい（図２０ａ参照）：
（ｉ）細胞から抽出されたゲノムＤＮＡを断片化および環状化させる段階
（ｉｉ）前記環状化されたＤＮＡ断片にシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを処理した後、ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理して、環状化されたＤＮＡ断片に二重鎖切断を生成する段階；および
（ｉｉｉ）前記二重鎖切断が生成されたＤＮＡ断片を用いてライブラリーを構築し、次世代ゲノムシークエンシング（ＮＧＳ）を行う段階
を含んでもよい。前記段階（ｉｉ）のシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡと共に使用され得る。

他の例で、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法はＢｌｅｓｓ方法によって行われてもよく、具体的に、下記の段階を含んでもよい（図２０ｂ参照）：
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドを細胞または細胞から分離されたゲノムＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片末端に標識した後、これを捕獲する段階；
（ｉｖ）前記捕獲されたＤＮＡ断片を増幅し、次世代ゲノムシークエンシング（ＮＧＳ）を行う段階
を含んでもよい。前記段階（ｉ）のシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、またはこれをコードする遺伝子またはこれを含むプラスミドは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドと共に使用され得る。

他の例で、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率、非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）、および／または標的特異性を確認（または測定または検出）する方法はＤＳＢＣａｐｔｕｒｅ方法によって行われてもよく、具体的に、下記の段階を含んでもよい（図２０ｃ参照）：
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミドを細胞または細胞から分離されたゲノムＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）を処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片に対して末端修復（ｅｎｄｒｅｐａｉｒ）およびアダプターライゲーション（ａｄａｐｔｏｒｌｉｇａｔｉｏｎ）を行う段階；
（ｉｖ）前記（ｉｉｉ）で得られたＤＮＡ断片を増幅し、次世代ゲノムシークエンシング（ＮＧＳ）を行う段階
を含んでもよい。前記段階（ｉ）のシトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、またはこれをコードする遺伝子またはこれを含むプラスミドはガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含むプラスミドと共に使用され得る。

本明細書で提供されるシチジンデアミナーゼを用いたＤＮＡ二重鎖切断方法およびこれを用いた核酸配列分析技術によって、シチジンデアミナーゼの塩基編集部位、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）部位での塩基編集効率または標的特異性、および／または非標的位置をより正確で効率的に確認することができる。

ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の７個の内在的標的部位（ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＨＢＢ）でＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ）およびＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）（参考例１参照）で得られた塩基編集効率を示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の７個の内在的標的部位で標的深層シークエンシングによって測定されたＣａｓ９ヌクレアーゼ−誘導突然変異頻度を示す。７個の内在的標的部位でインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度または塩基編集効率の順位を代表的に示すグラフである。標的部位およびこれと１〜４個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡおよび、ＢＥ３またはＣａｓ９をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させ、３個の内在的部位（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｓｉｔｅｓ；ＥＭＸ１）での突然変異頻度を測定した結果である（記載された核酸配列はグラフ上で下方向に配列番号１から配列番号３１まで順次に番号が付けられる）。標的部位およびこれと１〜４個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡおよび、ＢＥ３またはＣａｓ９をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させ、３個の内在的部位（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｓｉｔｅｓ；ＨＢＢ）での突然変異頻度を測定した結果である（記載された核酸配列はグラフ上で下方向に配列番号３２から配列番号６２まで順次に番号付けられる）。標的部位およびこれと１〜４個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡおよび、ＢＥ３またはＣａｓ９をコードするプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させ、３個の内在的部位（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｓｉｔｅｓ；ＲＮＦ２）での突然変異頻度を測定した結果である（記載された核酸配列はグラフ上で下方向に配列番号６３から配列番号９３まで順次に番号付けられる）。ＥＭＸ１部位でのＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３に関連する塩基編集頻度を示すグラフである。ＨＢＢ部位でのＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３に関連する塩基編集頻度を示すグラフである。ＲＮＦ２部位でのＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３に関連する塩基編集頻度を示すグラフである。ＢＥ３のＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの概要を模式的に示す。ＢＥ３および／またはＵＳＥＲを処理した場合、切断されたＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。Ｂ３によるＣ対Ｕ転換およびＵＳＥＲによるＤＮＡ切断結果を示すサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシング結果である。ＥＭＸ１の標的サイトでの配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）の直線整列を示すＩＧＶイメージである。６個の他の標的サイトでの配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）の直線整列を示すＩＧＶイメージである。図６ａ（ＥＭＸ１）および６ｂ（ＨＢＢ）：損傷していないゲノムＤＮＡ（灰色；中央部から一番目の層（ｌａｙｅｒ））とＢＥ３およびＵＳＥＲ（青色；中央部から２番目の層（ｌａｙｅｒ））またはＣａｓ９（赤色；中央部から３番目の層（ｌａｙｅｒ）；図６ｂのみにある）に分解されたゲノムＤＮＡで得られたＤＮＡ切断点数を示すゲノムワイドサーカスプロット（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｃｉｒｃｕｓｐｌｏｔ）であって、矢印はターゲットサイトを示す。図６ａ（ＥＭＸ１）および６ｂ（ＨＢＢ）：損傷していないゲノムＤＮＡ（灰色；中央部から一番目の層（ｌａｙｅｒ））とＢＥ３およびＵＳＥＲ（青色；中央部から２番目の層（ｌａｙｅｒ））またはＣａｓ９（赤色；中央部から３番目の層（ｌａｙｅｒ）；図６ｂのみにある）に分解されたゲノムＤＮＡで得られたＤＮＡ切断点数を示すゲノムワイドサーカスプロット（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｃｉｒｃｕｓｐｌｏｔ）であって、矢印はターゲットサイトを示す。図６ｃ（ＥＭＸ１）および６ｄ（ＨＢＢ）：Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲されたサイト（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｓｉｔｅｓ）（表２−８）でＤＮＡ配列を使用してＷｅｂＬｏｇｏを通じて得られた配列ロゴ（ＤＮＡ分解点数＞２．５）を示す。図６ｃ（ＥＭＸ１）および６ｄ（ＨＢＢ）：Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲されたサイト（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｓｉｔｅｓ）（表２−８）でＤＮＡ配列を使用してＷｅｂＬｏｇｏを通じて得られた配列ロゴ（ＤＮＡ分解点数＞２．５）を示す。図６ｅ（ＥＭＸ１）および６ｆ（ＨＢＢ）：標的深部シークエンシングを用いて決定されたＣａｓ９媒介インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３媒介置換頻度の散布図（Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）を示すものであって、円で表示された点はＢＥ３によって確認されたがＣａｓ９によって有効な効果がない非標的サイトを示す。図６ｅ（ＥＭＸ１）および６ｆ（ＨＢＢ）：標的深部シークエンシングを用いて決定されたＣａｓ９媒介インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３媒介置換頻度の散布図（Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）を示すものであって、円で表示された点はＢＥ３によって確認されたがＣａｓ９によって有効な効果がない非標的サイトを示す。図６ｇ（ＥＭＸ１）および６ｈ（ＨＢＢ）：標的深部シークエンシングによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞で確認されたＢＥ３非標的サイトを示すものであって、ＰＡＭ配列は３’末端の最後の３個のヌクレオチドであり、ミスマッチ塩基（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｂａｓｅ）は小文字で表わし、ダッシュ（−）はＲＮＡｂｕｌｇｅｓを示す（Ｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３））。図６ｇ（ＥＭＸ１）および６ｈ（ＨＢＢ）：標的深部シークエンシングによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞で確認されたＢＥ３非標的サイトを示すものであって、ＰＡＭ配列は３’末端の最後の３個のヌクレオチドであり、ミスマッチ塩基（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｂａｓｅ）は小文字で表わし、ダッシュ（−）はＲＮＡｂｕｌｇｅｓを示す（Ｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３））。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ−および塩基エディター（ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ）−処理ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認されたＤＮＡ切断点数が２．５以上である部位の数を示すベンダイヤグラムである。ＤＮＡ切断点数の範囲に対する総サイト数（■）と１０個以下のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ）（□）があるＰＡＭ含有サイト数を示すグラフである。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ−および塩基エディター（Ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ）−処理ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認された０．１以上のＤＮＡ切断点数を有するＰＡＭ−含む相同性部位の数を示すベンダイヤグラムである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって捕獲された相同性部位の比率を示すものであって、棒は標的（標的）部位と６ｎｔまで異なる相同性部位の数を示し、四角形（ＢＥ３）と三角形（Ｃａｓ９）はミスマッチ数の範囲に対してＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ捕獲サイトの比率を示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（１１ａ）およびＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（１１ｂ）によって確認されたＢＥ３−とＣａｓ９−関連サイトの数の間の相関関係を示すグラフである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（１１ａ）およびＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（１１ｂ）によって確認されたＢＥ３−とＣａｓ９−関連サイトの数の間の相関関係を示すグラフである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（ａ）またはＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（ｂ）によって確認されたＢＥ３関連サイトの数と６個以下のミスマッチがあるサイトの数の間の相関関係を示すグラフである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（ａ）またはＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（ｂ）によって確認されたＢＥ３関連サイトの数と６個以下のミスマッチがあるサイトの数の間の相関関係を示すグラフである。ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ４−９にシトシンがないＣａｓ９のみに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された非標的サイトを例示的に示す。３個の他のＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｄ）サイトの塩基編集効率を示す。３個の他のＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｄ）サイトの塩基編集効率を示す。３個の他のＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｄ）サイトの塩基編集効率を示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−陰性サイトで３個の互いに異なるＢＥ３デアミナーゼの塩基編集効率を示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−陰性サイトで３個の互いに異なるＢＥ３デアミナーゼの塩基編集効率を示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−陰性サイトで３個の互いに異なるＢＥ３デアミナーゼの塩基編集効率を示す。既存のｓｇＲＮＡ（ｇＸ１９ｓｇＲＮＡ）、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｓｇＲＮＡ（ｇＸ１８またはｇＸ１７ｓｇＲＮＡ）および延長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ｓｇＲＮＡ（ｇＸ２０またはｇｇＸ２０ｓｇＲＮＡ）を図式的に示す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨＢＢ標的サイトおよび非標的サイトの塩基編集頻度を標的深部シークエンシングで測定した結果を示す。改変されたｓｇＲＮＡを使用してＢＥ３非標的効果を減少させることができるのを示すものであって、１７ａは既存のｓｇＲＮＡ（ＧＸ１９ｓｇＲＮＡ）と改変されたｓｇＲＮＡ（ＧＸ１７ｓｇＲＮＡ、ｇＸ１８ｓｇＲＮＡ、ｇＸ２０ｓｇＲＮＡおよびｇｇＸ２０ｓｇＲＮＡ）の概略的に示す。改変されたｓｇＲＮＡを使用してＢＥ３非標的効果を減少させることができるのを示すものであって、図１７ｂはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で標的深層シークエンシングによってＥＭＸ１標的サイトおよび非標的サイトで測定された塩基編集効率（頻度）を示す。プラスミドｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳの開裂地図である。プラスミドｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳの開裂地図である。プラスミドｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−Ｃａｓ９ｎ−ＵＧＩ−ＮＬＳの開裂地図である。Ｃａｓ９発現プラスミド（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ）の開裂地図である。Ｈｉｓ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９をコーディングするプラスミドｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ１の開裂地図である。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ以外の方法で全体ゲノムでの塩基エディターの非標的サイトをプロファイリングする方法を模式的に示すものであって、２１ａはｃｉｒｃｌｅ−ｓｅｑを用いた方法をそれぞれ示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ以外の方法で全体ゲノムでの塩基エディターの非標的サイトをプロファイリングする方法を模式的に示すものであって、２１ｂはＢｌｅｓｓを用いた方法をそれぞれ示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ以外の方法で全体ゲノムでの塩基エディターの非標的サイトをプロファイリングする方法を模式的に示すものであって、２１ｃはＤＳＢＣａｐｔｕｒｅを用いた方法をそれぞれ示す。ＢＥ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９）−媒介二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋｓ；ＤＳＢｓ）過程および結果を示すものであって、（ａ）はＢＥ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９）、ＵＳＥＲ酵素、およびＳ１ヌクレアーゼを用いてＤＳＢを導入する過程を模式的に示し、（ｂ）はＢＥ１／ｓｇＲＮＡ、ＵＳＥＲ酵素、およびＳ１ヌクレアーゼ処理後のＰＣＲ増幅産物でのＢＥ１−媒介ＤＳＢ結果を示す電気泳動写真である。

以下、本発明を下記の実施例によってより具体的に説明する。しかし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるわけではない。

［参考例］
１．細胞培養および形質感染
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１１２６８）を１０％（ｗ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｗ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｗｅｌｇｅｎｅ）で補充されたＤＭＥＭ（ＤｕｌｂｅｃｃｏＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）培地で維持させた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０^５）を２４−ウェルプレートに接種し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してｓｇＲＮＡプラスミド（５００ｎｇ）と、塩基エディタープラスミド（ＢａｓｅＥｄｉｔｏｒｐｌａｓｍｉｄ）（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃７３０１９（ＥｘｐｒｅｓｓｅｓＢＥ１ｗｉｔｈＣ−ｔｅｒｍｉｎａｌＮＬＳｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ；ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９−ＮＬＳ；図１８ａ）、＃７３０２０（ＥｘｐｒｅｓｓｅｓＢＥ２ｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ；ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ−ＮＬＳ；図１８ｂ）、＃７３０２１（ＥｘｐｒｅｓｓｅｓＢＥ３ｉｎｍａｍｍａｌｉａｎｃｅｌｌｓ；ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−Ｃａｓ９ｎ−ＵＧＩ−ＮＬＳ；図１８ｃ））（１．５μｇ）またはＣａｓ９発現プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃４３９４５；図１９）を形質感染させた（ａｔ〜８０％ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）。形質感染後７２時間後に、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを分離した。前記細胞に対してマイコプラズマ汚染の有無をテストしなかった。

下記の実施例に使用されたｓｇＲＮＡは標的部位配列（標的配列；ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ配列；表１−８参照）の中の５’末端のＰＡＭ配列（５’−ＮＧＧ−３’（ＮはＡ、Ｔ、Ｇ、またはＣである））を除いた配列でＴをＵに変えた配列を下記の一般式３の標的化配列‘（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ’にして製作されたものを使用した：
５’−（Ｎ_ｃａｓ９）_ｌ−（ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡ）−（ＧＡＡＡ）−（ＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣ）−３’（一般式３；オリゴヌクレオチドリンカー：ＧＡＡＡ）。

２．タンパク質精製
Ｈｉｓ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９タンパク質をコーディングするプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ１；ＥｘｐｒｅｓｓｅｓＢＥ１ｗｉｔｈＮ−ｔｅｒｍｉｎａｌＨｉｓ６ｔａｇｉｎＥ．Ｃｏｌｉ；図２０）はＤａｖｉｄＬｉｕ（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃７３０１８）から提供を受けた。また、前記Ｈｉｓ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９タンパク質をコーディングするプラスミドｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ１で部位特異的変異導入法（ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を用いてｄＣａｓ９のＡ８４０をＨ８４０で置換して、Ｈｉｓ６−ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９タンパク質（ＢＥ３ｄｅｌｔａＵＧＩ；ＵＧＩドメインを欠如したＢＥ３変異型）をコーディングするプラスミド（ｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ３ｄｅｌｔａＵＧＩ）を製作した。

Ｒｏｓｅｔｔａ発現細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ、ｃａｔａｌｏｇｎｕｍｂｅｒ：７０９５４−３ＣＮ）を前記準備されたｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ１またはｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ３ｄｅｌｔａＵＧＩで形質転換させ、１００μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）と５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ）を含むＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）ｂｒｏｔｈで３７℃条件で一晩培養した。ｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ１またはｐＥＴ２８ｂ−ＢＥ３ｄｅｌｔａＵＧＩを含有するＲｏｓｅｔｔａ細胞を一晩培養した培養物１０ｍｌを１００μｇ／ｍｌカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）および５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｉｎ）を含有する４００ｍｌのＬＢｂｒｏｔｈに接種し、ＯＤ６００が０．５−０．６に到達するまで３０℃条件で培養した。前記培養された細胞を１時間１６℃に冷却させ、０．５ｍＭＩＰＴＧ（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を補充して、１４−１８時間培養した。

タンパク質精製のために、細胞を４℃で１０分間５０００ｘｇで遠心分離して収穫し、リゾチーム（Ｓｉｇｍａ）およびプロテアーゼ抑制剤（Ｒｏｃｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）補充された溶解緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴおよび１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）５ｍｌで超音波処理して溶解させた。前記得られた細胞反応物を４℃で１３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離して得られた溶解性細胞溶解物をＮｉ−ＮＴＡアガロースレジン（Ｑｉａｇｅｎ）と共に４℃で１時間培養した。細胞溶解物／Ｎｉ−ＮＴＡ混合物をカラムに適用して緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で洗浄した。ＢＥ３タンパク質を溶出緩衝液（５０ｍＭＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０）で溶出させた。溶出されたタンパク質を貯蔵緩衝液（２０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＫＣｌ、１ｍＭＤＴＴおよび２０％グリセロール）でバッファー交替して貯蔵し、遠心分離フィルターユニット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮させ、ｒＡＰＯＢＥＣ１−ＸＴＥＮ−ｄＣａｓ９タンパク質とｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９を精製した。

３．ＰＣＲ増幅産物の脱アミン化およびＵＳＥＲ処理
まず、ＥＭＸ１サイトを含むＰＣＲ増幅産物（１０μｇ）を３７℃で１時間１００μｌの反応体積で精製されたｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９タンパク質（４μｇ）とＥＭＸ１特異性ｓｇＲＮＡ（３μｇ）と共に培養した。その後、前記培養物を３７℃で３０分間ＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）（６ｕｎｉｔｓ）（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｍ５５０５−ｕｓｅｒ−ｅｎｚｙｍｅ；ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）およびＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｌｙａｓｅＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ＶＩＩＩ混合物と５０ｍＭＫＣｌ、５ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴ、１７５ｍｇ／ｍｌＢＳＡおよび５０％（ｗ／ｖ）グリセロール含む）と共に培養した後、アガロースゲル電気泳動を行った。

４．ゲノムＤＮＡの脱アミン化およびＵＳＥＲ処理
ゲノムＤＮＡは製造者の指示によってＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製（抽出）した。ゲノムＤＮＡ（１０μｇ）を前記参考例２で精製されたｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９タンパク質（３００ｎＭ）とｓｇＲＮＡ（９００ｎＭ）と共に５００μｌの反応容量で３７℃で８時間緩衝液（１００ｍＭＮａＣｌ、４０ｍＭ）Ｈｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭＭｇＣｌ２、および１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、ｐＨ７．９）で培養した。ＲＮａｓｅＡ（５０μｇ／ｍＬ）を使用してｓｇＲＮＡを除去した後、ウラシル含有ゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。精製されたゲノムＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）（２μｇ）をＵＳＥＲ（６Ｕｎｉｔ）と共に３７℃で１００μｌの反応容量で３時間培養した後、ＤＮｅａｓｙＢｌｏｏｄ＆ＴｉｓｓｕｅＫｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）で再び精製した。標的部位をＳＵＮ−ＰＣＲブレンドを使用してＰＣＲ増幅させ、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）配列分析を行ってＢＥ３−媒介シトシン脱アミン化およびＵＳＥＲ−媒介ＤＮＡ切断を確認した。

５．全体ゲノムおよびｄｉｇｅｎｏｍｅのシークエンシング
Ｃｏｖａｒｉｓシステム（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して４００−５００ｂｐ範囲でゲノムＤＮＡ（１μｇ）を断片化し、ＥｎｄＲｅｐａｉｒＭｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ）を使用して平滑末端化（ｂｌｕｎｔ−ｅｎｄｅｄ）させた。断片化されたＤＮＡをアダプターで連結してライブラリーを生成した後、ＭａｃｒｏｇｅｎでＨｉＳｅｑＸＴｅｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＷＧＳ（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った。

６．標的深層シークエンシング（Ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
深層シークエンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）ライブラリー生成のために、標的と潜在的な非標的部位をＫＡＰＡＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＰＣＲキット（ＫＡＰＡＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ＃ＫＫ２５０１）で増幅させた。プーリングされたＰＣＲ増幅物をＴｒｕＳｅｑＨＴＤｕａｌＩｎｄｅｘシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）が装着されたＭｉｎｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）またはＩｌｌｕｍｉｎａＭｉｓｅｑ（ＬＡＳＩｎｃ．韓国）を使用してシークエンシングした。

実施例１．人間細胞でＢＥ３−関連塩基編集効率とＣａｓ９−関連インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度の比較
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の７個のゲノム遺伝子座（ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＨＢＢ）で、三つの異なる形態のＢＥの単一塩基置換頻度によって定義された塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）効率を求めて、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの標的部位でのインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度によって定義されたゲノム編集効率と比較した（図１ａ、ｂ）。図１ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の７個の内在的標的部位（ＥＭＸ１、ＦＡＮＣＦ、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、ＨＥＫ３、ＨＥＫ４、ＨＢＢ）でＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９）、ＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ）およびＢＥ３（ＡＰＯＢＥＣ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ）（参考例１参照）で得られた塩基編集効率を示す。塩基編集効率は、標的深層シークエンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で測定した（参考例６参照）。ＢＥ３［ＡＰＯＢＥＣ−ｎＣａｓ９−ＵＧＩ（ｕｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）、２９±６％］がＢＥ１（ＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９、５±１％）とＢＥ２（ＡＰＯＢＥＣ−ｄＣａｓ９−ＵＧＩ、８±２％）より優れた効率を示した。図１ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内の７個の内在的標的部位で標的深層シークエンシングによって測定されたＣａｓ９ヌクレアーゼ−誘導突然変異頻度を示す（参考例１のＣａｓ９発現プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅｐｌａｓｍｉｄ＃４３９４５；図１９）を使用して得られた結果である）。このような結果は、ＢＥ３活性がＣａｓ９ヌクレアーゼ活性と独立的であるのを確認させてくれるものである。

図１ｃは、７個の内在的標的地点（ｏｎｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ；表２−８参照）でインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度または塩基編集効率の順位を代表的に示すグラフである。図１ｃで示されているように、活性順位分析の結果、特定ｓｇＲＮＡはＣａｓ９と共に作用する時は活性が低いが、ＢＥ３と共に作用する時は高い活性を示す一方、その反対の相関性を示すｓｇＲＮＡも存在した。

実施例２．ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｓｇＲＮＡｓに対するＢＥ３とＣａｓ９の寛容（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）
ＢＥ３デアミナーゼの特異性を評価するために、ＢＥ３がｓｍａｌｌｇｕｉｄｅＲＮＡ（ｓｇＲＮＡｓ）でのミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を寛容可能か否かを細胞内で調査した。このために、１〜４個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡおよび、ＢＥ３またはＣａｓ９をコードするプラスミド（参考例１参照）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に共同形質感染させ、３個の内在的部位（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｓｉｔｅｓ；ＥＭＸ１、ＨＢＢ、ＲＮＦ２）での突然変異頻度を測定した。

使用された１〜４個のミスマッチを有するｓｇＲＮＡの標的部位（ＰＡＭ配列（太字）含む）を下記の表１に整理した：

前記表１のミスマッチ配列および標的配列から得られた結果（インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とシトシン転換頻度）を図２ａ〜２ｃに示した（２ａ：ＥＭＸ１、２ｂ：ＨＢＢおよび２ｃ：ＲＮＦ２；Ｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３））。図２ａ〜２ｃで‘Ｃｎ’で表されたものはミスマッチ配列または標的配列で５’末端からｎ番目に位置するシトシン（Ｃ）の変異（他の塩基で置換または欠失）比率を示す。インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とシトシン転換頻度（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）は標的深層シークエンシング（参考例６）を使用して測定した。前記標的深層シークエンシングに使用されたプライマーは下記の通りである：

EMX1
1st PCR
Forward(5'→3'):
AGTGTTGAGGCCCCAGTG (配列番号94);
Reverse(5'→3'):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (配列番号95);
2nd PCR
Forward(5'→3'):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGGGCCTCCTGAGTTTCTCAT (配列番号96);
Reverse(5'→3')
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGCAGCAAGCAGCACTCT (配列番号97);

HBB
1st PCR
Forward(5'→3'):
GGCAGAGAGAGTCAGTGCCTA (配列番号98);
Reverse(5'→3'):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGCTGGGCATAAAAGT (配列番号99);
2nd PCR
Forward(5'→3'):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCTCCACATGCCCAGTTTC (配列番号100);
Reverse(5'→3')
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGGCTGGGCATAAAAGT (配列番号101);

RNF2
1st PCR
Forward(5'→3'):
CCATAGCACTTCCCTTCCAA (配列番号102);
Reverse(5'→3'):
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAACATACAGAAGTCAGGAA (配列番号103);
2nd PCR
Forward(5'→3'):
ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATTTCCAGCAATGTCTCAGG (配列番号104);
Reverse(5'→3')
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCAACATACAGAAGTCAGGAA (配列番号105).

また、ＥＭＸ１（図３ａ）部位、ＨＢＢ部位（図３ｂ）、およびＲＮＦ２部位（図３ｃ）でのＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３に関連する塩基編集頻度をミスマッチｓｇＲＮＡｓ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｓｇＲＮＡｓ）（表１参照）を使用して測定し、その結果を図３ａ〜３ｃに示した。図３ａ〜３ｃで示されるように、全般的に、Ｃａｓ９誘導インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３誘導置換頻度の間に統計的に有意味な相関関係（３個の部位でそれぞれＲ^２＝０．７０、０．８３、および０．７２）がある。

ＢＥ３デアミナーゼとＣａｓ９ヌクレアーゼはほとんど全ての位置での１個のヌクレオチド（１−ｎｔ）のミスマッチおよびＰＡＭ−遠位領域（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ−ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ）−ｄｉｓｔａｌｒｅｇｉｏｎ）での２個のヌクレオチド（２−ｎｔ）ミスマッチに対しては寛容を示したが、ＰＡＭ−近位領域またはＰＡＭ−遠位領域での３−ｎｔまたは４−ｎｔミスマッチに対しては寛容を示さない。しかし、２個または３個のミスマッチを有する一部ｓｇＲＮＡ（図２ａ−２ｃで星印で表示）はＢＥ３と共に使用する場合、高い活性を示す反面、Ｃａｓ９と共に使用する場合には活性が優れなく、その反対も同様であった。例えば、ＥＭＸ１部位で、完全に一致（マッチ）するｓｇＲＮＡまたは３−ｎｔミスマッチｓｇＲＮＡをＢＥ３と共に使用する場合、比較可能な程度の頻度差（３３％ｖｓ．１４％）で置換を誘導する反面、同一な完全一致または３−ｎｔミスマッチｓｇＲＮＡをＣａｓ９と共に使用する場合には広範囲に異なるインデル（ｉｎｄｅｌ）頻度を示した（５０％ｖｓ．２％）（図２ａ）。反対に、２個の２−ｎｔミスマッチを有するｓｇＲＮＡをＢＥ３と共に使用する場合に活性が低い反面（置換頻度＜１％）、同一なミスマッチを有するｓｇＲＮＡをＣａｓ９と共に使用する場合には活性が高かった（インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度＞１０％）（図２ａ）。このような結果はミスマッチを有するｓｇＲＮＡに対するＣａｓ９ヌクレアーゼとＢＥ３デアミナーゼの耐性が異なり、ＢＥ３とＣａｓ９がゲノム内で分離されたセットの非標的部位を有することができるのを暗示する。したがって、ＲＮＡ−プログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム−全体特異性をプロファイリングする方法が必要である。

実施例３．人間ゲノムでＢＥ３非標的ｓｉｔｅｓを確認するためのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ
ゲノム全体にかけてＣａｓ９ヌクレアーゼがＤＳＢを誘導する非標的位置を確認するための方法として、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ（Ｔｓａｉ、Ｓ．Ｑ．ｅｔａｌ．ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑｅｎａｂｌｅｓｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３、１８７−１９７（２０１５））、ＨＴＧＴＳ（Ｆｒｏｃｋ、Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆＤＮＡｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄｂｒｅａｋｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４））、ＢＬＥＳＳ（Ｒａｎ、Ｆ．Ａ．ｅｔａｌ．ＩｎｖｉｖｏｇｅｎｏｍｅｅｄｉｔｉｎｇｕｓｉｎｇＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓＣａｓ９．Ｎａｔｕｒｅ５２０、１８６−１９１（２０１５））、およびＩＤＬＶｃａｐｔｕｒｅ（Ｗａｎｇ、Ｘ．ｅｔａｌ．Ｕｎｂｉａｓｅｄｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｃｌｅａｖａｇｅｂｙＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ａｎｄＴＡＬＥＮｓｕｓｉｎｇｉｎｔｅｇｒａｓｅ−ｄｅｆｅｃｔｉｖｅｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３３、１７５−１７８（２０１５））などのようないくつかの異なる細胞基盤方法が開発された。デアミナーゼがＤＳＢを生成しないため、少なくとも現在の形態では、前記方法の中のいずれもプログラム可能な（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ）デアミナーゼのゲノム全体特異性（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ）を評価するのに適しない。適切な酵素を使用して試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で脱アミン化された、ウラシル含有位置（ｄｅａｍｉｎａｔｅｄ、ｕｒａｃｉｌ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｔｅｓ）でＤＳＢを生成することができ、この時発生したＤＮＡ切断位置はＣａｓ９とＣｐｆ１ヌクレアーゼのゲノム全体特異性を評価するのに使用される試験管内方法であるＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ（ｄｉｇｅｓｔｅｄ−ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；参照文献：Ｋｉｍ、Ｄ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ２６、４０６−４１５（２０１６）；Ｋｉｍ、Ｄ．ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅａｎａｌｙｓｉｓｒｅｖｅａｌｓｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆＣｐｆ１ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ３４、８６３−８６８（２０１６）；Ｋｉｍ、Ｄ．ｅｔａｌ．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ：ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔｓｉｎｈｕｍａｎｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅｍｅｔｈｏｄｓ１２、２３７−２４３、２３１ｐｆｏｌｌｏｗｉｎｇ２４３（２０１５））を通じて確認できると予測される。

このような予測を確認するために、標的配列を含むＰＣＲ増幅産物（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を、試験管内で、（１）ＵＧＩドメインがないＢＥ３の誘導体である組換えｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９タンパク質（参考例２）とそのｓｇＲＮＡと共に培養して、ＣからＵへの転換（Ｃ−ｔｏ−Ｕｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎｓ）およびＷａｔｓｏｎａｎｄＣｒｉｃｋｓｔｒａｎｄｓでの切断（ｎｉｃｋ）をそれぞれ誘導した後、（２）Ｅ．ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｌｙａｓｅＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ＶＩＩＩの混合物であるＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）と共に培養してウラシル位置でのスキ間（ｇａｐ）を生成してｃｏｍｐｏｓｉｔｅＤＳＢを発生させた（図４ａ参照）。その次に、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑを使用してＢＥ３デアミナーゼのゲノム全体標的特異性を評価することができるか否かを調査した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から精製された人間ゲノムＤＮＡを７時間それぞれ３回のＢＥ３リボヌクレオチド（ＲＮＰ）（３００ｎＭｒＡＰＯＢＥＣ１−ｎＣａｓ９タンパク質（参考例２）および９００ｎＭｓｇＲＮＡ）と共に培養した後、３時間使用者と共に培養した（図４ａ参照）。

図４ａは、このようなＢＥ３Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑの概要を示す。Ｅ．ｃｏｌｉウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵｒａｃｉｌＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ；ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼ（ＤＮＡｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ−ｌｙａｓｅＥｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）ＶＩＩＩの混合物であるＵＳＥＲによってＢＥ３−媒介ウラシル含有部位が切断されるのを確認することができる。図４ｂは、ＢＥ３および／またはＵＳＥＲを処理した場合、切断されたＰＣＲ産物を示す電気泳動写真である。図４ｂに示されているように、ＰＣＲ増幅産物はＢＥ３とＵＳＥＲと共に培養する時に切断されるのを確認することができる。

ＢＥ３によって誘導されたＣ対Ｕ転換およびＵＳＥＲによるウラシル除去はサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシングによって確認した（図４ｃ参照）。図４ｃはＢ３によるＣ対Ｕ転換およびＵＳＥＲによるＤＮＡ切断結果を示すサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シークエンシング結果である。各ゲノムＤＮＡサンプルを末端修復（ｅｎｄｒｅｐａｉｒ）およびアダプターライゲーション（ａｄａｐｔｏｒｌｉｇａｔｉｏｎ）した後、全体ゲノムシークエンシング（ＷＧＳ）を行った（図４ａ参照）。

人間参照ゲノム（ｈｕｍａｎｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ；ｈｇ１９）に対する配列整列（ｓｅｑｕｅｎｃｅａｌｉｇｎｍｅｎｔ）後、統合ゲノムビューアー（ＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅＧｅｎｏｍｉｃｓＶｉｅｗｅｒ；ＩＧＶ）を使用して標的位置での整列パターンをモニターしてその結果を図４ｄおよび図５に示した。図４ｄはＥＭＸ１の標的サイトでの配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）の直線整列を示すＩＧＶイメージであり、図５は６個の他の標的サイトでの配列リード（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）の直線整列を示すＩＧＶイメージである。図４ｄおよび図５に示されているように、試験管内で生成されたＤＳＢに関連するシグネチャーパターンが７個の標的位置の全てで観察された。

実施例４．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって明らかになったゲノム全体のＢＥ３非標的サイト
人間ゲノムでＢＥ３非標的位置を確認するために、５’末端が定められた位置に整列された配列リードの個数（ｎｕｍｂｅｒｏｆｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄｓ）を基盤にしてＤＮＡ切断点数をゲノムの各ｎｔ位置に割り当て、発明者らの以前の研究（Ｋｉｍ、Ｄ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ２６、４０６−４１５（２０１６））で同一な７ｓｇＲＮＡセットと共に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼの非標的位置を確認するために使用されたカットオフ値である２．５以上の点数を有する位置を全て羅列した（図６ａ−ｄおよび表２−８）．

各ヌクレオチドの位置ｉ（即ち、ゲノムＤＮＡ上のヌクレオチド位置）にＤＮＡ切断点数を下記の数式で算出した：

前記数式で、塩基配列データの数はヌクレオチドリード数を意味し、シークエンシング深さは特定位置でのシークエンシングリード数を意味し、Ｃ値は１にした。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲されたサイト（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｄｓｉｔｅｓ）（切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅｓｉｔｅ）＋ＰＡＭ）およびＤＮＡ切断スコア（ＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅｓｃｏｒｅ）を下記の表２〜８に示した：

図６ａおよび６ｂは損傷していないゲノムＤＮＡ（灰色；中央部から一番目層）とＢＥ３およびＵＳＥＲ（青色；中央部から２番目層）またはＣａｓ９（赤色；中央部から３番目層；図６ｂのみにある）に分解されたゲノムＤＮＡで得られたＤＮＡ切断点数を示すＧｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｃｉｒｃｕｓｐｌｏｔであって、矢印は標的サイトを示す。図６ｃおよび６ｄはＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲されたサイト（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｓｉｔｅｓ）（表２−８）でＤＮＡ配列を使用してＷｅｂＬｏｇｏを通じて得られた配列ロゴ（ＤＮＡ分解点数＞２．５）を示し、図６ｅおよび６ｆは標的深部シークエンシングを用いて決定されたＣａｓ９媒介インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度とＢＥ３媒介置換頻度の散布図（Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）を示すものであって、円で表された点はＢＥ３によって確認されたがＣａｓ９によって有効な効果がない非標的サイトを示す。図６ｇおよび６ｈは標的深部シークエンシングによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞で確認されたＢＥ３非標的サイトを示すものであって、ＰＡＭ配列は３’末端の最後の３個のヌクレオチドであり、ミスマッチ塩基（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄｂａｓｅ）は小文字で表わし、ダッシュ（−）はＲＮＡｂｕｌｇｅｓを示す（Ｅｒｒｏｒｂａｒｓｉｎｄｉｃａｔｅｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３））。

前記深部シークエンシングに使用されたプライマ−を下記の表９〜表１５に整理した：

図７はＣａｓ９ヌクレアーゼ−および塩基エディター（ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ）−処理ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認されたＤＮＡ切断点数が２．５以上である部位の数を示すベンダイヤグラムである。

前記結果から分かるように、７個の標的遺伝子に対してＢＥ３デアミナーゼとＵＳＥＲを共に使用する場合、試験管内で、ただ１−２４（８±３）位置で人間ゲノムＤＮＡを切断し、これは多重Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ分析（Ｋｉｍ、Ｄ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ．Ｇｅｎｏｍｅｒｅｓｅａｒｃｈ２６、４０６−４１５（２０１６））で同一なｓｇＲＮＡセットと共に使用されるＣａｓ９ヌクレアーゼの切断位置（７０±３０位置）よりはるかに少ない水準である（図７）。即ち、ＢＥ３はＣａｓ９より非標的サイトを切断する潜在性が低いと言える。Ｄｉｇｅｎｏｍｅで確認された位置を比較して得られた配列ロゴ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏｓ）はＰＡＭ−遠位領域とＰＡＭ−近位領域の全てＢＥ３デアミナーゼの特異性に寄与すると確認された（図６ｃ、ｄ）。

潜在的な非標的位置をより包括的に識別するためにコンピュータプログラムを改善した（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ２．０という）。これをより詳しく説明すれば次の通りである：ＤＮＡ切断点数が０．０００１から１０の間のカットオフ値以上である位置の個数と、前記カットオフ値以上の点数を有する位置の中で、標的位置と比較した、１０以下のミスマッチを有しＰＡＭ（５’−ＮＧＮ−３’または５’−ＮＮＧ−３’）を有している候補群の個数を計算した（図８）．図８はＤＮＡ切断点数の範囲に対する総サイト数（■）と１０個以下のミスマッチ（□）があるＰＡＭ含有サイト数を示すグラフである。これは損傷していない人間ゲノムＤＮＡ（左側）とＢＥ３およびＵＳＥＲ（右側）によって分解されたゲノムＤＮＡに対して全体ゲノムシークエンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行って得られた結果である。図８に示されているように、ＢＥ３とＵＳＥＲで処理されなくて損傷していないゲノムＤＮＡを陰性対照群として使用して得られたＷＧＳデータがカットオフ点数が０．１である場合、偽陽性サイト(ｆａｌｓｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅｓｉｔｅｓ）を生成しなかったので、カットオフ点数０．１を選択した（図８）。このような結果に基づいて、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ２．０による非標的位置決定ではＤＮＡ切断点数（ＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅｓｃｏｒｅ）が０．１以上であり１０以下のミスマッチを有しＰＡＭ（５’−ＮＧＮ−３’または５’−ＮＮＧ−３’）を有しているサイト（ｓｉｔｅ）を非標的位置と決定する。一方、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０による非標的位置決定ではＤＮＡ切断点数（ＤＮＡｃｌｅａｖａｇｅｓｃｏｒｅ）が２．５以上であるサイト（ｓｉｔｅ）を非標的位置候補群と決定する。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ２．０を使用し、以前の研究（Ｋｉｍ、Ｄ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｋｉｍ、Ｓ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｔａｒｇｅｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓｏｆＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ｎｕｃｌｅａｓｅｓｒｅｖｅａｌｅｄｂｙｍｕｌｔｉｐｌｅｘＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ．ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ（２０１６））では逃がしたが、ＥＭＸ１に特異的なＣａｓ９を使用してＨＴＧＴＳおよびＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによってキャプチャーされた二つのサイトを含んで、追加的なＢＥ３−およびＣａｓ９−関連ＤＮＡ切断位置を確認することができる。図９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ−および塩基エディター（Ｂａｓｅｅｄｉｔｏｒ）−処理ゲノムＤＮＡのＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認された０．１以上のＤＮＡ切断点数を有するＰＡＭ−含み相同性部位の数を示すベンダイヤグラムである。ＢＥ３デアミナーゼは試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で１−６７（１８±９）位置で塩基転換を誘導する反面、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは３０−２４１（９０±３０）位置でゲノムＤＮＡを切断した。

実施例５．Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって捕獲された相同性部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｉｔｅｓ）の比率
図７および図９に示されたＢＥ３−関連位置およびＣａｓ９−関連位置をより詳しく調査した。図１０はＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって捕獲された相同性部位の比率を示すものであって、棒は標的（標的）部位と６ｎｔまで異なる相同性部位の数を示し、四角形（ＢＥ３）と三角形（Ｃａｓ９）はミスマッチ数の範囲に対してＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑ捕獲サイトの比率を示す。図１０に示されているように、ミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）の個数と関係なく、Ｃａｓ９を使用する場合と比較して、ＢＥ３を使用する場合にＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認される相同性部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｉｔｅｓ）がさらに少なかった。

図１１ａおよび１１ｂは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（１１ａ）およびＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（１１ｂ）によって確認されたＢＥ３−とＣａｓ９−関連サイトの数の間の相関関係を示すグラフである。図１１ａおよび１１ｂに示されているように、Ｃａｓ９−関連位置とＢＥ３−関連位置の個数の間に統計的に有意な相関関係が確認された（Ｒ^２＝０．９７（Ｓｃｏｒｅ＞２．５、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０）または０．８６（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ２．０））。このような結果はｓｇＲＮＡがＣａｓ９特異性とＢＥ３特異性の全ての１次的決定因子（ｐｒｉｍａｒｙｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ）であるのを提案する。

また、図１２ａおよび１２ｂは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０（ａ）またはＤｉｇｅｎｏｍｅ２．０（ｂ）によって確認されたＢＥ３関連サイトの数と６個以下のミスマッチがあるサイトの数の間の相関関係を示す。図１２ａおよび１２ｂに示されているように、ＢＥ３関連Ｄｉｇｅｎｏｍｅ捕獲部位の数と人間ゲノムで６以下のミスマッチを有する相同性部位（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｓｉｔｅｓ）（“ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ”）の数の間に強い相関関係［Ｒ２＝０．９４（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ１．０）または０．９５（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ２．０）］があるのを確認した。特に興味深いことはＢＥ３単独またはＣａｓ９単独と関連があるということである。興味深く、ＤＮＡ−ｇＲＮＡ境界面でそれぞれＲＮＡまたはＤＮＡｂｕｌｇｅを生産するそれぞれの標的サイトと比較した時、ＢＥ３単独に関連するサイトの６９％（＝１８／２６）が一部が欠失されるか延長されたヌクレオチド（ｍｉｓｓｉｎｇｏｒｅｘｔｒａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を有している（表１）。対照的に、このようなｂｕｌｇｅ−ｔｙｐｅ非標的サイトはＣａｓ９関連部位では珍しい場合である。Ｃａｓ９に関連したサイトの４％（＝２５／６４７）のみ一部欠失されるか延長されたヌクレオチドを有することが確認された。

図１３は、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ４−９にシトシンがないＣａｓ９のみに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された非標的サイトの例を示す。Ｃａｓ９単独に関連するサイトの１３％（＝７３／５４８）はＢＥ３媒介脱アミン化（ｄｅａｍｉｎａｔｉｏｎ）の窓（ｗｉｎｄｏｗ）（図１３）である、ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ４−８（５’から３’方向に１−２０と番号が付けられる）の位置にシトシンを有さない。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑによって確認されたＢＥ３−関連サイトで非標的効果を確認するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で標的深部シークエンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行いＢＥ３誘導置換頻度とＣａｓ９誘導インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度を測定して、前述の図６ｅ〜６ｈおよび下記の表１６に示した。

７個のｓｇＲＮＡを使用して確認された総７５個のサイトを分析し、７個の標的サイトの全てを含んで、シークエンシングエラー（一般に０．１〜２％の範囲内）によるノイズ水準を超過する頻度を有する５０個サイトでＢＥ３誘導点突然変異を観察した（有効性検査比率は６７％）。ＢＥ３は暗騒音（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄｎｏｉｓｅ）水準より低い頻度を有する他のＢＥ３−関連Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−陽性部位で依然として突然変異を誘導することができる。重要な点は、塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が０．１％の頻度で検出されるＢＥ３非標的サイトを確認することができ、これはＤｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑは非常に敏感な方法であるというのを示す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＣａｓ９とＢＥ３の全てに関連したサイトの７０％（＝４４／６３）でインデル（ｉｎｄｅｌｓ）を検出可能な程度に誘導するが、ＢＥ３単独に関連する１２個のそれぞれのサイトではこのような活性を示さなかった（表２−８）。

図１４ａ〜１４ｃは、３個の他のＣａｓ９ヌクレアーゼに関連するＤｉｇｅｎｏｍｅ−捕獲された（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｃａｐｔｕｒｅｄ）サイトの塩基編集効率を示す。図１４ａ〜１４ｃに示されているように、ＢＥ３は３個の相異なるＣａｓ９ヌクレアーゼ単独に関連する２４個のＤｉｇｅｎｏｍｅ−陽性部位で検出可能な置換を引き起こさなかった。また、図１５ａ〜１５ｃは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−陰性サイトで３個の互いに異なるＢＥ３デアミナーゼの塩基編集効率を示す。図１５ａ〜１５ｃに示されているように、前記３個のＢＥ３デアミナーゼはＣａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ（Ｂａｅ、Ｓ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．＆Ｋｉｍ、Ｊ．Ｓ．Ｃａｓ−ＯＦＦｉｎｄｅｒ：Ａｆａｓｔａｎｄｖｅｒｓａｔｉｌｅａｌｇｏｒｉｔｈｍｔｈａｔｓｅａｒｃｈｅｓｆｏｒｐｏｔｅｎｔｉａｌ非標的ｓｉｔｅｓｏｆＣａｓ９ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（２０１４））を使用して識別された≦３個のミスマッチを有する２８個のＤｉｇｅｎｏｍｅ陰性サイトで塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）を誘導しなかった（図１５ａ−１５ｃ）。ＢＥ３誘導置換の頻度はＣａｓ９媒介インデル（ｉｎｄｅｌｓ）頻度と高い相関性を示した［Ｒ^２＝０．９２（ＥＭＸ１）または０．８９（ＨＢＢ）］（図６ｅ、ｆ）。それにもかかわらず、ＢＥ３によって検証されるが、Ｃａｓ９によっては検証されない非標的サイトが複数存在する。このような有効性が確認されたＢＥ３独占オフターゲットサイト（ＢＥ３−ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）の中の６４％（＝７／１１）はこれらそれぞれの標的サイトと比較して一部欠失されたヌクレオチドを有する。このような結果は、Ｃａｓ９とＢＥ３の非標的サイトが多くの部位で互いに重畳するが、Ｃａｓ９単独またはＢＥ３単独とは互いに排他的に関連する非標的サイトがあるということを示す（図１０）。

実施例６．改変ｓｇＲＮＡを通じたＢＥ３非標的効果の減少
ＢＥ３非標的効果を減らすために、既存のｓｇＲＮＡ（ｇＸ１９またはＧＸ１９；ｇおよびＧはそれぞれミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈｅｄ）およびマッチ（ｍａｔｃｈｅｄ）グアニンを意味する）を切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｓｇＲＮＡｓ（ｇＸ_１８またはｇＸ_１７で終結する）または５’末端に一つまたは２個のグアニンを追加的に含む延長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ｓｇＲＮＡ（ｇＸ２０またはｇｇＸ２０と称する）で代替し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での標的および非標的塩基編集（ｂａｓｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ）頻度を測定してその結果を図１６〜図１７および表１７に示した。

図１６ａは、既存のｓｇＲＮＡ（ｇＸ１９ｓｇＲＮＡ）、切断された（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｓｇＲＮＡ（ｇＸ１８またはｇＸ１７ｓｇＲＮＡ）および延長（ｅｘｔｅｎｄｅｄ）ｓｇＲＮＡ（ｇＸ２０またはｇｇＸ２０ｓｇＲＮＡ）を図式的に示す。図１６ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨＢＢ標的サイトおよび非標的サイトの塩基編集頻度を標的深層シークエンシングで測定した結果を示す。特異性比率（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｒａｔｉｏ）は、標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）位置での塩基編集頻度を非標的（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）位置での塩基編集頻度で割って計算した。ヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）は既存のｓｇＲＮＡと比較して改変されたｓｇＲＮＡの相対的特異性を示す。

図１７は改変されたｓｇＲＮＡを使用してＢＥ３非標的効果を減少させることができるのを示すものであって、１７ａは既存のｓｇＲＮＡ（ＧＸ１９ｓｇＲＮＡ）と改変されたｓｇＲＮＡ（ＧＸ１７ｓｇＲＮＡ、ｇＸ１８ｓｇＲＮＡ、ｇＸ２０ｓｇＲＮＡおよびｇｇＸ２０ｓｇＲＮＡ）を概略的に示し、図１７ｂはＨＥＫ２９３Ｔ細胞で標的深層シークエンシングによってＥＭＸ１標的サイトおよび非標的サイトで測定された塩基編集効率（頻度）を示す結果である。

図１６ａ、１６ｂ、１７ａ、および１７ｂに示されているように、切断された（Ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）ｓｇＲＮＡｓは多くの位置で非標的効果を減少させたが、５’末端にミスマッチを有するサイトでは非標的効果が悪化された（図１６ｂおよび図１７ｂで星印で表される）。延長ｓｇＲＮＡは標的効果は維持しながらほとんど全てのサイトで非標的効果を減少させた。興味深く、延長されたｓｇＲＮＡのうちの一部は既存のｓｇＲＮＡより標的部位でより高い活性を示した（表１７）。減衰された（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ）Ｃａｓ９変異体の使用、またはプラスミドよりはＢＥ３ＲＮＰを伝達することによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）のゲノム−全体特異性をより向上させることができる。

要約すれば、ミスマッチｓｇＲＮＡｓ、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ−ｓｅｑおよび標的深層シークエンシングを使用して得られた結果は、ＢＥ３デアミナーゼが高度に特異的に試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）でのＣ−Ｕ転換および人間細胞で人間ゲノムの制限された個数の位置での塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）を触媒することが確認された。また、ＢＥ３およびＣａｓ９の非標的サイトがいつも一致するのではなく、したがって各遺伝子編集ツールに対して独立的な評価が行なわれなければならないのを確認した。私たちは私たちの結果と方法が研究および医学でＲＮＡ誘導プログラム可能なデアミナーゼの広範囲な使用を促進することと期待する。

実施例７．ＢＥ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９）−媒介二重鎖切断（ＤＳＢｓ）
標的配列（ＥＮＸ１標的（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ）配列；配列番号３１）を含有するＰＣＲアンプリコン（ＰＣＲａｍｐｌｉｃｏｎ）を試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＢＥ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１−ｄＣａｓ９；実施例２）とｓｇＲＮＡ（配列番号３１を標的化するｓｇＲＮＡ）と共に培養して標的配列内のシトシンをウラシルに変換させた。ｒＡＰＯＢＥＣ１によって変換されたウラシル（Ｕｒａｃｉｌ）はＵＳＥＲ（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ）Ｅｎｚｙｍｅ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）を処理して除去した。その後、Ｓ１ヌクレアーゼ（Ｃａｔａｌｏｇ＃Ｍ５７６１；Ｐｒｏｍｅｇａ）を処理して単一鎖ＤＮＡ部位のホスホジエステル（ｐｈｏｓｐｈｏｄｉｅｓｔｅｒ）結合を切断してシトシンが除去された部位でＤＳＢを生成した（図２２のａ）。

前記反応が完了したＰＣＲアンプリコン（ＰＣＲａｍｐｌｉｃｏｎ）を電気泳動した結果、ＢＥ１／ｓｇＲＮＡ、ＵＳＥＲおよびＳ１ヌクレアーゼ処理によって切断生成されたのが確認された（図２２のｂ）。

以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者は本発明がその技術的な思想や必須的特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施できるということを理解することができるはずである。これに関連して、以上で述べた実施例は全ての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は前記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲の意味および範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更または改変された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

Claims

（１）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、またはシトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、またはシトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、（２）ガイドＲＮＡ、および（３）ウラシル−特異的除去試薬（ＵＳＥＲ）を含む、シトシンデアミナーゼを使用するＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）用組成物であって、
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼ活性を喪失した不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼであり、
前記ウラシル−特異的除去試薬は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩ、またはこれらの組み合わせを含むものである、前記組成物。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失したＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項１に記載の組成物。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にアミノ酸残基Ｄ１０が他のアミノ酸で置換された突然変異が導入されたものである、請求項２に記載の組成物。
シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは融合タンパク質形態であるか、または
前記シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子は、シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１に記載の組成物。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にアミノ酸残基Ｄ１０が他のアミノ酸で置換された突然変異とアミノ酸残基Ｈ８４０が他のアミノ酸で置換された突然変異が全て導入されたものであり、
前記組成物は、ＤＮＡの単一鎖領域を特異的に切断するエンドヌクレアーゼを追加的に含むものである、請求項１に記載の組成物。
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、をガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、または細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；および
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）で処理する段階
を含む、シトシンデアミナーゼを使用してＤＮＡに二重鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ）を生成する方法。
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、をガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、または細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）で処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；および
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階
を含む、シトシンデアミナーゼによって塩基編集（ｂａｓｅｅｄｉｔｉｎｇ）が導入されたＤＮＡの核酸配列分析方法。
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、をガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、または細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）で処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階；および
（ｉｖ）前記分析によって得られた核酸配列データで前記二重鎖切断部位を確認する段階
を含む、シトシンデアミナーゼの塩基編集部位確認方法。
（ｉ）（ａ）シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼ、または（ｂ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子、または（ｃ）シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子を含むプラスミド、をガイドＲＮＡと共に細胞に導入するか、または細胞から分離されたＤＮＡに接触させる段階；
（ｉｉ）ウラシル−特異的除去試薬（Ｕｒａｃｉｌ−ＳｐｅｃｉｆｉｃＥｘｃｉｓｉｏｎＲｅａｇｅｎｔ；ＵＳＥＲ）で処理してＤＮＡに二重鎖切断を生成する段階；
（ｉｉｉ）前記切断されたＤＮＡ断片の核酸配列を分析する段階；および
（ｉｖ）前記分析によって得られた核酸配列データで前記二重鎖切断部位を確認する段階
を含む、シトシンデアミナーゼの非標的位置（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）確認方法。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ＤＮＡ二重鎖を切断するエンドヌクレアーゼ活性を喪失したＣａｓ９タンパク質またはＣｐｆ１タンパク質である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にアミノ酸残基Ｄ１０が他のアミノ酸で置換された突然変異が導入されたものである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、融合タンパク質形態であるか、または
前記シトシンデアミナーゼコード遺伝子および不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼコード遺伝子は、シトシンデアミナーゼおよび不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼを含む融合タンパク質をコードする、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記不活性化された標的特異的エンドヌクレアーゼは、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９タンパク質にアミノ酸残基Ｄ１０が他のアミノ酸で置換された突然変異とアミノ酸残基Ｈ８４０が他のアミノ酸で置換された突然変異が全て導入されたものであり、
前記段階（ｉｉ）以後に、ＤＮＡの単一鎖領域を特異的に切断するエンドヌクレアーゼで処理する段階を追加的に含む、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが互いに結合された二重鎖ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体、または単一鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
試験管内（ｉｎｖｉｔｒｏ）で行われるものである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記段階（ｉ）の細胞から分離されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡである、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
段階（ｉ）の細胞から分離されたＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであり、
段階（ｉｉｉ）の核酸配列分析は、全体ゲノムシークエンシングによって行われるものである、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
前記段階（ｉｖ）以後に、
前記切断位置が標的部位（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）でない場合、非標的部位（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）と判断する段階を追加的に含む、請求項１０に記載の方法。
前記段階（ｉｖ）で確認された切断部位は、得られた塩基配列データを整列して５’末端がまっすぐに整列された位置、または５’末端プロットで二重ピークパターンを示す位置である、請求項１０に記載の方法。
前記整列は、標準ゲノム（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）で配列データをマッピングした後、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣを用いて行われる、請求項２０に記載の方法。
ワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）に該当する配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）がそれぞれ二つ以上ずつまっすぐに整列される部位を非標的部位であると判断する段階を追加的に含む、請求項２０に記載の方法。
２０％以上の配列データがまっすぐに整列され、それぞれのワトソン鎖およびクリック鎖で同一な５’末端を有する配列データの数が１０以上である部位が非標的部位であると判断する段階を追加的に含む、請求項２０に記載の方法。