CN113564145A

CN113564145A - 用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用

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Publication number: CN113564145A
Application number: CN202110626828.8A
Authority: CN
Inventors: 李潇飒; 孙晓东; 刘舒; 段晓悦; 彭凤
Original assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Current assignee: Shanghai First Peoples Hospital
Priority date: 2021-06-04
Filing date: 2021-06-04
Publication date: 2021-10-29
Anticipated expiration: 2041-06-04
Also published as: CN113564145B

Abstract

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用。该融合蛋白包含a)Cas9酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。其能够在各种真核生物的基因组中实现高效率、高精度、可调控的碱基编辑。并能够在不引入缺失和插入的情况下，在各种真核生物的基因组中实施高精度高功效的C‑T碱基编辑。

Description

用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体而言，涉及一种用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用。

背景技术

CRISPR/Cas系统以其方便、高效的优势成为近些年来应用最广的基因编辑工具。在sgRNA的引导下，Cas蛋白到达靶位点处切割产生双链断裂，联合后续的DNA修复过程，借助于非同源末端连接实现基因敲除，或给予一段DNA模板，借助于同源重组实现基因修复。

然而同源重组介导的基因修复效率普遍不高，且会引入大量的插入与缺失。将胞嘧啶脱氨酶与Cas蛋白融合而成的胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor，CBE)可以在不产生双链断裂的情况下在内源基因组上引入高效率的C到T(G到A)的突变，是进行基因突变纠正的有效工具，也成为基因治疗研究的热门选择。然而最常用的治疗用载体腺相关病毒AAV会造成其携带的碱基编辑器在体内的长期表达，理论上会增加全基因组内随机脱靶的风险。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明将Destablizing Domain(DD)与CBE融合表达构建了调控型的CBE，在不加外源小分子药物情况下，CBE表达产物被立即降解，理论上不引起编辑和脱靶；加入外源小分子药物，可以控制CBE表达时间，引起靶位点处有效碱基编辑的同时，理论上可以大大降低随机脱靶效应，提高临床治疗的安全性。

具体的：

本发明的第一方面涉及融合蛋白，其包含a)Cas酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。

本发明的第二方面涉及一种组合物，其包含如上所述融合蛋白、与所述Cas酶域结合的引导RNA以及trimethoprim。

本发明的第三方面涉及宿主细胞，其含有如上所述的组合物，并且其基因组中含有所述引导RNA所识别的靶序列。

本发明的第三方面涉及分离的核酸，其表达如上所述融合蛋白。

本发明的第四方面涉及载体，其含有如上所述的核酸，以及任选的引导RNA。

本发明的第五方面涉及改变基因产物表达的方法，其包括：

将如上所述的核酸，或如上所述载体导入宿主细胞并在trimethoprim存在的条件下表达出所述融合蛋白并与引导RNA配合以改变基因产物的表达。

本发明的第六方面涉及递送系统，其包括i)如上所述融合蛋白、或如上所述的核酸，或如上所述载体；ii)引导RNA以及iii)递送媒介物。

本发明的第七方面涉及药物组合物，其包含如上所述的递送系统以及药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所提供的融合表达Destablizing Domain与CBE的方法，可以在各种真核生物的基因组中实现高效率、高精度、可调控的碱基编辑。能够在不引入缺失和插入的情况下，在各种真核生物的基因组中实施高精度高功效的C-T碱基编辑。

本发明理论上可用于在体基因治疗，为CBE更加安全的应用于临床提供了新的方法和思路。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明所提供的调控型CBE结构示意图；A)双载体表达pCMV-Target-AID-ND结构示意图；B)双载体表达pCMV-Target-AID-CD结构示意图；C)双载体表达pCMV-Target-AID-NCD结构示意图；

图2为本发明一个实施例中调控型CBE在RNF2位点上引起了高效的碱基编辑；双载体表达的Target-AID、Target-AID-ND、Target-AID-CD和Target-AID-NCD在含有TMP(TMP+)和不含TMP(TMP-)的条件下在RNF2靶位点内所有胞嘧啶上引起的碱基编辑结果；EDITSITE，主要编辑位点；

图3为本发明一个实施例中调控型CBE在HEK293_SITE2位点上引起了高效的碱基编辑；双载体表达的Target-AID、Target-AID-ND、Target-AID-CD和Target-AID-NCD在含有TMP(TMP+)和不含TMP(TMP-)的条件下在HEK293_SITE2靶位点内所有胞嘧啶上引起的碱基编辑结果；EDIT SITE，主要编辑位点；

图4为本发明一个实施例中调控型CBE在HEK293_SITE3位点上引起了高效的碱基编辑；双载体表达的Target-AID、Target-AID-ND、Target-AID-CD和Target-AID-NCD在含有TMP(TMP+)和不含TMP(TMP-)的条件下在HEK293_SITE3靶位点内所有胞嘧啶上引起的碱基编辑结果；EDIT SITE，主要编辑位点。

具体实施方式

现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

本发明涉及融合蛋白，其包含a)Cas酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。

容易理解，上述a)～d)均是蛋白全长或具有功能的蛋白片段，例如Cas酶具有切合靶核酸的能力，UGI包含能够抑制尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)活性的域。

在一些实施方式中，所述的融合蛋白从N端到C端，其选自以下融合方式中的任意一种：

(1)Cas-DD-CDA-UGI；

(2)Cas-CDA-DD-UGI；

(3)Cas-DD-CDA-DD-UGI；

其中“-”代表任选的连接肽。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个。

在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽；

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自Gly、Ser、Pro、Ala以及Glu中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(GGGGS)n、(EAAAK)n、(GGGS)n、(GGS)n、(GS)n或(G)n，其中n选自1，2，3，4，5或6。

所述Cas酶域为具有DNA或RNA切割活性的Cas酶域，例如Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas11、Cas12、Cas13，其同源物、或其修饰形式。优选为II、V、VI型CRISPR系统，更优选为Cas9、Cas12、Cas13。

在一些实施方式中，所述Cas酶域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

在一些实施方式中，胞嘧啶脱氨酶域是所述活化诱导的脱氨酶(AID)。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶域是来自载脂蛋白B mRNA-编辑复合物(APOBEC)家族脱氨酶的脱氨酶，例如选自APOBEC1脱氨酶、APOBEC2脱氨酶、APOBEC3A脱氨酶、APOBEC3B脱氨酶、APOBEC3C脱氨酶、APOBEC3D脱氨酶、APOBEC3F脱氨酶、APOBEC3G脱氨酶和APOBEC3H脱氨酶。

在一些实施方案中，脱氨酶来自人、黑猩猩、大猩猩、猴、牛、狗、大鼠或小鼠。在一些实施方案中，脱氨酶来自人。

在一些实施方式中，所述胞嘧啶脱氨酶域是来自海七鳃鳗(Petromyzonmarinus)的胞苷脱氨酶1(pmCDA1)。进一步的，所述pmCDA1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

在一些实施方式中，所述不稳定结构域(DD)的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示。

在一些实施方式中，所述尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

根据本发明的再一方面，还涉及一种组合物，其包含如上所述融合蛋白、与所述Cas9酶域结合的引导RNA以及trimethoprim。

根据本发明的再一方面，还涉及宿主细胞，其含有如上所述的组合物，并且其基因组中含有所述引导RNA所识别的靶序列。

在一些实施方式中，所述的宿主细胞为真核细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为真菌细胞。

在一些实施方式中，所述细胞为植物细胞或动物细胞；在一些国家中，细胞是不具有全能性的细胞，例如，不是受精卵、胚胎、生殖细胞。或者是不能发育为可以借助光合作用，以水、二氧化碳和无机盐等无机物合成碳水化合物、蛋白质来维系生存的植物。

在一些实施方式中，所述细胞为非人的哺乳动物细胞。

在一些实施方案中，所述细胞非限制性地包括牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡等。

在一些实施方式中，所述细胞为人类细胞。

在一些实施方案中，所述细胞衍生自细胞系。用于组织培养的多种细胞系是本领域已知的。细胞系的实例包括但不限于C8161，CCRF-CEM，MOLT，mIMCD-3，NHDF，HeLa-S3，Huh1，Huh4，Huh7，HUVEC，HASMC，HEKn，HEKa，MiaPaCell，Panel，PC-3，TF1，CTLL-2，C1R，Rat6，CV1，RPTE，A10，T24，J82，A375，ARH-77，Calu1，SW480，SW620，SKOV3，SK-UT，CaCo2，P388D1，SEM-K2，WEHI-231，HB56，TIB55，Jurkat，J45.01，LRMB，Bcl-1，BC-3，IC21，DLD2，Raw264.7，NRK，NRK-52E，MRC5，MEF，Hep G2，HeLa B，HeLa T4，COS，COS-1，COS-6，COS-M6A，BS-C-1猴肾上皮细胞，BALB/3T3小鼠胚胎成纤维细胞，3T3 Swiss，3T3-L1，132-d5人胎儿成纤维细胞；小鼠成纤维细胞，293-T，3T3，721，9L，A2780，A2780ADR，A2780cis，A172，A20，A253，A431，A-549，ALC，B16，B35，BCP-1细胞，BEAS-2B，bEnd.3，BHK-21，BR 293，BxPC3，C3H-10T1/2，C6/36，Cal-27，CHO，CHO-7，CHO-IR，CHO-K1，CHO-K2，CHO-T，CHO Dhfr-/-，COR-L23，COR-L23/CPR，COR-L23/5010，COR-L23/R23，COS-7，COV-434，CMLT1，CMT，CT26，D17，DH82，DU145，DuCaP，EL4，EM2，EM3，EMT6/AR1，EMT6/AR10.0，FM3，H1299，H69，HB54，HB55，HCA2，HEK-293，HeLa，Hepa1c1c7，HL-60，HMEC，HT-29，Jurkat，JY细胞，K562细胞，Ku812，KCL22，KG1，KYO1，LNCap，Ma-MeI 1-48，MC-38，MCF-7，MCF-10A，MDA-MB-231，MDA-MB-468，MDA-MB-435，MDCK II，MDCK II，MOR/0.2R，MONO-MAC 6，MTD-1A，MyEnd，NCI-H69/CPR，NCI-H69/LX10，NCI-H69/LX20，NCI-H69/LX4，NIH-3T3，NALM-1，NW-145，OPCN/OPCT细胞系，Peer，PNT-1A/PNT 2，RenCa，RIN-5F，RMA/RMAS，Saos-2细胞，Sf-9，SkBr3，T2，T-47D，T84，THP1细胞系，U373，U87，U937，VCaP，Vero细胞，WM39，WT-49，X63，YAC-1，YAR及其转基因品种。细胞系可从本领域技术人员已知的多种来源获得，例如保藏中心。

根据本发明的再一方面，还涉及分离的核酸，其表达如上所述融合蛋白。

在一些实施方式中，所述核酸还具有核定位序列(NLS)。优选NLS与Cas酶核酸相连。

核酸可以为DNA或RNA，根据需要，核酸是密码子优化的，用于在所述细胞中更为高效地表达。

在一些实施方式中，所述核酸由至少两段独立的核酸片段A和B组成，并包含用于表达intein内含肽的核酸片段；

其中片段A中，SEQ ID NO：2所示核酸序列的3'端与用于表达intein内含肽N端的核酸片段的核酸片段连接；

片段B中，SEQ ID NO：3所示核酸序列的5'端与用于表达intein内含肽C端的核酸片段的核酸片段连接；

当所述核酸在真核细胞表达时，所述intein内含肽可以被切除，并且片段A和片段B连接得到所述融合蛋白。

优选的，用于表达intein内含肽N端的核酸片段如SEQ ID NO：4所示，用于表达intein内含肽C端的核酸片段如SEQ ID NO：5所示。

上述两个片段核酸能够满足AAV包装大小限制条件，理论上可用于在体基因治疗，提高基因治疗安全性。

根据本发明的再一方面，还涉及载体，其含有如上所述的核酸，以及任选的引导RNA。

术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。在一些实施方式中，本发明所述载体、转录物中还可以包含筛选所用的基因(例如抗生素抗性基因)、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。

载体可以包含一个或多个单元，例如由多个质粒组成，特别优选至少包含2个质粒，分别包装上述片段A和片段B，优选还包含具有引导RNA的质粒。

在一些实施方式中，所述载体中包含AAV载体。其可以为任何血清型，例如AAV1～AAV12。

根据本发明的再一方面，还涉及改变基因产物表达的方法，其包括：

根据本发明的再一方面，还涉及递送系统，其包括i)如上所述融合蛋白、或如上所述的核酸，或如上所述载体；ii)引导RNA以及iii)递送媒介物。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于在细胞或靶组织中引入核酸。这种方法可用于将编码CRISPR系统组分的核酸施用到培养中或宿主生物体中的细胞。非病毒载体递送系统包括DNA质粒，RNA，裸核酸和与递送媒介物(例如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加或整合的基因组。

非病毒递送核酸的方法包括脂转染，核转染，微注射，生物射弹，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或脂质:核酸缀合物，裸DNA，人工病毒粒子和DNA的试剂增强摄取。

病毒递送核酸的方法可以直接施用到所述主体或可以用于体外处理细胞，且可以任选地将修饰的细胞施用到所述主体。用载体转染方法可以在宿主基因组中整合，通常导致插入的转基因的长期表达。另外，已经在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

根据本发明的再一方面，还涉及药物组合物，其包含如上所述的递送系统以及药学上可接受的载体。

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。

本发明首先公开了一种利用融合Destablizing Domain与胞嘧啶碱基编辑器的方法实现了对碱基编辑的实时调控。通过将Destablizing Domain，七鳃鳗来源的胞嘧啶脱氨酶pmCDA与nCas9(D10A)同框融合表达得到了nCas9-DD-pmCDA、nCas9-pmCDA-DD以及包含两拷贝DD的nCas9-DD-pmCDA-DD共三种可调控的CBE；同时为便于AAV包装，本发明进一步在nCas9蛋白713-714位氨基酸处融合intein内含肽(可从前体蛋白中切除并将两侧肽段连接起来成为成熟蛋白质)，得到了Target-AID-N(nCas9^1-713-intein-N)、Target-AID-C(intein-C-nCas9^714-1368-pmCDA)、Target-AID-ND-C(intein-C-nCas9^714-1368-DD-pmCDA)、Target-AID-CD-C(intein-C-nCas9^714-1368-pmCDA-DD)和Target-AID-NCD-C(intein-C-nCas9^714-1368-DD-pmCDA-DD)四个表达载体。将sgRNA表达载体、Target-AID-N和Target-AID-C(Target-AID-ND-C表达载体、Target-AID-CD-C或Target-AID-NCD-C)共转染真核动物细胞，24小时后，加入10uM小分子抑制剂TMP抑制CBE降解，使其在靶位点基因组DNA发生C-T碱基编辑，PCR扩增靶位点上下游后，Sanger测序检测靶位点处发生的C-T碱基编辑效率。和原始的Target-AID相比，三个新系统在TMP存在的情况下，在靶基因组位点上引起了有效的编辑效率(多数略低于、少数高于原始Target-AID效率)，在TMP不存在的条件下，基本不引起有效编辑。其中Target-AID-CD(Target-AID-N和Target-AID-CD-C组合)引起的编辑效率最高，Target-AID-NCD(Target-AID-N和Target-AID-NCD-C组合)背景最低。

实施例1

人基因组RNF2位点利用双载体融合表达Destablizing Domain与CBE实施可调控的高精度高功效的碱基编辑

1.实验材料

1)试剂

引物合成自上海生工生物有限公司；限制性内切酶、DNA连接酶、高保真DNA聚合酶

购自NEB公司；质粒重组试剂盒Clone

购自Vazyme公司；pcDNA3.1_pCMV-nCas-PmCDA1-ugi pH1-gRNA来自addgene网站；

DNA胶回收试剂盒购自Corning公司；转染试剂

LTX，

购自Thermo Fisher公司；QuickExtract^TM基因组DNA抽提试剂。

2)细胞株

人胎肾细胞HEK293FT培养在加入了10％胎牛血清(Gbico)，1％双抗的DMEM培养基(Gibco)中贴壁培养。

2.实验方法

2.1pCMV-Target-AID表达质粒的构建

分别使用以下引物1和引物2以pCMV-nCas-PmCDA1-ugi-pH1-gRNA(addgene#79620)为模板进行PCR，以引物3和引物4以pCMV-BE3为模版进行PCR得到pCMV空载体，将上述PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

重组至pCMV表达载体中，得到pCMV-Target-AID表达质粒。

2.2pCMV-Target-AID-N、pCMV-Target-AID-C、pCMV-Target-AID-ND-C、pCMV-Target-AID-CD-C和pCMV-Target-AID-NCD-C表达质粒的构建

利用以下引物1和引物5以pCMV-Target-AID为模版进行PCR得到nCas9^1-713片段，引物6和引物7以工业合成的intein整合素蛋白为模板进行PCR得到intein-N，将上述2个PCR片段用质粒重组试剂盒Clone

重组至pCMV载体中得到Target-AID-N的表达质粒pCMV-nCas9^1-713-intein-N；

利用以下引物8和引物9以intein整合素蛋白为模板进行PCR得到intein-C，引物10和引物11以Target-AID为模版进行PCR得到nCas9^714-1368，将两段PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

重组至pCMV载体中得到Target-AID-C的表达质粒pCMV-intein-C-nCas9^714-1368-pmCDA1；

利用以下引物12和引物13以工业合成的DHFR为模版进行PCR，将PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

重组至Target-AID-C表达载体中PmCDA1的N端，得到Target-AID-ND-C表达质粒pCMV-intein-C-nCas9^714-1368-DD-pmCDA；

利用以下引物14和引物15以工业合成的DHFR为模版进行PCR，将PCR产物用质粒重组试剂盒Clone

重组至Target-AID-C表达载体中PmCDA1的C端，得到Target-AID-CD-C表达质粒pCMV-intein-C-nCas9^714-1368-pmCDA-DD。

重组至Target-AID-ND-C表达载体中PmCDA1的C端，得到Target-AID-NCD-C表达质粒pCMV-intein-C-nCas9^714-1368-DD-pmCDA-DD。

2.3sgRNA表达质粒的构建

分别将以下引物：16和17进行退火，将退火产物连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene#51133)后，得到靶向人基因组RNF2位点的sgRNA表达质粒psgRNF2。

表1引物

质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下:

dNTP 4μl；5×PS Buffer 10μl；Forward Primer 1μl；Reverse Primer 1μl；Template 10ng；PrimeSTAR(Takara)0.5μl；RNase-free water补至50μl

PCR程序如下:95℃,3min；95℃,10sec,58℃,15sec,72℃,1min,30循环；72℃,3min

2.4真核细胞转染

将psgRNF2、pCMV-Target-AID-N和pCMV-Target-AID-C(pCMV-Target-AID-ND-C,pCMV-Target-AID-CD-C或pCMV-Target-AID-NCD-C)质粒分别按照0.34μg:0.5μg:0.5μg的比例混合入250μl opti-MEM中,震荡混匀后分别加入1.34μl

plus试剂，涡旋混匀后分别加入2.68μl

LTX转染试剂，轻柔吹打混匀，室温放置5分钟后加入含有500μl DMEM+10％FBS培养基和十五万HEK293T细胞的24孔板中进行转染。转染24h后换含有10μM TMP和2μg/ml puromycine抗生素的新鲜培养基，继续培养48小时。

2.5基因组DNA抽提和PCR扩增

QuickExtractTM试剂抽提转染后HEK293FT细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA分别利用以下引物18和19进行PCR扩增，并利用

DNA胶回收试剂对PCR产物进行切胶回收，后续对其进行一代测序，检测基因编辑效率。

表2引物

编号	引物名	序列
			18	RNF2-G1F	CTCTGTGTCAGAACATGCTGG
19	RNF2-G1R	CACCACTGTTCACCCAGTAC

扩增基因组DNA使用PCR体系如下:

dNTP 4μl；5×PS buffer 10μl；Forward Primer 1μl；Reverse Primer 1μl；Template 10ng；PrimeSTAR(Takara)0.5μl；RNase-free water补至50μl。

PCR程序如下:95℃,3min；95℃,10sec,58℃,15sec,72℃,1min,30循环；72℃,3min。

实施例2

人基因组HEK293_SITE2位点利用双载体融合表达Destablizing Domain与CBE实施可调控的高精度高功效的碱基编辑

1.实验材料

1)试剂

同实施例1。

2)细胞株

同实施例1。

2.实验方法

2.1pCMV-Target-AID表达质粒的构建

同实施例1。

2.3sgRNA表达质粒的构建

分别将以下引物：20和21进行退火，将退火产物连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene#51133)后，得到靶向人基因组HEK293_SITE2位点的sgRNA表达质粒psgHEK2。

表3引物

编号	引物名	序列
			20	HEK293_site 2-FOR	ACCGGAACACAAAGCATAGACTGC
21	HEK293_site 2-REV	AAACGCAGTCTATGCTTTGTGTTC

质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下:

2.4真核细胞转染

将psgHEK2、pCMV-Target-AID-N和pCMV-Target-AID-C(pCMV-Target-AID-ND-C,pCMV-Target-AID-CD-C或pCMV-Target-AID-NCD-C)质粒分别按照0.34μg:0.5μg:0.5μg的比例混合入250μl opti-MEM中,震荡混匀后分别加入1.34μl

plus试剂，涡旋混匀后分别加入2.68μl

2.5基因组DNA抽提和PCR扩增

QuickExtract^TM试剂抽提转染后HEK293FT细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA分别利用以下引物22和23进行PCR扩增，并利用

表4引物

编号	引物名	序列
			22	HEK293_2-G1F	ATCCACAGCAACACCCTCTC
23	HEK293_2-G1R	CTTCACAGGCTACCCCCTAA

扩增基因组DNA使用PCR体系如下:

实施例3

人基因组HEK293_SITE3位点利用双载体融合表达Destablizing Domain与CBE实施可调控的高精度高功效的碱基编辑

1.实验材料

1)试剂

同实施例1。

2)细胞株

同实施例1。

2.实验方法

2.1pCMV-Target-AID表达质粒的构建

同实施例1。

2.3sgRNA表达质粒的构建

分别将以下引物：24和25进行退火，将退火产物连入经限制性内切酶BsaI消化后的sgRNA表达载体pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin(addgene#51133)后，得到靶向人基因组HEK293_SITE3位点的sgRNA表达质粒psgHEK3。

表5引物

编号	引物名	序列
			24	HEK293_site 3-FOR	ACCGGGCCCAGACTGAGCACGTGA
25	HEK293_site 3-REV	AAACTCACGTGCTCAGTCTGGGCC

质粒构建实验中扩增各种片段使用PCR体系如下:

2.4真核细胞转染

将psgHEK3、pCMV-Target-AID-N和pCMV-Target-AID-C(pCMV-Target-AID-ND-C,pCMV-Target-AID-CD-C或pCMV-Target-AID-NCD-C)质粒分别按照0.34μg:0.5μg:0.5μg的比例混合入250μl opti-MEM中,震荡混匀后分别加入1.34μl

plus试剂，涡旋混匀后分别加入2.68μl

2.5基因组DNA抽提和PCR扩增

QuickExtract^TM试剂抽提转染后HEK293FT细胞的基因组DNA，将抽提得到的基因组DNA分别利用以下引物26和27进行PCR扩增，并利用

表6引物

扩增基因组DNA使用PCR体系如下:

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 上海市第一人民医院

<120> 用于胞嘧啶碱基编辑的融合蛋白及其应用

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1368

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

485 490 495

Asn Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser

500 505 510

Leu Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys

515 520 525

Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

530 535 540

Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

565 570 575

Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

580 585 590

Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr

610 615 620

Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala

625 630 635 640

His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr

645 650 655

Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp

660 665 670

Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe

675 680 685

Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe

690 695 700

Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu

705 710 715 720

His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly

725 730 735

Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly

740 745 750

Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln

755 760 765

Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile

770 775 780

Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro

785 790 795 800

Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu

805 810 815

Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg

820 825 830

Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys

835 840 845

Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg

850 855 860

Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys

865 870 875 880

Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys

885 890 895

Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp

900 905 910

Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

915 920 925

Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp

930 935 940

Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser

945 950 955 960

Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

965 970 975

Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val

980 985 990

Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe

995 1000 1005

Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys

1010 1015 1020

Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser

1025 1030 1035 1040

Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu

1045 1050 1055

Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile

1060 1065 1070

Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser

1075 1080 1085

Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly

1090 1095 1100

Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile

1105 1110 1115 1120

Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser

1125 1130 1135

Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly

1140 1145 1150

Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile

1155 1160 1165

Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala

1170 1175 1180

Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys

1185 1190 1195 1200

Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser

1205 1210 1215

Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr

1220 1225 1230

Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser

1235 1240 1245

Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His

1250 1255 1260

Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val

1265 1270 1275 1280

Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys

1285 1290 1295

His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu

1300 1305 1310

Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp

1315 1320 1325

Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp

1330 1335 1340

Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile

1345 1350 1355 1360

Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1365

<210> 2

<211> 2139

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

atggacaaga agtactccat tgggctcgct atcggcacaa acagcgtcgg ttgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

gtcgtggata agggggcctc tgcccagtcc ttcatcgaaa ggatgactaa ctttgataaa 1500

aatctgccta acgaaaaggt gcttcctaaa cactctctgc tgtacgagta cttcacagtt 1560

tataacgagc tcaccaaggt caaatacgtc acagaaggga tgagaaagcc agcattcctg 1620

tctggagagc agaagaaagc tatcgtggac ctcctcttca agacgaaccg gaaagttacc 1680

gtgaaacagc tcaaagaaga ctatttcaaa aagattgaat gtttcgactc tgttgaaatc 1740

agcggagtgg aggatcgctt caacgcatcc ctgggaacgt atcacgatct cctgaaaatc 1800

attaaagaca aggacttcct ggacaatgag gagaacgagg acattcttga ggacattgtc 1860

ctcaccctta cgttgtttga agatagggag atgattgaag aacgcttgaa aacttacgct 1920

catctcttcg acgacaaagt catgaaacag ctcaagaggc gccgatatac aggatggggg 1980

cggctgtcaa gaaaactgat caatgggatc cgagacaagc agagtggaaa gacaatcctg 2040

gattttctta agtccgatgg atttgccaac cggaacttca tgcagttgat ccatgatgac 2100

tctctcacct ttaaggagga catccagaaa gcacaagtt 2139

<210> 3

<211> 1965

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

tctggccagg gggacagtct tcacgagcac atcgctaatc ttgcaggtag cccagctatc 60

aaaaagggaa tactgcagac cgttaaggtc gtggatgaac tcgtcaaagt aatgggaagg 120

cataagcccg agaatatcgt tatcgagatg gcccgagaga accaaactac ccagaaggga 180

cagaagaaca gtagggaaag gatgaagagg attgaagagg gtataaaaga actggggtcc 240

caaatcctta aggaacaccc agttgaaaac acccagcttc agaatgagaa gctctacctg 300

tactacctgc agaacggcag ggacatgtac gtggatcagg aactggacat caatcggctc 360

tccgactacg acgtggatca tatcgtgccc cagtcttttc tcaaagatga ttctattgat 420

aataaagtgt tgacaagatc cgataaaaat agagggaaga gtgataacgt cccctcagaa 480

gaagttgtca agaaaatgaa aaattattgg cggcagctgc tgaacgccaa actgatcaca 540

caacggaagt tcgataatct gactaaggct gaacgaggtg gcctgtctga gttggataaa 600

gccggcttca tcaaaaggca gcttgttgag acacgccaga tcaccaagca cgtggcccaa 660

attctcgatt cacgcatgaa caccaagtac gatgaaaatg acaaactgat tcgagaggtg 720

aaagttatta ctctgaagtc taagctggtc tcagatttca gaaaggactt tcagttttat 780

aaggtgagag agatcaacaa ttaccaccat gcgcatgatg cctacctgaa tgcagtggta 840

ggcactgcac ttatcaaaaa atatcccaag cttgaatctg aatttgttta cggagactat 900

aaagtgtacg atgttaggaa aatgatcgca aagtctgagc aggaaatagg caaggccacc 960

gctaagtact tcttttacag caatattatg aattttttca agaccgagat tacactggcc 1020

aatggagaga ttcggaagcg accacttatc gaaacaaacg gagaaacagg agaaatcgtg 1080

tgggacaagg gtagggattt cgcgacagtc cggaaggtcc tgtccatgcc gcaggtgaac 1140

atcgttaaaa agaccgaagt acagaccgga ggcttctcca aggaaagtat cctcccgaaa 1200

aggaacagcg acaagctgat cgcacgcaaa aaagattggg accccaagaa atacggcgga 1260

ttcgattctc ctacagtcgc ttacagtgta ctggttgtgg ccaaagtgga gaaagggaag 1320

tctaaaaaac tcaaaagcgt caaggaactg ctgggcatca caatcatgga gcgatcaagc 1380

ttcgaaaaaa accccatcga ctttctcgag gcgaaaggat ataaagaggt caaaaaagac 1440

ctcatcatta agcttcccaa gtactctctc tttgagcttg aaaacggccg gaaacgaatg 1500

ctcgctagtg cgggcgagct gcagaaaggt aacgagctgg cactgccctc taaatacgtt 1560

aatttcttgt atctggccag ccactatgaa aagctcaaag ggtctcccga agataatgag 1620

cagaagcagc tgttcgtgga acaacacaaa cactaccttg atgagatcat cgagcaaata 1680

agcgaattct ccaaaagagt gatcctcgcc gacgctaacc tcgataaggt gctttctgct 1740

tacaataagc acagggataa gcccatcagg gagcaggcag aaaacattat ccacttgttt 1800

actctgacca acttgggcgc gcctgcagcc ttcaagtact tcgacaccac catagacaga 1860

aagcggtaca cctctacaaa ggaggtcctg gacgccacac tgattcatca gtcaattacg 1920

gggctctatg aaacaagaat cgacctctct cagctcggtg gagac 1965

<210> 4

<211> 306

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 4

tgtctggctg gcgatactct cattaccctg gccgatggac gacgagtgcc tattagagaa 60

ctggtgtcac agcagaattt ttccgtgtgg gctctgaatc ctcagactta ccgcctggag 120

agggctagag tgagtagagc tttctgtacc ggcatcaaac ctgtgtaccg cctcaccact 180

agactgggga gatccattag ggccactgcc aaccaccgat ttctcacacc tcagggctgg 240

aaacgagtcg atgaactcca gcctggagat tacctggctc tgcctaggag aatccctact 300

gcctcc 306

<210> 5

<211> 156

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

atggcggcgg cgtgcccgga actgcgtcag ctggcgcaga gcgatgtgta ttgggatccg 60

attgtgagca ttgaaccgga tggcgtggaa gaagtgtttg atctgaccgt gccgggcccg 120

cataactttg tggcgaacga tattattgcg cataac 156

<210> 6

<211> 208

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 6

Met Thr Asp Ala Glu Tyr Val Arg Ile His Glu Lys Leu Asp Ile Tyr

1 5 10 15

Thr Phe Lys Lys Gln Phe Phe Asn Asn Lys Lys Ser Val Ser His Arg

20 25 30

Cys Tyr Val Leu Phe Glu Leu Lys Arg Arg Gly Glu Arg Arg Ala Cys

35 40 45

Phe Trp Gly Tyr Ala Val Asn Lys Pro Gln Ser Gly Thr Glu Arg Gly

50 55 60

Ile His Ala Glu Ile Phe Ser Ile Arg Lys Val Glu Glu Tyr Leu Arg

65 70 75 80

Asp Asn Pro Gly Gln Phe Thr Ile Asn Trp Tyr Ser Ser Trp Ser Pro

85 90 95

Cys Ala Asp Cys Ala Glu Lys Ile Leu Glu Trp Tyr Asn Gln Glu Leu

100 105 110

Arg Gly Asn Gly His Thr Leu Lys Ile Trp Ala Cys Lys Leu Tyr Tyr

115 120 125

Glu Lys Asn Ala Arg Asn Gln Ile Gly Leu Trp Asn Leu Arg Asp Asn

130 135 140

Gly Val Gly Leu Asn Val Met Val Ser Glu His Tyr Gln Cys Cys Arg

145 150 155 160

Lys Ile Phe Ile Gln Ser Ser His Asn Gln Leu Asn Glu Asn Arg Trp

165 170 175

Leu Glu Lys Thr Leu Lys Arg Ala Glu Lys Trp Arg Ser Glu Leu Ser

180 185 190

Ile Met Ile Gln Val Lys Ile Leu His Thr Thr Lys Ser Pro Ala Val

195 200 205

<210> 7

<211> 159

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 7

Met Ile Ser Leu Ile Ala Ala Leu Ala Val Asp Tyr Val Ile Gly Met

1 5 10 15

Glu Asn Ala Met Pro Trp Asn Leu Pro Ala Asp Leu Ala Trp Phe Lys

20 25 30

Arg Asn Thr Leu Asn Lys Pro Val Ile Met Gly Arg His Thr Trp Glu

35 40 45

Ser Ile Gly Arg Pro Leu Pro Gly Arg Lys Asn Ile Ile Leu Ser Ser

50 55 60

Gln Pro Ser Thr Asp Asp Arg Val Thr Trp Val Lys Ser Val Asp Glu

65 70 75 80

Ala Ile Ala Ala Cys Gly Asp Val Pro Glu Ile Met Val Ile Gly Gly

85 90 95

Gly Arg Val Ile Glu Gln Phe Leu Pro Lys Ala Gln Lys Leu Tyr Leu

100 105 110

Thr His Ile Asp Ala Glu Val Glu Gly Asp Thr His Phe Pro Asp Tyr

115 120 125

Glu Pro Asp Asp Trp Glu Ser Val Phe Ser Glu Phe His Asp Ala Asp

130 135 140

Ala Gln Asn Ser His Ser Tyr Cys Phe Glu Ile Leu Glu Arg Arg

145 150 155

<210> 8

<211> 84

<212> PRT

<213> artificial sequence

<400> 8

Met Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu

1 5 10 15

Val Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val

20 25 30

Ile Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp

35 40 45

Glu Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu

50 55 60

Tyr Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys

65 70 75 80

Ile Lys Met Leu

Claims

1.融合蛋白，其包含a)Cas酶域；b)不稳定结构域(DD)；c)胞嘧啶脱氨酶域(CDA)以及d)尿嘧啶糖苷酶抑制剂(UGI)域。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，从N端到C端，其选自以下融合方式中的任意一种：

(1)Cas-DD-CDA-UGI；

(2)Cas-CDA-DD-UGI；

(3)Cas-DD-CDA-DD-UGI；

其中“-”代表任选的连接肽。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，所述Cas酶域为Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Cas11、Cas12、Cas13中的任一种。

4.根据权利要求3所述的融合蛋白，所述Cas酶域的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

5.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，胞嘧啶脱氨酶域是所述活化诱导的脱氨酶(AID)。

6.根据权利要求5所述的融合蛋白，所述胞嘧啶脱氨酶域是来自海七鳃鳗(Petromyzonmarinus)的胞苷脱氨酶1(pmCDA1)。

7.组合物，其包含权利要求1～6任一项所述融合蛋白、与所述Cas酶域结合的引导RNA以及trimethoprim。

8.宿主细胞，其含有权利要求7所述的组合物，并且其基因组中含有所述引导RNA所识别的靶序列。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其为真核细胞。

10.分离的核酸，其表达权利要求1～6任一项所述融合蛋白。

11.根据权利要求10所述核酸，其由至少两段独立的核酸片段A和B组成，并包含用于表达intein内含肽的核酸片段；

12.载体，其含有权利要求10或11所述的核酸，以及任选的引导RNA。

13.根据权利要求12所述的载体，所述载体中包含AAV载体。

14.改变基因产物表达的方法，其包括：

将权利要求10或11所述的核酸，或权利要求12或13所述载体导入宿主细胞并在trimethoprim存在的条件下表达出所述融合蛋白并与引导RNA配合以改变基因产物的表达。

15.递送系统，其包括i)权利要求1～6任一项所述融合蛋白、或权利要求10或11所述的核酸，或权利要求12或13所述载体；ii)引导RNA以及iii)递送媒介物。

16.药物组合物，其包含权利要求15所述的递送系统以及药学上可接受的载体。