CN114990093A - 氨基酸序列小的蛋白序列mini rfx-cas13d - Google Patents
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Abstract
一种蛋白序列MINI RFX‑CAS13D，属于生物工程技术领域。本发明的目的是提供一种编辑活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX‑CAS13D。本发明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX‑CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX‑CAS13D蛋白是RFX‑CAS13D的人工缺失版本。本发明能精确靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤，在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别是涉及一种基因编辑技术。
背景技术
CRISPR/Cas13是细菌和古细菌为抵御外源病毒或质粒入侵而进化的一种获得性免
疫系统。在CRISPR/Cas13系统中，crRNA与Cas13蛋白形成复合体后，Cas13蛋白被激活发生结构改变，crRNA会与靶RNA序列形成互补结构，Cas13蛋白行使切割RNA的功能，使RNA发生断裂损伤。
除了基础科研外，CRISPR/Cas13还具有广泛的临床应用前景。利用CRISPR/Cas13系统做基因治疗时，需要把Cas13和crRNA导入到体内。目前做基因治疗最有效的递送载体是AAV病毒。但是AAV病毒包装的DNA一般不超过4.5kb。RFX Cas13D因为活性高得到广泛应用。但是RFX Cas13D蛋白有987个氨基酸，加上crRNA和启动子，虽然能够包装到AAV病毒中，但是对于连接其它RNA修饰的蛋白却不够，限制了其在临床中的应用。为了解决这个问题，几种小的Cas13被发明出来，包括CAS13X；CAS13BT1；CAS13BT2；CAS13BT3，但是这些Cas13编辑效率低，难以广泛应用。寻找Cas13蛋白小，编辑活性高。
发明内容
本发明的目的是提供一种编辑活性高、CAS13D蛋白小的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。
本发明氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。
本发明 MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体构成CRISPR/Cas13系统，能精确定位靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤。
本发明缺失片段的选择：
步骤一：根据CAS13D家族蛋白的结构解析文章对蛋白各结构域、功能域以及重要motif进行分析；
步骤二：根据分析结果进行适当判断并进行合理推测；
步骤三：合成推测的蛋白序列，并用实验验证，得到结果，验证推测；
步骤四：根据步骤一到三的结果进行缺失片段的调整，筛选出最优结果，即敲除效率与RFX CAS13D相当、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。
本发明MINI RFX-CAS13D氨基酸序列合成步骤如下：
步骤一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列对应的核苷酸序列；
步骤二：将合成序列构建到骨架载体pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1
上，即将合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列将骨架载体上的CAS13bt1的核苷酸序列进行替换，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；
步骤三：转化、挑菌、测序，确定目标序列已正确构建到骨架载体上，CMV-MINIRFX-CAS13D的测序结果与我们的预期构建序列一致，得到目标质粒；
步骤四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D质粒转化进DH5α感受态大肠杆菌，涂板，37℃ 12h, 挑取单克隆至摇菌管，37℃ 12h 200rpm，将摇菌管中的液体倒入200ml 液体LB培养基 ，37℃ 12h，用大提质粒试剂盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D质粒，完成质粒的扩增。
本发明MINI RFX-CAS13D/crRNA复合体：
（1）MINI RFX-CAS13D必须与crRNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体才能发挥RNA切割功能；
（2）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：crRNA负责与RNA进行碱基配对，若RNA能够与crRNA完成碱基配对，将会激活MINI RFX-CAS13D；
（3）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：若RNA不能够与crRNA完成碱基配对，RNA会被MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体释放，不会激活MINI RFX-CAS13D；MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体会继续与另一条RNA进行碱基配对；
（4）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：MINI RFX-CAS13D蛋白负责在RNA与crRNA完成碱基配对后，对RNA进行切割；
（5）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体不仅能够切割外源RNA，也能切割内源RNA。
本发明MINI RFX-CAS13D/crRNA切割内源RNA的具体步骤及效率检测方法：
步骤一：将质粒CMV-MINI RFX-CAS13D和质粒hU6-crRNA按照转染试剂HieffTrans TM Liposomal Transfection Reagent的说明书剂量要求转染至HEK293细胞中，细胞已在6-8小时前在六孔板铺匀，转染时的细胞密度在80%；
步骤二： 在细胞培养箱内37℃ 5%CO2 培养， 24h时更换新鲜细胞培养液， 48h收取细胞；
步骤三：提取细胞RNA，RT-QPCR检测Target RNA的量，确定MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体的敲除效率。
本发明能精确靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤，在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
附图说明
图1是CRISPR/MINI RFX-CAS13D基因编辑系统切割靶向DNA示意图。其中，灰色椭圆形表示MINI RFX-CAS13D蛋白；
图2为质粒CMV_MINI RFX-CAS13D图谱示意图。其中，包括CMV增强子、CMV启动子、T7启动子、SV40 NLS、MINI RFX-CAS13D、NLS、bGH poly(A)等元件；
图3为内源性靶位点RNA序列通过RNA提取、RT-QPCR后的敲除结果。
具体实施方式
本发明具体为CRISPR/ MINI RFX CAS13D基因编辑系统及其应用。本发明基因编辑系统为MINI RFX-CAS13D蛋白与crRNA形成的复合物，能精确靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的删减版本。MINI RFX-CAS13D蛋白包含682个氨基酸，所述MINI RFX-CAS13D蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述crRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
本发明CRISPR/Cas13基因编辑系统，基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑，所述CRISPR/Cas13系统为MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体，能精确定位靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤；所述MINI RFX-CAS13D蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列；所述crRNA具有SEQID NO:2所示的核苷酸序列，或者基于SEQ ID NO:2改造的crRNA序列。
本发明细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物细胞和植物细胞；所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo 大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40 转化的猴肾CVI 系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3 细胞、人U2-OS 骨肉瘤细胞、人A5413细胞、人K562 细胞、人HEK2133 细胞、人HEK2133T 细胞、人HCT116 细胞或人MCF-7细胞或TRI 细胞。
本发明MINI RFX-CAS13D蛋白包括无切割活性。或切割活性的MINI RFX-CAS13D蛋白。
本发明精确定位RNA序列包括crRNA中的3’端30bp序列与靶向RNA序列能形成碱基互补配对结构。
本发明MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体能精确靶向RNA序列指MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体可以识别并结合特定RNA序列，或指将与MINI RFX-CAS13D蛋白融合的其他蛋白或特异性识别crRNA的蛋白带至靶向RNA的位置。
本发明MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体或与MINI RFX-CAS13D蛋白融合的其他蛋白或特异性识别crRNA的蛋白可以对靶向RNA区域进行修饰和调控，所述修饰和调控包括基因转录水平的调控、RNA甲基化调控、RNA乙酰化修饰、组蛋白乙酰化修饰、单碱基转换器或染色质成像追踪。
本发明单碱基转换器包括碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、胞嘧啶到胸腺嘧啶、胞嘧啶到尿嘧啶或其它碱基之间的转换。
本发明CRISPR/MINI RFX-CAS13D基因编辑系统在细胞中进行基因编辑的方法，包括通过MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA的复合物识别定位靶向RNA，对RNA进行编辑；最后检测编辑效率；具体步骤为：
（1）合成人源化的MINI RFX-CAS13D基因序列；并克隆到表达载体上，得到CMV_MINI RFX-CAS13D；
（2）合成crRNA对应的寡核苷酸单链RNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒hU6_BsaI的BsaI酶切位点，得到hU6-crRNA；
（3）将表达MINI RFX-CAS13D蛋白、crRNA的载体分别递送至含有靶位点的细胞中；
（4）将编辑后的靶位点进行PCR扩增，一代测序或者二代测序检测编辑效率。
一、MINI RFX-CAS13D 氨基酸序列
MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。
缺失片段的选择：
步骤一：根据CAS13D家族蛋白的结构解析文章对蛋白各结构域、功能域以及重要motif进行分析；
步骤二：根据分析结果进行适当判断并进行合理推测；
步骤三：合成推测的蛋白序列，并用实验验证，得到结果，验证推测；
步骤四：根据步骤一到三的结果进行缺失片段的调整，筛选出最优结果，即敲除效率与RFX CAS13D相当、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。
MINI RFX-CAS13D蛋白包含682个氨基酸，氨基酸序列如下面所示：（人工序列）
MINI RFX-CAS13D氨基酸序列由金斯瑞生物科技有限公司合成，具体步骤如下：
步骤一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列对应的核苷酸序列；
步骤二：将合成序列构建到骨架载体pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1
上，即将合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列将骨架载体上的CAS13bt1的核苷酸序列进行替换，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；
步骤三：转化、挑菌、测序，确定目标序列已正确构建到骨架载体上，CMV-MINIRFX-CAS13D的测序结果与我们的预期构建序列一致，得到目标质粒。
步骤四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D质粒转化进DH5α感受态大肠杆菌，涂板，37℃ 12h, 挑取单克隆至摇菌管，37℃ 12h 200rpm，将摇菌管中的液体倒入200ml 液体LB培养基 ，37℃ 12h，用大提质粒试剂盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D质粒，完成质粒的扩增。
二、MINI RFX-CAS13D蛋白
1. MINI RFX-CAS13D蛋白保留了CAS13D蛋白家族的HEPN结构域切割位点，因此，MINI RFX-CAS13D蛋白能够对RNA进行特异性切割；
2. MINI RFX-CAS13D蛋白保留了CAS13D蛋白家族的RNA加工特性的序列特性，因此，MINI RFX-CAS13D蛋白能够对pre-RNA加工形成成熟的crRNA;
3. MINI RFX-CAS13D蛋白的缺失片段均避免了与crRNA的结合的蛋白通道，因此，MINI RFX-CAS13D蛋白能够有效结合crRNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体；同时，由于Target RNA与CAS13D蛋白的结合也在crRNA 所在的蛋白通道，因此，MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体能够有效结合Target RNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA/TargetRNA三元复合体；
4. MINI RFX-CAS13D蛋白与RFX-CAS13D蛋白具有相同的功能：能够特异性靶向并切割RNA；
5. MINI RFX-CAS13D蛋白与RFX-CAS13D蛋白特异性靶向并切割RNA的效率在多个位点验证均相当；
6. MINI RFX-CAS13D包含682个氨基酸，RFX-CAS13D包含967个氨基酸；MINI RFX-CAS13D的大小约为2/3个RFX-CAS13D；
7. MINI RFX-CAS13D由于其较小的长度，能够轻易地被包装、递送至体内进行基因治疗；
8. MINI RFX-CAS13D由于其较小的长度，能够容纳更多功能蛋白的组合，发挥复合功能；因此，能够完成更多的功能；同样，复合功能蛋白能够轻易地被包装、递送至体内进行基因治疗；
三、MINI RFX-CAS13D/crRNA复合体
1、MINI RFX-CAS13D必须与crRNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体才能发挥RNA切割功能；
2、MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：crRNA负责与RNA进行碱基配对，若RNA能够与crRNA完成碱基配对，将会激活MINI RFX-CAS13D；
3、MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：若RNA不能够与crRNA完成碱基配对，RNA会被MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体释放，不会激活MINI RFX-CAS13D；MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体会继续与另一条RNA进行碱基配对；
4、MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：MINI RFX-CAS13D蛋白负责在RNA与crRNA完成碱基配对后，对RNA进行切割；
5、MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体不仅能够切割外源RNA，也能切割内源RNA；
以下为MINI RFX-CAS13D/crRNA切割内源RNA的具体步骤及效率检测方法：
步骤一：将质粒CMV-MINI RFX-CAS13D和质粒hU6-crRNA按照转染试剂HieffTrans TM Liposomal Transfection Reagent的说明书剂量要求转染至HEK293细胞中，细胞已在6-8小时前在六孔板铺匀，转染时的细胞密度在80%；
步骤二： 在细胞培养箱内37℃ 5%CO2 培养， 24h时更换新鲜细胞培养液， 48h收取细胞；
步骤三：提取细胞RNA，RT-QPCR检测Target RNA的量，确定MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体的敲除效率。
以下对本发明做进一步详细说明：
本发明提供的CRISPR/Cas13基因编辑系统，为MINI RFX-CAS13D蛋白与crRNA形成的复合物，能精确靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤；所述基因编辑为在细胞中或体外进行基因编辑；MINI RFX-CAS13D蛋白小，为682个氨基酸，所述MINI RFX-CAS13D蛋白具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，所述crRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。本发明在基因编辑领域中具有广泛的应用前景。
本发明中，所述细胞包括真核细胞和原核细胞；所述真核生物细胞包括哺乳动物
细胞和植物细胞。
本发明中，所述哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞、幼仓鼠肾细胞、小鼠Sertoli细胞、小鼠乳腺瘤细胞、buffalo大鼠肝细胞、大鼠肝瘤细胞、由SV40转化的猴肾CVI系、猴肾细胞、犬肾细胞、人宫颈癌细胞、人肺细胞、人肝细胞、HIH/3T3细胞、人U2-OS骨肉瘤细胞、人A549细胞、人K562细胞、人HEK293细胞、人HEK293T细胞、人HCT116细胞或人MCF-7细胞或TRI细胞。
本发明中，所述CRISPR/ MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的删减版本。MINIRFX-CAS13D蛋白和single CRISPR RNA(crRNA)共同作用实现基因编辑。
本发明中，所述MINI RFX-CAS13D属于黄瘤瘤胃球菌属 (RUMINOCCOCUSFLAVEFACIENS XPD3002)。
本发明中，所述MINI RFX-CAS13D蛋白包括无切割活性或具有切割活性的MINIRFX-CAS13D蛋白。
本发明中，所述精确定位RNA序列包括crRNA中的3’端30bp序列与靶向RNA序列能形成碱基互补配对结构。
本发明中，所述靶向RNA序列为：
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN (SEQ ID NO:2)
本发明中，所述MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体能精确靶向RNA序列指MINIRFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体可以识别并结合特定RNA序列，或指将与MINI RFX-CAS13D蛋白融合的其他蛋白或特异性识别crRNA的蛋白带至靶向RNA的位置。
本发明中，所述单碱基转换器包括但不限定于碱基腺嘌呤到鸟嘌呤、或胞嘧啶到胸腺嘧啶、或胞嘧啶到尿嘧啶、或其它碱基之间的转换。
本发明提供的基因编辑系统编辑活性与之前的Cas13相比相当，但其大小相较于Cas13具有明显的优势。
本发明通过基因合成、分子克隆、细胞转染、PCR产物深度测序、生物信息学分析等
技术检测CRISPR/MINI RFX-CAS13D系统的编辑效率。
本发明提供的CRISPR/MINI RFX-CAS13D基因编辑系统能够在细胞中进行基因编辑，包括通过MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA的复合物识别定位靶向RNA，对RNA进行编辑；最后检测编辑效率。
具体步骤为：
（1）合成MINI RFX-CAS13D基因序列；并克隆到表达载体上，得到CMV_ MINI RFX-CAS13D；
（2）合成crRNA对应的寡核苷酸单链RNA，即Oligo-F和Oligo-R序列，退火后连接至质粒hU6_BsaI的BsaI酶切位点，得到hU6-crRNA；
（3）将表达MINI RFX-CAS13D蛋白、crRNA的载体递送至含有靶位点的细胞中；
（4）将编辑后的靶位点进行PCR扩增，一代测序或者二代测序检测编辑效率。
本发明中，可以根据具体需要，递送至细胞的CRISPR/MINI RFX-CAS13D系统包括但不限定于表达MINI RFX-CAS13D蛋白或crRNA的质粒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒载体或RNA或MINI RFX-CAS13D蛋白。
本领域技术人员可以理解的是，碱基N表示A、T、C或G四种碱基中的任何一种。
进一步地，步骤(3)中，所述递送的手段包括但不限定于脂质体、阳离子多聚物、纳米颗粒、多功能信封式纳米以及病毒载体。
进一步地，步骤(3)中，所述细胞包括但不限定于人细胞、动物细胞、植物细胞、细菌细胞、真菌细胞。
进一步地，步骤(2)中，所述crRNA具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，或与SEQID NO:2所示的核苷酸序列至少80％相同的核苷酸序列，或基于核苷酸序列进行的修饰，修饰包括但不限定于磷酸化、缩短、加长、硫化或甲基化。
更具体地，在一个具体实施例中，合成crRNA对应的寡核苷酸单链DNA序列，即Oligo-F 和Oligo-R，该寡核苷酸单链DNA序列如下：
Oligo-F AAACAGCATGACATCACTGAGCCCACT，(SEQ ID NO:3)
Oligo-R AAAAAGTGGGCTCAGTGATGTCATGCT。(SEQ ID NO:4).
更具体地，在一个具体实施例中，本领域技术人员可以理解的是，Oligo-F和
Oligo-R需要进行退火变为双链DNA，退火反应体系为10μL 100μM oligo-F，10μL100μM oligo-R，5μL Buffer3 10* ,25μL 水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序；退火程序如下：95℃_5min，室温℃_30min，-20℃保存。
更具体地，在一个具体实施例中，所述质粒U6-crRNA需要经过BsaI限制性内切酶(NEB)进行线性化处理。
更具体地，在一个具体实施例中，所述Oligo-F和Oligo-R退火后的产物与线性化处理后的U6-crRNA骨架载体通过DNA连接酶进行连接反应。
更具体地，在一个具体实施例中，将连接产物转化至感受态细胞后，经Sanger测序
验证正确的克隆，然后提取质粒备用。
更具体地，在一个具体实施例中，步骤(3)中的细胞为HEK293T，其包含的靶位点具
有 SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列:
AGTGGGCTCAGTGATGTCATGCT
更具体地，在一个具体实施例中，步骤 (3) 中的递送手段为脂质体，包括但不限于Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent、Lipofectamine™ 3000、Lipofectamine™ 2000。
更具体地，在本发明第一方面的一个具体实施例中，所述实验步骤(4)中PCR的模
板为编辑后的HEK293T cDNA。
更具体地，在一个具体实施例中，步骤(4)中PCR扩增的引物序列为：QPCR引物
CTCAGCCTGCACCATGC SEQ ID NO:6
TGGAAATGGTCGTCATAGAAATACA SEQ ID NO:7
在本发明一具体实施例中，CRISPR/MINI RFX-CAS13D系统能够在细胞中进行基因编
辑，所述方法包括如下步骤：
1、构建质粒CMV_MINI RFX-CAS13D
步骤(1)，根据MINI RFX-CAS13D基因，下载其氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。
步骤(2)，将MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列进行密码子优化，获得了MINI RFX-CAS13D在人细胞中高表达的编码序列。
步骤(3)，将获得基因MINI RFX-CAS13D的编码序列在公司进行基因合成，并构建至
CMV骨架质粒上，得到质粒CMV_MINI RFX-CAS13D，如图2所示。
2、制备线性化质粒U6-crRNA
步骤(1)，用BasI限制性内切酶将质粒U6-crRNA进行酶切线性化，酶切体系：30μg质粒CMV_MINI RFX-CAS13D，20μL 10xCutSmart缓冲液，3μLBasI内切酶，水补足至200μl，37℃水浴过夜。
步骤(2)，将酶切后的产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳，120V电泳30分钟。
步骤(3)，切除2903bp大小的DNA片段，用胶回收试剂盒依据厂家提供的步骤进行回收，最终用超纯水进行洗脱。
步骤(4)，将回收的线性化质粒CMV_MINI RFX-CAS13D用NanoDrop测定DNA浓度，备用或置于-20℃进行长期保存。
3、构建质粒hU6-crRNA
步骤(1)，设计crRNA序列；
步骤(2) ，在设计的crRNA序列对用的正义链和反义链上分别加上线性化质粒hU6-crRNA两侧对应的粘性末端序列，并在公司合成两条寡核苷酸单链；
DNA，具体序列为：
Oligo-F AAACAGCATGACATCACTGAGCCCACT，(SEQ ID NO:3)
Oligo-R AAAAAGTGGGCTCAGTGATGTCATGCT。(SEQ ID NO:4)；
步骤(3) ，寡核苷酸单链DNA进行退火变为双链DNA，退火反应体系：10μL 100μMoligo-F，10μL 100μM oligo-R，5μL Buffer3 10* ,25μL 水，震荡混匀后，放置于PCR仪中运行退火程序；退火程序如下：95℃_5min，室温℃_30min， -20℃保存；
步骤(4)，将退火后的产物与线性化质粒hU6-crRNA在DNA连接酶的作用下依据产品提供的步骤进行连接；
步骤(5)，取10μL连接产物进行化学感受态转化，将生长的细菌克隆进行Sanger测序验证；
步骤(6)，将测序验证连接正确的克隆摇菌，提取质粒hU6-crRNA备用。
4、转染表达MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA的质粒
步骤(1)，第0天，根据转染所需，将含有crRNA靶向位点的HEK293T细胞系在6孔板进行铺板，细胞密度约80％左右，靶位点序列如SEQ ID NO:5所示。
步骤(2)，第1天，进行转染，转染体系如下，
i.取1.5μg待转染质粒CMV_MINI RFX-CAS13D和1.5μg待转染质粒hU6-crRNA加入至125μlOpti-MEM培养基中，轻轻吹打混匀；
ⅱ.取8μgHieff TransTM Liposomal Transfection Reagent加入至125μlOpti-MEM培养基中，轻轻吹打混匀，室温静置5min；
ⅲ.将稀释的Hieff TransTM Liposomal Transfection Reagent和稀释的质粒进行混合，轻轻吹打混匀，室温静置 20min，然后加入至待转染细胞的培养基中。
步骤(3)，将细胞置于37℃，5％的CO2培养箱中继续培养。
5、内源位点效率验证
步骤(1)，收集编辑2天后的HEK293T细胞，用RNA试剂盒依据产品提供的步骤提取RNA。
步骤(2)，将提取的 RNA 进行反转录，用反转录试剂盒依据产品提供的步骤进行反转录，反应体系如下：
条件 42℃ 3 min。
步骤(3)，进行RT-QPCR， QPCR引物如SEQ ID NO:6-SEQ ID NO:7所示，反应体系如下：
Q-RTPCR运行程序如下：
MINI RFX-CAS13D核苷酸序列：（人工序列）
2046
atgatcgaaaaaaaaaagtccttcgccaagggcatgggcgtgaagtccacactcgtgtccggctccaaagtgtacatgacaaccttcgccgaaggcagcgacgccttcagccatcctaagggctacgccgtggtggctaacaaccctctgtatacaggacccgtccagcaggatatgctcggcctgaaggaaactctggaaaagaggtacttcggcgagagcgctgatggcaatgacaatatttgtatccaggtgatccataacatcctggacattgaaaaaatcctcgccgaatacattaccaacgccgcctacgccgtcaacaatatctccggcctggatgagggcagaaattacatcatcaattacggcaacgaatgctatgacattctggccctcctgagcggactgaggcactgggtggtccataacaacgaagaagagtccaggatctccaggacctggctctacaacctcgataagaacctcgacaacgaatacatctccaccctcaactacctctacgacaggatcaccaatgagctgaccaactccttctccaagaactccgccgaacaatatttcagattcagcattatgaaagagcagaaaaacctcggattcaatatcaccaagctcagggaagtgatgctggacaggaaggatatgtccgagatcaggaaaaatcataaggtgttcgactccatcaggaccaaggtctacaccatgatggactttgtgatttataggtattacatcgaagaggagaaggatatctttgtgattaacctgaggggctccttcaacgacgaccagaaggatgccctctactacgatgaagctaatagaatttggagaaagctcgaaaatatcatgcacaacatcaaggaatttaggggaaacaagacaagagagtataagaagaaggacgcccctagactgcccagaatcctgcccgctggccgtgatgtttccgccttcagcaaactcatgtatgccctgaccatgttcctggatggcaaggagatcaacgacctcctgaccaccctgattaataaattcgataacatccagagcttcctgaaggtgatgcctctcatcggagtcaacgctaagttcgtggaggaatacgcctttttcaaagactccgccaagatcgccgatgagctgaggctgatcaagtccttcgctagaatgggagaacctattgccgatgccaggagggccatgtatatcgacgccatccgtattttaggaaccaagctcaagaaaggcaagcacggcatgagaaatttcattattaataacgtgatcagcaataaaaggttccactacctgatcagatacggtgatcctgcccacctccatgagatcgccaaaaacgaggccgtggtgaagttcgtgctcggcaggatcgctgacatccagaaaaaacagggccagaacggcaagaaccagatcgacaggtactacgaaacttgtatccaattcgacaagaaaaggagcgtcattgaggacaccggcagggaaaacgccgagagggagaagtttaaaaagatcatcagcctgtacctcaccgtgatctaccacatcctcaagaatattgtcaatatcaacgccaggtacgtcatcggattccattgcgtcgagcgtgatgctcaactgtacaaggagaaaggctacgacatcaatctcaagaaactggaagagcagattaacagggagaaggccaaaaccgccctgaacgcctacctgaggaacaccaagtggaatgtgatcatcagggaggacctcctgagaattgacaacaagacatgtaccctgttcagaaacaaggccgtccacctggaagtggccaggtatgtccacgcctatatcaacgacattaatgacgagaagaagtacaacgataggctcctgaaactgctgtgtgtgcctttcggctactgtatccccaggtttaagaacctgagcatcgaggccctgttcgataggaacgaggccgccaagttcgacaaggagaaaaagaaggtgtccggcaattcc 。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2046
<212> DNA
<213> 肠道细菌黄化瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens )
<400> 1
atgatcgaaa aaaaaaagtc cttcgccaag ggcatgggcg tgaagtccac actcgtgtcc 60
ggctccaaag tgtacatgac aaccttcgcc gaaggcagcg acgccttcag ccatcctaag 120
ggctacgccg tggtggctaa caaccctctg tatacaggac ccgtccagca ggatatgctc 180
ggcctgaagg aaactctgga aaagaggtac ttcggcgaga gcgctgatgg caatgacaat 240
atttgtatcc aggtgatcca taacatcctg gacattgaaa aaatcctcgc cgaatacatt 300
accaacgccg cctacgccgt caacaatatc tccggcctgg atgagggcag aaattacatc 360
atcaattacg gcaacgaatg ctatgacatt ctggccctcc tgagcggact gaggcactgg 420
gtggtccata acaacgaaga agagtccagg atctccagga cctggctcta caacctcgat 480
aagaacctcg acaacgaata catctccacc ctcaactacc tctacgacag gatcaccaat 540
gagctgacca actccttctc caagaactcc gccgaacaat atttcagatt cagcattatg 600
aaagagcaga aaaacctcgg attcaatatc accaagctca gggaagtgat gctggacagg 660
aaggatatgt ccgagatcag gaaaaatcat aaggtgttcg actccatcag gaccaaggtc 720
tacaccatga tggactttgt gatttatagg tattacatcg aagaggagaa ggatatcttt 780
gtgattaacc tgaggggctc cttcaacgac gaccagaagg atgccctcta ctacgatgaa 840
gctaatagaa tttggagaaa gctcgaaaat atcatgcaca acatcaagga atttagggga 900
aacaagacaa gagagtataa gaagaaggac gcccctagac tgcccagaat cctgcccgct 960
ggccgtgatg tttccgcctt cagcaaactc atgtatgccc tgaccatgtt cctggatggc 1020
aaggagatca acgacctcct gaccaccctg attaataaat tcgataacat ccagagcttc 1080
ctgaaggtga tgcctctcat cggagtcaac gctaagttcg tggaggaata cgcctttttc 1140
aaagactccg ccaagatcgc cgatgagctg aggctgatca agtccttcgc tagaatggga 1200
gaacctattg ccgatgccag gagggccatg tatatcgacg ccatccgtat tttaggaacc 1260
aagctcaaga aaggcaagca cggcatgaga aatttcatta ttaataacgt gatcagcaat 1320
aaaaggttcc actacctgat cagatacggt gatcctgccc acctccatga gatcgccaaa 1380
aacgaggccg tggtgaagtt cgtgctcggc aggatcgctg acatccagaa aaaacagggc 1440
cagaacggca agaaccagat cgacaggtac tacgaaactt gtatccaatt cgacaagaaa 1500
aggagcgtca ttgaggacac cggcagggaa aacgccgaga gggagaagtt taaaaagatc 1560
atcagcctgt acctcaccgt gatctaccac atcctcaaga atattgtcaa tatcaacgcc 1620
aggtacgtca tcggattcca ttgcgtcgag cgtgatgctc aactgtacaa ggagaaaggc 1680
tacgacatca atctcaagaa actggaagag cagattaaca gggagaaggc caaaaccgcc 1740
ctgaacgcct acctgaggaa caccaagtgg aatgtgatca tcagggagga cctcctgaga 1800
attgacaaca agacatgtac cctgttcaga aacaaggccg tccacctgga agtggccagg 1860
tatgtccacg cctatatcaa cgacattaat gacgagaaga agtacaacga taggctcctg 1920
aaactgctgt gtgtgccttt cggctactgt atccccaggt ttaagaacct gagcatcgag 1980
gccctgttcg ataggaacga ggccgccaag ttcgacaagg agaaaaagaa ggtgtccggc 2040
aattcc 2046
Claims (6)
1.一种氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，MINI RFX-CAS13D蛋白是RFX-CAS13D的人工缺失版本。
2.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D蛋白和crRNA复合体构成CRISPR/Cas13系统，能精确定位靶向RNA序列，并产生切割，使RNA断裂损伤。
3.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：缺失片段的选择：
步骤一：根据CAS13D家族蛋白的结构解析文章对蛋白各结构域、功能域以及重要motif进行分析；
步骤二：根据分析结果进行适当判断并进行合理推测；
步骤三：合成推测的蛋白序列，并用实验验证，得到结果，验证推测；
步骤四：根据步骤一到三的结果进行缺失片段的调整，筛选出最优结果，即敲除效率与RFX CAS13D相当、氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D。
4.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D氨基酸序列合成步骤如下：
步骤一：合成MINI RFX-CAS13D的氨基酸序列对应的核苷酸序列；
步骤二：将合成序列构建到骨架载体pAB1678 CMV-HIVNES-GS-Cas13bt1
上，即将合成MINI RFX-CAS13D的核苷酸序列将骨架载体上的CAS13bt1的核苷酸序列进行替换，得到CMV-MINI RFX-CAS13D；
步骤三：转化、挑菌、测序，确定目标序列已正确构建到骨架载体上，CMV-MINI RFX-CAS13D的测序结果与我们的预期构建序列一致，得到目标质粒；
步骤四：吸取1μl CMV-MINI RFX-CAS13D质粒转化进DH5α感受态大肠杆菌，涂板，37℃12h, 挑取单克隆至摇菌管，37℃ 12h 200rpm，将摇菌管中的液体倒入200ml 液体LB培养基 ，37℃ 12h，用大提质粒试剂盒提取CMV-MINI RFX-CAS13D质粒，完成质粒的扩增。
5.根据权利要求1所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D/crRNA复合体：
（1）MINI RFX-CAS13D必须与crRNA形成MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体才能发挥RNA切割功能；
（2）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：crRNA负责与RNA进行碱基配对，若RNA能够与crRNA完成碱基配对，将会激活MINI RFX-CAS13D；
（3）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：若RNA不能够与crRNA完成碱基配对，RNA会被MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体释放，不会激活MINI RFX-CAS13D；MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体会继续与另一条RNA进行碱基配对；
（4）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体中：MINI RFX-CAS13D蛋白负责在RNA与crRNA完成碱基配对后，对RNA进行切割；
（5）MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体不仅能够切割外源RNA，也能切割内源RNA。
6.根据权利要求5所述的氨基酸序列小的蛋白序列MINI RFX-CAS13D，其特征在于：MINI RFX-CAS13D/crRNA切割内源RNA的具体步骤及效率检测方法：
步骤一：将质粒CMV-MINI RFX-CAS13D和质粒hU6-crRNA按照转染试剂Hieff Trans TMLiposomal Transfection Reagent的说明书剂量要求转染至HEK293细胞中，细胞已在6-8小时前在六孔板铺匀，转染时的细胞密度在80%；
步骤二： 在细胞培养箱内37℃ 5%CO2 培养， 24h时更换新鲜细胞培养液， 48h收取细胞；
步骤三：提取细胞RNA，RT-QPCR检测Target RNA的量，确定MINI RFX-CAS13D/crRNA二元复合体的敲除效率。
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