DE69535316T2

DE69535316T2 - Als lerk6 bezeichnetes cytokin

Info

Publication number: DE69535316T2
Application number: DE69535316T
Authority: DE
Inventors: P. Douglas Seattle CERRETTI
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1994-10-05
Filing date: 1995-10-04
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2015-10-05
Also published as: WO1996010911A1; AU3826895A; KR970705923A; ATE346498T1; ES2277335T3; EP0785716A1; NO971378L; EP0785716A4; FI971276A; JP2002504801A; NZ295022A; FI971276A0; MX9702341A; NO971378D0; AU687647B2; DK0785716T3; EP0785716B1; PT785716E; US6268482B1; DE69535316D1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Cytokin-Polypeptide, die als LERK-6 bezeichnet werden, die an den Hek oder Elk-Rezeptor binden, die Nukleinsäuren, die solche Polypeptide kodieren, Verfahren zum Herstellen von rekombinanten LERK-6 Polypeptiden, und pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche solche Polypeptide enthalten.
Hintergrund der Erfindung
Proteine, die als Rezeptor-Tyrosinkinasen bekannt sind, weisen eine intrinsische Kinaseaktivität auf, die bei Ligandenbindung aktiviert wird. Diese Klasse von Proteinen ist durch konservierte strukturelle Motive innerhalb der katalytischen Domänen (Hanks et al., Science 242:42, 1988) gekennzeichnet und kann basierend auf strukturellen Merkmalen der Regionen, die N-terminal zu der katalytischen Domäne liegen, in Familien unterteilt werden.
Boyd et al. (J. Biol. Chem. 267:3262, 1992) reinigten ein Zelloberflächenglycoprotein, das Tyrosinkinase-Aktivität aufwies. Die Aminosäuresequenz identifizierte dieses Protein als ein Mitglied der Eph/Elk-Familie, und das Protein wurde somit als Hek (humane Eph/Elk-ähnliche Kinase) bezeichnet. Ein mit Hek immunoreaktiver monoklonaler Antikörper wurde verwendet, um die Hek-Expression an einer Reihe von humanen Zelltypen zu untersuchen (Boyd et al., supra). Hek-Antigen wurde auf der humanen prä-B-Zellen-Leukämiezelllinie LK63 (die Zelllinie, die als Immunogen verwendet wurde, gegen das der Antikörper gezüchtet wurde) und der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie, JM gefunden. Die Raji-B-Lymphomazelllinie zeigte eine schwache Hek-Antigenexpression, während die restlichen getesteten Zelllinien (sowohl normale als auch Tumorzelllinien, unter denen sich hämopoetische Zelllinien befanden, die prä-B- und T-Zelllinien einschlossen) konsistent negativ waren. Von den normalen und Tumorgewebebiopsieproben, die ebenfalls auf Hek-Antigen-Expression getestet wurden, war keines von den normalen Geweben positiv und nur ein sehr geringer Anteil der hämopoetischen Tumore war positiv.
Die Expression von Hek-Transkripten in den oben beschriebenen LK63- und JM-Zelllinien, sowie in der humanen T-Zellen-Leukämiezelllinie HSB-2, wurde durch Northern-Blot-Analyse nachgewiesen (Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1611, 1992). Nukleotid- und Aminosäuresequenzen für einen isolierten Hek-cDNA-Klon werden in Wicks et al., supra präsentiert.
Das als Elk bezeichnete Zellenoberflächenprotein ist ein weiteres Mitglied der Eph-verwandten Tyrosinkinaserezeptorfamilie von Proteinen. Ein partieller Klon von Elk wurde zuerst in einer Rattenhirn-cDNA-Expressionsbibliothek entdeckt, die auf Proteine untersucht wurde, die Tyrosinkinaseaktivität exprimieren (Letwin et al., Oncogene 3:621, 1988). Danach wurde eine zusammengesetzte Sequenz, die sich über die gesamte Elk-Kodierungsregion erstreckt, von partiellen Klonen abgeleitet, die von einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek und einer Ratten-Kleinhirnbibliothek unter Verwendung des partiellen Klons als Sonde isoliert wurden (Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991).
Die Hek- und Elk-Proteine sind eng mit einer Reihe von anderen Rezeptortyrosinkinasen verwandt, einschließlich der Hek-Homology Mek4 und Cek4 (Sajjadi et al. New Biol. 3:769, 1991); Eek (Chan et al. Oncogene 6:1057, 1991); Erk (Chan et al. supra), Eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 10:6316, 1990); Cek5 (Pasquale, E.B. Cell Regulation 2:523, 1991); und Eph (Hirai et al. Science 238:1717, 1987). Die Proteine dieser Unterfamilie sind nicht nur in ihren cytoplasmatischen Domänen, sondern auch in ihren extrazellulären Domänen verwandt, die 41 bis 68 identisch sind. Interessanterweise sind die Gewebeverteilungen dieser verschiedenen Rezeptoren unterschiedlich. So wurde zum Beispiel berichtet, dass die Expression von Elk-mRNA auf Hoden und Hirn beschränkt ist (Lhotak et al., supra), während Eck nicht nur in denselben zwei Geweben, sondern auch in der Lunge, im Darm, den Nieren, der Milz, dem Eierstock und der Haut gefunden wird. Zusätzlich werden die meisten Ephverwandten Rezeptoren hauptsächlich im Hirn exprimiert. Aufgrund der Homologie der Rezeptoren in der Eph-Familie, kann ein gegebener Ligand für einen spezifischen Rezeptor auch an andere Rezeptoren binden.
Die Liganden, die für die Rezeptortyrosinkinasen identifiziert wurden, sind eine diverse Gruppe von Proteinen, welche das Wachstum, die Differenzierung und das Überleben von Zellen beeinflussen, die die Rezeptoren exprimieren. Liganden für Hek und Elk wurden isoliert, so wie weiter unten im Detail erläutert ist.
Die Identifikation etwaiger zusätzlicher Liganden für Hek und Elk, die existieren mögen, würden sich bei der Untersuchung der Natur von zellularen Prozessen, die mittels Signalisierung durch diese Rezeptoren reguliert werden, als nützlich erweisen. Wenn die Verstärkung oder Hemmung eines bestimmten biologischen Signals, das durch diese Rezeptoren vermittelt wird, gewünscht ist, ist es vorteilhaft, jedes der Proteine, die eine Rolle bei der Transduktion solcher Signale spielen, zu identifizieren. Ferner ist bekannt, dass bestimmte Proteine an bestimmte Rezeptoren binden, ohne eine Signaltransduktion zu starten, einschließlich des Interleukin-1-Rezeptor-Antagonistenproteins (Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343:336, 1990; und Carter et al., Nature 344:633, 1990). Die Identifikation von zusätzlichen Proteinen, die Hek oder Elk binden, ist ebenfalls wünschenswert, um festzustellen, ob solche Proteine als Antagonisten fungieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Säugetier LERK-6 als ein isoliertes oder homogenes Protein. Zusätzlich ist die Erfindung auf isolierte DNAs, die Säugetier LERK-6 kodieren, und auf Expressionsvektoren, die eine cDNA, welche ein Säugetier LERK-6 kodiert, aufweist, gerichtet. Innerhalb des Umfangs dieser Erfindung sind Wirtszellen, die mit Expressionsvektoren, die eine cDNA, die LERK-6 kodiert, aufweisen, transfiziert oder transformiert sind, und Verfahren zum Herstellen von LERK-6 durch Kultivieren solcher Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression von LERK-6 fördern.
Zusätzlich kann das LERK-6 an eine Festphasenmatrix gebunden werden und verwendet werden, um die Zellen, die Hek oder Elk auf ihrer Zelloberfläche exprimieren, affiniitätszureinigen oder zu trennen. Die Erfindung umfasst das Abtrennen der Zellen mit dem Hek oder Elk Rezeptor auf der Oberfläche davon aus einer Mischung von Zellen in Lösung, welches das Inkontaktbringen der Zellen in der Mischung mit einer Kontaktoberfläche mit einem LERK-6 Molekül darauf, und das Trennen der Kontaktoberfläche und der Lösung aufweist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Eine cDNA, die ein murines LERK-6 kodiert, wurde isoliert und ist in SEQ ID NO: 1 offenbart. Für einen Vergleich wurde ein Exon des humanen LERK-6 isoliert und ist in SEQ ID NO: 7 offenbart. Diese Entdeckung einer cDNA, die LERK-6 kodiert, ermöglicht die Konstruktion von Expressionsvektoren, welche cDNAs aufweisen, die LERK-6 kodieren; mit den Expressionsvektoren transfizierte oder transformierte Wirtszellen, biologisch aktives LERK-6 als homogene Proteine; und mit LERK-6 immunreaktive Antikörper.
LERK-6 kann bei der Verstärkung, Stimulierung, Proliferation oder Wachstums von Zellen, die den Hek oder Elk Rezeptor exprimieren, nützlich sein. Da der Hek oder Elk Rezeptor in dem Gewebe des Hirns und der Hoden gefunden wird, ist die Behandlung einer Vielzahl von Zuständen, die mit einer Gewebeschädigung assoziiert sind, möglich. Außerdem kann der Ligand und Rezeptorkomplex in das neurale Wachstum, Entwicklung und/oder Aufrechterhaltung eingebunden sein. Ohne auf diese beschränkt zu sein, sind bestimmte Verwendungen des LERK-6 später beschrieben.
So wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „LERK-6" auf eine Gattung von Polypeptiden, die unabhängig mit Hek oder Elk, die auf T-Zellen und Hirnzellen gefunden werden, binden und komplexieren. Der Begriff „LERK-6" umfasst Polypeptide mit der Aminosäuresequenz 1-184 der SEQ ID NO: 2. Proteine, die durch Nukleinsäuren kodiert sind, die die Nukleinsäure-Sequenz der SEQ ID NO: 7 enthalten, sind für einen Vergleich bereitgestellt. Zusätzlich haben jene LERK-6 Polypeptide, einen hohen Grad an Ähnlichkeit oder einen hohen Grad an Identität mit der Aminosäuresequenz 1-184 der SEQ ID NO: 2, oder der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 8, die für einen Vergleich bereitgestellt ist, und welche Polypeptide biologisch aktiv sind und den Hek oder Elk Rezeptor binden. Zusätzlich bezieht sich der Begriff „murines LERK-6" auf biologisch aktive Genprodukte der DNA der SEQ ID NO: 1. Weiters umfasst durch den Begriff „LERK-6" sind GPI-gebundene Proteine (welche eine extrazelluläre Region und eine C-terminate hydrophobe Region enthalten), und lösliche oder verkürzte Proteine, die hauptsächlich den Rezeptor-bindenden Abschnitt des Proteins aufweisen, die biologische Aktivität beibehalten und in der Lage sind, sezerniert zu werden. Spezifische Beispiele von solchen löslichen Proteinen sind jene, die die Sequenz der Aminosäuren 1 (Ala)-145 (Asn) der SEQ ID NO: 2 aufweisen.
Der Begriff „Hek/Elk" bedeutet entweder Hek oder Elk oder Beides, Hek und Elk. Zum Beispiel bezieht sich der Begriff „Anti-Hek/Elk-Antikörper" auf Antikörper gegen entweder Hek oder Elk. Der Begriff „Hek/Elk-exprimierende Zellen" bezieht sich auf Zellen, die entweder den Hek-Rezeptor oder den Elk-Rezeptor exprimieren, oder auf Zellen, die sowohl den Hek- als auch den Elk-Rezeptor exprimieren.
Der Begriff „biologisch aktiv", wie er sich auf LERK-6 bezieht, bedeutet, dass das LERK-6 in der Lage ist, an Hek/Elk zu binden.
„Isoliert" bedeutet, dass LERK-6 frei von einer Assoziation mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ist, zum Beispiel als ein Reinigungsprodukt von rekombinanten Wirtszellkulturen oder als ein gereinigter Extrakt.
Eine „LERK-6-Variante", so wie hierin angeführt, ist ein Polypeptid, das im Wesentlichen zu einem nativen LERK-6 homolog ist, das aber eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von jener eines nativen LERK-6 (human, murin oder anderen Säugetierspezies) aufgrund einer oder mehrerer Deletionen, Insertionen oder Substitutionen unterscheidet. Die variante Aminosäuresequenz ist vorzugsweise zumindest zu 80% identisch mit einer nativen LERK-6 Aminosäuresequenz, am bevorzugtesten zu mindestens 90 % identisch. Die prozentuelle Identität kann, zum Beispiel, durch Vergleichen der Sequenzinformation unter Verwendung des GAP Computer Programms, Version 6,0, bestimmt werden, welches von Devereux et al. (Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) beschrieben ist und von der University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWGCG) erhältlich ist. Die bevorzugten Standardparameter für das GAP-Programm schließen ein: (1) eine unäre Vergleichsmatrix (die einen Wert von 1 für Identitäten und 0 für Nicht-Identitäten enthält) für Nukleotide und die gewichtete Vergleichsmatrix von Gribskov und Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, wie von Schwanz und Dayhoff, Hrsg., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353–358, 1979, beschrieben; (2) eine Strafe von 3,0 für jede Lücke und eine zusätzliche Strafe von 0,10 für jedes Symbol in jeder Lücke; und (3) keine Strafe für Endlücken. Varianten können konservativ substituierte Sequenzen enthalten, das heißt, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Rest ersetzt wird, der ähnliche physiochemische Eigenschaften aufweist. Beispiele für konservative Substitutionen schließen die Substitution eines aliphatischen Rests durch einen anderen, wie beispielsweise Ile, Val, Leu oder Ala durch einen anderen, oder Substitutionen eines polaren Rests durch einen anderen, wie zum Beispiel zwischen Lys und Arg; Glu und Asp; oder Gln und Asn ein. Andere konservative Substitutionen dieser Art, zum Beispiel Substitutionen ganzer Regionen mit ähnlichen Hydrophobizitätseigenschaften sind weithin bekannt. Natürlich vorkommende LERK-6 Varianten oder Allele sind ebenfalls durch die Erfindung umfasst. Beispiele von solchen Varianten sind Proteine, die von abwechselnden mRNA Spleißvorgängen oder von der proteolytischen Spaltung des LERK-6 Proteins herrühren, wobei die LERK-6 Bindungseigenschaft aufrechterhalten wird. Abwechselndes Spleißen von mRNA kann ein verkürztes, jedoch biologisch aktives LERK-6 Protein ergeben, wie zum Beispiel eine natürlich vorkommende, lösliche Form des Proteins. Zu Variationen, die der Proteolyse zugeschrieben werden können, zählen, zum Beispiel, Unterschiede in den N- oder C-Termini bei der Expression in unterschiedlichen Arten von Wirtszellen, aufgrund der proteolytischen Entfernung von einer oder mehreren terminalen Aminosäuren von dem LERK-6 Protein (im Allgemeinen von 1-5 terminalen Aminosäuren).
Es wird vorausgesagt, dass LERK-6 an die Zelloberfläche über Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-Bindungen verankert wird. GPI Membrananker, einschließlich der chemischen Struktur und deren Bearbeitung, sind in Ferguson, M. und Williams, A., Ann. Rev. Biochem., 57:285, 1988 (hierin durch Bezugsnahme aufgenommen) beschrieben. Wenn anfänglich exprimiert, weisen bestimmte Proteine eine C-terminale hydrophobe Domäne auf, die Signale für das GPI-Ankern enthalten. Eine Spaltungsstelle ist stromaufwärts, häufig etwa 10-12 Aminosäuren stromaufwärts des N-Terminus der hydrophoben Domäne lokalisiert. Die post-translationale Bearbeitung umfasst die Spaltung des Proteins an dieser Spaltungsstelle. Ein GPI-Anker heftet sich an die neu-freigelegte C-terminale Aminosäure des bearbeiteten, reifen Proteins an. Wenn LERK-6 Proteine in Zellen, die GPI-Ankersignale in der hydrophoben Domäne erkennen, exprimiert werden, dann stellt die Aminosäuresequenz voller Länge der SEQ ID NO: 2 somit Vorläuferformen des Proteins dar.
Basierend auf Konsensussequenzen, die von anderen GPI-verankerten Proteinen abgeleitet sind, ist die hydrophobe Region in LERK-6 der vorliegenden Erfindung wahrscheinlich zwischen den Aminosäuren 170 (Leu) und 184 (Ser) und umfasst diese. Zwischen der hydrophoben Domäne und der Rezeptor-Bindungsdomäne ist eine Spacer-Region mit einer Länge von etwa 22 bis 25 Aminosäuren. Die Spacer-Region erstreckt sich von etwa Aminosäure 145 (Asn), 146 (Glu) oder 147 (Thr) bis zu etwa der Aminosäure 169 (His).
Beispiel 3 beschreibt die Konstruktion eines neuartigen hek:Fc Fusionproteins, dass für das Screenen auf LERK-6 ausgenutzt werden kann. Andere Antikörper Fc-Regionen können durch die humane IgG1 Fc Region, wie in dem Beispiel beschrieben, ersetzt werden. Andere geeignete Fc-Regionen sind jede, die mit hoher Affinität an Protein A oder Protein G binden können, und umfassen die Fc-Region von humanem IgG1 oder Fragmente der humanen oder murinen IgG1-Fc-Region, z.B., Fragmente, welche zumindest die Hinge-Region aufweisen, sodass sich Interketten-Disulfidbindungen ausbilden. Das hek:Fc-Fusionsprotein bietet den Vorteil, leicht gereinigt werden zu können. Zusätzlich erzeugen Disulfidbindungen, die sich zwischen den Fc-Regionen von zwei getrennten Fusionsprotein-Ketten bilden, Dimere.
Wie oben beschrieben ist, ist ein Aspekt der Erfindung lösliche LERK-6 Polypeptide. Lösliche LERK-6-Polypeptide enthalten die gesamte oder einen Teil der extrazellulären Domäne eines nativen LERK-6, es fehlt ihnen jedoch das GPI-Signal, welches die Retention des Polypeptids auf einer Zellmembran bewirken würde. Lösliche LERK-6-Polypeptide enthalten vorteilhafterweise das native (oder ein heterologes) Signalpeptid, wenn sie anfangs synthetisiert werden, um Sekretion zu fördern, aber das Signalpeptid wird bei der Sekretion von LERK-6 aus der Zelle abgespalten. Die löslichen LERK-6-Polypeptide, die durch die Erfindung umfasst sind, behalten die Fähigkeit, den Hek- oder Elk-Rezeptor zu binden. Lösliches LERK-6 kann auch einen Teil des GPI-Signals oder einen Teil der cytoplasmatischen Domäne oder anderer Sequenzen einschließen, vorausgesetzt, dass das lösliche LERK-6 Protein sezerniert werden kann.
Lösliches LERK-6 kann durch Trennen intakter Zellen, welche das gewünschte Protein exprimieren, von dem Kulturmedium, z.B. durch Zentrifugation, und durch Überprüfen des Mediums (Überstand) auf die Gegenwart des gewünschten Proteins identifiziert (und von seinen nicht-löslichen membrangebundenen Gegenstücken unterschieden) werden. Die Gegenwart von LERK-6 im Medium zeigt, dass das Protein aus den Zellen ausgeschieden wurde und somit eine lösliche Form des gewünschten Proteins ist.
Lösliche Formen von LERK-6 besitzen viele Vorteile gegenüber dem nativ-gebundenen LERK-6 Protein. Die Reinigung der Proteine aus rekombinanten Wirtszellen wird erleichtert, da die löslichen Proteine aus den Zellen ausgeschieden werden. Ferner sind lösliche Proteine im Allgemeinen für eine intravenöse Verabreichung besser geeignet.
Beispiele für lösliche LERK-6 Polypeptide schließen jene ein, die einen Wesentlichen Teil der extrazellulären Domäne eines nativen LERK-6-Proteins enthalten. Ein Beispiel eines löslichen murinen LERK-6-Proteins enthält die Aminosäuren 1 bis 145 von SEQ ID NO:2. Zusätzlich sind verkürzte lösliche LERK-6 Proteine, die weniger als die gesamte extrazelluläre Domäne aufweisen, in der Erfindung eingeschlossen. Wenn es anfangs innerhalb einer Wirtszelle exprimiert wird, kann das lösliche LERK-6 zusätzlich eines der unten beschriebenen heterologen Signalpeptide aufweisen, das innerhalb der verwendeten Wirtszelle funktional ist.
Alternativ dazu kann das Protein das native Signalpeptid aufweisen. In einer Ausführungsform der Erfindung kann lösliches LERK-6 als ein Fusionsprotein exprimiert werden, welches (vom N- zum C-Terminus) das Hefe-α-Faktor-Signalpeptid, ein FLAG^® Peptid, welches unten und im U.S. Patent Nr. 5.011.912 beschrieben ist, und lösliches LERK-6, welches aus den Aminosäuren 1-134 der SEQ ID NO: 2 besteht, aufweist. Dieses rekombinante Fusionsprotein wird in Hefezellen exprimiert und von diesen sezerniert. Das FLAG^® Peptid erleichtert die Reinigung des Proteins, und können im Anschluss von dem löslichen LERK-6 unter Verwendung von boviner mucosaler Enterokinase abgespalten werden. Isolierte DNA Sequenzen, die lösliche LERK-6 Proteine kodieren, sind durch die Erfindung umfasst.
Verkürztes LERK-6, einschließlich löslicher Polypeptide, kann durch eine von einer Reihe von herkömmlichen Techniken hergestellt werden. Eine gewünschte DNA-Sequenz kann unter Anwendung bekannter Techniken chemisch synthetisiert werden. DNA-Fragmente können auch durch Restriktionsendonuklease-Digestion einer klonierten DNA-Sequenz voller Länge hergestellt und durch Elektrophorese auf Agarose-Gelen isoliert werden. Linker, die Restriktionsendonukleose-Spaltungsstelle(n) enthalten, können eingesetzt werden, um das gewünschte DNA Fragment in einen Expressionsvektor einzuführen, oder das Fragment kann an den Spaltungsstellen, die natürlich darin vorhanden sind, verdaut werden. Das weithin bekannte Polymerasekettenreaktionsverfahren kann ebenfalls angewendet werden, um eine DNA-Sequenz, die ein gewünschtes Proteinfragment kodiert, zu amplifizieren. Als weitere Alternative können bekannte Mutagenesetechniken angewendet werden, um ein Stopp-Codon an einem gewünschten Punkt einzufügen, z.B. unmittelbar stromabwärts des Codons für die letzte Aminosäure der Rezeptor-Bindungsdomäne.
Wie oben erwähnt ist, bietet die Erfindung isolierte oder homogene LERK-6 Polypeptide, sowohl rekombinant als auch nicht-rekombinant. Varianten und Derivate von nativen LERK-6 Proteinen, die die gewünschte biologische Aktivität (z.B. die Fähigkeit, Hek/Elk zu binden) beibehalten, können durch Mutationen von Nukleotidsequenzen erhalten werden, die native LERK-6-Polypeptide kodieren. Änderungen der nativen Sequenz können durch eine beliebige von einer Reihe von bekannten Techniken erzielt werden. Mutationen können an bestimmten Stellen durch das Synthetisieren von Oligonukleotiden eingefügt werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, flankiert von Restriktionsstellen, welche die Ligation an Fragmente der nativen Sequenz ermöglichen. Nach der Ligation kodiert die resultierende rekonstruierte Sequenz ein Analogon, das die gewünschte Aminosäure-Insertion, Substitution oder Deletion aufweist.
Alternativ dazu können Oligonukleotid-gerichtete, ortsspezifische Mutageneseverfahren angewendet werden, um ein geändertes Gen bereitzustellen, wobei vorbestimmte Kondons durch Substitution, Deletion oder Insertion geändert werden können. Beispielhafte Verfahren zur Durchführung der oben genannten Änderungen werden von Walder et al. (Gene 42:133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, Januar 1985, 12–19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); und in den US-Patentschriften Nr. 4,518,584 und 4,737,462 offenbart.
LERK-6 kann modifiziert werden, um LERK-6-Derivate durch Bilden kovalenter oder aggregierender Konjugate mit anderen chemischen Anteilen wie Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphaten, Acetylgruppen und dergleichen zu erzeugen. Kovalente Derivate von LERK-6 können durch Verknüpfen der chemischen Anteile zu funktionellen Gruppen auf LERK-6-Aminosäure-Seitenketten oder am N-Terminus oder C-Terminus eines LERK-6-Polypeptids oder der extrazellulären Domäne davon hergestellt werden. Andere Derivate von LERK-6, die innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung liegen, schließen kovalente oder aggregierende Konjugate von LERK-6 oder seinen Fragmenten mit anderen Proteinen oder Polypeptiden ein, wie zum Beispiel durch Synthese in rekombinanter Kultur als N-terminale oder C-terminate Fusionen. Zum Beispiel kann das Konjugat eine Signal- oder Leader-Polypeptidsequenz (z.B. den α-Faktor-Leader von Saccharomyces) am N-Terminus eines LERK-6-Polypeptids enthalten. Das Signal- oder Leader-Peptid lenkt den Transfer des Konjugats co-translational oder post-translational von seiner Synthesestelle zu einer Stelle innerhalb oder außerhalb der Zellmembran oder Zellwand.
LERK-6-Polypeptidfusionen können Peptide aufweisen, welche hinzugefügt werden, um die Reinigung und Identifikation von LERK-6 zu erleichtern. Zu solchen Peptiden zählen zum Beispiel poly-His oder die antigenen Identifikationspeptide, die in der US-Patentschrift Nr. 5,011,912 und in Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988 beschrieben sind.
Die Erfindung schließt ferner LERK-6-Polypeptide mit oder ohne dazugehörige Glycosylierung mit nativem Muster ein. LERK-6, das in Hefe oder Säugetier-Expressionssystemen (z.B. COS-7-Zellen) exprimiert ist, kann einem nativen LERK-6 Polypeptid in Bezug auf das Molekulargewicht und das Glycosylierungsmuster ähnlich sein oder sich von diesem deutlich unterscheiden, je nachdem, welches Expressionssystem gewählt wurde. Die Expression von LERK-6-Polypeptiden in bakteriellen Expressionssystemen, wie E. coli, stellt nicht-glycosylierte Moleküle bereit.
Äquivalente DNA Konstrukte, die verschiedene Additionen oder Substitutionen von Aminosäureresten oder Sequenzen, oder Deletionen von terminalen oder internen Resten oder Sequenzen kodieren, die für die biologische Aktivität oder Bindung nicht benötigt werden, sind durch die Erfindung umfasst. Zum Beispiel, können N-Glycosylierungsstellen in der LERK-6 extrazellulären Domäne modifiziert werden, um Glycosylierung auszuschließen, was die Expression eines reduzierten Kohlenhydrat-Analogons in Säugetier- und Hefeexpressionssystemen ermöglicht. N-Glycosylierungsstellen in eukaryotischen Polypeptiden sind durch eine Aminosäure-Dreiergruppe Asn-X-Y gekennzeichnet, wobei X irgendeine Aminosäure mit Ausnahme von Pro ist, und Y für Ser oder Thr steht. Das murine LERK-6 Protein weist drei solcher Dreiergruppen bei den Aminosäuren 13-15, 145-147 und 159-161 der SEQ ID NO: 2 auf. Geeignete Substitutionen, Additionen oder Deletionen an der Nukleotidsequenz, welche diese Dreiergruppen kodiert, führen zu der Verhinderung des Anheftens von Kohlenhydratresten an die Asn-Seitenkette. Eine Änderung eines einzelnen Nukleotids, die so gewählt wird, dass Asn durch eine andere Aminosäure ersetzt wird, ist zum Beispiel ausreichend, um eine N-Glycosylierungsstelle zu inaktivieren. Bekannte Verfahren für das Inaktivieren von N-Glycosylierungsstellen in Proteinen schließen jene Verfahren ein, die in der US-Patentschrift 5,071,972 und in EP 276,846 beschrieben sind.
In einem anderen Beispiel können Sequenzen, die Cys-Reste kodieren, die für die biologische Aktivität nicht wesentlich sind, geändert werden, um zu bewirken, dass die Cys-Reste entfernt oder durch andere Aminosäuren ersetzt werden, wodurch die Bildung von inkorrekten intramolekularen Disulfidbrücken bei Renaturierung verhindert wird. Andere Äquivalente werden durch Modifikation von benachbarten zweibasischen Aminosäureresten hergestellt, um die Expression in Hefesystemen zu verstärken, in denen KEX2-Proteaseaktivität vorhanden ist. EP 212,914 offenbart die Verwendung von ortsspezifischer Mutagenese, um KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen in einem Protein zu inaktivieren. KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen werden durch Entfernen, Hinzufügen oder Ersetzen von Resten inaktiviert, um Arg-Arg, Arg-Lys und Lys-Arg-Paare zu ändern und so das Auftreten dieser benachbarten basischen Reste zu beseitigen. Lys-Lys-Paare sind weitaus weniger anfällig für KEX2-Spaltung, und die Umwandlung von Arg-Lys oder Lys-Arg in Lys-Lys stellt einen konservativen und bevorzugten Ansatz für das Inaktivieren von KEX2-Stellen dar. Das murine LERK-6 enthält eine KEX2-Proteaseverarbeitungsstellen bei den Aminosäuren 81-82 der SEQ ID NO: 2.
Nukleinsäuresequenzen innerhalb des Umfangs der Erfindung umfassen isolierte DNA und RNA Sequenzen, die an die hierin offenbarten LERK-6 Nukleotidsequenzen unter Bedingungen mäßiger Stringenz oder hoher Stringenz hybridisieren und die biologisch aktives LERK-6 kodieren. Bedingungen mäßiger Stringenz, wie in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Band 1, S. 101–104, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) definiert sind, umfassen die Verwendung einer Vorwaschlösung von 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0) und Hybridisierungsbedingungen von etwa 55°C, 5X SSC, über Nacht. Bedingungen hoher Stringenz umfassen höhere Temperaturen von Hybridisierung und Waschung. Der Fachmann wird erkennen, dass die Temperatur und Waschlösung-Salzkonzentration eingestellt werden können, wie gemäß von Faktoren, wie der Länge des Nukleinsäuremoleküls notwendig ist.
Aufgrund der bekannten Degeneration des genetischen Codes kann mehr als ein Codon dieselbe Aminosäure kodieren, somit kann eine DNA-Sequenz von der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 7, welche für einen Vergleich bereitgestellt ist, abweichen und dennoch ein LERK-6 mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 8, welche für einen Vergleich bereitgestellt ist, kodieren. Solche abweichenden DNA-Sequenzen können aus stillen Mutationen resultieren (z.B. die während der PCR-Amplifikation auftreten), oder können das Produkt einer vorsätzlichen Mutagenese einer nativen Sequenz sein.
Die Erfindung bietet äquivalente isolierte DNA Sequenzen, die biologisch aktives LERK-6 kodieren, die ausgewählt sind aus: (a) cDNA, welche die Nukleotidsequenz die in SEQ ID NO: 1 dargestellt ist, aufweist; (b) DNA, die in der Lage ist, an eine DNA von (a) unter mäßig stringenten Bedingungen zu hybridisieren und, die biologisch aktives LERK-6 kodiert; und (c) DNA, die als Folge des genetischen Kodes zu einer DNA degeneriert ist, die in (a), oder (b) definiert ist und die biologisch aktives LERK-6 kodiert. LERK-6 Proteine, die durch solche DNA äquivalente Sequenzen kodiert sind, sind durch die Erfindung umfasst. Für einen Vergleich ist die cDNA, die die Nukleotidsequenz aufweist, die in SEQ ID NO: 7 dargestellt ist, bereitgestellt.
DNAs, die Äquivalente zu der DNA Sequenz der SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 7, welche für einen Vergleich bereitgestellt ist, sind, werden unter mäßig und hohen stringenten Bedingungen an DNA Sequenzen hybridisieren, die Polypeptide kodieren, die die Aminosäuren 1-184 der SEQ ID NO: 2 oder SEQ ID NO: 8, welche für einen Vergleich bereitgestellt ist, aufweisen. Beispiele von LERK-6 Proteine, die durch solche DNA kodiert sind, umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein, LERK-6 Fragmente (lösliche oder GPI-gebundene) und LERK-6 Proteine, die inaktivierte N-Glycosylierungsstellen, inaktiverte KEX2 Protease Bearbeitungsstellen, oder konservative Aminosäure-Substitutionen, wie oben beschrieben, aufweisen. LERK-6 Proteine, die durch DNA kodiert sind, die von anderen Säugetier Spezies abgeleitet sind, wobei die DNA an die cDNA der SEQ ID NO: 1, oder der SEQ ID NO: 7 hybridisieren werden, sind ebenfalls umfasst. LERK-6 Proteine, die durch DNA kodiert sind, die von anderen Säugetier Spezies abgeleitet sind, wobei die DNA an die cDNA der SEQ ID NO: 7 hybridisieren werden, sind für einen Vergleich bereitgestellt.
Varianten, welche die erforderliche Fähigkeit zum Binden von Elk- oder Hek-Rezeptor aufweisen, können durch einen beliebigen, geeigneten Test ermittelt werden. Die biologische Aktivität von LERK-6 kann zum Beispiel durch Kompetition der Bindung der Ligandenbindungsdomäne des Hek/Elk-Rezeptors bestimmt werden (z.B. Konkurrenzbindungsuntersuchungen).
Eine Art einer Konkurrenzbindungsuntersuchung für ein LERK-6 Polypeptid verwendet ein radiomarkiertes, lösliches LERK-6 und intakte Hek/Elk-exprimierende Zellen. Anstelle von intakten Zellen könnten lösliche Hek/Elk:Fc Fusionsproteine (wie ein Hek:Fc oder Elk:Fc Fusionprotein), welche an eine Festphase durch die Interaktion eines Protein A, Protein G oder eines Antikörpers an die Hek, Elk oder Fc-Abschnitte des Molkeüls gebunden sind, mit der Fc-Region des Fusionsproteins substituiert werden. Eine andere Art von Konkurrenzbindungsuntersuchung benutzt radiomarkierte, lösliche Hek oder Elk-Rezeptoren, wie ein Hek:Fc oder Elk:Fc Fusionsprotein, und intakte Zellen, die LERK-6 exprimieren.
Konkurrenzbindungsuntersuchungen können durch Folgen einer tierkömmlichen Methodologie durchgeführt werden. Zum Beispiel kann radiomarkiertes LERK-6 verwendet werden, um mit einem mutmaßlichen LERK-6 Homologon zu konkurrieren, um die Bindungsaktivität gegen Oberflächen-gebundenes Hek/Elk zu untersuchen. Qualitative Ergebnisse können durch kompetitive autoradiographische Plattenbindungsuntersuchungen erhalten werden, oder Scatchard-Diagramme können benutzt werden, um quantitative Ergebnisse zu erzeugen.
Alternativ können Hek/Elk-Bindungsproteine, wie LERK-6 und Anti-Hek/Elk-Antikörper, an eine Festphase, wie eine Säulenchromatographie-Matrix oder ein ähnliches Substrat, das für das Identifizieren, Trennen oder Reinigen von Zellen, die Hek/Elk auf ihrer Oberfläche exprimieren, geeignet sind, gebunden werden. Die Bindung eines Hek/Elk-Bindungsproteins an eine Festphase-Kontaktoberfläche kann durch jedes Mittel erreicht werden, zum Beispiel, durch Konstruieren eines LERK-6:Fc-Fusionsproteins und die Bindung eines solchen, an die Festphase durch die Interaktion von Protein A oder Protein G. Verschiedene andere Mittel zum Fixieren von Proteinen auf einer Festphase sind im Stand der Technik bekannt und sind für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet. Zum Beispiel können magnetische Mikrokügelchen mit LERK-6 beschichtet werden und in dem Inkubationsgefäß durch ein Magnetfeld gehalten werden. Suspensionen von Zellmischungen, die Hek/Elk-exprimierende Zellen enthalten, können mit der Festphase, die LERK-6 Polypeptide darauf aufweist, kontaktiert werden. Zellen mit Hek/Elk auf ihrer Oberfläche binden an das fixierte LERK-6 und ungebundene Zellen werden dann weggewaschen. Dieses Affinitätsbindungsverfahren ist für das Reinigen, Screenen oder Trennen solcher Hek/Elk-exprimierenden Zellen aus Lösung nützlich. Verfahren zum Freisetzten von positiv-ausgewählten Zellen von der Festphase sind im Stand der Technik bekannt und umfassen, zum Beispiel, die Verwendung von Enzymen. Solche Enzyme sind vorzugsweise für die Zellen nicht toxisch und nicht-schädlich und sind vorzugsweise auf das Spalten des Zelloberflächen-Bindungspartner gerichtet. In dem Fall von Hek/Elk:LERK-6 Interaktionen würde das Enzym vorzugsweise den Hek/Elk-Rezeptor spalten, dadurch Befreien der resultierenden Zellsuspension von dem „fremden" LERK-6 Material. Die gereinigte Zellpopulation, insbesondere wenn von fötalen Gewebe erhalten, kann dann verwendet werden, um reife (Erwachsenen) Gewebe erneut zu besiedeln. Zum Beispiel können solch gereinigte neurale Zellen an einem Patienten mit einer neurodegenerativen Krankheit, wie Parkinson Krankheit, Alzheimer Krankheit, Lou Gehrig Krankheit, etc. verabreicht werden.
Alternativ können Mischungen von Zellen, die verdächtig werden, Hek/Elk⁺ Zellen zu enthalten, zuerst mit biotinyliertem LERK-6 inkubiert werden. Die Inkubationsperioden sind typischerweise zumindest eine Stunde lang, um eine ausreichende Bindung an Hek/Elk sicherzustellen. Die resultierende Mischung wird dann durch eine Säule, die mit Avidin-beschichteten Kügelchen gepackt ist, geleitet, wodurch die hohe Affinität von Biotin für Avidin die Bindung der Zellen an die Kügelchen bereitstellt. Die Verwendung von Avidin-beschichteten Kügelchen ist im Stand der Technik bekannt. Siehe Berenson, et al., J. Cell. Biochem., 10D:239 (1986). Das Waschen von ungebundenem Material und die Freisetzung von gebundenen Zellen werden unter Verwendung von herkömmlichen Verfahren durchgeführt.
Wie oben beschrieben kann LERK-6 verwendet werden, um Zellen, die Hek/Elk exprimieren, zu trennen. Bei einem alternativen Verfahren kann LERK-6 oder eine extrazelluläre Domäne oder ein Fragment davon an einen detektierbaren Anteil, wie ¹²⁵I konjugiert werden, um Hek/Elk-exprimierende Zellen zu detektieren. Die Radiomarkierung mit ¹²⁵I kann durch jede von vielen Standardmethodologien durchgeführt werden, die ein funktionelles ¹²⁵I-LERK-6 Molekül ergeben, das mit einer hochspezifischen Aktivität markiert ist. Oder ein iodinierter oder biotinylierter Antikörper gegen die Hek/Elk-Region oder die Fc-Region des Moleküls könnte verwendet werden. Ein anderer detektierbarer Anteil, wie ein Enzym, das eine kolorimetrische oder fluorometrische Reaktion katalysieren kann, Biotin oder Avidin kann verwendet werden. Zellen, die auf Hek/Elk-Expression untersucht werden, können mit markiertem LERK-6 in Kontakt gebracht werden. Nach der Inkubation wird ungebundenes, markiertes LERK-6 entfernt und die Bindung wird unter Verwendung des nachweisbaren Anteils gemessen.
Die Bindungseigenschaften von LERK-6 (einschließlich von Varianten) können ebenfalls unter Verwendung des konjugierten, löslichen Hek/Elk (zum Beispiel, ¹²⁵I-Hel/Elk:Fc) in Konkurrenzuntersuchungen, ähnlich zu den oben beschriebenen, bestimmt werden. In diesem Fall werden jedoch intakte Zellen, die Hek/Elk exprimieren und an ein festes Substrat gebunden sind, verwendet, um das Ausmaß zu messen, zu welchem eine Probe, die eine mutmaßliche LERK-6 Variante enthält, um die Bindung mit einem konjugiertem, einem löslichen Hek/Elk an LERK-6 konkurriert.
Andere Mittel zum Untersuchen für LERK-6 beinhalten die Verwendung von Anti-LERK-6 Antikörper, Zelllinien, die auf Reaktion zu LERK-6 proliferieren, oder rekombinante Zelllinien, die Hek/Elk exprimieren und in der Gegenwart von LERK-6 proliferieren.
Die hierin offenbarten LERK-6-Proteine können auch verwendet werden, um die biologische Aktivität von Elk- oder Hek-Proteinen im Hinblick auf ihre Bindungsaffinität für LERK-6 zu messen. Zum Beispiel kann LERK-6 dazu verwendet werden, um zu bestimmen, ob die biologische Aktivität nach der Modifikation eines Elk- oder Hek-Proteins beibehalten wird (z.B. chemische Modifikation, Stutzen, Mutation usw.). Die biologische Aktivität eines Elk- oder Hek-Proteins kann somit ermittelt werden bevor dieses zum Beispiel in einer Forschungsstudie oder möglicherweise in der Klinik verwendet wird.
LERK-6-Proteine finden als Reagens Anwendung, das von den Verantwortlichen für „Qualitätssicherungsstudien" eingesetzt werden kann, z.B. um die Haltbarkeit und Stabilität des Elk-Proteins unter verschiedenen Bedingungen zu überwachen. Zur Veranschaulichung sei angemerkt, dass LERK-6 in einer Bindungsaffinitätsstudie eingesetzt werden kann, um die biologische Aktivität eines Elk-Proteins zu messen, das bei unterschiedlichen Temperaturen gelagert oder in verschiedenen Zelltypen hergestellt wurde. Die Bindungsaffinität des modifizierten Elk-Proteins für LERK-6 wird mit jener eines unmodifizierten Elk-Proteins verglichen, um etwaige negative Auswirkungen der Modifikationen auf die biologische Aktivität von Elk festzustellen. Ebenso kann die biologische Aktivität eines Hek-Proteins mit Hilfe von LERK-6 ermittelt werden.
LERK-6 Polypeptide finden auch als Träger Anwendung, um Wirkstoffe, die daran angeheftet sind, an Zellen zu liefern, die den Elk- oder Hek-Zelloberflächenrezeptor tragen. Die Expression von Hek-Antigen wurde bei bestimmten leukämischen Zelllinien beobachtet, einschließlich der humanen T-Zell-Leukämiezelllinie, die als JM bezeichnet ist, und der humanen prä-B-Zell-Leukämiezelllinie, die als LK63 bezeichnet ist (Boyd et al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992, und Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1611, 1992). LERK-6 Proteine können somit verwendet werden, um diagnostische oder therapeutische Wirkstoffe im Rahmen von in vitro oder in vivo Verfahren zu diesen Zellen zu liefern (oder zu anderen Zelltypen, bei denen festgestellt wurde, dass sie Hek auf der Zelloberfläche exprimieren).
Ein Beispiel einer solchen Verwendung besteht darin, eine Hek⁺ oder Elk⁺ leukämische Zelllinie einem therapeutischen Wirkstoff/LERK-6-Konjugat auszusetzen, um festzustellen, ob der Wirkstoff gegenüber den Leukämiezellen Cytotoxizität aufweist. Eine Reihe von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen, die an LERK-6 angeheftet sind, können in einen Test aufgenommen werden, um den cytotoxischen Effekt der Wirkstoffe auf die Leukämiezellen zu detektieren und zu vergleichen. LERK- 6/Diagnosewirkstoff-Konjugate können verwendet werden, um die Gegenwart von Hek⁺-Zellen in vitro oder in vivo zu erfassen.
Diagnostische und therapeutische Wirkstoffe, die an ein LERK-6-Polypeptid angeheftet werden können, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Medikamente, Toxine, Radionuklide, Chromophore, Enzyme, die eine colorimetrische oder fluorimetrische Reaktion katalysieren, und dergleichen ein, wobei der jeweilige Wirkstoff gemäß der beabsichtigten Anwendung ausgewählt wird. Beispiele für Medikamente sind solche, die in der Behandlung von verschiedenen Krebsformen verwendet werden, z.B. Stickstoffloste wie L-Phenylalaninstickstofflost oder Cyclophosphamid, interkalierende Wirkstoffe wie cis-Diaminodichloroplatin, Antimetabolite wie 5-Fluoruracil, Vinca-Alkaloide wie Vincristin und Antibiotika wie Bleomycin, Doxorubicin, Daunorubicin und Derivate davon. Zu den Toxinen zählen Ricin, Abrin, Diptheria-Toxin, Pseudomonas aeruginosa Exotoxin A, ribosomale deaktivierende Proteine, Mycotoxine wie Trichothecene und Derivate und Fragmente (z.B. einzelne Ketten) davon. Zu den Radionukliden, die für eine diagnostische Verwendung geeignet sind, zählen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹²³I, ¹³¹I, ^99mTc, ¹¹¹In und ⁷⁶Br. Radionuklide, die für eine therapeutische Verwendung geeignet sind, schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – ¹³¹I, ²¹¹At, ⁷⁷Br, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ²¹²Pb, ²¹²Bi, ¹⁰⁹Pd, ⁶⁴Cu und ⁶⁷Cu ein.
Solche Wirkstoffe können an LERK-6 mit Hilfe eines beliebigen, geeigneten, herkömmlichen Verfahrens angeheftet werden. Da es sich bei LERK-6 um ein Protein handelt, enthält es funktionelle Gruppen auf Aminosäure-Seitenketten, die mit funktionellen Gruppen auf einem gewünschten Wirkstoff zum Reagieren gebracht werden können, um zum Beispiel kovalente Bindungen zu bilden. Alternativ dazu können das Protein oder der Wirkstoff derivatisiert werden, um eine gewünschte reaktive funktionelle Gruppe zu erzeugen oder anzuheften. Die Derivatisierung kann das Anheften von einem der bifunktionellen Kopplungsreagenzien einschließen, die für das Heften verschiedener Moleküle an die Proteine zur Verfügung stehen (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois). Es ist eine Reihe von Techniken für die radioaktive Markierung von Proteinen bekannt. Radionuklidmetalle können zum Beispiel durch einen geeigneten bifunktionellen chelatisierenden Wirkstoff an LERK-6 geheftet werden.
Somit werden Konjugate, die LERK-6 und einen geeigneten diagnostischen oder therapeutischen Wirkstoff (vorzugsweise kovalent verbunden) enthalten, zubereitet. Die Konjugate werden in einer Menge verabreicht oder auf andere Weise verwendet, die für die jeweilige Anwendung geeignet ist.
Eine weitere Verwendung des LERK-6 der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung als ein Forschungswerkzeug für die Untersuchung der Rolle, die LERK-6 in Verbindung mit Elk oder Hek beim Wachstum oder der Differenzierung von Zellen spielen kann, welche den Elk- oder Hek-Rezeptor tragen. Die LERK-6-Polypeptide der vorliegenden Erfindung können auch bei in vitro Tests zum Erfassen von Elk oder LERK-6 oder Interaktionen davon verwendet werden. Ebenso findet LERK-6 in Tests für Hek oder die Interaktion von LERK-6 mit Hek Anwendung.
Wie oben besprochen, wurden bei der Analyse von verschiedenen Rattengeweben in Bezug auf Elk-mRNA Transkripte nur im Gehirn und in Hoden entdeckt (Lhotak et al., supra). Es wird angenommen, dass das Binden von LERK-6 an Eph-verwandte Rezeptoren auf neuralem Gewebe eine neuroprotektive oder neurotrophe Wirkung ausübt.
LERK-6 findet Anwendung als ein Gewebekulturreagens. Ein LERK-6-Protein kann zu Neuronen hinzugefügt werden, die in vitro gezüchtet werden, um die Überlebensfähigkeit zu stärken oder die Lebensdauer der gezüchteten Neurone zu verlängern, wodurch Forschungsstudien von neuralem Gewebe und möglische klinische Behandlung von neuralem Gewebe erleichtert werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Behandeln von Störungen des neuralen Gewebes, dass das In-Kontakt-Bringen des neuralen Gewebes mit LERK-6 involviert. Zu solchen Erkrankungen gehören Verletzungen oder neurologische Erkrankungen, die chronischer oder akuter Natur sein können. Ein LERK-6-Protein kann einem Säugetier verabreicht werden, um eine solche Verletzung oder Erkrankung zu behandeln. LERK-6 wird bei einer Ausführungsform der Erfindung bei der Behandlung von neurodegenerativen Leiden eingesetzt, die zumindest teilweise durch den Mechanismus des neuralen Todes, der als Excitotoxizität bekannt ist, gekennzeichnet sind oder vermittelt werden. Außerdem kann LERK-6 einem Säugetier verabreicht werden, um eine trophe Wirkung auf neurales Gewebe auszuüben. Bei einem Patienten, der aufgrund einer Verletzung oder Erkrankung unter einem Verlust oder einer Schädigung von Neuronen leidet, kann LERK-6 die Lebensfähigkeit der Neuronen, die überlebt haben, stärken.
LERK-6 Polypeptide der Erfindung können in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren, die verwendet werden, um pharmazeutisch nützliche Zusammensetzungen herzustellen, formuliert werden. LERK-6 können in Beimengungen, entweder als das einzige aktive Material oder mit anderen bekannten aktiven Materialien, mit pharmazeutisch geeigneten Verdünnungsmitteln (z.B., Tris-HCl, Acetat, Phosphat), Konservierungsmitteln (z.B. Thimerosal, Benzylalkohol, Parabene), Emulgatoren, Solubilisatoren, Adjuvanzien und/oder Träger kombiniert werden. Geeignete Träger und ihre Formulierungen sind in Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. Ausgabe, 1980, Mack Publishing Co. beschrieben. Zusätzlich können solche Zusammensetzungen LERK-6 enthalten, das mit Polyethylenglykol (PEG), Metallionen komplexiert ist, oder in polymere Verbindungen, wie Polyessigsäure, Polyglykolsäure, Hydrogele, etc. eingebaut werden, oder in Liposome, Mikroemulsionen, Mizellen, unilamellare oder multilamellare Vesikel, Erythrozytengeister oder Sphäroblasten eingeführt werden. Derartige Zusammensetzungen werden den physikalischen Zustand, die Löslichkeit, die Stabilität, die in vivo-Freisetzungsrate und die in vivo-Eliminierungsrate des LERK-6 beeinflussen. LERK-6 kann mit Antikörpern gegen gewebespezifische Rezeptoren, Liganden oder Antigenen gepaart werden oder an Liganden gewebespezifischer Rezeptoren gekoppelt werden. Wo Hek/Elk auf neoplastischen Zellen gefunden wird, kann das LERK-6 an ein Toxin konjugiert werden, wobei LERK-6 verwendet wird, um das Toxin an die spezifische Stelle abzugeben, oder kann verwendet werden, um solche neoplastische Zellen gegenüber nachfolgend verabreichten antineoplastischen Mittel zu sensibilisieren.
LERK-6 kann topisch, parenteral oder durch Inhalation verabreicht werden. Der Ausdruck "parenteral" schließt subkutane Injektionen, intravenöse, intramuskuläre, intracisternale Injektions- oder Infusionstechniken ein. Diese Zusammensetzungen werden typischerweise eine wirksame Menge des LERK-6, entweder allein oder in Kombination mit einer wirksamen Menge von jedem anderen aktiven Material, enthalten. Solche Dosierungen und gewünschten Arzneimittelkonzentrationen, die in den Zusammensetzungen enthalten sind, können in Abhängigkeit von vielen Faktoren, einschließlich der beabsichtigten Verwendung, dem Körpergewicht und Alter des Patienten, und dem Verabreichungsweg variieren. Vorläufige Dosen können anhand von Tierversuchen bestimmt werden, und die Rationierung der Dosierungen für die menschliche Verabreichung können gemäß im Stand der Technik akzeptieren Praktiken durchgeführt werden.
LERK-6 Polypeptide können auch als Oligomere, wie kovalent-gebundene oder nicht-kovalent-gebundene Dimere oder Trimere existieren. Oligomere können durch Disulfidbindungen, die zwischen Cysteinresten auf unterschiedlichen LERK-6 Polypeptiden gebildet werden, verbunden werden. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein LERK-6 Dimer durch Fusionieren von LERK-6 an die Fc-Region eines Antikörpers (z.B. IgG1) auf eine Weise erzeugt, die mit der Bindung von LERK-6 an die Hek/Elk-Ligandenbindungsdomäne nicht interferiert. Das Fc Polypeptid wird vorzugsweise an den C-Terminus eines löslichen LERK-6 (welches nur die Rezeptorbindung aufweist) fusioniert. Die allgemeine Zubereitung von Fusionsproteinen, die heterologe Polypeptide aufweisen, die mit verschiedenen Abschnitten von Antikörper-abgeleiteten Polypeptiden (einschließlich die Fc-Domäne) fusioniert sind, wurde beschrieben, siehe z.B. Ashkenazi et.al. (PNAS USA 88:10535, 1991), und Byrn et.al. (Nature 344:677, 1990) die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen sind. Eine Genfusion, die das LERK-6:Fc-Fusionsprotein kodiert, wird in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt. Den LERK-6:Fc-Fusionsproteinen wird ermöglicht, sich ganz wie Antikörper-Moleküle zusammenzufinden, woraufhin sich zwischen den Ketten der Fc-Polypeptide Disulfid-Bindungen ausbilden, die zu einem bivalenten LERK-6 führen. Wenn Fusionsproteine sowohl mit schweren als auch mit leichten Ketten eines Antikörpers hergestellt werden, ist es möglich, ein LERK-6-Oligomer mit nicht weniger als vier LERK-6-extrazellulären Regionen zu bilden. Alternativ können zwei lösliche LERK-6 Domänen mit einem Peptidlinker verbunden werden.
Geeignete Wirtszellen für die Expression von LERK-6-Polypeptiden schließen Prokaryoten, Hefe oder höhere eukaryotische Zellen ein. Geeignete Klonierungs- und Expressionsvektoren zur Verwendung mit zellularen bakteriellen, fungalen, Hefe- und Säugetierwirten werden zum Beispiel in Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985) beschrieben. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls verwendet werden, um LERK-6-Polypeptide unter Verwendung von RNAs zu erzeugen, die von hierin offenbarten DNA-Konstrukten abgeleitet sind.
Zu den Prokaryoten zählen grammnegative und grammpositive Organismen, zum Beispiel E. coli oder Bacilli. Geeignete prokaryotische Wirtszellen für die Transformation schließen zum Beispiel E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium und verschiedene andere Spezies innerhalb der Gattungen von Pseudomonas, Streptomyces und Staphylococcus ein. In einer prokaryotischen Wirtszelle wie E. Coli kann ein LERK-6-Polypeptid einen N-terminalen Methioninrest enthalten, um die Expression des rekombinanten Polypeptids in der prokaryotischen Wirtszelle zu erleichtern. Das N-terminale Met kann von dem exprimierten rekombinanten LERK-6-Polypeptid abgespalten werden.
LERK-6 kann alternativ dazu in Hefe-Wirtszellen exprimiert werden, vorzugsweise aus der Gattung der Saccharomyces (z.B. S. cerevisiae). Andere Hefegattungen wie Pichia, K. lactis oder Kluyveromyces können ebenfalls verwendet werden. Hefevektoren werden oft einen Ursprung einer Replikationssequenz von einem 2μ-Hefeplasmid, eine autonom replizierende Sequenz (ARS), eine Promotorregion, Sequenzen für eine Polyadenylisierung, Sequenzen für die Transkriptionstermination und ein selektierbares Markierungsgen enthalten. Geeignete Promotorsequenzen für Hefevektoren schließen unter anderem Promotoren für Metallothionein, 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:2073, 1980) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 7:149, 1968; und Holland et al., Biochem. 17:4900, 1978) wie Enolase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphatisomerase, Phosphoglucoseisomerase und Glucokinase ein. Andere geeignete Vektoren und Promotoren zur Verwendung in der Hefeexpression werden ferner in Hitzeman, EPA-73,657 oder in Fleer et. al., Gene, 107:285–195 (1991); und van der Berg et. al., Bio/Technologie, 8:135–139 (1990) beschrieben. Eine weitere Alternative ist der Glucose-reprimierbare ADH2-Promotor, der von Russell et al. (J. Biol. Chem. 258:2674, 1982) und Beier et al. (Nature, 300:724, 1982) beschrieben wird. Shuttle-Vektoren, die sowohl in Hefe als auch in E. coli replizierbar sind, können konstruiert werden, indem DNA-Sequenzen aus pBR322 zur Selektion und Replikation in E. coli (Amp^r Gen und Replikationsursprung) in die oben beschriebenen Hefevektoren eingefügt werden.
Die Hefe-α-Faktor-Leadersequenz kann verwendet werden, um die Sekretion des LERK-6-Polypeptids zu steuern. Die α-Faktor-Leadersequenz wird oft zwischen die Promotorsequenz und die strukturelle Gensequenz eingefügt. Siehe z.B. Kurjan et al., Cell 30:933, 1982; Bitter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330, 1984; US-Patentschrift 4,546,082 und EP 324,274 . Andere Leadersequenzen, die zur Erleichterung der Sekretion von rekombinanten Polypeptiden aus Hefewirten geeignet sind, sind den Fachleuten bekannt. Eine Leadersequenz kann in der Nähe ihres 3'-Endes modifiziert werden, um eine oder mehrere Restriktionsstellen zu enthalten. Dies erleichtert die Fusion der Leadersequenz an das strukturelle Gen.
Hefetransformationsprotokolle sind den Fachleuten bekannt. Ein solches Protokoll wird von Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978 beschrieben. Das Hinnen et al. Protokoll selektiert für Trp⁺ Transformanten in einem selektiven Medium, wobei das selektive Medium aus 0,67 % Hefestickstoffbase, 0,5 Casaminosäuren, 2 % Glucose, 10 μg/ml Adenin und 20 μg/ml Uracil besteht.
Hefewirtszellen, die durch Vektoren transformiert sind, welche eine ADH2- Promotorsequenz enthalten, können gezüchtet werden, um die Expression in einem „reichen" Medium zu induzieren. Ein Beispiel eines reichen Mediums ist ein Medium, das aus 1 % Hefeextrakt, 2 % Pepton und 1 % Glucose, ergänzt durch 80 μg/ml Adenin und 80 μg/ml Uracil, besteht. Die De-Repression des ADH2-Promotors tritt ein, wenn Glucose aus dem Medium erschöpft ist.
Es könnten auch Säugetier- oder Insekten-Wirtszellkultursysteme verwendet werden, um rekombinante LERK-6-Polypeptide zu exprimieren. Baculovirussysteme zur Erzeugung heterologer Proteine in Insektenzellen werden von Luckow und Summers, Bio/Technology 6:47 (1988) untersucht. Etablierte Zelllinien mit Säugetierursprung können auch verwendet werden. Beispiele für geeignete Säugetier-Wirtszelllinien schließen die COS-7-Linie von Affennierenzellen (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), L-Zellen, C127-Zellen, 3T3-Zellen (ATCC CCL 163), Chinesische Hamstereierstockzellen (CHO), HeLa-Zellen und BHK (ATCC CRL 10)-Zelllinien sowie die CV-1/EBNA-1-Zelllinie ein, die aus der afrikanischen Grünmeerkatzennierenzelllinie CVI (ATCC CCL 70) gewonnen wird, so wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben ist.
Transkriptionale und translationale Kontrollsequenzen für Säugetierwirtszellen- Expressionsvektoren könne aus viralen Genomen ausgeschnitten werden. Häufig verwendete Promotorsequenzen und Verstärkersequenzen werden aus dem Polyomavirus, Adenovirus 2, Simian Virus 40 (SV40) und dem humanen Cytomegalievirus gewonnen. DNA-Sequenzen, die aus dem SV40-Viralgenom gewonnen werden, zum Beispiel der SV40- Ursprung, der frühe und späte Promotor, Verstärker, Spleiß- und Polyadenylisierungsstellen können verwendet werden, um andere genetische Elemente für die Expression einer Sequenz eines strukturellen Gens in einer Säugetierwirtszelle bereitzustellen. Virale frühe und späte Promotoren sind besonders nützlich, weil beide leicht aus einem viralen Genom als Fragment erhalten werden, das auch einen viralen Replikationsursprung enthalten kann (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Kleinere oder größere SV40-Fragmente können ebenfalls verwendet werden, vorausgesetzt, die ungefähr 250 bp Sequenz, die sich von der HindIII-Stelle zur BgII-Stelle erstreckt, die sich in der SV40 viralen Replikationsursprungsstelle befindet, ist eingeschlossen.
Beispielhafte Expressionsvektoren zur Verwendung in Säugetierwirtszellen können so konstruiert werden, wie von Okayama und Berg (Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983) offenbart. Ein nützliches System für stabile Hochexpression von Säugetier-cDNAs in C127 Mäuse-Mamma-Epithelzellen kann im Wesentlichen so wie von Cosman et al. (Mol. Immunol. 23:935, 1986) beschrieben konstruiert werden. Ein nützlicher Hochexpressionsvektor, PMLSV N1/N4, beschrieben von Cosman et al., Nature 312:768, 1984, wurde als ATCC39890 hinterlegt. Zusätzliche nützliche Säugetierexpressionsvektoren werden in EP-A-0367566 und in der US Patent-Anmeldung Seriennr. 07/701.415, eingereicht am 16 Mai, 1991, beschrieben. Die Vektoren können aus Retroviren gewonnen werden. Anstelle der nativen Signalsequenz, und zusätzlich zu einem Initiatormethionin, kann eine heterologe Signalsequenz hinzugefügt werden, wie die Signalsequenz für IL-7, beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195, die Signalsequenz für den IL-2-Rezeptor, beschrieben in Cosman et al., Nature 312:768 (1984), das IL-4-Signalpeptid, beschrieben in EP 367,566 ; das Typ-I-IL-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in der US-Patentschrift 4,968,607, und das Typ-II-IL-1-Rezeptorsignalpeptid, beschrieben in EP 460,846 .
LERK-6 als ein isoliertes, gereinigtes oder homogenes Protein gemäß der Erfindung kann durch rekombinante Expressionssysteme, wie oben beschrieben, oder durch Reinigen aus natürlich-vorkommenden Quellen hergestellt werden. LERK-6 kann im Wesentlichen zur Homogenität gereinigt werden, wie durch eine einzige Proteinbande bei der Analyse durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) anzeigt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung des LERK-6-Proteins weist das Züchten einer Wirtszelle auf, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, der eine DNA-Sequenz enthält, welche LERK-6 kodiert, unter Bedingungen, die ausreichen, um die LERK-6 Expression zu fördern. Das LERK-6-Protein wird dann in Abhängigkeit vom verwendeten Expressionssystem aus dem Kulturmedium oder den Zellextrakten wiedergewonnen. Dem Fachmann wird klar sein, dass Verfahren zur Reinigung des rekombinanten LERK-6 in Abhängigkeit von Faktoren wie dem Typ der verwendeten Wirtszellen und in Abhängigkeit davon, ob das LERK-6 in das Kulturmedium ausgeschieden wird oder nicht, variieren werden.
Wenn zum Beispiel Expressionssysteme verwendet werden, welche das rekombinante Protein ausscheiden, kann das Kulturmedium zuerst mit Hilfe eines im Handel erhältlichen Proteinkonzentrationsfilters, zum Beispiel einer Amicon oder Millipore Pellicon Ultrafiltrierungseinheit, konzentriert werden. Nach dem Konzentrationsschritt kann das Konzentrat auf eine Reinigungsmatrix wie ein Gelfiltrierungsmedium aufgetragen werden. Alternativ dazu kann ein Anionenaustauschharz verwendet werden, zum Beispiel eine Matrix oder ein Substrat mit anhängenden Diethylaminoethyl (DEAE)-Gruppen. Die Matrizen können Acrylamid, Agarose, Dextran, Zellulose oder andere, bei der Proteinreinigung häufig verwendete Arten sein. Alternativ dazu kann ein Kationenaustauschschritt durchgeführt werden. Geeignete Kationenaustauscher schließen verschiedene unlösliche Matrizen ein, welche Sulfopropyl- oder Carboxymethylgruppen aufweisen. Sulfopropylgruppen werden bevorzugt. Schließlich können ein oder mehrere Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (RP-HPLC)-Schritte unter Verwendung von hydrophoben RP-HPLC-Medien (z. B. Silicagel mit anhängenden Methyl- oder anderen aliphatischen Gruppen) durchgeführt werden, um LERK-6 weiter zu reinigen. Einige oder alle der vorhergehenden Reinigungsschritte, in unterschiedlichen Kombinationen, sind bekannt, und können durchgeführt werden, um ein im Wesentlichen homogenes rekombinantes Protein bereitzustellen.
Es ist auch möglich, eine Affinitätssäule zu verwenden, welche die ligandenbindende Domäne von Hek/Elk-Rezeptoren enthält, um exprimierte LERK-6-Polypeptide einer Affinitätsreinigung zu unterziehen. LERK-6-Polypeptide können aus einer Affinitätssäule unter Verwendung herkömmlicher Techniken entfernt werden, z.B. in einem hohen Salz-Eluierungspuffer gewonnen und danach zur Verwendung in einen niedrigeren Salzpuffer dialysiert werden oder durch Ändern des pHs oder anderer Komponenten, in Abhängigkeit der benutzen Affinitätsmatrix. Alternativ dazu kann die Affinitätssäule einen Antikörper aufweisen, der LERK-6 bindet. Beispiel 5 beschreibt ein Verfahren zum Verwenden von LERK-6 der Erfindung, um monoklonale Antikörper, die gegen LERK-6 gerichtet sind, zu erzeugen.
Rekombinantes Protein, das in bakterieller Kultur erzeugt wird, wird für gewöhnlich durch anfängliches Zerreißen der Wirtszellen, Zentrifugation, Extraktion aus Zellpellets, im Fall eines unlöslichen Polypeptids, oder aus der überstehenden Flüssigkeit, im Fall eines löslichen Polypeptids, isoliert, gefolgt von einer oder mehreren Schritten der Konzentration, des Aussalzens, Ionenaustauschs, der Affinitätsreinigung oder Größenausschlusschromatographie. Schließlich kann die RP-HPLC für endgültige Reinigungsschritte verwendet werden. Mikrobielle Zellen können durch ein beliebiges, geeignetes Verfahren zerrissen werden, einschließlich eines Frier-Tau-Zyklus, einer Beschallung, mechanischen Zerreißens oder der Verwendung von Zelllysiermitteln.
Transformierte Hefewirtszellen werden vorzugsweise benutzt, um LERK-6 als ein ausgeschiedenes Polypeptid zu exprimieren, um die Reinigung zu vereinfachen. Das aus einer Hefewirtszeitfermentation ausgeschiedene rekombinante Polypeptid kann durch Verfahren gereinigt werden, die den Verfahren, die von Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984) offenbart werden, gegenüber analog sind. Urdal et al. beschreiben ein Verfahren, das zwei sequentielle, Umkehrphasen-HPLC-Schritte zur Reinigung von rekombinantem humanem IL-2 an einer präparativen HPLC-Säule einschließt.
Nützliche Fragmente der LERK-6-Nukleinsäuren schließen Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide ein, welche eine Einzelstrang-Nukleinsäuresequenz (entweder RNA oder DNA) aufweisen, die imstande ist, an Ziel-LERK-6-mRNA (Sinn) oder LERK-6-DNA (Gegensinn)-Sequenzen zu binden. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide gemäß der vorliegenden Erfindung weisen ein Fragment der kodierenden Region von LERK-6-cDNA auf. Ein solches Fragment enthält im Allgemeinen mindestens ungefähr 14 Nukleotide, vorzugsweise von ungefähr 14 bis ungefähr 30 Nukleotide. Die Fähigkeit, ein Gegensinn- oder ein Sinn-Oligonukleotid basierend auf einer cDNA-Sequenz zu gewinnen, welche ein bestimmtes Protein kodiert, ist zum Bespiel in Stein und Cohen (Cancer Res. 48:2659, 1988) und in van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988) beschrieben.
Das Binden von Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotiden an Ziel-Nukleinsäuresequenzen führt zur Bildung von Doppelsträngen, welche die Transkription oder Translation der Zielsequenz durch eines von mehreren Mitteln blockieren, einschließlich verstärkter Degradierung der Doppelstränge, verfrühter Termination der Transkription oder Translation oder durch andere Mittel. Die Gegensinn-Oligonukleotide können daher verwendet werden, um die Expression von LERK-6-Proteinen zu blockieren. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide weisen ferner Oligonukleotide auf, welche modifizierte Zuckerphosphodiester-Hauptketten (oder andere Zuckerverbindungen wie die in W091/06629 beschriebenen) aufweisen, und wobei die Zuckerverbindungen endogenen Nukleasen gegenüber resistent sind. Solche Oligonukleotide mit resistenten Zuckerverbindungen sind in vivo stabil (d. h. imstande, enzymatischer Degradierung zu widerstehen), behalten aber die Sequenzspezifizität, um an Ziel-Nukleotidsequenzen binden zu können. Andere Beispiele von Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotiden schließen jene Oligonukleotide ein, die kovalent mit organischen Anteilen wie jenen, die in WO 90/10448 beschrieben sind, und anderen Anteilen verbunden sind, welche die Affinität des Oligonukleotids für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, wie Poly-(L-Lysin) erhöhen. Außerdem können interkalierende Wirkstoffe wie Ellipticin und alkylierende Wirkstoffe oder Metallkomplexe an Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide angeheftet werden, um die Bindungsspezifizitäten des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids für die Ziel-Nukleotidsequenz zu ändern.
Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch ein beliebiges Gentransferverfahren eingeführt werden, einschließlich zum Beispiel CaPO₄-vermittelte DNA-Transfektion, Elektroporation oder durch Verwendung von Gentransfervektoren wie dem Epstein-Barr-Virus. Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotide werden in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, vorzugsweise durch Einfügen des Gegensinn- oder Sinn-Oligonukleotids in einen geeigneten retroviralen Vektor eingefügt, wobei danach die Zelle mit dem Retrovirusvektor, der die eingefügte Sequenz enthält, entweder in vivo oder ex vivo in Kontakt gebracht wird. Geeignete retrovirale Vektoren schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – jene ein, die aus dem Maus-Retrovirus M-MuLV, N2 (einem aus M-MuLV gewonnenem Retrovirus) oder den Doppelkopievektoren gewonnen werden, die mit DCT5A, DCT5B und DCT5C bezeichnet sind (siehe PCT-Anmeldung US 90/02656).
Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotide können in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleotidsequenz enthält, auch durch Bilden eines Konjugats mit einem ligandbindenden Molekül eingeführt werden, wie in WO 91/04753 beschrieben. Geeignete ligandbindende Moleküle schließen – ohne darauf beschränkt zu sein – Zelloberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, andere Cytokine oder andere Liganden ein, welche an Zelloberflächenrezeptoren binden. Vorzugsweise führt die Konjugation des ligandbindenden Moleküls zu keiner wesentlichen Beeinträchtigung der Fähigkeit des ligandbindenden Moleküls, an sein entsprechendes Molekül oder seinen entsprechenden Rezeptor zu binden oder den Eintritt des Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotids oder seiner konjugierten Version in die Zelle zu blockieren.
Alternativ dazu kann ein Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid in eine Zelle, welche die Ziel-Nukleinsäuresequenz enthält, durch Bildung eines Oligonukleotid-Lipidkomplexes eingeführt werden, wie in WO 90/10448 beschrieben. Der Sinn- oder Gegensinn-Oligonukleotid-Lipidkomplex wird vorzugsweise innerhalb der Zelle durch eine endogene Lipase dissoziiert.
Zusätzlich zu dem obigen werden die folgenden Beispiele bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen zu illustrieren und nicht um den Umfang der Erfindung einzuschränken.
Beispiel 1
Klonierung von muriner LERK-6 cDNA
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren zum Isolieren einer DNA Sequenz, die murines LERK-6 der Erfindung kodiert. Eine kommerziell erhältliche 11,5 Tage murine embryonale cDNA Bibliothek wurde von Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, Kalifornien erhalten. Die Bibliothek wurde gemäß dem Verfahren, wie im Handbuch detailliert beschrieben ist und von Clontech bereitgestellt wird, ausplattiert und unter Verwendung der ³²P-radiomarkierten Sonden gescreent. Jede Sonde wurde unter Verwendung von Standardtechniken erzeugt. Im Allgemeinen wurden Polymerase-Kettenreaktionen (PCR) (Mullis and Faloona, Meth. Enzymol. 155:335–350, 1987) Amplifikationen unter Verwendung von zwei Primersätzen durchgeführt. Der erste Satz,
GATATTTACTGCCCGCACTACAACAGCT SEQ ID NO: 3
AGAGAAGGCGCTGTAGCGCTGGAAC SEQ ID NO: 4
wurde verwendet, um amplifizierte doppelsträngige DNA Fragmente von der DNA von LERK-3 zu erzeugen. LERK-3 ist der Gegenstand der co-anhängigen Patentanmeldung Seriennummer 08/109.745; 08/114.426, 08/161.132 und 08/240.124, eingereicht am 9. May, 1994. Die Sonde von LERK-3 wies die Nukleotide 260 bis 481 der SEQ ID NO: 1 der co-anhängigen Anmeldung Seriennummer 08/240.124, eingereicht am 9. Mai 1994 auf. Der zweite Primersatz,
ACGTAGTCTACTGGAACTCCAGTAACCCCAG SEQ ID NO: 5
AGCCTCAAGCACTGGCCAGAACTCTCTCTGGAGT SEQ ID NO: 6
wurde verwendet, um amplifizierte doppelsträngige DNA Fragmente von der DNA von LERK-4 zu erzeugen. LERK-4 ist ebenfalls der Gegenstand der co-anhängigen Patentanmeldung Seriennummer 08/109.745; 08/114.426, 08/161.132 und 08/240.124, eingereicht am 9. May, 1994. Die Sonde von LERK-3 wies die Nukleotide 110 bis 467 der SEQ ID NO: 3 der co-anhängigen Anmeldung Seriennummer 08/240.124, eingereicht am 9. Mai 1994 auf. Die Fragmente wurden mit ³²P radiomarkiert, und als Sonden verwendet, um eine murine embryonale Bibliothek zu screenen.
Das Screenen mit den Sonden wurde durch herkömmliche Verfahren durchgeführt und hybridisierende Klone wurden identifiziert. Die Hybridisierungsbedingungen bestehen aus 42°C und 50% Starks, gewaschen bei 0,1X SSC bei 63°C. Die Nukleotidsequenz des cDNA Inserts von einem individuellen Klon, welcher aus der murinen embryonalen Bibliothek isoliert wurde, und als Klon λ 13 bezeichnet wird, wurde bestimmt. Eine im Wesentlichen vollständige cDNA Sequenz der kodierenden Region der Klon λ13 cDNA und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz, sind in den SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2 dargestellt. Der offene Leserahmen innerhalb dieser Sequenz kodiert ein Protein von 184 Aminosäuren. Da die N-Termini der Proteine der LERK-Familie nicht homolog sind, wird vermutet, dass die erste Aminosäure der SEQ ID NO: 1 (Ala) am oder in der Nähe des nativen N-Terminus lokalisiert ist. Zusätzlich, da LERK-6 dieser Erfindung mit anderen biologisch aktiven LERK-Molekülen homolog ist, gibt es einen signifikante Wahrscheinlichkeit, dass die cDNA der SEQ ID NO: 1 ein biologisch aktives Protein kodiert. Die Sekretion eines solchen aktiven Proteins ist durch das oben beschriebene Verfahren in Bezug auf die Addition eines geeigneten Initiatormethionins und einer geeigneten Signalsequenz möglich, wie jene für murines IL-7. Die Aminosäure-Sequenz von LERK-6 ist zu 58% homolog zu der eines Cytokins, das als LERK-3 bezeichnet wird.
Ein Zelllysat, welches Klon λ13 DNA (die LERK-6 cDNA in λgt10) enthält, wurde bei der American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA, am 15. Juli 1994 hinterlegt, und die Hinterlegungsnummer ATCC 75829 zugeordnet. Die Hinterlegung wurde gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags gemacht.
Vergleichsbeispiel 2
Klonierung von humanem LERK-6
Dieses Beispiel beschreibt das Klonieren von Nukleinsäuren, die humanes LERK-6 kodieren. Humane LERK-6 Sequenz ist aus einem genomischen Klon isoliert, indem eine humane genomische Bibliothek mit einer murinen LERK-6 cDNA Sonde sondiert wird, die die Aminosäuren 30-173 kodiert. Plaque-enthaltende Filter wurde mit einer ³²P-markierten Sonde bei 55°C für 24 Stunden hybridisiert, gewaschen auf 0,5 × SSC bei 55°C und einem Röntgenfilm (Kodak XAR-5) ausgesetzt. Eine Sequenz von Nukleinsäuren, die einen solchen Klon enthalten, ist unten gezeigt, ebenfalls in SEQ ID NO: 7, und die Aminosäuren, die dadurch kodiert sind, sind in SEQ ID NO: 8 gezeigt.
Verglichen mit murinem LERK-6, besitzt die humane LERK-6 eine 98,077 prozentige Ähnlichkeit und eine 93,269 prozentige Identität.
Beispiel 3
Herstellung von löslichem Elk/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches Elk/Fc-Fusionsprotein kodiert. Dieses Fusionsprotein wurde in dem Bindungstest von Beispiel 5 verwendet, um die Bindungseigenschaften von LERK-6 zu bestimmen.
Eine DNA und eine kodierte Aminosäuresequenz für Ratten-Elk-cDNA wird in Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11, 2496, 1991) vorgestellt, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Das Ratten-Elk-Protein weist eine 538 Aminosäure extrazelluläre Domäne, eine 25 Aminosäure Transmembrandomäne und eine 419 Aminosäure cytoplasmatische Domäne auf.
Ein Ratten-Elk-cDNA-Fragment wurde an das 5'-Ende von cDNA fusioniert, welche den Fc-Abschnitt eines humanen IgG1-Antikörpers kodiert. Die Ratten-Elk-cDNA wurde bei T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto) beschafft. Eine Asp718 Restriktions-Endonuklease-Schnittstelle wurde stromaufwärts von der Elk kodierenden Region eingeführt. Ein Asp 718-BgIII-Fragment von Ratten-Elk-cDNA (welche die gesamte extrazelluläre Domäne, den Transmembranbereich und einen kleinen Abschnitt der cytoplasmatischen Domäne enthielt) wurde isoliert.
DNA, welche eine Einzelpolypeptidkette kodiert, welche die Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers aufweist, wurde in die Spel-Stelle des pBLUESCRIPT SK^®-Vektors kloniert, der von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Kalifornien, kommerziell erhältlich ist. Dieser Plasmidvektor ist in E. coli replizierbar und enthält ein Polylinker-Segment, das 21 einzigartige Restriktionsstellen einschließt. Die Nukleotidsequenz der klonierten DNA wird gemeinsam mit der Aminosäuresequenz des dadurch kodierten Fc-Polypeptids in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben, die hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Eine einzigartige BgIII-Stelle wurde eingeführt und umfasst die Codons für Aminosäuren drei und vier des Fc-Polypeptids. Das kodierte Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Hinge-Region zum nativen C-Terminus, d. h. ist eine Antikörper-Fc-Region mit im Wesentlichen voller Länge.
Das oben beschriebene Asp718-BgIII-Elk-cDNA-Fragment wurde in den pBLUESCRIPT SK^®-Vektor kloniert, der die Fc-cDNA enthielt, so dass die Elk-cDNA stromaufwärts von der Fc-cDNA positioniert ist. Einzelstrang-DNA, die aus der resultierenden Genfusion gewonnen wurde, wurde durch das in Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985) und Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987) beschriebene Verfahren mutagenisiert, um die gesamte extrazelluläre Domäne von Elk vollkommen an die Fc-Sequenz zu fusionieren. Die mutagenisierte DNA wurde sequenziert, um zu bestätigen, dass die richtigen Nukleotide entfernt wurden (d.h. dass der Transmembranbereich und die partielle DNA der cytoplasmatischen Domäne gelöscht wurden) und dass die Elk- und die Fc-Sequenz sich im selben Leserahmen befanden.
Das Elk/Fc-Fusionsprotein wird vorzugsweise in Säugetier-Wirtszellen synthetisiert, wie CV1-EBNA oder COS-7-Zellen. Die Elk/Fc-Genfusion wurde ausgeschnitten und in einen Säugetier-Expressionsvektor mit der Bezeichnung HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989) eingefügt. Säugetier-Wirtszellen wurden mit dem resultierenden rekombinanten Expressionsvektor transfiziert und gezüchtet, um eine transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Elk-Signalpeptid ausgeschieden wurde. Das Elk/Fc-Fusionsprotein wurde durch Affinitätschromatographie mit Hilfe einer Protein-A-Sepharosesäule gereinigt.
BEISPIEL 4
Zubereitung von löslichem Hek/Fc-Fusionsprotein
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion eines Expressionsvektors, der ein lösliches Hek/Fc-Fusionsprotein kodiert. Dieses Fusionsprotein kann in den Bindungstests von Beispiel 5 verwendet werden, um die Bindungseigenschaften von LERK-6 zu bestimmen.
Eine DNA und kodierte Aminosäuresequenz für humane Hek-cDNA wird in Wicks et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:1611, 1992) gezeigt, das hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Dieses Hek-Protein enthält (vom N- zum C-Terminus) eine extrazelluläre Domäne, eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne.
Zwei DNA-Fragmente, von denen eines ein N-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von Hek und das andere ein C-terminales Fragment der extrazellulären Domäne von Hek kodiert, wurden durch Polymerasekettenreaktionen (PCR) isoliert, die unter Standardbedingungen unter Verwendung von Oligonukleotidprimern basierend auf der Hek-Nukleotidsequenz durchgeführt wurden, die von Wicks et al., supra, publiziert wurde. Die Matrize für die PCR war cDNA, die aus mRNA hergestellt wurde, die aus einer humanen T-Zellleukämie-Zellinie mit der Bezeichnung CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) isoliert wurde. Die PCR-Produkte, welche das 5'-Ende der Hek-DNA enthielten, wurden mit Spel und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment zu isolieren, das sich von dem 5'-Ende der reifen humanen Hek-Sequenz (d. h. ohne DNA, welche die Signalsequenz kodiert) zu einer HindIII-Stelle erstreckt, die im Hek-Gen zu finden ist. Die PCR-Produkte, welche das 3'-Ende der extrazellulären Domäne der Hek-DNA enthielten, wurden mit HindIII und ClaI verdaut, um ein Fragment zu isolieren, das sich von der internen HindIII-Stelle zu einer ClaI-Stelle unmittelbar stromabwärts des 3'-Endes der Sequenz erstreckte, welche die Hek extrazelluläre Domäne kodierte. Die ClaI-Stelle wird unmittelbar stromabwärts von der extrazellulären Domäne in eine Mehrfach-Klonierungsstelle (mcs) eingeführt.
DNA, welche ein Mutein der Fc-Region eines humanen IgG1-Antikörpers kodiert, wurde isoliert. Diese Fc-Mutein-DNA und das dadurch kodierte Polypeptid werden in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 08/097,827 und dem Titel „Novel Cytokine Which is a Ligand for OX40", eingereicht am 23. Juli 1993, beschrieben, wobei diese Anmeldung hiermit durch Bezugnahme aufgenommen wird. Die Mutein-DNA wurde aus einer nativen Fc-Polypeptid-kodierenden DNA durch ortsspezifische Mutagenese gewonnen, welche im Wesentlichen so durchgeführt wurde wie von Deng und Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992), beschrieben. Die Aminosäuresequenz des Fc-Muteinpolypeptids ist mit jener von dem nativen Fc-Polypeptid identisch, das in der PCT-Anmeldung WO 93/10151 beschrieben wird, außer, dass die Aminosäure 9 von Leu in Ala, die Aminosäure 20 von Leu in Glu und die Aminosäure 22 von Gly in Ala geändert wurde. Dieses Mutein-Fc weist reduzierte Affinität für Immunoglobulinrezeptoren auf.
Ein rekombinanter Vektor, der die Fc-Mutein-DNA enthielt, wurde mit ClaI und NotI gespalten, welche den Vektor in einer Polylinkerregion unmittelbar stromaufwärts bzw. stromabwärts von dem Fc-Mutein-DNA-Insert spalten. Das gewünschte Fc-Muteinkodierende Fragment wurde isoliert.
Das Mutein-Fc-Polypeptid erstreckt sich von der N-terminalen Hinge-Region zum nativen C-Terminus, d. h. ist eine Antikörper-Fc-Region mit im Wesentlichen voller Länge. Fragmente von Fc-Regionen, z.B. jene, die an dem C-terminalen Ende gestutzt sind, können ebenfalls verwendet werden. Die Fragmente enthalten vorzugsweise mehrere Cysteinreste (mindestens die Cysteinreste in der Hinge-Region), um die Bildung von Zwischenketten-Disulfidbindungen zwischen den Fc-Polypeptidabschnitten von zwei getrennten Hek/Fc-Fusionsproteinen zu ermöglichen, wodurch Dimere gebildet werden.
Ein Säugetier-Expressionsvektor mit der Bezeichnung SMAG4 wurde mit Spel und NotI gespalten. Der SMAG4-Vektor enthält eine Maus-Interleukin-7 Signalpeptidkodierende Sequenz (beschrieben in der US-Patentschrift 4,965,195), die in den Säugetier-Hochexpressionsvektor pDC201 (beschrieben in Sims et al., Science 241:585, 1988 und in der PCT-Anmeldung WO 89/03884) eingefügt ist, welche auch imstande ist, in E. coli zu replizieren. Spel spaltet den Vektor unmittelbar stromabwärts der IL-7 Signalpeptid-kodierenden Sequenz. NotI spaltet ungefähr 155bp stromabwärts von der Spel-Stelle in einer Mehrfach-Klonierungsstelle des Vektors. Das große Spel/NotI-Fragment, das die Vektorsequenzen und die IL-7 Signalpeptid-kodierende DNA enthält, wurde isoliert.
Eine Vierweg-Ligation wurde durchgeführt, um die zwei Hek-kodierenden DNA-Fragmente und das oben beschriebene Fc-Mutein kodierende DNA-Fragment in den SpeI/NotI gespaltenen SMAG4-Expressionsvektor einzufügen. E. coli-Zellen wurden mit der Ligationsmischung transfiziert, und der gewünschte rekombinante Vektor wurde daraus isoliert. Der isolierte Vektor kodiert ein Fusionsprotein, das (vom N- zum C-Terminus) das Maus-IL-7 Signalpeptid, die extrazelluläre Domäne von Hek, vier Aminosäuren, die durch die eingeführte mcs kodiert werden, und das Fc-Mutein enthält.
Der Expressionsvektor wurde danach mit Plasmid pSV3.NEO in CV1/EBNA-Zellen co-transfiziert. Die CV1/EBNA-Zelllinie (ATCC CRL 10478) wurde aus einer Affennieren-Zelllinie gewonnen, wie in McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben. Der Vektor pSV3.NEO exprimiert das SV40 T-Antigen, das nicht durch die Wirtszellen hergestellt wird. Der pSV3.NEO-Vektor ist ähnlich dem pSV3 (Mulligan und Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072, 1981), aber enthält zusätzlich ein Neomycinresistenzgen. Die transformierten Zellen wurden gezüchtet, um eine transiente Expression des Fusionsproteins zu ermöglichen, das in das Kulturmedium über das Maus-IL-7-Signalpeptid ausgeschieden wird. Das Fusionsprotein wurde an einer Protein-A Sepharosesäule gereinigt, eluiert und verwendet, um Zellen auf ihre Fähigkeit, das Hek:Fc-Protein oder Elk:Fc-Protein zu binden, zu prüfen.
BEISPIEL 5: Bindungsstudie
Die Fähigkeit von LERK-6, an Elk oder Hek, zu binden, wurde im Rahmen des folgenden Tests untersucht. Zellen, welche LERK-6 auf der Zelloberfläche exprimieren, werden hergestellt. LERK-6-DNA wurde durch PCR amplifiziert. Die in der PCR verwendeten Primer wurden ausgewählt, um die Termini der kodierenden Region der LERK-6-DNA zu definieren und enthalten auch eine Xho I Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine Not I Stelle am 3'-Ende der amplifizierten DNA. Der 5'-Primer enthielt zusätzlich eine Konsens-Kozak-Sequenz stromaufwärts vom Startcodon.
Die Reaktionsprodukte wurden mit Xho I und Not I verdaut und in einen Expressionsvektor eingefügt, der mit Sal I (das mit Xho I kompatibel ist) und Not I gespalten wurde. Der Expressionsvektor war pDC410, wobei es sich dabei um einen Säugetier-Expressionsvektor handelt, der auch in E. coli repliziert. pDC410 ist ähnlich dem pDC406 (McMahan et al., EMBO J. 10:2821, 1991). Die pDC410 Mehrfach-Klonierungsstelle (mcs) unterscheidet sich von jener von pDC406 insofern, als sie zusätzliche Restriktionsstellen und drei Stoppcodons (eines in jedem Leserahmen) enthält. Ein T7-Polymerasepromotor stromabwärts der mcs erleichtert das Sequenzieren von DNA, die in die mcs eingefügt ist. Außerdem ist der EBV-Replikationsursprung durch DNA ersetzt, welche das SV40 große T-Antigen (aus einem SV40-Promotor getrieben) in pDC410 kodiert.
CV1-EBNA-1-Zellen in 10 cm² Schalen wurden mit dem rekombinanten Expressionsvektor transfiziert, der LERK-6-DNA enthielt. Die CV-1/EBNA-1-Zelllinie (ATCC CRL 10478) exprimiert konstitutiv EBV nukleares Antigen-1, das aus dem CMV unmittelbaren-frühen Verstärker/Promotor getrieben ist. CV1-EBNA-1 wurde aus der Afrikanischen Grünen Meerkatzen-Nierenzelllinie CV-1 (ATCC CCL 70) gewonnen, wie von McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) beschrieben ist.
Die transfizierten Zellen wurden 24 Stunden lang gezüchtet und die Zellen in jeder Schale werden danach in eine 24-Vertiefungen-Platte aufgeteilt. Nach weiteren 48 Stunden des Züchtens wurde ein Bindungstest durch folgendes Verfahren durchgeführt. Die transfizierten Zellen (ungefähr 4 × 10⁴ Zellen/Vertiefung) wurden mit BM-NFDM gewaschen, das ein Bindungsmedium ist (RPMI 1640, das 25 mg/ml Rinderserumalbumin, 2 mg/ml Natriumazid, 20 mM Hepes pH 7,2 enthält), zu dem 50 mg/ml fettfreie Trockenmilch hinzugefügt wurde. Die Zellen wurden danach eine Stunde lang bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen des Elk/Fc-Fusionsproteins, das in Beispiel 2 hergestellt wurde, oder dem in Beispiel 3 hergestellten Hek/Fc-Fusionsprotein inkubiert. Danach wurden die Zellen gewaschen und mit einer konstanten Sättigungskonzentration eines ¹²⁵I-Maus-Anti-Human-IgG in Bindemedium inkubiert, mit leichtem Rühren bei 37°C über einen Zeitraum von einer Stunde. Nach extensivem Waschen wurden die Zellen über Trypsinierung freigegeben.
Das Maus-Anti-Human-IgG, das oben verwendet wurde, ist gegen die Fc-Region des humanen IgG gerichtet und wurde bei Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA beschafft. Der Antikörper wurde mit Hilfe des standardmäßigen Chloramin-T-Verfahrens radioiodiert. Der Antikörper bindet an den Fc-Abschnitt eines beliebigen Elk:Fc- oder Hek:Fc-Fusionsproteins, das an die Zellen gebunden hat. In allen Tests wurde nicht-spezifische Bindung des ¹²⁵I-Antikörpers in Abwesenheit von Elk:Fc (oder Hek:Fc) sowie in der Gegenwart von Elk:Fc (oder Hek:Fc) und eines 200-fachen molaren Überschusses eines nicht markierten Maus-Anti-Human-IgG-Antikörpers geprüft.
Der zellgebundene ¹²⁵I-Antikörper wurde auf einem Packard-Autogamma-Zähler quantifiziert. Die Affinitätsberechnungen (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949) wurden mittels RS/1 (BBN Software, Boston, MA), welches auf einem Mikrovax Computer läuft, erzeugt.
Beispiel 6
Monoklonale Antikörper gegen LERK-6
Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Herstellung monoklonaler Antikörper, die LERK-6 binden. Gereinigtes LERK-6, ein Fragment davon, wie die extrazelluläre Domäne, synthetische Peptide oder Zellen, die LERK6 exprimieren, können verwendet werden, um unter Anwendung herkömmlicher Techniken, wie etwa jenen, die im US-Patent 4,411,993 beschrieben sind, monoklonale Antikörper zu erzeugen. Kurz gesagt, es werden Mäuse mit dem LERK-6-Immungen, das in komplettem Freudschen Adjuvans emulgiert ist, immunisiert, wobei Mengen im Bereich von 10 bis 100 μg subkutan oder intraperitoneal injiziert werden. Zehn bis zwölf Tage später werden die immunisierten Tiere mit zusätzlichem LERK-6, das in inkomplettem Freudschen Adjuvans emulgiert ist, re-immunisiert. Danach werden die Mäuse nach einem Wochen- bis Zweiwochen-Immunisierungsplan regelmäßig re-immunisiert. Durch retroorbitales Bluten oder Entfernen der Schwanzspitze werden regelmäßig Serumproben genommen, um mittels Dot-Blot-Assay, ELISA (Enyzm-gebundene Immunosorbent-Untersuchung) oder Inhibieren der Hek- oder Elk-Bindung auf LERK-6-Antikörper zu testen.
Nach Feststellung eines entsprechenden Antikörper-Titers wird positiven Tieren eine letzte intravenöse Injektion von LERK-7 in physiologischer Kochsalzlösung gegeben. Drei oder vier Tage später werden die Tiere geopfert, die Milzzellen geerntet, und die Milzzellen werden mit einer Maus-Myelom-Zelllinie, z.B. NS1 oder vorzugsweise P3x63Ag8.653 (ATCC CRL 1580) fusioniert. Die Fusionen erzeugen Hybridom-Zellen, die auf Mikrotiterplatten in einem selektivem HAT-Medium (Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) aufgebracht werden, um eine Vermehrung von nicht fusionierten Zellen, Myelomhybriden und Milzzellhybriden zu hemmen.
Die Hybridomzellen werden mittels ELISA bei Anpassung der von Engvall et.al. in Immunochem. 8:871,1971 und in dem US-Patent 4,703,004 beschriebenen Verfahren auf eine Reaktivität mit gereinigtem LERK-6 getestet. Ein bevorzugtes Screening-Verfahren ist die von Beckmann et.al. (J. Immunol. 144:4212, 1990) beschriebene Antikörperfangtechnik. Positive Hybridomzellen können intraperitoneal in syngene BALB/c-Mäuse injiziert werden, um Asciten zu erzeugen, die hohe Konzentrationen monoklonaler Anti-LERK-6-L-Antikörpern enthalten. Alternativ können Hybridomzellen mittels verschiedener Verfahren in vitro in Kolben oder Rollenflaschen herangezogen werden. In Maus-Asciten erzeugte monoklonale Antikörper können durch Ammoniumsulfat-Fällung, gefolgt von einer Gelausschlusschromatographie gereinigt werden. Alternativ kann auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Antikörperbindung an Protein A oder Protein G beruht, oder auch eine Affinitätschromatographie, die auf der Bindung an LERK-6 beruht, angewendet werden.
Beispiel 7
Herstellung von transgenen Mäusen, die LERK-6 überexprimieren.
Dieses Beispiel beschreibt ein Verfahren für das Erzeugen von transgenen Mäusen, die LERK-6 überexprimieren. LERK-6 überexprimierende transgene Mäuse können studiert werden, um die biologischen Wirkungen der Überexpression zu bestimmen. Maus (B16/J) Prozellkerne werden mit LERK-6 DNA gemäß dem Verfahren, welches durch Gordon et al., Science 214:1244–1246 (1981) beschrieben ist, mikroinjiiziert. Im Allgemeinen wurden fertilisierte Mauseier mit sichtbaren Prozellkernen zuerst auf einer Injektionskammer platziert und mit einer kleinen Pipette an Ort und Stelle gehalten. Eine Injektionspipette wird verwendet, um das LERK-6 kodierende Gen (z.B. Klon #6C) in den Prozellkern des Eies zu injizieren. Injizierte Eier werden entweder (i) in den Eileiter eines 0,5 Tag p.c. pseudoschwangeren Weibchens transferiert; (ii) in vitro kultiviert zu dem Zweizell-Stadium (über Nacht) und in den Eileiter eines 0,5 Tag p.c. pseudoschwangeren Weibchens transferiert; oder (iii) in vitro kultiviert zu dem Blastozyst-Stadium und in die Gebärmutter eines 2,5 Tag p.c. pseudoschwangeren Weibchens transferiert. Vorzugsweise kann eine der ersten zwei Optionen verwendet werden, da sie eine ausgedehnte in vitro Kultur vermeiden, und vorzugsweise etwa 20–30 mikroinjizierte Eier sollten transferiert werden, um kleine Würfe zu vermeiden.
Sequenzprotokoll:

Claims

Isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches hek/elk bindet, wobei das Polypeptid zumindest zu 90 % zu einer Aminosäuresequenz identisch ist die ausgewählt ist aus: (a) Aminosäuren 1–134 der SEQ ID Nr. 2; (b) Aminosäuren 1–145 der SEQ ID Nr. 2; und (c) Aminosäuren 1–184 der SEQ ID Nr. 2.
Isolierte Nukleinsäuresequenz, die ein Polypeptid kodiert, welches hek/elk bindet, die ausgewählt ist aus: (a) Nukleinsäuresequenz, welche die Sequenz der SEQ ID Nr. 1 aufweist; (b) Nukleinsäuresequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 kodiert (c) Nukleinsäuresequenz, die unter hochstringenten Bedingungen mit dem Komplement der Nukleinsäuresequenz von (a) oder (b) hybridisiert; und (d) Nukleinsäuresequenz, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz des Polypeptids, welches durch die Nukleinsäuresequenz von (a) oder (c) kodiert ist, kodiert.
Isoliertes Polypeptid, welches hek/elk bindet, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die zumindest zu 90 % zu einer Aminosäuresequenz identisch ist die ausgewählt ist aus: (a) Aminosäuren 1–134 der SEQ ID Nr. 2; (b) Aminosäuren 1–145 der SEQ ID Nr. 2; und (c) Aminosäuren 1–184 der SEQ ID Nr. 2.
Polypeptid, das durch eine isolierte Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 kodiert ist.
Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 aufweist.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 5 transfiziert oder transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Polypeptides, welches an hek/elk bindet, wobei das Verfahren das Kultivieren einer Wirtszelle gemäß Anspruch 6 unter die Expression fördernden Bedingungen und Gewinnen des Polypeptides aus dem Kulturmedium aufweist.
Isolierter Antikörper, welcher spezifisch ein Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 bindet.
Isolierter Antikörper nach Anspruch 8, welcher ein monoklonaler Antikörper ist.
Transgenes nicht-menschliches Säugetier, dessen Keim- und somatischen Zellen alle eine DNA Sequenz nach Anspruch 1 oder Anspruch 2 enthalten, welche in das Säugetier oder einen Vorfahren des Säugetiers in einem embryonalien Stadium eingeführt wurde.
Verfahren zum Abtrennen von Zellen, die einen hek/elk Rezeptor an der Oberfläche davon aufweisen, von einer Mischung von Zellen in Suspension, auf welcher das in Kontakt bringen der Zellen in der Mischung mit einer Kontaktoberfläche, welche das Polypeptid gemäß Anspruch 3 oder Anspruch 4 vorhanden ist, und Entfernen der Kontaktoberfläche aus der Suspension aufweist.
In-vitro Verfahren zum Abgeben eines gewünschten Molekül an eine Zelle, die hek/elk an seiner Oberfläche aufweist, welches das in Kontakt bringen der Zelle mit einem Fusionsprotein aufweist, welches eine Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, und das gewünschten Molekül aufweist.
Zusammensetzung, welche das Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 und ein oder mehrere pharmazeutisch geeignete Verdünnungsmittel, Emulgatoren, Lösungsvermittler, Adjuvantien und/oder Träger aufweist.
Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 für die Verwendung als Medikament.
Polypeptid nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 für die Herstellung eines Medikamentes für die Verwendung in einer Therapie.
Isolierte Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, welche ein Polypeptid kodiert, welches hek/elk bindet, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: (a) Aminosäuren 1–134 der SEQ ID Nr. 2; (b) Aminosäuren 1–145 der SEQ ID Nr. 2; und (c) Aminosäuren 1–184 der SEQ ID Nr. 2.
Isolierte Polypeptid gemäß Anspruch 3, welches hek/elk bindet, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz aufweist, die ausgewählt ist aus: (a) Aminosäuren 1–134 der SEQ ID Nr. 2; (b) Aminosäuren 1–145 der SEQ ID Nr. 2; und (c) Aminosäuren 1–184 der SEQ ID Nr. 2.