DE60217081T2

DE60217081T2 - Gen beteiligt an v(d)j rekombination und/oder dna reparatur

Info

Publication number: DE60217081T2
Application number: DE60217081T
Authority: DE
Inventors: Jean-Pierre De Villartay; Despina Moshous; Alain Fischer
Original assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2001-03-22
Filing date: 2002-03-21
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2022-03-22
Also published as: ATE349519T1; US20050064405A1; WO2002077026A3; DE60217081D1; WO2002077026A2; US20090208963A1; EP1373500A2; US7534874B2; ES2278940T3; EP1373500B1; WO2002077228A1; AU2002307829A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue DNA-Sequenz, die an der V(D)J-Rekombination in Lymphozyten beteiligt ist und deren Mutation schweren kombinierten Immundefekt (SCID) verursacht. Die Erfindung betrifft auch Diagnoseverfahren, Therapieverfahren und Verfahren zur Durchmusterung neuer Verbindungen, welche diese Sequenz verwenden, sowie nicht-menschliche transgene Tiere.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
B- und T-Lymphozyten erkennen fremdes Antigen durch spezialisierte Rezeptoren: die Immunglobuline bzw. den T-Zell-Rezeptor (TCR). Die hoch polymorphen Antigen-Erkennungsregionen dieser Rezeptoren sind aus variablen (V), Diversitäts- (D) und Verbindungs ("joining") (J)-Gensegmenten zusammengesetzt, die vor ihrer Expression durch einen Mechanismus, der als V(D)J-Rekombination bekannt ist, eine somatische Umlagerung eingehen (Tonegawa, 1983). Jedes V-, D- und J-Segment ist von Rekombinations-Signalsequenzen (RSSs) flankiert, die aus konservierten Heptameren und Nonameren zusammengesetzt sind, welche durch willkürliche Sequenzen mit entweder 12 oder 23 Nukleotiden getrennt sind. RSSs dienen als Erkennungssequenzen für die V(D)J-Rekombinase.
Die V(D)J-Rekombination kann grob in drei Schritte aufgeteilt werden. Das RAG1- und RAG2-Protein initiieren den Umlagerungsprozess durch die Erkennung der RSS und die Einführung eines DNA-Doppelstrang-Bruches (DSB) an der Grenze des Heptamers (Schatz et al., 1989; Oettinger, 1990). RAG1 und RAG2 sind die einzigen zwei Faktoren, die erforderlich sind, um in einer Reaktion, die an die retrovirale Integration und Transposition erinnert (van Gent et al., 1996; Roth und Craig, 1998) die DNA-Spaltung in zellfreien Systemen zu katalysieren (McBlane et al., 1995; Van Gent et al., 1995; Eastman et al., 1996). Es wurde gezeigt, dass drei saure Reste, DDE, die aktive Stelle zusammensetzen, die von RAG1 getragen wird (Kim et al., 1999; Landree et al., 1999; Fugmann et al., 2000). Die auf unreife B- und T-Lymphozyten beschränkte Expression sowohl des RAG1- als auch des RAG2-Gens begrenzt die V(D)J-Rekombination auf die Lymphoid-Linie. Am Ende dieser Phase, welche einen DNA-Schaden verursacht, wird die chromosomale DNA mit zwei Haarnadel-verschlossenen Codierungsenden (CE) zurückgelassen, während die RSSs und die dazwischenliegenden DNA-Sequenzen aus den Chromosomen als stumpfe phosphorylierte Signalenden (SE) aus dem Chromosom ausgeschnitten werden (Roth et al., 1992; Schlissel et al., 1993; Zhu und Roth, 1995). Der anschließende Schritt besteht in der Erkennung und dem Signalisieren des DNA-Schadens an die DNA-Reparaturmaschinerie. Von nun an sind allgegenwärtige enzymatische Aktivitäten beteiligt.
Die Beschreibung der murinen SCID-Situation, die durch einen Mangel an zirkulierenden reifen B- und T-Lymphozyten gekennzeichnet ist (Bosma et al., 1983), als allgemeiner DNA-Reparaturdefekt, der von einer erhöhten Empfindlichkeit gegen ionisierende Strahlung oder andere Mittel begleitet ist, die einen DNA-DSB verursachen, lieferte das Bindeglied zwischen V(D)J-Rekombination und DNA-DSB-Reparatur (Fulop, 1990; Biedermann, 1991; Hendrickson, 1991). Dieses wurde weiter durch die Analyse von chinesischen Ovarialzelllinien (CHO) bestätigt, die anfänglich auf der Basis ihres Defekts bei der DNA-Reparatur selektiert wurden und von denen sich herausstellte, dass sie in vitro eine beeinträchtigte V(D)J-Rekombination aufweisen (Taccioli et al., 1993). Dies führte zu der Beschreibung des Ku70/Ku80/DNA-PKcs-Komplexes als DNA-Schaden-Sensor (Überblick in (Jackson and Jeggo, 1995)). Kurz gesagt, ist DNA-PKcs eine DNA-abhängige Proteinkinase, die zu der Phosphoinosit(PI)kinase-Familie gehört, die an der Stelle der DNA-Läsion durch Wechselwirkung mit dem Regulationskomplex Ku70/80 rekrutiert wird, welcher sich an DNA-Enden bindet (Gottlieb und Jackson, 1993). Zellen aus SCID-Mäusen fehlt DNA-PK-Aktivität aufgrund einer Mutation in dem DNA-PKcs codierenden Gen (Blunt et al., 1996; Danska et al., 1996). Dies beeinträchtigt den V(D)J-Rekombinationsprozess schwer, was letztendlich zu einem Anhalten sowohl der B- als auch der T-Zellentwicklung führt.
In jüngerer Zeit wurden zwei Proteine, NBS1 und γ-H2AX, an der Stelle der chromosomalen Umlagerung im TCR-α-Locus in Thymozyten identifiziert (Chen et al., 2000). NBS1, das im Nijmegen-Bruchsyndrom mutiert ist, nimmt an der Bildung des RAD50/MRE11/NBS1-Komplexes teil, der an der DNA-Reparatur beteiligt ist (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998). γ-H2AX stellt die phosphorylierte Form des Histons H2A als Reaktion auf einen äußeren Schaden dar und wird als wichtiger Sensor eines DNA-Schadens angesehen (Rogakou et al., 1998; Rogakou et al., 1999; Paull et al., 2000). Die biologische Implikation dieser Beobachtung ist noch nicht vollständig verstanden, aber sie zeigt, dass der RAD50/MRE11/NBS1-Komplex bei der Aufspürung und Signalisierung des RAG1/2-vermittelten DNA-DSB an die zelluläre DNA-Reparatur-Maschinerie mit dem DNA-PK-Komplex kooperieren kann. In der Endphase der V(D)J-Umlagerung stellt die DNA-Reparatur-Maschinerie als solche die Religierung der beiden chromosomalen gebrochenen Enden sicher. Dieser letzte Schritt ähnelt dem wohlbekannten nicht-homologe Enden verbindenden (NHEJ) DNA-Stoffwechselweg in der Hefe Saccharomyces cerevisiae (Überblick in (Haber, 2000)), an dem der XRCC4- (Li et al., 1995) und der DNA-Ligase IV- (Robins und Lindahl, 1996) Faktor beteiligt sind. Die kürzlich erhaltene Kristallstruktur von XRCC4 demonstriert die hantelartige Konformation dieses Proteins und liefert eine strukturelle Basis für seine Bindung an DNA sowie seine Assoziation mit DNA-Ligase IV (Junop et al., 2000). Alle Tiermodelle, die ein defektes Gen von einem der beiden der bekannten V(D)J-Rekombinationsfaktoren tragen, entweder natürlich (muriner und equiner SCID) oder durch homologe Rekombination erzeugt, weisen einen tiefgreifenden Defekt im Lymphoid-Entwicklungsprogramm aufgrund eines Anhaltens der B- und T-Zellreifung in frühen Stadien auf (Mombaerts et al., 1992; Shinkai et al., 1992; Nussenzweig et al., 1996; Zhu et al., 1996; Jhappan et al., 1997; Shin et al., 1997; Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998; Gao et al., 1998; Taccioli et al., 1998). In den Fällen von DNA-Ligase IV und XRCC4 ist dieser Phänotyp auch von einer frühen embryonalen Letalität begleitet, die von einem massiven apoptotischen Tod von postmitotischen Neuronen verursacht wird (Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998).
Bei Menschen sind mehrere Immundefekt-Zustände durch ein fehlerhaftes T- und/oder B-Zell-Entwicklungsprogramm gekennzeichnet (Fischer et al., 1997). In etwa 20 % der Fälle wird ein schwerer kombinierter Immundefekt (SCID)-Phänotyp durch die vollständige Abwesenheit von sowohl zirkulierenden B- als auch T-Lymphozyten verursacht, die auch mit einem Defekt im V(D)J-Rekombinationsprozess verbunden ist, während Natural Killer (NK)-Zellen anwesend sind. Mutationen entweder im RAG1- oder im RAG2-Gen machen eine Unterklasse der Patienten mit diesem Zustand aus (Schwarz et al., 1996; Corneo et al., 2000; Villa et al., 2001). Bei einigen Patienten (RS-SCID) wird der T-B-SCID-Defekt nicht von einer RAG1- oder RAG2-Mutation verursacht und wird von einer erhöhten Empfindlichkeit gegen ionisierende Bestrahlungen sowohl von Knochenmarkszellen (CFU-GMs) als auch primären Haut-Fibroblasten (Cavazzana-Calvo et al., 1993) sowie einem Defekt in der V(D)J-Rekombination in Fibroblasten (Nicolas et al., 1998) begleitet.
Obwohl dieser Zustand nahelegt, dass RS-SCID einen allgemeinen DNA-Reparaturdefekt aufweisen könnte, der an die murine SCID-Situation erinnert, wurde gefunden, dass die DNA-PK-Aktivität bei diesen Patienten normal ist, und die Beteiligung des DNA-PKcs-Gens wurde eindeutig durch genetische Mittel in mehreren blutsverwandten Familien ausgeschlossen (Nicolas et al., 1996). Eine Rolle aller anderer bekannten Gene, die an der V(D)J-Rekombination/DNA-Reparatur beteiligt sind, wurde gleichermaßen als für den RS-SCID-Zustand verantwortlich ausgeschlossen (Nicolas et al., 1996). Das Gen, das in RS-SCID defekt ist, codiert deshalb einen noch nicht beschriebenen Faktor. Die Erfinder haben kürzlich den mit der Krankheit verbundenen Locus dem kurzen Arm des menschlichen Chromosoms 10 in einer 6.5cM-Region zugeordnet, die von zwei polymorphen Markern D10S1664 und D10S674 begrenzt wird (Moshous et al., 2000), einer Region, von der gezeigt wurde, dass sie mit einem ähnlichen SCID- Zustand verbunden ist, der bei Athabascan sprechenden amerikanischen Indianern beschrieben wurde (A-SCID) (Hu et al., 1988; Li et al., 1998).
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifikation und Klonierung des Artemis-Gens, das in dieser Region des Chromosoms 10 lokalisiert ist. Artemis codiert einen neuen V(D)J-Rekombinations- und/oder DNA-Reparatur-Faktor, welcher der Metallo-β-lactamase-Überfamilie angehört und dessen Mutationen Anlass zum menschlichen RS-SCID-Zustand geben.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäure-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nukleotiden 39-2114 der SEQ ID Nr. 1 oder den Nukleotiden 60-2114 der SEQ ID Nr. 1.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Polypeptide, die von der Nukleinsäure der Erfindung codiert werden, und verschiedene Verwendungen, die mit den Gegenständen der Erfindung vorgenommen werden können.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 stellt eine schematische Ansicht der genomischen Organisation des Artemis-Gens, wobei die Exone als Rechtecke dargestellt sind, und die verschiedenen bei RS-SCID-Patienten identifizierten Mutationen dar.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
In einem ersten Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäure-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nukleotiden 39-2114 von SEQ ID Nr. 1 oder den Nukleotiden 60-2114 von SEQ ID Nr. 1.
Es ist auch vorgesehen, dass die Erfindung die genomische Nukleinsäuresequenz umfasst, die nach der Transkription zu SEQ ID Nr. 1 führt Die genomische Nukleinsäuresequenz kann vom Fachmann leicht aus SEQ ID Nr. 1 mittels Durchmusterung einer Bibliothek genomischer DNA unter Verwendung einer Sonde erhalten werden, welche von SEQ ID Nr. 1 abgeleitet ist. Sie kann auch ausgehend von der Sequenz mit der GenBank Zugangsnummer AL360083 erhalten werden, welche unter der folgenden Adresse verfügbar ist: http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=Nucleotide& list_uids=12584428&dopt=GenBank.
Die Erfindung umfasst auch ein isoliertes und gereinigtes Nukleinsäure-Molekül, welches das Komplement des isolierten Nukleinsäure-Moleküls der Erfindung ist, wie vorstehend beschrieben.
Mit Nukleinsäure, Nukleinsequenz, Nukleinsäuresequenz, Polynukleotid, Oligonukleotid, Polynukleotidsequenz, Nukleotidsequenz, alles Ausdrücke, die ohne Unterscheidung in der vorliegenden Anmeldung verwendet werden, bezeichnet man einen spezifischen Strang von Nukleotiden, modifiziert oder nicht, der ein Fragment oder eine Region einer Nukleinsäure definiert, die natürliche oder nicht-natürliche Nukleotide umfasst. Es kann sich um eine doppelsträngige DNA, eine einzelsträngige DNA oder um Transkriptionsprodukte der DNAs handeln. Die Sequenzen gemäß der Erfindung umfassen auch Peptidnukleinsäure oder Analoga oder Sequenzen mit modifizierten Nukleotiden (Phosphorothioaten, Methylphosphonaten ...).
Mit isoliert ist gemeint, dass die Nukleinsäure der Erfindung nicht in ihrer natürlichen Chromosomenumgebung vorliegt. Die Sequenzen gemäß der Erfindung sind isoliert und/oder gereinigt worden, was bedeutet, dass sie direkt oder indirekt (z.B. durch Kopie mittels Amplifikation) erhalten wurden, wobei ihre natürliche Umgebung zumindest teilweise modifiziert worden ist. Die Nukleinsäuren, die durch chemische Synthese erhalten worden sind, sind ebenfalls Teil der vorliegenden Erfindung.
Die stringenten Hybridisierungsbedingungen können definiert werden, wie es in Sambrook et al. ((1989) Molecular cloning: a laboratory manual. 2. Aufl. Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, New York) beschrieben ist, mit den folgenden Bedingungen: 5 × oder 6 × SCC, 50-65°C. Hochstringente Bedingungen, die ebenfalls für eine Hybridisierung verwendet werden können, sind mit den folgenden Bedingungen definiert: 6 × SSC, 60-65°C.
Die DNA-DNA- oder DNA-RNA-Hybridisierung kann in zwei Schritten durchgeführt werden: (1) Vorhybridisierung bei 42°C für 3 h in Phosphat-Puffer (20 mM, pH 7,5), der 5 oder 6 × SSC (1 × SSC entspricht einer Lösung 0,15 M NaCl + 0,015 M Natriumcitrat), 50 % Formamid, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 10 × Denhardt, 5 % Dextransulfat und 1 % Lachssperma-DNA enthält; (2) Hybridisierung für bis zu 20 h bei einer Temperatur von 50-65°C, bevorzugter 60-65°C, gefolgt von verschiedenen Waschschritten (etwa 20 Minuten in 2 × SSC + 2 % SDS, dann 0,1 × SSC + 0,1 % SDS). Der letzte Waschschritt wird in 0,2 × SSC + 0,1 % SDS fürr etwa 30 Minuten bei etwa 50-65°C und/oder in 0,1 × SSC + 0,1 % SDS bei der gleichen Temperatur durchgeführt. Diese Hochstringenz-Hybridisierungsbedingungen können von einem Fachmann angepasst werden. In der Tat ist der Fachmann in der Lage, die Bedingungen der besten Stringenz durch Variieren der Konzentrationen an SSC und SDS und der Temperatur der Hybridisierung und Waschschritte zu bestimmen.
Der Ausdruck "Bedingungen hoher Stringenz" bezieht sich auch auf Hybridisierung und Waschen unter Bedingungen, welche das Binden eines Nukleinsäure-Moleküls, das zur Durchmusterung verwendet wird, wie eine Oligonukleotid-Sonde oder cDNA-Molekül-Sonde, an hoch homologe Sequenzen ermöglichen. Eine beispielhafte Hochstringenz-Waschlösung ist 0,2 × SSC und 0,1 % SDS, verwendet bei einer Temperatur zwischen 50-65°C.
Wenn Oligonukleotid-Sonden verwendet werden, um cDNA oder genomische Bibliotheken zu durchmustern, kann eine der folgenden zwei Hochstringenz-Lösungen verwendet werden. Die erste derselben ist 6 × SSC mit 0,05 % Natriumpyrophosphat bei einer Temperatur von 35°C-62°C, abhängig von der Länge der Oligonukleotid-Sonde. Zum Beispiel werden 14 Basenpaar-Sonden bei 35°C-40°C gewaschen, 17 Basenpaar-Sonden werden bei 45°C-50°C gewaschen, 20 Basenpaar-Sonden werden bei 52°C-57°C gewaschen und 23 Basenpaar-Sonden werden bei 57-63°C gewaschen. Die Temperatur kann um 2-3°C erhöht werden, wenn die nicht-spezifische Hintergrundbindung hoch erscheint. Eine zweite Hochstringenz-Lösung verwendet Tetramethylammoniumchlorid (TMAC) für das Waschen von Oligonukleotid-Sonden. Eine stringente Waschlösung ist 3 M TMAC, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0 und 0,2 % SDS. Die Waschtemperatur bei Verwendung dieser Lösung ist eine Funktion der Länge der Sonde. Zum Beispiel wird eine 17 Basenpaar-Sonde bei etwa 45-50°C gewaschen.
Zwei Polynukleotide werden als "identisch" oder "homolog" bezeichnet, wenn die Sequenz der Nukleotide bzw. Aminosäure-Reste in den zwei Sequenzen die gleiche ist, wenn sie für eine maximale Entsprechung ausgerichtet sind, wie nachstehend beschrieben. Der Ausdruck "komplementär zu" wird hierin verwendet, um zu bezeichnen, dass die komplementäre Sequenz mit der ganzen oder einem angegebenen zusammenhängenden Teil einer Bezugs-Polynukleotidsequenz identisch ist. Sequenzvergleiche zwischen zwei (oder mehr) Polynukleotiden oder Polypeptiden werden typisch durch Vergleichen von Sequenzen von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Segment oder "Vergleichsfenster" durchgeführt, um lokale Regionen von Sequenzähnlichkeit zu identifizieren und zu vergleichen. Das optimale Alignment von Sequenzen für den Vergleich kann durch den lokalen Homologiealgorithmus von Smith und Waterman, Ad. App. Math 2:482 (1981), durch den Homologie-Alignmentalgorithmus von Neddleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), durch das Verfahren der Suche nach Ähnlichkeit von Pearson und Lipman, Prop. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 85:2444 (1988), durch Computer-Implementierung dieser Algorithmen (GAP, BESTFIT, BLAST N, BLAST P, FASTA und TFASTA im Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) oder durch Augenschein durchgeführt werden. Um das optimale Alignment-Fenster zu bestimmen, könnte das BLAST-Programm unter Verwendung der Matrix BLOSUM 62 oder der Matrizes PAM oder PAM250 mit Standardparametern oder Parametern verwendet werden, die modifiziert sind, um die Spezifität zu erhöhen.
"Prozentsatz der Sequenzidentität oder -homologie" wird durch Vergleich von zwei optimal ausgerichteten Sequenzen über ein Vergleichsfenster bestimmt, wobei der Teil der Polynukleotidsequenz im Vergleichsfenster Additionen oder Deletionen (d.h. Leerstellen) im Vergleich zur Bezugssequenz (die keine Additionen oder Deletionen umfasst) für ein optimales Alignment der beiden Sequenzen umfassen kann. Der Prozentsatz wird durch Bestimmung der Zahl der Positionen, an denen die identische Nukleinsäurebase oder der identische Aminosäure-Rest in beiden Sequenzen auftritt, was die Zahl der übereinstimmenden Positionen liefert, Teilen der Zahl der übereinstimmenden Positionen durch die Gesamtzahl der Positionen im Vergleichsfenster und Multiplizieren des Ergebnisses mit 100 berechnet, was den Prozentsatz der Sequenzidentität liefert.
Die Erfinder haben auch demonstriert, dass es möglich ist, die V(D)J-Rekombinationsaktivität zu erhalten, indem nur ein Fragment des Proteins verwendet wird, das durch die Nukleotide 39-1193 oder 60-1193 codiert wird. Dieses spezielle Fragment wird ebenfalls in der vorliegenden Erfindung bevorzugt.
Es ist wichtig zu bemerken, dass die Fragmente gemäß der Erfindung vorzugsweise nicht vollständig zwischen den Nukleotiden 158-609, 607-660 oder 29-537 der SEQ ID Nr. 1 enthalten sind. In der Tat entsprechen diese Nukleotide EST, die in der GenBank unter den Zugangsnummern AA306797 (Nukleotide 29-537) und AA315885 (Nukleotide 158-609, 607-660) offenbart sind. Diese EST-Offenbarungen sind jedoch unvollständig, da AA306797 ein "N" in der Position 91 umfasst, welches es unklar macht, da es alle 4 verschiedenen Nukleotide repräsentiert (das tatsächliche Nukleotid ist ein "C", wie an der Position 119 von SEQ ID Nr. 1 gesehen). Weiter startet AA306797 vor dem ersten Methionin, wie in der vorliegenden Erfindung identifiziert (Nukleotid 39 der SEQ ID Nr. 1), was nicht das tatsächliche Startcodon des Proteins der Erfindung nahelegt. EST AA315885 besitzt im Vergleich zu der Sequenz der Erfindung ein hinzugefügtes "C" am Nukleotid 453 von AA315885 (entsprechend dem Nukleotid 610 der SEQ ID Nr. 1).
Die Offenbarungen von AA306797 und AA315885 sind von Dronkert et al. (2000, Mol. Cell. Biol., 20, 4553-61) verwendet worden, um (nach Translation der EST) einen Teil des menschlichen SNM1c-Proteins zu erhalten, das teilweise homolog zum murinen SNM1, dem Gegenstand der Offenbarung, ist. Die Probleme bei den zwei EST, die oben erwähnt sind, führten zu einem falschen translatierten Protein.
Es ist auch bemerkenswert, dass Wood et al. (2001, Science, 291, 1284-9) erwähnen, dass das Gen-EST, das SNM1C entspricht, auf dem Chromosom 10 angeordnet ist, aber nicht die Lokalisation (10p) präzisieren, noch geben sie irgendeine andere Information an als EST AA315885, von dem gezeigt wurde, dass es fehlerhaft ist.
Die Nukleotide 1 bis 35 und 37 bis 189 der SEQ ID Nr. 1 sind in EST offenbart worden, welches in GenBank unter der Zugangsnummer AA278590 offenbart ist und unvollständig und fehlerhaft ist, da ihm das "G"-Nukleotid fehlt, das an der Position 36 der SEQ ID Nr. 1 vorliegt.
Die Nukleotide 1848 bis 2321 entsprechen einigen Nukleotiden, die in EST anwesend sind, das in GenBank unter der Zugangsnummer AI859962 offenbart ist und unvollständig ist. Dieses EST offenbart einen fehlerhaften Teil der komplementären Sequenz der SEQ ID Nr. 1, die Nukleotide, die komplementär zu den Nukleotiden sind, die am Start von EST AI859962 vorliegen, entsprechen nicht den letzten Nukleotiden der SEQ ID Nr. 1.
Dieses EST enthält teilweise EST AA278850, das ebenfalls unvollständig und fehlerhaft ist (Fehlpaarung eines Nukleotids im Vergleich zum Komplement der SEQ ID Nr. 1).
Deshalb sind diese Offenbarungen nicht nur fehlerhaft und unvollständig, sondern verknüpfen auch nicht die Nukleinsäure der Erfindung, wie oben definiert, mit der V(D)J-Rekombination und dem SCID-Defekt, wie es die Erfinder in der vorliegenden Anmeldung vornahmen. Dies hätte den Fachmann verwirrt, der nicht in der Lage gewesen wäre, viel Information aus diesen Offenbarungen zu erhalten.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf einen Vektor gerichtet, der das Nukleinsäure-Molekül der Erfindung umfasst, insbesondere die Nukleinsäuresequenz, die den Nukleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 oder 60-1193 der SEQ ID Nr. 1 entspricht. Zahlreiche Vektoren sind in der Technik bekannt, und sie können beispielsweise Expressionsvektoren oder Amplifikationsvektoren sein.
Die Erfindung ist auch auf eine Wirtszelle gerichtet, welche den erfindungsgemäßen Vektor umfasst.
Die Erfindung ist auch auf ein Verfahren zur Produktion eines Proteins gerichtet, das an der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist, umfassend die Schritte:

a) Exprimieren des erfindungsgemäßen Nukleinsäure-Moleküls in einem geeigneten Wirt, um ein Protein zu synthetisieren, das an der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist, und
b) Isolieren des Proteins, das an der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist.

Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, welches das Komplement des isolierten Nukleinsäure-Moleküls der Erfindung, wie vorstehend definiert, ist, und auf ein isoliertes Protein oder Peptid gerichtet, das durch die Nukleinsäure der Erfindung codiert wird. Wie nachstehend ersichtlich, kann das Protein oder Peptid der Erfindung entweder durch rekombinante DNA-, chemische oder andere Techniken erhalten werden.
Die Ausdrücke Polypeptid und Protein sind so zu verstehen, dass sie einen spezifischen Strang von Aminosäuren bedeuten, der natürlich oder synthetisch sein kann. Der Fachmann kennt Wege zur Variation von Aminosäuren. Bevorzugte Proteine oder Polypeptide sind insbesondere die SEQ ID Nr. 2 und die Aminosäuren 1-385 oder 8-385 der SEQ ID Nr. 2.
Die Expressionsvektoren der Erfindung enthalten bevorzugt einen Promotor, Translations-Start- und Terminationssignale sowie geeignete Regionen für die Regulierung der Transkription. Sie müssen in der Wirtszelle aufrechterhalten werden. Der Fachmann kennt derartige Vektoren und die Weisen, Proteine zu produzieren und zu reinigen, insbesondere durch Verwendung von Markierungen (wie dem Histidin-Marker oder Glutathion). Es ist auch möglich, in-vitro-Translations-Kits zu verwenden, die in großem Umfang verfügbar sind, um das Protein oder Peptid gemäß der Erfindung zu produzieren.
Die Nukleinsäure der Erfindung oder ein Fragment derselben kann unter Verwendung von Standard-Ligierungstechniken oder von homologer Rekombination in einen geeigneten Expressions- oder Amplifikationsvektor inseriert werden. Der Vektor wird so gewählt, dass er die Amplifikation der Nukleinsäure der Erfindung und/oder die Expression des Gens ermöglicht.
Die Vektoren können so gewählt werden, dass sie in einer großen Vielfalt von Wirten, wie prokaryotischen, Hefe-, Insekten- (Baculovirus-Systeme) und/oder eukaryotischen Wirtszellen, funktional sind. Die Wahl der Wirtszelle kann von den Eigenschaften des zu exprimierenden Polypeptids oder dessen Fragment abhängen, zum Beispiel, wenn Posttranslations-Modifikationen erforderlich sind (wie Glycosylierung und/oder Phosphorylierung). Wenn dies der Fall ist, sind eukaryotische Zellen, wie Hefe, Insekten- oder Säuger-Wirtszellen, vorzuziehen.
Der Fachmann kennt verschiedene Typen von Vektoren, die verwendet werden können, und die verschiedenen Techniken, die verwendet werden, um sie in Wirtszellen eintreten zu lassen (Elektroporation, Lipofektion ...).
Ein Überblick über die verschiedenen verwendbaren Vektoren, Wirtszellen und Regulations-DNA-Sequenzen auf den Vektoren, abhängig von den Wirtszellen, können in der US 6,165,753 , insbesondere Spalte 9, Zeile 34 bis Spalte 13, Zeile 36, gefunden werden. Dieser technische Teil des Dokuments, der sich auf das Cyclin-E2-Gen und -Polypeptid bezieht, aber auf jede andere cDNA oder jedes andere Gen verallgemeinert werden kann, wird hierin durch Bezugnahme aufgenommen.
Ein weiterer Überblick über die verschiedenen Vektoren, Regulationssequenzen, Wirtszellen und Verfahren zur Expression von Polypeptiden, die verwendet werden können, kann in der WO 99/55730, Seite 6, Zeile 3 bis Seite 25, Zeile 6, gefunden werden, was hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Zusammenfassend enthalten die Vektoren der Erfindung mindestens ein selektierbares Markergen, das ein Protein codiert, welches für das Überleben und Wachstum der Wirtszelle in einem selektiven Kulturmedium erforderlich ist. Typische Selektionsmarker-Gene codieren Proteine, die bei prokaryotischen Wirtszellen entweder eine Resistenz gegen Antibiotika, wie Ampicillin, Tetracyclin oder Kanamycin, verleihen, auxotrophe Defekte der Zelle komplementieren (beispielsweise Ura-Hefen). Bevorzugte selektierbare Marker sind das Kanamycinresistenz-Gen, das Ampicillinresistenz-Gen und das Tetracyclinresistenz-Gen. Das Kanamycinresistenz-Gen ist bevorzugt, wenn Vektoren, die sowohl im prokaryotischen als auch eukaryotischen (Säuger-)Zellen aktiv sind, verwendet werden, da das Protein in Säuger-Zellen eine Resistenz gegen Neomycin verleiht.
Die Vektoren der Erfindung enthalten auch eine Ribosomen-Bindungssequenz, wie eine Shine-Dalgarno-, eine Kozak-Sequenz oder eine interne Ribosomen-Eintrittsstelle (Ires).
Eine Signalsequenz kann auch verwendet werden, um das Polypeptid aus der Wirtszelle herauszulenken, wenn es synthetisiert ist. Dem Fachmann sind viele Signalsequenzen bekannt und jede derselben, die in der gewählten Wirtszelle funktional ist (homolog oder heterolog), kann in Verbindung mit der erfindungsgemäßen Nukleinsequenz verwendet werden.
Die Vektoren der Erfindung sind typisch von einem Ausgangsvektor, wie einem im Handel erhältlichen Vektor, abgeleitet. Derartige Vektoren können einige der Elemente, die in den fertigen Vektor einzuschließen sind, enthalten oder nicht, wobei derartige Elemente durch geeignete molekularbiologische Techniken eingeführt werden. So können hinzugefügte Elemente einzeln nach enzymatischem Verdau und Ligieren des Elements in den Vektor eingeführt werden. Dieses Verfahren ist in der Technik wohlbekannt und ist zum Beispiel in Sambrook et al., oben, beschrieben.
Bevorzugte Vektoren, von denen aus es möglich ist, die Vektoren der Erfindung zu erhalten, sind mit bakteriellen, Insekten- und Säuger-Wirtszellen kompatibel und schließen, ohne beschränkend zu sein, pCRII, pCR3 und pcDNA3 (Invitrogen Company, San Diego, Kalifornien), pBSII (Stratagene Company, LaJolla, Kalifornien), pET15b (Novagen, Madison, Wisconsin), PGEX (Pharmacia Biotech, Piscataway, N.J.), pEGFP-N2 (Clontech, Palo Alto, Kalifornien), PETL (BlueBacll; Invitrogen) und pFASTBacDual (Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.) ein.
Nach Konstruktion des Vektors und Insertion der Nukleinsäure der Erfindung kann der vollständige Vektor für die Amplifikation und/oder Polypeptid-Expression in eine geeignete Wirtszelle inseriert werden.
Derartige Wirtszellen können prokaryotische Wirtszellen (wie E. coli, Bacillus subtilis) oder eukaryotische Wirtszellen (wie eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Vertebratenzelle) sein. Die Wirtszelle kann, wenn sie unter geeigneten Bedingungen kultiviert wird, das Polypeptid synthetisieren, welches anschließend aus dem Kulturmedium (wenn die Wirtszelle es in das Medium sekretiert) oder direkt aus der Wirtszelle, die es produziert (wenn es nicht sekretiert wird), gesammelt werden kann. Nach dem Sammeln kann das Polypeptid unter Verwendung von Verfahren wie Molekularsieb-Chromatographie, Affinitätschromatographie und dergleichen gereinigt werden.
Die Wahl der Wirtszelle für die Polypeptid-Produktion hängt teilweise davon, ob das Polypeptid glycosyliert oder phosphoryliert werden soll (in welchem Fall eukaryotische Wirtszellen bevorzugt sind), und von der Weise ab, in welcher die Wirtszelle in der Lage ist, das Protein in seine native Tertiärstruktur (z.B. richtige Orientierung der Disulfid-Brücken usw.) zu "falten", so dass biologisch aktives Protein durch die Zelle hergestellt wird. Wenn die Wirtszelle nicht das Polypeptid synthetisiert, das die biologische Aktivität der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur aufweist, kann das Polypeptid nach Reinigung bei verschiedenen Dialysen "gefaltet" werden.
Geeignete Säugerzellen oder -zelllinien sind in der Technik wohlbekannt und umfassen Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO), HeLa-, HEK293-, Hep-2-, 3T3-Zellen, Affen-COS-1- und COS-7-Zelllinien und die CV-1-Zelllinie, Maus-Neuroblastom-N2A-Zellen, HeLa-Maus-L-929-Zellen, 3T3-Linien, die von Swiss-, Balb-c- oder NIH-Mäusen abstammen, BHK- oder NaK-Hamster-Zelllinien.
Nützliche Bakterien-Wirtszellen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen die verschiedenen Stämme von E. coli, wie HB101, DN5.α., DH10 oder MC1061. Verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas spp. oder Bacillus spp., Streptomyces spp. und dergleichen können ebenfalls in diesem Verfahren verwendet werden.
Viele Hefezellen-Stämme, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls als Wirtszellen für die Expression der Polypeptide der vorliegenden Erfindung verfügbar und man wird die Stämme von Saccharomyces cerevisiae, S. pombe, Kluyveromyces ... bevorzugen.
Der Eintritt (auch als "Transformation" oder "Transfektion") des Vektors in die gewählte Wirtszelle kann unter Verwendung von Verfahren wie Calciumchlorid, Elektroporation, Mikroinjektion, Lipofektion oder das DEAE-Dextran-Verfahren erzielt werden. Das gewählte Verfahren ist teilweise eine Funktion der Art der zur verwendenden Wirtszelle. Diese Verfahren und andere geeignete Verfahren sind dem Fachmann wohlbekannt und sind z.B. in Sambrook et al., oben, angegeben.
Der Fachmann kennt das Medium zur Verwendung für die Kultivierung der Wirtszellen, einschließlich des Selektionsmittels (Antibiotikums), das dem Medium zuzusetzen ist, abhängig vom Marker, der sich auf dem in die Zelle inserierten Vektor befindet.
Die Polypeptidmenge, die in der Wirtszelle produziert wird, kann unter Verwendung von in der Technik bekannten Standardverfahren, wie, ohne Beschränkung, Western-Blot-Analyse, SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, nicht-denaturierender Gelelektrophorese, HPLC-Auftrennung, Immunpräzipitation und/oder Aktivitätsassays, wie DNA-Bindungs-Gelshift-Assays, ausgewertet werden.
Die Reinigung des von Zellen der Erfindung produzierten Polypeptids kann, wenn es in Lösung vorliegt (Sekretion oder Exkretion), unter Verwendung einer Vielfalt von Techniken bewerkstelligt werden. Wenn es einen Marker wie Hexahistidin enthält, kann es im Wesentlichen in einem Einstufen-Verfahren durch Leiten der Lösung durch eine Affinitätssäule gereinigt werden, wobei die Säulenmatrix eine hohe Affinität für den Marker oder direkt für das Polypeptid aufweist (Nickel-Säule für Polyhistidin).
Wenn das Polypeptid ohne angebrachten Marker hergestellt wird, können andere wohlbekannte Verfahren für die Reinigung verwendet werden. Derartige Verfahren umfassen ohne Beschränkung Ionenaustausch-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie, HPLC, native Gelelektrophorese in Kombination mit Gelelution und präparative isoelektrische Fokussierung ("Isoprime"-Maschine/Technik, Hoefer Scientific). In einigen Fällen können zwei oder mehr dieser Techniken vereinigt werden, um eine erhöht Reinheit zu erzielen.
Wenn vorausgesehen wird, dass das Polypeptid hauptsächlich intrazellulär gefunden wird, kann das intrazelluläre Material (einschließlich Einschlusskörpern bei gram-negativen Bakterien) unter Verwendung jeder dem Fachmann bekannten Standardtechnik aus der Wirtszelle extrahiert werden. Zum Beispiel kann die Wirtszelle durch French-Presse, Homogenisierung und/oder Beschallung, gefolgt von Zentrifugation, lysiert werden, um den Inhalt des Periplasmas/Zytoplasmas freizusetzen.
Wenn das Polypeptid im Periplasma Einschlusskörper gebildet hat, wird das Polypeptid unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren erhalten, insbesondere mit Hilfe von chaotropen Mitteln wie Guanidin oder Harnstoff, um die Einschlusskörper freizusetzen, aufzubrechen und löslich zu machen. Eine weitere Dialyse trägt dazu bei, das Polypeptid zu lösen.
Man kann auch andere dem Fachmann wohlbekannte Standardverfahren verwenden, wie Auftrennung durch Elektrophorese, gefolgt von Elektroelution, verschiedene Arten von Chromatographie (Immunaffinität, Molekularsieb und/oder Ionenaustausch) und/oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie. In einigen Fällen kann es vorzuziehen sein, mehr als eines dieser Verfahren für eine vollständige Reinigung zu verwenden.
Zusätzlich zur Herstellung und Reinigung des Polypeptids unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken können die Polypeptide, Fragmente und/oder Derivate derselben durch chemische Syntheseverfahren (wie Festphasen-Peptidsynthese) unter Verwendung von in der Technik bekannten Verfahren hergestellt werden, wie jenen, die von Merrifield et al., (J. Am. Chem. Soc., 85:2149 [1963]), Houghten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:5132 [1985]) und Stewart und Young (Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Co., Rockford, III. [1984]) beschrieben sind. Derartige Polypeptide können mit oder ohne ein Methionin am Amino-Terminus synthetisiert werden. Chemisch synthetisierte Polypeptide oder Fragmente können unter Verwendung von in diesen Literaturstellen angegebenen Verfahren oxidiert werden, um Disulfid-Brücken zu bilden. Es wird erwartet, dass diese synthetischen Polypeptide oder Fragmente eine biologische Aktivität aufweisen, die mit jener der Polypeptide vergleichbar ist, die rekombinant produziert oder aus natürlichen Quellen gereinigt werden, nämlich eine Fähigkeit, die V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur zu fördern, und können so austauschbar mit rekombinantem oder natürlichem Polypeptid verwendet werden.
Das Polypeptid der Erfindung kann chemisch abgeleitet oder mit einem Polymer assoziiert werden. Die modifizierten Polypeptide gemäß der Erfindung können anderen pharmakologischen Eigenschaften aufweisen als die unmodifizierten Polypeptide, wie eine erhöhte oder verringerte Halbwertszeit nach Verabreichung an ein Tier oder einen Menschen, eine unterschiedliche Pharmakokinetik ...
Die Polypeptide gemäß der Erfindung, ihre Fragmente, Varianten, und/oder Derivate können verwendet werden, um unter Verwendung von Standardmethoden Antikörper herzustellen, zum Beispiel nach Verabreichung an ein Tier wie eine Maus, eine Ratte, ein Kaninchen oder eine Ziege unter Verwendung eines geeigneten Adjuvans (insbesondere komplettes oder inkomplettes Freund-Adjuvans).
So sind Antikörper, die mit den Polypeptiden der Erfindung reagieren, sowie reaktive Fragmente derartiger Antikörper ebenfalls im Bereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Antikörper können polyklonal, monoklonal, rekombinant, chimär, einzelkettig und/oder bispezifisch sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper oder das Fragment desselben entweder menschlichen Ursprungs oder wird "humanisiert", d.h. so hergestellt, dass eine Immunreaktion gegen den Antikörper verhütet oder minimiert wird, wenn er einem Patienten verabreicht wird.
Bei dem Antikörper-Fragment kann es sich um irgendein Fragment handeln, das mit den Polypeptiden der vorliegenden Erfindung reagiert. Die Erfindung umfasst auch die Hybridome, die erzeugt werden, indem man das Polypeptid gemäß der Erfindung oder ein Fragment desselben einem ausgewählten Säuger als Antigen präsentiert, gefolgt von der Fusion von Zellen (z.B. Milzzellen) des Säugers mit gewissen Krebszellen, um durch bekannte Techniken, wie der Technik von Köhler und Milstein (1975 Nature 256, 495), immortalisierte Zelllinien zu schaffen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper sind zum Beispiel chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, Fab oder F(ab')₂-Fragmente. Sie können Immunokonjugate oder markierte Antikörper sein.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben demonstriert, dass das Artemis-Gen (auch als SNM1C bezeichnet) einen neuen V(D)J-Rekombinations- und/oder DNA-Reparatur-Faktor codiert, welcher der Metallo-β-lactamase-Überfamilie angehört und dessen Mutationen Anlass zum menschlichen RS-SCID-Zustand geben.
Deshalb ist die vorliegende Erfindung auch auf ein in-vitro-Verfahren zur Bestimmung des SCID-Typs bei einem Patienten gerichtet, das darin besteht, in dem Patienten die Nukleinsäure zu analysieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nukleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 der SEQ ID Nr. 1, wobei eine Mutation der Nukleinsäure die Klassifikation des SCID als strahlungsempfindlichen SCID ermöglicht.
Die Mutationen, die gesucht werden, umfassen Punktmutationen, die zu einer nicht-konservativen Änderung einer Aminosäure des Proteins oder zu einer Produktion eines vorzeitigen Terminationscodons führen, Deletionen, Insertionen oder Modifikationen aufgrund von Änderungen der genomischen DNA, die der SEQ ID Nr. 1 entspricht, und der Spleißdonor- und -akzeptor-Stellen, welche die Exone flankieren.
Die Erfindung ist auch auf ein in-vitro-Verfahren zur Diagnose bei einem Patienten gerichtet, einschließlich einer pränatalen Diagnose, eines Zustands, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem SCID, einer Prädisposition für Krebs, einem Immundefekt und dem Tragen einer Mutation, welche das Risiko erhöht, dass die Nachfahren eine derartige Krankheit haben, welches darin besteht, dass die Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nukleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 der SEQ ID Nr. 1, und/oder das Protein, das von der Nukleinsäure in dem Patienten codiert wird, analysiert werden, wobei eine Mutation der Nukleinsäure und/oder des Proteins ein erhöhtes Risiko anzeigt, dass dieser Zustand vorliegt.
Es ist auch eingeschlossen, dass das Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung so durchgeführt wird, dass eines der oder die zwei Allele des Patienten analysiert werden, wobei man nach jeglichen Mutationen (Punktmutationen, Deletionen, Insertionen, Mutationen, die zu unvollständigem Spleißen führen ...) Ausschau hält, welche zur Produktion eines nicht-funktionalen Proteins führen. Deshalb muss verstanden werden, dass die Analyse der Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nukleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 der SEQ ID Nr. 1, direkt oder indirekt an der genomischen DNA durchgeführt wird.
Diese Diagnoseverfahren werden bevorzugt in vitro an DNA oder RNA durchgeführt, die aus Zellen erhalten worden ist, die dem Patienten entnommen wurden.
Die Diagnoseverfahren gemäß der Erfindung können an genomischer DNA durchgeführt werden, die aus dem Patienten zum Beispiel durch Amplifikation der Exone isoliert wurde, insbesondere mit den Primerpaaren SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 32, die in den Intronen des Artemis-Gens angeordnet sind und die Amplifikation der Exone und der Exon-Intron-Verbindungsstellen ermöglichen, von denen die Erfinder gezeigt haben, dass sie in einigen RS-SCID-Patienten mutiert sind. Es ist klar, dass jeder Primer, der die Exone amplifizieren würde oder die Analyse der Exon-Intron-Verbindungsstelle ermöglichen würde, in dieser Ausführungsform des erfindungsgemäßen Diagnoseverfahrens verwendet werden kann.
Eine Weise der Durchführung eines Diagnoseverfahrens gemäß der Erfindung bestünde darin, einen PCR-SSCP durchzuführen oder das Amplifikationsprodukt zu sequenzieren, um die Mutationen im Artemis-Gen zu bestimmen.
Das ARTEMIS- (oder SNM1C-) Protein, das von der Nukleinsäure der Erfindung codiert wird, ist deshalb an der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt. Mutationen in der Nukleinsäure, die zur Expression eines nicht-funktionalen Proteins führen, führen, wenn sie bei beiden Allelen in einem Patienten vorkommen, zu einem SCID-Zustand bei dem Patienten. Es wird auch vorhergesagt, dass die Eigenschaften des ARTEMIS-Proteins auf anderen Gebieten, wie der Krebstherapie, ausgenutzt werden können, da Verbindungen, die mit dem Protein in einer Krebszelle wechselwirken, dazu beitragen können, die Zelle gegen ein Antitumormittel zu sensibilisieren, dessen Wirkung darin besteht, die DNA zu zerkleinern (Strahlung, chemische Mittel).
Die Erfindung ist deshalb auf ein Verfahren zur Identifikation einer Verbindung gerichtet, die an die Nukleinsäure oder das Protein der Erfindung binden kann, umfassend die Schritte:

a) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäure oder des Proteins mit einer Kandidaten-Verbindung und
b) Bestimmen der Bindung zwischen der Kandidaten-Verbindung und der Nukleinsäure oder dem Protein.

Die Verfahren zur Beurteilung der Bindung einer Verbindung an eine Nukleinsäure oder ein Protein sind in der Technik wohlbekannt und werden bevorzugt in vitro durchgeführt. Ein Verfahren, um ein derartiges Ziel zu erreichen, kann darin bestehen, die Nukleinsäure oder das Protein an einen festen Träger zu knüpfen, auf den die zu testende Verbindung fließen gelassen wird, und die Rückgewinnung der Verbindung nach Vorbeifließen auf dem Träger zu überprüfen. Durch Einstellung von Parametern ist es auch möglich, die Bindungsaffinität zu bestimmen. Die Verbindungen können auch durch andere Verfahren gefunden werden, einschließlich FRET, SPA ... wenn die Verbindungen und die Nukleinsäure oder das Protein markiert sind. Der Assay kann auch an Zellen durchgeführt werden, welche die Nukleinsäure der Erfindung enthalten, zum Beispiel auf einem Vektor gemäß der Erfindung, und/oder das erfindungsgemäße Protein exprimieren. Dies liefert auch die Information über die Fähigkeit der Verbindung, durch die Membran zu treten und in die Zellen einzudringen. Diese Zellen können Bakterienzellen (Suche nach antibiotischen Verbindungen, die an das β-Lactamase-Fragment des Proteins binden) oder Säugerzellen sein.
Die Erfindung ist deshalb auch auf eine Verbindung gerichtet, die durch das oben beschriebene Verfahren identifiziert wird, wobei die Verbindung an die Nukleinsäure oder das Protein der Erfindung bindet.
Besonders bevorzugte Verbindungen sind Verbindungen, die an die β-Lactamase-Region des Proteins der Erfindung (erste 180 Aminosäuren der SEQ ID Nr. 2) oder die assoziierte b-CASP-Domäne (Aminosäuren 181-385 der SEQ ID Nr. 2) binden. Derartige Verbindungen können eine chemische Formel aufweisen, die der Formel I oder IV der WO 00/63213, wobei die Formel und der entsprechende Teil der Beschreibung hierin durch Bezugnahme einverleibt wird, WO 99/33850, WO 01/02411 oder US 6,150,350 ähnlich ist, wobei die Beschreibung der Verbindungen hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Bei einer Verbindung, die durch ein Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert wird, kann es sich um eine Verbindung mit einem chemischen Gerüst (chemische Verbindung), ein Lipid, ein Kohlenhydrat (Zucker), ein Protein, ein Peptid, eine Hybrid-Verbindung, Protein-Lipid, Protein-Kohlenhydrat, Peptid-Lipid, Peptid-Kohlenhydrat, ein Protein oder ein Peptid, auf das verschiedene Substitutenten gepfropft worden sind, handeln.
Die vorhergesehenen chemischen Verbindungen (mit einem chemischen Gerüst) können ein oder mehrere (bis zu 3 oder 4) Cyclen, insbesondere aromatische Cyclen, insbesondere mit 3 bis 8 Kohlenstoffatomen enthalten und alle Arten von Substituentengruppen (insbesondere Niederalkyl, d.h. mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Ketogruppen, Alkoholgruppen, Halogengruppen ...) aufweisen. Der Fachmann weiß, wie verschiedene Varianten einer Verbindung ausgehend von einem gegebenen Gerüst durch Pfropfen dieser Reste auf das Gerüst herzustellen sind.
Das Verfahren der Erfindung ermöglicht auch das Durchmustern, den Nachweis und/oder die Identifikation von Verbindungen, welche die biologische Aktivität des ARTEMIS-Proteins inhibieren können. In der Tat ist es möglich, die Verbindungen, die an die Nukleinsäure oder das Protein binden und durch das Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert worden sind, in einem Assay, wie einem Komplementierungsassay zu testen, wobei ein Vektor, der die SEQ ID Nr. 1 oder die Nukleotide 39-2114 der SEQ ID Nr. 1 trägt und ein funktionales Protein exprimiert, in eine Zelle eingeführt wird, die einem Patienten entnommen wurde, der an RS-SCID leidet, und die Verbindung auf ihre Fähigkeit getestet wird, die Wiederherstellung der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur in den Zellen zu hemmen. Die Beispiele erläutern einen derartigen Assay, der vorzugsweise in vitro durchgeführt wird.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht so den Nachweis, die Identifikation und/oder die Durchmusterung von Verbindungen, die für die Behandlung von Krankheiten nützlich sein können, an denen die V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist. Jedoch müssen die Verbindungen, die durch das Verfahren gemäß der Erfindung identifiziert wurden, möglicherweise optimiert werden, um in einer therapeutischen Behandlung verwendet zu werden, damit sie eine überlegene Aktivität und/oder eine geringere Toxizität aufweisen.
In der Tat wird die Entwicklung von neuen Arzneistoffen häufig auf der folgenden Grundlage durchgeführt:

– Durchmustern von Verbindungen mit der gesuchten Aktivität bei einem relevanten Modell durch ein geeignetes Verfahren,
– Auswahl der Verbindungen, welche die erforderlichen Eigenschaften (hier Modulation von V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur) aufweisen, aus dem ersten Durchmusterungstest,
– Bestimmung der Struktur (insbesondere der Sequenz (wenn möglich der tertiären Sequenz), wenn sie Peptide, Proteine oder Nukleinsäuren sind, der Formel und des Gerüsts, wenn sie chemische Verbindungen sind) der ausgewählten Verbindungen,
– Optimieren der ausgewählten Verbindungen durch Modifikation der Struktur (zum Beispiel durch Änderung der stereochemischen Konformation (zum Beispiel Überführen der Aminosäuren in einem Peptid von L in D), Addition von Substituenten am Peptid- oder chemischen Gerüst, insbesondere durch Pfropfen von Gruppen oder Resten auf das Gerüst, Modifikation der Peptide (siehe insbesondere Gante "Peptidomimetics", in Angewandte Chemie – International Edition Engl. 1994, 33, 1699-1720),
– Durchlaufen und Durchmustern der "optimierten" Verbindungen bei geeigneten Modellen, die häufig Modelle näher an der untersuchten Krankheit sind. In diesem Stadium würde man häufig Tiermodelle verwenden, insbesondere Nager (Ratten oder Mäuse) oder Hunde oder nicht-menschliche Primaten, die gute Modelle für SCID oder Krebse sind, und nach den phänotypischen Änderungen in den Modellen nach Verabreichung der Verbindung Ausschau halten.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verbindungen, die nach Befolgen der Schritte oder äquivalenten Schritte, wie beschrieben, optimiert worden sind.
Die vorliegende Erfindung ist auch auf irgendein Mitglied aus der Nukleinsäure, dem Vektor, der Wirtszelle, dem Protein, dem Antikörper und der Verbindung der Erfindung als Medikament gerichtet. Diese Einheiten können in der Tat allein für die Behandlung von verschiedenen Arten von Krankheiten, insbesondere jenen, in denen die V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur eine Rolle spielt, verwendet werden, wobei die Krankheiten ohne Beschränkung RS-SCID, Immundefekt, Krebs einschließen. Diese Einheiten können auch in Kombination mit einer weiteren Behandlung verwendet werden, welche für die Krankheit geeignet ist, wobei die Verwendung simultan, getrennt oder aufeinanderfolgend ist.
Insbesondere können die Produkte gemäß der Erfindung in Kombination mit Zytokinen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, entzündungshemmenden Mitteln und/oder chemotherapeutischen Mitteln verwendet werden, wie es für die behandelte Indikation geeignet ist.
Die Erfindung ist auch auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff, Träger oder ein pharmazeutisch annehmbares Verdünnungsmittel zusammen mit mindestens einem Mitglied aus der Nukleinsäure, dem Vektor, der Wirtszelle, dem Protein, dem Antikörper und der Verbindung der Erfindung umfasst.
Der Fachmann kennt die geeigneten Hilfsstoffe und Träger, die verwendet werden können, und man kann zum Beispiel Wasser zur Injektion, bevorzugt mit anderen Materialien ergänzt, die in Lösungen für die Verabreichung an Säuger üblich sind, oder neutrale gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung gemischt mit Serumalbumin anführen. Einige Träger können in Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. Auflage, A.R. Gennaro, Hsg., Mack Publishing Company [1990] gefunden werden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung kann oral, nasal, über die Schleimhaut verabreicht oder insbesondere intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziert werden. Der Träger und/oder Hilfsstoff wird abhängig vom Verabreichungsweg geeignet gewählt. Das bereits zitierte US-Patent 6,165,753 gibt Beispiele für geeignete Verabreichungswege und Hilfsstoffe an (Spalte 17, Zeile 31 bis Spalte 21, Zeile 55, wobei die allgemeine Information hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird).
Die Erfindung ist auch auf die Verwendung mindestens eines Mitglieds aus der Nukleinsäure, dem Vektor, der Wirtszelle, dem Protein, dem Antikörper, der Verbindung und der pharmazeutischen Zusammensetzung der Erfindung für die Herstellung eines Medikaments gerichtet, das für die Behandlung einer Krankheit vorgesehen ist, bei der die V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur eine Rolle spielt, wobei die Krankheit insbesondere aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Krebs, SCID, insbesondere RS-SCID, Immundefekt, zum Beispiel aufgrund von Problemen im Schalter der schweren Ketten der Immunglobuline oder aufgrund von Problemen im Prozess der somatischen Hypermutation der Immunglobuline, ausgewählt ist.
Die US 6,165,753 beschreibt auch Verfahren der Gentherapie, und diese Lehre wird durch Bezugnahme aufgenommen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Nukleinsäure der Person so verabreicht, dass sie in Stammzellen eintritt, d.h. die Zellen, welche die Erzeuger der Zellen des Immunsystems sind. Dies kann in vivo oder ex vivo nach Entnahme der Zellen des Patienten, Selektieren der Stammzellen, Einführen der Nukleinsäure in die selektierten Zellen und Reinjektion der transformierten Zellen in den Patienten durchgeführt werden.
Für die Penetration der Nukleinsäure in die Zellen können verschiedene Mittel vom Fachmann verwendet werden. Insbesondere ist es möglich, die Nukleinsäure mittels eines viralen Vektors in die Zellen einzuführen.
Dieses Virus kann menschlichen oder nicht-menschlichen Ursprungs sein, solange es die Fähigkeit besitzt, die Zellen des Patienten zu infizieren. Insbesondere ist das Virus ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Adenoviren, Retroviren (Oncoviren wie RSV, Spumaviren, Lentiviren), Poxviren, Herpesviren (HSV, EBV, CMV ...), Iridovirus, Hepadnavirus (Hepatitis B-Virus), Papoviren (SV40, Papillomavirus), Parvoviren (Adeno-assoziiertes Virus...), Reoviren (Reovirus, Rotavirus), Togaviren (Arbovirus, Alphavirus, Flavivirus, Rubivirus, Pestivirus), Coronaviren, Paramyxoviren, Orthomyxoviren, Rhabdoviren (Tollwutvirus), Bunyaviren, Arenaviren, Picornaviren (Enterovirus, Coxsackievirus, Echovirus, Rhinovirus, Aphtovirus, Cardiovirus, Hepatitis A-Virus ...), modifiziertem Virus Ankara und abgeleiteten Viren derselben.
Mit abgeleiteten Viren ist gemeint, dass das Virus Modifikationen besitzt, welches es an den Menschen anpasst (falls es ein Virus nicht-menschlichen Ursprungs ist, das menschliche Zellen ohne die Modifikationen nicht infizieren könnte) und/oder seine potentielle oder tatsächliche Pathogenität verringern. Insbesondere ist es am besten, wenn das Virus, das für die Genübertragung verwendet wird, im menschlichen Körper replikationsdefizient ist. Dies ist ein wichtiger Sicherheitsgesichtspunkt, da die Kontrolle der Expression des funktionalen Gens für die Implementierung des Verfahrens der Erfindung von Bedeutung sein kann. Man wünscht auch nicht, dass eine Dissemination des viralen Vektors welcher das Gen mit therapeutischem Interesse trägt, zu anderen Zellen oder zu anderen Menschen stattfindet.
Dies ist der Grund, warum der virale Vektor, der im Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, vorzugsweise replikationsdefizient ist und deshalb mit Hilfe eines Hilfsvirus oder in einer komplementären Zelllinie hergestellt würde, welche das genetische Material, das für die Herstellung eines ausreichenden Virustiters benötigt wird, in trans bringen würde.
Derartige defekte Viren und geeignete Zelllinien sind in der Technik zum Beispiel im US-Patent 6,133,028 beschrieben, welches defekte Adeno-assoziierte Viren (AAV) und die dazugehörigen Komplementationszelllinien beschreibt und dessen Inhalt hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. Andere geeignete Viren werden zum Beispiel in der WO 00/34497 beschrieben. Bei Adenoviren oder AAV kann es interessant sein, die E1- und/oder E4-Region zu deletieren.
Bei dem nachstehend beschriebenen MFG-Virus kann man die Komplementations-Ψ-CRIP-Zelllinie verwenden, die in Hacein-Bey et al. (1996, Blood 87, 3108-16), hierin durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben wurde. Andere geeignete Zelllinien können ebenfalls verwendet werden.
Um die langanhaltende Wirkung der Korrektur zu verbessern, würde man ein Virus bevorzugen, welches die Integration des funktionalen Gens in ein Chromosom der infizierten Zellen ermöglicht.
Insbesondere würde man Adenoviren, von denen einige, die replikationsdefizient sind, dem Fachmann wohlbekannt sind, oder Retroviren wählen, insbesondere von Mäusen abstammende Retroviren. Unter den Retroviren, die verwendet werden können, würde man einen Vektor auf der Basis des myeloproliferativen Sarcomavirus (MPSV) bevorzugen, wie in Bunting et al. (1998, Nature Medicine, 4, 58-64, dessen Inhalt hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird) beschrieben. Ein weiteres gut geeignetes Retrovirus, das für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden kann, ist der MFG-Vektor, der vom MLV-Virus (Moloney-Retrovirus) abgeleitet ist und in Hacein-Bey et al. (1996, Blood 87, 3108-16) oder Cavazzana-Calvo et al. (2000, Science, 288, 669-72) beschrieben wird, wobei der Inhalt dieser beiden Dokumente hierin durch Bezugnahme aufgenommen wird.
Die Wahl des für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung zu verwendenden Virus ist eine Funktion der Merkmale des Virus und der Komplementationszelllinie. Es ist klar, dass verschiedene Viren verschiedene Eigenschaften aufweisen (insbesondere LTR in Retroviren) und dass die oben angeführten Viren und Zelllinien nur Beispiele für Mittel sind, die für die Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendet werden können, und dass sie nicht als beschränkend angesehen werden sollen. Der Fachmann weiß, wie die beste Kombination Gen-Virus-Zelllinie und/oder Hilfsvirus für jede gegebene Situation zu wählen ist.
In einer weiteren Ausführungsform wird die Nukleinsäure mittels eines synthetischen Vektors in die Zelle eingeführt, welcher ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus einem kationischen Amphiphil, einem kationischen Lipid, einem kationischen oder neutralen Polymer, einer protischen polaren Verbindung wie Propylenglycol, Polyethylenglycol, Glycerol, Ethanol, 1-Methyl-L-2-pyrrolidon oder deren Derivaten und einer aproptischen polaren Verbindung wie Dimethylsulfoxid (DMSO), Diethylsulfoxid, Di-n-propylsulfoxid, Dimethylsulfon, Sulfolan, Dimethylformamid, Dimethylacetamid, Tetramethylharnstoff, Acetonitril oder deren Derivaten. Der Fachmann in der Art kennt synthetische Vektoren, die verwendet werden können und ein hohes Transfektionsmaß ermöglichen, wie die Reagenzien Lifofectine und Lipofectamine, die von Life Technologies (Bethesda, MD) erhältlich sind.
Es wird vorhergesehen, dass die Expression des funktionalen Artemis-Gens in den Zellen des SCID-Patienten einen selektiven Vorteil für die Zellen oder Nachkommenschaft der Zellen im Vergleich zu nicht-transformierten Zellen oder Nachkommen der nicht-transformierten Zellen bringt und zu einer Verbesserung des Zustands des Patienten führt.
Unter selektivem Vorteil wird verstanden, dass der Anteil der Zellen, die durch Einführen des funktionalen Gens korrigiert worden sind, im Vergleich zu den Zellen des gleichen Typs, in dem das Gen nicht funktional ist, zunehmen wird und dass dies zu einer Milderung der Krankheit oder selbst einer Heilung führen würde.
Die Möglichkeit, einen derartigen selektiven Vorteil zu erhalten, ist für ein anderes Gen von Cavazzana-Calvo et al. (2000, Science, 288, 669-72) demonstriert worden.
Die Verwendung der Erfindung wird am besten durchgeführt, wenn die Zellen, in die das funktionale Artemis-Gen eingeführt wird, Stammzellen oder undifferenzierte Zellen sind, die Vorläuferzellen der Zellen sind, denen die Expression des funktionalen Artemis-Gens fehlt. Dies würde zu der Tatsache führen, dass eine große Zahl von Zellen im Laufe der Zeit korrigiert wird, da die Nachkommen der Stammzellen ebenfalls korrigiert würden. Weiter gibt es, da die Stammzellen im Laufe der Zeit zu einer großen Zahl von Zellen differenzieren würden, nur die Notwendigkeit, eine kleine anfängliche Zahl von Zellen zu transfizieren.
Es ist möglich, einige der Stammzellen für das hämatopoetische System zu identifizieren, da sie an ihrer Oberfläche den Marker CD34 beherbergen (CD34+-Zellen). Ihr Ansteuern kann in vivo oder ex vivo durchgeführt werden (Sortieren dieser Zellen, Transfektion und Reinfusion durch intravenöse Injektion). Der Fachmann weiß, dass Stammzellen aus Nabelschnurblut isoliert werden können.
Es kann interessant sein, den Zellzyklus der Stammzellen zu induzieren, um die Effizienz der Transfektion zu erhöhen. Die ist insbesondere der Fall, wenn das Verfahren der Erfindung an Zellen ex vivo durchgeführt wird.
In der Tat sind einige der Vektoren, die für die Einführung des interessierenden Gens in die Zellen verwendet werden können, Vektoren, die nur nicht-ruhenden Zellen einverleibt werden können. Damit die Zellen replizieren, verwendet man bevorzugt Wachstumsfaktoren und/oder Zytokine, wie CSF (GM-CSF, M-CSF, G-CSF), Interleukine (bevorzugt IL-1, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 15), Interferone (insbesondere α oder γ). Man könnte auch Stammzellenfaktor, Megakaryozyten-Differenzierungsfaktor, gegebenenfalls gekuppelt mit Polyethylenglycol oder Flt-3-L, verwenden. Diese Faktoren können allein oder in Kombination verwendet werden.
Wenn die Verwendung der Erfindung ex vivo durchgeführt wird, können die Stammzellen auch in einem Medium aufrechterhalten werden, das mit anderen Nährstoffen, wie Serum (fetales Rinderserum, wie gewöhnlich, oder bevorzugt fetales Zellserum) ergänzt ist. Es kann auch interessant sein, die zu transfizierenden Zellen in Platten aufrechtzuhalten, die Zelladhäsionselemente wie Zelladhäsionsproteine (insbesondere Fibronectin oder Vitronectin) oder die Peptide enthalten, von denen gezeigt wurde, dass sie die Zelladhäsion fördern. Es ist klar, dass die Wahl des Kulturmediums durch die Art von Zellen und das angestrebte Ziel beeinflusst wird.
In der erfindungsgemäßen Verwendung werden die Nukleinsäure, der Vektor, die Wirtszelle, das Protein, der Antikörper, die Verbindung und die pharmazeutische Zusammensetzung der Erfindung vorzugsweise zusammen mit einem genotoxischen Mittel verabreicht, wobei die Verwendung simultan, getrennt oder aufeinanderfolgend ist.
Die Erfindung betrifft auch ein transgenes nicht-menschliches Säugetier, in dessen Genom die Nukleinsäuresequenz der Erfindung integriert ist, insbesondere eine Nukleinsäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nukleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 der SEQ ID Nr. 1 und operativ mit Regulationselementen verknüpft ist, wobei die Expression der codierenden Sequenz die Menge des ARTEMIS-Proteins und/oder das Maß der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des Säugetiers im Vergleich zu einem nicht-transgenen Säugetier derselben Spezies erhöht.
Es wird bevorzugt, dass die Nukleinsäuresequenz, die in das Genom des nicht-menschlichen transgenen Tiers integriert ist, ein Polypeptid codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Polypeptiden, welche die Aminosäuren 1-692, 1-385 oder 8-385 der SEQ ID Nr. 2 umfassen. Es wird auch bevorzugt, dass die Nukleinsäuresequenz, die in das Genom des nicht-menschlichen transgenen Tiers integriert ist, ein Polypeptid codiert, das aus der Gruppe von Polypeptiden ausgewählt ist, die aus den Aminosäuren 1-692, 1-385 oder 8-385 der SEQ ID Nr. 2 besteht.
Es ist auch vorgesehen, dass die Regulationselemente (Promotoren, Enhancer, Introne, ähnlich jenen, die in Säuger-Expressionsvektoren verwendet werden können) gewebespezifisch sein können, was die Überexpression des ARTEMIS-Proteins nur in einer spezifischen Art von Zellen ermöglicht. Insbesondere kennt der Fachmann die verschiedenen Promotoren, die für diesen Zweck verwendet werden können.
Die Insertion des Konstrukts in das Genom des nicht-menschlichen transgenen Tiers der Erfindung kann mittels Verfahren durchgeführt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind, und kann entweder statistisch oder gezielt sein. Mit wenigen Worten gesagt, konstruiert der Fachmann einen Vektor, der die Sequenz zur Inserierung in das Genom und einen Selektionsmarker (zum Beispiel das Gen, welches das Protein codiert, das Resistenz gegen Neomycin verleiht) enthält, und kann veranlassen, dass er in die embryonalen Stammzellen (ES) eines Tiers eintritt. Die Zellen werden dann mit dem Selektionsmarker selektiert und einem Embryo einverleibt, zum Beispiel durch Mikroinjektion in einen Blastozysten, der erhalten werden kann, indem man den Uterus von trächtigen Weibchen perfundiert. Die Reimplantation des Embryos und die Wahl der transformierten Tiere, gefolgt von der potentiellen Rückkreuzung, ermöglichen es, derartige nicht-menschliche transgene Tiere zu erhalten. Um ein "reineres" Tier zu erhalten, kann das Selektionsmarkergen unter Verwendung einer stellenspezifischen Rekombinase ausgeschnitten werden, wenn es von den korrekten Sequenzen flankiert ist.
Die Erfindung betrifft auch ein transgenes nicht-menschliche Säugetier, dessen Genom eine Zerstörung des endogenen Artemis-Gens, das durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, umfasst, wobei die Zerstörung die Insertion einer selektierbaren Markersequenz umfasst und wobei die Zerstörung ein nicht-menschliches Säugetier zum Ergebnis hat, das im Vergleich zu einem nicht-menschlichen Wildtyp-Säugetier einen Defekt in der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur zeigt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zerstörung eine homozygote Zerstörung.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat die homozygote Zerstörung eine Null-Mutation des endogenen Gens zur Folge, welches ARTEMIS codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Säugetier ein Nager, in der bevorzugtesten Ausführungsform ist das Säugetier eine Maus.
Die Erfindung umfasst auch eine isolierte Nukleinsäure, die ein Artemis-Knockout-Konstrukt umfasst, das eine selektierbare Markersequenz umfasst, die von DNA-Sequenzen flankiert ist, die homolog zum endogenen Artemis-Gen sind, dessen cDNA durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei, wenn das Konstrukt in einen nicht-menschlichen Säuger oder einen Ahnen des nicht-menschlichen Säugers im embryonalen Zustand eingeführt wird, die selektierbare Markersequenz das endogene Artemis-Gen in dem Genom des nicht-menschlichen Säugetiers zerstört, so dass das nicht-menschliche Säugetier im Vergleich zu einem nicht-menschlichen Wildtyp-Säugetier einen Defekt in der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur zeigt.
Dieses Konstrukt wird verwendet, um Tiere zu erhalten, welche die zerstörte Kopie des Artemis-Gens haben, und ist im Allgemeinen auf einem Vektor getragen, der ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung ist.
Die Erfindung betrifft auch eine Säuger-Wirtszelle, deren Genom eine Zerstörung des endogenen Artemis-Gens umfasst, wobei die Zerstörung die Insertion einer selektierbaren Markersequenz umfasst. Bevorzugt ist die Zerstörung homozygot und führt zu einer Nicht-Expression eines funktionalen ARTEMIS-Proteins (oder Expression eines nicht-funktionalen Proteins).
Es sollte bemerkt werden, dass die Zerstörung durch in der Technik bekannte Verfahren erhalten werden kann und bedingt sein kann, d.h. nur in spezifischen Arten von Zellen vorliegt oder in einigen Momenten der Entwicklung induziert wird. Das Verfahren, um ein solches Ziel zu erreichen, kann die Verwendung von stellenspezifischen Rekombinasen wie Cre (die lox-Stellen erkennt) oder FLP (die RFT-Stellen erkennt)-Rekombinasen unter der Kontrolle eines zellspezifischen Promotors sein. Es wurde gezeigt, dass diese Rekombinasen (insbesondere Cre) für Modifikationen geeignet sind, und ihre Aktivität kann durch Injektion eines Substrats (wie eines Hormons) induziert werden. Diese Modifikationen sind in der Technik bekannt und können zum Beispiel in Shibata et al. (1997, Science 278, 120-3) gefunden werden.
Deshalb kann das nicht-menschliche transgene Tier oder die Zelle der Erfindung eventuell den selektierbaren Marker nicht mehr zeigen, der bei der Einwirkung der Rekombinasen entfernt worden sein kann, welche zur Zerstörung des Gens führen. Jedoch ist im Verfahren des Erhalts einer solchen Zerstörung ein selektierbarer Marker in das Artemis-Gen hauptsächlich inseriert worden, um die Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen.
Die US 6,087,555 beschreibt eine Weise zum Erhalt einer Knock-out-Maus und die allgemeine Lehre dieses Patents wird hierin durch Bezugnahme einverleibt (Spalte 5, Zeile 54 bis Spalte 10, Zeile 30). In diesem Patent wird eine OPG-Knock-out-Maus beschrieben, das gleiche Verfahren gilt für eine Artemis-Knock-out-Maus. Der Fachmann findet auch in Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1986) Information.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung ein nicht-menschliches transgenes Säugetier, dessen Genom eine erste Zerstörung, welche die des endogenen Artemis-Gens ist, und eine zweite Zerstörung umfasst, welche die des endogenen p53-Gens ist. In der bevorzugten Ausführungsform ist mindestens die erste Zerstörung oder die zweite Zerstörung eine homozygote Zerstörung. In der bevorzugtesten Ausführungsform sind sowohl die erste Zerstörung als auch die zweite Zerstörung beide homozygote Zerstörungen, was insbesondere eine Null-Inaktivierung sowohl des Artemis- als auch des p53-Gens zur Folge hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das transgene Säugetier ein Nager, insbesondere eine Ratte oder eine Maus.
Das nicht-menschliche transgene Säugetier kann als Modell zur Untersuchung von Pro-B-Zell-Lymphomen verwendet werden. In der Tat betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung eines Modells zur Untersuchung von Pro-B-Zell-Lymphomen, welches umfasst, dass man das transgene Säugetier für eine Person bereitstellt, die ein solches Modell zur Untersuchung von Pro-B-Zell-Lymphomen benötigt, und ein Verfahren zur Untersuchung von Pro-B-Zell-Lymphomen, welches das Studium des transgenen Säugetiers umfasst.
Die nicht-menschlichen transgenen Tiere und die "Knock-out"-Zellen der Erfindung können auch zur Identifikation von pharmakologisch interessanten Verbindungen verwendet werden. Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen, welche die V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur modulieren, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit dem nicht-menschlichen Säugetier oder der Knock-out-Wirtszelle der Erfindung und Bestimmen der Zunahme oder Abnahme der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur in dem nicht-menschlichen Säugetier oder der Wirtszelle im Vergleich zur V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des nicht-menschlichen Säugetiers oder der Wirtszelle vor der Verabreichung der Verbindung.
Ein Verfahren zum Testen der Genotoxizität von Verbindungen, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit dem nicht-menschlichen Säugetier oder einer Wirtszelle der Erfindung und das Bestimmen der Zunahme oder Abnahme der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur in dem nicht-menschlichen Säugetier oder der Wirtszelle im Vergleich zur V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des nicht-menschlichen Säugetiers oder der Wirtszelle vor der Verabreichung der Verbindung, ist ebenfalls ein Gegenstand der Erfindung.
Funktion von Artemis
Obwohl aus dem Phänotyp von RS-SCID-Patienten geschlossen werden kann, dass Artemis ein Teil der ubiquitären Maschinerie ist, die an der DNA-DSB (Doppelstrangbruch)-Reparatur, an der auch der V(D)J-Rekombinationsprozess beteiligt ist, beteiligt ist, muss die genaue Funktion für diesen neuen Faktor noch ermittelt werden.
Die wiederholte Suche nach einem globalen Homolog von Artemis in anderen Spezies in Protein-Datenbanken hat bislang keinen vielversprechenden Kandidaten ergeben. Die einzige Ähnlichkeit besteht ausgehend von dem Peptid 0083, welches den gesamten N-terminalen Abschnitt von Artemis umfasst, zu den verschiedenen Mitgliedern der SNM1-Familie.
Artemis ist jedoch aus mindestens zwei Gründen eindeutig nicht das humane Ortholog von entweder SNM1 aus der Maus oder PSO2 aus der Hefe:

– Erstens unterscheiden sich die drei Proteine trotz ihrer SNM1-Ähnlichkeitsregionen in den mit diesen assoziierten Domänen. Insbesondere sind die 331 Aminosäuren, die die C-terminate Region von Artemis bilden, in SNM1/PSO2 nicht vorhanden und zeigen keinerlei offensichtliche Ähnlichkeiten zu irgendeinem anderen bekannten Protein.
– Zweitens zeigen, obwohl murine und aus Hefe stammende SNM1/PSO2-Mutanten einen starken Defekt bei der Reparatur von durch DNA-Strangvernetzungsmittel verursachten DNA-Schädigungen zeigen (Henriques und Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000), diese keine erhöhte Empfindlichkeit gegen ionisierende Strahlungen, was anzeigt, dass diese beiden Proteine wahrscheinlich nicht direkt an der Reparatur von DNA-DSB (Doppelstrangbrüchen) beteiligt sind.

Dies steht in scharfem Kontrast zu dem Phänotyp von RS-SCID-Patienten, deren primärer molekularer Defekt tatsächlich das Fehlen von DNA-DSB-Reparatur ist, wie durch das Fehlen der Bildung von codierenden Verknüpfungen („coding joints") im Verlauf der V(D)J-Rekombination und die erhöhte Empfindlichkeit von Knochenmarks- und Fibroblastenzellen gegenüber γ-Strahlen veranschaulicht wird (Cavazzana-Calvo et al., 1993; Nicolas et al., 1998).
Interessanterweise weisen Artemis, SNM1 aus der Maus und PSO2 aus Hefe gemeinsam eine Domäne auf, die eine Metallo-β-lactamase-Faltung ausbildet (Aravind, 1997) und wahrscheinlich mit enzymatischer Aktivität assoziiert ist, angesichts des Vorhandenseins von nahezu allen kritischen katalytischen Resten (oder von konservierten Resten, die diese für eine Funktion ersetzen könnten). Es gibt jedoch keinen offensichtlichen Konsens in Hinblick auf die Natur der verschiedenen Metallo-β-lactamase-Substrate, außerhalb von einer allgemeinen negativ geladenen Zusammensetzung. Eine Sequenzanalyse enthüllte die Existenz einer konservierten Region, die die Metallo-β-lactamase-Domäne in Mitgliedern der Artemis/SNM1/PSO2-Unterfamilie begleitet (Daten nicht gezeigt), einschließlich verschiedener anderer Sequenzen, die mit dem Nukleinsäurestoffwechsel in Zusammenhang stehen, wie zwei Untereinheiten des „cleavage and polyadenylation specificity factor" (CPSF; Spaltungs- und Polyadenylierungsspezifitätsfaktor).
Es wird vorgeschlagen, diese Domäne, die detailliert anderswo beschrieben wird, βCASP für Metallo-β-lactamase-assoziierte CPSF Artemis SNM1/PSO2-Domäne zu nennen. Obwohl sie hochgradig divergent ist und eine Mehrzahl von Insertionen (z.B. innerhalb von PSO2 aus Hefe) toleriert, beherbergt diese Domäne mehrere konservierte Reste, wie das H319 in Artemis, die eine Rolle bei der durch Mitglieder dieser Unterfamilie katalysierten Reaktion spielen könnten.
Es ist verlockend, zu spekulieren, dass diese Domäne zur Substratbindung in einer ähnlichen Weise wie die α-helikale Domäne von Glyoxalase, eines anderen Mitgliedes der β-Lactamase-Familie (Cameron et al., 1999), beitragen könnte.
Artemis in dem NHEJ-Stoffwechselweg der DNA-Reparatur
DNA-DSB können entweder durch homologe Rekombination (HR) oder durch den „non-homologous end-joining pathway" (NHEJ; nicht-homologe Endverknüpfungs-Stoffwechselweg) (zusammenfassende Übersicht in (Haber, 2000)) repariert werden. Obwohl in Hefe HR der vorherrschende Reparaturweg ist, wird bei höheren Eukaryoten zumeist NHEJ eingesetzt und dieser repräsentiert den DNA-Reparatur-Stoffwechselweg, dem während einer V(D)J-Rekombination gefolgt wird.
Es wird angenommen, dass wenigstens drei Proteinkomplexe gemeinsam oder nacheinander an dem Ort des RAG1/2-abgeleiteten DSB wirksam werden. Der Ku70-80-Komplex wird wahrscheinlich als erstes zu der Läsionsstelle rekrutiert, gefolgt von der Hinzufügung der DNA-PKcs-Untereinheit. Dieser anfängliche Komplex wird als der primäre DNA-Schädigungssensor, der die DNA-Reparaturmaschinerie aktivieren wird, angesehen. Die XRCC4/DNA-Ligase IV repräsentiert den besten Kandidaten, um die Lücke tatsächlich zu reparieren. Vor kurzem wurde der RAD50/MRE11/NBS1-Komplex, der bekanntermaßen an dem NHEJ teilnimmt (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998), an der Stelle der sich umlagernden TCR-Gene gefunden, was für seine mögliche Beteiligung an der DNA-Reparaturphase der V(D)J-Rekombination spricht (Chen et al., 2000).
Man würde selbstverständlich gerne wissen, wie Artemis seine Rolle in dieser Kaskade spielt. An dieser Stelle können nur spekulative Antworten basierend auf der Analogie von Phänotypen zwischen den verschiedenen defizienten Modellen, einschließlich RS-SCID, gegeben werden. Es ist äußerst unwahrscheinlich, dass Artemis mit dem RAD50/MRE11/NBS1-Komplex verknüpft wird. Tatsächlich führen sowohl bei Patienten mit Nijmegen- als auch Ataxie-Teleangiektasie-Syndrom (ATLD) Mutationen in dem NBS1- und MRE11-Gen zu einer chromosomalen Instabilität, begleitet von einer durch einen tiefgreifenden Defekt bei der DNA-Schädigung induzierten G1-Arretierung des Zellzyklus (G0/G1-Checkpoint), während die V(D)J-Reparatur verschont wird (Carney et al., 1998; Varon et al., 1998). Dies steht in scharfem Kontrast zu der normalen G1- Arretierung bei RS-SCID-Fibroblasten in Folge einer Bestrahlung (unveröffentlichte Ergebnisse).
Bezüglich des XRCC4/DNA-Ligase IV-Komplexes gibt es zwei hauptsächliche Unterschiede zwischen den Mäusen mit RS-SCID-Zustand und den XRCC4- und DNA-Ligase IV-Knock-out-Mäusen:

– Erstens führt ein vollständiges Null-Allel von Artemis (wie in P6, P15 und P40) nicht zu embryonaler Letalität bei Menschen. Diese Beobachtung unterstützt eine Beteilung von Artemis in dieser Phase von NHEJ nicht.
– Zweitens ist die Neuverknüpfung von linearisierten DNA-Konstrukten, die in RS-SCID-Fibroblasten eingeführt werden, normal (unveröffentlichte Ergebnisse), während dieser Assay, wenn ein Defekt vorliegt, hochgradig diagnostisch für abnormale NHEJ in Hefe ist (Teo und Jackson, 1997; Wilson et al., 1997).

Die vielleicht offensichtlichste Verknüpfung zwischen Artemis und NHEJ wird in Hinblick auf den Ku/DNA-PK-Komplex gefunden. Tatsächlich sind humane RS-SCID-Patienten und scid-Mäuse, die eine Mutation in dem DNA-PKcs codierenden Gen aufweisen, die einzigen zwei bekannten Zustände, wo ein mit der V(D)J-Rekombination assoziierter DNA-Reparaturdefekt allein die Bildung der codierenden Verknüpfungen („coding joints") beeinflusst.
Die Signalverknüpfungs („signal joint")-Bildung ist in dem Kontext einer defekten V(D)J-Rekombination in allen anderen analysierten Szenarien ebenfalls beeinträchtigt.
Darüber hinaus scheinen die Manifestationen des DNA-Reparaturdefekts sowohl bei humanen RS-SCID-Patienten als auch scid-Mäusen recht stark auf das Immunsystem beschränkt zu sein und scheinen beispielsweise zu keinen neurologischen Störungen oder zur Entwicklung von Krebs, zwei Manifestationen, die oftmals mit Defekten bei den anderen Mitspielern der NHEJ assoziiert sind (Roth und Gellert, 2000), zu führen.
Als Schlussfolgerung beschreibt die Erfindung die Identifizierung und Klonierung des Artemis, einen neuen Faktor der V(D)J-Rekombination, codierenden Gens. Mutationen von Artemis bewirken T-B-SCID-Defekte bei Menschen aufgrund eines Fehlens von Reparatur der RAG1/2-vermittelten DNA-Doppelstrangbrüche. Artemis gehört zu einer großen Familie von Molekülen, die als Teil ihrer mutmaßlichen katalytischen Stelle eine Metallo-β-lactamase-Faltung ausbilden. Ein Zweig dieser Familie, der auch SNM1 aus Hefe und PSO2 aus der Maus umfasst, weist angefügt eine andere Domäne, welche als βCASP bezeichnet wird, auf, die die Aktivität dieser Untergruppe von Proteinen zu Nukleinsäuren dirigieren könnte, und dient dementsprechend dem Zweck der DNA-Reparatur.
Schließlich sind wahrscheinlich andere Domänen, die noch ermittelt werden müssen, für das Dirigieren der verschiedenen Artemis/SNM1/PSO2-Proteine zu ihren spezifischen DNA-Reparatur-Stoffwechselwegen, der DSB-Reparatur für Artemis oder der DNA-ICL-Reparatur für SNM1/PSO2, verantwortlich.
Die folgenden Beispiele sind nur für Veranschaulichungszwecke bestimmt und sollten nicht so aufgefasst werden, dass sie den Umfang der Erfindung in irgend einer Weise beschränken.
BEISPIELE
Beispiel 1: Klonierung der Artemis-cDNA
Patienten und Zellen
Es wurden im Rahmen dieser Untersuchung 13 RS-SCID-Patienten aus 11 Familien, die aufgrund ihres typischen Phänotyps von autosomaler rezessiver SCID bei vollständigem Fehlen von peripheren T- und B-Lymphozyten, aber Vorhandensein von natürlichen Killerzellen (Fischer et al., 1997) ausgewählt worden sind, analysiert. Alle Patienten zeigten einen beeinträchtigten V(D)J-Rekombinationsassay in Fibroblasten und für alle RS-SCID-Familien mit Ausnahme von P16, P40 und P47 konnte der Strahlungsempfindlichkeitsstatus an Knochenmarkszellen und/oder Fibroblasten bestimmt werden ((Cavazzana-Calvo et al., 1993; Nicolas et al., 1998; Moshous et al., 2000) und unsere unveröffentlichten Ergebnisse). Die Genotypisierung der blutsverwandten Familien unter Verwendung von polymorphen Mikrosatellitenmarkern, wie anderswo berichtet (Moshous et al., 2000) stimmte in jedem Falle mit unserer zuvor beschriebenen Lokalisierung von RS-SCID auf dem Chromosom 10p überein. Die Untersuchung basierte auf vier Patienten französischer Herkunft (P1, P3, P6 und P15) und einer davon (P15) stammte von verwandten Eltern, einer war von italienischer Herkunft (P16), einem Griechen (P4) und einem Afrikaner (P2). Die verbleibenden Patienten entstammen vier blutsverwandten türkischen Familien, wobei zwei von diesen verwandt sind (P38, P5, P11 bzw. P12). Vor dieser Untersuchung war von den Familien eine Zustimmung nach Information erhalten worden. Aus Hautbiopsien wurden primäre Fibroblasten-Zelllinien abgeleitet und mit SV40 pseudo-immortalisiert, wie anderswo beschrieben (Nicolas et al., 1998), und in RPMI 1640 (GIBCO BRL), ergänzt mit 15% fötalem Kälberserum, kultiviert.
Klonierung von Artemis-cDNA und Amplifizierung von genomischer DNA
Ausgehend von Fibroblasten-RNA wurde cDNA des ersten Strangs synthetisiert. Artemis in voller Länge codierende Sequenz wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) an cDNA amplifiziert unter Verwendung des Advantage-GC cDNA PCR Kit (Clontech) gemäß den Empfehlungen des Herstellers und der Primer 0083F1 (5'-GATCGGCGGCGCTATGAGTT-3', SEQ ID Nr. 3) und 169F (5'-TGTCATCTCTGTGCAGGTTT-3', SEQ ID Nr. 4), die ausgehend von den EST-Sequenzen AA278590 und AI859962 gestaltet worden sind. Die PCR-Produkte wurden direkt an einem ABI377-Sequenziergerät (Perkin-Elmer) unter Verwendung der BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (Applied Biosystems) mit einer Reihe von internen OligoNucleotiden sequenziert. Aufgrund von mehreren alternativ gespleißten Transkripten wurde eine Sequenzierung auch an klonierten PCR-Produkten ausgeführt. Artemis- Volllängen-cDNA wurde in pIRES-EGFP (Clontech) für eine nachfolgende Verwendung in Transfektionsexperimenten subkloniert. Die genomische Struktur des Artemis-Gens wurde durch Alignment (auf Homologie basierende gegenseitige Ausrichtung) der cDNA-Sequenz gegenüber der als Entwurf ermittelten Sequenz des Bac 2K17 (AL360083) abgel/eitet. Für die spezifische Amplifizierung von jedem Exon wurde eine Reihe von OligoNucleotid-Primerpaaren gestaltet. Exon 4- und Exon 5-PCR-Produkte wurden in pGemT (Promega) für eine nachfolgende Verwendung bei einer Southern-Blot-Analyse (siehe unten) kloniert.
Die Primer, die für eine genomische Amplifizierung der verschiedenen Exons 1 bis 14 verwendet wurden, entsprechen SEQ ID Nr. 5 bis SEQ ID Nr. 32. Diese Paare von Primern ermöglichen die Amplifizierung von jedem Exon, wie im Sequenzprotokoll angegeben, wobei die Nummer des Exons nach dem „Ex" steht, „F" Vorwärts und „R" Rückwärts bedeutet.
Ergebnisse
Als Teil ihrer Bemühungen im Rahmen der Sequenzierung des menschlichen Chromosoms 10 hat die „Chromosome 10 Mapping Group" am Sanger Center mehrere künstliche Bakterienchromosomen (BACs)-Kontigs, welche das gesamten Chromosom 10 überspannen, konstruiert (http://www.sanger.ac.uk/HGP/Chr10). Zwei von diesen Contigs, 10ctg1105 und 10ctg23 (1A), waren von besonderem Interesse, da sie mehrere BACs umfassten, welche die die RS-SCID-Region flankierenden Marker D10S1664 und D10S674 wie auch D10S191 und D10S1653, welche die maximalen paarweisen LOD-Scores bei A-SCID-Populationen zeigten (Li et al., 1998), trugen.
Es wurde eine systematische Überprüfung der Nucleotidsequenzen, welche die in den beiden von der „Human Chromosome 10 Sequencing Group" am Sanger Center veröffentlichten Contigs (http://webace.sanger.ac.uk/cgibin/ace/simple/10ace) vorhandenen 24 BACs umfassten, initiiert. Die Analysen basierten auf einer in silico-Nucleotidsequenz-Bewertung mit GENESCAN- (Burge und Karlin, 1997) (http://bioweb.pasteur.fr./seganal/interfaces/genscan.html) und FGENESH (Salamov und Solovyev, 2000) (http://genomic.sanger.ac.uk/gf/gfb.html)-Software, zwei Programmen, die darauf abzielen, nach mutmaßlichen Peptid-codierenden Genen in großen genomischen DNA-Sequenzen zu suchen. Alle vorhergesagten Peptide wurden nachfolgend gegenüber den translatierten nicht-redundanten GENBANK/EMBL-Nucleotid-Datenbanken unter Verwendung von TBLASTN überprüft. Bei der Veröffentlichung der AL360083-Entwurfssequenz, welche aus dem BAC 2K17 stammte, sagte FGENESH ein 149 Aminosäuren (aa; AS) langes Peptid (welches nachfolgend als Peptid „0083" bezeichnet wurde) voraus, innerhalb von welchem sich 121 aa als zu 35% bzw. 31% identisch zu den Proteinen MuSNM1 (AAF64472) und PSO2 aus Hefe (P30620) erwiesen. Die gleiche Peptid-Vorhersage wurde bei Verwendung von GENESCAN erhalten.
SNM1 und PSO2 sind zwei Proteine, die an der Reparatur von DNA-Schäden, die durch DNA-Strangvernetzungsmittel (ICL; „interstrand cross-linking-agents"), einschließlich Cisplatin, Mitomycin C oder Cyclophosphamid ((Henriques und Moustacchi, 1980; Dronkert et al., 2000) und darin zitierte Referenzen), verursacht werden, beteiligt sind. Maus- und Hefe-Mutanten für SNM1/PSO2 sind gegenüber mehreren Mitteln, die ICLs hervorrufen, hypersensitiv, nicht aber gegenüber γ-Strahlen, im Gegensatz zu RS-SCID-Patienten, bei welchen bei einigen Knochenmarkszellen und Fibroblasten eine Hypersensitivität gegen γ-Strahlen festgestellt wurde. Das das mutmaßliche Peptid „0083" codierende Gen repräsentierte aufgrund seiner chromosomalen Lage und der Ähnlichkeit des „0083"-Peptids zu DNA-Reparaturproteinen trotz der bedeutenden Diskrepanz in dem Strahlenempfindlichkeits-Phänotyp einen guten Kandidaten. Die Gültigkeit des mutmaßlichen „0083"-Peptids wurde ermittelt, indem nach RNA-Transkripten, welche dieses Peptid codierten, in der „TIGR human Gene Indices"-Datenbank unter Verwendung von TBLASTN (http://www.tigr.org/docs/tigrscripts/nhgi_scripts/tgi_blast.pl?organism=Human) gesucht wurde.
Diese Anfrage ergab den THC535641-Index, innerhalb von welchem AA278590 die am weitesten 5' gelegene Sequenz repräsentierte und dem I.MA.G.E.-Klon 703546 entsprach. Die Nucleotidsequenz des gegenüberliegenden Endes dieses Klons (AA278850) stimmte mit dem THC483503-Index überein. Die AI859962-Nucleotidsequenz in diesem zweiten Index lieferte die am weitesten 3' gelegene Erstreckung der cDNA, welche das „0083"-Peptid codiert. Eine vollständige cDNA wurde durch RT-PCR-Amplifizierung von Fibroblasten-RNA unter Verwendung der innerhalb der Nucleotidsequenzen AA278590 bzw. AI859962 ausgewählten Primer 0083F1 und 169E erhalten. Diese cDNA wurde direkt sequenziert und in pGemT kloniert. Mehrere Klone stellten nicht-produktive Transkripte dar, die durch alternative Spleißereignisse erzeugt worden sind (Daten nicht gezeigt). Die Erfinder konzentrierten sich auf einen Satz von Klonen, die das längste offene Leseraster beherbergten. Die vollständige cDNA-Sequenz von 2354 bp (SEQ ID Nr. 1) enthält ein offenes Leseraster (ORF) von 2079 bp. Es wird angenommen, dass das ATG an Position 39 oder das ATG an Position 60 die Translationsstartstelle darstellt, basierend auf der Analyse von umgebenden Nucleotiden, welche mit der Kozack-Consensussequenz für die Initiation der Translation übereinstimmen. Das codierte Protein von 692 oder 685 aa, das als Artemis bezeichnet wurde (und SNM1C entspricht), weist ein vorhergesagtes Molekulargewicht von ungefähr 78 kD auf. Das „0083"-Peptid (welches dem durch die Nucleotide 348 bis 800 von SEQ ID Nr. 1 codierten Peptid entspricht) entspricht I106-H254 (Beginn bei Nukl. 39) und ist Teil einer größeren Region, welche Ähnlichkeit zu scPSO2 und muSNM1 zeigt.
Es ist nicht möglich, vollständig sicherzustellen, dass diese cDNA die Volllängen-Sequenz darstellt, obwohl mehrere Versuche, die 5'-Sequenz weiter auszudehnen, scheiterten. Der polyA-Schwanz in der 3'-untranslatierten Region der Sequenz SEQ ID Nr. 1 wird durch die genomische Sequenz codiert und ist nicht die Folge von RNA-Prozessierung, was nahe legt, dass diese cDNA sich möglicherweise weiter strangabwärts erstreckt. Funktionale Komplementierungsuntersuchungen (siehe unten) legen jedoch stark nahe, dass der vollständige Artemis-ORF tatsächlich kloniert worden ist. Die Struktur des Artemis-Gens (Tabelle 1) wurde durch Vergleich der cDNA-Sequenz mit der genomischen (AL360083) Sequenz abgeleitet. Artemis besteht aus 14 Exons mit Größen, die von 52 bp bis 1160 bp reichen. In verschiedenen Artemis-cDNA-Klonen wurden vier alternative Exons identifiziert und führen zu nicht-produktiven Spleißungen (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 1: Exongrenzen des ARTEMIS-Gens
RS-SCID ist zuvor einer 6,5 cM großen chromosomalen Region, die durch die polymorphen Marker D10S1664 und D10S674 flankiert wird, einer Region, die für klassische cDNA-Selektionsuntersuchungen (Li et al., 1998; Moshous et al., 2000) zu groß ist, zugewiesen worden. Eine in silico-Bewertung von als Entwurf vorliegenden genomischen Sequenzen, welche diese Region überspannen, führte die Erfinder zu der Identifizierung des Artemis-Gens.
Beispiel 2: Expression von Artemis
Southern-Blot-Analyse
Zehn μg DNA mit hohem Molekulargewicht wurden mit HindIII oder Eco88I verdaut, auf einem 0,7%-igen Agarosegel aufgetrennt, unter Vakuum auf eine Nylon-Membran (Genescreen) geblottet und mit P32-markierten Artemis-Exon 5- und -Exon 4-spezifischen Sonden hybridisiert.
RNA-Expressionsanalyse
PCR-ready cDNA aus mehreren Geweben wurde von Clontech erworben und mittels der Artemis-spezifischen Primer 0083F4 (5'-AGCCAAAGTATAAACCACTG-3', SEQ ID Nr. 33) und 169F (SEQ ID Nr. 4) oder den vom Hersteller bereitgestellten GAPDH-Primern als Kontrolle amplifiziert und auf 1%-igen Agarosegelen aufgetrennt. Artemis-spezifische PCR-Produkte wurden auf eine Nylonmembran geblottet und mit einem internen P³²-markierten OligoNucleotid hybridisiert, wohingegen die GAPDH-PCR-Kontrolle durch Ethidiumbromid-Färbung sichtbar gemacht wurde.
Ergebnisse
Erhöhte Strahlenempfindlichkeit von RS-SCID gegenüber γ-Strahlen ist nicht auf die Zellen des Immunsystems beschränkt, sondern ist auch ein Charakteristikum von Fibroblasten, was nahe legt, dass Artemis ubiquitär exprimiert wird. Dies wurde durch eine PCR-Analyse an einer Gruppe von 15 cDNAs, welche ein breites Spektrum von hämopoetischen und nicht-hämopoetischen Geweben repräsentierten, bestätigt.
Das Ausmaß der Artemis-Expression ist ubiquitär, aber schwach und benötigte 30 PCR-Zyklen (38 Zyklen für den Skelettmuskel), um mit einem internen P32-markierten OligoNucleotid ein geeignetes Signal zu erhalten, verglichen mit der starken Ethidiumbromid-Färbung, die für das Kontrollgen GAPDH erhalten wurde.
Die nur in einem geringen Ausmaß erfolgende Expression von Artemis könnte eine allgemeine Eigenschaft der SNM1-Proteinfamilie reflektieren, da festgestellt worden war, dass die Grundexpression von mSNM1 in ES-Zellen ebenso sehr gering war (Dronkert et al, 2000). Es ist anzumerken, dass verglichen mit anderen Geweben die Artemis-Expression im Thymus oder Knochenmark, den Orten der V(D)J-Rekombination, nicht erhöht war.
Wie angesichts der generalisierten erhöhten Strahlenempfindlichkeit bei RS-SCID-Patientenzellen (Cavazzana-Calvo et al., 1993) erwartet, zeigte Artemis ein pleiotropes Expressionsmuster.
Beispiel 3: Das Artemis-Gen ist bei humanen RS-SCIDs mutiert
Mutationsanalyse
Artemis-Mutationssequenzanalysen wurden entweder an cDNA nach RT-PCR-Amplifizierung oder an genomischer DNA nach einer Exon-spezifischen PCR-Amplifizierung ausgeführt. Alle PCR-Produkte wurden unter Verwendung der BigDyeTerminator Cycle Sequencing Ready Reaction direkt sequenziert.
Ergebnisse
Die Struktur und die Sequenz des Artemis-Gens wurden in einer Reihe von 11 RS-SCID-Familien, welche 13 Patienten umfassten, analysiert (Tabelle 2 und 1). Drei Patienten (P6, P15 und P40) waren durch ein vollständiges Fehlen des Artemis-Transkripts, welches durch eine sich von Exon 1 bis 4 erstreckende genomische Deletion verursacht wurde, gekennzeichnet. Diese Mutation kann als ein vollständiges Null-Allel angesehen werden.
Die gleiche genomische Deletion war auf einem Allel in P1 vorhanden, der eine C279T-Nucleotidveränderung auf dem anderen Allel trug, die zu der Bildung eines Nicht-Sinn-Codons bei R74 führte. Eine homozygote C279T-Mutation war auch bei P2 vorhanden und wurde bei P4 heterozygot gefunden.
Für diese Reihe von RS-SCID-Patienten waren zwei andere genomische Deletionen charakteristisch. Eine die Exons 5 bis 8 überspannende homozygote Deletion bei P47 führte zu der Bildung einer cDNA, in welcher Exon 4 im Raster an Exon 9 gespleißt war, was zu einem mutmaßlichen Protein, welchem K96 bis Q219 fehlt, führt. Bei P3 führte eine heterozygote genomische Deletion der Exons 5 und 6 zu dem außerhalb des Rasters erfolgenden Spleißen von Exon 4 an 7, was zu einer Rasterverschiebung bei K96 führt. Das zweite Allel trug bei diesem Patienten eine heterozygote G- gegen C-Nucleotid-Veränderung in der kanonischen Spleißdonorsequenz des Exons 11, welche das außerhalb des Rasters erfolgende Spleißen von Exon 10 an 12, welches zu einer Rasterverschiebung bei T300 führt, bewirkte.
Als letztes wurden bei sechs Patienten drei andere Spleißdonorsequenz-Mutationen identifiziert. Eine heterozygote G- gegen A-Nucleotidveränderung in der Spleißdonorstelle des Exons 10 in P4 bewirkte die Produktion einer cDNA, wo die Fusion von Exon 9 an 12 das offene Leseraster bewahrte und potentiell zu der Herstellung eines Proteins, welchem A261 bis E317 fehlt, führte. Eine homozygote G- gegen T-Mutation in der Exon 5-Donorstelle wurde bei den Geschwistern P5, P11 und P12 wie auch bei P38 gefunden, welche das außerhalb des Rasters erfolgende Spleißen von Exon 4 an 6 und die Erzeugung einer Rasterverschiebung bei K96 bewirkte. Obwohl diese Form von cDNA, welcher das Exon 5 als ein Ergebnis eines alternativen Spleißereignisses fehlt, auch in geringem Ausmaß in RNA aus normalen Zellen nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt), war sie für alle cDNAs in P5 und P38 verantwortlich. Bei dem Patienten P16 bewirkte eine homozygote Deletion von G818 in Exon 9 zusammen mit einer homozygoten C- gegen T-Veränderung neun Nucleotide strangabwärts in dem Intron die Bildung einer Rasterverschiebung bei A254.
Wann immer Proben von den Eltern der Patienten verfügbar waren, wurden sie auf das Vorhandensein der Mutationen getestet. Dies konnte die Vererbung der Mutationen bei P5, P11 und P12 wie auch P38 und P16 durch direkte Sequenzierung der Exon-spezifischen genomischen PCR-Produkte, erhalten von der DNA der Eltern, (Daten nicht gezeigt), bestätigen, die mit der autosomalen rezessiven Vererbung übereinstimmt.
Zusammengefasst tragen alle der in dieser Reihe getesteten 13 RS-SCID-Patienten homozygote oder heterozygote Mutationen in dem Artemis-Gen. Keine dieser Mutationen waren einfache Missense-Mutationen und eine von diesen (genomische Deletion von Exon 1 bis 4) kann als ein wahres Null-Allel angesehen werden angesichts des vollständigen Fehlens von Artemis-Transkript in P6, P15 und P40. Alle Mutationen werden in 1 und Tabelle 2 rekapituliert. Tabelle 2 : Mutationen des Artemis-Gens in RS-SCID-Patienten

*: Stop-Codon

Der erste Hinweis darauf, dass Artemis tatsächlich das an RS-SCID beteiligte Gen war, kam aus der Identifizierung von Mutationen bei mehreren Patienten. Insgesamt wurden 8 unterschiedliche Mutationen des Gens bei 11 Familien gefunden. Obwohl einige der Mutationen rekurrent waren, war es nicht möglich, irgendeine eindeutige Korrelation mit der geographischen Herkunft der Patienten zu ermitteln.
Aus der Analyse dieser Mutationen ergeben sich mehrere interessante Merkmale:

– Erstens umfassen drei der identifizierten Modifikationen genomische Deletionen, welche mehrere Exons überspannen, welche zu Rasterverschiebung und Auftreten einer vorzeitigen Termination in zwei Fällen und einer im Raster erfolgenden Deletion von 216 aa in einem Falle führen. Dies zeigt an, dass das Artemis-Gen möglicherweise einen Hot-Spot für eine Gendeletion darstellen könnte.
– Zweitens besteht keine der Mutationen in einfachen Nucleotidsubstitutionen, welche Aminosäure-Veränderungen erzeugen, und nur eine, die C279T-Transversion, erzeugt eine Nonsense-Mutation (Nicht-Sinn-Mutation). Die anderen Nucleotidveränderungen betreffen Spleißdonorsequenzen, was in drei Fällen entweder zu Rasterverschiebungen oder in einem Falle zu einer im Raster erfolgenden Deletion eines Teils des Proteins führt.
– Drittens umfasst bei drei Patienten (P5, P15 und P40) die genomische Deletion Exon 1 bis 4 und führt zu einem vollständigen Fehlen von Artemis codierender cDNA. Diese Deletion, die so aufgefasst werden kann, dass sie zu einem Null-Allel führt, demonstriert dementsprechend, dass Artemis kein essentielles Protein für die Lebensfähigkeit ist im Gegensatz zu beispielsweise XRCC4 und DNA-Ligase IV (Barnes et al., 1998; Frank et al., 1998; Gao et al., 1998) oder dass es teilweise redundant ist.

Diese Information ist von besonderem Interesse im Kontext eines murinen Knockout-Gegenstücks zu dem humanen RS-SCID-Zustand. Die Beteiligung von Artemis an dem RS-SCID-Zustand wurde unzweideutig ermittelt durch Komplementierung des V(D)J-Rekombinationsdefekts in Fibroblasten von Patienten nach Transfektion mit einer Artemis-wt-cDNA (nächstes Beispiel).
Beispiel 4: Artemis komplementiert den RS-SCID-V(D)J-Rekombinationsdefekt
V(D)J-Rekombinationsassay
Der V(D)J-Rekombinationsassay wurde ausgeführt, wie zuvor beschrieben (Nicolas et al., 1998). Kurz zusammengefasst, wurden 5 × 10⁶ sich exponentiell vermehrende SV40-transformierte Haut-Fibroblasten in 400 μl Kulturmedium (RPMI 1640, 10% FCS) einer Elektroporation mit 6 μg RAG-1 und 4,8 μg RAG-2 codierendem Expressionsplasmid zusammen mit 2,5 μg der extrachromosomalen V(D)J-Substrate pHRecCJ (codierende Verknüpfung („coding joint")) oder pHRecCJ (Signalverknüpfung („signal joint")) unterzogen. Diese Plasmide tragen ein LacZ-Gen, welches durch eine DNA-Stuffersequenz, welche von V(D)J-Rekombinationssignalsequenzen flankiert wird, unterbrochen wird. Nach einer Rekombination wird die Stuffer-DNA herausgeschnitten und das LacZ-Gen erneut zusammengefügt, was blaue Bakterienkolonien erzeugt, wenn auf XgaI/IPTG-Medium ausplattiert wird. pARTE-ires-EGFP (2,5 μg) wurde für eine Komplementationsanalyse hinzugefügt. Für die Transfektion verwendete Konstrukte wurden nach 48 h gewonnen, erneut in DH10B-Bakterien eingeführt und auf XgaI/IPTG enthaltenden Platten ausplattiert. Der Rekombinationsprozentsatz wurde bestimmt, indem blaue und weiße Kolonien gezählt wurden und das Verhältnis berechnet wurde. Blaue Kolonien wurden zufällig gepickt und die Plasmid-DNA sequenziert, um die Qualität der V(D)J-Junktionen zu analysieren.
Ergebnisse
Die Erfinder haben zuvor das Fehlen einer sich aus einer V(D)J-Rekombination ableitenden Bildung von codierenden Verknüpfungen („coding joints") bei Fibroblasten von RS-SCID-Patienten nach einer Transfektion mit RAG1- und RAG2-Expressionskonstrukten zusammen mit extrachromosomalen V(D)J-Rekombinationssubstraten, welche für die Analyse der codierenden (pHRecCJ) Verknüpfung spezifisch sind, gezeigt (Nicolas et al., 1998). Im Gegensatz dazu wurde bei RS-SCID-Fibroblasten die Signalverknüpfungs („signal joint")-Bildung stets als normal ermittelt ((Nicolas et al., 1998) und Tabelle 3).
Das Artemis-Gen wurde in den Säugetier-Expressionsvektor plres-EGFP kloniert und dessen funktionale Komplementationsaktivität in dem V(D)J-Rekombinationsassay in Fibroblasten aus 7 RS-SCID-Patienten unter Verwendung des pHRecCJ-Substrats bestimmt (Tabelle 3). In allen Fällen wurden nach Transfektionen in Gegenwart von wt-Artemis blaue Bakterienkolonien gewonnen, was die RAG1/2-gesteuerte Rekombination des Substrats bescheinigt, während in Abwesenheit von exogenem wt-Artemis praktisch keine derartigen Kolonien erhalten wurden.
Die Häufigkeiten von Rekombinationsereignissen reichten von 1,5 × 10^–3 bis 2,9 × 10^–3, was mit der Häufigkeit von 3,2 × 10^–3 übereinstimmte, die bei einer Verwendung einer Kontroll-Fibroblasten-Zelllinie erhalten wird. Eine Sequenzanalyse der gewonnenen pHRecCJ-Plasmide, welche in diesem Assay in Fibroblastenlinien von P1 und P40 blaue Kolonien bildeten, zeigte, dass die Junktionen bona fide V(D)J-codierende Verknüpfungen („coding joints") mit einem begrenzten Zurechtschneiden der codierenden Enden ähnlich zu jenen, die bei Kontroll-Fibroblasten erhalten wurden (nicht gezeigt), waren.
Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse an, dass der V(D)J-Rekombinationsdefekt bei RS-SCID in direktem Zusammenhang mit den beschriebenen Mutationen in dem Artemis-Gen steht und durch die Einführung einer wt-Artemis-cDNA in die Fibroblasten der Patienten komplementiert werden kann. Obwohl eine vorübergehende Expression von Artemis auf hohem Niveau nicht toxisch zu sein schien, konnten keine stabilen Transfektanten abgeleitet werden, um die Komplementierung der Hypersensitivität gegenüber ionisierender Strahlung zu analysieren. Dies könnte auf eine Toxizität einer Expression von wt-Artemis auf hohem Niveau über lange Zeit hinweg in den transfizierten Fibroblasten zurückzuführen sein. Eine analoge zelluläre Toxizität war zuvor nach einer Überexpression von anderen humanen oder aus der Maus stammenden Homologen von SNM1 in vitro beschrieben worden und kann ein Charakteristikum dieser Familie von Proteinen sein (Dronkert et al., 2000). Dies steht auch in Übereinstimmung mit der auf niedrigem Niveau erfolgenden physiologischen RNA-Expression dieser Gene (siehe oben).
Es ist interessant, festzuhalten, dass das aus den ersten 385 Aminosäuren von SEQ ID Nr. 2 bestehende Protein ebenfalls in der Lage war, den V(D)J-Rekombinationsdefekt in diesem Assay zu komplementieren.
Beispiel 5 : Artemis gehört zu der Metallo-β-lactamase-Überfamilie
Datenbasenrecherchen unter Verwendung des Programms BLAST2 mit der Artemis-AS-Sequenz als Abfrage enthüllte über die ersten 360 Aminosäuren von Artemis signifikante Ähnlichkeiten zu mehreren Proteinen, einschließlich der Proteine PSO2 aus Hefe und SNM1 aus der Maus. Nachfolgende Iterationen mit dem PSI-BLAST-Programm hoben signifikante Ähnlichkeiten der ersten 150 Aminosäuren zu gut etablierten Mitgliedern der Metallo-β-lactamase-Überfamilie hervor.
Die Metallo-β-lactamase-Faltung, die erstmals für die β-Lactamase aus Bacillus cereus beschrieben worden ist (Carfi et al., 1995), wird durch verschiedene Metalloenzyme mit einer weit verbreiteten Verteilung und breiten Substratspezifität angenommen (Aravind, 1997). Sie besteht aus einem vierlagigen β-Sandwich mit zwei gemischten β-Faltblättern, die durch α-Helices flankiert werden, wobei die Metallbindungsstellen an einer Kante des β-Sandwichs lokalisiert sind. Sequenzanalyse wie auch eine Sekundärstruktur-Vorhersage für Artemis zeigten klar die Konservierung von für die Metallo-β-lactamase-Faltung typischen Motiven an. Dies trifft insbesondere für die Aminosäuren D17, [HXHKDH]33-38, H115 und D316, die an der Metallbindungstasche teilnehmen und die katalytische Stelle der Metallo-β-lactamasen repräsentieren, zu. Der letzte Metall-bindende Rest der Metallo-β-lactamasen, H225 in Tenotrophomonas maltophilia-Metallo-β-lactamase (1SML), welcher sich am Ende eines β-Faltblatts (Faltblatt β12) befindet, fehlt bei Artemis/SNM1/PSO2, könnte aber durch die Asparaginsäure D165 von Artemis, die bei SNM1/PSO2 ebenfalls konserviert ist, funktional ersetzt sein. Der letztgenannte Rest befindet sich am Ende eines vorhergesagten β-Faltblatts, getrennt durch eine α-Helix von dem Strang, der den vorangegangenen Metall-bindenden Rest trägt.
Zusammengenommen zeigt diese Analyse nicht nur an, dass Artemis wahrscheinlich die β-Lactamase-Faltung angenommen hat, sondern möglicherweise auch eine damit assoziierte katalytische Aktivität konserviert haben könnte, im Gegensatz zu mehreren anderen Proteinen, die viele der katalytischen Reste verloren haben (Aravind, 1997).
Beispiel 6: In vitro-Mutagenese des Artemis-Gens
Die Analyse der Proteinsequenz von Artemis enthüllte enthüllte die Existenz einer mutmaßlichen Metallo-β-lactamase-Domäne (M1 bis R179), welche nahe legt, dass Artemis irgendeine katalytische Funktion, wie Hydrolase, haben könnte. Dieser Domäne folgt eine andere Domäne (E180 bis S385), die als β-CASP für „β Lactamase CPSF-Artemis-SNM1-PSO2 associated domain" (mit β-Lactamase-CPSF, Artemis, SNM1, PSO2 assoziierte Domäne) bezeichnet wurde. Die β-CASP-Domäne ist in einer Reihe von Proteinen mit einer Funktion im Rahmen des Stofffwechsels von Nukleinsäuren (DNA-Reparatur, RNA-Prozessierung ...) stets mit der β-lact-Domäne assoziiert. Schließlich umfasst die letzte Domäne (C-ter) E386 bis T692. Die Rolle und die wechselseitige Abhängigkeit dieser beiden Domänen wurden in vitro analysiert, indem Mutanten erzeugt wurden und deren Aktivität sowohl auf die V(D)J-Rekombination als auch die DNA-Reparatur getestet wurde.
Ergebnisse
V(D)J-Rekombination
Der Assay basiert auf der Transfektion eines Fibroblasten mit Rag1- und Rag2-Expressionskonstrukten, um die V(D)J-Rekombination eines extrachromosomalen Substrats (pHRec-CJ oder pHRec-CS, siehe Beispiel 4) zu analysieren. Die βLact+βCASP-Region (M1 bis S385) ist ausreichend, um den V(D)J-Rekombinationsdefekt in Fibroblasten aus Artemis-defizienten (RS-SCID-) Patienten zu komplementieren.
Jedoch komplementiert die βLact-Domäne (M1 bis R179) allein diesen Defekt nicht. Es existiert ebenfalls keine Aktivität, wenn βCASP-Cter- (E180 bis T692) oder C-ter-(E386 bis T692)-Konfigurationen von Artemis verwendet werden.
Die katalytische Stelle von Metallo-β-lactamasen in Bakterien ist durch die Anordnung von mehreren konservierten His- und Asp-Resten, die Zn-Atome binden und die Hydrolase-Aktivität verleihen, gekennzeichnet. Viele dieser Reste sind auch bei Artemis konserviert, was des Weiteren die mögliche Hydrolase-Aktivität von Artemis nahe legt.
Mehrere von diesen His- und Asp-Resten wurden zu Val mutiert und die restliche Funktion des Proteins wurde in dem V(D)J-Assay analysiert.
D17A, H35A, D37A und D136A vernichteten die Funktion von Artemis nahezu vollständig, während H165A und H319A dessen Aktivität verringerten. H38A und H151A scheinen keine Wirkung zu haben.
DNA-Reparatur
Dieser Assay basiert auf der Analyse der Empfindlichkeit von mit einem retroviralen Vektor, welcher verschiedene Formen von Artemis exprimiert, transduzierten RS-SCID-Fibroblasten gegenüber γ-Strahlen. Während βLact–βCASP/C-ter die übermäßige Strahlenempfindlichkeit von RS-SCID-Zellen komplementiert, hat βLact-βCASP keine Wirkung.
Schlussfolgerungen
Diese Mutageneseexperimente legen nahe, dass Artemis wahrscheinlich irgendeine katalytische Aktivität aufweist, wie aufgrund von dessen Homologie zu bakteriellen Metallo-β-lactamasen gemutmaßt wird.
Die βLact+βCASP-Domäne von Artemis trägt dessen katalytische Aktivität, da 1) sie eine V(D)J-Rekombination an extrachromosomalen Substraten sicherstellen kann und 2) eine Mutation von mehreren mutmaßlichen katalytischen Resten (His und Asp) die Funktion vernichten kann.
Nichtsdestotrotz ist es interessant, festzuhalten, dass die βLact+βCASP-Domäne an sich nicht ausreichend zu sein scheint, um Artemis-Aktivität im Kontext des gesamten Chromosoms zu ermöglichen, da das Volllängen-Artemis-Protein oder wenigstens ein Teil der C-terminalen Domäne erforderlich zu sein scheint, um den Strahlungsempfindlichkeits-Phänotyp zu komplementieren.
Dies legt nahe, dass Artemis wahrscheinlich mit anderen Proteinen in dem Kontext von dessen Substrat innerhalb des Chromatins wechselwirkt.
Basierend auf diesem Ergebnis ist es möglich, dass die V(D)J-Rekombinationsaktivität gegenüber endogenen (in Chromatin befindlichen gegenüber extrachromosomalen) IgG- und TCR-Genen ebenfalls das gesamte Artemis-Protein erfordern könnte.
Diese Situation ist in gewisser Weise ähnlich zu jener des Rag2-Proteins. Bei Rag2 ist eine Kernregion erforderlich und ausreichend, um die Rekombination von extrachromosomalen Substraten zu bewirken, ist aber bei der Umlagerung von endogenen Loci unwirksam.
Beispiel 7: Analyse von Patienten mit partiellem Artemis-Mangel
Beobachtung
Bei einer Begutachtung von SCID-Patienten trafen die Erfinder auf 4 Fälle (bei 2 Familien), welche einen komplexen Phänotyp aufwiesen, welcher Ataxia-Teleangiectasia, gleichwohl ohne eindeutige Ataxie, ähnelte. Diese Patienten litten unter schwerer Lymphopenie und Hypogammaglobulinämie.
Bei einigen dieser Patienten legte die Feststellung von Chromosomenaberrationen bei Lymphozyten nahe, dass sie einen DNA-Reparaturdefekt aufweisen könnten, was weiter betätigt wurde, indem Hypersensitivität von Knochenmark gegenüber γ-Strahlen gezeigt wurde.
In Fibroblasten von zwei dieser Patienten (welche die beiden Familien repräsentierten) war eine V(D)J-Rekombination entweder nicht vorhanden oder stark verringert und wurde auf das normale Niveau durch Hinzufügen von wt-Artemis wiederherstellt, wie in Beispiel 4.
Als letztes war es möglich, zu zeigen, dass das Artemis-Gen in beiden Fällen mutiert war, was zu vorzeitigen Stop-Codons bei T432 bzw. D451 (am Beginn der C-Ter-Domäne) führte.
Diese Beobachtung bestätigt irgendwie die Ergebnisse der in vitro-Mutagenese (siehe Beispiel 6), was zeigt, dass ein Artemis-Protein, dem die vollständige C-Ter-Domäne fehlt, nach wie vor Rekombinationsaktivität in dem Chromatin-Kontext in vivo aufweisen kann (diese Patienten haben tatsächlich einige Lymphozyten), aber die Effizienz gegenüber endogenen Loci sehr schwach ist (diese Patienten sind stark lymphopenisch).
Bei zwei Patienten aus der ersten Familie wurde der Immunmangel von der Entwicklung einer sehr aggressiven und disseminierten lymphoproliferativen Erkrankung (SLP), assoziiert mit der Anwesenheit von EBV, begleitet.
Diese SLPs können wahrscheinlich basierend auf ihrer Klonalität und ihrer Aggressivität mit wahren B-Zell-Lymphomen verglichen werden.
Schlussfolgerung
Die hauptsächliche Schlussfolgerung aus dieser Beobachtung ist, dass Artemis wahrscheinlich als ein „Wärter" („Caretaker") angesehen werden kann, da ein Mangel an diesem offensichtlich mit der Entwicklung von B-Zell-Lymphomen verbunden ist.
Diese Idee wird durch die Literatur gestützt, die (in mehreren Berichten) zeigt, dass Mängel an anderen Faktoren der V(D)J-Rekombination/DNA-Reparatur (wie Ku80, DNA-PK, XRCC4, DNA-Ligase IV) in Tiermodellen stets zu der Entwicklung von pro-B-Zell-Lymphomen führen, wenn sie vor einem P53-/--Hintergrund eingeführt werden, was diese als wahre Wächter enthüllt.
Diese Hypothese kann in einem Tiermodell experimentell getestet werden.
LITERATURVERZEICHNIS

Aravind, L. (1997). An evolutionary classification of the matallo-β-lactamase fold. In Silico Biology.
Barnes et al. (1998). Targeted disruption of the gene encoding DNA ligase IV leads to lethality in embryonic mice. Curr Biol 31, 1395-1398.
Biedermann et al. (1991). Scid mutation in mice confers hypersensitivity to ionizing radiation and a deficiency in DNA double-strand break repair. Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 1394-1397.
Blunt et al. (1996). Identification of a nonsense mutation in the carboxyl-terminal region of DNA-dependant protein kinase catalytic subunit in the scid mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10285-10290.
Bosma et al. (1983). A severe combined immunodeficiency mutation in the mouse. Nature 301, 527-30.
Bunge, C. und Karlin, S. (1997). Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J Mol Biol 268, 78-94.
Cameron et al. (1999). Crystal structure of human glyoxalase II and its complex with a glutathione thiolester substrate analogue. Structure Fold Des 7,1067-78.
Carfi et al. (1995). The 3-D structure of a zinc metallo-beta-lactamase from Bacillus cereus reveals a new type of protein fold. Embo J 14, 4914-21.
Carney et al. (1998). The hMre11/hRad50 protein complex and Nijmegen breakage syndrome: linkage of double-strand break repair to the cellular DNA damage response. Cell 93, 477-86.
Cavazzana-Calvo et al. (1993). Increased radiosensitivity of granulocyte macrophage colony-forming units and skin fibroblasts in human autosomal recessive Severe Combined Immunodeficiency. J. Clin. Invest. 91, 1214-1218.
Chen et al. (2000). Response to RAG-mediated V(D)J cleavage by NBS1 and gamma-H2AX. Science 290, 1962-5.
Corneo et al. (2000). 3D clustering of human RAG2 gene mutations in Severe Combined Immune Deficiency (SCID). J. Biol. Chem. 275, 12672-12675.
Danska et al. (1996). Biochemical and genetic defects in the DNA-dependent protein kinase in murine scid lymphocytes. Mol Cell Biol 16, 5507-17.
Dronkert et al. (2000). Disruption of mouse SNM1 causes increased sensitivity to the DNA interstrand cross-linking agent mitomycin C. Mol Cell Biol 20, 4553-61.
Eastman et al. (1996). Initiation of V(D)J recombination in vitro obeying the 12/23 rule, nature 380, 85-88.
Fischer et al. (1997). Naturally occurring primary deficiencies of the immune system. Annu. Rev. Immunol. 75, 93-124.
Frank et al. (1998). Late embryonic lethality and impaired V(D)J recombination in mice lacking DNA ligase IV. Nature 396, 173-7.
Fugmann et al. (2000). Identification of two catalytic residues in RAG1 that define a single active site within the RAG1/RAG2 protein complex. Mol Cell 5, 97-107.
Fulop, G.M. und Phillips, R.A. (1990). The scid mutation in mice causes a general defect in DNA repair. Nature 347, 479-482.
Gao et al. (1998). A targeted DNA-PKcs-null mutation reveals DNA-PK-independent functions for KU in V(D)J recombination. Immunity 9, 367-76.
Gao et al. (1998). A critical role for DNA end-joining proteins in both lymphogenesis and neurogenesis. Cell 95, 891-902.
Gottlieb, T. M und Jackson, S.P. (1993). The DNA-dependant protein kinase: requirement for DNA ends and association with Ku antigen. Cell 72, 132-142.
Haber, J. E. (2000). Partners and pathways repairing a double-strand break. Trends Genet 16, 259-64.
Hendrickson et al. (1991). A link between double-strand break related repair and V(D)J recombination: the scid mutation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4061-4065.
Henriques, J.A. und Moustacchi, E. (1980). Isolation and characterization of pso mutants sensitive to photo-addition of psoralen derivatives in Saccharomyces cerevisiae. Genetics 95, 273-88.
Hu, D.C., Gahagan, S., Wara, D.W., Hayward, A. und Cowan, M.J. (1988). Congenital severe combined immunodeficiency disease (SCID) in American Indians. Pediatr. Res. 24, 239.
Jackson, S.P. und Jeggo, P.A. (1995). DNA double-strand break repair and V(D)J recombination: involvement of DNA-PK. Trends Biochem Sci 20, 412-5.
Jhappan, C, Morse, H.C.R., Fleischmann, R.D., Gottesman, M.M. und Merlino, G. (1997). DNA-PKcs: a T-cell tumour suppressor encoded at the mouse scid locus. Nat Genet 17, 483-6.
Junop, M. S., Modesti, M., Guarne, A., Ghirlando, R., Gellert, M. und Yang, W. (2000). Crystal structure of the xrcc4 DNA repair protein and implications for end joining. Embo J 19, 5962-70.
Kim, D.R., Dai, Y., Mundy, C.L., Yang, W. und Oettinger, M.A. (1999). Mutations of acidic residues in RAG1 define the active site of the V(D)J recombinase. Genes Dev 13, 3070-80.
Landree, M.A., Wibbenmeyer, J.A. und Roth, D.B. (1999). Mutational analysis of RAG1 and RAG2 identifies three catalytic amino acids in RAG1 critical for both cleavage steps of V(D)J recombination. Genes Dev 13, 3059-69.
Li, et al. (1998). The gene for severe combined immunodeficiency disease in Athabascan-speaking Native Americans is located on chromosome 10p. Am J Hum Genet 62, 136-44.
Li et al. (1995). The Xrcc4 Gene Encodes a Novel Protein Involved In DNA Double-Strand Break Repair and V(D)J Recombination. Cell 83, 1079-1089.
McBlane et al. (1995). Cleavage at a V(D)J recombination signal requires only RAG1 and RAG2 proteins and occurs in two steps. Cell 83, 387-95.
Mombaerts et al. (1992). RAG-1 deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell 68, 869-877.
Moshous et al. (2000). A new gene involved in DNA double-strand break repair and V(D)J recombination is located on human chromosome 10p. Hum Mol Genet 9, 583-588.
Nicolas et al. (1996). Lack of detectable defect in DNA double-strand break repair and DNA-dependant protein kinase activity in radiosensitive human severe combined immunodeficiency fibroblasts. Eur. J. Immunol. 26, 1118-1122.
Nicolas et al. (1998). A human SCID condition with increased sensitivity to ionizing radiations and impaired V(D)J rearrangements defines a new DNA Recombination/Repair deficiency. J. Exp. Med 188, 627-634.
Nussenzweig et al. (1996). Requirement for Ku80 in growth and immunoglobulin V(D)J recombination, Nature 382, 551-555.
Oettinger et al. (1990). RAG-1 and RAG-2, adjacent genes that synergistically activate V(D)J recombination. Science 248, 1517-1523.
Paull et al. (2000). A critical role for histone H2AX in recruitment of repair factors to nuclear foci after DNA damage. Curr Biol 10, 886-95.
Robins, P. und Lindahl, T. (1996). DNA ligase IV from HeLa cell nuclei. J Biol Chem 271, 24257-61.
Rogakou et al. (1999). Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. J Cell Biol 146, 905-16.
Rogakou et al. (1998). DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem 273, 5858-68.
Roth, D.B. und Craig, N.L. (1998). VDJ recombination: a transposase goes to work. Cell 94, 411-4.
Roth, D.B. und Gellert, M. (2000). New guardians of the genome. Nature 404, 823-5.
Roth et al. (1992). V(D)J recombination: Broken DNA molecules with covalently sealed (hairpin) coding ends in scid mouse thymocytes. Cell 70, 983-991.
Salamov, A.A. und Solovyev, V.V. (2000). Ab initio gene finding in Drosophila genomic DNA. Genome Res 10, 516-22.
Schatz et al. (1989). The V(D)J recombination activating gene, RAG-1. Cell 59, 1035-1048.
Schlissel et al. (1993). Double-strand signal sequence breaks in V(D)J recombination are blunt, 5'-phosphorylated, RAG-dependent, and cell cycle regulated. Genes Dev 7, 2520-32.
Schwarz et al. (1996). RAG mutations in human B cell-negative SCID. Science 274, 97-99.
Shin et al. (1997). A Kinase-Negative Mutation Of Dna-Pkcs In Equine Scid Results In Defective Coding and Signal Joint Formation. J. Immunol. 158, 3565-3569.
Shinkai et al. (1992). RAG-2 deficient mice lack mature lymphocytes owing to inability to initiate V(D)J rearrangement. Cell 68, 855-867.
Taccioli et al. (1998). Targeted disruption of the catalytic subunit of the DNA-PK gene in mice confers severe combined immunodeficiency and radiosensitivity. Immunity 9, 355-66.
Taccioli et al. (1993). Impairement of V(D)J recombination in double-strand break repair mutants. Science 260, 207-210.
Teo, S.H. und Jackson, S.P. (1997). Identification Of Saccharomyces Cerevisiae DNA Ligase .4. Involvement In DNA Double-Strand Break Repair. EMBO Journal 16, 4788-4795.
Tonegawa, S. (1983). Somatic generation of antibody diversity. Nature 302, 575-81.
Van Gent et al. (1995). Initiation of V(D)J recombination in a cell-free system. Cell 87, 925-934.
van Gent et al. (1996). Similarities between initiation of V(D)J recombination and retroviral integration. Science 271, 1592-1594.
Varon et al. (1998). Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome. Cell 93, 467-76.
Villa et al. (2001). V(D)J recombination defects in lymphocytes due to RAG mutations: severe immunodeficiency with a spectrum of clinical presentations. Blood 97, 81-88.
Wilson et al. (1997). Yeast DNA ligase IV mediates non-homologous DNA end joining. Nature 388, 495-8.
Zhu et al. (1996). Ku86-deficient mice exhibit severe combined immunodeficiency and defective processing of V(D)J recombination intermediates. Cell 86, 379-389.
Zhu, C. und Roth, D. B. (1995). Characterization of coding ends in thymocytes of scid mice: implications for the mechanism of V(D)J recombination. Immunity 2, 101-12.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nucleotiden 39-2114 von SEQ ID Nr. 1 oder den Nucleotiden 60-2114 von SEQ ID Nr. 1.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den Nucleotiden 39-1193 oder den Nucleotiden 60-1193 von SEQ ID Nr. 1.
Isoliertes Nukleinsäure-Molekül, welches das Komplement des isolierten Nukleinsäure-Moleküls von Anspruch 1 ist.
Vektor, umfassend das Nukleinsäure-Molekül von Anspruch 1.
Wirtszelle, umfassend den Vektor von Anspruch 4.
Verfahren zur Produktion eines Proteins, das an V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist, umfassend die Schritte: a) Exprimieren des Nukleinsäure-Moleküls von Anspruch 1 in einem geeigneten Wirt, um ein Protein zu synthetisieren, das an V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist und b) Isolieren des Proteins, das an V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur beteiligt ist.
Isoliertes Protein oder Peptid, das durch die Nukleinsäure von Anspruch 1 codiert wird.
Monoklonaler oder polyklonaler Antikörper, der das Protein oder Peptid von Anspruch 7 spezifisch erkennt.
In-vitro-Verfahren zur Bestimmung des Typs von schweren kombinierten Immundefekten (SCID) bei einem Patienten, das darin besteht, die Nukleinsäure zu analysieren, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nucleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 von SEQ ID Nr. 1 des Patienten, wobei eine Mutation in der Nukleinsäure die Klassifikation des SCID als strahlenempfindlicher SCID ermöglicht.
In-vitro-Verfahren zur Diagnose, einschließlich einer pränatalen Diagnose, eines Zustands bei einem Patienten, welcher ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem SCID, einer Prädisposition für Krebs, einem Immundefekt und dem Tragen einer Mutation, welche das Risiko erhöht, dass Nachkommen eine derartige Krankheit aufweisen, bestehend in der Analyse der Nukleinsäure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 1, den Nucleotiden 39-2114, 60-2114, 39-1193 und 60-1193 von SEQ ID Nr. 1 und/oder dem Protein, das durch die Nukleinsäure des Patienten codiert wird, wobei eine Mutation in der Nukleinsäure und/oder dem Protein ein erhöhtes Risiko für das Vorliegen eines SCID anzeigt.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die sich an die Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 3 oder das Protein von Anspruch 7 binden kann, umfassend die Schritte: a) In-Kontakt-Bringen der Nukleinsäure oder des Proteins mit einer Kandidaten-Verbindung und b) Bestimmen der Bindung zwischen der Kandidaten-Verbindung und der Nukleinsäure oder dem Protein.
Eine der Nukleinsäuren von Anspruch 1 oder 7, der Vektor von Anspruch 4, die Wirtszelle von Anspruch 5, das Protein von Anspruch 7 und der Antikörper von Anspruch 8 als Medikament.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch annehmbaren Hilfsstoff mit mindestens einem aus der Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 3, dem Vektor von Anspruch 4, der Wirtszelle von Anspruch 5, dem Protein von Anspruch 7 und dem Antikörper von Anspruch 8.
Venrwendung von mindestens einem aus der Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 3, dem Vektor von Anspruch 4, der Wirtszelle von Anspruch 5, dem Protein von Anspruch 7, dem Antikörper von Anspruch 8 und der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Therapie eines schweren kombinierten Immundefekts (SCID) bestimmt ist.
Verwendung von mindestens einem aus der Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 3, dem Vektor von Anspruch 4, der Wirtszelle von Anspruch 5, dem Protein von Anspruch 7, dem Antikörper von Anspruch 8 und der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 13 für die Herstellung eines Arzneimittels, das für die Therapie von Krebs vorgesehen ist, bevorzugt zusammen mit einem Genom-schädigenden Mittel, wobei die Verwendung simultan, getrennt oder aufeinanderfolgend ist.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, das die Nukleinsäuresequenz von Anspruch 1 in sein Genom integriert aufweist, welche operativ an Regulationselemente geknüpft ist, wobei die Expression der codierenden Sequenz die Konzentration des ARTEMIS-Proteins, das durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, und/oder das Maß der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des Säugetiers relativ zu einem nicht-transgenen Säugetier derselben Art erhöht.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, dessen Genom eine Zerstörung des endogenen ARTEMIS-Gens umfasst, das durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei die Zerstörung die Insertion einer selektierbaren Markersequenz umfasst und wobei die Zerstörung zum Ergebnis hat, dass das nicht-menschliche Säugetier einen Defekt in der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur im Vergleich zu einem nicht-menschlichen Wildtyp-Säugetier zeigt.
Transgenes Säugetier nach Anspruch 17, wobei die Zerstörung eine homozygote Zerstörung ist.
Transgenes Säugetier nach Anspruch 18, wobei die homozygote Zerstörung eine Null-Mutation des endogenen Gens zur Folge hat, das ARTEMIS codiert, welches durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird.
Säugetier nach Anspruch 16 oder 17, bei dem es sich um eine Maus handelt.
Isolierte Nukleinsäure, umfassend ein ARTEMIS-Knockout-Konstrukt, das eine selektierbare Markersequenz umfasst, die von DNA-Sequenzen flankiert ist, die homolog zu dem endogenen ARTEMIS-Gen sind, dessen cDNA durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei, wenn das Konstrukt in ein nicht-menschliches Säugetier oder einen Vorfahren des nicht-menschlichen Säugetiers in einem embryonalen Stadium eingeführt wird, die selektierbare Markersequenz das endogene ARTEMIS-Gen in dem Genom des nicht-menschlichen Säugetiers so zerstört, dass das nicht-menschliche Säugetier einen Defekt in der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur im Vergleich zu einem nicht-menschlichen Wildtyp-Säugetier zeigt.
Vektor, umfassend die Nukleinsäure von Anspruch 21.
Säuger-Wirtszelle, deren Genom eine Zerstörung des endogenen ARTEMIS-Gens umfasst, dessen cDNA durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, wobei die Zerstörung die Insertion einer selektierbaren Markersequenz umfasst.
Verfahren zur Durchmusterung von Verbindungen, welche V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur modulieren, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit dem nicht-menschlichen Säugetier von Anspruch 17 oder der Wirtszelle von Anspruch 23 und Bestimmen der Zunahme oder Abnahme der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur in dem nicht-menschlichen Säugetier oder der Wirtszelle im Vergleich zu der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des nicht-menschlichen Säugetiers oder der Wirtszelle vor der Verabreichung der Verbindung.
Verfahren zum Testen der Genomtoxizität von Verbindungen, umfassend das In-Kontakt-Bringen einer Verbindung mit dem nicht-menschlichen Säugetier von Anspruch 17 oder der Wirtszelle von Anspruch 23 und Bestimmen der Zunahme oder Abnahme der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur in dem nicht-menschlichen Säugetier oder der Wirtszelle im Vergleich zu der V(D)J-Rekombination und/oder DNA-Reparatur des nicht-menschlichen Säugetiers oder der Wirtszelle vor der Verabreichung der Verbindung.
Verwendung von mindestens einer Verbindung, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus der Nukleinsäure von Anspruch 1 oder 3, dem Vektor von Anspruch 4, der Wirtszelle von Anspruch 5, dem Protein von Anspruch 7, dem Antikörper von Anspruch 8 und der pharmazeutischen Zusammensetzung von Anspruch 13 für die Herstellung eines Medikaments zur Modulation der Expression und/oder Aktivität des ARTEMIS-Proteins, das durch SEQ ID Nr. 2 dargestellt wird, in einer Zelle.
Nicht-menschliches transgenes Säugetier, dessen Genom eine erste Zerstörung, bei der es sich um die des endogenen ARTEMIS-Gens handelt, dessen cDNA durch SEQ ID Nr. 1 dargestellt wird, und eine zweite Zerstörung umfasst, bei der es sich um die des endogenen p53-Gens handelt.
Transgenes Säugetier nach Anspruch 27, bei dem mindestens die erste Zerstörung oder die zweite Zerstörung eine homozygote Zerstörung ist.
Transgenes Säugetier nach Anspruch 27, bei dem die erste Zerstörung und die zweite Zerstörung homozygote Zerstörungen sind.
Transgenes Säugetier nach Anspruch 27, bei dem es sich um eine Maus handelt.