JP6621820B2

JP6621820B2 - ゲノムでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法

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Publication number: JP6621820B2
Application number: JP2017526125A
Authority: JP
Inventors: ジンスキム; デシクキム; サンスペ
Original assignee: Institute for Basic Science
Current assignee: Institute for Basic Science
Priority date: 2014-11-14
Filing date: 2015-11-13
Publication date: 2019-12-18
Anticipated expiration: 2035-11-13
Also published as: KR101828933B1; EP3219810A1; EP3219810B1; EP3219810A4; CN107109486A; KR20160058703A; JP2017533724A; WO2016076672A1; CN107109486B

Description

本発明は、ゲノムでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）を検出する方法に関し、より詳細には、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で分離されたゲノム（ｃｅｌｌ‐ｆｒｅｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）にプログラマブルヌクレアーゼを処理してゲノムを切断した後、それを全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）し、データを分析することで非標的位置を検出する方法、並びにその方法を用いて非標的効果を最小化するプログラマブルヌクレアーゼの標的位置選別方法に関する。

ＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、及び第ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｒｅｐｅａｔ／ＣＲＩＳＰＲ‐ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）原核生物獲得免疫システム由来のＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）など、プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅｓ）は培養された細胞及び個体のゲノム編集に広く用いられている。前記プログラマブルヌクレアーゼを用いたゲノム編集技術は、生命科学、生命工学、及び医学分野などで様々な目的のために利用される非常に有用な技術である。例えば、幹細胞または体細胞で標的化された遺伝子改変を起こすことで、様々な遺伝的疾患または後天的疾患に対する遺伝子／細胞治療が可能となっている。しかし、前記プログラマブルヌクレアーゼは、標的位置（ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）だけでなく、それと相同性を有する非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）に対しても、突然変異を引き起こす恐れがある（Ｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１３，４１（２０）：９５８４‐９５９２）。

代表的な一例として、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡ（ｓｍａｌｌｇｕｉｄｅＲＮＡ）で構成されるＲＧＥＮは、ｓｇＲＮＡとハイブリダイズされる２０‐ｂｐ（ｂａｓｅｐａｉｒ）配列及びＣａｓ９により認識されるＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列である５´‐ＮＧＧ‐３´で構成される２３‐ｂｐの標的ＤＮＡ配列を認識するが、一部のヌクレオチド配列が一致しない場合にも働くことがある（ＧｅｎｏｍｅＲｅｓ，２０１４，２４：１３２‐１４１）。さらに、ＲＧＥＮは、ｓｇＲＮＡ配列に比べて追加の塩基配列を有するか（ＤＮＡｂｕｌｇｅ）、または１つの塩基がない（ＲＮＡｂｕｌｇｅ）非標的ＤＮＡ配列も切断し得る。これと類似に、ＺＦＮとＴＡＬＥＮも一部塩基の異なる配列を切断し得る。これは、ゲノムにプログラマブルヌクレアーゼを適用する場合、標的位置以外に相当数の非標的位置を有し得ることを示唆する。

非標的ＤＮＡの切断は、プロトオンコジーン（ｐｒｏｔｏ‐ｏｎｃｏｇｅｎｅ）や癌抑制遺伝子（ｔｕｍｏｒｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｇｅｎｅ）のように不所望の遺伝子で突然変異を引き起こす恐れがあり、転位（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）、欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）、及び逆位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）などのゲノム組換えを増加させ得るため、研究分野及び医学分野などにおけるプログラマブルヌクレアーゼの利用に深刻な問題となり得る（ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉ，２００９，１０６：１０６２０‐１０６２５）。そこで、プログラマブルヌクレアーゼの非標的効果を低減するための様々な戦略が報告されてはいるものの、全体ゲノムレベルで非標的効果なしに標的位置にのみ特異的に働くプログラマブルヌクレアーゼは未だに報告されていない。このような問題点に応えるべく、プログラマブルヌクレアーゼの特異性をゲノムレベルで確認できる方法を開発することが重要である。

本発明者らは、ゲノムレベルでプログラマブルヌクレアーゼの標的及び非標的位置を検出し分析することができるシステムを開発するために鋭意研究した結果、ゲノムをプログラマブルヌクレアーゼで切断した後、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を行うことでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出することができる方法（Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ、ｎｕｃｌｅａｓｅ‐ｄｉｇｅｓｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を開発し、本発明を成すに至った。

本発明の一目的は、（ａ）分離されたゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを標的特異的プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）で切断するステップと、（ｂ）前記切断されたＤＮＡに対する次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うステップと、（ｃ）前記シーケンシングにより得た塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）で前記切断された位置を決定するステップと、を含む、プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）を検出する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を鋳型としてインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）転写されたガイドＲＮＡを細胞に導入するステップを含む、ゲノム編集における非標的効果を低減する方法を提供することにある。

本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、高度の再現性を有してゲノムレベルでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出することができるため、標的特異性の高いプログラマブルヌクレアーゼの製作及びそのための研究に用いられることができる。

インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるＲＧＥＮ‐媒介ゲノムＤＮＡの切断に関する図であって、インビトロにおけるＲＧＥＮ‐媒介ゲノムＤＮＡの切断を示す模式図である。インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるＲＧＥＮ‐媒介ゲノムＤＮＡの切断に関する図であって、標的位置及び４個の潜在的非標的位置でＨＢＢを標的とするＲＧＥＮによりゲノムＤＮＡが切断されるかを確認した図である。１Ｘ反応で、Ｃａｓ９タンパク質（４０ｕｇ、３００ｎＭ）及びｓｇＲＮＡ（３０ｕｇ、９００ｎＭ）を８μｇのＨＡＰ１ゲノムＤＮＡと８時間反応させた。Ｃａｓ９及びｓｇＲＮＡは１０倍〜１０，０００倍に漸次的に希釈した。切断されなかったＤＮＡをｑＰＣＲにより測定した。下側には、標的位置及び４個の潜在的非標的位置のＤＮＡ配列を示している。一致しないヌクレオチドを赤色で示し、ＰＡＭ配列は青色で示した。インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるＲＧＥＮ‐媒介ゲノムＤＮＡの切断に関する図であって、標的位置及び潜在的非標的位置で、ＲＧＥＮによる突然変異の頻度をＴ７Ｅ１分析により測定したものである。インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）におけるＲＧＥＮ‐媒介ゲノムＤＮＡの切断に関する図であって、インデル（ｉｎｄｅｌ）頻度を測定するために標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行って示したものである。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、非標的位置を確認するためのヌクレアーゼ‐切断の全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）を示す模式図である。非形質転換またはＲＧＥＮ形質転換細胞から分離したゲノムＤＮＡをＲＧＥＮで切断し、ＷＧＳを行った。塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）を標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ、ｈｇ１９）に対して整列し、ＩＧＶプログラムを用いて視覚化した。正方向の塩基配列データはオレンジ色で、逆方向の塩基配列データは空色で示した。赤色の三角形及び垂直点線は切断位置を示す。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、標的位置でＨＢＢ特異的ＲＧＥＮを用いて得た代表的なＩＧＶデータである。インデルは矢印で示した。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、ヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示したものである。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、潜在的非標的位置であるＯＴ１でＨＢＢ特異的ＲＧＥＮを用いて得た代表的なＩＧＶデータである。インデルは矢印で示した。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、潜在的非標的位置であるＯＴ３でＨＢＢ特異的ＲＧＥＮを用いて得た代表的なＩＧＶデータである。インデルは四角形で示した。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、潜在的非標的位置であるＯＴ７でＨＢＢ特異的ＲＧＥＮを用いて得た代表的なＩＧＶデータである。非標的位置を探すためのＲＧＥＮにより誘導されたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに関する図であって、潜在的非標的位置であるＯＴ１２でＨＢＢ特異的ＲＧＥＮを用いて得た代表的なＩＧＶデータである。ゲノム上の特定位置における５´末端個数のプロット（ｐｌｏｔ）を示した図であって、ヌクレアーゼ切断位置におけるＩＧＶデータを示したものである。ゲノム上の特定位置における５´末端個数のプロット（ｐｌｏｔ）を示した図であって、ＯＴ１位置でヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。ゲノム上の特定位置における５´末端個数のプロット（ｐｌｏｔ）を示した図であって、ＯＴ３位置でヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認され標的ディープシーケンシングにより検証されたＨＢＢＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、非形質転換またはＲＧＥＮ形質転換細胞でＨＢＢＲＧＥＮを用いてＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された標的位置と非標的位置の数を示すベン図である。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認され標的ディープシーケンシングにより検証されたＨＢＢＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、標的位置とＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を比較したヒートマップ（ｈｅａｔｍａｐ）を示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認され標的ディープシーケンシングにより検証されたＨＢＢＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置で、ＤＮＡ配列を用いてＷｅｂＬｏｇｏにより得た配列ロゴ（ｌｏｇｏ）を示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認され標的ディープシーケンシングにより検証されたＨＢＢＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ及び標的化ディープシーケンシングの結果を要約したものである。Ｎ．Ｄ．は、確認されなかったことを意味する。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認され標的ディープシーケンシングにより検証されたＨＢＢＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、標的化ディープシーケンシングにより検証された非標的位置を示したものである。青色のバーは非形質転換ＨＡＰ１細胞、赤色のバーはＨＢＢＲＧＥＮ形質転換ＨＡＰ１細胞を用いて得たインデル頻度を示したものである。左側には、標的位置及び非標的位置のＤＮＡ配列を示しており、不一致塩基は赤色で示し、ＰＡＭ配列は青色で示した。右側のＰ値はフィッシャー直接検定（Ｆｉｓｈｅｒｅｘａｃｔｔｅｓｔ）で計算したものである。完全なゲノム配列で確認された偽陽性位置を示した図であって、ＨＡＰ１細胞で自然的に発生するインデルの結果として示される偽陽性位置周辺の代表的なＩＧＶデータである。新しく検証された非標的位置でＨＢＢＲＧＥＮにより誘導されたインデル配列を示した図であって、標的化ディープシーケンシングにより非標的インデルを検出したものである。挿入されたヌクレオチドは赤色で示し、ＰＡＭ配列は青色で示した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、ＶＥＧＦ‐Ａ非標的位置のうち１つで５´末端個数のプロットを示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、標的位置とＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を比較したヒートマップである。与えられた位置で、暗い赤色は１００％、暗い青色は０％一致することを示す。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置で、ＤＮＡ配列を用いてＷｅｂＬｏｇｏにより得た配列ロゴを示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ及び標的ディープシーケンシングの結果を要約したものである。Ｎ．Ｄ．は、確認されなかったことを意味する。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を示した図であって、標的化ディープシーケンシングにより検証された非標的位置を示したものである。青色のバーは非形質転換ＨＡＰ１細胞、赤色のバーはＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮ形質転換ＨＡＰ１細胞を用いて得たインデル頻度を示す。左側には、標的位置及び非標的位置のＤＮＡ配列を示しており、不一致塩基は赤色で、ＰＡＭ配列は青色で示した。右側のＰ値は、フィッシャー直接検定（Ｆｉｓｈｅｒｅｘａｃｔｔｅｓｔ）で計算したものである。ＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を確認するためのＲＧＥＮ誘導Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、標的位置においてヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。ＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を確認するためのＲＧＥＮ誘導Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、非標的位置においてヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。ＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を確認するためのＲＧＥＮ誘導Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、非標的位置においてヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。ＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮの非標的位置を確認するためのＲＧＥＮ誘導Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、非標的位置においてヌクレオチド位置による同一の５´末端を有する塩基配列データの絶対的及び相対的数字を示す５´末端プロットを示したものである。新しく検証された非標的位置でＶＥＧＦ‐ＡＲＧＥＮにより誘導されたインデル配列を示した図であって、非標的インデルは、標的化ディープシーケンシングにより検出した。挿入されたヌクレオチドは赤色で示し、ＰＡＭ配列は青色で示した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析に対するインビトロＤＮＡ切断点数付与システムを示したものである。向上したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析を示した図であって、インビトロＤＮＡ切断点数のゲノムレベルのＣｉｒｃｏｓプロットを示したものである。ヒトゲノムＤＮＡ（赤色）及びＲＧＥＮで切断されたゲノムＤＮＡ（緑色）を用いて全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）を行った。向上したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析を示した図であって、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミドから転写されたｓｇＲＮＡを用いたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示す模式図である。向上したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析を示した図であって、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミドから転写されたｓｇＲＮＡを用いて得た配列ロゴを示したものである。インビトロＤＮＡ切断点数付与システムの再現性を示した図である。オリゴヌクレオチド二本鎖から転写されたｓｇＲＮＡを用いたＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されたバルジ型（ｂｕｌｇｅ‐ｔｙｐｅ）非標的位置を示したものである。複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示す模式図である。複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、単一及び複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析により確認されたインビトロ切断位置の数字をベン図で示したものである。複合（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ）Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを示した図であって、単一または複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより得たＸ染色体上のインビトロＤＮＡ切断点数を示したものである。複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を分析した図であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ及びＨＴＧＴＳにより確認した位置の数字をベン図で示したものである。複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を分析した図であって、総不一致数（上側）及びシード部位（ｓｅｅｄｒｅｇｉｏｎ）における不一致数（下側）による、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置の割合を示したものである。複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を分析した図であって、ヒトゲノムで６以下のヌクレオチド不一致を有する位置の数及びＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置の数を散布図（ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ）で示したものである（上側）。１１個のＲＧＥＮ標的位置をＧ１（ヒトゲノムで６以下のヌクレオチド不一致を有する位置が１３，０００個未満）及びＧ２（ヒトゲノムで６以下のヌクレオチド不一致を有する位置が１６，０００個以上）の２つのグループに分けた（下側）。エラーバーはＳＥＭを示す。Ｐ値はスチューデントｔ検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ｀ｓｔ‐ｔｅｓｔ）で計算したものである。複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置を分析した図であって、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより確認された位置の数及びＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置の数を散布図で示したものである。ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ陽性位置の数及びヒトゲノムで６以下のヌクレオチド不一致を有する相同性位置の数との相関関係が不十分であることを示したものである。ＨＴＧＴＳ及びＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑによっては確認されたが、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっては確認されなかった２個のＥＭＸ１非標的位置を示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ及びＣＨＩＰ‐ｓｅｑにより確認された位置の数をベン図で示したものである。ＲＮＦ２‐特異的ｓｇＲＮＡによって形質転換されたＨｅＬａ細胞で確認された標的及び非標的位置におけるインデル頻度をｌｏｇｓｃａｌｅで示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、一般的なｓｇＲＮＡ（ｇＸ_１９ｓｇＲＮＡ）及び変形されたｓｇＲＮＡ（ｇｇＸ_２０ｓｇＲＮＡ）を模式的に示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＮＧＳにより検証されたＥＭＸ１の標的及び非標的位置におけるインデル頻度を示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＮＧＳにより検証されたＨＥＫ２９３‐３の標的及び非標的位置におけるインデル頻度を示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＮＧＳにより検証されたＲＮＦ２ｓｇＲＮＡの標的及び非標的位置におけるインデル頻度を示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＥＭＸ１の標的位置におけるインデル頻度を非標的位置におけるインデル頻度で除して計算した特異性比（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｒａｔｉｏｓ）を示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＨＥＫ２９３‐３の標的位置におけるインデル頻度を非標的位置におけるインデル頻度で除して計算した特異性比（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｒａｔｉｏｓ）を示したものである。非標的位置で標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いてインデル頻度を確認したものであって、ＲＮＦ２ｓｇＲＮＡの標的位置におけるインデル頻度を非標的位置におけるインデル頻度で除して計算した特異性比（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｒａｔｉｏｓ）を示したものである。ＮＧＳにより検証された非標的位置及びＮＧＳにより検証されなかった非標的位置を分析したものであって、全体２０‐ｎｔ配列で示された不一致による非標的位置での相対的なインデル頻度（ｌｏｇｓｃａｌｅ）プロットを示したものである。ＮＧＳにより確認した位置（図２２ａ）は、検証された位置（図２２ｂ）及び検証されなかった位置（図２２ｃ）の２つのグループに分けた。ＮＧＳにより検証された非標的位置及びＮＧＳにより検証されなかった非標的位置を分析したものであって、１０‐ｎｔシード配列で示された不一致による非標的位置での相対的なインデル頻度（ｌｏｇｓｃａｌｅ）プロットを示したものである。ＮＧＳにより検証された非標的位置及びＮＧＳにより検証されなかった非標的位置を分析したものであって、１０‐ｎｔシード配列で示された不一致による非標的位置での相対的なインデル頻度（ｌｏｇｓｃａｌｅ）プロットを示したものである。１００個の標的位置に対してＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った結果を示したものであって、試験過程を模式的に示したものである。１００個の標的位置に対してＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った結果を示したものであって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに基づいて非標的位置を予測するプログラムと他のプログラム（Ｃｒｏｐ‐ｉｔ）を比較した結果を示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）の非標的効果をゲノムレベルで確認したものであって、ＺＦＮ‐２２４処理前／後の標的位置の代表的なＩＧＶ写真である。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）の非標的効果をゲノムレベルで確認したものであって、未処理ゲノムＤＮＡ（赤色）、ＺＦＮ‐２２４（ＷＴＦｏｋＩ）で切断したＤＮＡ（緑色）、及びＺＦＮ‐２２４（ＫＫ／ＥＬＦｏｋＩ）で切断したＤＮＡ（青色）のゲノムレベルでインビトロＤＮＡ切断点数を示すＣｉｒｃｏｓプロットを示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）の非標的効果をゲノムレベルで確認したものであって、ＺＦＮ‐２２４（ＷＴＦｏｋＩ）での非標的候補位置を用いて得た配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）を示したものである。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）の非標的効果をゲノムレベルで確認したものであって、ＺＦＮ‐２２４（ＫＫ／ＥＬＦｏｋＩ）での非標的候補位置を用いて得た配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）を示したものである。ＺＦＮのＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより非標的位置を検出した結果を示したものであって、ＺＦＮ‐２２４（ＫＫ／ＥＬＦｏｋＩ）の非標的候補位置で標的化ディープシーケンシングを用いてインデル頻度を測定したものである。ＺＦＮのＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより非標的位置を検出した結果を示したものであって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ、ＩＬＤＶ、及びインビトロ選択により検出した非標的候補位置の数を示したベン図である。ＺＦＮのＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより非標的位置を検出した結果を示したものであって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ、ＩＬＤＶ、及びインビトロ選択により検出した、検証された標的位置の数を示したベン図である。

上記の目的を達成するための一様態として、本発明は、（ａ）分離されたゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを標的特異的プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）で切断するステップと、（ｂ）前記切断されたＤＮＡに対する次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うステップと、（ｃ）前記シーケンシングにより得た塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）で前記切断された位置を決定するステップと、を含む、プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）を検出する方法を提供する。本発明者らは、上記の方法を「Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ」と命名し、これは、ヌクレアーゼにより切断されたゲノムシーケンシング（ｎｕｃｌｅａｓｅ‐ｄｉｇｅｓｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を意味する。

ゲノム編集／遺伝子編集技術は、ヒト細胞を始めとする動植物細胞のゲノム塩基配列に標的指向型変異を導入できる技術であって、特定遺伝子をノックアウト（ｋｎｏｃｋ‐ｏｕｔ）またはノックイン（ｋｎｏｃｋ‐ｉｎ）したり、タンパク質を生成しないノンコードＤＮＡ配列にも変異を導入したりすることができる。本発明の方法は、前記ゲノム編集／遺伝子編集技術に用いられるプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出することであって、これは、標的位置にのみ特異的に働くプログラマブルヌクレアーゼの開発に有用に用いられることができる。

（ａ）ステップは、分離されたゲノム（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを標的特異的プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）で切断するステップであって、換言すれば、分離されたゲノムＤＮＡを、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で特定標的に特異的に働くプログラマブルヌクレアーゼを用いて切断するステップである。但し、プログラマブルヌクレアーゼは、標的特異的に製作したとしても、特異性によって、他の部位、すなわち、非標的位置も切断し得る。したがって、前記（ａ）ステップにより、用いられた標的特異的プログラマブルヌクレアーゼが、ゲノムＤＮＡに対して活性を有し得る位置である標的位置及び多数の非標的位置を切断することで、特定位置が切断されたゲノムＤＮＡが得られる。前記ゲノムＤＮＡの種類は特に制限されず、野生型細胞または形質転換された細胞のゲノムＤＮＡであってもよい。また、前記形質転換された細胞は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの目的によって、特定プログラマブルヌクレアーゼを発現するように形質転換されたものであってもよい。

本発明において、用語「プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）」は、目的とするゲノム上の特定位置を認識して切断することのできる全ての形態のヌクレアーゼを意味する。これに制限されるものではないが、特に、ゲノム上の特定標的配列を認識するドメインである植物病原性遺伝子由来のＴＡＬエフェクター（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒ）ドメインと切断ドメインが融合されたＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｚｉｎｃ‐ｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、微生物免疫システムであるＣＲＩＳＰＲ由来のＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｃｐｆ１、アゴホモログ（Ａｇｏｈｏｍｏｌｏｇ、ＤＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ）などが含まれてもよい。

前記プログラマブルヌクレアーゼは、ヒト細胞を始めとする動植物細胞のゲノムで特定塩基配列を認識し、二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）を起こす。前記二本鎖切断は、ＤＮＡの二本鎖を切断して鈍端（ｂｌｕｎｔｅｎｄ）または付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ）を形成することを全て含む。ＤＳＢは、細胞内で相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）または非相同末端結合（ｎｏｎ‐ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ‐ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）機構により効率的に修復されるが、この過程で、研究者が所望の変異を標的部位に導入することができる。前記プログラマブルヌクレアーゼは、人工的な、もしくは操作された非天然発生（ｎｏｎ‐ｎａｔｕｒａｌｌｙｏｃｃｕｒｒｉｎｇ）のものであってもよい。

本発明において、用語「標的位置（ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）」とは、前記プログラマブルヌクレアーゼを用いて変異を導入しようとする位置を意味し、その目的に応じて任意に選択できるものであって、特定遺伝子内に存在してもよく、タンパク質を生成しないノンコードＤＮＡ配列であってもよい。

前記プログラマブルヌクレアーゼは配列特異性（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を有するため標的位置に作用するが、標的配列によって非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）に作用することもある。本発明において、用語「非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）」とは、プログラマブルヌクレアーゼの標的配列と同一ではない配列を有する位置で前記プログラマブルヌクレアーゼが活性を有する位置を意味する。すなわち、プログラマブルヌクレアーゼにより切断される標的位置以外の位置を意味する。特に、本発明において非標的位置は、特定のプログラマブルヌクレアーゼに対する実際の非標的位置だけでなく、非標的位置となる可能性のある位置も含む概念であって、前記非標的位置は、これに制限されるものではないが、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でプログラマブルヌクレアーゼにより切断される位置である。

プログラマブルヌクレアーゼが標的位置以外の位置でも活性を有することは、様々な原因により引き起こされ得る現象であるが、特に、標的位置に対して設計された標的配列とヌクレオチド不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する、標的位置と配列相同性が高い非標的配列である場合に、プログラマブルヌクレアーゼが働く可能性がある。前記非標的位置は、これに制限されるものではないが、標的配列と１以上のヌクレオチド不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する位置である。

これは、ゲノム内で不所望の遺伝子の突然変異を引き起こす恐れがあるため、前記プログラマブルヌクレアーゼを用いるにおいて深刻な問題となり得る。したがって、プログラマブルヌクレアーゼの標的位置での活性なみに非標的位置を正確に検出して分析する過程も非常に重要であり、これは、非標的効果なしに標的位置にのみ特異的に働くプログラマブルヌクレアーゼを開発するにおいて有用に用いられることができる。

前記プログラマブルヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）、Ｃｐｆ１、及びＡｇｏホモログからなる群から選択されるものであってもよいが、これに制限されるものではなく、標的遺伝子の特定配列を認識し、ヌクレオチド切断活性を有して、標的遺伝子でインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を引き起こすことができるものであれば、何れも本発明の範囲に含まれることができる。

前記メガヌクレアーゼは、これに制限されるものではないが、自然発生のメガヌクレアーゼであってもよく、これらは、１５‐４０個の塩基対の切断部位を認識する。これは、通常、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ‐ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ‐Ｃｙｓｔボックスファミリー、及びＨＮＨファミリーの４つのファミリーに分類される。メガヌクレアーゼとしては、例えば、Ｉ‐ＳｃｅＩ、Ｉ‐ＣｅｕＩ、ＰＩ‐ＰｓｐＩ、ＰＩ‐ＳｃｅＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＶ、Ｉ‐ＣｓｍＩ、Ｉ‐ＰａｎＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩ、Ｉ‐ＰｐｏＩ、Ｉ‐ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ‐ＣｒｅＩ、Ｉ‐ＴｅｖＩ、Ｉ‐ＴｅｖＩＩ、及びＩ‐ＴｅｖＩＩＩが挙げられる。

自然発生のメガヌクレアーゼ、主に、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに由来するＤＮＡ結合ドメインを用いて、植物、酵母、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、哺乳動物細胞及びマウスで位置‐特異的ゲノム変形が促進されていたが、このようなアプローチは、メガヌクレアーゼ標的配列が保存された相同性遺伝子の変形（Ｍｏｎｅｔｅｔａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｏｎ．２５５：８８‐９３）であって、標的配列が導入される前に操作されたゲノムの変形には限界があった。したがって、医学的または生命工学的に係わる部位において新規な結合特異性を示すようにメガヌクレアーゼを操作しようとする試みがあった。また、メガヌクレアーゼに由来する自然発生または操作されたＤＮＡ結合ドメインが、異種性ヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する切断ドメインに働くように連結された。

前記ＺＦＮは、選択された遺伝子、及び切断ドメインまたは切断ハーフ‐ドメインの標的部位に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質を含む。前記ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及びＤＮＡ切断ドメインを含む人工的な制限酵素であってもよい。ここで、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、選択された配列に結合するように操作されたものであってもよい。例えば、Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５‐１４１；Ｐａｂｏｅｔａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３‐３４０；Ｉｓａｌａｎｅｔａｌ，（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６‐６６０；Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２‐６３７；Ｃｈｏｏｅｔａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１‐４１６が本明細書の参照資料として含まれることができる。自然発生のジンクフィンガータンパク質に比べて、操作されたジンクフィンガー結合ドメインは新規な結合特異性を有することができる。操作方法は、合理的設計及び様々なタイプの選択を含むが、これに限定されない。合理的設計は、例えば、三重（または四重）ヌクレオチド配列、及び個別ジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの利用を含み、この際、それぞれの三重または四重ヌクレオチド配列は、特定の三重または四重配列に結合するジンクフィンガーの１つ以上の配列と連合される。

標的配列の選択、融合タンパク質（及びそれを暗号化するポリヌクレオチド）の設計及び構成は、当業者に公知となっており、参照資料として米国特許出願公開２００５／００６４４７４及び２００６／０１８８９８７の全文に詳細に説明されており、前記公開特許の全文が本発明の参照資料として本明細書に含まれる。また、このような参考文献及び当業界における他の文献に開示されているように、ジンクフィンガードメイン及び／または多重‐フィンガージンクフィンガータンパク質が任意の適切なリンカー配列、例えば、５個以上のアミノ酸長のリンカーを含むリンカーによってともに連結され得る。６個以上のアミノ酸長のリンカー配列の例は、米国登録特許６，４７９，６２６；６，９０３，１８５；７，１５３，９４９を参考とする。これに説明されたタンパク質は、タンパク質の各ジンクフィンガーの間に適切なリンカーの任意の組合せを含むことができる。

また、ＺＦＮのようなヌクレアーゼは、ヌクレアーゼ活性部分（切断ドメイン、切断ハーフ‐ドメイン）を含む。周知のように、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと異なるヌクレアーゼからの切断ドメインのように、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに異種性であってもよい。異種性の切断ドメインは、任意のエンドヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼから得られる。切断ドメインが由来可能な例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼを含むが、これに限定されない。

類似に、切断ハーフ‐ドメインは、前記で提示されているように、切断活性のために二量体化を必要とする任意のヌクレアーゼまたはその一部に由来してもよい。融合タンパク質が切断ハーフ‐ドメインを含む場合、一般に、２つの融合タンパク質が切断に必要とされる。代案として、２つの切断ハーフ‐ドメインを含む単一タンパク質が用いられてもよい。２つの切断ハーフ‐ドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来してもよく、もしくは、各切断ハーフ‐ドメインが異なるエンドヌクレアーゼ（またはそれの機能的断片）に由来してもよい。また、２つの融合タンパク質の標的部位は、２つの融合タンパク質とその各標的部位の結合により切断‐ハーフドメインが相互に対して空間的に配向して位置することで、切断ハーフ‐ドメインが、例えば二量体化により機能性切断ドメインを形成するようにするといった関係で配置されることが好ましい。したがって、一様態において、３〜８個のヌクレオチドまたは１４〜１８個のヌクレオチドにより標的部位の隣接した端部が分離される。しかし、任意の定数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が２個の標的部位の間に介在されてもよい（例えば、２〜５０個のヌクレオチド対またはそれ以上）。一般に、切断部位は標的部位の間に置かれる。

制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列‐特異的に結合して（標的部位で）、その結合部位やその付近でＤＮＡを切断することができる。ある制限酵素（例えば、ＴｙｐｅＩＩＳ）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合と切断可能なドメインを有する。例えば、ＴｙｐｅＩＩＳ酵素ＦｏｋＩは、一本鎖上の認識部位から９個のヌクレオチドにおいて、そして残りの一本鎖上の認識部位から１３個のヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖の切断を触媒する。したがって、一様態において、融合タンパク質は少なくとも１個のＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素からの切断ドメイン（または切断ハーフ‐ドメイン）と１つ以上の亜鉛‐フィンガー結合ドメイン（操作されてもよく、そうでなくてもよい）を含む。

本発明において、用語「ＴＡＬＥＮ」は、ＤＮＡのターゲット領域を認識及び切断できるヌクレアーゼをいう。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥドメイン及びヌクレオチド切断ドメインを含む融合タンパク質をいう。本発明において、「ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ」及び「ＴＡＬＥＮ」という用語は互換可能である。ＴＡＬエフェクターは、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）バクテリアが様々な植物種に感染した際に、それらのタイプＩＩＩ分泌システムにより分泌されるタンパク質として知られている。前記タンパク質は、宿主植物内のプロモーター配列に結合してバクテリアの感染を助ける植物遺伝子の発現を活性化することができる。前記タンパク質は、３４個以下の様々な数のアミノ酸の繰り返しからなる中心繰り返しドメインによって植物ＤＮＡ配列を認識する。したがって、ＴＡＬＥは、ゲノム工学の道具のための新規なプラットフォームとなり得ると考えられる。但し、ゲノム‐編集活性を有する機能ＴＡＬＥＮを製作するためには、次のように今まで知られていない少数の主要媒介変数が定義されるべきである。ｉ）ＴＡＬＥの最小ＤＮＡ‐結合ドメイン、ｉｉ）１つのターゲット領域を構成する２つの半分‐部位の間のスペーサーの長さ、及びｉｉｉ）ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをｄＴＡＬＥに連結するリンカーまたは融合接合（ｆｕｓｉｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ）。

本発明のＴＡＬＥドメインは、１つ以上のＴＡＬＥ‐繰り返しモジュールにより配列‐特異的方式でヌクレオチドに結合するタンパク質ドメインをいう。前記ＴＡＬＥドメインは、少なくとも１個のＴＡＬＥ‐繰り返しモジュール、より具体的には１〜３０個のＴＡＬＥ‐繰り返しモジュールを含むが、これに限定されない。本発明において、「ＴＡＬエフェクタードメイン」及び「ＴＡＬＥドメイン」という用語は互換可能である。前記ＴＡＬＥドメインは、ＴＡＬＥ‐繰り返しモジュールの半分を含むことができる。前記ＴＡＬＥＮについては、国際公開特許ＷＯ／２０１２／０９３８３３号または米国公開特許２０１３‐０２１７１３１号に開示の内容全文が本明細書に参照資料として含まれる。

本発明において、用語「ＲＧＥＮ」は、標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を構成要素として含むヌクレアーゼを意味する。

本発明において、前記ＲＧＥＮは、標的ＤＮＡ特異的ガイドＲＮＡ及び分離されたＣａｓタンパク質の形態でインビトロで分離されたゲノムＤＮＡに適用可能であるが、これに制限されない。

前記ガイドＲＮＡは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）転写された（ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ）ものであってもよく、特にオリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものであってもよいが、これに制限されない。

本発明において、用語「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの主要タンパク質構成要素であって、活性化したエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）を形成することができるタンパク質である。

前記Ｃａｓタンパク質は、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ‐ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ）と複合体を形成し、その活性を示すことができる。

Ｃａｓタンパク質または遺伝子情報は、ＮＣＢＩ（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋのような公知のデータベースから得ることができる。具体的に、前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、より具体的に、溶連菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｓ）由来のＣａｓタンパク質、より具体的にはＣａｓ９タンパク質であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、より具体的に、ナイセリアメニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓタンパク質、より具体的にはＣａｓ９タンパク質であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、より具体的に、パスツレラマルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、より具体的にはＣａｓ９タンパク質であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、より具体的に、フランシセラノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａ）由来のＣａｓタンパク質、より具体的にはＣａｓ９タンパク質であってもよい。また、前記Ｃａｓタンパク質は、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属、より具体的に、カンピロバクタージェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓタンパク質、より具体的にはＣａｓ９タンパク質であってもよい。しかし、上記の例に本発明が制限されるものではない。

また、前記Ｃａｓタンパク質は、天然型タンパク質の他にも、ガイドＲＮＡと協動して活性化されたエンドヌクレアーゼまたはニッカーゼ（ｎｉｃｋａｓｅ）として作用可能な変異体を全て含む概念として本発明で用いられる。前記Ｃａｓ９タンパク質の変異体は、触媒的アスパラギン酸残基（ｃａｔａｌｙｔｉｃａｓｐａｒｔａｔｅｒｅｓｉｄｕｅ）が任意の他のアミノ酸に変更されたＣａｓ９の突然変異形態であることができる。具体的に、他のアミノ酸はアラニン（ａｌａｎｉｎｅ）であってもよいが、これに制限されない。

本発明において、前記Ｃａｓタンパク質は組換えタンパク質であってもよい。

前記用語「組換え」は、例えば、細胞、核酸、タンパク質またはベクターなどを言及しながら用いられる際に、異種（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）核酸またはタンパク質の導入または天然型（ｎａｔｉｖｅ）核酸またはタンパク質の変更、または変形された細胞に由来した細胞によって変形された細胞、核酸、タンパク質、またはベクターを示す。したがって、例えば、組換えＣａｓタンパク質は、ヒトコドン表（ｈｕｍａｎｃｏｄｏｎｔａｂｌｅ）を用いてＣａｓタンパク質を暗号化する配列を再構成することで作製することができる。

前記Ｃａｓタンパク質またはそれをコードする核酸は、Ｃａｓタンパク質が核内で作用できるようにする形態であってもよい。

前記分離されたＣａｓタンパク質は、また、細胞内に容易に導入される形態であってもよい。その例として、Ｃａｓタンパク質は、細胞浸透ペプチドまたはタンパク質導入ドメイン（ｐｒｏｔｅｉｎｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎｄｏｍａｉｎ）と連結されることができる。前記タンパク質導入ドメインは、ポリ‐アルギニンまたはＨＩＶ由来のＴＡＴタンパク質であってもよいが、これに制限されない。細胞浸透ペプチドまたはタンパク質導入ドメインは、上述の例の他にも種々のものが当業界に公知となっているため、当業者であれば、前記例に制限されずに様々な例を本発明に適用することができる。

また、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸は、核移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ、ＮＬＳ）配列をさらに含むことができる。したがって、前記Ｃａｓタンパク質をコードする核酸を含む発現カセットは、前記Ｃａｓタンパク質を発現させるためのプロモーター配列などの調節配列の他にもＮＬＳ配列を含むことができる。しかし、これに制限されない。

Ｃａｓタンパク質は、分離及び／または精製に有利なタグと連結されることができる。その例として、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｓタグなどのような小さいペプチドタグ、またはＧＳＴ（ＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅＳ‐ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）タグ、ＭＢＰ（Ｍａｌｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ）タグなどを目的に応じて連結することができるが、これに制限されない。

本発明において、用語「ガイドＲＮＡ（ｇｕｉｄｅＲＮＡ）」は、標的ＤＮＡ特異的なＲＮＡを意味し、Ｃａｓタンパク質と結合してＣａｓタンパク質を標的ＤＮＡに導くことができる。

本発明において、ガイドＲＮＡは、２つのＲＮＡ、すなわち、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ‐ａｃｔｉｖａｔｉｎｇｃｒＲＮＡ）を構成要素として含むデュアルＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）；または標的ＤＮＡ内の配列と相補的な配列を含む第１部位と、Ｃａｓタンパク質と相互作用する配列を含む第２部位と、を含む形態、より具体的に、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分が融合された形態である単鎖ガイドＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ‐ｃｈａｉｎｇｕｉｄｅＲＮＡ；ｓｇＲＮＡ）であってもよい。

前記ｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と相補的な配列を有する部分（これをＳｐａｃｅｒｒｅｇｉｏｎ、ＴａｒｇｅｔＤＮＡｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ、ｂａｓｅｐａｉｒｉｎｇｒｅｇｉｏｎなどと命名することもある）及びＣａｓタンパク質の結合のためのｈａｉｒｐｉｎ構造を含むことができる。より具体的に、標的ＤＮＡ内の配列と相補的な配列を有する部分、Ｃａｓタンパク質の結合のためのｈａｉｒｐｉｎ構造及びＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ配列を含むことができる。上述の構造は、５´から３´の順に順次に存在するものであってもよい。しかし、これに制限されるものではない。

前記ガイドＲＮＡがｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの主要部分及び標的ＤＮＡの相補的な部分を含む場合であれば、如何なる形態のガイドＲＮＡも本発明で用いられることができる。

前記ｃｒＲＮＡは、標的ＤＮＡとハイブリダイズされたものであってもよい。

ＲＧＥＮは、Ｃａｓタンパク質及びｄｕａｌＲＮＡで構成されてもよく、Ｃａｓタンパク質及びｓｇＲＮＡで構成されてもよいが、これに制限されない。

前記ガイドＲＮＡ、具体的にｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ内の配列と相補的な配列を含み、ｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡの上流部位、具体的にｓｇＲＮＡまたはｄｕａｌＲＮＡのｃｒＲＮＡの５´末端に１つ以上の追加のヌクレオチドを含むことができる。前記追加のヌクレオチドはグアニン（ｇｕａｎｉｎｅ、Ｇ）であってもよいが、これに制限されるものではない。

本発明の目的上、前記ＲＧＥＮはインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）、そしてインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でヌクレアーゼ活性を有することができる。したがって、インビトロでゲノムＤＮＡの非標的位置を検出するのに用いられることができ、これをインビボで適用した時に、前記検出された非標的位置と同一の位置でも活性を有すると予想される。

前記ゲノムＤＮＡは、非形質転換細胞または標的特異的プログラマブルヌクレアーゼがヌクレアーゼ活性を有するように形質転換された細胞から分離されたものであり、プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出しようとする目的に応じて、その由来が制限されることなく用いられることができる。

本発明において、用語「Ｃｐｆ１」は、前記ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムとは区別される新しいＣＲＩＳＰＲシステムのプログラマブルヌクレアーゼであって、Ｃｐｆ１のプログラマブルヌクレアーゼとしての役割は、最近報告された（Ｃｅｌｌ，２０１５，１６３（３）：７５９‐７１）。前記Ｃｐｆ１は単一ＲＮＡにより駆動されるプログラマブルヌクレアーゼであって、ｔｒａｃｒＲＮＡが不要であり、Ｃａｓ９に比べて相対的に大きさが小さい特徴を有する。また、チミン（ｔｈｙｍｉｎｅ）が豊かなＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列を用いてＤＮＡの二本鎖を切断し付着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅｅｎｄ）を作る。前記Ｃｐｆ１は、これに制限されるものではないが、特にカンジダタスパセイバックター（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｉｂａｃｔｅｒ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダタスメタノプラズマ（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）、またはユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属由来であってもよい。

本発明の具体的な一実施例では、ＨＢＢ遺伝子を標的としたＲＧＥＮを、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で分離されたゲノムＤＮＡに処理した結果、標的位置及び一部の非標的予想位置が切断され、インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）では、前記部位にインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）が誘導されることを確認した（図１）。しかし、全ての非標的予想位置が切断されるのではなかった。

（ｂ）ステップは、前記（ａ）ステップで切断されたＤＮＡを用いて次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）を行うステップであって、標的位置の配列と相同性を有する配列を探して非標的位置であろうと予測する間接的な方法と異なって、全体ゲノムレベルで実質的にプログラマブルヌクレアーゼにより切断される非標的位置を検出するために行うステップである。

本発明において、用語「全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）」は、次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）による全長ゲノム配列を１０Ｘ、２０Ｘ、４０Ｘの形式で様々な倍数でゲノムを読む方法を意味する。「次世代シーケンシング」は、チップ（Ｃｈｉｐ）ベース、そしてＰＣＲベースのペアエンド（ｐａｉｒｅｄｅｎｄ）形式で全長ゲノムを切り、その断片を、化学的な反応（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）に基づいてシーケンシングを超高速で行う技術を意味する。

（ｃ）ステップは、前記次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＮＧＳ）により得た塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）で、ＤＮＡが切断された位置を決定するステップであって、シーケンシングデータを分析することで、プログラマブルヌクレアーゼの標的位置及び非標的位置を簡便に検出することができる。前記塩基配列データから、ＤＮＡが切断された特定位置を決定することは様々なアプローチ法により行われることができ、本発明では、前記位置を決定するための様々な合理的な方法を提供する。しかし、これは本発明の技術的思想に含まれる例示に過ぎず、本発明の範囲がこれら方法により制限されるものではない。

例えば、前記切断された位置を決定するための一例として、全ゲノムシーケンシングにより得た塩基配列データを、分析プログラム（例えば、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣ）を用いてゲノム上の位置に応じて整列した場合、５´末端が垂直整列された位置が、ＤＮＡが切断された位置を意味することができる。換言すれば、本発明において、用語「垂直整列」とは、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣなどのプログラムで全ゲノムシーケンシングの結果を分析した際に、隣接したワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）のそれぞれに対して、２個以上の塩基配列データの５´末端がゲノム上の同一の位置（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）から始まる配列をいう。これは、プログラマブルヌクレアーゼにより切断されて同一の５´末端を有することになるＤＮＡ断片がそれぞれシーケンシングされて現われるものである。

すなわち、プログラマブルヌクレアーゼが標的位置及び非標的位置でヌクレアーゼ活性を有して前記部位を切断する場合、塩基配列データを整列すると、共通的に切断された部位は、それぞれその位置が５´末端から始まるため垂直整列されるが、切断されなかった部位には５´末端が存在しないため、整列時にスタッガード（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ）方式で配列され得る。そのため、垂直整列された位置を、プログラマブルヌクレアーゼにより切断された部位であるとみなすことができ、これは、プログラマブルヌクレアーゼの標的位置または非標的位置を意味し得る。

前記整列は、標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）に塩基配列データをマッピングした後、ゲノムで同一位置を有する塩基を各位置に応じて配列することを意味する。したがって、塩基配列データを上記のような方式で整列することができれば、如何なるコンピュータプログラムも利用可能であって、これは、当業界において公知のプログラムであってもよく、目的に応じて製作されたプログラムであってもよい。本発明の一実施例では、ＩＳＡＡＣを用いて整列を行ったが、これに制限されるものではない。

整列結果、上述のように５´末端が垂直整列された位置を探すなどの方法によって、プログラマブルヌクレアーゼによりＤＮＡが切断された位置を決定することができ、前記切断された位置が標的位置（ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）ではないと、非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）であると判断することができる。換言すれば、プログラマブルヌクレアーゼの標的位置として設計した塩基配列と同一の配列は標的位置であり、前記塩基配列と同一ではない配列は非標的位置と判断することができる。これは、上述の非標的位置の定義から自明なことである。前記非標的位置は、特に、標的位置の配列と相同性を有する配列で構成されたものであり得る。具体的には、標的位置と１個以上のヌクレオチド不一致（ｍｉｓｍａｔｃｈ）を有する配列、より具体的には、標的位置と１〜６個のヌクレオチド不一致を有するものであり得るが、これに特に制限されるものではなく、プログラマブルヌクレアーゼが切断可能な位置であれば本発明の範囲に含まれ得る。この際、前記標的位置は、ガイドＲＮＡと相補的な１５〜３０ヌクレオチド配列であってもよく、ヌクレアーゼが認識する配列（例えば、Ｃａｓ９の場合、Ｃａｓ９が認識するＰＡＭ配列）をさらに含んでもよい。

非標的位置は、５´末端が垂直整列された位置を探す方法の他にも、５´末端プロットで二重ピークパターンを示す場合、その位置が標的位置ではないと、非標的位置であると判断することができる。ゲノム内の各位置に対して、同一の塩基の５´末端を構成しているヌクレオチドの数を数えてグラフを描く場合、特定位置で二重ピークパターンが示されることになるが、前記二重ピークは、プログラマブルヌクレアーゼにより切断された二本鎖のそれぞれの鎖によって示されるものであるためである。

本発明の具体的な一実施例では、ゲノムＤＮＡをＲＧＥＮで切断してから、全体ゲノムを分析した後、それをＩＳＡＡＣを用いて整列し、切断された位置では垂直整列、切断されなかった位置ではスタッガード方式で整列されるパターンを確認した。これを５´末端プロットで示した際に、切断部位で二重ピークの独特のパターンが示されることを確認した（図２〜図４）。

さらには、これに制限されるものではないが、具体例として、ワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）に該当する塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）がそれぞれ２つ以上ずつ垂直整列される位置を非標的位置であると判断することができる。また、２０％以上の塩基配列データが垂直整列され、それぞれのワトソン鎖及びクリック鎖で同一の５´末端を有する塩基配列データの数が１０以上である位置が非標的位置、すなわち、切断される位置であると判断することができる。

本発明の具体的な一実施例では、両鎖で同一の５´末端を有する塩基配列データの数が１０以上であり、少なくとも１９％の塩基配列データが垂直整列される位置を検索した。その結果、既存に検証された標的及び非標的位置を含む１２５個の位置を検出することで、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが高度の再現性を有することを確認した（図５〜図７）。

本発明の他の具体的な一実施例では、他の標的遺伝子であるＶＥＧＦ‐Ａに対してもＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより非標的位置を検出できることを確認した（図８〜図１０）。また、他の具体的な一実施例では、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが、ＲＧＥＮでなくＺＦＮの非標的位置も検出できることを確認した（図２４）。結論的に、前記結果から、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、標的位置及びプログラマブルヌクレアーゼの種類にかかわらずプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出することができる方法であることが分かる。

前記非標的位置の検出は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でプログラマブルヌクレアーゼをゲノムＤＮＡに処理して行うことができる。したがって、前記方法により検出された非標的位置に対して、実質的にインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）でも非標的効果があるかを確認することができる。但し、これは追加的な検証過程に過ぎないため、本発明の範囲に必ずしも伴われるステップであるわけではなく、必要に応じて追加的に行われるステップに過ぎない。本発明において、用語「非標的効果（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔ）」は、非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）とは区別される概念である。すなわち、上述のように、本発明において非標的位置という概念は、プログラマブルヌクレアーゼが働くことができる位置のうち標的位置ではない位置を意味するものであって、ヌクレアーゼにより切断される位置を意味するが、非標的効果は、細胞内の非標的位置でプログラマブルヌクレアーゼによりインデル（Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ）が発生する効果を意味する。本発明において、用語「インデル」は、ＤＮＡの塩基配列において一部の塩基が中間に挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）または欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）された変異を通称するものである。また、プログラマブルヌクレアーゼによって前記インデルが発生した非標的位置を、非標的インデル位置と言う。結論的に、本発明の非標的位置は、非標的インデル位置を含む概念であり、プログラマブルヌクレアーゼが活性を有することができる可能性のある位置であればよく、必ずしもプログラマブルヌクレアーゼによるインデルが確認されなければならないのではない。一方、本発明における非標的位置は非標的候補位置（ｃａｎｄｉｄａｔｅｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）であって、非標的インデル位置は、検証された非標的位置（ｖａｌｉｄａｔｅｄｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）とも命名される。

具体的に、前記検証過程は、これに制限されるものではないが、前記非標的位置に対するプログラマブルヌクレアーゼが発現された細胞からゲノムＤＮＡを分離し、前記ＤＮＡの非標的位置でインデルを確認することで、非標的位置での非標的効果を確認することであることができる。これは、Ｔ７Ｅ１分析、Ｃｅｌ‐Ｉ酵素を用いた突然変異検出分析または標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）などの当業界に公知のインデル確認方法を行うことで、非標的効果を確認することであることができる。前記非標的効果を確認するステップは、非標的位置でインデルが発生したかを直接的に確認することであることができる。但し、このようなインビボ検証過程でインデルが発生しなかったとしても、これは検出可能なレベル以下の頻度でインデルが発生した場合まで確認したわけではないため、あくまでも補助的な手段としてみなすべきである。

上述のように、垂直整列された位置を確認するか、または５´末端プロットで二重ピークを確認するだけでも、非標的位置を十分に検出することができ、これは高度の再現性を有する。しかし、不均一な切断パターンまたは低いシーケンシング深さ（ｄｅｐｔｈ）を有する一部位置が漏れる恐れがあるという問題がある。そこで、本発明者らは、塩基配列データの整列パターンに基づいて、各ヌクレオチドの位置にＤＮＡ切断点数を算出する数式を開発（図１１）し、これは次のとおりである：

前記数式により、既存のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっては検出されなかった多数の追加的な位置を検出することができ、これにより、偽陽性位置を簡単にフィルタリングすることができる。前記数式においてＣ値は、当業者が任意の定数を適用できるものであって、本発明の実施例によって制限されるものではない。特に、これに制限されるものではないが、例えば、Ｃ値を１００として前記算出された点数が２５，０００点以上である場合、非標的位置であると判断することができる。但し、前記点数の基準は、目的に応じて当業者が適宜調整および変更することができる。

本発明の具体的な一実施例では、既存のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ方式に前記ＤＮＡ切断点数を導入して非標的位置を検出しており、その結果、単純に垂直整列位置を探す方式に比べて追加的な位置を検出することができ、これは高度の再現性を有することを確認した（図１２及び図１３）。本発明の他の具体的な一実施例では、ＲＧＥＮのｓｇＲＮＡにおいて、プラスミド鋳型から転写されたものとオリゴヌクレオチド二本鎖から転写されたものとを比較し、プラスミド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡを使用した場合に、検出された非標的位置が標的位置とさらに高度の相同性を有することを確認した（図１４、表１及び表２）。

さらに、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは複数のプログラマブルヌクレアーゼを用いて行ってもよく、本発明者らはこれを「複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ」と命名した。この場合、前記プログラマブルヌクレアーゼは、２個以上、具体的には２〜１００個の標的に対するプログラマブルヌクレアーゼを混合したものであってもよいが、これに制限されるものではない。

前記複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの場合、それぞれのプログラマブルヌクレアーゼによってゲノムＤＮＡが切断されるため、切断位置がどのプログラマブルヌクレアーゼによって切断されたかを確認することが重要である。これは、標的位置との編集距離（ｅｄｉｔｄｉｓｔａｎｃｅ）に応じて非標的位置を分類することで行うことができ、非標的位置の塩基配列が標的位置と相同性を有するということを前提とする。これにより、それぞれのプログラマブルヌクレアーゼに対する標的及び非標的位置が明確に区分されることができる。

本発明の具体的な一実施例では、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑに１１個のそれぞれ異なる標的位置に対するｓｇＲＮＡを用いた複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行っており、確認された９６４個の位置を標的位置との編集距離（ｅｄｉｔｄｉｓｔａｎｃｅ）に応じて分類し、それぞれの標的位置に対する非標的位置を確認した（図１５〜図１９）。

他の具体的な一実施例では、１００個のそれぞれ異なる標的位置に対するｓｇＲＮＡを用いて複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行っており、この場合にも、特に制限されずに非標的位置を確認することができた（図２３）。これにより、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、標的位置の数にかかわらず適用可能であることを確認した。

本発明の具体的な一実施例では、特定位置を標的とするＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）において、全体ゲノムでＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出された非標的位置のうち標的位置とのヌクレオチド不一致が６個以下である相同性位置が１３，０００個以下であり、ヌクレオチド不一致が２個以下である相同性位置を有しない場合、前記特定位置をＲＧＥＮの標的位置として選別することが、非標的効果を最小化することができることを確認した。これは、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを用いて標的位置を選別する好ましい基準を確立していく過程を示す一例であって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりプログラマブルヌクレアーゼの非標的効果を最小化できると期待される。

本発明の他の具体的な一実施例では、標的位置の配列と相同性を有する位置の数は、ヌクレオチド不一致のレベルが増加するほど、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによって少ない比率で検出されることを確認した（図１６）。

これは、ＲＧＥＮの標的位置を選別するにおいて、標的配列とゲノム内で相同性を有するヌクレオチド配列が少ないほど、特に、高度の相同性を有するヌクレオチド配列が少ないほど、相対的にさらに特異的であるためである。これにより選別されたＲＧＥＮの標的位置は、非標的効果が最小化したものであることができる。

また、他の様態として、本発明は、プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）を鋳型としてインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）転写されたガイドＲＮＡを細胞に導入するステップを含む、ゲノム編集において非標的効果を低減する方法を提供する。

前記非標的効果の低減は、プラスミドを鋳型として用いる際に、バルジ型（ｂｕｌｇｅ‐ｔｙｐｅ）の非標的位置にインデルが発生することを防ぐことによると判断される。すなわち、ガイドＲＮＡをインビトロ転写過程により製造する場合、オリゴヌクレオチド二本鎖を鋳型として用いると、バルジ型非標的位置が多く検出されるが、プラスミド鋳型を用いると、殆どのバルジ型非標的位置がなくなる。そのため、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにおいてだけでなく、ＲＧＥＮを用いてゲノムＤＮＡを切断してインデルを誘導する際にも、オリゴヌクレオチド二本鎖に代えてプラスミドを鋳型とすることで、非標的効果を低減することができる。これは、オリゴヌクレオチドに（ｎ‐１）ｍｅｒと呼ばれるｆａｉｌｅｄｓｅｑｕｅｎｃｅが含まれているためであると判断される。

以下、本発明を実施例を挙げてさらに詳細に説明する。しかし、これら実施例は、本発明を例示的に説明するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものではない。

実施例１：Ｃａｓ９及びインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）ｓｇＲＮＡ
組換えＣａｓ９タンパク質は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から精製するか、またはＴｏｏｌｇｅｎ（ＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ）から購入した。ｓｇＲＮＡは、Ｔ７ＲＮＡ重合酵素を用いてインビトロ転写により合成した。具体的に、ｓｇＲＮＡ鋳型を反応緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、６ｍＭのＭｇＣｌ_２、１０ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのｓｐｅｒｍｉｄｉｎｅ、ＮＴＰ、及びＲＮａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）でＴ７ＲＮＡ重合酵素とともに３７℃で８時間反応させた。転写されたｓｇＲＮＡから鋳型ＤＮＡを除去するために、ＤＮａｓｅＩとともにインキュベーションした後、ＰＣＲｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｋｉｔ（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）を用いて精製した。

実施例２：細胞培養及び形質転換条件
ＨｅＬａ細胞は、１０％のＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養した。ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ｃａｓ９発現プラスミド（５００ｎｇ）及びｓｇＲＮＡをコードするプラスミド（５００ｎｇ）を８ｘ１０^４個のＨｅＬａ細胞に導入した。４８時間後、製造社の指針に従ってＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でゲノムＤＮＡを分離した。

実施例３：ゲノムＤＮＡのインビトロ切断
ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、ＨＡＰ１細胞からゲノムＤＮＡを精製した。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑのために、ゲノムＤＮＡのインビトロ切断を行った。具体的に、ＲＮＰ（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）を形成するために、常温で１０分間Ｃａｓ９タンパク質及びｓｇＲＮＡをインキュベーションした。次に、前記ＲＮＰ複合体とゲノムＤＮＡを、反応緩衝液（１００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ‐ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、及び１００μｇ／ｍｌのＢＳＡ）で３７℃で８時間反応させた。ｓｇＲＮＡを分解するために、前記過程で切断されたゲノムＤＮＡにＲＮａｓｅＡ（５０ｕｇ／ｍＬ）を処理し、ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）でさらに精製した。

実施例４：全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）及びＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ（ｄｉｇｅｓｔｅｄｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）のために、切断されたＤＮＡをソニケータ（ｓｏｎｉｃａｔｏｒ）で破砕し、ライブラリを作るためにアダプタ（ａｄａｐｔｏｒ）とライゲーション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）した。前記ライブラリを用いて、Ｍａｃｒｏｇｅｎ（ＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ）でＩｌｌｕｍｉｎａＨｉＳｅｑＸＴｅｎＳｅｑｕｅｎｃｅｒを用いてＷＧＳを行った。次に、ヒト標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）ｈｇ１９に対して配列ファイルを整列するためにＩｓａａｃを用いた。切断点数付与システムを用いてＤＮＡ切断位置を確認した。

複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの場合、検出位置結果を編集距離（ｅｄｉｔｄｉｓｔａｎｃｅ）に応じて１１個のグループに分類した。前記インビトロＲＧＥＮ切断位置を検出するのに用いられたコンピュータプログラム及びＤｉｇｅｎｏｍｅ検出位置の分類に用いられたコンピュータプログラムは、別に製作した。

実施例５：標的化ディープシーケンシング（ｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）
Ｐｈｕｓｉｏｎ重合酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄｂｉｏｌａｂｓ）を用いて標的位置及び潜在的非標的位置を増幅した。ＮａＯＨでＰＣＲ増幅産物を変性させ、ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑを用いてペアエンド（ｐａｉｒｅｄ‐ｅｎｄ）シーケンシングを行った後、インデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）頻度を計算した。

実験例１：インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でＲＧＥＮを用いたゲノムＤＮＡの切断
プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出することができる方法を開発するために、本発明者らは、代表的にＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）を用いて実験を行った。但し、これは本発明の技術を説明するための一実施例に過ぎず、適用可能なプログラマブルヌクレアーゼの種類がＲＧＥＮに限定されるものではない。本発明のゲノムでプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法は、インビトロでゲノムを特定標的のためのプログラマブルヌクレアーゼで切断した後、全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）を行い、それを分析することで前記プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法であって、本発明者らはこれをＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ（ｎｕｃｌｅａｓｅ‐ｄｉｇｅｓｔｅｄｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と命名した。

本発明者らは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより、大規模細胞集団でプログラマブルヌクレアーゼにより誘導された非標的位置を確認することができると思った。

インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で高濃度のＲＧＥＮをゲノムに処理して非標的ＤＮＡ配列を効果的に切断することができ、これにより、５´末端が同一である多数のＤＮＡ断片を生産した。前記ＲＧＥＮで切断されたＤＮＡ断片は、ヌクレアーゼ切断位置が垂直整列された塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）が生成された。これに対し、ＲＧＥＮで切断されなかった塩基配列データは、スタッガード方式（ｓｔａｇｇｅｒｅｄｍａｎｎｅｒ）で整列された。非標的位置に対応する垂直整列を有する塩基配列データを探すために、コンピュータプログラムを開発した。

先ず、本発明者らは、インビトロゲノムでＲＧＥＮが潜在的非標的ＤＮＡ配列を効果的に切断できるかを確認した。そのために、ＲＧＥＮの標的位置と高度の相同性を有する位置（ＯＴ１位置と命名）で非標的突然変異を誘導できるＨＢＢ遺伝子‐特異的ＲＧＥＮを選択した。前記位置に加えて、前記ＲＧＥＮの標的位置と３個のヌクレオチドが異なる３種類の他の潜在的非標的位置（ＯＴ３、ＯＴ７及びＯＴ１２位置と命名）も分析した。

０．０３ｎＭ〜３００ｎＭ範囲の濃度のＨＢＢ特異的ｓｇＲＮＡとともに予めインキュベーションしたＣａｓ９タンパク質を用いて、野生型ＨＡＰ１細胞から分離されたゲノムＤＮＡを切断した（図１ａ）。次に、前記位置でＤＮＡ切断を確認するために、定量的ＰＣＲを用いた。ＨＢＢ標的位置及びＯＴ１位置の何れも、非常に低いＲＧＥＮ濃度でも略完全に切断された（図１ｂ）。これに対し、ＯＴ３位置では高濃度のＲＧＥＮでのみ完全に切断され、残りのＯＴ７及びＯＴ１２位置では最高濃度でも殆ど切断されなかった。

次に、ＨＡＰ１細胞に前記ＲＧＥＮを形質転換させた後、前記位置で誘導されたインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を検出するために、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７Ｅ１）及び標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を用いた。

Ｔ７Ｅ１分析のために、製造社の指針に従って、ＤＮｅａｓｙＴｉｓｓｕｅｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを分離し、標的位置をＰＣＲで増幅させた。次に、増幅されたＰＣＲ産物をサーモサイクラ（ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を用いて熱で変性させ、ゆっくりと冷却させた。冷却した産物を３７℃で２０分間Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（ＴｏｏｌＧｅｎ）とインキュベーションし、アガロースゲル電気泳動によりサイズ別に分離した。

標的化ディープシーケンシングのために、標的位置または非標的位置を包括するゲノムＤＮＡ断片をＰｈｕｓｉｏｎ重合酵素（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄｂｉｏｌａｂｓ）を用いて増幅した。ＩｌｌｕｍｉｎａＭｉＳｅｑを用いてＰＣＲ増幅産物をペアエンド（ｐａｉｒｅｄ‐ｅｎｄ）シーケンシングした。

結果を解釈するにあたり、ＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列において３‐ｂｐ上流に位置したインデルは、ＲＧＥＮにより誘導された突然変異として見なした。期待したとおり、ＨＢＢＲＧＥＮはＨＢＢ標的及びＯＴ１非標的位置で高い活性を示し、それぞれ７１％及び５５％の頻度（Ｔ７Ｅ１）でインデルが発生した（図１ｃ）。ＯＴ３位置では、３．２％（Ｔ７Ｅ１）または４．３％（ディープシーケンシング）の頻度で非標的インデルが誘導された（図１ｃ及び図１ｄ）。一方、インビトロで殆ど切断されなかった他の２つの潜在的非標的位置では、Ｔ７Ｅ１（検出制限、〜１％）及びディープシーケンシング（検出制限、〜０．１％）によりインデルが検出されなかった。ＯＴ７位置では、シード部位（ｓｅｅｄｒｅｇｉｏｎ、ＰＡＭ配列の１０‐〜１２‐ｎｔ上流）でヌクレオチド不一致がなかったが、インビトロまたは細胞内で切断が起こらず、このようなことから、ＰＡＭ‐遠位部位（ｄｉｓｔａｌｒｅｇｉｏｎ）の重要性が分かった。

前記結果は、ＲＧＥＮがインビトロで非標的ＤＮＡ配列を切断することができるが、細胞内では同一の位置にインデルを誘導できないことがあるという既存結果とも一致する。したがって、ＲＧＥＮは、細胞内でより、インビトロで標的特異性がさらに低下する。これは、細胞内ＲＧＥＮにより起こる殆どのＤＮＡ二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅｓｔｒａｎｄｂｒｅａｋ、ＤＳＢ）がＮＨＥＪ（ｎｏｎ‐ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｅｎｄ‐ｊｏｉｎｉｎｇ）またはＨＲ（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）に修正されるためであると判断される。

実験例２：塩基配列データの分析
インビトロでＲＧＥＮを用いてゲノムＤＮＡを切断した場合、切断位置で垂直整列された塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）を作ることができるかを確認するために、４種類のゲノムＤＮＡセットを用いて全ゲノムシーケンシング（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ、ＷＧＳ）を行った。

ＲＧＥＮ形質転換または非形質転換（ｍｏｃｋ‐ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）ＨＰＡ１細胞から分離したゲノムＤＮＡを、３００ｎＭのＣａｓ９とＨＢＢ遺伝子を標的する９００ｎＭのｓｇＲＮＡでインビトロで完全に切断した。これとともに、前記細胞から分離されたゲノムＤＮＡを用いて、インビトロＲＧＥＮ切断なしにＷＧＳを行った（図２ａ）。標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）に塩基配列データをマッピングした後、標的位置及び４個の相同性位置で配列パターンを観察するためにＩＧＶ（ｉｎｔｅｒｇｒａｔｉｖｅｇｅｎｏｍｉｃｓｖｉｅｗｅｒ）を用いた。

先ず、対照群ＨＡＰ１細胞から分離されたＤｉｇｅｎｏｍｅ（ｄｉｇｅｓｔｅｄｇｅｎｏｍｅ）を調べた時に、標的位置、ＯＴ１及びＯＴ３位置で垂直整列の一般的ではないパターンが観察され（図２ｂ、３ａ及び３ｂ）、切断位置を包括する塩基配列データは殆ど示されなかった。これに対して、ＲＧＥＮを処理していない完全なゲノムでは、前記位置で垂直整列が観察されなかった。ＯＴ７及びＯＴ１２位置では、殆どの塩基配列データが潜在的切断位置（ＰＡＭ配列で３‐ｂｐ上流）を包括しており、結果としてスタッガード整列が示された（図３ｃ及び３ｄ）。

次に、ＲＧＥＮによって形質転換した細胞から分離されたＤｉｇｅｎｏｍｅと、それに対応する完全なゲノムとを比較した。５個の全ての位置で、完全なゲノムは一般的なパターンのスタッガード整列を示した（図２ｂ及び図３）。これに対して、標的位置及びＯＴ‐１位置で、Ｄｉｇｅｎｏｍｅは垂直整列及びスタッガード整列の両方のパターンを示した。前記２個の位置で、スタッガード整列に対応する略全ての塩基配列データはインデルを含んでいた（図２ｂ、３ａ及び３ｂ）。すなわち、ＲＧＥＮは、それらにより誘導されるインデル配列を切断することができなかった。一方、Ｔ７Ｅ１及びディープシーケンシングの結果と類似に、ＯＴ７及びＯＴ１２で切断位置を包括する塩基配列データではインデルが発見されなかった。ＯＴ３位置では、Ｄｉｇｅｎｏｍｅが少数の切断位置を包括する塩基配列データを有し、全体的にはストレート整列パターンを示した。特に、一塩基配列データではＲＧＥＮにより誘導されたインデルが確認された（図３ｂ）。

前記結果は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが極少数の非標的突然変異を確認するに十分な程度の敏感性を有し、塩基配列データが垂直整列されたパターンが、インビトロでＲＧＥＮ切断の独特の特徴であるということを示唆する。

実験例３：単一ヌクレオチドレベルで５´末端プロット
ゲノムレベルで潜在的ＲＧＥＮ非標的位置を確認するために、塩基配列データの垂直整列を探すためのコンピュータプログラムを開発した。先ず、単一ヌクレオチドレベルで、ＨＢＢの標的位置及び検証された２個の非標的位置（ＯＴ１及びＯＴ３）の付近のヌクレオチド位置から始まる５´末端を有する塩基配列データの数を表示した（図４ａ）。ワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）及びクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）の両方が配列分析されたため、それぞれの鎖に対応する略同一の数の塩基配列データが切断位置で互いにすぐ横で観察され、二重ピークが生成されると推測した。予測したとおり、Ｄｉｇｅｎｏｍｅは前記３個の切断位置（標的位置、ＯＴ１及びＯＴ３）で二重ピークを生成した（図２ｃ、４ｂ及び４ｃ）。インビトロでＲＧＥＮを処理していない完全なゲノムは、前記位置で二重ピークパターンを生成しなかった。

次に、上記のようなアプローチ方式を、全体ＲＧＥＮ形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅ、非形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅ、完全なＲＧＥＮ形質転換ゲノム及び完全な非形質転換ゲノムに適用した。先ず、ｓｇＲＮＡのない条件、またはＲＧＥＮ濃度が１００倍低い条件（３ｎＭのＣａｓ９）で、インビトロで非形質転換ゲノムＤＮＡにＣａｓ９タンパク質を処理し、ＷＧＳ及びＤｉｇｅｎｏｍｅ分析を行った。両鎖で同一の５´末端を有する塩基配列データの数が１０以上であり、少なくとも１９％の塩基配列データが垂直整列される位置を検索した。標的位置及び２個の検証された非標的位置を含んで、非形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅに３ｎＭのＲＧＥＮを処理した場合には１７個、３００ｎＭのＲＧＥＮを処理した場合には７８個の位置を確認した（図５ａ）。これらは、５´末端プロットで二重ピークパターンを示し、ＩＧＶイメージで垂直整列を示した。前記位置のうち、３ｎＭのＲＧＥＮを処理したＤｉｇｅｎｏｍｅで１個、３００ｎＭのＲＧＥＮを処理したＤｉｇｅｎｏｍｅで２個の位置は、自然的に発生するインデルの結果として示される偽陽性である。また、ＲＧＥＮ形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅでは、検証された３個の標的及び非標的位置を含んで総１２５個の位置で前記パターンが観察された。一方、前記３個のＤｉｇｅｎｏｍｅで検証されなかったＯＴ７及びＯＴ１２位置では、二重ピークパターンが示されなかった。さらに、前記３つのＤｉｇｅｎｏｍｅで殆どの位置が共通的に確認されたが、これは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが高度の再現性を有することを示唆する。

具体的に、非形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅ（３ｎＭのＲＧＥＮ）で発見された１６個のうち１５個（９４％）の候補位置（１個の偽陽性を除く）は、他の２つのＤｉｇｅｎｏｍｅでも確認された。また、非形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅ（３００ｎＭ）で発見された７６個のうち７４個（９７％）の候補位置が、ＲＧＥＮ形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅでも発見された（図５ａ）。ＲＧＥＮ形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅで検証された３個の切断位置を除き、残りの１２２個の位置では、ＲＧＥＮ形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅでインデルが示されなかった。これは、前記候補位置では突然変異が殆ど起こらないことを示唆する。一方、完全なゲノムで２個の位置、完全なＲＧＥＮ形質転換ゲノムで３個の位置、そしてＣａｓ９（３００ｎＭ）単独処理非形質転換ゲノムで１個の位置で二重ピークパターンが観察されたが、前記３個の完全なゲノムで確認された全ての位置は、標準塩基配列に対するＨＡＰ１ゲノムで自然的に起こるインデルの結果として示された偽陽性である（図６ａ〜６ｃ）。したがって、二重ピークパターンまたは塩基配列データの垂直整列は、Ｄｉｇｅｎｏｍｅで発見される独特の特徴であると考えられる。

次に、２０‐ｂｐ標的位置配列とＲＧＥＮ形質転換及び非形質転換Ｄｉｇｅｎｏｍｅで確認された７４個の共通的な位置のＤＮＡ配列を比較した結果、２０個のヌクレオチドの５´末端で、１個を除いた全ての塩基が保存されていることを確認した（図５ｂ）。さらに、標的配列ではない他の７４個の位置でＤＮＡ配列を比較して得た配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）またはデノボモチーフ（ｄｅｎｏｖｏｍｏｔｉｆ）は、５´末端の最初の２個のヌクレオチドを除き、全ての位置で標的配列と完全に付合した（図５ｃ）。また、二重ピーク位置のうち７０個（９５％）は、切断予想位置から正確に３ヌクレオチドの下流に５´‐ＮＧＧ‐３´ ＰＡＭ配列を有していた。たった６．２５％（＝１／１６）の位置で偶然にＰＡＭが示されたと予想される。２個の位置は５´‐ＮＡＧ‐３´ＰＡＭを含む。ある位置は、ＤＮＡまたはＲＮＡバルジ（ｂｕｌｇｅ）または一般的ではないＰＡＭである５´‐ＮＧＡ‐３´形態で標的位置に付合した。５´‐ＮＧＡ‐３´が細胞でＰＡＭとして作用できるか否かは不明であるが、本発明の強いインビトロ切断条件でＲＧＥＮが前記位置を切断したと判断される。他の位置は標的配列と配列相同性を有していなかったが、これは、その位置が偽陽性であることを示唆する。

また、相同性位置でヌクレオチド不一致が少ないほど、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出される可能性が高いということを確認した。すなわち、標的位置に比べて３ヌクレオチドが異なる相同性位置１５個のうち７個（４７％）及び４ヌクレオチドが異なる相同性位置１４２個のうち１４個（１０％）がＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出された。また、５ヌクレオチドが異なる１，１９１位置のうち１５個（１．２％）、６ヌクレオチドが異なる７，８９６位置のうち１個（０．０１３％）が検出された（図５ｄ）。

まとめると、前記結果は、二重ピークパターンの殆どがインビトロでＲＧＥＮ切断によって引き起こされ、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによりゲノムレベルでヌクレアーゼ切断位置を探すことができることを示唆する。

実験例４：ディープシーケンシングにより候補位置で非標的効果（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｅｆｆｅｃｔ）を確認
前記２つのＤｉｇｅｎｏｍｅで確認された７４個の共通位置で、非標的効果を立証するためにディープシーケンシングを行った（図５ｅ）。さらに、標的位置と３ヌクレオチドが異なって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出されなかったその他の８個の位置も試験した。前記８個の位置では、少なくとも０．１％の頻度で非標的インデルが検出されなかった。これは、陰性対照群より大きい値である（Ｆｉｓｈｅｒｅｘａｃｔｔｅｓｔ、ｐ＜０．０１）（図５ｄ）。インデルは、０．１１％〜８７％の頻度で７４個の位置のうち既に検証された標的位置、ＯＴ１及びＯＴ３位置を含む総５個の位置で観察された（図５ｅ、７ａ及び７ｂ）。新しく検証された他の２個の非標的位置のうち、ＨＢＢ＿４８では０．１１％の頻度で、ＨＢＢ＿７５では２．２％の頻度でインデルが検出された。前記２つの位置は、標的位置と３ヌクレオチドが異なった。標的位置と５´末端で１個のヌクレオチドが異なる２０‐ｎｔｓｇＲＮＡ配列に比べて、ＨＢＢ＿４８位置は３個のヌクレオチド、ＨＢＢ＿７５位置では２個のヌクレオチドが一致しなかった。２０‐ｎｔｓｇＲＮＡ配列に比べて、前記検証された非標的位置はＤＮＡまたはＲＮＡバルジを有しておらず、５´‐ＮＧＡ‐３´または５´‐ＮＡＧ‐３´のように一般的ではないＰＡＭ配列も有していなかった。前記２個の新しい非標的位置及びその他の３個の位置がそれぞれの３つのＤｉｇｅｎｏｍｅで共通的に確認された。前記結果から、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが、ゲノムレベルのヌクレアーゼ非標的効果を確認することができる、敏感で再現可能な方法であることが分かる。

実験例５：ＶＥＧＦ‐Ａ特異的ＲＧＥＮに対するＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ
次に、本発明者らは、ＨＢＢ遺伝子以外に他の遺伝子でもＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが適用可能であるかを確認しようとした。ＶＥＧＦ‐Ａ位置で標的突然変異を引き起こし、追加的に４個の相同性位置で非標的突然変異を引き起こす他のＲＧＥＮに対するＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った。標的位置及び既に検証された４個の非標的位置を含む総８１個の位置で二重ピークパターンを確認した（図８ａ及び図９）。前記８１個の位置で、全てのＤＮＡ配列が一般的な５´‐ＮＧＧ‐３´ＰＡＭ配列を含むことを確認した。標的配列と前記配列を比較して、全てのヌクレオチド位置が一致することを確認した。さらに、デノボモチーフを得るために前記配列を互いに比較した。その結果、配列ロゴも略全てのヌクレオチド位置で標的配列と一致したが、これは、２０‐ｎｔｓｇＲＮＡ配列で全てのヌクレオチドがＲＧＥＮの特異性に寄与することを示唆する（図８ｂ及び８ｃ）。

次に、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された８１個の位置、及びＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっては確認されなかったが、標的位置と３個以下のヌクレオチドが異なる２８個の位置で、標的及び非標的効果を確認するために標的化ディープシーケンシングを用いた。前記ＲＧＥＮはＨＡＰ１細胞で非常に活性化され、標的位置で８７％の頻度、既に検証された４個の非標的位置で０．３２％〜７９％の頻度でインデルが発生した。また、０．０６５±０．０２１％〜６．４±１．２％の頻度でインデルが誘導された４個の非標的位置を追加的に確認した（図８ｅ及び図１０）。ＲＧＥＮを用いて得た前記位置でのインデル頻度は、空ベクター対照群を用いた場合に比べて非常に増加した（Ｆｉｓｈｅｒｅｘａｃｔｔｅｓｔ、ｐ＜０．０１）。前記非標的位置は、２０‐ｎｔ標的配列と１〜６ヌクレオチドが一致せず、ＰＡＭ近位シード部位（ｐｒｏｘｉｍａｌｓｅｅｄｒｅｇｉｏｎ）で少なくとも１つの不一致を含む。ヒトゲノムで６‐ｎｔ不一致を有する位置は１３，８９２個であるが、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置はたった６個であり（０．０４３％）、これらのうちディープシーケンシングにより検証された位置はたった１個である（図８ｄ及び８ｅ）。現在まで、標的位置と６個のヌクレオチド不一致を有するＲＧＥＮ非標的位置は報告されていない。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された８１個のうち４０個の位置が２０‐ｎｔ標的配列と比較してヌクレオチドが欠失されているかまたは追加的なヌクレオチドを含むが、ＤＮＡまたはＲＮＡバルジを含む非標的位置は存在しなかった。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認されなかった全ての位置で、ＲＧＥＮにより得たインデル頻度は０．０５％以下であるか、空ベクター対照群を用いて得たものより低いかまたは統計的に差がなかった。

前記実験例１〜５から、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出するにおいて非常に高度の再現性を有する方法であることが分かった。

実験例６：向上したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ
先ず、本発明者らは、ヒトゲノムに対するＷＧＳ（ｗｈｏｌｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）データを用いてインビトロ切断位置を確認することができる点数付与システムを開発した。前記実験例１〜５で確認したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析は、高度の再現性を有するが、不均一な切断パターンまたは低いシーケンシング深さ（ｄｅｐｔｈ）を有する一部位置が漏れる恐れがあるという問題がある。本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質が鈍端に１つまたは２つのヌクレオチドオーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を生成する場合を推正することで、前記位置を確認することができるということを見出した。そこで、塩基配列データの整列パターンに基づいて、各ヌクレオチド位置にＤＮＡ切断点数を付与した（図１１）。前記プログラムを用いて、既存のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっては検出されなかった多数の追加的な位置を検出した。切断点数のゲノムレベルプロット（ｐｌｏｔ）は、切断されなかったゲノムＤＮＡで偽陽性位置が殆ど発見されないということを示す（図１２ａ）。全体ゲノムで確認された少数の偽陽性位置はゲノムＤＮＡで自然的に発生するインデル（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｎｄｄｅｌｅｔｉｏｎ、Ｉｎｄｅｌ）を含むが、これは容易にフィルタリングすることができる。２つの独立したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析で見られるように、ヒトゲノムに対する切断点数は高度の再現性を有する（Ｒ^２＝０．８９）（図１３）。

本発明者らは、また、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ分析でプラスミド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡは、オリゴヌクレオチド二本鎖を用いて転写されたものから検出される、標的位置でヌクレオチドが欠損された如何なる偽陽性のバルジ型（ｂｕｌｇｅ‐ｔｙｐｅ）非標的位置も切断しないことを確認した（図１２ｂ及び図１４）。これは、オリゴヌクレオチド二本鎖から転写されたｓｇＲＮＡは、合成に失敗したオリゴヌクレオチドから転写された不完全な分子を含んで、均一成分ではないためであると判断される。結果的に、プラスミド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡを用いて確認された切断位置は、オリゴヌクレオチド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡを用いて確認した場合より、標的位置とさらに高度の相同性を有し（表１及び表２）、これは、切断位置周辺のＤＮＡ配列を互いに比較して得た配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）で確認することができる（図１２ｃ）。

したがって、本発明の切断点数付与システムを用いることで偽陰性位置の数を非常に減少させることができ、プラスミド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡを用いて偽陽性位置の数を非常に減少させることができる。

実験例７：複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ
他の方法とは異なって、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、ヌクレアーゼの数に比例してシーケンシング深さを増加させることなく複合的に用いられることができる。本発明者らは、ＩＤＬＶ検出及びその他の方法に比べてより敏感性を有するＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑを用いて個別的に分析された１０個のｓｇＲＮＡを選定した。本発明者らは、Ｃａｓ９タンパク質、１０個のｓｇＲＮＡ、及びＨＢＢ遺伝子を標的とする１つの追加的なｓｇＲＮＡの混合物でヒトゲノムＤＮＡを切断し、２つの独立したＷＧＳ分析を行った（図１５ａ）。次に、前記点数付与システムを用いて、ゲノムレベルでインビトロ切断位置を叩いた。その結果、ヒトゲノムで総９６４個の位置を確認した（表３〜表１２）。次に、前記位置を標的位置との編集距離（ｅｄｉｔｄｉｓｔａｎｃｅ）に応じて分類した（図１５ａ及び表３〜表１２）。

ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ及び他の方法は、標的位置との相同性が不十分な９０％程度の検出位置を除去するフィルタリングステップが要求されるが、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、位置をフィルタリングすることなく編集距離に基づいて整列することができる。前記９６４個の位置は、１１個のグループに明確に区分された。さらに、インビトロ切断位置に対する各１１個のグループは、１１個の標的配列のうち１つと高度の相同性を有する。したがって、各グループ内で配列を比較して得たデノボモチーフ（ｄｅｎｏｖｏｍｏｔｉｆ）または配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）は、略全てのヌクレオチド位置で標的配列と付合した（図１５ａ）。前記結果は、Ｃａｓ９により認識されるＰＡＭ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ‐ａｄｊａｃｅｎｔｍｏｔｉｆ）配列及びＰＡＭ‐近位（ｐｒｏｘｉｍａｌ）１０‐ｎｔ「シード（ｓｅｅｄ）」部位ほどではないが、２３‐ｎｔ標的配列で５´‐末端の１０‐ｎｔ部位がＲＧＥＮの特異性に寄与することを意味する。さらに、前記１１ＲＧＥＮで切断される９６４個の位置のうち１個を除いた全ての位置が、５´‐ＮＧＧ‐３´のＰＡＭ配列または５´‐ＮＮＧ‐３´／５´‐ＮＧＮ‐３´のＰＡＭ類似配列を有することを確認した。したがって、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、相同性配列に対するプログラム検索を行わなくても、インビトロ切断位置を正確に探すことができて簡便であり、複数のプログラマブルヌクレアーゼに適用可能であるという点で、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ及びＨＴＧＴＳなどの既存に公知の他の方法に比べて多くの利点を有する。

次に、各ｓｇＲＮＡが標的及び非標的位置を切断することができるかを確認した。ＨＢＢ‐特異的ｓｇＲＮＡを高濃度（９００ｎＭ）でＣａｓ９（３００ｎＭ）とともに処理した時に、切断された３０個の位置のうち１７個の位置（＝５７％）では、同一のｓｇＲＮＡを低濃度（８２ｎＭ）で用いて複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った場合にも検出された（図１５ｂ及び１６ｃ）。前記結果は、１１個のｓｇＲＮＡそれぞれが互いに独立して自分の標的及び非標的位置にＣａｓ９を導くことができることを示唆し、これにより、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが複合性を有することが分かる。

実験例８：インビトロ切断位置
前記１１個のｓｇＲＮＡは、ゲノムレベルで広範囲の特異性を示した。ヒトゲノムで、ｓｇＲＮＡ１つ当りの切断位置の数は１３〜３０２個であることが確認された（図１６ａ及び表３〜表１２）。期待したとおり、Ｃａｓ‐ＯＦＦｉｎｄｅｒを用いてヒトゲノムで確認された標的位置の全て、そして前記それぞれの標的位置と１または２個のヌクレオチド不一致を有する位置の殆どが、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った時に検出された（図１６ｂ）。しかし、３個以上のヌクレオチド不一致を有する位置は殆ど検出されなかった。すなわち、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出された位置の比率は、ヌクレオチド不一致の数が３から６に増加するにつれて幾何級数的に減少した（図１６ｂ）。また、シード部位（ｓｅｅｄｒｅｇｉｏｎ）で２個以上のヌクレオチド不一致を有する位置は、０または１個の不一致を有する位置よりもインビトロで切断されなかった（Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓｔ‐ｔｅｓｔ）。

一方、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出された位置の数及びヒトゲノムで６個以下のヌクレオチド不一致を有する相同性位置（「ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙ」と定義される）の数が、非常に相関関係（Ｒ^２＝０．９３）を有することを確認した（図１６ｃ）。すなわち、ヒトゲノムで１６，０００個以上の相同性位置を有する５個のｓｇＲＮＡが、インビトロで６３個以上（ｓｇＲＮＡ当り平均１６１個）を切断するのに比べて、１３，０００個未満の相同性位置を有する６個のｓｇＲＮＡは、インビトロで４６個以下（ｓｇＲＮＡ当り平均２８個）を切断して、相対的にさらに特異的であることが分かった（Ｐ＜０．０１、Ｓｔｕｄｅｎｔ´ｓｔ‐ｔｅｓｔ）（図１６ｃ）。前記結果は、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ陽性位置の数とヒトゲノムに対する標的位置のｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｉｔｙとの間で観察される相関関係不足（Ｒ^２＝０．２９）とは対照的である（図１７）。しかし、細胞内で１０個以下の位置を切断する、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより確認された５個の最も特異的なｓｇＲＮＡは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された最も特異的なｓｇＲＮＡと一致した。

前記結果は、ヒトゲノムでヌクレオチド不一致が６個以下である相同性位置が１３，０００個より少なく、ヌクレオチド不一致が２個以下である相同性位置がない特定位置が、非標的効果を最小化するにおいて好適であることを示唆する。これに関連して、本発明で試験した４個の遺伝子に対して５´‐ＮＧＧ‐３´ＰＡＭ配列を含む１７１５個の標的可能な位置のうち、３６８個の位置（＝２１．５％）が前記概念に付合する（表１３）。

実験例９：Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑｖｓ．その他の方法
平均的に、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、既存のＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより検出した位置のうち８０±８％の位置を成功的に叩いた（図１６ａ）。例えば、ＶＥＧＦＡ１、ＲＮＦ２、及びＨＥＫ２９３‐３位置に特異的な３個のｓｇＲＮＡを用いてＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより検出した全ての位置が、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっても確認された。また、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑによっては検出されなかった総７０３個の新しい位置（ｓｇＲＮＡ当り平均７０個）を検出した（図１６ａ）。結果的に、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑは、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出した位置の２５±６％を検出したのである。ＲＮＦ２特異的ｓｇＲＮＡは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの利点をみせる良い事例である。先行研究によると、２回の独立したＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ分析を行ったが、このｓｇＲＮＡに対する非標的位置を検出することができなかった。しかし、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、標的位置に加えて、１２個の切断位置を叩いた。さらに、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの陽性位置の数とＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑの陽性位置の数との間に相関関係不足（Ｒ^２＝０．２０）が観察された（図１６ｄ）。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑは、１０個のｓｇＲＮＡのうち９個に対して、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑよりも多くの非標的位置候補を得ることができるが、これは包括的な結果ではない。すなわち、ＨＢＢｓｇＲＮＡはＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより分析されなかった。全体的に、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより検出されなかった総１６８個の位置を検出した。

一方、ＶＥＧＦＡ１及びＥＭＸ１位置を標的とする２個のｓｇＲＮＡに対しては、ＨＴＧＴＳもともに行った（図１６ａ）。他の２つの方法（ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ及びＨＴＧＴＳ）の少なくとも１つにより検出された殆どの位置（ＶＥＧＦＡ１は４０個のうち３１個、ＥＭＸ１は１９個のうち１７個）もＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより叩かれたが、ＶＥＧＦＡ１は９個、ＥＭＸ１は２個が検出されなかった。これは、前記位置のうち一部がＰＣＲプライマーによる人為的結果（ａｒｔｉｆａｃｔ）またはＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑ及びＨＴＧＴＳが有する内在的限界である自然的に発生したＤＳＢから発生する偽陽性であるためであると判断される。しかし、前記位置において殆ど、特に他の２つの方法で共通的に確認された２個のＥＭＸ１非標的位置は、前記特定位置での低いシーケンシング深さ（ｄｅｐｔｈ）（図１８）または低濃度（８２ｎＭ）のｓｇＲＮＡのため、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑで確認されなかったものである。このような問題点は、平均シーケンシング深さを増加させるためにＷＧＳを複数回行い、単一分析で高濃度のｓｇＲＮＡを用いて得た塩基配列データと併合することで克服することができる。

ＶＥＧＦＡ２特異的ｓｇＲＮＡは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑがＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑより多くの候補位置を検出できるという規則から唯一に例外される場合である。すなわち、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑによっては検出されなかった１２２個の位置を確認した。前記標的配列は、シトシンストレッチ（ｃｙｔｏｓｉｎｅｓｔｒｅｔｃｈ）からなる一般的ではない配列である。単独重合体（ｈｏｍｏｐｏｌｙｍｅｒ）位置でＷＧＳにより得た多数の塩基配列データは、地図作成プログラムで除去されることができる。一方、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑは、検出されたオリゴヌクレオチド位置を増幅させるためにＰＣＲを用いるため、前記位置を検出することができるであろう。

次に、ＣｈｉＰ‐ｓｅｑ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）により検出したものと、本発明で確認された切断位置とを比較した。先ず、本発明で用いられた４個のｓｇＲＮＡに対してＣｈｉＰ‐ｓｅｑを行った。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された大体のＣａｓ９‐切断位置（２８８個、９８％）にはｄＣａｓ９が結合しなかった（図１９）。前記結果は、Ｃａｓ９のＤＮＡ結合はＤＮＡ切断とは分離される概念であり、ｄＣａｓ９を用いたＣｈｉＰ‐ｓｅｑは、ｄＣａｓ９ベースの転写因子及びエピゲノム（ｅｐｉｇｅｎｏｍｅ）モジュレータの特異性を調べるには有用であるが、Ｃａｓ９ＲＧＥＮのゲノムレベル特異性を分析するには適しないことを示唆する。

実験例１０：細胞内非標的位置の確認
次に、ＮＧＳ（ｎｅｘｔ‐ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）プラットフォームを用いて、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ及びＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより確認された位置（表１４〜表２３）のうち一部位置に対して、それぞれのｓｇＲＮＡとＣａｓ９タンパク質がヒト細胞内で非標的インデルを誘導することができるかを確認した。

Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ及びＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑにより共通的に検出される１３２個の位置のうち１１６個の位置（＝８８％）で、シーケンシングエラーによって引き起こされるバックグラウンドノイズレベル以上でインデルが検出された。これに対し、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑのみにより検出された位置及びＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑのみにより検出された位置の殆どは、標的化ディープシーケンシングによりインデルが確認されなかった。すなわち、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑのみにより検出された１２７個の位置のうち２１個（＝１７％）、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑのみにより検出された４５個の位置のうち２３個（＝５１％）が、ノイズレベル以上でインデルが誘導され、２つの方法は両方とも包括的な方法ではないということが確認された。検証された位置の殆どで、インデル頻度は１％未満であって、対応する標的位置で確認されたものより著しく低いレベルを示した。例えば、ＲＮＦ２標的ｓｇＲＮＡは、本発明で検証された標的位置及び２個の非標的位置でインデルを誘導したが、これらは、それぞれ６８％、０．２５％、及び０．０９％の頻度を示した（図２０）。このようなことから、ＮＧＳにより確認されなかった位置では、インデルがノイズレベルより低い頻度（位置に応じて０．００１％〜４％）で誘導され得ることが分かった。

非標的効果を低減するために、５´末端にさらに２つのグアニンを含むｓｇＲＮＡ（ｇｇＸ_２０ｓｇＲＮＡと命名する）を用いた（図２１ａ）。前記変形されたｓｇＲＮＡは、対応するＧＸ_１９ｓｇＲＮＡよりも５９８倍までさらに特異性を示した（図２１ｂ〜２２ｇ）。ＲＮＦ２特異的ｇｇＸ_２０ｓｇＲＮＡは、ノイズレベル以上の非標的インデルが検出されなかった（図２１ｄ）。

実験例１１：非標的位置でのインデル頻度
ＮＧＳにより検証された非標的位置（＝１６０）及び検証されなかった非標的位置（＝１４４）でのインデル頻度から、具体的に非標的効果を確認しようとした。不一致ヌクレオチドの数及び標的位置に対する非標的位置でのインデル頻度のプロットで、２個以下のヌクレオチド不一致を有する非標的位置が細胞内で効果的に切断されることを確認し（平均インデル頻度＝５．３８％）、３個以上のヌクレオチド不一致を有する場合、切断されにくいことを確認した（平均インデル頻度＝０．１４％以下）（図２２ａ）。標的位置でのインデル頻度は６０±７％と示された。検証または非検証位置でヌクレオチド不一致は、ＰＡＭ‐遠位及びＰＡＭ‐近位の部位に略均一に分布されていた。３個以上のヌクレオチド不一致を有する検証または非検証位置は、ＰＡＭ‐遠位部位がシード部位ほど重要であった（図２２ｂ及び２３ｃ）。すなわち、シード部位で０または１個のヌクレオチド不一致を有する位置でのインデル頻度は、２個以上の不一致を有する位置ほど低かった。

前記結果から、ゲノムで潜在的非標的位置の数、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより確認された位置の比（図１６ａ）、及び前記位置の平均インデル頻度（図２０ａ）から算出される非標的点数（表２４）を計算することができる。

前記結果をまとめると、本発明者らは、プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）の非標的位置を検出することができるＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ方法を開発し、これは、既存の他の方法に比べて高度の再現性を有して便利に非標的位置を検出することができる。さらに、本発明者らは、インビトロＤＮＡ切断点数付与システムを開発し、合成オリゴヌクレオチド二本鎖よりはプラスミド鋳型から転写されたｓｇＲＮＡを用いて、偽陽性及び偽陰性位置の数を減少させることのできる、向上したＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを開発した。また、１１個のｓｇＲＮＡ混合物を用いてゲノムＤＮＡを切断することで複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行い、これにより、ＧＵＩＤＥ‐ｓｅｑによっては検出されなかった、ｓｇＲＮＡ当り平均７０個の追加的な切断位置を確認した。ＲＧＥＮ形質転換ヒト細胞において、前記位置のうち多数で非標的インデルが誘導された。そこで、数百個の非標的位置でのインデル頻度、ヌクレオチド不一致の数、及び不一致の位置を調べて、ＲＧＥＮ特異性においてＰＡＭ‐遠位部位がシード部位ほど重要であることを確認した。また、シード部位で２個以上のヌクレオチド不一致を有する位置は、全体不一致ヌクレオチドの数がないか１個であるものに比べて、インビトロで切断されないことを確認した。

実験例１２：大規模複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ
本発明者らは、複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの標的を大規模に拡張した場合にも、非標的位置を効果的に検出することができるかを確認しようとした。

具体的に、総１００個のそれぞれ異なる標的位置に対する複合Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った。標的配列を１００個に拡張したにもかかわらず、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑにより前記１００個の標的に対する非標的位置を効果的に検出することができた。

そこで、コンピュータプログラムを用いて、標的位置に対する６個以下のヌクレオチド不一致を有する位置を求めた後、この部分をＲＧＥＮによって切断された位置と切断されなかった位置とに分類した。次に、ニューラルネットワーク（Ｎｅｕｒａｌｎｅｔｗｏｒｋ）に基づく機械学習（ｍａｃｈｉｎｅｌｅａｒｎｉｎｇ）により、切断された位置の配列と切断されなかった位置の配列との違いを分析し、これを用いて、標的位置に対する非標的位置を予測できるプログラムを製作した。前記プログラムを用いて、既存に開発された他のプログラム（ｃｒｏｐ‐ｉｔ）と比較したところ、より多数の非標的位置を検出することができることが分かった（図２３）。

実験例１３：ＺＦＮに対するＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ
さらに、本発明者らは、同一のアプローチ法により、ＲＧＥＮに代えてＺＦＮの非標的位置も検出することができるかを確認しようとした。

ＲＧＥＮと同様に、ＺＦＮタンパク質をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で分離されたゲノム（ｃｅｌｌ‐ｆｒｅｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ）に処理して切断した後、ＷＧＳを行った。ＺＦＮの場合、それをＩＧＶにより標的位置を調べた時に垂直整列が起こることを確認し（図２４ａ）、全体ゲノムレベルで切断点数を付与した（図２４ｂ）。インビトロ切断位置周辺のＤＮＡ配列を比較して得た配列ロゴ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｏｇｏ）は、殆どの位置で標的配列と付合することを確認した（図２４ｃ及び図２４ｄ）。Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑの結果として出た標的位置と非標的位置候補のうちヌクレオチド不一致領域が４個以下である部分に対して、ＺＦＮを用いて形質転換させた後、標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行った（表２５）。

その結果、６２個の非標的位置候補のうち３５個の標的及び非標的位置でインデルがあることが確認され、具体的には、０．０２８％から５．９％まで誘導されることを確認することができた（表２５）。これは、Ｄｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑ方法が、ＺＦＮの非標的位置も予測することができることを示唆する。ＦｏｋＩ位置に変形（ＫＫまたはＥＬ）させて作ったＺＦＮの場合、特異性が増加することが確認された（図２４）。このようにＦｏｋＩが変形されたＺＦＮを用いてＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑを行った時にも、総１６個の非標的位置候補を探すことができた。ＦｏｋＩが変形されたＺＦＮを用いて形質転換させた細胞でも、１６個の非標的位置候補のうち１５個の位置でインデルが起こることが確認され、このことから、既存の他の方法（ＩＬＤＶ、Ｉｎｖｉｔｒｏｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）に比べて多数の非標的位置を探すことができることが確認された（図２５）。

結論的に、前記結果は、本発明のＤｉｇｅｎｏｍｅ‐ｓｅｑが、ＲＧＥＮ、ＺＦＮだけでなく、標的位置及び非標的位置を有することのできる如何なるプログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）にも適用可能であることを示唆する。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施され得ることを理解できるであろう。これに関連して、上述の実施例は、全ての点で例示的なものにすぎず、限定的なものではないと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、添付の特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出される全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれると解釈されるべきである。

Claims

（ａ）分離されたゲノムＤＮＡを標的特異的プログラマブルヌクレアーゼ（ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅｎｕｃｌｅａｓｅ）で切断するステップと、
（ｂ）前記切断されたＤＮＡに対する次世代シーケンシング（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うステップと、
（ｃ）前記シーケンシングにより得た塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）を整列して、切断されたＤＮＡの５´末端が垂直整列された位置、または、切断されたＤＮＡの同一の５´末端を有する塩基配列データの数を数えて描いた５´末端プロットで、プログラマブルヌクレアーゼにより切断された二本鎖のそれぞれの鎖によって示される二重ピークパターンを示す位置を、切断された位置として決定するステップと、
（ｄ）前記切断された位置が標的位置（ｏｎ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）ではない場合、非標的位置として判断するステップと、
を含む、プログラマブルヌクレアーゼの非標的位置（ｏｆｆ‐ｔａｒｇｅｔｓｉｔｅ）を検出する方法。
前記ゲノムＤＮＡは、標的特異的プログラマブルヌクレアーゼが発現される細胞、または発現されない細胞から分離された物である、請求項１に記載の方法。
前記整列は標準塩基配列（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｏｍｅ）に塩基配列データをマッピングした後、ＢＷＡ／ＧＡＴＫまたはＩＳＡＡＣを用いて行う、請求項１に記載の方法。
ワトソン鎖（Ｗａｔｓｏｎｓｔｒａｎｄ）とクリック鎖（Ｃｒｉｃｋｓｔｒａｎｄ）に該当する塩基配列データ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅａｄ）がそれぞれ２つ以上ずつ垂直整列される位置を非標的位置であると判断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
２０％以上の塩基配列データが垂直整列され、それぞれのワトソン鎖及びクリック鎖で同一の５´末端を有する塩基配列データの数が１０以上である位置が非標的位置であると判断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記分離されたゲノムＤＮＡはプログラマブルヌクレアーゼが発現された細胞から分離されたものであって、前記ＤＮＡの非標的位置でインデルを確認するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
前記インデルを確認することは前記非標的位置に対するＴ７Ｅ１分析及びＣｅｌ‐Ｉ酵素を用いた突然変異検出分析または標的化ディープシーケンシング（ｔａｒｇｅｔｅｄｄｅｅｐｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を行うことによる、請求項６に記載の方法。
前記非標的位置は、標的位置と一個以上のヌクレオチド不一致を有する、請求項１に記載の方法。
前記非標的位置は標的位置と１〜６個のヌクレオチド不一致を有する、請求項１に記載の方法。
前記（ｃ）ステップは、切断された各々の位置に下記式を適用して、切断点数を算出して行う請求項１に記載のプログラマブルヌクレアーゼの非標的位置を検出する方法。
前記式でＣ値が１００として、算出された点数が２５，０００点以上である場合、非標的位置であると判断するステップをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
前記プログラマブルヌクレアーゼは２個以上の標的に対するプログラマブルヌクレアーゼを混合したものである、請求項１に記載の方法。
前記プログラマブルヌクレアーゼは２〜１００個の標的に対するプログラマブルヌクレアーゼを混合したものである、請求項１に記載の方法。
標的位置との編集距離（ｅｄｉｔｄｉｓｔａｎｃｅ）により、非標的位置を分類するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
前記プログラマブルヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼ（ｍｅｇａｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＺＦＮ（ｚｉｎｃｆｉｎｇｅｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＴＡＬＥＮ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｃｔｉｖａｔｏｒ‐ｌｉｋｅｅｆｆｅｃｔｏｒｎｕｃｌｅａｓｅ）、ＲＧＥＮ（ＲＮＡ‐ｇｕｉｄｅｄｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄｎｕｃｌｅａｓｅ）、及びＣｐｆ１からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記ＲＧＥＮは、標的遺伝子の特定配列に特異的に結合するガイドＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を含む、請求項１５に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡは、オリゴヌクレオチド二本鎖またはプラスミド鋳型から転写されたものである、請求項１６に記載の方法。
前記ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ）及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ＲＮＡ（ｄｕａｌＲＮＡ）または一本鎖ガイドＲＮＡの形態のものである、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質またはこれの変異体である、請求項１６に記載の方法。
前記Ｃａｓタンパク質は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属及びカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属からなる群より選択される一つの由来である、請求項１６に記載の方法。
前記メガヌクレアーゼは、Ｉ‐ＳｃｅＩ、Ｉ‐ＣｅｕＩ、ＰＩ‐ＰｓｐＩ及びＰＩ‐ＳｃｅＩからなる群より選択される、請求項１５に記載の方法。
前記Ｃｐｆ１は、カンジダタスパセイバックター（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＰａｃｅｉｂａｃｔｅｒ）、ラクノスピラ（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａ）属、ブチリビブリオ（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ）属、ペレグリニバクテリア（Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ）、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄｏｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属、プレボテラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）属、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）属、カンジダタスメタノプラズマ（ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＭｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ）及びユーバクテリウム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属からなる群より選択される一つの由来である、請求項１５に記載の方法。