CN109295186B

CN109295186B - 一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用

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Publication number: CN109295186B
Application number: CN201811160230.9A
Authority: CN
Inventors: 松阳洲; 梁普平; 黄军就
Original assignee: Sun Yat Sen University
Current assignee: Sun Yat Sen University
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2023-10-03
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: WO2020063520A1; CN109295186A; US20210395812A1

Abstract

本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(Adenine base editor,ABE)脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。所述腺嘌呤单碱基编辑系统由TadA:TadA*:Cas9的融合基因和gRNA两部分组分组成。其能催化靶位点处腺嘌呤(Adenine,A)至鸟嘌呤(Guanine，G)的高效置换，在人类疾病基因编辑治疗和疾病模型构建中有广泛的应用前景。为此，我们开发了首个能够检测ABE系统全基因组范围内脱靶效应的检测方法——EndoV‑seq。本发明提供的EndoV‑seq方法在基因编辑，尤其是基因编辑治疗领域，具有广泛的应用前景。

Description

一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域。更具体地，涉及是基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(Adenine base editor,ABE)脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。

背景技术

CRISPR/Cas9系统是一项新的人工核酸酶技术，其是由gRNA(guide RNA)和Cas9蛋白组成的复合物。在靶位点3’末端PAM(Protospacer adjacent motif)序列的帮助下，该gRNA-Cas9蛋白复合物通过gRNA5’末端的20个碱基与靶DNA结合，从而将内切核酸酶Cas9招募到靶位点处，切割靶DNA，从而编辑靶基因。虽然，CRISPR/Cas9技术的出现，极大地提高了基因定点突变的效率，但目前依然无法满足临床基因治疗的需要。最近，基于CRISPR/Cas9技术，科学家开发了新一代的基因编辑系统——腺嘌呤单碱基编辑系统(Adenine baseeditor,ABE)。ABE系统是由TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA两部分组分组成的。在gRNA的引导下，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白能够与DNA上的靶位点结合，其中与gRNA互补的DNA链会被Cas9核酸酶切断，而非互补链上4-9位的A碱基则会被腺嘌呤脱氨酶——TadA蛋白——催化脱氨基形成I碱基。随着DNA的复制，I(次黄嘌呤，Inosine)碱基会被G(鸟嘌呤,Guanine)碱基替代，从而实现A至G的碱基置换。与CRISPR/Cas9核酸酶相比，ABE系统的效率更高。由于,ABE系统能在不诱导DNA双链断裂的情况下实现A至G的碱基置换，其安全性比CRISPR/Cas9核酸酶也更高。

大约48％的人致病单碱基突变可以通过A至G的碱基置换实现修复，从而最终实现遗传疾病的治疗，所以ABE系统在人类疾病基因治疗领域有着广泛的应用前景。但是，目前仍未有一项能够在全基因组范围内检测ABE系统脱靶效应的方法，这严重制约了ABE系统的应用。

发明内容

本发明的目的是针对上述ABE系统尚无全基因组范围内检测脱靶效应的方法，提供一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用。

在本发明一具体实施例中，本发明通过基因合成、分子克隆、蛋白表达纯化、体外转录、核酸纯化、全基因组测序、PCR产物深度测序、生物信息学分析等技术检测ABE系统的脱靶效应。同时，我们还结合细胞转染和PCR产物深度测序技术对该检测方法的有效性和灵敏度进行了验证。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测DNA序列的gRNA以及基因组DNA共混后进行反应；其中，所述基因组DNA包含有待测DNA序列,在所述反应体系中，TadA:TadA*:Cas9和gRNA复合物切割与gRNA互补的待测DNA链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；

(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶V切割包含次黄嘌呤DNA,造成DNA双链断裂；

(3)、利用全基因组测序以及生物信息学分析检测腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶效应。

在本发明第一方面一具体实施例中，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(EndoV-seq)；所述EndoV-seq首先利用体外纯化的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白与gRNA共处理基因组DNA；TadA:TadA*:Cas9和gRNA的复合物将切割与gRNA互补的DNA链，同时将非互补链上的A转变成I；然后，利用内切核酸酶V(Endonuclease V，EnodV)切割包含I碱基的基因组DNA,造成DNA双链断裂；最后，利用全基因组测序结合生物信息学分析检测DNA双链断裂，从而探究ABE系统的脱靶效应。我们将这一方法命名为EndoV-seq。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。

本领域技术人员可以理解的是，本发明所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白由Cas9效应蛋白与腺苷脱氨酶(简称TadA蛋白)融合而成，本领域技术人员可以根据需要，利用一条或多条连接多肽，将一个Cas9 效应蛋白结构域与一个或多个TadA蛋白进行连接，获得融合蛋白，在本发明一具体实施例中，所述TadA蛋白均重复一次。可以理解的是，所述Cas9效应蛋白和TadA蛋白的N端和C端的连接顺序为本领域常规技术，连接多肽包括但不限于本领域常规的连接多肽片段，常见地，比如GS linker。

本领域技术人员可以理解的是，本领域技术人员可以根据具体需要，针对基因组DNA设计任意特异性靶向的gRNA，并对gRNA进行本领域熟知的修饰，以提高gRNA靶向特异性。在本发明一具体实施例中，本发明设计的gRNA序列包括：

HBG：GTGGGGAAGGGGCCCCCAAGAGG，其中下划线标注的为PAM序列

VEGFA3：GGTGAGTGAGTGTGTGCGTGTGG，其中下划线标注的为PAM序列。

本领域技术人员可以理解的是，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，TadA为腺苷脱氨酶的缩写，TadA*为TadA突变体的缩写，Cas9为CRISPR/Cas系统的Cas9效应蛋白。

进一步地，所述CRISPR/Cas系统的效应蛋白结构域中，所述Cas9效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白Streptococcus pyogenes Cas9(SpCas9),Staphylococcus aureus Cas9(SaCas9),Lachnospiraceae Cpf1(LbCpf1),Acidaminococcus Cpf1(AsCpf1),Streptococcus thermophilus Cas9(StCas9),andNeisseriameningitidis Cas9(NmCas9)和Francisella Cpf1(FnCpf1)等。

进一步地，所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，腺苷脱氨酶TadA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示或为与SEQ ID NO.2所示氨基酸至少80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％一致的序列。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的制备方法是将合成的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白原核表达载体(pET42b-ABE7.10，SEQ ID NO.3)载体在大肠杆菌中进行表达并纯化TadA:TadA*:Cas9融合蛋白。

更具体地，该制备过程包括步骤(1)将pET42b-ABE7.10转化到BL21Star^TM(DE3)E.coli(Thermo Fisher)感受态中。

更具体地，步骤(2)诱导TadA:TadA*:Cas9融合蛋白表达的方式是：挑取单克隆37℃过夜培养后1:200接种于1L含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.7–0.8。然后，将培养液放于4℃冰箱静置1h，加入终浓度0.5mM IPTG18℃诱导蛋白表达14-16h。

更具体地，步骤(3)纯化及保存TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的方式是：4000rpm，10min收集诱导后的菌体，加入10ml裂解液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,1M NaCl,20％甘油,5mM TCEP(Sigma-Aldrich),0.4mM PMSF(Sigma-Aldrich)，蛋白酶抑制剂(Roche)and 20mMImidazole(Sigma-Aldrich))。超声(5min total,2s on,5s off)初步破碎细胞。然后，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液再次超声(5min total,2s on,5s off)。之后，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液。上清液与Ni-NTA琼脂糖树脂(GE Healthcare)4℃孵育1.5h。混合液倒入层析柱，然后用40ml洗涤液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl,20％甘油,5mM TCEP,20mM imidazole)清洗Ni-NTA琼脂糖树脂(GE Healthcare)。然后，用洗脱液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl,20％甘油,5mM TCEP,270mM Imidazole)将蛋白从Ni柱洗脱。洗脱蛋白过5ml阳离子交换层析(Hi-Trap HP SP阳离子交换柱，GEHealthcare)。然后，用30kDa浓缩管浓缩(Millipore)至300μl。然后，将浓缩产物过0.22μm滤菌膜(Millipore)过滤除菌。用BCA试剂盒(Pierce Biotechnology)测蛋白浓度后暂存于4℃，如需长期保存，则将蛋白用液氮速冻后冻于-80℃保存。

更具体地，所述gRNA的制备方法是包括(1)化学合成gRNA；(2)体外转录合成gRNA。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述反应体系为溶液反应体系，所述溶液反应体系还包含所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白将所述非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤所需的缓冲液组分。

在本发明第一方面一具体实施例中，所述步骤(3)包括：

对步骤(2)酶切后的体系进行全基因组测序，获得全基因组测序结果；

对全基因组测序结果进行生物信息学分析，获得所述腺嘌呤单碱基编辑系统的脱靶数据；

进一步地，所述步骤(3)还包括：根据所述脱靶数据预测所述腺嘌呤单碱基编辑系统在细胞(包括人细胞、动物细胞、植物细胞等)或机体内(包括人、动物、植物等)的脱靶效应。

第二方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的试剂盒，包括第一方面所提供的靶向目的DNA的gRNA序列或TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、EndoV核酸酶。

第三方面，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法在检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应中的应用。

本发明利用体外纯化的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA，利用融合蛋白-gRNA复合物处理基因组DNA。然后，利用核酸纯化试剂盒纯化处理过的基因组DNA。再利用内切核酸酶V消化以上纯化的基因组DNA。消化完成后，再将该基因组DNA纯化，并进行全基因组测序检测ABE系统的全基因组脱靶效应。该检测方法(EndoV-seq)和检测结果也在本发明的保护范围之内。同时，还可以根据EndoV-seq的检测结果，优选出效率和特异性高的gRNA。EndoV-seq作为优选gRNA的方法也在本发明的保护范围之内。

另外，上述EndoV-seq在基因编辑中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明将促进以ABE系统为工具，进行的精准基因编辑治疗的临床应用，精准疾病模型构建的应用，精准基因编辑植物或作物的培育等应用。

第四方面，EndoV-seq还可以用于检测其他能够将A碱基转变成I碱基的酶或化学试剂的效率和脱靶活性。酶包括但不限定于TadA腺嘌呤脱氨酶。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，该检测方法可以用于腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的检测，促进腺嘌呤单碱基编辑系统在疾病基因治疗、模型构建、基因编辑植物或作物的培育等应用，具有十分广泛的应用前景。

附图说明

图1为Cas9蛋白、BE3蛋白和TadA:TadA*:Cas9蛋白的蛋白凝胶电泳图；第一道泳道为蛋白分子Marker，第二道为Cas9蛋白，第三道为BE3蛋白，第四道为TadA:TadA*:Cas9蛋白；

图2为gRNA琼脂糖凝胶电泳结果，两条泳道均为gRNA。

图3为TadA:TadA*:Cas9蛋白-gRNA复合物和EndoV共处理能够切开靶DNA分子。

图4为EnodV-seq能够检测到靶位点处的DNA双链断裂。

图5为EndoV-seq检测HBG和VEGFA3两条gRNA介导的ABE系统的全基因组范围内的脱靶效应。A图是Circosplot展示EndoV-seq检测到的靶位点及脱靶位点，红色箭头指示的是靶位点。B图是Weblog展示的脱靶位点的分子模式。下方标注的是gRNA的靶序列，其中PAM标注为绿色字母。

图6为PCR产物深度测序验证HBG的脱靶位点，18个脱靶位点中有6个位点能被验证，并用*号标出。

图7为PCR产物深度测序验证VEGFA3的脱靶位点，22个脱靶位点中有3个位点能被验证，并用*号标出；

图8为本发明基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(EndoV-seq)的流程示意图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。

除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议条件实施。

本发明一具体实施方式中，本发明提供了一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的系统、方法、试剂盒及其应用。

本发明提供的基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，采用了本发明提供的基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应检测试剂盒，所述方法包括但不限于如下步骤的一个或多个步骤：

TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的表达纯化和gRNA的制备

1、TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的表达纯化

制备含编码TadA:TadA*:Cas9融合蛋白基因的重组表达质粒，本实施例中，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的原核表达载体为pET42b-ABE7.10(SEQ ID NO.3)；

步骤(1)、将pET42b-ABE7.10转化到BL21Star^TM(DE3)E.coli(Thermo Fisher)感受态中。

步骤(2)、诱导TadA:TadA*:Cas9融合蛋白表达：挑取单克隆37℃过夜培养后1:200接种于1L含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝0.7–0.8。培养液放于4℃冰箱静置1h，加入终浓度0.5mM IPTG18℃诱导蛋白表达14-16h。

步骤(3)、纯化及保存TadA:TadA*:Cas9融合蛋白：4℃收集菌体并纯化蛋白。4000rpm，10min收集诱导后的菌体，加入10ml裂解液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,1M NaCl,20％甘油,5mM TCEP(Sigma-Aldrich),0.4mM PMSF(Sigma-Aldrich)，蛋白酶抑制剂(Roche)and 20mM Imidazole(Sigma-Aldrich))。超声(5min total,2s on,5s off)初步破碎细胞，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液再次超声(5min total,2s on,5s off)，15000rpm，4℃离心10min后收集上清液。上清液与Ni-NTA琼脂糖树脂(GE Healthcare)4℃孵育1.5h。混合液倒入层析柱，40ml洗涤液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl,20％甘油,5mM TCEP,20mM imidazole)清洗Ni-NTA琼脂糖树脂(GE Healthcare)。然后用洗脱液(100mM Tris-HCl,pH 8.0,0.5M NaCl,20％甘油,5mM TCEP,270mM Imidazole)将蛋白从Ni柱洗脱。洗脱蛋白过5ml阳离子交换层析(Hi-Trap HP SP阳离子交换柱，GE Healthcare)。然后用30kDa浓缩管浓缩(Millipore)至300μl。然后将浓缩产物过0.22μm滤菌膜(Millipore)过滤除菌。用BCA试剂盒(Pierce Biotechnology)测蛋白浓度后暂存于4℃，如需长期保存，则将蛋白用液氮速冻后冻于-80℃保存。

蛋白表达检测结果如附图1，图1显示了Cas9蛋白、BE3蛋白和TadA:TadA*:Cas9蛋白的蛋白凝胶电泳图。

2、gRNA的制备

本发明实施例通过化学直接合成或者通过体外转录制备gRNA，其中，体外转录制备gRNA包括以下步骤①通过PCR的方式获得包含T7启动子的gRNA转录模板DNA。或者将gRNA编码序列克隆到包含T7启动子的转录载体中，然后将该载体线性化而获得包含T7启动子的gRNA转录模板DNA；②体外转录gRNA；

体外转录gRNA的方法是：以包含T7启动子的gRNA转录模板DNA为模板，用MEGAshortscript T7kit(Life Technologies)转录生产gRNA。再用RNA纯化试剂盒纯化gRNA(Qiagen)，并用不含核酸酶的水洗脱gRNA，即可获得gRNA。

具体地，gRNA体外转录方法的操作程序如下：

1)以gRNA转录模板DNA为模板，利用MEGAshortscript T7kit(LifeTechnologies)，按照如下表1所示体系配制反应体系。

表1 反应体系

成分	用量
		T7 10×反应液	2μl
T7 ATP溶液	2μl
		T7 CTP溶液	2μl
T7 GTP溶液	2μl
		T7 UTP溶液	2μl
模板DNA	1μg
		T7 RNA转录酶	2μl
ddH₂O	加水至20μl

37℃反应2h，案后往反应体系中加1μl TURBO DNase,37℃反应15min。

2)gRNA的纯化，用Qiagen的RNaeasy Kit纯化，按照如下步骤进行：

a.加ddH₂O使得起始RNA的体积为100μl，混匀。

b.加350μl Binding Solution Concentrate到RNA样品中，并混匀。

c.加250μl 100％乙醇，并混匀。

d.将样品转移到柱子中，12000g离心15s。

e.用500μl Wash Solution洗两次，12000g离心15s。

f.加50μl ddH₂O将RNA从柱子上洗脱下来。

3)结果如图2所示，图2显示了HBG和VEGFA3两条gRNA的琼脂糖凝胶电泳结果。

EndoV-seq检测ABE系统在靶位点的单碱基编辑

为了验证EndoV-seq是否能够用于检测ABE系统全基因组范围内的脱靶效应，我们利用了一条已经多次被验证能高效靶向靶位点的gRNA——HEK293-2，其靶序列为GAACACAAAGCATAGACTGCGGG，其中下划线标注的为PAM序列。首先，我们通过PCR的方式扩增出了包含了HEK293-2位点的PCR产物，然后将该产物纯化，具体纯化方法如下。

按AxyPrep PCR cleanup kit的操作手册进行实验。

a.在PCR反应液中，加3个体积的Buffer PCR-A并混匀，然后转移到DNA制备管，将DNA制备管置于2ml离心管中，12,000g离心1min，将滤液弃掉。

b.将制备管放回2ml离心管中，加700μl Buffer W2，12000g离心1min，将滤液弃掉。

c.将制备管放回2ml离心管中，加400μl Buffer W2，12000g离心1min，弃滤液。

d.12,000g离心3min，使Buffer W2中的乙醇充分弃掉。

e.将制备管置于新的1.5ml离心管中，在制备管中央加25-30μl的无核酸酶的水，静置1min。12000

g离心1min(无核酸酶的水用前先65℃预热)。

获得了纯化后的PCR产物之后，将PCR产物加入到20μl反应体系中。该反应体系中含有2μl10×NEBuffer 3,400nM TadA:TadA*:Cas9融合蛋白,900nM gRNA and 200ng PCR产物。37℃反应3h。依次加入RNase A和Proteinase K移除gRNA及蛋白。然后再次按照如上步骤纯化，取100ng与1单位的Endo V(ThermoFisher)混合10μl反应体系，65℃反应30min。3％琼脂糖检测。检测结果如图3所示，用EndoV消化TadA:TadA*:Cas9和gRNA处理过的PCR产物，能够将包含HEK293-2靶位点的PCR产物切断。其中Cas9蛋白作为阳性对照。图3的结果说明EndoV能够用于检测ABE系统的脱氨基作用。

为了进一步检测EndoV-seq是否能够用于检测ABE系统的脱氨基作用，我们进一步用TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和HEK293-2gRNA一起处理人HEK293T细胞的基因组DNA。首先，我们用基因组DNA提取试剂盒从HEK293T细胞中提取基因组DNA(DNeasy Blood&TissueKit,Qiagen),操作方法完全按照说明书进行。然后用TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和HEK293-2gRNA一起处理人HEK293T细胞的基因组DNA。在500μl反应体系中我们加有50μl 10×NEBuffer 3,400nM ABE7.10,900nM gRNA and 10μg基因组DNA。37℃反应8h。8h后，向反应体系中加入RNase A和Proteinase K移除gRNA及蛋白。然后用苯酚/氯仿/异戊醇仿抽提基因组DNA，操作步骤如下。

a.向以上反应加入1体积的苯酚/氯仿/异戊醇剧烈混匀，室温下静置10分钟，待分层后12000rpm离心10分钟；

b.吸取上层水相，并记录其体积；

c.加入1/10体积的3M NaAc，加3倍体积冷的无水乙醇(-20℃冰箱)，剧烈混匀。然后，冰上孵育15分钟；

d.离心(12000rpm，15分钟，4℃)，用移液器尽可能除去乙醇；

e.加入0.5ml 70％乙醇洗DNA沉淀一次，12000rpm，离心2分钟，吸取并尽可能弃掉乙醇；

f.加入30μl水溶解DNA，然后用Nanodrop测定其浓度；

然后，取4μg基因组DNA与8单位的EndoV核酸酶(ThermoFisher)混合100μl反应体系，65℃反应3h，酚氯仿抽提基因组DNA。最后，取1μg基因组DNA做全基因组测序。然后用BWA软件将测序的Reads比对到人参考基因组。我们发现EndoV-seq确实能够检测到ABE系统介导的靶位点的修饰，结果如图4所示。

EndoV-seq检测ABE系统在全基因组范围内的脱靶效应

为了进一步探究EndoV-seq是否能够用于检测ABE系统全基因范围内的脱靶效应。我们进一步利用在实施例1中所转录出的HBG和VEGFA3两条gRNA,然后将其分别与TadA:TadA*:Cas9融合蛋白孵育。然后用该蛋白-RNA复合物处理HEK293-2基因组DNA。

在500μl反应体系中我们加有50μl 10×NEBuffer 3,400nM ABE7.10,900nM gRNAand 10μg基因组DNA。37℃反应8h。8h后，向反应体系中加入RNase A和Proteinase K移除gRNA及蛋白。然后用苯酚/氯仿/异戊醇仿抽提基因组DNA，操作步骤如下。

b.吸取上层水相，并记录其体积；

d.离心(12000rpm，15分钟，4℃)，用移液器尽可能除去乙醇；

f.加入30μl水溶解DNA，然后用Nanodrop测定其浓度；

然后，取4μg基因组DNA与8单位的EndoV核酸酶(ThermoFisher)混合100μl反应体系，65℃反应3h，酚氯仿抽提基因组DNA。最后，取1μg基因组DNA做全基因组测序。然后，用BWA软件将测序的Reads比对到人参考基因组。再利用在线软件

(Digenome 2.0,http://www.rgenome.net/digenome-js/standalone)对基因组各个位点进行打分，确定其切割的分值。参考之前用Digenome-seq检测胞嘧啶单碱基编辑系统脱靶效应的研究，我们将分值大于0.1的位点定义为阳性脱靶位点。我们发现EndoV-seq能够检测到靶位点以及脱靶位点，研究结果如图5所示，EndoV-seq检测到的脱靶位点见表2和表3。

表2 EndoV-seq检测到的HBG gRNA介导的ABE系统的脱靶位点统计

表3 EndoV-seq检测到的VEGFA3gRNA介导的ABE系统的脱靶位点统计

为了进一步研究EndoV-seq的有效性和敏感度。我们将pcDNA3.1-ABE7.10载体(由广州艾基生物科技有限公司合成，SEQ ID NO.4)与表达HBG(或VEGFA3)gRNA的gRNA表达载体pUC19-SpCas9-gRNA(SEQ ID NO.5,本实验室构建)共转染到293T细胞中，48h后收集细胞。利用基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA(DNeasy Blood&Tissue Kit,Qiagen),操作方法完全按照说明书进行。然后利用表2和表3中的引物通过PCR扩增靶位点和脱靶位点，并将这些PCR产物用于深度测序。如图6，通过深度测序，我们发现，对于HBG来说，18个脱靶位点中有6个位点能被验证。而对于VEGFA3来说，22个脱靶位点中有3个位点能被验证。所以，EndoV-seq的总验证率为22.5％(9/40)，说明EndoV-seq能够有效检测ABE系统的脱靶效应。对于HBG gRNA来说，我们发现HBG-OT9位点在细胞内的脱靶效率为0.13％，十分接近PCR产物深度测序的检测极限0.1％¹(1.Tsai,S.Q.et al.CIRCLE-seq:a highly sensitive invitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9nuclease off-targets.Nature methods14,607-614(2017).)，说明EndoV-seq具有很高的灵敏度。以上结果说明，EndoV-seq能够高效、灵敏地检测ABE系统全基因组范围内的脱靶效应。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明提供了本发明基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法(EndoV-seq)的流程示意图，如图8所示。

如图8，本发明实施例利用体外纯化的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、gRNA以及基因组DNA共孵育。在该反应体系中，TadA:TadA*:Cas9和gRNA的复合物将切割与gRNA互补的DNA链，同时将非互补链上的A转变成I(次黄嘌呤，Inosine)。然后，利用内切核酸酶V(Endonuclease V，EndoV)切割包含I碱基的基因组DNA,造成DNA双链断裂。最后，利用全基因组测序结合生物信息学分析检测ABE系统的脱靶效应。

基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统(Adenine base editor,ABE)脱靶效应的方法，能催化靶位点处腺嘌呤(Adenine,A)至鸟嘌呤(Guanine，G)的高效置换，在人类疾病基因编辑治疗和疾病模型构建中有广泛的应用前景。但由于CRISPR/Cas9系统的特异性不高，易将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白靶向到与gRNA不完全匹配的脱靶位点上，导致脱靶。严重制约了ABE系统的应用。为此，本发明提供的首个能够检测ABE系统全基因组范围内脱靶效应的检测方法EndoV-seq，利用EndoV-seq能在体外检测到ABE系统的脱靶位点，并结合体内实验进行验证。可以预见，EndoV-seq在基因编辑，尤其是基因编辑治疗领域，将具有广泛的应用前景。

本发明所述SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的碱基序列分别如下(所述SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5的碱基序列为商业质粒载体的序列，故不写入后续序列表中)：

SEQ ID NO.3：

GATATACCATGGGCAGCAGTCATCATCATCACCATCACTCGGAGGTTGAATTCTCCCACGAGTATTGGATGCGGCACGCTCTTACGTTAGCAAAACGCGCGTGGGACGAGCGTGAAGTACCGGTAGGCGCCGTGTTAGTGCATAATAACCGGGTCATTGGTGAAGGATGGAATCGGCCGATCGGGAGACACGATCCGACAGCACATGCTGAGATTATGGCTTTACGGCAAGGAGGACTGGTTATGCAGAACTACCGGTTGATTGATGCTACACTGTACGTAACCTTAGAACCATGTGTGATGTGTGCTGGAGCCATGATACATTCCCGCATCGGAAGAGTGGTTTTTGGGGCTCGTGATGCAAAAACTGGCGCCGCCGGAAGTCTTATGGACGTGTTACATCATCCAGGCATGAATCATCGGGTCGAGATTACAGAGGGCATTTTGGCAGATGAATGTGCTGCATTGCTTAGTGATTTCTTCCGCATGCGGAGACAGGAAATCAAAGCCCAAAAAAAAGCTCAAAGTAGTACTGATAGTGGTGGATCCAGTGGAGGCTCGTCAGGCTCTGAAACGCCTGGCACATCAGAATCGGCAACGCCAGAGTCGTCAGGAGGTTCCTCAGGTGGATCTTCGGAGGTCGAGTTTTCACATGAGTATTGGATGCGTCATGCCTTGACGTTGGCGAAACGGGCGCGCGATGAGCGTGAGGTGCCCGTGGGAGCGGTGTTGGTACTGAATAACCGGGTTATAGGGGAAGGATGGAACCGGGCTATTGGGTTACACGACCCAACGGCGCACGCCGAGATAATGGCACTGCGCCAAGGGGGCTTAGTTATGCAGAATTATCGCCTTATCGATGCTACACTGTATGTAACCTTTGAACCCTGCGTAATGTGTGCGGGGGCTATGATCCACTCGAGAATAGGGCGCGTGGTATTCGGCGTACGCAACGCTAAAACCGGGGCTGCGGGCTCGTTGATGGATGTTCTGCACTACCCCGGAATGAATCACAGAGTAGAGATCACGGAGGGAATTTTGGCCGACGAATGTGCAGCTTTACTGTGCTACTTTTTTCGGATGCCGCGGCAAGTCTTCAACGCACAGAAGAAGGCTCAATCTTCCACTGACTCAGGTGGCTCGAGTGGTGGGAGTAGCGGATCTGAGACGCCAGGCACATCAGAGAGTGCAACCCCCGAGTCATCGGGTGGGAGTTCCGGCGGATCTGATAAGAAATACTCAATAGGCTTAGCTATCGGCACAAATAGCGTCGGATGGGCGGTGATCACTGATGAATATAAGGTTCCGTCTAAAAAGTTCAAGGTTCTGGGAAATACAGACCGCCACAGTATCAAAAAAAATCTTATAGGGGCTCTTTTATTTGACAGTGGAGAGACAGCGGAAGCGACTCGTCTCAAACGG ACAGCTCGTAGAAGGTATACACGTCGGAAGAATCGTATTTGTTATCTACAGGAGATTTTTTCAAATGAGATGGCGAAAGTAGATGATAGTTTCTTTCATCGACTTGAAGAGTCTTTTTTGGTGGAAGAAGACAAGAAGCATGAACGTCATCCTATTTTTGGAAATATAGTAGATGAAGTTGCTTATCATGAGAAATATCCAACTATCTATCATCTGCGAAAAAAATTGGTAGATTCTACTGATAAAGCGGATTTGCGCTTAATCTATTTGGCCTTAGCGCATATGATTAAGTTTCGTGGTCATTTTTTGATTGAGGGAGATTTAAATCCTGATAATAGTGATGTGGACAAACTATTTATCCAGTTGGTACAAACCTACAATCAATTATTTGAAGAAAACCCTATTAACGCAAGTGGAGTAGATGCTAAAGCGATTCTTTCTGCACGATTGAGTAAATCAAGACGATTAGAAAATCTCATTGCTCAGCTCCCCGGTGAGAAGAAAAATGGCTTATTTGGGAATCTCATTGCTTTGTCATTGGGTTTGACCCCTAATTTTAAATCAAATTTTGATTTGGCAGAAGATGCTAAATTACAGCTTTCAAAAGATACTTACGATGATGATTTAGATAATTTATTGGCGCAAATTGGAGATCAATATGCTGATTTGTTTTTGGCAGCTAAGAATTTATCAGATGCTATTTTACTTTCAGATATCCTAAGAGTAAATACTGAAATAACTAAGGCTCCCCTATCAGCTTCAATGATTAAACGCTACGATGAACATCATCAAGACTTGACTCTTTTAAAAGCTTTAGTTCGACAACAACTTCCAGAAAAGTATAAAGAAATCTTTTTTGATCAATCAAAAAACGGATATGCAGGTTATATTGATGGGGGAGCTAGCCAAGAAGAATTTTATAAATTTATCAAACCAATTTTAGAAAAAATGGATGGTACTGAGGAATTATTGGTGAAACTAAATCGTGAAGATTTGCTGCGCAAGCAACGGACCTTTGACAACGGCTCTATTCCCCATCAAATTCACTTGGGTGAGCTGCATGCTATTTTGAGAAGACAAGAAGACTTTTATCCATTTTTAAAAGACAATCGTGAGAAGATTGAAAAAATCTTGACTTTTCGAATTCCTTATTATGTTGGTCCATTGGCGCGTGGCAATAGTCGTTTTGCATGGATGACTCGGAAGTCTGAAGAAACAATTACCCCATGGAATTTTGAAGAAGTTGTCGATAAAGGTGCTTCAGCTCAATCATTTATTGAACGCATGACAAACTTTGATAAAAATCTTCCAAATGAAAAAGTACTACCAAAACATAGTTTGCTTTATGAGTATTTTACGGTTTATAACGAATTGACAAAGGTCAAATATGTTACTGAAGGAATGCGAAAACCAGCATTTCTTTCAGGTGAACAGAAGAAAGCCATTGTTGATTTACTCTTCAAAACAAATCGAAAAGTAACCGTTAAGCAATTAAAAGAAGATTATTTCAAAAAAATAGAATGTTTTGATAGTGTTGAAATTTCAGGAGTTGAAGATAGATTTAATGCTTCATTAGGTACCTACCATGATTTGCTAAAAATTATTAAAGATAAAGATTTTTTGGATAATGAAGAAAATGAAGATATCTTAGAGGATATTGTTTTAACATTGACCTTATTTGAAGATAGGGAGATGATTGAGGAAAGACTTAAAACATATGCTCACCTCTTTGATGATAAGGTGATGAAACAGCTTAAACGTCGCCGTTATACTGGTTGGGGACGTTTGTCTCGAAAATTGATTAATGGTATTAGGGATAAGCAATCTGGCAAAACAATATTAGATTTTTTGAAATCAGATGGTTTTGCCAATCGCAATTTTATGCAGCTGATCCATGATGATAGTTTGACATTTAAAGAAGACATTCAAAAAGCACAAGTGTCTGGACAAGGCGATAGTTTACATGAACATATTGCAAATTTAGCTGGTAGCCCTGCTATTAAAAAAGGTATTTTACAGACTGTAAAAGTTGTTGATGAATTGGTCAAAGTAATGGGGCGGCATAAGCCAGAAAATATCGTTATTGAAATGGCACGTGAAAATCAGACAACTCAAAAGGGCCAGAAAAATTCGCGAGAGCGTATGAAACGAATCGAAGAAGGTATCAAAGAATTAGGAAGTCAGATTCTTAAAGAGCATCCTGTTGAAAATACTCAATTGCAAAATGAAAAGCTCTATCTCTATTATCTCCAAAATGGAAGAGACATGTATGTGGACCAAGAATTAGATATTAATCGTTTAAGTGATTATGATGTCGATCACATTGTTCCACAAAGTTTCCTTAAAGACGATTCAATAGACAATAAGGTCTTAACGCGTTCTGATAAAAATCGTGGTAAATCGGATAACGTTCCAAGTGAAGAAGTAGTCAAAAAGATGAAAAACTATTGGAGACAACTTCTAAACGCCAAGTTAATCACTCAACGTAAGTTTGATAATTTAACGAAAGCTGAACGTGGAGGTTTGAGTGAACTTGATAAAGCTGGTTTTATCAAACGCCAATTGGTTGAAACTCGCCAAATCACTAAGCATGTGGCACAAATTTTGGATAGTCGCATGAATACTAAATACGATGAAAATGATAAACTTATTCGAGAGGTTAAAGTGATTACCTTAAAATCTAAATTAGTTTCTGACTTCCGAAAAGATTTCCAATTCTATAAAGTACGTGAGATTAACAATTACCATCATGCCCATGATGCGTATCTAAATGCCGTCGTTGGAACTGCTTTGATTAAGAAATATCCAAAACTTGAATCGGAGTTTGTCTATGGTGATTATAAAGTTTATGATGTTCGTAAAATGATTGCTAAGTCTGAGCAAGAAATAGGCAAAGCAACCGCAAAATATTTCTTTTACTCTAATATCATGAACTTCTTCAAAACAGAAATTACACTTGCAAATGGAGAGATTCGCAAACGCCCTCTAATCGAAACTAATGGGGAAACTGGAGAAATTGTCTGGGATAAAGGGCGAGATTTTGCCACAGTGCGCAAAGTATTGTCCATGCCCCAAGTCAATATTGTCAAGAAAACAGAAGTACAGACAGGCGGATTCTCCAAGGAGTCAATTTTACCAAAAAGAAATTCGGACAAGCTTATTGCTCGTAAAAAAGACTGGGATCCAAAAAAATATGGTGGTTTTGATAGTCCAACGGTAGCTTATTCAGTCCTAGTTGTTGCTAAGGTGGAAAAAGGGAAATCGAAGAAGTTAAAATCCGTTAAAGAGTTACTAGGGATCACAATTATGGAAAGAAGTTCCTTTGAAAAAAATCCGATTGACTTTTTAGAAGCTAAAGGATATAAGGAAGTTAAAAAAGACTTAATCATTAAACTACCTAAATATAGTCTTTTTGAGTTAGAAAACGGTCGTAAACGGATGCTGGCTAGTGCCGGAGAATTACAAAAAGGAAATGAGCTGGCTCTGCCAAGCAAATATGTGAATTTTTTATATTTAGCTAGTCATTATGAAAAGTTGAAGGGTAGTCCAGAAGATAACGAACAAAAACAATTGTTTGTGGAGCAGCATAAGCATTATTTAGATGAGATTATTGAGCAAATCAGTGAATTTTCTAAGCGTGTTATTTTAGCAGATGCCAATTTAGATAAAGTTCTTAGTGCATATAACAAACATAGAGACAAACCAATACGTGAACAAGCAGAAAATATTATTCATTTATTTACGTTGACGAATCTTGGAGCTCCCGCTGCTTTTAAATATTTTGATACAACAATTGATCGTAAACGATATACGTCTACAAAAGAAGTTTTAGATGCCACTCTTATCCATCAATCCATCACTGGTCTTTATGAAACACGCATTGATTTGAGTCAGCTAGGAGGTGACTCTGGCGGGTCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTAATAATTGATTAATACCTAGGCTGCTAAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGATTGGCGAATGGGACGCGCCCTGTA GCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCATATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGCTTACAATTTAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAATTAATTCTTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATACCATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTATCGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAAATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGTTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGCCATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACGCGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATTTTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCATCAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTAACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGTCGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCCTAGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATAACACCCCTTGTATTACTGTTTATGTAAGCAGACAGTTTTATTGTTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGATTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCATGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCAAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCAATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATAAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGAGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCAGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACAACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCATGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCAAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGA

SEQ ID NO.4：

AGCTTAAGTTTAAACCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTT GAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCGACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGCGGCCGCCATGTCCGAAGTCGAGTTTTCCCATGAGTACTGGATGAGACACGCATTGACTCTCGCAAAGAGGGCTTGGGATGAACGCGAGGTGCCCGTGGGGGCAGTACTCGTGCATAACAATCGCGTAATCGGCGAAGGTTGGAATAGGCCGATCGGACGCCACGACCCCACTGCACATGCGGAAATCATGGCCCTTCGACAGGGAGGGCTTGTGATGCAGAATTATCGACTTATCGATGCGACGCTGTACGTCACGCTTGAACCTTGCGTAATGTGCGCGGGAGCTATGATTCACTCCCGCATTGGACGAGTTGTATTCGGTGCCCGCGACGCCAAGACGGGTGCCGCAGGTTCACTGATGGACGTGCTGCATCACCCAGGCATGAACCACCGGGTAGAAATCACAGAAGGCATATTGGCGGACGAATGTGCGGCGCTGTTGTCCGACTTTTTTCGCATGCGGAGGCAGGAGATCAAGGCCCAGAAAAAAGCACAATCCTCTACTGACTCTGGTGGTTCTTCTGGTGGTTCTAGCGGCAGCGAGACTCCCGGGACCTCAGAGTCCGCCACACCCGAAAGTTCTGGTGGTTCTTCTGGTGGTTCTTCCGAGGTCGAATTTTCACATGAGTATTGGATGCGACACGCCTTGACGCTCGCCAAAAGGGCGAGGGACGAACGGGAAGTTCCCGTAGGCGCCGTCCTTGTACTGAATAATCGAGTTATTGGCGAAGGTTGGAACAGGGCCATAGGACTGCATGATCCAACAGCCCATGCAGAAATCATGGCGCTCCGGCAGGGTGGCCTTGTCATGCAAAATTATAGGCTGATCGACGCGACGTTGTACGTCACCTTCGAACCTTGCGTTATGTGTGCAGGCGCTATGATACATTCAAGAATTGGGCGAGTCGTGTTTGGGGTCAGGAACGCAAAGACTGGTGCAGCCGGTTCCCTTATGGATGTGCTCCACTACCCAGGAATGAATCATCGGGTCGAGATTACAGAGGGGATACTGGCTGACGAATGCGCCGCCCTCCTGTGCTACTTCTTTCGGATGCCCAGGCAGGTGTTTAACGCACAGAAGAAAGCTCAAAGCAGTACCGACTCTGGGGGCTCTAGTGGAGGCTCCAGCGGTTCTGAGACCCCCGGCACTAGTGAATCTGCCACTCCCGAATCATCCGGGGGATCTTCAGGGGGATCTGATAAAAAGTATTCTATTGGTTTAGCCATCGGCACTAATTCCGTTGGATGGGCTGTCATAACCGATGAATACAAAGTACCTTCAAAGAAATTTAAGGTGTTGGGGAACACAGACCGTCATTCGATTAAAAAGAATCTTATCGGTGCCCTCCTATTCGATAGTGGCGAAACGGCAGAGGCGACTCGCCTGAAACGAACCGCTCGGAGAAGGTATACACGTCGCAAGAACCGAATATGTTACTTACAAGAAATTTTTAGCAATGAGATGGCCAAAGTTGACGATTCTTTCTTTCACCGTTTGGAAGAGTCCTTCCTTGTCGAAGAGGACAAGAAACATGAACGGCACCCCATCTTTGGAAACATAGTAGATGAGGTGGCATATCATGAAAAGTACCCAACGATTTATCACCTCAGAAAAAAGCTAGTTGACTCAACTGATAAAGCGGACCTGAGGTTAATCTACTTGGCTCTTGCCCATATGATAAAGTTCCGTGGGCACTTTCTCATTGAGGGTGATCTAAATCCGGACAACTCGGATGTCGACAAACTGTTCATCCAGTTAGTACAAACCTATAATCAGTTGTTTGAAGAGAACCCTATAAATGCAAGTGGCGTGGATGCGAAGGCTATTCTTAGCGCCCGCCTCTCTAAATCCCGACGGCTAGAAAACCTGATCGCACAATTACCCGGAGAGAAGAAAAATGGGTTGTTCGGTAACCTTATAGCGCTCTCACTAGGCCTGACACCAAATTTTAAGTCGAACTTCGACTTAGCTGAAGATGCCAAATTGCAGCTTAGTAAGGACACGTACGATGACGATCTCGACAATCTACTGGCACAAATTGGAGATCAGTATGCGGACTTATTTTTGGCTGCCAAAAACCTTAGCGATGCAATCCTCCTATCTGACATACTGAGAGTTAATACTGAGATTACCAAGGCGCCGTTATCCGCTTCAATGATCAAAAGGTACGATGAACATCACCAAGACTTGACACTTCTCAAGGCCCTAGTCCGTCAGCAACTGCCTGAGAAATATAAGGAAATATTCTTTGATCAGTCGAAAAACGGGTACGCAGGTTATATTGACGGCGGAGCGAGTCAAGAGGAATTCTACAAGTTTATCAAACCCATATTAGAGAAGATGGATGGGACGGAAGAGTTGCTTGTAAAACTCAATCGCGAAGATCTACTGCGAAAGCAGCGGACTTTCGACAACGGTAGCATTCCACATCAAATCCACTTAGGCGAATTGCATGCTATACTTAGAAGGCAGGAGGATTTTTATCCGTTCCTCAAAGACAATCGTGAAAAGATTGAGAAAATCCTAACCTTTCGCATACCTTACTATGTGGGACCCCTGGCCCGAGGGAACTCTCGGTTCGCATGGATGACAAGAAAGTCCGAAGAAACGATTACTCCCTGGAATTTTGAGGAAGTTGTCGATAAAGGTGCGTCAGCTCAATCGTTCATCGAGAGGATGACCAACTTTGACAAGAATTTACCGAACGAAAAAGTATTGCCTAAGCACAGTTTACTTTACGAGTATTTCACAGTGTACAATGAACTCACGAAAGTTAAGTATGTCACTGAGGGCATGCGTAAACCCGCCTTTCTAAGCGGAGAACAGAAGAAAGCAATAGTAGATCTGTTATTCAAGACCAACCGCAAAGTGACAGTTAAGCAATTGAAAGAGGACTACTTTAAGAAAATTGAATGCTTCGATTCTGTCGAGATCTCCGGGGTAGAAGATCGATTTAATGCGTCACTTGGTACGTATCATGACCTCCTAAAGATAATTAAAGATAAGGACTTCCTGGATAACGAAGAGAATGAAGATATCTTAGAAGATATAGTGTTGACTCTTACCCTCTTTGAAGATCGGGAAATGATTGAGGAAAGACTAAAAACATACGCTCACCTGTTCGACGATAAGGTTATGAAACAGTTAAAGAGGCGTCGCTATACGGGCTGGGGACGCTTGTCGCGGAAACTTATCAACGGGATAAGAGACAAGCAAAGTGGTAAAACTATTCTCGATTTTCTAAAGAGCGACGGCTTCGCCAATAGGAACTTTATGCAGCTGATCCATGATGACTCTTTAACCTTCAAAGAGGATATACAAAAGGCACAGGTTTCCGGACAAGGGGACTCATTGCACGAACATATTGCGAATCTTGCTGGTTCGCCAGCCATCAAAAAGGGCATACTCCAGACAGTCAAAGTAGTGGATGAGCTAGTTAAGGTCATGGGACGTCACAAACCGGAAAACATTGTAATCGAGATGGCACGCGAAAATCAAACGACTCAGAAGGGGCAAAAAAACAGTCGAGAGCGGATGAAGAGAATAGAAGAGGGTATTAAAGAACTGGGCAGCCAGATCTTAAAGGAGCATCCTGTGGAAAATACCCAATTGCAGAACGAGAAACTTTACCTCTATTACCTACAAAATGGAAGGGACATGTATGTTGATCAGGAACTGGACATAAACCGTTTATCTGATTACGACGTCGATCACATTGTACCCCAATCCTTTTTGAAGGACGATTCAATCGACAATAAAGTGCTTACACGCTCGGATAAGAACCGAGGGAAAAGTGACAATGTTCCAAGCGAGGAAGTCGTAAAGAAAATGAAGAACTATTGGCGGCAGCTCCTAAATGCGAAACTGATAACGCAAAGAAAGTTCGATAACTTAACTAAAGCTGAGAGGGGTGGCTTGTCTGAACTTGACAAGGCCGGATTTATTAAACGTCAGCTCGTGGAAACCCGCCAGATCACAAAGCATGTTGCCCAGATACTAGATTCCCGAATGAATACGAAATACGACGAGAACGATAAGCTGATTCGGGAAGTCAAAGTAATCACTTTAAAGTCAAAATTGGTGTCGGACTTCAGAAAGGATTTTCAATTCTATAAAGTTAGGGAGATAAATAACTACCACCATGCGCACGACGCTTATCTTAATGCCGTCGTAGGGACCGCACTCATTAAGAAATACCCGAAGCTAGAAAGTGAGTTTGTGTATGGTGATTACAAAGTTTATGACGTCCGTAAGATGATCGCGAAAAGCGAACAGGAGATAGGCAAGGCTACAGCCAAATACTTCTTTTATTCTAACATTATGAATTTCTTTAAGACGGAAATCACTCTGGCAAACGGAGAGATACGCAAACGACCTTTAATTGAAACCAATGGGGAGACAGGTGAAATCGTATGGGATAAGGGCCGGGACTTCGCGACGGTGAGAAAAGTTTTGTCCATGCCCCAAGTCAACATAGTAAAGAAAACTGAGGTGCAGACCGGAGGGTTTTCAAAGGAATCGATTCTTCCAAAAAGGAATAGTGATAAGCTCATCGCTCGTAAAAAGGACTGGGACCCGAAAAAGTACGGTGGCTTCGATAGCCCTACAGTTGCCTATTCTGTCCTAGTAGTGGCAAAAGTTGAGAAGGGAAAATCCAAGAAACTGAAGTCAGTCAAAGAATTATTGGGGATAACGATTATGGAGCGCTCGTCTTTTGAAAAGAACCCCATCGACTTCCTTGAGGCGAAAGGTTACAAGGAAGTAAAAAAGGATCTCATAATTAAACTACCAAAGTATAGTCTGTTTGAGTTAGAAAATGGCCGAAAACGGATGTTGGCTAGCGCCGGAGAGCTTCAAAAGGGGAACGAACTCGCACTACCGTCTAAATACGTGAATTTCCTGTATTTAGCGTCCCATTACGAGAAGTTGAAAGGTTCACCTGAAGATAACGAACAGAAGCAACTTTTTGTTGAGCAGCACAAACATTATCTCGACGAAATCATAGAGCAAATTTCGGAATTCAGTAAGAGAGTCATCCTAGCTGATGCCAATCTGGACAAAGTATTAAGCGCATACAACAAGCACAGGGATAAACCCATACGTGAGCAGGCGGAAAATATTATCCATTTGTTTACTCTTACCAACCTCGGCGCTCCAGCCGCATTCAAGTATTTTGACACAACGATAGATCGCAAACGATACACTTCTACCAAGGAGGTGCTAGACGCGACACTGATTCACCAATCCATCACGGGATTATATGAAACTCGGATAGATTTGTCACAGCTTGGGGGTGACTCTGGTGGTTCTCCCAAGAAGAAGAGGAAAGTCTAAA

SEQ ID NO.5：

TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTG GGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTGGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCTGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC

应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。

序列表

<110> 中山大学

<120> 一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法及其在基因编辑中的应用

<130> 2018

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 167

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu

1 5 10 15

Thr Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala

20 25 30

Val Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro

35 40 45

Ile Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg

50 55 60

Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu

65 70 75 80

Tyr Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His

85 90 95

Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly

100 105 110

Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His

115 120 125

Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu

130 135 140

Leu Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys

145 150 155 160

Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp

165

<210> 2

<211> 1763

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr

1 5 10 15

Leu Ala Lys Arg Ala Trp Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val

20 25 30

Leu Val His Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Pro Ile

35 40 45

Gly Arg His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln

50 55 60

Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Val Thr Leu Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser

85 90 95

Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Ala Arg Asp Ala Lys Thr Gly Ala

100 105 110

Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His His Pro Gly Met Asn His Arg

115 120 125

Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu

130 135 140

Ser Asp Phe Phe Arg Met Arg Arg Gln Glu Ile Lys Ala Gln Lys Lys

145 150 155 160

Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly

165 170 175

Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala Thr Pro Glu Ser Ser Gly

180 185 190

Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp

195 200 205

Met Arg His Ala Leu Thr Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu

210 215 220

Val Pro Val Gly Ala Val Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu

225 230 235 240

Gly Trp Asn Arg Ala Ile Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu

245 250 255

Ile Met Ala Leu Arg Gln Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu

260 265 270

Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala

275 280 285

Gly Ala Met Ile His Ser Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg

290 295 300

Asn Ala Lys Thr Gly Ala Ala Gly Ser Leu Met Asp Val Leu His Tyr

305 310 315 320

Pro Gly Met Asn His Arg Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp

325 330 335

Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Tyr Phe Phe Arg Met Pro Arg Gln Val

340 345 350

Phe Asn Ala Gln Lys Lys Ala Gln Ser Ser Thr Asp Ser Gly Gly Ser

355 360 365

Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Glu Thr Pro Gly Thr Ser Glu Ser Ala

370 375 380

Thr Pro Glu Ser Ser Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Asp Lys Lys Tyr

385 390 395 400

Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly Trp Ala Val Ile

405 410 415

Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys Val Leu Gly Asn

420 425 430

Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly Ala Leu Leu Phe

435 440 445

Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys Arg Thr Ala Arg

450 455 460

Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr Leu Gln Glu Ile

465 470 475 480

Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe Phe His Arg Leu

485 490 495

Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His Glu Arg His Pro

500 505 510

Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His Glu Lys Tyr Pro

515 520 525

Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser Thr Asp Lys Ala

530 535 540

Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met Ile Lys Phe Arg

545 550 555 560

Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp Asn Ser Asp Val

565 570 575

Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn Gln Leu Phe Glu

580 585 590

Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys Ala Ile Leu Ser

595 600 605

Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu Ile Ala Gln Leu

610 615 620

Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu Ile Ala Leu Ser

625 630 635 640

Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp Leu Ala Glu Asp

645 650 655

Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp Asp Leu Asp Asn

660 665 670

Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu Phe Leu Ala Ala

675 680 685

Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile Leu Arg Val Asn

690 695 700

Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met Ile Lys Arg Tyr

705 710 715 720

Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala Leu Val Arg Gln

725 730 735

Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp Gln Ser Lys Asn

740 745 750

Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln Glu Glu Phe Tyr

755 760 765

Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly Thr Glu Glu Leu

770 775 780

Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys Gln Arg Thr Phe

785 790 795 800

Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly Glu Leu His Ala

805 810 815

Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu Lys Asp Asn Arg

820 825 830

Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro Tyr Tyr Val Gly

835 840 845

Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met Thr Arg Lys Ser

850 855 860

Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val Val Asp Lys Gly

865 870 875 880

Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn Phe Asp Lys Asn

885 890 895

Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu Leu Tyr Glu Tyr

900 905 910

Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr Val Thr Glu Gly

915 920 925

Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys Lys Ala Ile Val

930 935 940

Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val Lys Gln Leu Lys

945 950 955 960

Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser Val Glu Ile Ser

965 970 975

Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr Tyr His Asp Leu

980 985 990

Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn Glu Glu Asn Glu

995 1000 1005

Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg

1010 1015 1020

Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp

1025 1030 1035 1040

Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg

1045 1050 1055

Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys

1060 1065 1070

Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe

1075 1080 1085

Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln

1090 1095 1100

Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala

1105 1110 1115 1120

Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val

1125 1130 1135

Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu

1140 1145 1150

Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly

1155 1160 1165

Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys

1170 1175 1180

Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln

1185 1190 1195 1200

Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp

1205 1210 1215

Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp

1220 1225 1230

Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp

1235 1240 1245

Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn

1250 1255 1260

Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln

1265 1270 1275 1280

Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr

1285 1290 1295

Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile

1300 1305 1310

Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln

1315 1320 1325

Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu

1330 1335 1340

Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp

1345 1350 1355 1360

Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr

1365 1370 1375

His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu

1380 1385 1390

Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr

1395 1400 1405

Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile

1410 1415 1420

Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe

1425 1430 1435 1440

Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro

1445 1450 1455

Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly

1460 1465 1470

Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn

1475 1480 1485

Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser

1490 1495 1500

Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp

1505 1510 1515 1520

Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr

1525 1530 1535

Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu

1540 1545 1550

Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser

1555 1560 1565

Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu

1570 1575 1580

Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu

1585 1590 1595 1600

Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln

1605 1610 1615

Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr

1620 1625 1630

Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu

1635 1640 1645

Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile

1650 1655 1660

Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala

1665 1670 1675 1680

Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro

1685 1690 1695

Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn

1700 1705 1710

Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg

1715 1720 1725

Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His

1730 1735 1740

Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu

1745 1750 1755 1760

Gly Gly Asp

Claims

1.一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)、将TadA:TadA*:Cas9融合蛋白、一种或多种靶向待测DNA序列的gRNA以及基因组DNA共混后进行反应；其中，所述基因组DNA包含有待测DNA序列,在所述反应中，TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和gRNA复合物切割与gRNA互补的待测DNA链，同时将非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤；

(2)、在步骤(1)反应后的体系中加入内切核酸酶V切割包含次黄嘌呤的DNA,造成DNA双链断裂；

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas9系统的效应蛋白结构域、腺苷脱氨酶结构域。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白包括CRISPR/Cas9系统的效应蛋白结构域、连接多肽、腺苷脱氨酶结构域。

4.根据权利要求2-3任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9系统的效应蛋白结构域中，效应蛋白包括但不限定于无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白，所述无切割活性或仅具有单链切割活性的Cas蛋白包括StreptococcuspyogenesCas9(SpCas9),StaphylococcusaureusCas9(SaCas9),LachnospiraceaeCpf1(LbCpf1),AcidaminococcusCpf1(AsCpf1),StreptococcusthermophilusCas9(StCas9),andNeisseriameningitidis Cas9(NmCas9)，FrancisellaCpf1(FnCpf1)中的一种或多种。

5.根据权利要求1-3任一权利要求所述的方法，其特征在于，所述的TadA:TadA*:Cas9融合蛋白中，腺苷脱氨酶TadA蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白是利用原核表达载体在细菌中表达并纯化获得的。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述反应体系为溶液反应体系，所述溶液反应体系还包含所述TadA:TadA*:Cas9融合蛋白将所述非互补链上的腺嘌呤转变成次黄嘌呤所需的缓冲液组分。

9.一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的试剂盒在权利要求1所述方法中的应用，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1提供的靶向目的DNA的gRNA序列、TadA:TadA*:Cas9融合蛋白和/或EndoV核酸酶。

10.如权利要求1所述一种基于全基因组测序检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应的方法在检测腺嘌呤单碱基编辑系统脱靶效应中的应用。