CN116217733A - 编辑碱基的融合蛋白及其应用 - Google Patents

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刘明耀
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Abstract

本发明公开了一种编辑碱基的融合蛋白及其应用。所述融合蛋白的N端至C端依次包括TadA8e片段和Cas9n片段，所述TadA8e片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cas9n片段为具有单链切割活性的Cas9蛋白片段；所述融合蛋白还包括Rad51片段，所述Rad51片段与所述Cas9n片段相邻并位于所述Cas9n片段的N端或C端；所述Rad51片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的编辑腺嘌呤的融合蛋白可以有效提高近PAM区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口；本发明的编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白有效提高了A/C同时编辑效率。

Description

编辑碱基的融合蛋白及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种编辑碱基的融合蛋白及其应用。本发明还涉及编码所述编辑碱基的融合蛋白的多核苷酸，包含所述多核苷酸的重组表达载体，包含前述融合蛋白、多核苷酸或重组表达载体的碱基编辑系统及药物组合物。
背景技术
自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，改变了传统的基因操作手段。2016年4月，David Liu实验室首次报导了基于胞嘧啶脱氨酶与CRISPR/Cas9融合的可在DNA上实现C到T或G到A的CBE单碱基编辑工具。2017年10月，David Liu实验室再次报导了基于胞嘧啶脱氨酶与CRISPR/Cas9融合的可在DNA上实现A到G或T到C的ABE单碱基编辑工具。
单碱基基因编辑技术，已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复、疾病动物模型制作、基因治疗。其中，不同改进版本的CBE，如提高效率的CBEmax、能识别特定序列的eA3A-BE3、缩窄窗口的YE1-BE3、拓宽窗口的BE-PLUS、提高靶向靠近PAM区编辑效率的hyCBE等。而对于ABE而言，虽然也有提高效率的ABEmax、缩窄窗口的ABE7.10F148A，但其它版本的改进进展缓慢。提高靶向靠近PAM区编辑效率的ABE，由于腺苷脱氨酶兼容性差的原因，超高活性的ABE未见报道。另外，基于胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶两种脱氨酶与CRISPR/Cas9融合的双功能碱基编辑器A&C-BEmax，由于腺苷脱氨酶的活性有所损失，导致其两种碱基同时编辑的效率低，限制了A&C-BEmax的广泛应用。
目前ABE在靠近PAM区编辑效率低下。另外，基于胞嘧啶脱氨酶、腺苷脱氨酶两种脱氨酶与CRISPR/Cas9融合的双功能碱基编辑器A&C-BEmax，其A/C两种碱基同时编辑的效率最高为30％，效率仍然较低。一定程度上限制了ABE和A&C-BEmax的广泛应用。
因此，开发一种通用的超高活性的ABE和A&C-BEmax也是本领域的迫切需要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中缺少高的近PAM区编辑效率的腺嘌呤碱基编辑器以及缺少高的同时编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器的不足，提供一种编辑碱基的融合蛋白及其应用。本发明的融合蛋白不仅可以有效提高近PAM区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口；还有效提高了A/C同时编辑效率。
发明人依据自己的先前研究策略，在现有的腺嘌呤碱基编辑器中融合Rad51的DNA结合结构域(Rad51 DBD)，经过不同Rad51 DBD的融合位点和腺嘌呤碱基编辑器的筛选尝试，发现Rad51 DBD与ABEmax进行融合，几乎失去A到G的编辑效率；而Rad51DBD与ABE8e进行融合，则在特定融合位点融合可以得到超高活性的腺嘌呤碱基编辑器，有效提高近PAM区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口。此外，采用相似的策略在编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器(A&C-BEmax)中融合Rad51 DBD，其A/C同时编辑效率并未得到有效提高；因此，发明人尝试将腺嘌呤脱氨酶进行改进(将TadA-TadA*换成TadA8e)，发现其A/C同时编辑效率得到了有效提高，进一步融合Rad51 DBD，获得了具有超高活性的编辑腺嘌呤和胞嘧啶的碱基编辑器。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供一种编辑腺嘌呤的融合蛋白，所述融合蛋白的N端至C端依次包括TadA8e片段和Cas9n片段，所述TadA8e片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cas9n片段为具有单链切割活性的Cas9蛋白片段；
所述融合蛋白还包括Rad51片段，所述Rad51片段与所述Cas9n片段相邻并位于所述Cas9n片段的N端或C端；所述Rad51片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明中，所述Rad51片段为Rad51的DNA结合结构域(DNA Binding Domain)，所述Rad51为来源于人的具有DNA断裂修复的蛋白质。
在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括核定位信号片段，所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的N端和/或C端。
在本发明一些具体实施方案中，所述核定位信号片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中，所述核定位信号是指促进蛋白质进入细胞核(例如通过核转运)的氨基酸序列，为本领域公知。
在本发明一些实施方案中，所述Cas9n片段的来源选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9或其突变体组成的组。
在本发明一些较佳实施方案中，所述Cas9n片段的来源为SpCas9。
在本发明一些具体实施方案中，所述Cas9n片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中，所述Cas9n片段是Cas9蛋白具有核酸剪切功能的片段或其突变体。优选地，所述Cas9蛋白可以是来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9蛋白(SpCas9)、金黄色葡萄球菌(Streptococcus aureus)的Cas9蛋白(SaCas9)、脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitides)的Cas9蛋白(NmeCas9)、嗜热链球菌(Streoticiccystgerniogukys)的Cas9蛋白(StCas9)或空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的Cas9蛋白(CjCas9)。
本发明中，TadA8e是腺嘌呤脱氨酶，能够移除腺嘌呤分子中的氨基。
在本发明一些具体实施方案中，所述融合蛋白的所述核定位信号片段位于融合蛋白的N端和C端，所述Cas9n片段的来源为SpCas9。
本发明的第二方面提供一种编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白，所述融合蛋白的N端至C端依次包括hAID片段、TadA8e片段和Cas9n片段，所述hAID片段的氨基酸序列如SEQID NO:5所示，所述TadA8e片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cas9n片段为具有单链切割活性的Cas9蛋白片段。
在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括Rad51片段，所述Rad51片段与所述Cas9n片段相邻并位于所述Cas9n片段的N端；所述Rad51片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明一些较佳实施方案中，所述Cas9n片段为如第一方面所述的融合蛋白的Cas9n片段。即，所述Cas9n片段的来源选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9或其突变体组成的组。优选地，所述Cas9n片段的来源为SpCas9。更优选地，所述Cas9n片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
在本发明一些实施方案中，所述融合蛋白还包括UGI片段，和/或核定位信号片段。
在本发明一些较佳实施方案中，所述UGI片段位于所述Cas9n片段的C端；所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的N端和/或C端。
在本发明一些更佳实施方案中，所述UGI片段包括两个拷贝，每个拷贝优选具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。所述核定位信号片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明中，hAID为胞嘧啶脱氨酶，能够移除胞嘧啶分子中的氨基。
本发明的第三方面提供一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如第一方面或第二方面所述的融合蛋白。
本发明中，所述多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。
本领域公知，由于密码子的简并性，有大量多核苷酸序列可以编码相同的融合蛋白。另外，不同物种对于密码子具有一定的偏好性，可能会根据在不同物种中表达的需要，会对所述融合蛋白的密码子进行优化，这些变体均在本发明所述多核苷酸的保护范围内。
本发明的第四方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第三方面所述的多核苷酸。
本发明中，所述重组表达载体进行重组的载体可为本领域常规的能在宿主细胞内稳定表达的载体，例如细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒等。
本发明的第五方面提供一种碱基编辑系统，所述碱基编辑系统包括：碱基编辑器和sgRNA；所述碱基编辑器包含如第一方面或第二方面所述的融合蛋白。
本发明中，所述sgRNA具有与所述碱基编辑器中的Cas9n蛋白结合并将其引导至目的基因的功能。所述sgRNA在其5’端具有与所述目的基因互补的序列，并通过该互补的序列与所述目的基因结合，从而将本发明的碱基编辑器引导至所述目的基因。
所述目的基因中含有PAM序列，所述PAM序列是指可由Cas9n蛋白识别的序列。
本发明的第六方面提供一种药物组合物，所述药物组合物包含如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、或者如第五方面所述的碱基编辑系统。
本发明的第七方面提供一种非治疗目的的碱基编辑方法，所述碱基编辑方法包括通过如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的多核苷酸、如第四方面所述的重组表达载体、或如第五方面所述的碱基编辑系统在靶细胞中进行碱基编辑。
在本发明一些实施方案中，所述靶细胞为原核细胞或真核细胞。
本发明中，所述原核细胞可为本领域公知的微生物细胞，优选具有医疗研究价值、工业生产价值的微生物细胞。
在本发明一些较佳实施方案中，所述真核细胞为动物细胞或植物细胞。
本发明中，所述动物细胞可为哺乳动物细胞、啮齿类动物细胞，包括人、马、牛、羊、鼠、兔等。
本发明中，所述非治疗目的例如在实验室中通过检测靶细胞发生的编辑来评价本发明所述的编辑腺嘌呤的融合蛋白、编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白或相应的碱基编辑系统。反之，也可以通过碱基编辑研究靶细胞的功能。
本发明中，所述碱基编辑方法还可以是治疗目的的。本发明中，所述治疗是指治疗受试者例如人类的疾病，包括抑制所述疾病的发生或发展、缓解所述疾病的症状或治愈所述疾病。
本发明的第九方面提供如第一方面或第二方面所述的融合蛋白、如第三方面所述的多核苷酸、如第四方面所述的重组表达载体、如第五方面所述的碱基编辑系统、或者如第六方面所述的药物组合物在制备碱基编辑试剂、构建动物模型中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明的编辑腺嘌呤的融合蛋白可以有效提高近PAM区的编辑效率，并拓宽了编辑窗口；本发明的编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白有效提高了A/C同时编辑效率。
附图说明
图1为超高活性ABE的设计与构建示意图。
图2为不同的超高活性ABE构建体在人的内源靶点CCR5-sg1编辑效率对比结果示意图。
图3为超高活性ABE(hyABE8e)与ABE8e在人的多内源靶点对比结果示意图。
图4为高活性A&C-BEmax的设计与构建示意图。
图5为不同的高活性A&C-BEmax构建体在人的内源靶点CTLA-sg2碱基编辑效率对比结果示意图。
图6为不同的高活性A&C-BEmax构建体在人的内源靶点CTLA-sg2等位基因A/C同时编辑效率(Allele with A to G or C to T)对比结果示意图。
图7为超高活性A&C-BEmax(hyA&C-BEmax)、高活性A&C-BEmax(eA&C-BEmax)与A&C-BEmax在人的多个内源靶点碱基编辑效率对比结果示意图。
图8为超高活性A&C-BEmax(hyA&C-BEmax)、高活性A&C-BEmax(eA&C-BEmax)与A&C-BEmax在人的多个内源靶点等位基因A/C同时编辑效率对比结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
实施例中质粒的构建方法和转染方法参见Xiaohui Zhang等，Increasing theefficiency and targeting range of cytidine base editors through fusion of asingle-stranded DNA-binding protein domain，Nature Cell Biology 22(6):1-11。
实施例1
1、如图1所示，分别在已报道的ABEmax基础上设计与人的单链DNA结合蛋白Rad51的功能结构域融合构建体、在近期报道的ABE8e(Addgene#138489)基础上设计与人的单链DNA结合蛋白Rad51的功能结构域融合构建体。同时设计并测试来源于人的内源性靶点CCR5-sg1p(tgacatcaattattatacatcgg，SEQ ID NO:7)。按照说明书依次构建上述质粒。
2、将构建好的质粒与靶点质粒按照750ng:250ng比例共转HEK293T细胞，转染后120h，提细胞DNA，PCR之后进行PCR文库构建，之后送高通量测序。分析结果，找出编辑效率最优的融合构建体hyABE(如图2所示)。
3、以ABE8e作为对照，将编辑效率最优的hyABE融合构建体与更多内源靶点：
FANCF-M-b：aagttcgctaatcccggaactgg(SEQ ID NO:8)、
MAGEA1-M-b：gctggcagcaagggcggcgctgg(SEQ ID NO:9)、
ABE site25：agtaaacaaagcatagactgagg(SEQ ID NO:10)和
PPP1R12C site6：ggggctcaacatcggaagagggg(SEQ ID NO:11)
共转HEK293T细胞，验证其功能特性，结果如图3所示。
结果显示，通过将单链DNA结合蛋白的功能域Rad51DBD与已知的高活性和高兼容性的ABE8e进行不同的融合筛选，发现当Rad51DBD融合在TadA8e与Cas9n中间时，以及Rad51DBD融合在Cas9n的C端时，均可以有效提高靠近PAM的编辑效率，其中当Rad51DBD融合在TadA8e与Cas9n中间时效率最高，为方便描述，将该融合蛋白命名为hyABE8e。hyABE8e的编辑窗口从原来ABE8e的3-8位拓宽为3-13位。
实施例2
1、如图4所示，分别在已报道的A&C-BEmax基础上设计与人的单链DNA结合蛋白Rad51的功能结构域融合构建体，用近期报道的活性较高、兼容性高的ABE8e中的腺嘌呤脱氨酶替换A&C-BEmax中的两个腺嘌呤脱氨酶构建融合构建体(eA&C-BEmax)，以及将人的单链DNA结合蛋白Rad51的功能结构域进一步融合构建融合构建体(hyA&C-BEmax)，同时设计并测试来源于人的内源性靶点CTLA-sg2(tgtgaagagcttcactgagtagg，SEQ ID NO:12)。依次构建上述质粒。
2、将构建好质粒与靶点质粒按照750ng:250ng比例共转HEK293T细胞，转染后120h，提细胞DNA，PCR之后进行PCR文库构建，之后送高通量测序。分析结果，找出碱基编辑效率最优的融合构建体，如图5和图6所示。
结果显示，用ABE8e的TadA8e替换A&C-BEmax中的TadA-TadA*，得到eA&C-BEmax，发现其A/C同时编辑的效率可进一步进高。
3、以A&C-BEmax作为对照，将最优的融合构建体(eA&C-BEmax和hyA&C-BEmax)与更多内源靶点：
FANCF-sg1：cgaccaatagcattgcagagagg(SEQ ID NO:13)、
PPP1R12C site3：gagctcactgaacgctggcatgg(SEQ ID NO:14)和
EGFR-sg12：atacaccgtgccgaacgcaccgg(SEQ ID NO:15)
共转HEK293T细胞，验证其功能特性，如图7和图8所示。
结果显示，将单链DNA结合蛋白的功能域Rad51DBD与eA&C-BEmax融合，得到hyA&C-BEmax，A/C同时编辑效率被进一步提高。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
上海邦耀生物科技有限公司
<120> 编辑碱基的融合蛋白及其应用
<130> P21017691C
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 166
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TadA8e片段
<400> 1
Ser Glu Val Glu Phe Ser His Glu Tyr Trp Met Arg His Ala Leu Thr
1 5 10 15
Leu Ala Lys Arg Ala Arg Asp Glu Arg Glu Val Pro Val Gly Ala Val
20 25 30
Leu Val Leu Asn Asn Arg Val Ile Gly Glu Gly Trp Asn Arg Ala Ile
35 40 45
Gly Leu His Asp Pro Thr Ala His Ala Glu Ile Met Ala Leu Arg Gln
50 55 60
Gly Gly Leu Val Met Gln Asn Tyr Arg Leu Ile Asp Ala Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Val Thr Phe Glu Pro Cys Val Met Cys Ala Gly Ala Met Ile His Ser
85 90 95
Arg Ile Gly Arg Val Val Phe Gly Val Arg Asn Ser Lys Arg Gly Ala
100 105 110
Ala Gly Ser Leu Met Asn Val Leu Asn Tyr Pro Gly Met Asn His Arg
115 120 125
Val Glu Ile Thr Glu Gly Ile Leu Ala Asp Glu Cys Ala Ala Leu Leu
130 135 140
Cys Asp Phe Tyr Arg Met Pro Arg Gln Val Phe Asn Ala Gln Lys Lys
145 150 155 160
Ala Gln Ser Ser Ile Asn
165
<210> 2
<211> 113
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Rad51片段
<400> 2
Ala Met Gln Met Gln Leu Glu Ala Asn Ala Asp Thr Ser Val Glu Glu
1 5 10 15
Glu Ser Phe Gly Pro Gln Pro Ile Ser Arg Leu Glu Gln Cys Gly Ile
20 25 30
Asn Ala Asn Asp Val Lys Lys Leu Glu Glu Ala Gly Phe His Thr Val
35 40 45
Glu Ala Val Ala Tyr Ala Pro Lys Lys Glu Leu Ile Asn Ile Lys Gly
50 55 60
Ile Ser Glu Ala Lys Ala Asp Lys Ile Leu Ala Glu Ala Ala Lys Leu
65 70 75 80
Val Pro Met Gly Phe Thr Thr Ala Thr Glu Phe His Gln Arg Arg Ser
85 90 95
Glu Ile Ile Gln Ile Thr Thr Gly Ser Lys Glu Leu Asp Lys Leu Leu
100 105 110
Gln
<210> 3
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 核定位信号片段
<400> 3
Lys Arg Thr Ala Asp Gly Ser Glu Phe Glu Ser Pro Lys Lys Lys Arg
1 5 10 15
Lys Val
<210> 4
<211> 1367
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cas9n片段
<400> 4
Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Ala Ile Gly Thr Asn Ser Val Gly
1 5 10 15
Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe Lys
20 25 30
Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile Gly
35 40 45
Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu Lys
50 55 60
Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser Phe
85 90 95
Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys His
100 105 110
Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr His
115 120 125
Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp Ser
130 135 140
Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His Met
145 150 155 160
Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro Asp
165 170 175
Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr Asn
180 185 190
Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala Lys
195 200 205
Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn Leu
210 215 220
Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn Leu
225 230 235 240
Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe Asp
245 250 255
Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp Asp
260 265 270
Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp Leu
275 280 285
Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp Ile
290 295 300
Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser Met
305 310 315 320
Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys Ala
325 330 335
Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe Asp
340 345 350
Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser Gln
355 360 365
Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp Gly
370 375 380
Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg Lys
385 390 395 400
Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu Gly
405 410 415
Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe Leu
420 425 430
Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile Pro
435 440 445
Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp Met
450 455 460
Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu Val
465 470 475 480
Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr Asn
485 490 495
Phe Asp Lys Asn Leu Pro Asn Glu Lys Val Leu Pro Lys His Ser Leu
500 505 510
Leu Tyr Glu Tyr Phe Thr Val Tyr Asn Glu Leu Thr Lys Val Lys Tyr
515 520 525
Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln Lys
530 535 540
Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr Val
545 550 555 560
Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp Ser
565 570 575
Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly Thr
580 585 590
Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp Asn
595 600 605
Glu Glu Asn Glu Asp Ile Leu Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu
610 615 620
Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His
625 630 635 640
Leu Phe Asp Asp Lys Val Met Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr
645 650 655
Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys
660 665 670
Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala
675 680 685
Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys
690 695 700
Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His
705 710 715 720
Glu His Ile Ala Asn Leu Ala Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile
725 730 735
Leu Gln Thr Val Lys Val Val Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg
740 745 750
His Lys Pro Glu Asn Ile Val Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr
755 760 765
Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu
770 775 780
Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val
785 790 795 800
Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln
805 810 815
Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu
820 825 830
Ser Asp Tyr Asp Val Asp His Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp
835 840 845
Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly
850 855 860
Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn
865 870 875 880
Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe
885 890 895
Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys
900 905 910
Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys
915 920 925
His Val Ala Gln Ile Leu Asp Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu
930 935 940
Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys
945 950 955 960
Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu
965 970 975
Ile Asn Asn Tyr His His Ala His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val
980 985 990
Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val
995 1000 1005
Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys
1010 1015 1020
Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr
1025 1030 1035
Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr Glu Ile Thr Leu Ala Asn
1040 1045 1050
Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu Thr Asn Gly Glu Thr
1055 1060 1065
Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe Ala Thr Val Arg
1070 1075 1080
Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys Lys Thr Glu
1085 1090 1095
Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro Lys Arg
1100 1105 1110
Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro Lys
1115 1120 1125
Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu
1130 1135 1140
Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser
1145 1150 1155
Val Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe
1160 1165 1170
Glu Lys Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu
1175 1180 1185
Val Lys Lys Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe
1190 1195 1200
Glu Leu Glu Asn Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu
1205 1210 1215
Leu Gln Lys Gly Asn Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn
1220 1225 1230
Phe Leu Tyr Leu Ala Ser His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro
1235 1240 1245
Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln Leu Phe Val Glu Gln His Lys His
1250 1255 1260
Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg
1265 1270 1275
Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp Lys Val Leu Ser Ala Tyr
1280 1285 1290
Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu Gln Ala Glu Asn Ile
1295 1300 1305
Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala Pro Ala Ala Phe
1310 1315 1320
Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser Thr
1325 1330 1335
Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile Thr Gly
1340 1345 1350
Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp
1355 1360 1365
<210> 5
<211> 181
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> hAID
<400> 5
Asp Ser Leu Leu Met Asn Arg Arg Lys Phe Leu Tyr Gln Phe Lys Asn
1 5 10 15
Val Arg Trp Ala Lys Gly Arg Arg Glu Thr Tyr Leu Cys Tyr Val Val
20 25 30
Lys Arg Arg Asp Ser Ala Thr Ser Phe Ser Leu Asp Phe Gly Tyr Leu
35 40 45
Arg Asn Lys Asn Gly Cys His Val Glu Leu Leu Phe Leu Arg Tyr Ile
50 55 60
Ser Asp Trp Asp Leu Asp Pro Gly Arg Cys Tyr Arg Val Thr Trp Phe
65 70 75 80
Thr Ser Trp Ser Pro Cys Tyr Asp Cys Ala Arg His Val Ala Asp Phe
85 90 95
Leu Arg Gly Asn Pro Asn Leu Ser Leu Arg Ile Phe Thr Ala Arg Leu
100 105 110
Tyr Phe Cys Glu Asp Arg Lys Ala Glu Pro Glu Gly Leu Arg Arg Leu
115 120 125
His Arg Ala Gly Val Gln Ile Ala Ile Met Thr Phe Lys Asp Tyr Phe
130 135 140
Tyr Cys Trp Asn Thr Phe Val Glu Asn His Glu Arg Thr Phe Lys Ala
145 150 155 160
Trp Glu Gly Leu His Glu Asn Ser Val Arg Leu Ser Arg Gln Leu Arg
165 170 175
Arg Ile Leu Leu Pro
180
<210> 6
<211> 83
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> UGI片段
<400> 6
Thr Asn Leu Ser Asp Ile Ile Glu Lys Glu Thr Gly Lys Gln Leu Val
1 5 10 15
Ile Gln Glu Ser Ile Leu Met Leu Pro Glu Glu Val Glu Glu Val Ile
20 25 30
Gly Asn Lys Pro Glu Ser Asp Ile Leu Val His Thr Ala Tyr Asp Glu
35 40 45
Ser Thr Asp Glu Asn Val Met Leu Leu Thr Ser Asp Ala Pro Glu Tyr
50 55 60
Lys Pro Trp Ala Leu Val Ile Gln Asp Ser Asn Gly Glu Asn Lys Ile
65 70 75 80
Lys Met Leu
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CCR5-sg1p
<400> 7
tgacatcaat tattatacat cgg 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FANCF-M-b
<400> 8
aagttcgcta atcccggaac tgg 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MAGEA1-M-b
<400> 9
gctggcagca agggcggcgc tgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ABE site25
<400> 10
agtaaacaaa gcatagactg agg 23
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP1R12C site6
<400> 11
ggggctcaac atcggaagag ggg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTLA-sg2
<400> 12
tgtgaagagc ttcactgagt agg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FANCF-sg1
<400> 13
cgaccaatag cattgcagag agg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PPP1R12C site3
<400> 14
gagctcactg aacgctggca tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> EGFR-sg12
<400> 15
atacaccgtg ccgaacgcac cgg 23

Claims (10)

1.一种编辑腺嘌呤的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的N端至C端依次包括TadA8e片段和Cas9n片段，所述TadA8e片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cas9n片段为具有单链切割活性的Cas9蛋白片段；
所述融合蛋白还包括Rad51片段，所述Rad51片段与所述Cas9n片段相邻并位于所述Cas9n片段的N端或C端；所述Rad51片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括核定位信号片段，所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的N端和/或C端；较佳地，所述核定位信号片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
和/或，所述Cas9n片段的来源选自SpCas9、SaCas9、NmeCas9、StCas9、CjCas9或其突变体组成的组；较佳地，所述Cas9n片段的来源为SpCas9；更佳地，所述Cas9n片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
3.一种编辑腺嘌呤和胞嘧啶的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的N端至C端依次包括hAID片段、TadA8e片段和Cas9n片段，所述hAID片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，所述TadA8e片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述Cas9n片段为具有单链切割活性的Cas9蛋白片段。
4.如权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括Rad51片段，所述Rad51片段与所述Cas9n片段相邻并位于所述Cas9n片段的N端；所述Rad51片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；较佳地，所述Cas9n片段为如权利要求2所述的融合蛋白的Cas9n片段；
和/或，所述融合蛋白还包括UGI片段，和/或核定位信号片段；较佳地，所述UGI片段位于所述Cas9n片段的C端；所述核定位信号片段位于所述融合蛋白的N端和/或C端；更佳地，所述UGI片段包括两个拷贝，每个拷贝优选具有如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；所述核定位信号片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。
6.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求5所述的多核苷酸。
7.一种碱基编辑系统，其特征在于，所述碱基编辑系统包括：碱基编辑器和sgRNA；所述碱基编辑器包含如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白。
8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、或者如权利要求7所述的碱基编辑系统。
9.一种非治疗目的的碱基编辑方法，其特征在于，所述碱基编辑方法包括通过如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、如权利要求5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的重组表达载体、或如权利要求7所述的碱基编辑系统在靶细胞中进行碱基编辑；
较佳地，所述靶细胞为原核细胞或真核细胞；
更佳地，所述真核细胞为动物细胞或植物细胞。
10.如权利要求1-4任一项所述的融合蛋白、如权利要求5所述的多核苷酸、如权利要求6所述的重组表达载体、如权利要求7所述的碱基编辑系统、或者如权利要求8所述的药物组合物在制备碱基编辑试剂、构建动物模型或培育植物新品种中的应用。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117659210A (zh) * 2023-11-30 2024-03-08 华南农业大学 一种用作植物双碱基编辑器的重组融合蛋白及其应用

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