DE60316124T3

DE60316124T3 - Hybride and einzelkettige meganukleasen und deren anwendungen

Info

Publication number: DE60316124T3
Application number: DE60316124.3T
Authority: DE
Inventors: Sylvain Arnould; Patrick Chames; Andre Choulika; Jean-Charles Epinat; Emmanuel Lacroix
Original assignee: Cellectis SA
Current assignee: Cellectis SA
Priority date: 2002-03-15
Filing date: 2003-03-14
Publication date: 2018-03-22
Anticipated expiration: 2023-03-15
Also published as: AU2003215869B2; US20040002092A1; ATE372379T1; DE60316124D1; EP1485475B2; US8206965B2; EP1485475B1; JP2010207234A; CA2479153C; CA2479153A1; DK1485475T3; JP2011188867A; JP2005520519A; DE60316124T2; AU2003215869A1; WO2003078619A1; EP1485475A1; ES2292994T3; US20060078552A1

Description

HINTERGRUND
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Patentanmeldung betrifft als Meganucleasen bezeichnete Hybrid-Rare cutting-Endonucleasen, die eine spezifische Nucleotidsequenz erkennen und spalten; Polynucleotidsequenzen, die für die Rare cutting-Endonucleasen codieren; einen Vektor, der eine der Polynucleotidsequenzen umfasst, eine Zelle oder ein Tier, das eine der Polynucleotidsequenzen oder der Rare cutting-Endonucleasen umfasst; ein Verfahren zum Herstellen einer der Rare cutting-Endonucleasen; und jegliche Verwendung der beschriebenen Produkte und Verfahren. Insbesondere erwägt die vorliegende Erfindung jegliche Verwendung einer solchen Rare cutting-Endonuclease für die Genmanipulation und Gentherapie.
Kurze Beschreibung des Standes der Technik
Meganucleasen stellen eine Familie von sehr Rare cutting[hochspezifischen]-Endonucleasen dar. Diese wurde erstmals zu Beginn der Neunzigerjahre durch die Verwendung (in vivo) des Proteins I-Sce I (Omeganuclease, ursprünglich durch ein mitochondriale Gruppe I Intron der Hefe Saccharomyces cerevisiae codiert) charakterisiert. Homing-Endonucleasen, die von Introns ORF, unabhängigen Genen oder intervenierenden Sequenzen (Inteinen) codiert werden, sind nun als ”Meganucleasen” definiert, die auffällige strukturelle und funktionale Eigenschaften besitzen, welche sie von ”klassischen” Restriktionsenzymen (im Allgemeinen aus dem bakteriellen System R/MII) unterscheiden. Sie haben Erkennungssequenzen, die sich über 12–40 bp DNA erstrecken, während ”klassische” Restriktionsenzyme viel kürzere Erstreckungen von DNA in dem Bereich von 3–8 bp (bis zu 12 bp für Rare-Cutter) erkennen. Daher besitzen die Meganucleasen selbst im menschlichen Genom eine sehr geringe Spaltungshäufigkeit.
Des Weiteren kontrastiert die allgemeine Asymmetrie der Meganucleasen-Targetsequenzen mit der charakteristischen Dyadensymmetrie der meisten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen. Von mehreren Meganucleasen, die von Intronen ORF oder Inteinen codiert werden, wurde gezeigt, dass sie das Homing [gezielte Einfügen] ihrer jeweiligen genetischen Elemente in allelische, intronlose oder inteinlose Stellen fördern. Durch Erstellen eines Site-spezifischen Doppelstrangbruchs in den intronlosen oder inteinlosen Allelen erzeugen diese Nucleasen rekombinogene Enden, die an einem Genkonversionsprozess teilnehmen, der die Codierungssequenz dupliziert und zu der Einbringung eines Introns oder einer intervenierenden Sequenz auf DNA-Level führt.
Meganucleasen gliedern sich in 4 separate Familien auf der Basis von ziemlich gut konservierten Aminosäurenmotiven auf. Eine von ihnen ist die Dodecapeptid-Familie (Dodecamer, DOD, D1–D2, LAGLI-DADG, P1–P2). Dies ist die größte Familie von Proteinen, die durch ihr am allgemeinsten bewahrtes Sequenzmotiv geclustert sind: eine oder zwei Kopien (überwiegende Mehrheit) einer Sequenz von zwölf Resten: die Di-Dodecapeptid-Meganucleasen mit einem Dodecapetid (D) liegen bei einer Molekülmasse von 20 kDa und wirken als Homodimer. Solche mit zwei Kopien (DD) reichen von 25 kDa (230 AA) bis 50 kDa (HO, 545 AA) mit 70 bis 150 Resten zwischen jedem Motiv und wirken als Monomer. Die Spaltung findet innerhalb des Erkennungsstelle statt, wodurch ein 4 nt-gestufter Schnitt mit 3'OH-Überhängen verbleibt. I-Ceu I, und I-Cre I veranschaulichen die Meganucleasen mit einem Dodecapeptidmotiv (Mono-Dodecapeptid). I-Dmo I, I-Sce I, PI-Pfu I und PI-Sce I veranschaulichen Meganucleasen mit zwei Dodecapeptidmotiven.
Goguel et al. (Mol. Cell. Biol., 1992, 12, 696–705) zeigt durch Austauschexperimente von RNA-Maturase und Meganuclease von Hefemitochondrien, dass die Meganuclease-Sequenz ein Austauschen nicht gut verträgt und ihre Endonuclease-Aktivität verliert.
Endonucleasen sind Enzyme, die für die heutigen fortgeschrittenen Genmanipulationstechniken, besonders für das Clonen und Analysieren von Genen, benötigt werden. Meganucleasen sind von großem Interesse als Rare Cutter-Endonucleasen, da sie aufgrund der Größe ihrer Erkennungsstelle eine sehr geringe Erkennungs- und Spaltungshäufigkeit in einem großen Genom besitzen. Deshalb werden die Meganucleasen für die Molekularbiologie und die Genmanipulation verwendet, insbesondere gemäß den Verfahren, die in WO 96/14408 , US 5,830,729 , WO 00/46385 und WO 00/46386 beschrieben sind.
Bislang wurden in einem ersten Lösungsansatz zur Erzeugung von neuer Endonuclease einige chimäre Restriktionsenzyme durch Hybride zwischen einer Zinkfinger-DNA-Bindungsdomäne und der nichtspezifischen DNA-Spaltungsdomäne aus dem natürlichen Restriktionsenzym Fok I bereitet (Smith et al., 2000, Nucleic Acids Res, 28, 3361–9; Kim et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93, 1156–60; Kim & Chandrasegaran, 1994, Proc Natl Acad Sci USA, 91, 883–7; WO 95/09233 ; WO 94/18313 ).
Ein zusätzlicher Lösungsansatz bestand in einer Änderung der Erkennungsdomäne des EcoRV-Restriktionsenzyms, um seine Spezifizität durch Site-spezifische Mutagenese zu verändern (Wenz et al., 1994, Biochim Biophys Acta, 1219, 73–80).
Trotz dieser Anstrengungen besteht immer noch ein starker Bedarf nach neuen Rare cutting-Endonucleasen mit einer neuen Sequenzspezifizität für die Erkennung und das Spalten.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist eine Banddarstellung von I-DmoI (pdb-Code lb24). Die gestrichelte Linie repräsentiert die zweifache Pseudo-Symmetrieachse zwischen den zwei Domänen. Die N-terminale Domäne von I-DmoI befindet sich links von dieser Achse, und die C-terminale Domäne befindet sich auf der rechten Seite. DNA (in der Struktur lb24 nicht vorhanden) sollte sich senkrecht zu der Symmetrieachse unter den zwei β-Faltblättern binden (Pfeile), α^D und α'^D beziehen sich auf Helices, welche das Dodecapeptidmotiv aufweisen, DBM (DNA Binding Moiety) auf DNA-bindenden Rest, und V auf variable Sequenz.
2 ist eine Banddarstellung von dimerem I-CreI mit gebundener DNA in Stabdarstellung (pdb-Code 1g9y). Die gestrichelte Linie repräsentiert die zweifache Symmetrieachse zwischen den zwei Domänen oder Monomeren. Die gebundene DNA liegt senkrecht zu der Symmetrieachse unter den zwei β-Faltblättern (Pfeile) vor. α^D bezieht sich auf eine Helix, die das Dodecapeptidmotiv aufweist, DBM auf DNA-bindenden Rest, und V auf variable Sequenz.
3A und 3B sind Banddarstellungen von I-Dmo I bzw. I-CreI in der Region der Dodecapeptidmotive. Für beide Proteine sind die Hauptkettenatome von Resten, die den Dodecapeptidmotive entsprechen, in Stabdarstellung gezeigt, zusammen mit den überlagerten Atomen von dem anderen Protein. Die gestrichelte Linie repräsentiert die zweifache Symmetrieachse zwischen den beiden Proteindomänen. Sterne stehen in 3A für die Grenzen der Linker zwischen den I-DmoI-Domänen und in 3B die entsprechenden Positionen in I-CreI, an denen dieser Linker manipuliert werden soll. Die Orientierungen der Proteine sind gemäß der Darstellung in 1 und 2.
4 ist eine Banddarstellung des I-DmoI/I-CreI-Hybridproteins (Modellstruktur aufgebaut durch nebeneinander liegende Anordnung der zwei Domänen, die ihrer jeweiligen Röntgenstruktur entnommen ist). Der Linker, der die beiden Domänen zusammen fügt, wobei es sich um das Ende des I-DmoI-Teils handelt, befindet sich zwischen den beiden Sternen. Die gestrichelte Linie repräsentiert die zweifache Symmetrieachse zwischen den beiden Protein-Domänen. Die N-terminale Domäne von I-DmoI befindet sich links, und die I-CreI Domäne rechts von der Achse. α^D und α'^D beziehen sich auf Helices, welche das Dodecapeptidmotiv aufweisen, DBM auf den DNA-bindenden Rest, und V auf variable Sequenz.
5A und 5B sind Banddarstellungen des I-CreI-Dimers (1g9y) bzw. des Einzelketten-I-CreI (modellierte Struktur). (5A) Die Sterne geben an, wo der Linker eingebracht werden soll; drei α-Helices im ersten Monomer (im Anschluss an den Stern ganz links) sind in der Einzelkette entfernt, zusammen mit den N-terminalen Resten des zweiten Monomers (vor dem anderen Stern). (5B) Der Loop, der beide Domänen zusammenfügt, zwischen den beiden Sternen liegend, ist von I-DmoI entnommen (Struktur lb24). Die graue Scheibe repräsentiert die Symmetrieachse (Orientierung von oberhalb der Strukturen her, z. B. ist sie im Vergleich mit den vorherigen Figuren 90° um eine horizontale Achse gedreht).
6A und 6B geben die Aminosäurensequenz von zwei Alternativen von Hybrid-Meganuclease I-DmoI/I-Cre I an, sowie eine Polynucleotidsequenz, die für jede Alternative codiert. Unterstrichene Reste sind die LAGLI-DADG-Motive. In Fettdruck sind Reste in der I-DmoI-Domäne gezeigt, die mutiert sind. Das ”H” gibt den Austauschpunkt an der Grenze zwischen der I-DmoI- und I-CreI-Domäne an. In allen Proteinsequenzen sind die zwei ersten N-terminalen Reste Methionin und Alanin (MA), und die drei C-terminalen Reste sind Alanin, Alanin und Asparaginsäure (AAD). Diese Sequenzen ermöglicht den Erhalt von DNA-codierenden Sequenzen, welche die NcoI(CCATGG)- und EagI(CGGCCG)-Restriktionsstellen umfassen, die für das Clonen in verschiedene Vektoren verwendet werden. Alternative A weist nur einen Austauschpunkt auf, wohingegen Alternative B drei zusätzliche Mutationen aufweist, die eine potentielle Hinderung vermeiden.
7 gibt die Aminosäurensequenz einer Alternative eines Einzelketten-I-Cre I an und ein Polynucleotid, das für die Einzelketten-Meganuclease codiert. In der Proteinsequenz sind die zwei ersten N-terminalen Reste Methionin und Alanin (MA), und die drei C-terminalen Reste sind Alanin, Alanin und Asparaginsäure (AAD). Diese Sequenzen ermöglicht den Erhalt von DNA-codierenden Sequenzen, welche die NcoI(CCATGG)- und EagI(CGGCCG)-Restriktionsstellen umfassen, die für das Clonen in verschiedene Vektoren verwendet werden.
8 zeigt das In vitro-Spaltungsassay für die Hybrid-Meganuclease I-Dmo I/I-Cre I (8B) und das SDS-PAGE-Gel mit einem solchen Hybrid (8A). 8A: Linie A: Molekülgewicht-Marker; Line B: Hybrid Meganuclease I-Dmo I/1-Cre I; Linie C: Wildtyp-Meganuclease I-Dmo I. 8B: Agarosegelaktivität von Hybrid-I-Dmo I/I-Cre; Linien A, B, C, D: Target-I-Dmo I/I-Cre I; Linien E, F, G, H: Target-I-Cre I/I-Dmo I; Linien D, G: Größenmarker; Linien C, H: lineares Plasmid; Linien B, F: Assay bei 37°C; Linien A, E: Assay bei 65°C.
9 zeigt den In vitro-Spaltungsassay für die Einzelketten-Meganuclease I-Cre I (9B) und das SDS-PAGE-Gel der Gelfiltration mit einer solchen Einzelketten-Meganuclease (9A). 9A: Linie A: Molekülgewicht-Marker; Linien B und C: Dead Colume der Gelfiltration. Linie D: Einzelketten-Meganuclease I-Cre I. 9B: Agarosegelaktivität der Einzelketten-Meganuclease; Linie A: Marker; Line B: Targetstelle der Wildtyp I-Cre I-Meganuclease; Linie C: Targetstelle der Wildtyp I-Cre I + Wildtyp I-Cre I-Meganuclease (positive Kontrolle); Linie D: Targetstelle der Wildtyp I-Sce I + Einzelketten-I-Cre I-Meganuclease (negative Kontrolle); Linien E und F: jeweilige Targetstelle der Wildtyp I-Cre I + Einzelketten-I-Cre I-Meganuclease, bei 37 und 65°C für Linien E und F während 1 h.
10A ist eine schematische Darstellung des LACURAZ-Reporterkonstrukts. LACZ steht für die Elemente des Lac Z-Gens. Die Sektionen A von jeder Seite der intervenierenden Sequenz umfassen die interne Duplikation des Lac Z-Gens. pADH1 ist ein Hefe bildender Promotor. tADH1 ist ein Hefe-Terminator. Ura3 steht für das Ura3-Gen. Die Pfeile stehen für den Beginn der Transkription. Das Etikett ”Spaltungsstelle” bezieht sich auf die Erkennungs- und Spaltungsstelle der untersuchten Meganuclease. ”Trp1” bezieht sich auf einen Trp1-selektierbaren Marker, und ”cen” auf einen ARS-CEN Replikationsursprung.
10B ist eine schematische Darstellung des Meganuclease-induzierbaren Expressionsvektors. pGAL10 ist ein Hefe-Promotor, der in Gegenwart von Galactose induzierbar ist. tADH1 ist ein Hefe-Terminator. ”Leu2” und ”2μ” beziehen sich auf einen Leu2-selektierbaren Marker bzw. einen 2μ-Replikationsursprung. Der Pfeil steht für den Beginn der Transkription.
11 zeigt die Kombinationen von Co-Transformationen und anschließenden Modifikationen des Reportergens. ”#X” bezieht sich auf die in Tabelle A angegebene Kombination. Die hellgrauen Kästen beziehen sich auf das Ura3-Gen. Die dunkelgrauen Kästen beziehen sich auf das Lac Z-Gen. Die weissen Kästen beziehen sich auf das Gen, das für die Meganuclease codiert. Die weissen Etikette beziehen sich auf die Erkennungs- und Spaltungsstelle der untersuchten Meganuclease.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
DEFINITIONEN
In der vorliegenden Anmeldung ist mit ”Meganuclease” eine Rare cutting-Endonuclease bezeichnet, die typischerweise eine Polynucleotid-Erkennungsstelle mit einer Länge von ungefähr 12–40 bp, insbesondere bevorzugt von 14–40 bp aufweist. Typische Meganucleasen verursachen eine Spaltung innerhalb ihrer Erkennungsstelle, wodurch ein 4 nt-gestufter Schnitt mit 3'OH-Überhängen verbleibt. Meganuclease wird gemeinhin auch als Homing-Endonuclease bezeichnet. Vorzugsweise gehören ”Meganucleasen” gemäß der vorliegenden Erfindung zur Dodecapeptid-Familie (LAGLIDADG). Für mehr Informationen über Meganucleasen siehe Dalgaard et al. (1997, Nucleic Acids Research, 25, 4626–4638) und Chevalier und Stoddard (2001, Nucleic Acids Research, 29, 3757–3774). Konkrete Beispiele für LAGLIDADG-Meganucleasen sind in Tabelle 1 aufgeführt.
”Helix” oder ”Helices” bezeichnet bei der vorliegenden Erfindung α-Helix oder α-Helices. α^D und αLAGLIDADG bezieht sich bei der vorliegenden Erfindung auf die Helix, die das LAGLIDADG-, DOD- oder Dodecapeptidmotiv aufweist.
Mit ”abgeleitet” wird ausgedrückt, dass die Domäne die Sequenz einer Domäne der Meganuclease aufweist, von der die Domäne abgeleitet ist. Diese Sequenz einer Domäne kann einige Modifikationen oder Substitutionen aufweisen.
Eine ”Targetstelle” oder Erkennungs- und/oder Spaltungsstelle gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich auf eine Polynucleotidsequenz, die durch eine Meganuclease gebunden und gespalten wird.
Der Begriff ”rekombinantes Polypeptid” wird vorliegend in Bezug auf Polypeptide verwendet, die künstlich entworfen wurden und mindestens zwei Polypeptidsequenzen aufweisen, die in ihrer anfänglichen natürlichen Umgebung nicht als benachbarte Polypeptidsequenzen vorgefunden werden, oder in Bezug auf Polypeptide, die aus einem rekombinanten Polynucleotid exprimiert wurden.
Gemäß der vorliegenden Verwendung der umfasst der Begriff ”Individuum” Säugetiere wie auch andere Tiere (z. B. Vögel, Fische, Reptilien, Insekten). Die Begriffe ”Säugetier” und ”Säuger(-)” gemäß der vorliegenden Verwendung beziehen sich auf jegliches Wirbeltier, einschließlich Monotremata, Beuteltiere und Plazentale, die ihre Jungen säugen und entweder lebende Junge gebären (eutharische oder plazentale Säugetiere) oder Eier legen (metatharische oder nicht-plazentale Säugetiere).)
Beispiele für Species von Säugetieren umfassen Menschen und andere Primaten (z. B. Affen, Schimpansen), Nagetiere (z. B. Ratten, Mäuse, Meerschweinchen) und Wiederkäuer (z. B. Kühe, Schweine, Pferde).
Der Begriff ”Reportergen” gemäß der vorliegenden Verwendung bezieht sich auf eine Nucleinsäuresequenz, deren Produkt einfach untersucht werden kann, z. B. kolorimetrisch als das Produkt einer enzymatischen Reaktion, wie etwa das lacZ-Gen, das für -Galactosidase codiert. Beispiele für häufig verwendete Reportermoleküle umfassen Enzyme wie etwa P-Galactosidase, β-Glucoronidase, β-Glucosidase; Leuchtmoleküle wie etwa Grün Fluoreszierendes Protein und Glühwürmchen-Luciferase; und auxotrophe Marker wie etwa His3p und Ura3p. (Siehe z. B. Kapitel 9 in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1998)).
Gemäß ihrer vorliegenden austauschbaren Verwendung umfassen die Begriffe ”Nucleinsäure”, ”Oligonucleotid” und ”Polynucleotid” RNA, DNA oder RNA/DNA-Hybridsequenzen von mehr als einem Nucleotid entweder in Einzelketten- oder Duplexform. Der Begriff ”Polynucleotid” bezieht sich auf ein Polymer mit Bausteinen, die ein Purin oder Pyrimidin, eine Ribose oder Desoxyribosezucker-Funktionsgruppe, und eine Phosphatgruppe, oder Phosphodiesterbindung umfassen. ”Polynucleotid” bezieht sich ferner auf ein Polynucleotid, das ”modifizierte Nucleotide” umfasst, die mindestens eine der folgenden Modifikationen aufweisen: (a) eine alternative Bindungsgruppe, (b) eine analoge Form von Purin, (c) eine analoge Form von Pyrimidin, oder (d) einen analogen Zucker.
Endonuclease: Mit ”Endonuclease” ist ein Enzym bezeichnet, das in der Lage ist, einen Doppelstrangbruch in einem DNA-Molekül an hochspezifischen Stellen hervor zu rufen.
”Zellen” oder ”Wirtszellen” sind Ausdrücke, die vorliegend austauschbar verwendet werden. Es ist anzumerken, dass sich solche Begriffe nicht nur auf die bestimmte, in Rede stehende Zelle, sondern auch auf den Nachwuchs oder potentiellen Nachwuchs einer solchen Zelle beziehen. Weil bestimmte Modifikationen in aufeinander folgenden Generationen entweder aufgrund von Mutation oder von Umwelteinflüssen auftreten können, kann es sein, dass ein solcher Nachwuchs nicht mit der Parentalzelle identisch ist, ist aber immer noch im Umfang des Begriffs gemäß der vorliegenden Verwendung mit umfasst.
”Identität” bezieht sich auf eine Sequenzidentität zwischen zwei Nucleinsäuremolekülen oder Polypeptiden. Eine Identität kann festgestellt werden durch Vergleichen einer Position in jeder Sequenz, die für Vergleichszwecke abgeglichen sein kann. Wenn eine Position in der verglichenen Sequenz mit der gleichen Base besetzt ist, sind die Moleküle in dieser Position identisch. Ein Grad der Ähnlichkeit oder Identität zwischen Nucleinsäure oder Aminosäuresequenzen ist eine Funktion der Anzahl von identischen oder überein stimmenden Nucleotiden in Positionen, die von den Nucleinsäuresequenzen geteilt werden. Verschiedene Alignment-Algorithmen und/oder -Programme können zum Berechnen der Identität zwischen zwei Sequenzen verwendet werden, darunter FASTA, oder BLAST, die als Teil der GCG Sequence Analysis Package (University of Wisconsin, Madison, Wis.) verfügbar sind, und können z. B. mit standardisierten Einstellungen verwendet werden.
Die ”nichthumanen Tiere” der Erfindung umfassen Säuger wie etwa Nagetiere, nichthumane Primaten, Schafe, Hunde, Kühe, Hühner, Amphibien, Reptilien usw. Bevorzugte nichthumane Tiere sind aus der Familie der Nagetiere einschließlich Ratte und Maus ausgewählt, insbesondere bevorzugt Maus, bis hin zu transgenen Amphibien wie etwa Mitgliedern des Genus Xenopus, und transgene Hühner, Kühe, Schafe können ebenso wertvolle Werkzeuge zur Verfügung stellen.
Der Begriff ”Vektor” bezieht sich auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nucleinsäure, an das es gebunden wurde, zu transportieren. Ein Typ eines bevorzugten Vektors ist ein Episom, d. h. eine Nucleinsäure, die zu extra-chromosomaler Replikation fähig ist. Bevorzugte Vektoren sind solche, die zu einer autonomen Replikation und/oder Expression von Nucleinsäuren, an die sie gebunden sind, fähig sind. Vektoren, die in der Lage sind, die Expression von Genen, an die sie operativ gebunden sind, zu lenken, werden vorliegend als ”Expressionsvektoren” bezeichnet. Ein Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, ohne hierauf beschränkt zu sein, ein YAC (Yeast Artificial Chromosome), ein BAC (Bacterial Artificial), einen Baculovirus-Vektor, einen Phagen, ein Phagemid, ein Cosmid, einen viralen Vektor, ein Plasmid, einen RNA-Vektor oder ein lineares oder kreisförmiges DNA- oder RNA-Molekül, das aus einer chromosomalen, nicht-chromosomalen, halbsynthetischen oder synthetischen DNA bestehen kann. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren, die bei rekombinanten DNA-Techniken von Nutzen sind, oft in Form von ”Plasmiden” vor, die sich allgemein auf kreisförmige doppelsträngige DNA-Loops beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. Große Anzahlen von geeigneten Vektoren sind dem Fachmann bekannt und kommerziell verfügbar, wie etwa die folgenden bakteriellen Vektoren: pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pbs, pDIO, phagescript, psiX174, pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene); ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia); pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (Pharmacia); pQE-30 (QIAexpress).
Virale Vektoren umfassen Retroviren, Adenoviren, Parvoviren (z. B. adenoassoziierte Viren), Coronaviren, Negativstrang-RNA-Viren wie etwa Orthomyxovirus (z. B. Influenza-Virus), Rhabdovirus (z. B. Tollwut- und Vesikulär-Stomatitis-Virus), Paramyxovirus (z. B. Masern und Sendai), Positivstrang-RNA-Viren wie etwa Picornavirus und Alphavirus, und doppelsträngige DNA-Viren einschließlich Adenvirus, Herpesvirus (z. B. Herpes Simplex-Virustypen 1 und 2, Epstein-Barr-Virus, Cytomegalovirus) und Pockenvirus (z. B. Vaccinia, Fowlpox und Canarypox). Andere Viren umfassen beispielsweise Norwalk-Virus, Togavirus, Flavivirus, Reoviren, Papovavirus, Hepadnavirus und Hepatitisvirus. Beispiele für Retroviren umfassen: Vogelleukose-Sarkom, Mammalian C-Typ, B-Typ-Viren, D-Typ-Viren, HTLV-BLV-Gruppe, Lentivirus, Spumavirus (Coffin, J. M., Retroviridae: The viruses and their Replication, In Fundamental Virology, Third Edition, B. N. Fields, et al. (Hrsg.), Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996). Andere Beispiele umfassen Murine Leukämie-Viren, Murine Sarkom-Viren, Maus-Mammatumorvirus, Boviner Leukämievirus, Feliner Leukämievirus, Feliner Sarkomvirus, Vogelleukämievirus, Human-T-Zellen-Leukämievirus, Endogener Pavianvirus, Gibbonaffen-Leukämievirus, Mason Pfizer-Affenvirus, Simianer Immunodefizienzvirus, Simianer Sarkomvirus, Rous-Sarkomvirus und Lentiviren. Andere Beispiele für Vektoren sind beispielsweise in McVey et al., U.S. 5,801,030 beschrieben, auf deren Lehren hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Vektoren können selektierbare Marker umfassen (z. B. Neomycinphosphotransferase, Histidinoldehydrogenase, Dihydrofolatreductase, Hygromycinphosphotransferase, Herpes Simplex virus-Thymidinkinase, Adenosindeaminase, Glutaminsynthetase und Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase für die eukaryotische Zellkultur; TRP1 für S. cerevisiae; Tetracyclin-, Rifampicin- oder Ampicillinresistenz in E. coli; usw.). Die Erfindung soll jedoch auch andere Formen von Expressionsvektoren umfassen, die äquivalente Funktionen erfüllen und im Nachfolgenden auf diesem Gebiet bekannt werden.
Flankiert: Ein Polynucleotid, das linearisiert oder exzisiert werden soll, wird von einer Spaltungsstelle flankiert, falls eine solche Stelle an oder in der Nähe von einem oder beiden Enden des Polynucleotids vorhanden ist. Es kann eine Spaltungsstelle vorhanden oder in der Nähe von einem Ende des Polynucleotids sein, das linearisiert oder exzisiert werden soll, oder es können zwei Spaltungsstellen vorhanden sein, eine an oder in der Nähe von jedem Ende des Polynucleotids, das linearisiert oder exzisiert werden soll. Mit ”Nähe” ist bei der vorliegenden Erfindung bevorzugt bezeichnet, dass die Spaltungsstelle bei weniger als 1 kb, bevorzugt weniger als 500 bp, insbesondere bevorzugt weniger als 200 oder 100 bp von dem Ende des zu integrierenden Polynucleotids vorhanden ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft neu entworfene Rare cutting-Endonucleasen und deren Verwendung. Diese neu entworfenen Rare cutting-Endonucleasen sind bevorzugt von der Meganuclease-Familie von ”Dodecapeptid”-LAGLIDADG abgeleitet.
HYBRID-MEGANUCLEASEN
Meganucleasen bilden eine Klasse von über 200 Rare cutting-doppelsträngigen DNA-Endonucleasen (Gruppe I Intron Homing-Endonucleasen und Inteine) (Belfort und Roberts, 1997, Nucleic Acids Res, 25, 3379–3388; Jurica and Stoddard, 1999, Cell Mol Life Sci, 55, 1304–1326). Sie erkennen asymmetrische DNA-Sequenzen mit einer Länge von zwischen 14 und 40 Basenpaaren, die Doppelstrangbrüche etwa in der Mitte ihrer Targetsequenz hervorrufen. Diese Targetstelle ist vorliegend als die Summe von zwei unterschiedlichen Halb-Sites definiert. In komplexer DNA steht zu erwarten, dass 16 (und mehr) Nucleotide lange DNA-Sequenzen selbst in einem Genom mit der Größe des menschlichen Genoms (3 × 10⁹ Basenpaare) unverwechselbar sind. Meganucleasen schneiden zelluläre Genome daher nur einmal, und zwar am Target-Locus.
Die LAGLIDADG-Proteinfamilie ist durch das Vorhandensein von einer oder zwei Kopien eines gut bewahrten Sequenz Motivs charakterisiert, das als Dodecapeptid, oder P1 und P2, LAGLI und DADG oder LAGLIDADG bezeichnet wird. Ausserhalb dieser Motive besteht keine relevante Sequenzhomologie (paarweise Sequenzhomologien insgesamt machen weniger als 25% aus). Die kleineren Beispiele, d. h. I-CreI (Durrenberger and Rochaix, 1991, Embo J, 10, 3495–3501), haben nur ein Dodecapeptid-Motiv und fungieren als Homodimere von zwei 15–20 kDa-Unterbausteinen oder Subdomänen. Diese Proteine mit nur einem Dodecapeptid-Motiv werden in der vorliegenden Anmeldung als ”Mono-Dodecapeptid”-Proteine bezeichnet. Größere Proteine, d. h. I-DmoI (Dalgaard et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 5414–5417), I-SceI (Jacquier et Dujon, 1985, Cell, 41, 383–394) und PI-SceI (Gimble und Wang, 1996, J Mol Biol, 263, 163–180) hingegen sind Einzelketten-Proteine (20–30 kDa), die zwei (nicht-identische) Dodecapeptidmotive tragen. Diese Proteine mit zwei Dodecapeptidmotive werden in der vorliegenden Anmeldung as”Di-Dodecapeptid”-Proteine bezeichnet.
Detaillierte dreidimensionale Strukturen (Chevalier et al., 2001, Nat Struct Biol, 8, 312–316; Duan et al., 1997, Cell, 89, 555–564; Heath et al., 1997, Nat Struct Biol, 4, 468–476; Hu et al., 2000, J Biol Chem, 275, 2705–2712; Ichiyanagi et al., 2000, J Mol Biol, 300, 889–901; Jurica et al., 1998, Mol Cell, 2, 469–476; Poland et al., 2000, J Biol Chem, 275, 16408–16413; Silva et al., 1999, J Mol Biol, 286, 1123–1136) wurden für vier LAGLIDADG-Proteine aufgelöst: I-CreI (1), I-DmoI (2), PI-SceI und PI-PfuI. Diese Strukturen veranschaulichen, dass die Dodecapeptidmotive Teil eines Zwei-Helix-Bündels sind. Die zwei α-Helices bilden den Großteil der zentralen Schnittstelle, an der eine zweifache (Pseudo-)Symmetrieachse zwei strukturelle Domänen voneinander trennt. Zusätzlich zu dem Dodecapeptidmotiv weist jede Domäne eine DNA-Bindungsschnittstelle auf, die das Protein zu einer Interaktion mit einer der zwei Half-Sites der Target-DNA-Sequenz treibt.
Eine unverwechselbare katalytische, aktive Stelle weist Aminosäurereste von beiden strukturellen Domänen auf, deren spezifische Beschaffenheit und räumliche Verteilung für eine DNA-Spaltung erforderlich ist. In der Familie von LAGLIDADG-Proteinen sind die Reste in den aktiven Stellen divergent. Die einzigen Reste, die eine dauerhafte Bewahrung aufweisen, sind die letzten sauren Aminosäuren (D oder E) von beiden LAGLIDADG-Motiven (unterstrichener Rest). Deshalb ist es schwierig, Resten in der aktiven Stelle funktionale Rollen zuzuordnen, mit Ausnahme dieser sauren Aminosäuren. Mutationen dieser Reste beseitigen die Katalyse, aber nicht die DNA-Bindung (Lykke-Andersen et al., 1997, Embo J, 16, 3272–3281; Gimble & Stephens, 1995, J. Biol. Chem., 270, 5849–5856). Ausserdem spielt eine Hydrierungssschale, die aus mehreren Wassermolekülen besteht, welche strukturell durch die Aminosäuren-Seitenketten von sauren und basischen Resten organisiert sind, zusammen mit divalenten Kationen wahrscheinlich eine wesentliche Rolle bei der Durchführung der Spaltung von DNA-Phosphodiesterbindungen (Chevalier et al., 2001, Nat Struct Biol, 8, 312–316).
Die Manipulation von bekannten Meganucleasen, um deren Spezifizität zu DNA-Sequenzen zu modifizieren, könnte das Targeting neuer DNA-Sequenzen und die Erzeugung von Doppelstrangbrüchen in ausgewählten Genen ermöglichen.
Reste, die zu der Interdomänen-Packungsschnittstelle und der katalytischen Stelle in einer Beziehung stehen, sind jedoch sehr eingeschränkt. Es ist bekannt, dass die katalytischen Domänen von Enzymen oftmals komplex und stark reaktiv gegen Modifikationen sind. Im Falle der Meganucleasen ist diese Empfindlichkeit gegen eine Modifikation erhöht, da die katalytische Stelle durch die Schnittstelle von zwei Domänen gebildet wird. Folglich ist nicht bekannt, ob ein Domänenaustausch von Meganucleasen mit unterschiedlicher katalytischen Stellenresten funktionale, aktive Proteine wieder herstellen würde. Ausserdem ist trotz der Domänenstruktur von bekannten Meganucleasen, insbesondere denen der Familie von LAGLIDADG-Proteinen, nichts über das modulare Verhalten einer solchen Domänenstruktur bekannt.
Die vorliegende Erfindung zeigt erstmalig, dass LAGLIDADG-Endonucleasen modular sind, und dass der Domänenaustausch von natürlichen Homing-Endonucleasen oder Meganucleasen sowohl möglich als auch nutzbringend ist: neuartige, künstliche Kombinationen von zwei Domänen, die von unterschiedlichen LAGLIDADG-Meganucleasen entnommen sind, erkennen, binden und schneiden DNA-Sequenzen, die aus den zwei entsprechenden Half-Sites bestehen. Die Manipulation solcher künstlicher Kombinationen (hybride oder chimäre Homing-Endonucleasen oder Meganucleasen) ist in erster Linie nützlich, um Meganucleasen mit einer neuen Spezifizität zu erzeugen.
Die Familie von LAGLIDADG-Proteinen zeigt im Wesentlichen eine Sequenzbewahrung in den Dodecapeptidmotiven. Die 3D-Strukturen sind ähnlich: sie haben den gleichen Satz von sekundären Strukturelementen, die mit einer unverwechselbaren Topologie organisiert sind. Die Bewahrung des Dodecapeptidmotivs und der Proteingröße (insbesondere die Trenndistanz als Sequenzlänge zwischen zwei Dodecapeptidmotiven in Di-Dodecameganuclease zusammen mit den biologischen Beziehungen, d. h. gleiche ”Funktion” und bewahrte 3D-Architektur) scheinen ausreichend sein, um vorzuschlagen, dass die sekundäre Struktur bewahrt wird.
Die Beschreibung offenbart neuartige Endonucleasen, genauer gesagt Hybrid-Meganucleasen, bevorzugt abgeleitet von mindestens zwei verschiedenen LAGLIDADG-Meganucleasen. Bei den anfänglichen Meganucleasen kann es sich um ”Mono-Dodecapeptid” oder ”Mono-LAGLIDADG” wie etwa I-Cre I-Meganuclease oder ”Di-Dodecapeptid”- oder ”Di-LAGLIDADG”-Meganucleasen wie etwa I-DmoI handeln. Diese neu entworfenen Endonucleasen oder Meganucleasen sind Hybride von LAGLIDADG-Meganucleasen. Die Erfindung betrifft eine Hybrid-Meganuclease zwei Domänen umfassend, wobei jede Domäne von einer anderen LAGLIDADG-Meganuclease abgeleitet ist. Siehe Tabelle 1 (Motiv ”D” bezieht sich auf Mono-Dodecapeptid-Meganucleasen, und Motiv ”dd” oder ”DD” auf Di-Dodecapeptid-Meganucleasen). Die Beschreibung offenbart eine Hybrid-Meganuclease zwei Domänen umfassend, wobei jede Domäne von der gleichen Meganuclease abgeleitet ist, aber in einer unterschiedlichen Anordnung (z. B. Ort, Organisation, Position usw.) im Vergleich mit der anfänglichen Meganuclease (z. B. ist die zweite Domäne von der N-terminalen Domäne der anfänglichen Meganuclease abgeleitet, und/oder die erste Domäne ist von der C-terminalen Domäne der anfänglichen Meganuclease abgeleitet).
Mit ”Domäne” von LAGLIDADG-Meganucleasen wird bei der vorliegenden Erfindung ein Polypeptidfragment bezeichnet, das ein Dodecapeptidmotiv und einen DNA-bindenden Rest umfasst oder daraus besteht. Optional kann die Domäne auch zusätzliche Polypeptidsequenzen umfassen, die weder beim Binden von DNA noch in der Domänenschnittstelle involviert sind. Solche zusätzliche Sequenzen besitzen jedoch eine variable Größe und sind im Allgemeinen weder für die DNA-Erkennung und -Binding noch die Endonuclease-Aktivität von entscheidender Wichtigkeit. Das Dodecapeptidmotiv ist in einer α-Helix involviert, vorliegend schematisch als α LAGLIDADG oder α^D bezeichnet. Genauer gesagt cappt der D(E)-Rest im Allgemeinen die α-Helix, und der nachfolgende Gly-Rest initiiert eine Neuausrichtung der Hauptkette in einen β-Strang senkrecht zur α-Helix. Der DNA-bindende Rest, vorliegend schematisch als DBM bezeichnet, umfasst im Allgemeinen α-Helices und β-Stränge. Der minimale DNA-bindende Rest in einer Meganuclease ist eine β-Haarnadel (zwei β-Stränge, die durch einen Loop oder eine Kehre verbunden sind). Natürliche Meganucleasen umfassen in jedem DNA-bindenden Rest zwei solche β-Haarnadeln, die zu einem 4-strängigen β-Faltblatt verbinden. Die Verbindung zwischen den zwei β-Haarnadeln umfasst eine α-Helix. Der DNA-bindende Rest umfasst im Allgemeinen eine weitere α-Helix hinter dem 4-strängigen β-Faltblatt. Die zusätzlichen Polypeptidsequenzen waren auf jeder Seite der Gruppe zu finden, die aus dem Dodecapeptid-Motiv und dem DNA-bindenden Rest besteht. Deshalb umfasst eine Meganucleasedomäne gemäß der vorliegenden Erfindung die Helix, welche das Dodecapeptidmotiv umfasst, α^D, und einen DNA-bindenden Rest, DBM. Optional kann eine zusätzliche Sequenz ferner in der Domäne enthalten sein. Die zusätzliche Sequenz ist auf der N-terminalen Seite einer ersten Domäne der Hybrid-Meganuclease oder auf der C-terminalen Seite einer zweiten Domäne der Hybrid-Meganuclease möglich.
Die LAGLIDADG-Meganucleasen, die zwei Dodecapeptidmotive umfassen, vorliegend als Di-LAGLIDADG-Meganuclease bezeichnet, umfassen zwei Domänen, von denen eine als N-terminale Domäne und die andere als C-terminale Domäne bezeichnet wird. Die N-terminale Domäne umfasst nacheinander eine zusätzliche optionale Sequenz, das Dodecapeptidmotiv und den DNA-bindenden Rest. Die C-terminale Domäne umfasst nacheinander das Dodecapeptidmotiv, den DNA-bindenden Rest und eine zusätzliche optionale Sequenz. Die zwei Dodecapeptid-α-Helices jeder Domäne bilden eine dicht gepackte Domänenschnittstelle. Der Loop, der die zwei Domänen verbindet, befindet sich zwischen dem DNA-bindenden Rest der N-terminalen Domäne und der Helix, welche das zweite Dodecapeptidmotiv der C-terminalen Domäne umfasst. Die Di-Dodecapeptid-Meganucleasen könnten schematisch durch die folgende Struktur von dem N-terminalen Ende zu dem C-terminalen End dargestellt werden: V α^D DBM (L) α'^D DBM' V' (wobei sich V auf die zusätzliche optionale Sequenz, α^D auf die Helix mit dem Dodecapeptidmotiv, DBM auf den DNA-bindenden Rest, L auf den verbinden Loop bezieht; der Apostroph ' bezieht sich auf die Elemente der C-terminalen Domäne). Die Helices α^D und α'^D entsprechen den Helices, welche die Dodecapeptidmotive umfassen. Die Domänen einer Meganuclease, die zwei Dodecapeptidmotive umfasst, sind asymmetrisch (ähnlich, aber im Allgemeinen nicht identisch). Die Anzahl von Di-Dodecapeptid-Meganucleasen ist bekannt. Siehe Tabelle 1, Motiv ”dd” oder ”DD”. (Siehe auch Dalgaard et al., 1993, Proc Natl Acad Sci USA, 90, 5414–5417, Tabelle 1 und 1)
Die dimeren LAGLIDADG-Meganucleasen, die ein Dodecapeptidmotiv umfassen, vorliegend als Mono-Dodecapeptid-Meganucleasen bezeichnet, umfassen nacheinander eine zusätzliche optionale Polypeptidsequenz, das Dodecapeptidmotiv, den DNA-bindenden Rest und eine zusätzliche optionale Polypeptidsequenz. Die zwei Dodecapeptid-Helices (eine in jedem Monomer) bilden eine dicht gepackte Dimerschnittstelle. Die Mono-Dodecapeptid-Meganucleasen könnten schematisch dargestellt werden durch die folgende Struktur, welche vom N-terminalen Ende bis zum C-terminalen Ende folgendes umfasst: V α^D DBM V' (wobei sich V und V' auf zusätzliche optionale Sequenzen, α^D auf die Helix mit dem Dodecapeptidmotiv, DBM auf den DNA-bindenden Rest beziehen). Die Anzahlen von Mono-Dodecapeptid-Meganucleasen sind bekannt. Siehe Tabelle 1, Motiv D (Siehe auch Lucas et al., 2001, Nucleic Acids Res., 29, 960–9, Tabelle 1 und 1).
Die Beschreibung offenbart auch die nachfolgenden Absätze [45] bis [62], [65] bis [79], [85] bis [123], [128] bis [129], [186] bis [200], [209] bis [236], welche nicht Teil der Erfindung sind.
Noch stärker bevorzugt I-Dmo I/I-Cre I, und I-Cre I/I-Dmo I; oder
Beispielsweise entspricht für ”I-Sce I/I-Ceu I” die erste angegebene Meganuclease dem Ursprung der ersten Domäne der Hybrid-Meganuclease, und die zweite angegebene Meganuclease dem Ursprung der zweiten Domäne der Hybrid-Meganuclease.
Die Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus:

1) einer ersten Domäne aus einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease und einer zweiten Domäne aus einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind;
2) einer ersten Domäne aus einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease und einer zweiten Domäne aus einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind;
3) einer ersten Domäne aus einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease und einer zweiten Domäne aus einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind; oder
4) einer ersten Domäne aus einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease und einer zweiten Domäne aus der gleichen oder einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease, bevorzugt aus einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind.

Die Mittel für die Einführung einer Verbindung zwischen den zwei Domänen der Hybrid-Meganuclease gemäß der Erfindung sind dem Fachmann allgemein bekannt. Bei der vorliegenden Erfindung sind die bevorzugten Mittel entweder die Verwendung eines flexiblen Polypeptid-Linkers oder die Verwendung eines Loops aus einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease. Bei der vorliegenden Erfindung ist der Loop eine Ausführungsform des Linkers. Der flexible Polypeptid-Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threoninreste. Der Loop kann entweder ein Loop sein, der in einer der zwei anfänglichen Di-Dodecapeptid-Meganucleasen vorliegt, die für den Entwurf der Hybrid-Meganuclease verwendet werden, oder ein Loop aus einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease, bevorzugt dem I-Dmo I-Loop, der zwischen die zwei Domänen eingebracht wird.
Unser bevorzugter Lösungsansatz für die Erzeugung einer Hybrid-Meganuclease ist ein Domänenaustausch, der mit den verschiedenen LAGLIDADG-Meganucleasen in Einklang ist.
N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease

Eine erste Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Der Austauschpunkt ist an eine beliebigen geeigneten Stelle positioniert. Der Austauschpunkt ist der Punkt, an dem die Sequenz der ersten Meganuclease (A) im Wesentlichen durch die Sequenz der zweiten Meganuclease (B) ersetzt wird. Dieser Austauschpunkt von der letzten Helix des DNA-bindenden Rests DBM zum Ende der das zweite Dodecapeptidmotiv, α'^D, umfassenden Helix positioniert sein. Er liegt bevorzugt innerhalb des Loops (L), der vor dem zweiten Dodecapeptidmotiv (α'^D) oder in der das Dodecapeptidmotiv umfassenden Helix (α'^D) positioniert ist. Im Allgemeinen nehmen wenige Aminosäuren, etwa 4 bis 10 Aminosäuren, vor dem Dodecapeptidmotiv, auch an der Bildung der Helix (α'^D) teil. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Austauschpunkt innerhalb der Helix (α'^D) positioniert. Bei einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform ist der Austauschpunkt in der Helix (α'^D) vor dem Dodecapeptidmotiv selbst positioniert. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst die N-terminale Domäne der Meganuclease A und die C-terminale Domäne der Meganuclease B. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D	DBM	L	α'^D	DBM'	V', optional
1	A	αA	A(N)	A	α'A	B(C)	B
2	A	αA	A(N)	A	α'A/α'B	B(C)	B
3	A	αA	A(N)	A	α'B	B(C)	B
4	A	αA	A(N)	A/B	α'B	B(C)	B
5	A	αA	A(N)	B	α'B	B(C)	B
6	A	αA	A(N)/B(N)	B	α'B	B(C)	B

Hierbei geben A und B die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Der Austauschpunkt ist durch eine ”Austauschdomäne” ersetzt. Anstatt die Sequenz abrupt zu ändern, können die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease nämlich eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste von den Helices α^D und α'^D, die auf die Schnittstelle der Helices hin gerichtet sind, sind diejenigen einer Meganuclease für beide Helices α^D und α'^D (entweder diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease A oder diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus der α^D und α'^D umfassenden Helix, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease zu finden sind, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α'^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	αA	αA	A(N)	A	α'A	α'B	B(C)	B
2	A	αA	αB	A(N)	A	α'B	α'B	B(C)	B
3	A	αA	aX	A(N)	A	α'X	α'B	B(C)	B
4	A	αA	aX	A(N)	A	α'X	α'B	B(C)	B
5	A	αA	aX	A(N)	A/B	α'A	α'B	B(C)	B
6	A	αA	αB	A(N)	A/B	α'B	α'B	B(C)	B
7	A	αA	aX	A(N)	A/B	α'X	α'B	B(C)	B
8	A	αA	aX	A(N)	A/B	aX	α'B	B(C)	B
9	A	αA	αA	A(N)	B	α'A	α'B	B(C)	B
10	A	αA	αB	A(N)	B	α'B	α'B	B(C)	B
11	A	αA	aX	A(N)	B	α'X	α'B	B(C)	B
12	A	αA	aX	A(N)	B	aX	α'B	B(C)	B
13	A	αA	αA	A(N)/B(N)	B	α'A	α'B	B(C)	B
14	A	αA	αB	A(N)/B(N)	B	α'B	α'B	B(C)	B
15	A	αA	aX	A(N)/B(N)	B	α'X	α'B	B(C)	B
16	A	αA	aX	A(N)/B(N)	B	α'X	α'B	B(C)	B

Hierbei geben A, B und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, a, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619). Optional kann der Loop vollständig oder teilweise durch einen geeigneten Linker ersetzt werden. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst bevorzugt Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Optional kann der Loop auch durch einen Loop aus irgendeiner anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease, bevorzugt den I-Dmo I-Loop, ersetzt werden.
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst oder daraus besteht, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind, an ihrem N- und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne aufweisen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal, oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden. Somit ist die Hauptfunktion des Hybrids eine spezifische DNA-Bindung.
N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine zweite Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und eine zweite Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Der Austauschpunkt ist an einer beliebigen geeigneten Stelle positioniert. Er ist bevorzugt am Ende des Loops (LA) vor dem zweiten Dodecapeptidmotiv (α'^D) oder in der Helix (α'^D) positioniert. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Austauschpunkt innerhalb der Helix (α'^D) positioniert. Der Austauschpunkt ist in der Helix (α'^D) vor dem Dodecapeptidmotiv selbst positioniert. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die N-terminale Domäne der Meganuclease A und die N-terminale Domäne der Meganuclease B. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der C-terminalen Domäne der Meganuclease B, insbesondere bevorzugt ihre C-terminalen Domäne. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

1 A αA A(N) A α'A B(N) B

2 A αA A(N) A α'A/αB B(N) B

3 A αA A(N) A αB B(N) B
Hierbei geben A und B die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Der Austauschpunkt ist durch eine Austauschdomäne. Anstatt die Sequenz abrupt zu ändern, können die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease nämlich eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices α^D und α'^D (diejenigen von α^D und α'^D von entweder der Meganuclease A oder B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter			inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	αA	αA	A(N)	A	α'A	αB	B(N)	B
2	A	αA	αB	A(N)	A	α'B	αB	B(N)	B
3	A	αA	aX	A(N)	A	α'X	αB	B(N)	B
4	A	αA	aX	A(N)	A	aX	αB	B(N)	B

Hierbei geben A, B und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um um die sterische Hinderung zwischen Aminosäure-Seitenketten zu vermeiden und/oder um die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Stabilität zu erhöhen und um die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619). Optional kann der Loop vollständig oder teilweise mit einem geeigneten Linker ersetzt werden. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Der flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Ein kurzer flexibler Linker kann auch zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden.
Optional kann der Loop auch durch einen Loop aus einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease ersetzt werden, bevorzugt den I-Dmo I-Loop.
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N- und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne aufweisen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal, oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
A Hybrid-Meganuclease, umfassend oder bestehend aus einer ersten Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease abgeleitet ist, (A) und einer zweiten Domäne, die von der N-terminalen Domäne der gleichen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind, wird ebenfalls in der Beschreibung beschrieben. Die gleichen Entwurfsregeln werden auf diese Art von Meganuclease angewendet.
N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/Domäne von Mono-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine dritte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne aus der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und einer zweiten Domäne von einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B), wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Der Austauschpunkt ist an einer beliebigen geeigneten Stelle positioniert. Er ist bevorzugt am Ende des Loops (LA) vor dem zweiten Dodecapeptidmotiv (α'^D) der Meganuclease (A) oder in der Helix α^D positioniert. Der Austauschpunkt ist innerhalb der Helix α'^D positioniert. Der Austauschpunkt ist in der Helix α'^D vor dem Dodecapeptidmotiv selbst positioniert. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die N-terminale Domäne der Meganuclease A und die Domäne der Meganuclease B. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

1 A αA A(N) A α'A B B

2 A αA A(N) A α'A/αB B B

3 A αA A(N) A αB B B
Hierbei geben A und B die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Die Erfindung betrifft genauer gesagt eine Hybrid-Meganuclease I-Dmo I/I-Cre I, die eine erste Domäne aus der N-terminalen Domäne der I-Dmo I-Meganuclease und eine zweite Domäne aus der I-Cre I-Meganuclease umfasst oder aus dieser besteht, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Vorzugsweise ist der geeignete Linker der I-Dmo I-Meganuclease-Loop. Vorzugsweise ist der Austauschpunkt in der Helix α'^D vor dem Dodecapeptidmotiv selbst positioniert. Bei einer Ausführungsform betrifft die Erfindung die Hybrid-Meganucleasen I-Dmo I/I-Cre I, die in Beispiel 1 und in 6 beschrieben sind, oder eine Variante davon.

Bei einer alternativen Ausführungsform ist der Austauschpunkt durch eine Austauschdomäne ersetzt. Anstatt die Sequenz abrupt zu ändern, können die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease nämlich eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices (diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease A, oder diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A, oder diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	αA	αA	A(N)	A	α'A	αB	B	B
2	A	αA	αB	A(N)	A	αB	αB	B	B
3	A	αA	aX	A(N)	A	α'X	αB	B	B
4	A	αA	aX	A(N)	A	aX	αB	B	B

Hierbei geben A, B und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, a^D ^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619).
Optional kann der Loop vollständig oder teilweise durch einen geeigneten Linker ersetzt werden. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst bevorzugt Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Optional kann der Loop auch durch einen Loop aus irgendeiner anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease ersetzt werden, bevorzugt den I-Dmo I-Loop.
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der Domäne einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine vierte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Der Austauschpunkt ist an einer beliebigen geeigneten Stelle positioniert. Dieser Austauschpunkt kann von der letzten Helix des DNA-bindenden Restes DBM zum Anfang des Loops (LB) vor der Helix α'^D hin positioniert sein. Er ist bevorzugt am Anfang des Loops (LB) vor der Helix α'^D positioniert. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst die C-terminale Domäne der Meganucleasen A und B. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der N-terminalen Domäne der Meganuclease A, insbesondere bevorzugt ihre N-terminalen Domäne. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

1 A α'A A(C) B α'B B(C) B

2 A α'A A(C)/B(N) B α'B B(C) B
Hierbei geben A und B die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Der Austauschpunkt ist durch eine ”Austauschdomäne” ersetzt. Anstatt die Sequenz abrupt zu ändern, können die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease nämlich eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Schnittstelle der Helices hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices α^D und α'^D (diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease A oder diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α'^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α'^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM'	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM'	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	α'A	αA	A(C)	B	α'A	α'B	B(C)	B
2	A	α'A	αB	A(C)	B	α'B	α'B	B(C)	B
3	A	α'A	aX	A(C)	B	α'X	α'B	B(C)	B
4	A	α'A	aX	A(C)	B	aX	α'B	B(C)	B
5	A	α'A	αA	A(C)/B(N)	B	α'A	α'B	B(C)	B
6	A	α'A	αB	A(C)/B(N)	B	α'B	α'B	B(C)	B
7	A	α'A	aX	A(C)/B(N)	B	α'X	α'B	B(C)	B
8	A	α'A	aX	A(C)/B(N)	B	aX	α'B	B(C)	B

Hierbei geben A, B und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619). Optional kann der Loop vollständig oder teilweise durch einen geeigneten Linker ersetzt werden. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst bevorzugt Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Optional kann der Loop auch durch einen Loop aus irgendeiner anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease ersetzt werden, bevorzugt den I-Dmo I-Loop.
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
Eine Hybrid-Meganuclease, umfassend oder bestehend aus einer ersten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der C-terminalen Domäne der gleichen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind, wird ebenfalls in der Beschreibung beschrieben. Die gleichen Entwurfsregeln werden auf diese Art von Meganuclease angewendet.
Domäne von Mono-Dodecapeptidmeganuclease/C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine fünfte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne aus der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und einer zweiten Domäne aus der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B), wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Der Austauschpunkt kann von der letzten Helix des DNA-bindenden Restes DBM zum Anfang des Loops (LB) vor der Helix α'^D hin positioniert sein. Er ist bevorzugt am Anfang des Loops (LB) vor der Helix (α'^D) positioniert. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die Domäne der Meganuclease A und die C-terminale Domäne der Meganuclease B. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

1 A αA A B α'B B(C) B

2 A αA A/B(N) B α'B B(C) B
Hierbei geben A und B die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Der Austauschpunkt ist durch eine ”Austauschdomäne” ersetzt. Anstatt die Sequenz abrupt zu ändern, können die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease nämlich eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Schnittstelle der Helices hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices α^D und α'^D (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A oder diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α'^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V' optional
Typ	V optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V' optional
1	A	αA	αA	A	B	αA	α'B	B(C)	B
2	A	αA	αB	A	B	α'B	α'B	B(C)	B
3	A	αA	aX	A	B	α'X	α'B	B(C)	B
4	A	αA	aX	A	B	aX	α'B	B(C)	B
5	A	αA	αA	A/B(N)	B	αA	α'B	B(C)	B
6	A	αA	αB	A/B(N)	B	α'B	α'B	B(C)	B
7	A	αA	aX	A/B(N)	B	α'X	α'B	B(C)	B
8	A	αA	aX	A/B(N)	B	aX	α'B	B(C)	B

Hierbei geben A, B und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. A/B gibt an, dass der Austauschpunkt im Segment ist, der Ursprung des ersten Teils des Elementes A ist, und dass derjenige des zweiten Teils B ist. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619). Optional kann der Loop vollständig oder teilweise durch einen geeigneten Linker ersetzt werden. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Optional kann der Loop auch durch einen Loop aus irgendeiner anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease ersetzt werden, bevorzugt den I-Dmo I-Loop.
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine sechste Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweitem Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Die erste und die zweite Domäne sind entweder durch einen geeigneten Linker oder einen Verbindungs-Loop aus einer beliebigen Di-Dodecapeptid-Meganuclease Y verbunden, beispielsweise den Loop der I-Dmo I-Meganuclease. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es können auch kurze flexible Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Der Linker wird bevorzugt an einem Ende an die Helix nach dem 4-strängigen β-Faltblatt des DBM der C-terminalen Domäne der Meganuclease A und am anderen Ende an der Helix α^D der N-terminalen Domäne der Meganuclease B angehängt. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende, die C-terminale Domäne der Meganuclease A, einen Linker oder einen Verbindungs-Loop, und die N-terminale Domäne der Meganuclease B. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der N-terminalen Domäne der Meganuclease A, insbesondere bevorzugt ihre N-terminale Domäne. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der C-terminalen Domäne der Meganuclease B, insbesondere bevorzugt ihre C-terminale Domäne. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

A α'A A(C) Y αB B(N) B
Hierbei geben A, B und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease können eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices α^D und α'^D (diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease A oder B).). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α'^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	α'A	αA	A(C)	Y	α'A	αB	B(N)	B
2	A	α'A	αB	A(C)	Y	α'B	αB	B(N)	B
3	A	α'A	aX	A(C)	Y	α'X	αB	B(N)	B
4	A	α'A	aX	A(C)	Y	aX	αB	B(N)	B

Hierbei geben A, B, X und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619).
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
Eine Hybrid-Meganuclease, umfassend oder bestehend aus einer ersten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist und einer zweiten Domäne, die von der N-terminalen Domäne der gleichen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind, wird ebenfalls in der Beschreibung beschrieben. Die gleichen Entwurfsregeln werden auf diese Art von Meganuclease angewendet.
Domäne von Mono-Dodecapeptid-Meganuclease/N-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine siebte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Die erste und die zweite Domäne sind entweder durch einen geeigneten Linker oder einen Verbindungs-Loop aus einer beliebigen Di-Dodecapeptid-Meganuclease Y verbunden, beispielsweise den Loop von I-Dmo I-Meganuclease. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Der Linker wird bevorzugt an einem Ende an der Helix nach dem 4-strängigen β-Faltblatt des DBM der Domäne der Meganuclease A und am anderen Ende an der Helix α^D der N-terminalen Domäne der Meganuclease Bangebracht. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die Domäne der Meganuclease A, einen Linker oder Verbindungs-Loop, und die N-terminale Domäne der Meganuclease B. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der C-terminalen Domäne der Meganuclease B, insbesondere bevorzugt ihre C-terminalen Domäne.
Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

A αA A Y αB B(N) B
Hierbei geben A, B und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease können eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A, oder diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A und diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	αA	αA	A	Y	αA	αB	B(N)	B
2	A	αA	αB	A	Y	α'B	αB	B(N)	B
3	A	αA	aX	A	Y	α'X	αB	B(N)	B
4	A	αA	aX	A	Y	aX	αB	B(N)	B

Hierbei geben A, B, X und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619).
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der N-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
C-terminale Domäne von Di-Dodecapeptid-Meganuclease/Domäne von Mono-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine achte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der Domäne einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Die erste und die zweite Domäne sind entweder durch einen geeigneten Linker oder einen Verbindungs-Loop aus einer beliebigen Di-Dodecapeptid-Meganuclease Y verbunden, beispielsweise den Loop der I-Dmo I-Meganuclease. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Der Linker wird bevorzugt an einem Ende an der Helix nachdem 4-strängigen β-Faltblatt des DBM der C-terminalen Domäne der Meganuclease A und am anderen Ende an der Helix α^D der Domäne der Meganuclease B angebracht. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die C-terminale Domäne der Meganuclease A, einen Linker oder einen Verbindungs-Loop, und die Domäne der Meganuclease B. Vorzugsweise umfasst die resultierende Hybrid-Meganuclease nicht den DBM der N-terminalen Domäne der Meganuclease A, insbesondere bevorzugt ihre N-terminalen Domäne. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

A α'A A(C) Y αB B B
Hierbei geben A, B, und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, a^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.

Die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease können eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices (diejenigen von α^D und α'^D aus der Meganuclease A, oder diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von a' aus der Meganuclease A und diejenigen von α^D aus der Meganuclease B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ	V, optional	α^D		DBM	L	α'^D		DBM'	V', optional
Typ	V, optional	intra	inter	DBM	L	inter	intra	DBM'	V', optional
1	A	α'A	αA	A(C)	Y	α'A	αB	B	B
2	A	α'A	αB	A(C)	Y	αB	αB	B	B
3	A	α'A	aX	A(C)	Y	aX	αB	B	B
4	A	α'A	aX	A(C)	Y	α'X	αB	B	B

Hierbei geben A, B, X und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619).
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der C-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der Domäne einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
Domäne von Mono-Dodecapeptid-Meganuclease/Domäne von Mono-Dodecapeptid-Meganuclease
Eine neunte Hybrid-Meganuclease umfasst oder besteht aus einer ersten Domäne, die von der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der Domäne der gleichen oder einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, wobei die erste und die zweite Domäne mittels eines geeigneten Linkers gebunden sind. Die erste und die zweite Domäne sind entweder durch einen geeigneten Linker oder einen Verbindungs-Loop aus einer beliebigen Di-Dodecapeptid-Meganuclease Y verbunden, beispielsweise den Loop der I-Dmo I-Meganuclease. Ein geeigneter Linker ist bevorzugt flexibel. Dieser flexible Linker umfasst im Wesentlichen Glycin-, Serin- und Threonin-Reste. Es kann auch ein kurzer flexibler Linker zwischen den Loop und die Domänen eingebracht werden. Der Linker wird bevorzugt an einem Ende an der Helix nach dem 4-strängigen β-Faltblatt des DBM der Domäne der Meganuclease A und am anderen Ende an der Helix α^D der Domäne der Meganuclease B angebracht. Die resultierende Hybrid-Meganuclease umfasst vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende die Domäne der Meganuclease A, die aus der variablen Sequenz VA hinter dem DBM von B gelöscht wurd, erinen Linker oder einen Verbindungs-Loop, und die Domäne der Meganuclease B. Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

A αA A Y αB B B
Hierbei geben A, B und Y die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Die Helices α^D und α'^D der Hybrid-Meganuclease können eine Mischung aus den zwei anfänglichen Meganucleasen sein. Die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf die Helixschnittstelle hin gerichtet sind, sind diejenigen von einer Meganuclease für beide Helices (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A oder B).
Optional könnten die Reste an der Schnittstelle von einem anderen Paar von Dodecapeptid-Helices aus einer Mono- oder Di-Dodecapeptid-Meganuclease X abgeleitet sein. Innerhalb jeder Domäne sind die Aminosäurereste aus den Helices α^D und α'^D, die auf das Innere der Domäne hin gerichtet sind, diejenigen, die den Resten entsprechen, die an dieser Position in dieser Domäne der Meganuclease vorgefunden werden, aus der sie stammt (diejenigen von α^D aus der Meganuclease A und B). Eine solche Hybrid-Meganuclease umfasst schematisch:

Typ V, optional α^D DBM L α'^D DBM' V', optional

intra inter inter intra

1 A αA αA A Y αA αB B B

2 A αA αB A Y αB αB B B

3 A A aX A Y α'X αB B B

4 A αA aX A Y aX αB B B
Hierbei geben A, B, Y und X die Meganuclease am Ursprung des Segmentes V, α^D, DBM, L, α'^D, DBM', V' an. ”inter” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Schnittstelle zwischen den Domänen hin, und ”intra” bezieht sich auf die Reste von α^D und α'^D zur Innenseite jeder Domäne hin. αA und αB beziehen sich auf die α^D der N-terminalen Domäne, und α'A und α'B beziehen sich auf die α'^D der C-terminalen Domäne. Bei der Spalte ”DBM” geben die Buchstaben (N) und (C) den Ursprung aus der N-terminalen Domäne bzw. der C-terminalen Domäne an.
Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die sterische Hinderung zwischen Aminosäuren-Seitenketten zu vermeiden und/oder die Stabilität zu erhöhen. Optional können ferner einige Aminosäure-Modifikationen eingebracht werden, um die Produktion und/oder die Löslichkeit zu verbessern und die Toxizität zu verringern (Turmel et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 2610–2619).
Optional kann eine solche Hybrid-Meganuclease, die eine erste Domäne aus der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) und eine zweite Domäne aus der Domäne einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) umfasst, an ihrem N-terminalen und/oder C-terminalen Ende ferner einen Loop oder Linker und eine beliebige zusätzliche Domäne umfassen. Vorzugsweise ist die zusätzliche Domäne eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, eine nukleare Lokalisierungsdomäne oder eine DNA-Spaltungsdomäne. Optional kann die Endonuclease-Aktivität eines solchen Hybrids abgeschafft werden.
Ein Beispiel für eine Hybrid-Meganuclease, genauer gesagt eine Hybrid-Meganuclease mit einer ersten Domäne, die von der N-terminalen Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der C-terminalen Domäne einer anderen Di-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist, ist in Beispiel 1 für die I-DmoI/I-Cre I Hybrid-Meganuclease beschrieben. Ein Beispiel für eine Art der Einbringung des Linkers zwischen zwei Domänen ist in Beispiel 2 für die Einzelketten-I-Cre I Meganuclease beschrieben.
Alternative Manipulationsstrategien sind möglich. Beispielsweise könnte es sich bei einem flexiblen Linker um eine Sequenz handeln, die eine Anzahl von Glycin-, Serin- und Threonin-Aminosäuren umfasst. Ein möglicher Nachteil, der bei unserem Verfahren nicht vorliegt, könnte in diesem Fall die Notwendigkeit sein, für jede Domänenkombination die genaue Linkersequenz und Länge zusammen mit den Verbindungen zu den Protein-Domänen zu bestimmen und letztendlich zu optimieren.
Unsere bevorzugte Strategie basiert auf Strukturanalysen und einem Vergleich der Parentalproteine, zwischen denen ein Domänenaustausch stattfindet. Ein anderer Lösungsansatz erfordert das Abgleichen der Sequenzen von zwei Proteinen in den Regionen, die am sichersten Motiven von bewahrten Strukturen entsprechen. Beispielsweise steht die Sequenzbewahrung des Dodecapeptidmotivs im Zusammenhang mit dem beständigen Vorhandensein eines Interdomänen-Zweihelixbündels. Domänen-ausgetauschte Endonucleasen können durch das Austauschen von Proteinsequenzen irgendwo in dem zweiten Dodecapeptidmotiv manipuliert werden, oder unmittelbar vor diesem Motiv, wenn eine Linkerregion vorhanden sein muss.
Die Erfindung erwägt auch die Verwendung solcher Hybrid-Meganuclease im Wesentlichen als Erkennungsdomäne. In diesem Fall kann die Endonuclease-katalytische Aktivität der Hybrid-Meganuclease durch irgendeine Mutation abgeschafft werden, beispielsweise die sauren Reste DIE, die für die katalytische Aktivität nötig sind.
Die Beschreibung offenbart auch ein chimäres Protein mit einer Domäne, die von einer Dodecapeptid-Meganuclease abgeleitet ist, einem Linker und einer Helix, welche das Dodecapeptidmotiv umfasst. Optional ist der Linker ein Loop aus einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease. Optional umfasst das chimäre Protein ferner eine zusätzliche Domäne. Diese zusätzliche Domäne ist bevorzugt eine DNA-bindende Domäne, eine Transkriptionsaktivator- oder -repressordomäne, ein nukleares Lokalisierungssignal, oder eine DNA-Spaltungsdomäne.
EINZELKETTEN-MEGANUCLEASEN sind nicht Teil der Erfindung
Wir beschreiben eine Einzelketten-Meganuclease, die von ”Mono-Dodecapeptid”-Meganucleasen abgeleitet ist. Die ”Mono-Dodecapeptid”-Meganucleasen sind als Homodimer aktiv. Jedes Monomer dimerisiert in erster Linie durch ihre Dodecapeptidmotive. Diese Einzelketten-Meganuclease bindet covalent zwei Monomere einer ”Mono-Dodecapeptid”-Meganuclease, die etwa so modifiziert ist, dass eine covalente Verbindung zwischen die zwei Unterbausteine dieses Enzyms eingebracht wird. Vorzugsweise wird die covalente Verbindung durch Erzeugen einer Peptidbindung zwischen die zwei Monomere eingebracht. Die Beschreibung offenbart auch eine Einzelketten-Meganuclease, die eine erste und eine zweite Domäne in der N-terminalen zu C-terminalen Orientierung umfasst, wobei die erste und die zweite Domäne von der gleichen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease abgeleitet sind, und wobei die Einzelketten-Meganuclease geeignet ist, eine DNA-Spaltung hervorzurufen. Die Einzelketten-Meganuclease kann zwei Unterbausteine aus der gleichen Meganuclease wie etwa Einzelketten-I-Cre und Einzelketten-I-Ceu I umfassen. Die Einzelketten-I-Ceu II wird ebenfalls offenbart. Siehe Beispiel 2 für die Einzelketten-I-Cre I. Die Beschreibung eine Einzelketten-Meganuclease von I-Cre, welche die Sequenz mit SEQ-ID Nr. 6 umfasst. Eine Einzelketten-Meganuclease besitzt mehrere Vorteile. Beispielsweise ist eine Einzelketten-Meganuclease einfacher zu manipulieren. Die Einzelketten-Meganuclease ist im Vergleich mit einer Dimerformation thermodynamisch begünstigt, z. B. für die Erkennung der Targetsequenz. Die Einzelketten-Meganuclease ermöglicht die Steuerung der Oligomerisation. Gleiche Prinzipien von Hybrid-Meganucleasen treffen auf die Einzelketten-Meganuclease zu. Insbesondere siehe Hybrid-Meganuclease mit einer ersten Domäne, die von der Domäne einer Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (A) abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von der Domäne der gleichen oder einer anderen Mono-Dodecapeptid-Meganuclease (B) abgeleitet ist. Absätze [130] bis [170] sind beschränkt auf Hybrid-Meganuclease gemäß der Erfindung – Einzelketten-Meganuclease sind nur Teil der Beschreibung.
Die Erfindung betrifft auch Varianten der Hybrid-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise umfassen die Varianten einer Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease einen Kern der Meganuclease, der aus den zwei Domänen und dem Linker mit mindestens 70% Identität mit der anfänglichen Hybrid-Meganuclease besteht, insbesondere bevorzugt mindestens 80, 90, 95 oder 99% Identität. Die Variante kann 1) eine sein, bei der einer oder mehrere der Aminosäurereste mit einem bewahrtem oder nicht bewahrten Aminosäurerest substituiert sind, und ein solcher substituierter Aminosäurerest kann oder kann nicht ein solcher sein, der von dem genetischen Code codiert ist, oder 2) eine, bei der einer oder mehrere der Aminosäurereste eine Substituentengruppe umfasst, oder 3) eine, bei der die Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease mit einer anderen Verbindung fusioniert ist, wie etwa einer Verbindung zum Erhöhen der Halbwertszeit des Polypeptids (z. B. Polyethylenglycol), oder 4) eine, bei der die zusätzlichen Aminosäuren mit der Hybrid-Meganuclease fusioniert sind, wie etwa eine Leader- oder sekretorische Sequenz oder eine Sequenz, die für die Reinigung der Hybrid-Meganuclease verwendet wird. Solche Varianten sind als innerhalb der Reichweite des Fachmannes liegend anzusehen. Im Falle einer Aminosäuresubstitution in der Aminosäurensequenz einer erfindungsgemäßen Hybrid-Meganuclease können eine oder mehrere Aminosäuren durch ”äquivalente” Aminosäuren ersetzt werden. Der Ausdruck ”äquivalente” Aminosäure wird vorliegend verwendet, um jegliche Aminosäure zu bezeichnen, die für eine der Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften substituiert werden kann, so dass der Fachmann auf dem Gebiet der Peptidchemie von einer im Wesentlichen unveränderten sekundären Struktur und hydropathischen Beschaffenheit des Polypeptids ausgehen würde. Im Allgemeinen stellen die folgenden Gruppen von Aminosäuren äquivalente Änderungen dar: (1) Ala, Pro, Gly, Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, Thr; (2) Cys, Ser, Tyr, Thr; (3) Val, Ile, Leu, Met, Ala, Phe; (4) Lys, Arg, His; (5) Phe, Tyr, Trp, His. Eine modifizierte Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease ist ein Peptidmolekül, das gegen Proteolyse beständig ist, ein Peptid, in dem die -CONH-Peptidbindung modifiziert und durch eine (CH2NH) reduzierte Bindung, eine (NHCO) retro-inverso-Bindung, eine (CH2-O)-Methylen-oxy-Bindung, eine (CH2-S)-Thiomethylen-Bindung, eine (CH2CH2) carba-Bindung, eine (CO-CH2) cetomethylen-Bindung, eine (CHOR-CH2)-Hydroxyethylen-Bindung, eine (N-N)-Bindung, eine E-alcene-Bindung oder auch eine -CH=CH-Bindung ersetzt ist. Die Erfindung umfasst auch eine Hybrid oder Einzelketten-Meganuclease, in der mindestens eine Peptidbindung gemäß der vorstehenden Beschreibung modifiziert wurde.
Die vorliegende Erfindung betrifft jegliche Zelle oder nicht-menschliches Tier, die/das eine Hybrid-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Die vorliegende Erfindung umfasst auch jegliche pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
POLYNUCLEOTIDE, DIE FÜR HYBRID- UND EINZELKETTEN-MEGANUCLEASEN CODIEREN, VEKTOREN, ZELLEN UND TIERE
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Polynucleotid, das eine Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung codiert. Von diesen Polynucleotiden betrifft die Erfindung ein Polynucleotid mit einer Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ-ID Nr. 1, 3 und 5 ausgewählt ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft:

a) jeden Vektor, der eine Polynucleotidsequenz umfasst, die für eine Hybrid-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung codiert;
b) jede prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die entweder eine Polynucleotidsequenz, die für eine Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, oder den Vektor mit dieser Polynucleotidsequenz umfasst;
c) jedes nicht-menschliche Tier mit einer Polynucleotidsequenz, die für eine Hybrid-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung codiert, einen Vektor mit dieser Polynucleotid, oder eine Zelle, die entweder dieses Polynucleotid oder einen Vektor mit diesem Polynucleotid umfasst.

Der Vektor mit einem Polynucleotid, das eine Hybrid-Meganuclease codiert, enthält die gesamte oder einen Teil der Codiersequenz für die eine Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease,die operativ mit einer oder mehreren Expression control Sequenzen verbunden ist, wodurch die Codiersequenz unter der Kontrolle von transkriptionalen Signale steht, um die Produktion oder Synthese der Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease zu ermöglichen. Deshalb ist das Polynucleotid, das eine Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease codiert, in einer Expressionskassette enthalten. Genauer gesagt umfasst der Vektor einen Replikationsursprung, einen Promotor, der operativ mit dem codierenden Polynucleotid verbunden ist, eine Ribosomen-Bindungsstelle, eine RNA-splicing site (wenn genomische DNA verwendet wird), eine Polyadenylierungsstelle, und eine Transkriptions-Terminierungsstelle. Er kann auch einen Enhancer umfassen. Die Auswahl des Promotor hängt von dem gewünschten Pfad für die Expression der Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease ab.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erzeugen einer Hybrid-Meganuclease, welches das Einbringen eines Expressionsvektors in eine Zelle umfasst, die mit dem Element des Expressionsvektors kompatibel ist.
Die Polynucleotidsequenz, welche die Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease codiert, kann durch jegliches bekannte Verfahren bereitet werden.
Beispielsweise kann die Polynucleotidsequenz, welche die Hybrid-Meganuclease codiert, aus den Polynucleotidsequenzen, welche die anfänglichen Meganucleasen codieren, durch übliche molekularbiologische Vorgehensweisen bereitet werden.
Vorzugsweise wird die Polynucleotidsequenz, welche die Hybrid- oder Einzelketten-Meganuclease codiert, bevorzugt durch allgemein bekannte Rück- oder Revers-Translationsverfahren bereitet. Es ist eine Anzahl von Rücktranslation-Softwares verfügbar, beispielsweise in der GCG Sequence Analysis Package (University of Wisconsin, Madison, Wis.); in DNA strider, in EMBOSS (European Molecular Biology Open Software Suite http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Software/EMBOSS/Apps/backtranseq.html); usw.). Die erhaltene Polynucleotidsequenz kann durch jegliches Verfahren synthetisiert werden, das dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist.
HYBRIDERKENNUNGS- UND SPALTSTELLEN
Die Hybrid-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung erkennen und spalten eine Hybridstelle oder ein Target, die/das die Half-Sites enthält, die von jeder der Domänen erkannt werden, die in der Hybrid-Meganuclease enthalten sind.
Die Erkennungsstellen der Meganucleasen sind nicht palindromisch. Für eine Di-Dodecapeptid-Meganuclease A erkennen die N-terminalen und C-terminalen Domänen zwei unterschiedliche halbe Erkennungsstellen; diese sind vorliegend als ”Site L_A” und ”Site R_A” bezeichnet. Die angegebenen Sequenzen für die anfänglichen Half-Sites entsprechen im Allgemeinen der Sequenz des +-Strangs des Genoms. ”L” bezieht sich auf den linken Teil der Stelle, und ”R” auf den rechten Teil. Deshalb kann die Stelle der Meganuclease A als Site LA-Site RA beschrieben werden. Mit ”RC Site” ist bei der vorliegenden Erfindung die reverse Komplementärsequenz der Half-Site auf dem +-Strang der genomischen Targetstelle bezeichnet.
Die Orientierung der Parentalmoleküle auf ihre jeweilige Erkennungs- und Spaltungsstelle ist nicht immer genau definiert oder bekannt. Daher müssen vorzugsweise mehrere Half-Site-Kombinationen synthetisiert und einer Spaltung unterzogen werden. Beispielsweise für eine Hybrid-Meganuclease mit einer ersten Domäne, die von einer Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease A abgeleitet ist, und einer zweiten Domäne, die von einer Domäne einer Di-Dodecapeptid-Meganuclease B abgeleitet ist, werden die folgenden Targetstellen bevorzugt verwendet:
Site L_A-Site R_B
RC Site R_A-Site R_B
Site L_A-RC Site L_B
RC Site R_A-RC Site L_B
Wenn die Orientierung bekannt ist, kann die Hybridstelle einfach ohne jede Kombination definiert werden. Die Bestimmung der Orientierung kann durch die Erzeugung von Hybrid-Meganuclease und die Untersuchung ihrer Spezifizität an den mehreren Targets der vorstehend erwähnten Kombination festgestellt werden. Siehe Beispiel 3 (I-DmoI/I-Cre 1) für eine Art der Bestimmung der jeweiligen Orientierung der Meganuclease und der Erkennungsstelle.
Um die Endonuclease-Aktivität und Spezifizität zu testen, wird eine synthetische Targetstelle entsprechend der Fusion der Parental-Half-Sites oder eine Kombination davon synthetisiert und in einen Vektor cloniert oder als solche verwendet.
Die Erfindung betrifft ein isoliertes oder rekombinantes Polynucleotid, das eine Hybrid-Targetstelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Diese Hybrid-Targetstelle umfasst zwei Half-Sites ausden anfänglichen Meganucleasen, jeweils eine pro Meganuclease. Die Erfindung betrifft auch einen Vektor, der eine Hybrid-Targetstelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft ferner eine Zelle, die ein rekombinantes Polynucleotid oder einen Vektor mit einer Hybrid-Targetstelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft ferner ein nicht-menschliches Tier, das ein rekombinantes Polynucleotid oder einen Vektor mit einer Hybrid-Targetstelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst. Die Erfindung betrifft ferner eine Pflanze, die ein rekombinantes Polynucleotid oder einen Vektor mit einer Hybrid-Targetstelle gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst.
Wenn über die Erkennung und Spaltungsstelle nichts bekannt ist, könnte das folgende Verfahren zum Definieren dieser Site angewendet werden.
Homing Intron-codierte Meganucleasen der Dodecapeptidefamilie erkennen und spalten normalerweise eine Sequenz, die in einem Gen ohne Intron vorhanden ist, wobei das Intron die Codiersequenz für die Meganuclease umfasst. Die Targetsequenz für die Meganuclease ist nämlich durch die Zusammenfügung von Upstream- und Downstream-Exon dargestellt, die in dem Gen ohne Intron natürlich vorhanden ist. Der Doppelstrangbruch tritt bei dieser Klasse von Meganuclease innerhalb der Erkennungsstelle auf.
In Abwesenheit von Daten über die Erstreckung der Erkennungsstelle sollte die Länge der Erkennungsstelle 30 Nucleotide auf dem linken Teil (Upstream-Exon) und 30 Nucleotide auf der rechten Seite (Eownstream-Exon) betragen, was 60 Nucleotide zum Testen der Bindung und/oder der Spaltung des Proteins bedeutet. Die Erkennungssequenz sollte um die Position des Introneinbringungspunktes in dem Gen ohne Intron zentriert sein.
Im besonderen Fall von Inteinen (PI) sollte das kanonische Target in der junction auf DNA-Level der Sequenz bestehen, die für die zwei Exteine codiert, und sollte eine Größe haben, die zu derjenigen der vorherigen Stelle (ca. 30 + 30 = 60 Nucleotide insgesamt) äquivalent ist. In Abwesenheit von Daten über die Erkennungsstelle könnte ein Unterschied bei der Bestimmung der Stelle von Intron-codierten Meganucleasen das Vorhandensein eines Cysteincodons (bei einer großen Anzahl von Fällen zu beobachten) in der Mitte der Erkennungssequenz (TOT oder TGC) sein.
Im Falle von hybrid-Meganucleasen sollte die kanonische Targetsequenz durch die junction zwischen den zwei Half-Sites jeder ursprünglichen Meganuclease dargestellt sein.
IN VITRO-SPALTASSAY
Die Erkennung und das Spalten einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch jegliches Verfahren getestet werden, das dem Fachmann bekannt ist. Ein Weg, um die Aktivität der Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganuclease zu testen, ist die Verwendung eines in vitro-Spaltungsassay an einem Polynucleotidsubtrat, das die der zu testenden Meganuclease entsprechende Erkennungs- und Spaltungsstelle umfasst. Dieses Polynucleotidsubstrat ist eine synthetische Targetstelle entsprechend der Fusion von Parental-Half-Sites, die synthetisiert und in einen Vektor cloniert wird. Dieser Vektor wird durch ein Restriktionsenzym linearisiert und daraufhin mit dem Hybrid inkubiert. Das Polynucleotidsubstrat kann linear oder kreisförmig sein und umfasst bevorzugt nur eine Spaltungsstelle. Die zu testende Meganuclease wird mit dem Polynucleotidsubstrat unter geeigneten Bedingungen inkubiert. Die resultierenden Polynucleotide werden mit einem beliebigen bekannten Verfahren analysiert, z. B. mittels Elektrophorese auf Agarose oder mittels Chromatographie. Die Meganucleaseaktivität wird durch das Auftreten von zwei Banden (Produkte) und das Verschwinden der anfänglichen Substratbande mit der vollen Länge erfasst. Vorzugsweise wird die zu testende Meganuclease mit Poteinase K verdaut, beispielsweise vor der Analyse des resultierenden Polynucleotids. Bei einer Ausführungsform wird das Targetprodukt durch die Einbringung eines Polynucleotids, das die Erkennungs- und Spaltungsequenz umfasst, in ein Plasmid mittels TA oder Restriktionsenzymcloning bereitet, optional gefolgt von der Linearisierung des Plamids. Vorzugsweise wird eine solche Linearisierung nicht in der Umgebung der Targetstelle durchgeführt. Siehe Wang et al., 1997, Nucleic Acid Research, 25, 3767–3776; In dem Abschnitt Materials & Methods” I-CreI endonuclease-Aktivität assays”, auf dessen Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird) und die Papiere zur Charakterisierung der betreffenden Meganucleasen.
Die Orientierung der anfänglichen Meganuclease auf ihre jeweilige Erkennungs- und Spaltungsstelle ist nicht immer bekannt (z. B., bindet Nterm I-DmoI den linken oder den rechten Halbteil seiner Site?). Somit müssen mehrere Half-Site-Kombinationen synthetisiert und einem Spalten unterzogen werden.
IN VIVO-SPALTUNGSASSAY
Die Erkennung und Spaltung einer spezifischen DNA-Sequenz durch die Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit jedem Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, getestet werden. Ein Weg zum Testen der Aktivität der Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganuclease ist die Verwendung eines in vivo Single-strand Annealing Recombination Test (SSA). Diese Art von Test ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in Rudin et al (Genetics 1989, 122, 519–534); Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480–4); Lin et al (Mol. Cell. Biol., 1984, 4, 1020–1034) und Rouet et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 6064–6068) beschrieben; auf dessen Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird. Dieser Test könnte für das Testen einer beliebigen Endonuclease, bevorzugt einer Rare cutting-Endonuclease, angewendet werden.
Um die Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung zu testen, entwickelten wir einen in vivo-Assay basierend auf SSA in einer eukaryotischen Zelle, und zwar einer Hefezelle oder einer höheren eukaryotischen Zelle wie etwa Säugerzellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform des in vivo-Assay verwendet das Verfahren eine Hefezelle. Dieser Organismus besitzt den Vorteil, dass er seine DNA mittels homologer Rekombination mit einer größeren Häufigkeit natürlich rekombiniert.
Dieser in vivo-Test baseirt auf der Reparatur mittels SSA eines durch einen Site-spezifischen Doppelstrangbruch induzierten Reportermarkers, der durch die zu testende Meganuclease an ihrer Erkennungs- und Spaltungsstelle erzeugt wird. Das Target besteht aus einem modifizierten Reportergen mit einer internen Duplizierung, die durch eine intervenierende Sequenz abgetrennt ist, welche die Erkennungs- und Spaltungsstelle der zu testenden Meganuclease umfasst. Die interne Duplizierung sollte mindestens 50 bp, bevorzugt 200 bp, insbesondere bevorzugt mindestens 300 oder 400 bp enthalten. Die Effektivität des SSA-Tests nimmt mit der Größe der internen Duplizierung zu. Die intervenierenden Sequenzen liegen bei und umfassen bevorzugt weniger als 2 kb. Vorzugsweise liegt die Größe der intervenierenden Sequenz, welche zumindest die Erkennungs- und Spaltungsstelle umfasst, zwischen einigen bp bis 1 kb, insbesondere bevorzugt um 500 bp. Die intervenierende Sequenz kann optional einen Selektionsmarker umfassen (z. B. Neomycinphosphotransferase, Histidinoldehydrogenase, Dihydrofolatreductase, Hygromycinphosphotransferase, Herpes simplex Virus-Thymidinkinase, Adenosindeaminase, Glutaminsynthetase und Hypoxanthin-Guaninphosphoribosyltransferase für eine eukaryotische Zellkultur; TRP1 oder URA3 für S. cerevisiae; Tetracyclin-, Rifampicin- oder Ampicillinresistenz in E. coli; usw.). Mit Reportergen ist jegliche Nucleinsäure bezeichnet, die für ein leicht zu testendes Produkt codiert, z. B. β-Galactosidase, Luciferase, alkaline Phosphatase, Grünes Fluoreszierendes Protein, Tyrosinase, DsRed-Proteine. Das Reportergen ist bevorzugt mit einem konstitutiven Promotor, der mit der in dem Assay verwendeten Zelle in einem Zusammenhang steht (z. B. CMV-Promotor), operativ verbunden. Gemäß dem vorliegenden Assayverfahren wird der Reporter nur dann erfasst, wenn ein SSA-Ereignis im Anschluss an den durch die zu testende Meganuclease eingebrachten Doppelstrangbruch eintritt.
Die zu testende Meganuclease wird in eine Expressionskassette eingebracht. Bevorzugt befindet sich diese Expressionskassette auf einem separaten Konstrukt. Die Meganuclease-Codiersequenz kann operativ mit einem induzierbaren Promotor oder mit einem konstitutiven Promotor verbunden werden. Natürlich muss der Promotor mit der in diesem Assay verwendeten Zelle kompatibel sein. Bei einer bevorzugten Ausführungsform besteht das Konstrukt aus einem Plasmid.
Optional kann jedes Konstrukt einen wählbaren Marker umfassen, um das Vorhandensein des Plasmids in der Zelle sicher zu stellen. Das Vorhandensein dieses wählbaren Markers ist für den Assay erforderlich, der in Hefezelle stattfindet. Beispielsweise bei Hefe kann das erste Konstrukt, welches das Targetgen umfasst, einen Leu2-selektierbaren Marker umfassen, der es ermöglicht, dass transformierte Hefe auf einem synthetischen Medium wächst, das kein Leucin enthält, und das zweite Konstrukt kann den Trp1-selektierbaren Marker umfassen, der es ermöglicht, dass transformierte Hefe auf einem synthetischen Medium wächst, das kein Tryptophan enthält.
Die zwei Konstrukte werden verwendet, um gleichzeitig eine geeignete Zelle zu transformieren. Wenn die Meganuclease exprimiert wird und ihre Spaltungsstelle auf dem Reporterkonstrukt erkennt, kann sie Doppelstrangbruch und Site-spezifische Rekombination zwischen den Targetsequenzen mittels eines als Single-Strand Annealing bekannten Mechanismus promoten. Das resultierende Reportergen sollte dann ein vollständig aktives Reporterprotein exprimieren. Kontrollexpeminente können mit einem Konstrukt, das kein Meganucleasegen exprimiert, und einem Reporterkonstrukt ohne Erkennungs- und Spaltungsstelle durchgeführt werden.
Beispiel 4 beschrieb die Verwendung eines Target bestehend aus einem modifizierten β-Galactosidasegen mit einer 900 pb internen Duplizierung, die von dem Ura3-selektierbaren Marker getrennt ist, und einer Spaltungsstelle für die zu testende Meganuclease (Einzelketten-I-Cre I).
Die Erkennung und Spaltung durch die Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung kann auch mit einem Genkonvertierungs-Assay getestet werden. Beispielsweise umfasst das Reporterkonstrukt ein erstes modifiziertes Reportergen mit einer Löschung und einer Einfügung einer intervenierenden Sequenz an der Stelle der Löschung. Diese intervenierende Sequenz umfasst die Erkennungs- und Spaltungsstelle der zu testenden Meganuclease. Das Reporterkonstrukt umfasst ferner das Fragment des gelöschten Reportergens, das auf jeder Seite durch die an die Löschung angrenzenden Reportergen-Sequenzen flankiert. Die angrenzenden Sequenzen umfassen mindestens 100 bp Homologie mit dem Reportergen auf jeder Seite, bevorzugt mindestens 300 pb. Die Induzierung eines Site-spezifischen Doppelstrangbruchs, der von der zu testenden Meganuclease an seiner Erkennungs- und Spaltungsstelle erzeugt wird, löst ein Genkonversionsereignis aus, das in einem funktionalen Reportergen resultiert. Diese Art von Assay ist in den folgenden Artikeln dokumentiert: Rudin et al. (Genetics 1989, 122, 519–534), Fishman-Lobell & Haber (Science 1992, 258, 480–4), Paques & Haber (Mol. Cell. Biol., 1997, 17, 6765–6771), auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Ansonsten kann die Erkennung und Spaltung durch die Hybrid- und/oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung durch einen Rekombinations-Assay an chromosomalen Targets getestet werden. Die Rekombination kann auf SSA oder Genkonversionsmechanismen basieren. Beispielsweise wird ein mutiertes, nicht-funktionales Reportergen, das eine Erkennungs- und Spaltungsstelle für die zu testende Meganuclease umfasst, in das Chromosom der Zelle eingebracht. Diese Spaltungsstelle muss sich in der Nähe der Mutation befinden, bevorzugt weniger als 1 kb von der Mutation, insbesondere bevorzugt weniger als 500 bp, 200 bp, oder 100 pb in der Umgebung der Mutation. Durch Transfektion der Zelle mit einem Fragment des funktionalen Reportergens, das der Mutation entspricht, und einem Expressionskonstrukt, das die Produktion der zu testenden Meganuclease in der Zelle ermöglicht, führt die Reparatur des von der zu testenden Meganuclease erzeugten Doppelstrangbruchs mittels homologer Rekombination zu einem funktionalen Reportergen, wobei die Reportergen-Expression erfasst wird. Diese Art von Assay ist in den folgenden Artikeln dokumentiert: Rouet et al. (Mol. Cell. Biol., 1994, 14, 8096–8106); Choulika et al. (Mol. Cell. Biol., 1995, 15, 1968–1973); Donoho et al. (Mol. Cell. Biol., 1998, 18, 4070–4078), auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
SUCHE NACH HYBRID-MEGANUCLEASE FUR EIN TARGETGEN OR -VIRUS
Die vorliegende Erfindung beschreibt neue Verfahren zur Entdeckung neuer Targets für natürliche oder hybride Meganucleasen an einem ins Auge gefassten Locus eines Virusgenoms und anderer interessierender Genome, genauer gesagt in einem Gen von diesen. Von der großen Anzahl von LAGLIDADG-Meganucleasen ermöglichen nämlich die Hybrid-Meganucleasen die Erzeugung einer großen Vielfalt von Targetstellen. Diese neuen Targetstellen sind in dem interessierenden Genom selten, bevorzugt nahezu einzigartig, und sind für mehrere Anwendungen, die nachfolgend genauer bezeichnet sind, nützlich.
Eine Datenbank, die alle bekannten Meganucleasen Targetstellen umfasst, wird erstellt. Vorzugsweise umfasst eine solche Datenbank die Targetstellen, von denen experimentell gezeigt wurde, dass sie von einer Meganuclease gespalten wurden. Eine zweite Datenbank wird entworfen, welche alle möglichen Targets für Hybrid-Meganucleasen umfasst. Solche Targets für Hybrid-Meganucleasen können gemäß der vorstehenden Beschreibung entworfen werden.
Aus diesen Datenbanken wird ein Abgleich vorgenommen, um homologe Sequenzen ohne Lücken zu finden, wobei die homologen Sequenzen eine Identität von mindestens 70%, bevorzugt 80%, insbesondere bevorzugt 90%, noch stärker bevorzugt von 95% besitzen. Es können verschiedene Abgleichalgorithmen und/oder -programme verwendet werden, um die Identität zwischen zwei Sequenzen zu berechnen, darunter FASTA oder BLAST, die als Teil der GCG Sequence Analysis Package (University of Wisconsin, Madison, Wis.) verfügbar sind, und können beispielsweise mit standardisierten Einstellungen verwendet werden.
VERWENDUNG VON MEGANUCLEASEN
Die Hybrid-Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung kann für Molekularbiologie und für Genmanipulation und Gentherapie verwendet werden, genauer gesagt gemäß den Verfahren, die beschrieben sind in WO 96/14408 , US 5,830,729 , WO 00/46385 , WO 00/46386 und den Vorläufigen Anmeldungen, die am 26.10.02 unter dem Anwaltsaktenzeichen Nr. 3665-20 und am 14.09.01 unter dem Anwaltsaktenzeichen Nr. 3665-17 hinterlegt wurden und auf deren Offenbarungsgehalt hiermit vollinhaltlich Bezug genommen wird.
Eine sehr interessante Verwendung der Hybrid-Meganuclease besteht im Targeting eines bestimmten interessierenden genomischen Locus. Die Induzierung eines Doppelstrangbruchs an einer interessierenden Stelle in der chromosomalen DNA der Zelle ist nämlich begleitet von einer Einfügung eines Targeting DNA-Homologs in die Region um die Spaltungsstelle mit hoher Effizienz. Die Hybrid-Meganuclease kann für das Targeting eines bestimmten genomischen Locus verwendet werden, der die Hybrid-Targetstelle umfasst. Hybrid-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung können bei Verfahren verwendet werden, welche die Induzierung einer doppelsträngigen DNA-Spaltung an einer spezifischen Stelle in chromosomaler DNA in Zellen beinhalten. Für mehr Details siehe WO 96/14408 , US 5,830,729 , WO 00/46386 . Die Hybrid-Meganuclease kann bei einem Genmanipulationsverfahren verwendet werden, das die folgenden Schritte umfasst: 1) Einbringen eines Doppelstrangbruchs an dem genomischen Locus, der die Hybrid-Targetstelle umfasst, mit der entsprechenden Hybrid-Meganuclease; 2) Vorsehen eines die einzubringende Sequenz umfassenden Targeting-DNA-Konstrukts, das von der zu dem Targeting-Locus homologen Sequenz flankiert ist. Die homologe DNA befindet sich nämlich am linken und rechten Arm des Targeting-DNA-Konstrukts, und die DNA zum Modifizieren der interessierenden Sequenz befindet sich zwischen den zwei Armen. Die Hybrid-Meganuclease kann der Zelle entweder durch einen Expressionsvektor, der die Polynucleotidsequenz umfasst, welche für die Hybrid-Meganuclease codiert und für ihre Expression in der verwendeten Zelle geeignet ist, oder die Hybrid-Meganuclease selbst zur Verfügung gestellt werden.
Die Hybrid- oder Einzelketten-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung können zum Löschen eines viralen Genoms oder eines Teils davon verwendet werden. Ein Schnitt in dem viralen Genom induziert nämlich eine Rekombination, die zur Löschung eines Teils oder zur Löschung des gesamten viralen Genoms (ihren kann. Dieses Verfahren wird im Allgemeinen als ”virus pop-out” bezeichnet. Deshalb ermöglichen die Hybrid-Meganucleasen das Targeting des viralen Genoms. Siehe WO 96/14408 , Beispiel 5. Daher betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Löschung eines viralen Genoms oder eines Teils desselben, wobei ein Doppelstrangbruch in dem viralen Genom mittels einer Meganuclease gemäß der vorliegenden Erfindung induziert wird, und der Doppelstrangbruch ein Rekombinationsereignis induziert, das zur Löschung des viralen Genoms oder eines Teils desselben führt.
Für die Bestimmung der relevanten Hybrid-Meganuclease zum Einbringen einer Doppelstrangspaltung an einem Target-Locus oder einem Target-Viralgenom, siehe den unmittelbar vorausgegangenen Abschnitt.
Bei einer anderen Verwendung können die Hybrid- und Einzelketten-Meganucleasen für die in vivo-Exzision eines Polynucleotidfragmentes verwendet werden, das von mindestens einer, bevorzugt zwei Hybrid-Targetstellen flankiert ist. Hybrid-Meganucleasen gemäß der vorliegenden Erfindung können bei Verfahren verwendet werden, welche die Exzision von Targeting-DNA oder eines Polynucleotidfragments aus einem Vektor in Zellen, die den Vektor aufgenommen haben, beinhalten. Solche Verfahren beinhalten die Verwendung eines Vektors, der das Polynucleotidfragment flankiert von mindestens einer, bevorzugt zwei Hybrid-Targetstellen umfasst, und entweder eines Expressionsvektors, der ein Polynucleotid umfasst, das für die Hybrid- und Einzelketten-Meganuclease entsprechende der für die Expression in der verwendeten Zelle geeigneten Hybrid-Targetstelle codiert, oder der Hybrid und Einzelketten-Meganuclease. Das exzisierte Polynucleotidfragment kann für Transgene verwendet werden, wie im Detail in den Vorläufigen Anmeldungen beschrieben ist, die am 26.10.01 unter USSN 60/330,639 und am 14.09.01 unter USSN 60/318,818 hinterlegt wurden. Die exzisierte Targeting-DNA umfasst homologe DNA am linken und rechten Arm der Targeting-DNA, und die DNA, welche die interessierende Sequenz modifiziert, befindet sich zwischen den zwei Armen. Für mehr Detail siehe WO 00/46385 . Das Verfahren der Exzision von Targeting-DNA aus einem Vektor in der Zelle kann zum Reparieren einer spezifischen interessierenden Sequenz in chromosomaler DNA, zum Modifizieren einer spezifischen Sequenz oder eines Gens in chromosomaler DNA, für die Attenuierung eines interessierenden endogenen Gens, zum Einbringen einer Mutation in eine Targetstelle, oder für die Behandlung oder Prophylaxe einer genetischen Erkrankung eines Individuums verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch die resultierenden Zellen und ihre Verwendungen, wie etwa für die Erzeugung von Proteinen oder anderen Genprodukten, oder für Behandlung oder Prophylaxe einer Erkrankung oder Störung in einem Individuum (z. B. einem Menschen oder anderen Säuger oder Wirbeltier), die als Resultat eines genetischen Defekts (Mutation) entsteht. Beispielsweise können Zellen mit den vorliegend beschriebenen Verfahren (z. B. ex vivo) erzeugt und dann unter Verwendung bekannter Verfahren in ein Individuum eingebracht werden. Als Alternative können Zellen in dem Individuum modifiziert werden (ohne aus dem Individuum entnommen zu werden).
Die Erfindung betrifft auch die Erzeugung von Tiermodellen für eine Krankheit, wobei Hybrid-Meganucleasestellen an der Stelle des Krankheitsgens für eine Bewertung optimaler Zuführungsverfahren eingebracht werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: I-DMO I/I-CRE I-HYBRID-MEGANUCLEASE
Entwurf der I-Dmo I/I-Cre I Hybrid-Meganuclease
I-Dmo I ist eine thermostabile Endonuclease, für die von einem Intron im 23S rRNA-Gen des hyperthermophilen Archaeon Desufurococcus mobilis codiert wird (Dalgaard et al., 1993, Proc Natl Acad Sci U S A, 90, 5414–5417). I-DmoI gehört zur LAGLIDADG-Familie der Meganucleasen. Ihre Struktur, gelöst durch Röntgenkristallographie (pdb-Code 1b24) (Silva et al., 1999, J Mol Biol, 286, 1123–1136), besteht aus zwei ähnlichen Domänen(αββαββα), die in einer Pseudo-Zweifachsymmetriebeziehung stehen. Ein Dodecapeptidmotiv befindet sich am C-terminalen Ende der ersten α-Helix in jeder Domäne. Diese Helices bilden ein Zwei-Helix-Bündel an der Schnittstelle zwischen den Domänen und liegen senkrecht zu einer sattelförmigen DNA-Bindungsfläche, die von zwei viersträngigen, antiparallelen β-Faltblättern gebildet wird (1).
I-CreI ist eine weitere LAGLIDADG-Meganuclease, für die von einem offenen Leserahmen codiert wird, der in einem Self-Splicing-Intron im Chlamydomonas reinhardtii-Chloroplast 23S rRNA-Gen enthalten ist (Durrenberger und Rochaix, 1991, Embo J, 10, 3495–3501). Anders als die meisten Mitglieder dieser Proteinfamilie enthält I-CreI jedoch eine einzelne Kopie des Dodecapeptidmotivs und fungiert in Dimerform. I-CreI-Dimere weisen die Gesamtarchitektur von Einzelketten-LAGLIDADG-Proteinen auf (2) (Chevalier et al., 2001, Nat Struct Biol, 8, 312–316; Heath et al., 1997, Nat Struct Biol, 4, 468–476; Jurica et al., 1998, Mol Cell, 2, 469–476). Jedes Monomer entspricht einer einzelnen Domäne, die eine der zwei viersträngigen antiparallelen Faltblätter für die DNA-Bindung zur Verfügung stellen, und die Dodecapeptidmotive befinden sich in α-Helices an der Interdomäne-Schnittstelle.

Da sie eine ähnliche Gesamttopologie aufweisen, können Strukturen von I-DmoI und I-CreI auf eine geringe (lokale) Root Mean Square Deviation (RMSD) überlagert werden, wobei jedes Monomer aus I-CreI gut mit einer der zwei Domänen aus I-DmoI überein stimmt. Ein optimaler struktureller Abgleich (RMSD = 0,66 Å, 3) wurde erhalten durch Überlagern der folgenden Atome (die Restenummerierung entspricht beiden pdb-Strukturen, und für I-CreI werden Reste im zweiten Monomer um 200 bezogen diejenigen im ersten Monomer verschoben):

Source-Reste	Target-Reste	Überlagerte Atome
I-DmoI, 14–22	I-CreI, 13–21	N, Cα, C, O
I-DmoI, 110–118	I-CreI, 213–221	N, Cα, C, O
I-DmoI, Tyr13	I-CreI, Tyr12	N, Cα, C, O, Cβ, Cγ
I-DmoI, Phe109	I-CreI, Tyr212	N, Cα, C, O, Cβ, Cγ

Die geringe RMSD ist ein starkes Indiz für die Ähnlichkeit der zwei Dodecapeptid-Interdomänen-Packungsschnittstellen. Die Dodecapeptidmotive und entsprechende abgeglichene Sequenzen von α-Helices sind:
Die visuelle Überprüfung der Überlagerung zeigte an, dass ein Hybrid von beiden Proteinen gebildet werden kann, indem die zweite I-DmoI-Domäne mit dem entsprechenden I-CreI-Monomer ersetzt wird. Die I-DmoI-Sequenz, beginnend ab einem Punkt (dem Austauschpunkt) innerhalb des Loops, der beide DNA-Bindungsdomänen verbindet, oder innerhalb der darauf folgenden zweiten Dodecapeptid-α-Helix, soll ab einem entsprechenden Punkt mit derjenigen von I-CreI ersetzt werden. Wir entschieden uns dafür, die Domänen am Anfang des zweiten Dodecapeptidmotivs auszutauschen. Die resultierende Hybridproteinsequenz war die Proteinsequenz von I-DmoI bis zu (einschließlich) Phe109 und die Proteinsequenz von I-CreI ab (einschließlich) Leu213. Reste aus I-CreI, die vor Leu213 kommen, wurden somit entfernt. Siehe 6A für die Aminosäure (SEQ-ID Nr. 2) und Polynucleotidsequenzen (SEQ-ID Nr. 1) eines solchen Hybrids.
In einer modellierten Struktur wies die neue Interdomänen-Packungsschnittstelle nur wenige Defekte auf, z. B. hat keine Aminosäurenseitenkette sterische Kollisionen, die nur schwer zu entspannen sind, mit Ausnahme vielleicht von Ile107(I-DmoI), das Überlappungen mit Phe294 (I-CreI) aufweist. Um die resultierende, potentiell ungünstige Abstoßung zu unterdrücken, wird der Isoleucinrest durch einr Leucin-Aminosäure (den abgeglichenen Aminosäurerest in I-CreI) ersetzt. Letztlich ist die Interdomänen-Linkersequenz wie folgt:
Des Weiteren befinden sich Leu47, His51 und Leu55 (I-DmoI) zu nahe bei Lys296 (I-CreI). Dies ist jedoch ungewiss, da eine Verzerrung der Proteinhauptkettenstruktur (der I-DmoI-Region, in der sich die Reste 47, 51 und 55 befinden) anzeigen kann, dass die Struktur nicht vollständig gesichert ist. Dennoch wird eine zweite Version des Hybridproteins entworfen, die drei zusätzliche Mutationen umfasst: L47A, H51A und L55D. Auswahlen von Alanin-Aminosäuren wurden getroffen, um die α-Helixform der entsprechenden Reste zu stabilisieren. Die dritte Mutation (Asparaginsäure) sollte zur Bildung einer Interdomänen-Salzbrücke mit Lys296 führen und dadurch eine zusätzliche Stabilisierung zur Verfügung stellen. Siehe 6B für die Aminosäure (SEQ-ID Nr. 4) und Polynucleotidsequenzen (SEQ-ID Nr. 3) eines solchen Hybrids.
Produktion von Hybrid I-Dmo I/I-Cre I Meganuclease Lösungen

Sonication-Lösung: 25 mM HEPES (pH 7,5), 5% (v/v) Glycerin, 0,1% (v/v) Anti-Proteasenlösung;
Lösung A: 25 mM HEPES (pH 7,5), 5% (v/v) Glycerin,
Lagerungslösung: 25 mM HEPES (pH 7,5), 20% (v/v) Glycerin
Standard-Reaktionslösung: 12,5 mM HEPES (pH 7,5), 2,5% (v/v) Glycerin, 5–10 mM MgCl₂,
Standard-Stopplösung (10X): 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 0,25 M EDTA, 5% (w/v) SDS, 0,5 mg/ml Proteinase K.

Plasmide
Ein Expressionsplasmid (pET 24 d (+) Novagen) wurde entworfen, um I-DmoIlI-CreI Hybrid-Meganuclease mit oder ohne ein Histidinetikett zu erzeugen. Kurz gesagt wurde ein Fragment erzeugt, das die ORF Sequenz enthielt und von NcoI- und EagI- oder XhoI-Restriktionsstellen flankiert war, unter Verwendung der Polymerase Chain Reaktion (PCR) und spezifischer Oligonucleotide. Zuerst wurden die Hälfte der I-DmoI- und I-CreI-Sequenzen mittels PCR bereitet, daraufhin wurde die I-DmoI/I-CreI-Hybridsequenz mittels einer anderen PCR fertig gestellt.
Expression und Reinigung der I-DmoI/I-CreI Hybrid-Meganuclease
Escherichia coli-Stamm BL21 (DE3) RIL wurde für die Reinigung von I-DmoI/I-CreI verwendet. Mit dem I-DmoI/I-CreI-Plasmid (pET 24 d (+) Novagen) transformierte Clones wurden bei 37°C unter Schütteln in 250 ml Luria Broth gezüchtet, die 30 mg/ml Kanamycin enthielt.
Wenn die Kultur einen A₆₀₀ von 0,8–1,2 erreichte, wurde eine Expression induziert durch Zugabe von IPTG zu einer endgültigen Konzentration von 1 mM, und nach 5 h bis 15 h bei 25°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet.
Die folgenden Prozeduren wurden bei 4°C durchgeführt, falls nicht anders angegeben. Die geernteten Zellen wurden in 25 ml eiskalter sonication solution resuspendiert und daraufhin 5 Minuten sonicated. Das Lysat wurde mit 105.000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und daraufhin einer zweiten Ultrazentrifugierung mit 105.000 g für 30 min unterzogen. Dieser Überstand, der 90% des Proteins enthielt, wurde als 'lösliche' Fraktion bezeichnet.
Die lösliche Fraktion wurde auf eine mit Kobalt befüllte 5 ml Hi-Trap Cheliersäule (Amersham, Uppsala, Sweden) mit einer Fließrate von 2,5 ml/min aufgegeben (Amersham-Pharmacia FPLC Akta purifier 10). Nach dem Waschen der Säule mit 25 ml Lösung A wurden gebundene Proteine mit einem 0–0,25 M linearen Imidazol-Gradienten in Lösung A eluiert, gefolgt von einem Eluierschritt mit 0,5 M Imidazol – 0,5 M NaCl. Fraktionen wurden gesammelt, und die Mengen von Protein und I-DmoI/I-CreI-Aktivität (siehe unten) wurden bestimmt. Die Säulenfraktionen wurden auch mit SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die am meisten I-DmoI/I-CreI-Aktivität enthielten, wurden gepoolt und konzentriert unter Verwendung eines 10 kDa-Cutoff-Centriprep Amicon-Systems. Diese konzentrierte Fraktion wurde gereinigt und auf eine Superdex75 PG Hi-Load 26–60 Säule (Amersham, Uppsala, Sweden) mit einer Fließrate von 1 ml/min(Amersham-Pharmacia FPLC Akta purifier 10) von Lösung A aufgegeben. Fraktionen wurden gesammelt, und die Mengen von Protein und I-DmoI/I-CreI Aktivität (siehe unten) wurden bestimmt. Die Säulenfraktionen wurden auch mit SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die am meisten I-DmoI/I-CreI-Aktivität enthielten, wurden gepoolt und konzentriert unter Verwendung eines 10 kDa-Cutoff-Centriprep Amicon-Systems. Dann wurde über Nacht gegen Lagerungslösung dialysiert, und in Aliquots in flüssigem Stickstoff gelagert.
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde gemäß der Beschreibung von Laemmli unter Verwendung von 15% Acrylamidgels durchgeführt. Gels wurden mit Coomassie brilliant blue eingefärbt. 8A zeigt, dass die Hybrid-Meganuclease I-DmoI/I-CreI gut exprimiert ist, und dass dieses Hybrid im Überstand erhalten wird und somit löslich ist.
Größe der I-DmoI/I-CreI-Hybrid-Meganuclease
Das Molekülgewicht von I-DmoIl I-CreI in Lösung wurde mittels Größenausschluss-Chromatographie des gereinigten Proteins geschätzt. Die Säulenfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, und die 31,2 kDa-Bande eluierte in erster Linie, was einer Molekülmasse von 30 kDa entsprach. Somit zeigte diese Analyse an, dass I-DmoI/I-CreI hauptsächlich ein Momomer ist.
BEISPIEL 2: EINZELKETTEN-I-CRE I-MEGANUCLEASE ist nicht Teil der Erfindung
Einzelketten-I-Cre I Meganuclease-Design
I-CreI ist eine einzelne LAGLIDADG-Proteindomäne, die dimerisiert (2). Für die Domänenaustausch-Strategie planten wir, eine I-CreI-Domäne mit irgendeiner anderen LAGLIDADG-Domäne zu verbinden. Der Entwurf eines Einzelketten-I-CreI-Proteins durch Anordnen eines Verbindungsgliedes zwischen den zwei Monomeren war komplementär zu Beispiel I. Dies ergab kein Protein mit einer neuen DNA-Bindungsspezifizität. Stattdessen veranschaulichte das resultierende künstliche Protein, dass natürliche einzelne LAGLIDADG-Proteine effektiv als die zwei Hälften eines größeren, doppelten LAGLIDADG-Proteins aufgefasst werden können. Wenn eine Fusionierung der zwei Domänen funktional war, sollte ein Austausch der Domänen aus unterschiedlichen einzelnen LAGLIDADG zwischen solchen Proteinen oder mit Domänen aus doppelten LAGLIDADG-Proteinen kein Problem bereiten.
Jede I-CreI-Domäne umfasst eine C-terminale Subdomäne, bestehend aus drei α-Helices, die in der C-terminalen Domäne von doppelten LAGLIDADG-Proteinen vorhanden sein können, aber nicht Teil der N-terminalen Domäne sein können. Die N-terminale Domäne dieser Proteine ist nämlich kürzer, da der Loop oder Linker, der die zwei Domänen verbindet, anstelle der drei α-Helices steht. Die drei Helices enden an entgegengesetzten Seiten der Dimerstruktur, weit entfernt von den N-terminalen Helices der Dodecapeptidmotive. Die Länge eines flexiblen Linkers, der den C-terminalen Rest einer Domäne mit dem N-terminalen Rest der anderen Domäne verbindet (end-to-end Fusionierung) wäre beträchtlich. Ausserdem wäre der Entwurf eines solchen Linkers schwierig aufgrund der Notwendigkeit, über einen Großteil der Proteinoberfläche zu gehen. Es ist daher unsicher, ob eine korrekte Domänenpackung erzielt wird.
Die im vorherigen Beispiel erörterte strukturelle Überlagerung von I-DmoI und I-CreI ermöglichte es, eine einfache Linker-Lösung zu entwerfen. Die Loop-Region aus I-DmoI selbst, Reste 96 to 103 (Sequenz ERIRLFNM), kann das C-terminale Fragment von einer I-CreI Domäne ersetzen und zu der N-terminalen Region der zweiten Domäne führen (wie in dem I-DmoI/I-CreI-Hybridprotein der Fall ist, mit der Ausnahme, dass die Reste am Anfang der I-CreI α-Helix nicht ersetzt zu werden brauchen und nicht ersetzt werden sollten). Auf beiden Seiten des Loop können Reste aus I-DmoI und I-CreI can gut abgeglichen und überlagert werden. Diese Reste sind:

Source-Reste Sequenz Target-Reste Sequenz Überlagerte Atome

I-DmoI, 93–95 I-DmoI, 104–106 NML REO I-CreI, 93–95 I-CreI, 207–209 PFL KEF N, Cα, C, O N, Cα, C, O
Die Verbindung zwischen den I-CreI Domänen sollte daher gewählt werden, um die C-terminalen Reste der ersten Domäne und die N-terminalen Reste der zweiten Domäne zu ersetzen, jeweils entweder ab Pro93, Phe94 oder Leu95 und bis zu Lys207, Glu208 oder Phe209. Aminosäuren an zwei der überlagerten Positionen sind nämlich identisch (Leu95 in beiden Proteinen und Glu105 aus I-DmoI mit Glu208 aus I-CreI; unterstrichene Reste), und an einer dritten Position sind sie ausreichend ähnlich, um äquivalent zu sein (Arg104 und Lys207 aus I-DmoI bzw. I-CreI; unterstrichene Reste).
Das Lysin 98 der ersten Domäne I-CreI wurde entfernt, trotzt der Offenbarung von Jurica et al. (1998, Mol. Cell., 2, 469–476), die besagt, dass Lysin 98 in I-CreI, das ein gut bewahrter residue ist und nahe der aktiven (Spaltungs-)Stelle liegt, eine funktionale Rolle besitzen könnte.
Prolin 93 is kein optimaler Rest für die α-Helixbildung der Hauptkette an dieser Restposition. Das entsprechende Asparagin in I-DmoI ist nur geringfügig besser; bestimmte Wasserstoffbindungseigenschaften der Aminosäure führen zu einer ausgeprägten Tendenz, einen N-terminalen Bruch in α-Helices zu fördern. An dieser Position ist ein Alaninrest letztlich bevorzugt (Glutarsäure wäre eine andere geeignete Aminosäure mit einer guten innewohnenden Neigung zur Annahme einer α-Helixform und könnte eine stabilisierende Salzbrücke mit Arg97 in der darauf folgenden Linkerregion bilden).
Eine einkettige Version von I-CreI wurde somit entworfen, um die I-DmoI-Brücke einzubringen, beginnend mit Met94 und bis Glu105, zwischen eine verkürzte Version der natürlichen I-CreI Domäne (Trunkierung nach der Pro93Ala-Mutation) und einer nahezu vollständigen Kopie dieser Domäne (Trunkierung vor Phe209) (5 und 7 für die Aminosäure (SEQ-ID Nr. 6) und Polynucleotidsequenzen (SEQ-ID Nr. 5)). Met94 ersetzt eine klobigere Phenylalanin-Aminosäure, die in das I-CreI-Proteindimer eingebettet ist. Beide Aminosäuren scheinen gleich gut zu passen und könnten alternativ an dieser Sequenzposition versucht werden. Eine andere nicht-polare Aminosäure, Isoleucin an Position 98 (I-DmoI-Nummerierung), packt in die ursprüngliche Dimerstruktur, ohne atomare Überlappungen zu erzeugen. Rest 101, ein aromatisches Phenylalanin, ist ebenfalls in Ordnung, könnte jedoch durch eine andere aromatische Aminosäure, Tyrosin, ersetzt werden, die dann eine stabilisierende Wasserstoffbrücke zur Hauptkettencarbonylgruppe von Rest 94 bilden könnte. Die folgenden Sequenzen sind daher alternative Lösungen, um eine Linkerregion zwischen zwei I-CreI Domänen zur Verfügung zu stellen:
Produktion von Einzelketten-I-Cre I Meganuclease
Lösungen

Sonication-Lösung: 25 mM HEPES (pH 7,5), 5% (v/v) Glycerin, 0,1% (v/v) Anti-Proteasenlösung;
Lösung A: 25 mM HEPES (pH 7,5), 5% (v/v) Glycerin,
Lagerungslösung: 25 mM HEPES (pH 7,5), 20% (v/v) Glycerin
Standard-Reaktionslösung: 12,5 mM HEPES (pH 7,5), 2,5% (v/v) Glycerin, 5–10 mM MgCl₂;
Standard-Stopplösung (10X): 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 0,25 M EDTA, 5% (w/v) SDS, 0,5 mg/ml Proteinase K.

Plasmide
Ein Expressionsplasmid (pET 24 d (+) Novagen) wurde entworfen, um Einzelketten-I-CreI (Sc I-CreI) mit oder ohne ein Histidinetikett zu erzeugen. Kurz gesagt wurde ein Fragment erzeugt, das die ORF Sequenz enthielt und von NcoI- und EagI- oder XhoI-Restriktionsstellen flankiert war, unter Verwendung der Polymerase Chain Reaktion (PCR) und spezifischer Oligonucleotide. Zuerst wurden die zwei halben modifizierten I-CreI Sequenzen mittels PCR bereitet, und daraufhin wurde die Einzelketten-I-CreI-Hybridsequenz mittels einer anderen PCR fertig gestellt.
Expression und Reinigung von Sc I-CreI (Sc = Einzelkette)
Escherichia coli-Stamm BL21 (DE3) RIL wurde verwendet für die Produktion und die Reinigung desSc I-CreI Polypeptid. Mit dem Sc I-CreI-Plasmid (pET 24 d (+) Novagen) transformierte Clones wurden bei 37°C unter Schütteln in 250 ml Luria Broth gezüchtet, die 30 mg/ml Kanamycin enthielt.
Wenn die Kultur einen A₆₀₀ von 0,8–1,2 erreichte, wurde eine Expression induziert durch Zugabe von IPTG bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 mM, und nach 5 h bis 15 h bei 25°C wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet.
Die folgenden Prozeduren wurden bei 4°C durchgeführt, falls nicht anders angegeben. Die geernteten Zellen wurden in 25 ml eiskalter sonication solution resuspendiert und daraufhin 5 Minuten sonicated. Das Lysat wurde mit 105.000 g 30 min lang zentrifugiert. Der Überstand wurde entnommen und daraufhin einer zweiten Ultrazentrifugierung mit 105.000 g für 30 min unterzogen. Dieser Überstand, der 90% des Proteins enthielt, wurde als 'lösliche' Fraktion bezeichnet.
Die lösliche Fraktion wurde auf eine mit Kobalt befüllte 5 ml Hi-Trap Cheliersäule (Amersham, Uppsala, Sweden) mit einer Fließrate von 2,5 ml/min aufgegeben (Amersham-Pharmacia FPLC Akta purifier 10). Nach dem Waschen der Säule mit 25 ml Lösung A wurden gebundene Proteine mit einem 0–0,25 M linearen Imidazol-Gradienten in Lösung A eluiert, gefolgt von einem Eluierschritt mit 0,5 M Imidazol – 0,5 M NaCl. Fraktionen wurden gesammelt, und die Mengen von Protein und Protein und Sc I-CreI-Aktivität (siehe unten) wurden bestimmt. The Säulenfraktionen were also analysiert by SDS-PAGE. Die Fraktionen, die enthielten am meisten of the Sc I-CreI Aktivität were pooled und konzentriert using ein 10 kDa-Cutoff-centriprep Amicon system. This konzentriert Fraktion was gereinigt was applied to ein Superdex75 PG Hi-Load 26–60 Säule (Amersham, Uppsala, Sweden) at ein Fließrate von 1 ml/min (Amersham-Pharmacia FPLC Akta purifier 10) of Lösung A. Fraktionen wurden gesammelt, und die Mengen von Protein und Sc I-CreI Aktivität (siehe unten) wurden bestimmt. Die Säulenfraktionen wurden auch mit SDS-PAGE analysiert. Die Fraktionen, die am meisten Sc I-CreI-Aktivität enthielten, wurden gepoolt und konzentriert unter Verwendung eines 10 kDa-Cutoff-Centriprep Amicon-Systems. Dann wurde über Nacht gegen Lagerungslösung dialysiert, und in Aliquots in flüssigem Stickstoff gelagert.
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurde gemäß der Beschreibung von Laemmli unter Verwendung von 15% Acrylamidgels durchgeführt. Gels wurden mit Coomassie brilliant blue eingefärbt. (9A)
Größe der Sc I-CreI Meganuclease
Das Molekülgewicht von Sc I-CreI in Lösung wurde mittels Größenausschluss-Chromatographie des gereinigten Proteins geschätzt. Die Ergebnisse der Sizing-Säule sind in 2A zusammengefasst. Die Säulenfraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, und die 31,4 kDa-Bande eluierte in erster Linie, was einer Molekülmasse von 30 kDa entsprach. Somit zeigte diese Analyse an, dass Sc I-CreI hauptsächlich ein Momomer ist.
BEISPIEL 3: SPALTUNGS-ASSAY
IN VITRO SPALTUNGS-ASSAY
Endonucleaseaktivität-Assays von Hybrid-I-Dmo I/I-Cre I-Meganuclease
Plasmid pGEMtarget (3,9 kb) wurde mittels TA oder Restriktionsenzymclonieren des Targetprodukts entworfen, das mittels PCR oder Einzelstammhybridisierung erhalten wurde. Die Targetprodukte umfassen die folgenden Erkennungs- und Spaltungsstellen:
Dieses Plasmid wurde für die Spaltungsassays verwendet. Es wurde mit dem Quiagen Maxipreps DNA Purification System (Qiagen) isoliert. Für die meisten Experimente wurde es mit Xmnl vor dem Assay linearisiert. Standard I-DmoI/I-CreI-Assays wurden bei 37°C in der Standard-Reaktionslösung (Lösung A 0,5 X, Zugabe MgCl₂ 5 bis 10 mM) durchgeführt, mit 0,1 vol 10 × Standard-Stopplösung gestoppt, und die Produkte mittels Elektrophorese in 1% Agarose/Ethidiumbromidgels bei Raumtemperatur abgetrennt. Die Fluoreszenz wurde mit einer Kamera unter Verwendung eines Transilluminators aufgenommen.
Eine Einheit Endonuclease-Aktivität (U) wurde definiert als die Menge I-DmoIl I-CreI, die nötig ist, um 200 ng Target-DNA innerhalb von 60 min bei 37°C unter den gleichen Assay-Bedingungen wie bei I-CreI Wildtyp zu spalten. Aktivitäts-Assays wurden ebenfalls bei 65°C durchgeführt als I-DmoI optimale Temperature für DNA-Spaltung.
Die I-DmoIl I-CreI Hybrid-Meganuclease spaltet spezifisch die Target I-CreI/I-DmoI und spaltet nicht die Wildtyp-Targets von I-DmoI, I-CreI, und I-Sce I Meganucleasen und die Target I-DmoI/I-CreI. Diese Resultate sind in 8B gezeigt. Somit zeigt die I-DmoI1 I-CreI Hybrid-Meganuclease eine höhere Spezifizität für ihre neue Targetsequenz. Die I-DmoV I-CreI Hybrid-Meganuclease spaltet die Target I-CreI/I-DmoI bei 37 und 65°C, aber die Spaltung ist bei 65°C schneller. Die neue Spezifizität der I-DmoIl I-CreI Hybrid-Meganuclease für die Target I-CreI/I-DmoI ermöglicht die Bestimmung der relativen Orientierung der Wildtyp Meganuclease I-Dmo I und ihrer Erkennungs- und Spaltungsstelle. Die N-terminale Domäne von I-Dmo I Meganuclease erkennt nämlich die zweite Halbdomäne der Target I-CreI/I-DmoI. Deshalb erkennt die N-terminale Domäne der I-Dmo I Meganuclease die rechte Half-Site (R) und ihre C-terminale Domäne die linke (L).
Endonucleaseaktivität-Assays von Einzelketten-I-Cre I Meganuclease ist nicht Teil der Erfindung
Plasmid pGEMtarget (3,9 kb), wurde mit TA oder Restriktionsenzymclonieren des Targetproduktes durchgeführt, das mittes1 PCR oder Einzelstammhybridisierung erhalten wurde. Das Targetprodukt umfasst die Erkennungs- und Spaltungsstelle
Dieses Plasmid wurde für die Spaltungsassays verwendet. Es wurde mit dem Quiagen Maxipreps DNA Purification System (Qiagen) isoliert. Für die meisten Experimente wurde es mit XmnI vor dem Assay linearisiert. Standard Sc I-CreI-Assays wurden bei 37°C in der Standard-Reaktionslösung (Lösung A 0,5 X, Zugabe MgCl₂ 5 bis 10 mM) durchgeführt, mit 0,1 vol 10 × Standard-Stopplösung gestoppt, und die Produkte mittels Elektrophorese in 1% Agarose/Ethidiumbromidgels bei Raumtemperatur abgetrennt. Die Fluoreszenz wurde mit einer Kamera unter Verwendung eines Transilluminators aufgenommen.
Eine Einheit Endonuclease-Aktivität (U) wurde als die Menge von Sc I-CreI definiert, die nötig ist, um 200 ng Target-DNA innerhalb von 60 min bei 37°C unter den gleichen Assay-Bedingung wie mit dem I-CreI Wildtyp zu spalten. Aktivitäts-Assays wurden ebenfalls bei 65°C durchgeführt, um mit dem Wildtyp I-CreI die Auswirkung der Temperatur auf die DNA-Spaltung zu vergleichen.
Die Einzelketten-Meganuclease behielt ihre Spezifität, da diese Meganuclease die I-Sce I Targetstelle nicht spaltete und die Wildtyp I-Cre I Targetstelle spaltete. Diese Ergebnisse sind in 9B gezeigt.
IN VIVO SPALTUNGSASSAY IN HEFE
Endonucleaseaktivität-Assays von Einzelketten-I-Cre I Meganuclease ist nicht Teil der Erfindung
Um die Meganucleasen zu testen, entwickelten wir einen in vivo-Assay mit der Hefe Saccharomyces cerevisiae. Dieser Organismus hat den Vorteil, dass er naturally DNA über homologe Rekombination natürlich rekombiniert.
Dieser Test basierte auf der Reparatur eines kolorimetrischen Markers, die mittels site-spezifischem Doppelstrangbruch durch die interessierende Meganuclease induziert wurde.
Das Target bestand aus einem modifizierten β-Galactosidasegen mit einer 900 pb internen Duplizierung, die durch den Ura3-selektierbaren Marker abgetrennt war, und einer Spaltungsstelle für die zu untersuchende Meganuclease (das resultierende Konstrukt wurde als LACURAZ bezeichnet) (10A).
Die Meganuclease wurde exprimiert unter Kontrolle eines Galactose-induzierbaren Promotors aus einem nuklearen Expressionsplasmid, das den Leu2-selektierbaren Marker trug, was es transformierter Hefe ermöglichte, auf einem Medium zu wachsen, das kein Leucin enthielt, und einem 2 μ-Replikationsursprung (10B). Die Expression des Reportergens (LACURAZ) wurde von einem konstitutiven Promotor gesteuert und von einem anderen Shuttle-Vektor mit dem Trp1-selektierbaren Marker getragen, was es transformierter Hefe ermöglichte, auf einem Medium zu wachsen, das kein Tryptophan enthielt, und einem ARS-CEN Replikationsursprung (10A).
Die zwei Konstrukte wurden verwendet, um gleichzeitig einen geeigneten Hefestamm zu transformieren. Wenn die Meganuclease exprimiert wird (oder überexprimiert nach Induzierung auf einem Galactosemedium) und ihre Spaltungsstelle auf dem Reporterkonstrukt erkennt, kann sie Doppelstrangbruch und Site-spezifische Rekombination zwischen den Targetsequenzen mittels eines Single-Strand Annealing Mechanismus fördern. Das resultierende Reportergen sollte dann vollständig aktive β-Galatosidase exprimieren. Wir bereiteteten auch alle Kontrollexperimente mit Plasmiden, die kein Meganucleasegen exprimieren, und Reporterkonstrukt ohne Spaltungsstelle (alle möglichen Ereignisse sind in 11 beschrieben).
Der ssay wird auf die folgende Weise durchgeführt:
Die Hefe wurde mit dem Expressionsplasmid und dem Reporterplasmid co-transfiziert. Die Co-Transformanten wurden ausgewählt, und das Vorhandensein der zwei Plasmide wurde erhalten durch Selektion auf einem synthetischen Medium, das kein Leucin oder Tryptophan enthielt (Tabelle A). Ausserdem wurden zwei Sätze von Medien verwendet, welche die Überexpression des Meganucleasegens ermöglichen bzw. nicht ermöglichen (d. h. auf selektivem Medium mit unterschiedlicher Kohlenstoffquelle: Galactose zum Induzieren der Expression der Meganuclease oder Glucose). Wenn Kolonien groß genug waren, zeigte ein Overlay-Assay das Vorhandensein oder Nichtvorhandensein der β-Galactosidase-Aktivität.
Theoretisch sollte β-Galactosidase-Aktivität nur dann erfasst werden, wenn eine Meganuclease und ihre eigene Erkennungsstelle in der gleichen Hefezelle vorhanden sind (mit Ausnahme des natürlichen Hintergrunds der autonomen Rekombination des Reporterkonstrukts) (siehe 10).
Mit diesem Schema subclonierten wir die das I-CreI Einzelkettengen in unsere Galactose-induzierbaren Plasmide sowie die I-CreI Erkennungsstelle in unser Reporterkonstrukt und co-transfizierten beide Plasmide in unseren Hefestamm. (Als Kontrolle wurde ein I-CreI-Gen auf dem gleichen Reporterkonstrukt verwendet). Tabelle A: Nummer der Transformation pro Assay

Reporterkonstrukt/Expressionsvektor Leeres Plasmid LACURAZ-Kontrolle ohne Spaltungsstelle LACURAZ + Spaltungsstelle

Leeres Plamid #1 #2 #3

Meganuclease-Gen #4 #5 #6
Jede Transformation wird auf Glucose und Galactosemedium plattiert.
Verfahrensweisen:
Hefezellentransformation

1. 2–5 ml flüssiges YPGlu oder 10 ml minimum Medium impfen und unter Schütteln über Nacht bei 30°C inkubieren.
2. Auf Kultur zählen und mit 50 ml warmem YPGlu auf eine Zelldichte von 5 × 10⁶ Zellen/ml Kultur beimpfen.
3. Die Kultur bei 30°C auf einem Schüttler bei 200 U/min bis zu einem Äquivalent zu 2 × 10⁷ Zellen/ml inkubieren. Dies dauert 3 bis 5 h. Diese Kultur ergibt genügend Zellen für 10 Transformationen.
4. Die Kultur in ein steriles 50 ml Zentrifugenröhrchen bei 3000 g (5000 U/min) für 5 min ernten.
5. Das Medium abgießen, resuspendieren the Zellen in 25 ml of sterile Wasser und erneut zentrifugieren.
6. Das Wasser abgießen, die Zellen in 1 ml 100 mM LiAc (Lithiumacetat) resuspendieren und die Suspension in ein 1,5 ml Microfuge-Röhrchen transferieren.
7. Zellen 15 s lang bei Höchstgeschwindigkeit pelletieren und LiAc mit einer Mikropipette entfernen.
8. Die Zellen auf ein endgültiges Volumen von 500 μl (2 × 10⁹ Zellen/ml) resuspendieren (ca. 400 μl 100 mM LiAc).
9. Eine 1 ml-Probe von Salmon Sperm-DNA 5 min. lang kochen und schnell in Eiswasser abschrecken.
10. Die Zellensuspension schleudern und 50 μl-Proben in etikettierte Microfuge-Röhrchen pipettieren. Die Zellen pelletieren und das LiAc mit einer Mikropipette entfernen.
11. Der grundlegende ”Transformations-Mix” besteht aus: 240 μl PEG (50% w/v) 36 μl 1,0 M. LiAc 50 μl SS-DNA (2,0 mg/ml) X μl Plasmid-DNA (0,1–10 μg) 34-X μl Sterile ddH20 360 μl TOTAL

Diese Inhaltsstoffe in der angegebenen Reihenfolge zugeben.
(Die Inhaltsstoffe können auch mit Ausnahme der Plasmid-DNA vorgemischt werden, woraufhin 355 μl des ”Transformations-Mix” auf das Zellenpellet zugegeben werden. Daraufhin die 5 μl Plasmid-DNA zugeben und mischen. Darauf achten, dass das richtige Volumen zugeführt wird, da der ”Transformations-Mix” viskös ist).

12. Jedes Röhrchen gründlich schleudern, bis das Zellenpellet vollständig vermischt ist.
13. Bei 30°C 30 min. lang inkubieren
14. Wärmeshock in einem Wasserbad bei 42°C für 30 min.
15. Mit 6–8000 U/min 15 s lang mikrofugieren und den Transformations-Mix mit einer Mikropipette entnehmen.
16. 1 ml steriles YPGlu pipettieren und die Zellen bei 30°C 1 bis 2 h stehen lassen. Dies ermöglicht es, eine gleiche Anzahl von Transformanten anf den Glucose- und Galactoseplatten zu züchten.
17. Mit 6–8000 U/min 15 s lang mikrofugieren und den Überstand entfernen.
18. 200 μl ml steriles YPGlu 50% in jedes Röhrchen pipettieren und das Pellet durch vorsichtiges Auf- und Abpipettieren resuspendieren.
17. 100 μl der Transformation auf selektive Platten plattieren.
18. Die Platten 2–4 Tage lang inkubieren, um Transformanten zu erhalten.

X-Gel Agarose Overlay-Assay
Die folgende Lösung wird für 2 Platten gegeben:

1. 5 ml 1% Agarose in Wasser mikrowellenbehandeln
2. X-Gal-Mix bereiten mit 5 ml Natriumphosphatpuffer 1 M 600 μl Dimethylformamid (DMF) 100 μl SDS 10%
3. Agarose und den Mix kombinieren und unter Rühren auf 55°C abkühlen lassen
4. Wenn die genannte Lösung fertig ist, 20 μl X-Gal 10% in DMF zugeben
5. Unter Verwendung einer Plastikpipette die Oberfläche jeder Platte mit Zellen mit 5 ml der warmen Lösung bedecken.
6. Nach dem Abkühlen und Verfestigen des Agar können die Platten bei entweder 25°C, 30°C oder 37°C inkubiert werden. Die blaue Färbung entwickelt sich in einigen Stunden, je nach der Stärke des Induktors.
7. Kolonien können sogar 5 Tage später durch den oberen Agar aufgenommen werden.

Einfach mit einer sterilen Pasteurpipette durch den Agar in die gewünschte Kolonie oder den gewünschten Fleck stechen. Dann mit der Spitze der Pasteurpipette auf eine frische Platte aufstreichen, und trotz der Permeabilisierung wachsen die Zellen. Resultate: 1-Kontrollexperiment mit I-Cre I:

Reporterkonstrukt/Expressionsvektor	Leeres Plasmid	LACURAZ-Kontrolle ohne Spaltungsstelle	LACURAZ + I-CreI-Spaltungsstelle
Leeres Plamid	Glucose: weiss	Glucose: weiss	Glucose: weiss
Leeres Plamid	Galactose: weiss	Galactose: weiss	Galactose: weiss
I-CreI gene	Glucose: weiss	Glucose: weiss	Glucose: hellblau
I-CreI gene	Galactose: weiss	Galactose: weiss	Galactose: dunkelblau

2-Experiment mit Einzelketten-I-CreI

Reporterkonstrukt/Expressionsvektor	Leeres Plasmid	LACURAZ-Kontr. ohne Spaltungsstelle	LACURAZ + I-CreI Spaltungsstelle
Leeres Plamid	Glucose: weiss	Glucose: weiss	Glucose: weiss
Leeres Plamid	Galactose: weiss	Galactose: weiss	Galactose: weiss
Einzelketten-I-CreI gene	Glucose: weiss	Glucose: weiss	Glucose: hellblau
Einzelketten-I-CreI gene	Galactose: weiss	Galactose: weiss	Galactose: dunkelblau

Diese Ergebnisse zeigen an, dass das Einzelketten-I-CreI-Gen die Expression einer aktiven Meganuclease ermöglicht, die sich wie das natürliche I-CreI-Molekül verhält, durch Erkennen und Schneiden seiner eigenen Spaltungsstelle, was eine homologe Recombination der Reportersequenz induziert. Die hellblaue Färbung geht auf eine sehr geringe Expression der Meganuclease zurück, die in der Zelle sehr stabil ist. Diese kleine Proteinmenge ermöglicht dem Reporterkonstrukt die Rekombination, was zur Produktion einer erfassbaren β-Galactosidase-Aktivität führt. Auf jeder ”weissen” Platte treten einige blaue Kolonien mit einer durchschnittlichen Rate von 10^–2 auf. Dieser Hintergrund geht auf die hochspontane Rekombination in Hefe zurück.
IN VIVO SPALTUNGSASSAY IN SÄUGERZELLEN
Endonuclease-Aktivität von Einzelketten-I-CreI-Meganuclease
Wir entwickelten auch einen Assay in Säugerzellen basierend auf der Erfassung einer homologen Rekombination, die durch einen angestrebten Doppelstrangbruch induziert wird. Wie bei dem vorstehend beschriebenen Hefesystem überwachen wir die Restoration eines funktionalen LacZ-Markers, die aus der Spaltungsaktivität der interessierenden Meganuclease resultiert.
Wir transferierten zuerst das Hefe-Reportersystem in ein Säuger-Expressionsplasmid. Das LACZ-Repeat, zusammen mit der intervenierenden-Sequenz, einschließlich einer I-CreI Spaltungsstelle, wurde in pcDNA3 (Invitrogene) cloniert. Dadurch sind alle funktionalen LACZ-Gene, die aus einer Rekombination resultieren, unter der Kontrolle des CMV-Promotors von pcDNA3, und weisen auch funktionale Terminierungssequenzen auf. Wir clonierten auch die I-CreI und Einzelketten-I-CreI offenen Leserahmen in pCLS3.1, einem selbstgefertigen Expressionsvektor für Säugerzellen.
Unter Verwendung des Effectene(Qiagen)-Transfektionskit wurden 0,5 μg des Reporterplasmids in Simian COS Zellen co-transfiziert, mit 0,5 μg von pCLS3.1, 0,5 μg des I-CreI Expressionsplasmids, oder 0,5 μg des Einzelketten-I-CreI Expressionsplasmids. Die β-Galactosidase-Aktivität wurde 72 hours nach Transfektion durch einen nachstehend beschriebenen Assay überwacht. In einem Kontrollexperiment wurden 0,5 μg eines Reporterplasmids ohne Spaltungsstellen mit 0,5 μg pCLS3.1, 0,5 μg I-CreI Expressionsplasmid, oder 0,5 μg Einzelketten-I-CreI Expressionsplasmid co-transfiziert.
Dieser Assay basiert auf der Erfassung einer Tandem-Repeat-Rekombination, die bei einem als SSA (Single-strand Annealing) bezeichneten Prozess häufig auftritt. Deshalb entwarfen wir auch einen Assay basierend auf der Erfassung einer Rekombination zwischen invertierten Repeats. Rekombination zwischen invertierten Repeats tritt meistens durch Genkonversion auf, einen andere Art von Rekombinationsereignis.
Ein vollständiges LacZ ORF, unterbrochen durch eine I-CreI-Spaltungsstelle (und somit nicht funktional) wird in pcDNA3 zwischen den CMV Promotor und die Terminierungssequenz eingebracht. Eine trunkierte, nicht-funktionale Kopie des Gens wird in einer invertierten Orientierung cloniert, um ein homologes Donortemplate für die Genkonversion zur Verfügung zu stellen. Es ist nicht von Promotor- und Terminatorsequenzen flankiert. Es umfasst 2,5 Kb des inneren Teils von the LacZ ORF, die Region überlappend, an der die I-CreI Spaltungsstelle in der anderen Kopie zu finden ist.
0,5 μg des Reporterplasmids wurden in COS Zellen co-transfiziert, mit 0,5 μg pCLS3.1, 0,5 μg des I-CreI Expressionsplasmids, oder 0,5 μg des Einzelketten-I-CreI Expressionsplasmid. In einem Kontrollexperiment wurden 0,5 μg eines Reporterplasmids ohne homologes Donortemplate mit 0,5 μg pCLS3.1, 0,5 μg I-CreI Expressionsplasmid, oder 0,5 μg des Einzelketten-I-CreI Expressionsplasmids co-transfiziert.
Der Assay wird wie folgt durchgeführt:
COS-Zellen wurden mit Effectene-Transfektionsreagens gemäß dem Lieferfirmen(Qiagen)-Protokoll transfiziert. 72 h nach der Transfektion wurden Zellen zweimal mit PBS1X gespült und in Lysepuffer inkubiert (Tris-HCl 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X100 0,1%, BSA 0,1 mg/ml, Proteaseinhibitoren). Lysat wurde zentrifugiert, und der Überstand für Bestimmung der Proteinkonzentration und β-Galactosidase-Flüssigassay verwendet. Typischerweise wurden 30 μl Extract mit 3 μl Mg 100X Puffer (MgCl₂ 100 mM, (3-Mercaptoethanol 35%), 33 μl ONPG 8 mg/ml und 234 μl Natriumphosphat 0,1 M pH 7,5 kombiniert. Nach Inkubieren bei 37°C wurde die Reaktion mit 500 μl 1 M Na₂CO₃ gestoppt, und OD wurde bei 415 nm gemessen. Die relative β-Galactosidase-Aktivität wird als Funktion of dieses OD, normalisiert mit der Reaktionszeit, und der Protein-Gesamtmenge bestimmt.
Resultate
1. Tandem-Repeat-Rekombination:
2. Inverted repeat Rekombination
Diese Resultate zeigen an, dass die Einzelketten-I-CreI genügend Spaltung einer I-CreI Spaltungsstelle induzieren können, um eine homologe Rekombination zwischen Direkt-Repeats wie auch zwischen invertierten Repeats zu stimulieren.
Bei Direkt-Repeats wurden ähnliche Niveaus von induzierter Rekombination mit jeder der Einzelketten-I-CreI (#5-6) oder I-CreI (#3-4) beobachtet. Dieses Niveau an Rekombination stellt eine 2- bis 2,5-fache Zunahme im Vergleich mit dem Hintergrundniveau der Rekombination des Reporterplasmids (#1-2) dar. Ausserdem wurde keine solche Zunahme des Rekombinationsniveaus mit einem Reporterplasmid beobachtet, das keine I-CreI Spaltungsstelle aufwies (#7-12).
Bei invertierten Repeats induziert die Einzelketten-I-CreI (#5-6) und die I-CreI Meganuclease (#3-4) eine ähnliche Stimulation der Genkonversion; mit einer 2,5- bis 4-fachen Zunahme im Vergleich mit dem Hintergrundnivau (#1-2). Wie von einem Bonafide-Homologrekombinationsereignis zu erwarten war, wurde keine Stimulation mit einem Reporterplasmid beobachtet, das kein homologes Donortemplate aufwies (#7-12).

SEQUENCE LISTING

SEQUENCE LISTING

Claims

Hybridmeganuclease, umfassend eine erste Domäne und eine zweite Domäne in der Orientierung N-terminal zu C-terminal, wobei die erste Domäne abgeleitet ist von der N-terminalen Domäne von I-DmoI und die zweite Domäne abgeleitet ist von I-CreI, wobei die erste und zweite Domäne durch einen zweckmäßigen Linker gebunden sind, jede Domäne ein Polypeptidfragment ist, umfassend oder bestehend aus ein Dodecapeptidmotiv und eine DNA-bindende Einheit, und wobei die Hybridmeganuclease in der Lage ist., DNA-Spaltung zu verursachen.
Hybridmeganuclease gemäß Anspruch 1, wobei der zweckmäßige Linker einen Loop umfasst, abgeleitet von einer Di-Dodecapeptidmeganuclease.
Hybridmeganuclease gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der zweckmäßige Linker einen Loop umfasst, abgeleitet von der ersten Di-Dodecapeptidmeganuclease oder einem Teil davon.
Hybridmeganuclease gemäß Anspruch 1 bis 3, wobei die Hybridmeganuclease die Sequenz von SEQ ID NO: 4 umfasst.
Gereinigtes oder rekombinantes Polynucleotid, welches eine Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert.
Gereinigtes oder rekombinantes Polynucleotid, umfassend ein Hybridtarget und eine Spaltstelle für eine Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Polynucleotid gemäß Anspruch 6, wobei die Stelle zwei Halbstellen der initialen Dodecapeptidmeganuclease umfasst.
Vektor, umfassend ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7.
Wirtszelle, umfassend ein Polynucleotid gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, einen Vektor gemäß Anspruch 8 oder eine Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4.
Verwendung eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, eines Vektors gemäß Anspruch 8 oder einer Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 als molekularbiologisches Werkzeug.
Verwendung eines Polynucleotids gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, eines Vektors gemäß Anspruch 8 oder einer Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 für die Gentechnik mit der Maßgabe, dass die genetische Identität der Keimbahn von menschlichen Lebewesen nicht modifiziert wird.
Gentechnikverfahren, umfassend die Schritte: 1) Einführen eines Doppelstrangbruches an einem Targetinglocus, umfassend die Hybridtargetstelle mit der entsprechenden Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, 2) Zurverfügungstellen eines Targetingkonstruktes, umfassend die einzuführende Sequenz, flankiert durch eine Sequenz, welche zum Targetinglocus homolog ist.
Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Targetinglocus ein genomischer Locus ist.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 12 bis 13, wobei die Meganuclease zur Verfügung gestellt wird entweder durch einen Expressionsvektor, umfassend ein Polynucleotid gemäß Anspruch 5, oder durch die Meganuclease selbst.
Verfahren zur Deletion eines viralen Genoms oder eines Teils davon, wobei ein Doppelstrangbruch im viralen Genom induziert wird durch eine Meganuclease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und dieser Doppelstrangbruch ein Rekombinationsereignis induziert, welches zur Deletion des viralen Genoms oder eines Teils davon führt.