PT785716E - Citóquina designada por lerk-6 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "Citóquina designada por LERK-6"

Campo da invenção A presente invenção refere-se a polipéptidos de citóquinas designados por LERK-6 que se ligam ao receptor hek ou elk, aos ácidos nucleicos que codificam para estes polipéptidos, a processos para a produção de polipéptidos de LERK-6 recombinantes e a composições farmacêuticas que contêm estes polipéptidos.

Antecedentes da invenção

As proteínas conhecidas como tirosina-quinases receptoras têm uma actividade de quinase intrínseca que é activada por ligação do ligando. Esta classe de proteínas é caracterizada por motivos estruturais conservados nos domínios catalíticos (Hanks et ai., Science, 242:42, 1988) e pode ser subdividida em famílias com base nas características estruturais das regiões N-terminais em relação ao domínio catalítico.

Boyd et al. (J. Biol. Chem., 267:3262, 1992) purificaram uma glicoproteína de superfície celular que exibe actividade de tirosina-quinase. A sequência de aminoácidos identificou esta proteína como um membro da família eph/elk e a proteína foi assim designada por hek (quinase do tipo eph/elk humana). Utilizou-se um anticorpo monoclonal imunorreactivo com hek para estudar a expressão de hek em vários tipos de células humanas (Boyd et al., supra). 0 antigénio hek foi detectado na linha celular de leucemia de células pré-B humanas, LK63 (a linha celular utilizada como imunogénio contra o qual o anticorpo foi produzido) e a linha celular de leucemia de células T humanas, JM. A linha celular de linfoma B de Raji apresentava uma expressão de antigénio hek fraca e as restantes linhas celulares testadas (quer linhas celulares normais, quer de tumor, entre as quais estavam linhas celulares hematopoiéticas que incluíam linhas de células pré-B e T) eram consistentemente negativas. De entre os espécimes de biópsia de tecido normal e de tumor que também foram testados quanto a expressão de antigénio hek, nenhum dos tecidos 2 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ normais era positivo e apenas um proporção muito baixa de tumores hemopoiéticos era positiva. A expressão de moléculas transcritas hek nas linhas celulares LK63 e JM acima descritas, bem como a linha celular de leucemia de células T humanas, HSB-2, foi demonstrada por análise de transferência de Northern (Wicks et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 8_9:1611, 1992). As sequências de nucleótidos e aminoácidos para um clone de ADNc de hek isolado são apresentadas em Wicks et al., supra. A proteína de superfície celular designada por elk é outro membro da família de proteínas de tirosina-quinase receptoras relacionadas com eph. Um clone parcial de elk foi primeiro identificado numa biblioteca de expressão de ADNc de cérebro de rato que foi pesquisada quanto a proteínas que expressam actividade de tirosina-quinase (Letwin et al., Oncogene _3:621, 1988) . Mais tarde, uma sequência compósita que abrange toda a região codificante de elk foi derivada a partir de clones parciais isolados de uma biblioteca de ADNc de cérebro de rato e uma biblioteca de cérebro-cerebelar de rato utilizando o clone parcial como uma sonda (Lhotak et al., Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991).

As proteínas hek e elk têm uma relação estreita com outras tirosina-quinases receptoras, incluindo os homólogos de hek, mek4 e cek4 (Sajjadi et al., New Biol. 3_: 769, 1991); eek (Chan et al. Oncogene 6_: 1057, 1991); erk (Chan et al. supra.), eck (Lindberg et al. Mol. Cell. Biol. 1_0:6316, 1990); cek5 (Pasquale, E.B. Cell Regulation 2:523, 1991); e eph (Hirai et al. Science 238.:1717, 1987). As proteínas desta subfamília são relacionadas não só nos seus domínios citoplasmáticos, mas também nos seus domínios extracelulares, que são 41 a 68% idênticos. Com interesse, as distribuições tecidulares destes vários receptores são diversas. Por exemplo, está descrito que a expressão de ARNm de elk se limita aos testículos e cérebro (Lhotak et al., supra) enquanto que o eck é encontrado não só nestes mesmos dois tecidos, mas também no pulmão, intestino, rim, baço, ovário e pele. Além disso, a maioria dos receptores relacionados com eph é essencialmente expressa no cérebro. Devido à homologia dos receptores na família de eph, um 3 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ determinado ligando para um receptor especifico pode também ligar-se a outros receptores.

Os ligandos gue foram identificados para as tirosina-quinases receptoras são um grupo diverso de proteínas que afectam o crescimento, a diferenciação e a sobrevivência das células que expressam os receptores. Foram isolados ligandos para hek e elk, como discutido em maior pormenor a seguir. A identificação de ligandos adicionais para hek e elk que possam existir seria útil na investigação da natureza dos processos celulares regulados por sinalização através destes receptores. Se é desejável o aumento ou inibição de um sinal biológico particular mediado através destes receptores, é vantajoso identificar cada uma das proteínas que possam desempenhar um papel na transdução destes sinais. Além disso, é conhecido que algumas proteínas se podem ligar a receptores sem iniciar a transdução de sinal, incluindo a proteína antagonista do receptor de interleucina-1 (Eisenberg et al., Nature 343:341, 1990; Hannum et al., Nature 343:336, 1990; e Cárter et al., Nature 344:633, 1990). A identificação de proteínas adicionais que se ligam a hek ou elk também é desejável, de modo a determinar se estas proteínas funcionam como antagonistas.

Sumário da invenção A presente invenção refere-se a LERK-6 de mamífero na forma de uma proteína isolada ou homogénea. Além disso, a invenção refere-se a ADN isolados que codificam para LERK-6 de mamífero e a vectores de expressão compreendendo um ADNc que codifica para LERK-6 de mamífero. No âmbito da presente invenção incluem-se células hospedeiras que foram transfectadas ou transformadas com vectores de expressão que compreendem um ADNc que codifica para LERK-6 e processos para produzir LERK-6 por cultura destas células hospedeiras sob condições que levam à expressão de LERK-6.

Adicionalmente, a LERK-6 pode ser ligada a uma matriz de fase sólida e utilizada para purificar por afinidade, ou separar células que expressam hek ou elk na sua superfície celular. A invenção inclui separar células que têm o receptor 4 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ hek ou elk na sua superfície de uma mistura de células em solução, compreendendo contactar as células na mistura com uma superfície de contacto que tem uma molécula LERK-β nela e separar a superfície de contacto e a solução.

Descrição detalhada da invenção

Foi isolado um ADNc que codifica para LERK-6 de murídeo e está descrito na SEQ ID N0:1. Para comparação, isolou-se um exão de LERK-β humana e está descrito na SEQ ID NO: 7. Esta identificação de um ADNc que codifica para LERK-β permite construir vectores de expressão compreendendo ADNc que codificam para LERK-6; células hospedeiras transfectadas ou transformadas com os vectores de expressão; LERK-6 biologicamente activo como proteínas homogéneas; e anticorpos imunorreactivos com LERK-6. 0 LERK-6 poderá ser útil para o aumento, estimulação, proliferação ou crescimento de células que expressam o receptor hek ou elk. Uma vez que o receptor hek ou elk é encontrado no tecido do cérebro e testículos, é possível o tratamento de uma variedade de condições associadas com danos nesses tecidos. Além disso, o complexo de ligando e receptor pode estar envolvido no crescimento, desenvolvimento e/ou manutenção neural. Apesar de não se limitar a estas, descrevem-se a seguir utilizações particulares de LERK-6.

Tal como aqui utilizado, o termo "LERK-6" refere-se a um género de polipéptidos que se ligam e complexam independentemente com o receptor hek ou elk encontrado em células T e células cerebrais. 0 termo "LERK-6" inclui polipéptidos com a sequência de aminoácidos 1-184 de SEQ ID NO:2. Proporcionam-se para comparação, proteínas que são codificadas por ácidos nucleicos que contêm a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO:7. Além disso, os polipéptidos de LERK-6 têm um nível elevado de semelhança ou um nível elevado de identidade com a sequência de aminoácidos 1-184 de SEQ ID NO: 2 ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 que é proporcionada para comparação e cujos polipéptidos são biologicamente activos e ligam-se ao receptor hek ou elk. Adicionalmente, o termo "LERK-6 de murídeo" refere-se a produtos de genes biologicamente activos do ADN de SEQ ID 5 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ NO:1. Também se incluem no termo “LERK-6" as proteínas ligadas a GPI (que incluem uma região extracelular e uma região hidrófoba C-terminal) e proteínas solúveis ou truncadas que compreendem essencialmente a porção de ligação ao receptor da proteína, retêm actividade biológica e são capazes de ser segregadas. Exemplos específicos destas proteínas solúveis são as que compreende a sequência de aminoácidos 1 (Ala)-145(Asn) de SEQ ID NO:2. 0 termo “hek/elk" significa ou hek, ou elk, ou ambos, hek e elk. Por exemplo, o termo “anticorpos anti-hek/elk" refere-se a anticorpos contra hek ou elk. 0 termo “células que expressam hek/elk" refere-se a células que expressam ou o receptor hek, ou o receptor elk, ou células que expressam ambos os receptores hek e elk. 0 termo “biologicamente activo" tal como se refere a LERK-6, significa que o LERK-6 é capaz de se ligar a hek/elk. “Isolado" significa que o LERK-6 está isento de associação com outras proteínas ou polipéptidos, por exemplo, como um produto de purificação ou cultura de células hospedeiras recombinantes, ou como um extracto purificado. "Variante de LERK-6", tal como aqui utilizado, significa um polipéptido substancialmente homólogo ao LERK-6 nativo, mas que tem uma sequência de aminoácidos diferente da de LERK-6 nativo (humano, murídeo ou outra espécie de mamífero) devido a uma ou mais eliminações, inserções ou substituições). A sequência de aminoácidos variante é de preferência pelo menos 80% idêntica a uma sequência de aminoácidos de LERK-6 nativa, mais preferencialmente pelo menos 90% idêntica. A percentagem de identidade pode ser determinada, por exemplo, comparando a informação de sequência utilizando o programa de computador GAP, versão 6.0, descrito por Devereux et ai. {Nucl. Acids Res. 12:387, 1984) e disponível da University of Wisconsin

Genetics Computer Group (UWGCG). Os parâmetros por defeito preferidos para o programa GAP incluem: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e de 0 para não identidades) para nucleótidos e uma matriz de comparação ponderada de Gribskov e Burgess, Nucl. Acids Res. 14:6745, 1986, como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds., 6 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358, 1979; (2) uma penalização de 3,0 para cada intervalo e uma penalização adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo; e (3) nenhuma penalização para intervalos finais. As variantes podem compreender sequências substituídas de forma conservativa, o que significa que um determinado resíduo de aminoácidos é substituído por um resíduo com características físico-químicas semelhantes. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de um resíduo alifático por outro, tal como Ile, Vai, Leu ou Ala uns pelos outros, ou substituições de um resíduo polar por outro, tal como entre Lys e Arg; Glu e Asp; ou Gin e Asn. Outras substituições conservativas deste tipo, por exemplo, substituição de regiões inteiras com características de hidrofobicidade semelhante, são bem conhecidas. As variantes ou alelos de LERK-β que ocorrem naturalmente também são abrangidas pela invenção. Exemplos destas variantes são proteínas que resultam de fenómenos de splicing alternativo de ARNm, ou da clivagem proteolítica da proteína LERK-6, em que a propriedade de ligação de LERK-β é mantida. O splicing alternativo de ARNm pode originar uma proteína LERK-6 truncada mas biologicamente activa, tal como uma forma solúvel da proteína que ocorre naturalmente, por exemplo. As variações atribuíveis à proteólise incluem, por exemplo, diferenças nos terminais N ou C aquando da expressão em diferentes tipos de células hospedeiras, devido a remoção proteolítica de um ou mais aminoácidos terminais da proteína LERK-6 (em geral de 1-5 aminoácidos terminais). É previsto que a LERK-6 esteja ancorada à superfície celular através da ligação de glicosilfosfatidilinositol (GPI). As âncoras membranares de GPI, incluindo a estrutura química e seu processamento, estão descritas em Ferguson, M. e Williams, A., Ann. Rev. Biochem. 5_7:285, 1988 (aqui incorporado como referência). Quando inicialmente expressas, algumas proteínas compreendem um domínio hidrófobo C-terminal que contém sinais para ancoragem de GPI. Um local de clivagem está localizado a montante, muitas vezes cerca de 10-12 aminoácidos a montante do terminal N do domínio hidrófobo. O processamento pós-tradução inclui a clivagem da proteína no seu local de clivagem. Uma âncora de GPI liga-se ao novo aminoácido C-terminal exposto, da proteína madura, processada. 7 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Assim, quando as proteínas LERK-6 são expressas em células que reconhecem os sinais de ancoragem de GPI no domínio hidrófobo, a sequência de aminoácidos de comprimento total de SEQ ID NO:2 representa formas percursoras das proteínas.

Com base em sequências de consenso derivadas de outras proteínas ancoradas por GPI, a região hidrófoba em LERK-β da presente invenção estará provavelmente entre, e inclui, os aminoácidos 170 (Leu) e 184(Ser). Entre o domínio hidrófobo e o domínio de ligação ao receptor situa-se uma região espaçadora de cerca de 22 a 25 aminoácidos de comprimento. A região espaçadora estende-se desde aproximadamente o aminoácido 145 (Asn), 146(Glu) ou 147(Thr) até cerca do aminoácido 169(His). O Exemplo 3 descreve a construção de uma nova proteína de fusão hek:Fc que pode ser utilizada na pesquisa de LERK-6. A região Fc de IgGl humana descrita no exemplo pode ser substituída por outras regiões Fc de anticorpo. Outras regiões Fc adequadas são as que se podem ligar com afinidade elevada a proteína A ou proteína G e incluem a região Fc de IgGl humana, ou fragmentos da região Fc de IgGl humana ou de murídeo, e.g., fragmentos que compreendem pelo menos a região de charneira de modo que se irão formar ligações dissulfureto intercadeia. A proteína de fusão hek:Fc oferece a vantagem de ser facilmente purificada. Além disso, formam-se ligações dissulfureto entre as regiões Fc de duas cadeias de proteína de fusão separadas, criando dímeros.

Como descrito supra, um aspecto da invenção constitui os polipéptidos de LERK-6 solúveis. Os polipéptidos de LERK-6 solúveis compreendem todo ou parte do domínio extracelular de uma LERK-6 nativa, mas não possuem o sinal GPI que iria causar retenção do polipéptido numa membrana celular. Os polipéptidos de LERK-6 solúveis compreendem com vantagem o péptido de sinal nativo (ou um heterólogo) quando inicialmente sintetizados para promover a secreção, mas o péptido de sinal é clivado por secreção de LERK-6 a partir da célula. Os polipéptidos de LERK-6 solúveis abrangidos pela invenção retêm a capacidade de se ligar ao receptor hek ou elk. De facto, a LERK-6 solúvel pode também incluir parte do sinal GPI ou parte do domínio 8 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ citoplasmático ou outras sequências, desde que a proteína LERK-6 solúvel possa ser segregada. A LERK-6 solúvel pode ser identificada (e distinguida dos seus equivalentes ligados à membrana, não solúveis) separando células intactas que expressam a proteína desejada do meio de cultura, e.g., por centrifugação, e testando o meio (sobrenadante) quanto à presença da proteína desejada. A presença de LERK-6 no meio indica que a proteína foi segregada a partir das células e assim é uma forma solúvel da proteína desejada.

As formas solúveis de LERK-6 possuem muitas vantagens em relação à proteína LERK-6 ligada, nativa. A purificação das proteínas a partir de células hospedeiras recombinantes é possível, uma vez que as proteínas solúveis são segregadas a partir das células. Além disso, as proteínas solúveis são geralmente mais adequadas para administração intravenosa.

Exemplos de polipéptidos de LERK-6 solúveis incluem os que compreendem uma porção substancial do domínio extracelular de uma proteína LERK-6 nativa. Um exemplo de uma proteína LERK-6 de murídeo solúvel compreende os aminoácidos 1-145 de SEQ ID NO:2. Além disso, as proteínas LERK-6 solúveis, truncadas compreendendo menos do que todo o domínio extracelular são incluídas na invenção. Quando inicialmente expressa numa célula hospedeira, a LERK-6 solúvel pode compreender adicionalmente um dos péptidos de sinal heterólogos a seguir descritos que é funcional nas células hospedeiras utilizadas. Alternativamente, a proteína pode compreender o péptido de sinal nativo. Numa concretização da invenção, a LERK-6 solúvel pode ser expressa na forma de uma proteína de fusão compreendendo (do terminal N para C) o péptido de sinal do factor-α de levedura, um péptido FLAG® descrito a seguir e na patente US N° 5011912 e LERK-6 solúvel consistindo nos aminoácidos 1-134 de SEQ ID NO:2. Esta proteína de fusão recombinante é expressa em, e segregada a partir de células de levedura. O péptido FLAG® facilita a purificação da proteína e pode ser subsequentemente clivado da LERK-6 solúvel utilizando enteroquinase mucosa de bovino. As sequências de ADN isoladas que codificam para proteínas LERK-6 solúveis são abrangidas pela invenção. 9 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ A LERK-6 truncada, incluindo polipéptidos solúveis, pode ser preparada por qualquer uma de várias técnicas convencionais. Uma sequência de ADN desejada pode ser sintetizada quimicamente utilizando técnicas conhecidas per se. Também se podem produzir fragmentos de ADN por digestão com endonucleases de restrição de uma sequência de ADN clonada de tamanho total e isolada por electroforese em geles de agarose. Os ligantes que contêm um local (s) de clivagem por endonucleases de restrição podem ser utilizados para inserir o fragmento de ADN desejado num vector de expressão, ou o fragmento pode ser digerido em locais de clivagem naturalmente presentes ai. Também se pode utilizar o procedimento bem conhecido de reacção em cadeia com polimerase, para amplificar uma sequência de ADN que codifica para um fragmento de proteína desejado. Como outra alternativa, podem-se utilizar técnicas de mutagénese conhecidas para inserir um codão de terminação num ponto desejado, e.g., imediatamente a jusante do codão para o último aminoácido do domínio de ligação do receptor.

Como referido acima, a invenção proporciona polipéptidos de LERK-6 isolados ou homogéneos, quer recombinantes, quer não recombinantes. As variantes e derivados de proteínas LERK-6 nativas que retêm a actividade biológica desejada (e.g. a capacidade de se ligar a hek/elk) podem ser obtidas por mutações de sequências de nucleótidos que codificam para polipéptidos de LERK-6 nativos. As alterações da sequência de aminoácidos nativa podem ser conseguidas por qualquer um de vários métodos convencionais. As mutações podem ser introduzidas em loci particulares, sintetizando oligonucleótidos que contêm uma sequência mutante, flanqueada por locais de restrição que permitem a ligação a fragmentos da sequência nativa. Após ligação, a sequência reconstruída resultante codifica para um análogo com a inserção, substituição ou eliminação de aminoácidos desejada.

Alternativamente, podem-se utilizar procedimentos de mutagénese específico, para um local dirigida por oligonucleótidos, para se obter um gene alterado em que codões pré-determinados podem ser alterados por substituição, eliminação ou inserção. Exemplos de métodos para produzir as alterações descritas acima estão descritos em Walder et al. 10 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ (Gene £2:133, 1986); Bauer et al. (Gene £7:73, 1985); Craik (BioTechniques, Janeiro de 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principies and Methods, Plenum Press, 1981); Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488, 1985); Kunkel et al. (Methods in Enzymol. 154:367, 1987); e patentes U.S. Nos 4518584 e 4737462. A LERK-6 pode ser modificada para criar derivados de LERK-6 por formação de conjugados covalentes ou de agregação com outras porções químicas, tais como grupos glicosilo, lípidos, grupos fosfato, acetilo e semelhantes. Os derivados covalentes de LERK-6 podem ser preparados ligando as porções químicas a grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácidos de LERK-6, ou ao terminal N ou terminal C de um polipéptido de LERK-6, ou ao seu domínio extracelular. Outros derivados de LERK-6 no âmbito da presente invenção incluem conjugados covalentes ou de agregação de LERK-6, ou seus fragmentos, com outras proteínas ou polipéptidos, tal como por síntese em cultura recombinante como fusões N-terminais ou C-terminais. Por exemplo, o conjugado pode compreender uma sequência de polipéptidos de sinal ou de comando (e.g. o comando de factor-α de Saccharomyces) no terminal N de um polipéptido de LERK-6. O péptido de sinal ou de comando dirige, em co-tradução ou pós-tradução, a transferência do conjugado do seu local de síntese para um local no interior ou exterior da membrana celular, ou parede celular.

As fusões de polipéptido de LERK-6 podem compreender péptidos adicionados para facilitar a purificação e identificação de LERK-6. Estes péptidos incluem, por exemplo, poli-His ou os péptidos de identificação antigénica descritos na patente US N° 5011912 e em Hopp et al., Bio/Technology 6:1204, 1988. A invenção inclui também polipéptidos de LERK-6 com ou sem o padrão de glicosilação nativo associado. A LERK-6 expressa em sistemas de expressão de levedura ou mamífero (e.g. células COS-7) pode ser semelhante a, ou significativamente diferente de um polipéptido de LERK-6 nativa em termos de peso molecular e padrão de glicosilação, dependendo da escolha do sistema de expressão. A expressão de 11 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ polipéptidos de LERK-6 em sistemas de expressão bacterianos, tais como E. coli, proporciona moléculas não glicosiladas.

As construções de ADN equivalentes que codificam para várias adições ou substituições de resíduos ou sequências de aminoácidos, ou eliminações de resíduos ou sequências terminais ou internos, não necessários para actividade biológica ou ligação, são abrangidos pela invenção. Por exemplo, os locais de N-glicosilação no domínio extracelular de LERK-6 podem ser modificados para impedir a glicosilação, permitindo a expressão de um análogo de hidrato de carbono reduzido em sistemas de expressão de mamífero e levedura. Os locais de N-glicosilação em polipéptidos eucariotas caracterizam-se por um tripleto de aminoácidos Asn-X-Y, em que X é qualquer aminoácido excepto Pro e Y é Ser ou Thr. A proteína LERK-6 de murídeo compreende três destes tripletos, nos aminoácidos 13-15, 145-147 e 159-161 de SEQ ID N0:2. As substituições, adições ou eliminações adequadas à sequência de nucleótidos que codifica para estes tripletos resultará na prevenção da ligação de resíduos de hidrato de carbono na cadeia lateral de Asn. A alteração de um único nucleótido, seleccionado de modo que o Asn é substituído por um aminoácido diferente, por exemplo, é suficiente para inactivar um local de N-glicosilação. Procedimentos conhecidos para inactivar locais de N-glicosilação em proteínas incluem os descritos na patente US5071972 e EP276846.

Noutro exemplo, as sequências que codificam para resíduos de Cys que não são essenciais para a actividade biológica podem ser alteradas para fazer com que os resíduos de Cys sejam eliminados ou substituídos com outros aminoácidos, impedindo a formação de pontes dissulfureto intramoleculares incorrectas, aquando da renaturação. Outros equivalentes são preparados por modificação de resíduos de aminoácido dibásicos adjacentes, para aumentar a expressão em sistemas de levedura em que está presente a actividade de protease KEX2. Em EP212914 descreve-se a utilização de mutagénese específica do local para inactivar locais de processamento da protease KEX2 numa proteína. Os locais de processamento de protease KEX2 são inactivados por eliminação, adição ou substituição de resíduos para alterar pares Arg-Arg, Arg-Lys, e Lys-Arg, para eliminar a ocorrência destes resíduos básicos adjacentes. Os 12 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ emparelhamentos Lys-Lys são consideravelmente menos susceptíveis a clivagem por KEX2 e a conversão de Arg-Lys ou Lys-Arg em Lys-Lys representa uma abordagem conservativa e preferida para a inactivação de locais de KEX2. A LERK-6 de murideo contém um local de processamento de protease KEX2 nos aminoácidos 81-82 de SEQ ID NO:2.

As sequências de ácido nucleico no âmbito da invenção incluem sequências de ADN e de ARN isoladas que hibridam com as sequências de nucleótidos de LERK-6 aqui descritas, sob condições de rigor moderado ou elevado e que codificam para LERK-6 biologicamente activa. As condições de rigor moderado, como definido por Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2 ed. Vol. 1, pp. 101-104, Cold Spring

Harbor Laboratory Press, (1989), incluem a utilização de uma solução de pré-lavagem de 5X SSC, SDS a 0,5%, EDTA 1,0 mM (pH 8,0) e condições de hibridação de cerca de 55°C, 5X SSC, durante a noite. As condições de rigor elevado incluem temperaturas de hibridação e lavagem mais elevadas. O perito na arte irá reconhecer que a temperatura e concentração de sal da solução de lavagem podem ser ajustadas como necessário de acordo com factores como o tamanho da molécula de ácido nucleico.

Devido à degenerescência conhecida do código genético, em que mais do que um codão pode codificar para o mesmo aminoácido, uma sequência de ADN pode variar em relação à apresentada na SEQ ID NO:l ou SEQ ID NO:7 que é proporcionada para comparação, e codificar ainda para uma proteína LERK-6 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:8, que é proporcionada para comparação, respectivamente. Estas sequências de ADN variantes podem resultar de mutações silenciosas (e que ocorrem durante a amplificação por PCR) ou podem ser o produto de mutagénese deliberada de uma sequência nativa. A invenção proporciona sequências de ADN isoladas equivalentes, que codificam para LERK-6 biologicamente activa, seleccionada de entre: (a) ADNc que compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO:l; (b) ADN capaz de hibridar com um ADN de (a) sob condições de rigor moderado e que codifica para LERK-6 biologicamente activa; e (c) ADN que 13 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ é degenerado como resultado do código genético, em relação a um ADN definido em (a) ou (b) e que codifica para LERK-6 biologicamente activa. As proteínas LERK-6 codificadas por estas sequências de ADN equivalentes são abrangidas pela invenção. Para comparação, proporciona-se o ADNc que compreende a sequência de nucleótidos apresentada na SEQ ID NO: 7.

Os ADN que são equivalentes à sequência de ADN de SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:7, que é proporcionada para comparação, irão hibridar sob condições de rigor moderado e elevado com a sequência de ADN que codifica para os polipéptidos que compreendem sequências de aminoácidos de 1-184 de SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO:8, que é proporcionada para comparação. Exemplos de proteínas LERK-6 codificadas por este ADN incluem, mas não se limitam a, fragmentos de LERK-6 (solúveis ou ligados a GPI) e proteínas LERK-6 compreendendo um local(s) de N-glicosilação inactivado, local(s) de processamento de protease KEX2 inactivado ou substituição (ões) de aminoácidos conservativa, como descrito acima. AS proteínas LERK-6 codificadas pelo ADN derivado de outras espécies de mamífero, em que o ADN irá hibridar com o ADN de SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 7 também são incluídas. As proteínas LERK-6 codificadas pelo ADN derivado de outras espécies de mamífero, em que o ADN irá hibridar com o ADNc de SEQ ID NO:7, são proporcionadas para comparação.

As variantes que possuem a capacidade pretendida de se ligar ao receptor hek/elk podem ser identificadas por qualquer teste adequado. A actividade biológica de LERK-6 pode ser determinada, por exemplo, por competição para a ligação ao domínio de ligação do ligando do receptor hek/elk (i.e. testes de ligação competitiva).

Um tipo de teste de ligação competitiva para um polipéptido de LERK-6 utiliza uma LERK-6 solúvel, marcada radioactivamente e células que expressam hek/elk intactas. Em vez de células intactas, podem-se substituir proteínas de fusão hek/elk:Fc solúveis (tais como uma proteína de fusão hek:Fc ou elk:Fc) ligadas a uma fase sólida, através da interacção de uma proteína A, proteína G ou um anticorpo contra as porções hek, elk ou Fc da molécula, com a região Fc da proteína de fusão. Outro tipo de teste de ligação 14 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ competitiva utiliza receptores hek ou elk solúveis, marcados radioactivamente, tais como uma proteína de fusão hek:Fc ou elk:Fc e células que expressam LERK-6, intactas.

Os testes de ligação competitiva podem ser realizados seguindo uma metodologia convencional. Por exemplo, pode-se utilizar LERK-6 marcada radioactivamente para competir com um homólogo putativo de LERK-6 para testar quanto à actividade de ligação contra hek/elk ligado a superfície. Podem-se obter resultados qualitativos por testes competitivos de ligação de placas autorradiográficas, ou podem-se utilizar gráficos de Scatchard para produzir resultados quantitativos.

Alternativamente, as proteínas de ligação a hek/elk, tais como LERK-6 e anticorpos anti-hek/elk podem ser ligados a uma fase sólida, tal como uma matriz de cromatografia em coluna, ou um substrato semelhante, adequado para identificar, separar ou purificar células que expressam hek/elk na sua superfície. A ligação de uma proteína de ligação a hek/elk a uma superfície que contacta uma fase sólida pode ser realizada por qualquer meio, por exemplo, construindo uma proteína de fusão LERK6:F c e ligando esta a uma fase sólida através da interacção da proteína A ou proteína G. São bem conhecidos na arte vários outros meios para fixar proteínas a uma fase sólida e estes são adequados para utilizar na presente invenção. Por exemplo, podem-se revestir microesferas magnéticas com LERK-6 e mantê-las no recipiente de incubação através de um campo magnético. As suspensões de misturas de células contendo células que expressam hek/elk são contactadas com a fase sólida que tem polipéptidos de LERK-6. As células que têm hek/elk na sua superfície ligam-se à LERK-6 fixada e as células não ligadas são removidas por lavagem. Este método de ligação por afinidade é útil para purificar, pesquisar ou separar estas células que expressam hek/elk a partir da solução. Os métodos para libertar células seleccionadas positivamente a partir da fase sólida são conhecidos na arte e incluem, por exemplo, a utilização de enzimas. Estas enzimas são preferencialmente não tóxicas e não prejudiciais para as células e são preferencialmente dirigidas para a clivagem do parceiro de ligação à superfície celular. No caso de interacções hek/elk:LERK-6, a enzima irá clivar preferencialmente o receptor hek/elk, libertando assim a 15 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ suspensão celular resultante do material LERK-6 “estranho". A população de células purificada, em especial se obtida a partir de tecido fetal, pode então ser utilizada para repopulação de tecidos maduros (adultos). Por exemplo, estas células neurais purificadas podem ser administradas a um paciente com um distúrbio neurodegenerativo, tal como doença de Parkinson, doença de Alzheimer, doença de Lou Gehrig, etc.

Alternativamente, misturas de células que se suspeita que contêm células hek/elk+ podem ser primeiro incubadas com LERK-6 biotinilada. Os períodos de incubação são tipicamente de pelo menos uma hora de duração, para assegurar uma ligação suficiente a hek/elk. A mistura resultante é então passada através de uma coluna empacotada com esferas revestidas com avidina, em que a afinidade elevada da biotina para avidina proporciona a ligação da célula às esferas. A utilização de esferas revestidas com avidina é conhecida na arte. Veja-se Berenson, et al. J.Cell, Biochem., 10D:239 (1986). A lavagem de material não ligado e a libertação das células não ligadas são realizadas utilizando métodos convencionais.

Como descrito acima, a LERK-6 pode ser utilizada para separar células que expressam hek/elk. Num método alternativo, a LERK-6, ou um domínio extracelular, ou um seu fragmento pode ser conjugado com uma porção detectável, tal como 125I para detectar células que expressam hek/elk. A marcação radioactiva com I pode ser realizada por qualquer uma de varias metodologias convencionais que originam uma molécula 125I-LERK-6 funcional, marcada com actividade específica elevada. Ou pode-se utilizar um anticorpo iodado ou biotinilado contra a região hek/elk ou a região Fc da molécula. Pode-se utilizar outra porção detectável, tal como uma enzima que pode catalisar uma reacção colorimétrica ou fluorimétrica, biotina ou avidina. As células a ser testadas quanto à expressão de hek/elk podem ser contactadas com LERK-6 marcada. Após incubação, a LERK-6 marcada não ligada é removida e a ligação é medida utilizando a porção detectável.

As características de ligação de LERK-6 (incluindo variantes) podem também ser determinadas utilizando hek/elk solúvel, conjugado (por exemplo 125I-hek/elk:Fc) em testes de competição semelhantes aos descritos acima. Neste caso, no 16 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ entanto, as células intactas que expressam hek/elk ligadas a um substrato sólido, são utilizadas para medir a extensão em que uma amostra contendo uma variante de LERK-6 putativa compete com LERK-6 para ligação a um hek/elk solúvel, conjugado.

Outro meio de testar a LERK-6 inclui a utilização de anticorpos anti-LERK-6, linhas celulares que proliferam em resposta a LERK-6 ou linhas recombinantes que expressam hek/elk e proliferam na presença de LERK-6.

As proteínas LERK-6 aqui descritas também podem ser utilizadas para medir a actividade biológica de proteínas elk ou hek em termos da sua afinidade de ligação para LERK-6. Como exemplo, a LERK-6 pode ser utilizada para determinar se a actividade biológica é retida após modificação de uma proteína elk ou hek (e.g. modificação química, truncagem, mutação, etc.). A actividade biológica de uma proteína elk ou hek pode assim ser determinada antes de ser utilizada num estudo de pesquisa, ou possivelmente na clínica, por exemplo.

As proteínas LERK-6 têm utilidade como reagentes que podem ser utilizados por quem realiza estudos de "garantia de qualidade", e.g., para monitorizar o tempo de vida e estabilidade em armazenamento da proteína elk sob diferentes condições. A título ilustrativo, a LERK-6 pode ser utilizada num estudo de afinidade de ligação para medir a actividade biológica de uma proteína elk que foi armazenada a diferentes temperaturas, ou produzida em diferentes tipos de células. A afinidade de ligação da proteína elk modificada para LERK-6 é comparada com a da proteína elk não modificada, para detectar qualquer impacto adverso das modificações na actividade biológica de elk. De igual modo, a actividade biológica de uma proteína hek pode ser determinada utilizando LERK-6.

Os polipéptidos de LERK-6 também têm utilidade como transportadores para fornecer agentes ligados a eles a células que possuem o receptor de superfície celular elk ou hek. A expressão do antigénio hek foi referida para algumas linhas celulares de leucemia, incluindo a linha celular de leucemia de células T humanas designada por JM e a linha celular de leucemia de células pré-B humanas designada por LK63 (Boyd et 17 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ al., J. Biol. Chem. 267:3262, 1992, e Wicks et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 89:1611, 1992). As proteínas LERK-6 podem assim ser utilizadas para fornecer agentes de diagnóstico ou terapêuticos a estas células (ou a outros tipos de células que se verifica que expressam hek na superfície celular) em procedimentos in vitro ou in vivo.

Um exemplo desta utilização é expor uma linha celular leucémica hek+ ou elk+ a um conjugado agente terapêutico/LERK-β para determinar se o agente exibe citotoxicidade em relação às células leucémicas. Podem-se incluir num teste vários agentes terapêuticos diferentes ligados a LERK-6 para detectar e comparar o efeito citotóxico dos agentes nas células leucémicas. Os conjugados LERK-6/agente de diagnóstico podem ser utilizados para detectar a presença de células hek+ in vitro ou in vivo.

Os agentes de diagnóstico e terapêuticos que podem ser ligados a um polipéptido de LERK-6 incluem, mas não se limitam a drogas, toxinas, radionuclidos, cromóforos, enzimas que catalisam uma reacção colorimétrica ou fluorimétrica e semelhantes, sendo o agente particular escolhido de acordo com a aplicação pretendida. Exemplos de drogas incluem as utilizadas no tratamento de várias formas de cancro, e.g., mostardas de azoto, tais como mostarda de L-fenilalanina e azoto ou ciclofosfamida, intercalando agentes tais como cis-diaminodicloroplatina, antimetabolitos, tais como 5-fluorouracilo, alcaloides de vinca, tal como vincristina e antibióticos, tais como bleomicina, doxorubicina, daunorubicina e seus derivados. Entre as toxinas referem-se a ricina, abrina, toxina de difteria exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, proteínas inactivadoras de ribossoma, micotoxinas, tais como tricotecenos e seus derivados e fragmentos {e.g. cadeias simples). Os radionuclidos adequados para utilização de diagnóstico incluem, mas não se limitam a 123I, 1311, 99mTc, 111 In e 76Br. Os radionuclidos adequados para utilização terapêutica incluem, mas não se limitam a 131I, 211At, 77Br, 186Re, 188Re, 212Pb, 212Bi, 109Pd, 64Cu, e 67Cu.

Estes agentes podem ser ligados a LERK-6 por qualquer procedimento convencional. A LERK-6, sendo uma proteína, compreende grupos funcionais em cadeias laterais de aminoácido 18 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ que podem ser reagidos com grupos funcionais num agente desejado para formar ligações covalentes, por exemplo. Alternativamente, a proteína ou agente podem ser derivatizados para produzir ou ligar um grupo funcional reactivo desejado. A derivatização pode envolver a ligação de um dos reagentes de acoplamento bifuncionais disponíveis para ligar várias moléculas a proteínas (Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois) . São conhecidas várias técnicas para marcar radioactivamente proteínas. Os metais radionuclidos podem ser ligados a LERK-6 utilizando um agente quelante bifuncional adequado, por exemplo.

Os conjugados que compreendem LERK-β e um agente de diagnóstico ou terapêutico adequado (de preferência ligado de forma covalente) são assim preparados. Os conjugados são administrados ou utilizados de outro modo numa quantidade adequada para a aplicação particular.

Outra utilização da LERK-6 da presente invenção é como uma ferramenta de pesquisa para estudar o papel que a LERK-6, em conjunção com elk ou hek, pode desempenhar no crescimento ou diferenciação de células que possuem o receptor elk ou hek. Os polipéptidos de LERK-6 da presente invenção também podem ser utilizados em testes in vitro para a detecção de elk ou LERK-6 ou das suas interacções. De igual modo, a LERK-6 é útil em testes para hek ou da interacção de LERK-6 com hek.

Como discutido acima, quando vários tecidos de rato foram analisados quanto a ARNm de elk detectaram-se moléculas transcritas apenas no cérebro e testículos (Lhotak et al., supra). Pensa-se que a ligação de LERK-6 a receptores relacionados com eph no tecido neural exerce um efeito neuroprotector ou neurotrófico. A LERK-6 é útil como reagente de cultura de tecido. Pode-se adicionar uma proteína LERK-6 a neurónios cultivados in vitro para aumentar a viabilidade ou prolongar o tempo de vida dos neurónios cultivados, facilitando assim estudos de pesquisa e o tratamento clínico possível do tecido neural.

Uma concretização da presente invenção refere-se a um método para tratar distúrbios do tecido neural, envolvendo 19 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ contactar ο tecido neural com LERK-β. Estes distúrbios incluem lesão ou doenças neurológicas, quer crónicas, quer agudas. Uma proteína LERK-6 pode ser administrada a um mamífero para tratar esta lesão ou doença. Numa concretização da invenção, a LERK-β é utilizada no tratamento de condições neurodegenerativas caracterizadas ou mediadas, pelo menos em parte, pelo mecanismo de morte neural conhecido como excitotoxicidade. Adicionalmente, a LERK-6 pode ser administrada a um mamífero para exercer um efeito trófico no tecido neural. Num paciente que sofre de perda de, ou dano nos neurónios devido a lesão ou doença, a LERK-6 poderá aumentar a viabilidade desses neurónios que sobreviveram.

Os polipéptidos de LERK-6 da invenção podem ser formulados de acordo com métodos conhecidos utilizados para preparar composições farmaceuticamente úteis. A LERK-6 pode ser combinada em mistura, quer como o único material activo, quer com outros materiais activos conhecidos, com diluentes farmaceuticamente adequados (e.g., Tris-HCl, acetato, fosfato), conservantes (e.g. timerosal, álcool benzílico, parabenos), emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou transportadores. Os transportadores adequados e suas formulações estão descritos em Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a ed. 1980, Mack Publishing Co. Além disso, estas composições podem conter LERK-6 complexada com polietilenoglicol (PEG), iões metálicos ou incorporada em compostos poliméricos, tais como poli(ácido acético), poli(ácido glicólico), hidrogéis, etc., ou incorporada em lipossomas, microemulsões, micelas, vesículas unilamelares ou multilamelares, membranas de eritrócitos ou esferoblastos. Estas composições irão influenciar o estado físico, solubilidade, estabilidade, velocidade de libertação in vivo e velocidade de eliminação in vivo de LERK-6. A LERK-6 também pode ser conjugada com anticorpos contra receptores específicos de tecido, ligandos ou antigénios, ou acoplada a ligandos de receptores específicos de tecido. Quando o hek/elk é encontrado em células neoplásicas, a LERK-6 pode ser conjugada com uma toxina, sendo a LERK-6 utilizada para fornecer a toxina ao local específico ou pode ser utilizada para sensibilizar estas células neoplásicas para administrar subsequentemente agentes antineoplásicos. 20 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ A LERK-6 pode ser administrada tópica, parentericamente ou por inalação. O termo "parentérico" inclui injecções subcutâneas, injecção intravenosa, intramuscular, intracisterna ou técnicas de infusão. Estas composições irão tipicamente conter uma quantidade eficaz da LERK-β, isolada ou em combinação com uma quantidade eficaz de qualquer outro material activo. Estas dosagens e concentrações de droga desejadas contidas nas composições podem variar dependendo de muitos factores, incluindo a utilização pretendida, o peso corporal e idade do paciente e a via de administração. As doses preliminares podem ser determinadas de acordo com testes animais e o escalonamento das dosagens para administração humana pode ser realizado de acordo com práticas aceites na arte.

Os polipéptidos de LERK-6 podem existir como oligómeros, tais como dímeros ou trímeros ligados de forma covalente ou não covalente. Os oligómeros podem ser ligados por ligações dissulfureto formadas entre resíduos de cisterna em diferentes polipéptidos de LERK-6. Numa concretização da invenção, cria-se um dímero LERK-6 fundindo LERK-6 à região Fc de um anticorpo (e.g. IgGl) de um modo que não interfere com a ligação de LERK-6 ao domínio de ligação ao ligando de hek/elk. O polipéptido Fc é de preferência fundido com o terminal C de uma LERK-6 solúvel (compreendendo apenas a ligação ao receptor). A preparação geral de proteínas de fusão compreendendo polipéptidos heterólogos fundidos com várias porções de polipéptidos derivados de anticorpo (incluindo o domínio Fc) foi descrita, e.g., por Ashkenazi et al. (PNAS USA 8_8:10535, 1991) e Byrn et al. (Nature 344:677, 1990) aqui incorporado como referência. Uma fusão de gene que codifica para a proteína de fusão LERK-6:Fc é inserida num vector de expressão adequado. Deixam-se as proteínas de fusão LERK-6:Fc organizar de um modo semelhante às moléculas de anticorpo, ocorrendo a formação de ligações dissulfureto intercadeia entre polipéptidos Fc, originando LERK-6 bivalente. Se as proteínas de fusão são feitas com ambas, as cadeias pesadas e leves de um anticorpo, é possível formar um oligómero de LERK-6 com tanto quanto quatro regiões extracelulares de LERK-6. Alternativamente, podem-se ligar dois domínios de LERK-6 solúveis com um ligante peptídico. 21 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

As células hospedeiras adequadas para expressão de polipéptidos de LERK-6 incluem procariotas, leveduras ou células de eucariotas superiores. Os vectores de clonagem e expressão adequados para utilização com hospedeiros de células bacterianas, fúngicas, de levedura e de mamífero estão descritos, por exemplo, em Pouwels et al. Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, Nova Iorque, (1985). Também se podem utilizar sistemas de tradução isentos de células para produzir polipéptidos de LERK-6 utilizando ARN derivado de construções de ADN aqui descritas.

Os procariotas incluem organismos Gram-negativos ou Gram-positivos, por exemplo E. coli ou Bacilli. As células hospedeiras procariotas adequadas para transformação incluem, por exemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Salmonella typhimurium, e várias outras espécies dos géneros

Pseudomonas, Streptomyces, e Staphylococcus. Numa célula hospedeira procariota, tal como E. coli, um polipéptido de LERK-6 pode incluir um resíduo de metionina N-terminal para facilitar a expressão do polipéptido recombinante na célula hospedeira procariota. A Met N-terminal pode ser clivada a partir do polipéptido de LERK-6 recombinante, expresso.

Os polipéptidos de LERK-6 podem ser expressos em células hospedeiras de levedura, de preferência do género

Saccharomyces (e.g., S. cerevisiae) . Também se podem utilizar outros géneros de levedura, tais como Pichia, K. lactis ou

Kluyveromyces. Os vectores de levedura irão muitas vezes conter uma sequência de origem de replicação de um plasmídeo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autónoma (ARS), uma região promotora, sequências de poliadenilação, sequências para terminação da transcrição e um gene marcador seleccionável. As sequências promotoras adequadas para vectores de levedura incluem, entre outras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato-quinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 2073, 1980) ou outras enzimas glicolíticas (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg. 149, 1968; e Holland et al., Biochem. _^7; 4900, 1978), tais como enolase, gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, hexoquinase, piruvato-descarboxilase, fosfofrutoquinase, glucose-6-fosfato-isomerase, 3-fosfoglicerato-mutase, piruvato-quinase, e triosefosfato-isomerase, fosfoglucose-isomerase 22 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ glucoquinase. Outros vectores e promotores adequados para utilização na expressão de levedura estão também descritos em Hitzeman, EPA-73657 ou em Fleer et al., Gene, 107:285-195 (1991); e van den Berg et al., Bio/Technology, 8_: 135-139 (1990). Outra alternativa é o promotor de ADH2 repressível por glucose descrito por Russell et al. (J. Biol. Chem. 258: 2674, 1982) e Beier et al. (Nature 300:724, 1982). Os vectores vaivém replicáveis quer em levedura, quer em E. coli, podem ser construídos inserindo sequências de ADN de pBR322 para selecção e replicação em E. coli (gene Ampr e origem de replicação) nos vectores de levedura acima descritos. A sequência de comando do factor-α de levedura pode ser utilizada para dirigir a secreção do polipéptido de LERK-6. A sequência de comando do factor-α é muitas vezes inserida entre a sequência de promotor e a sequência de gene estrutural. Veja-se, e.g. Kurjan et al., Cell 3_0:933, 1982; Bitter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 8_1:5330, 1984; patente U.S. 4546082 e EP324274. Outras sequências de comando adequadas para facilitar a secreção de polipéptidos recombinantes a partir de hospedeiros de levedura são conhecidas dos peritos na arte. Uma sequência de comando pode ser modificada próximo da sua extremidade 3' para conter um ou mais locais de restrição. Isto irá facilitar a fusão da sequência de comando com o gene estrutural.

Os protocolos de transformação de levedura são conhecidos dos peritos na arte. Um destes protocolos é descrito por Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_5: 1929, 1978 . O protocolo de Hinnen et al. selecciona transformantes Trp+ num meio selectivo, consistindo o meio selectivo de base nitrogenada de levedura a 0,67%, casaminoácidos a 0,5%, glucose a 2%, adenina 10 pg/ml e uracilo 20 pg/ml.

As células hospedeiras de levedura transformadas por vectores contendo a sequência de promotor de ADH2 podem ser crescidas para induzir a expressão num meio "rico". Um exemplo de um meio rico é um que consiste de extracto de levedura a 1%, peptona a 2% e glucose a 1% suplementado com adenina 80 pg/ml e uracilo 80 pg/ml. A desrepressão do promotor ADH2 ocorre quando a glucose do meio é exausta. 23 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Também se podem utilizar sistemas de cultura de células de mamífero ou de insecto para expressar polipéptidos de LERK-β recombinantes. Os sistemas de baculovírus para produção de proteínas heterólogas em células de insecto são revistos por Luckow e Summers, Bio/Technology 6:47 (1988). Também se podem utilizar linhas celulares de origem mamífera estabelecidas. Exemplos de linhas celulares hospedeiras de mamífero incluem a linha COS-7 de células de rim de macaco (ATCC CRL 1651) (Gluzman et al., Cell 23:175, 1981), células L, células C127, células 3T3 (ATCC CCL 163), células de ovário de hamster chinês (CHO), células HeLa, e linhas celulares de BHK (ATCC CRL 10) e a linha celular CV-l/EBNA-1 derivada da linha celular de rim de macaco verde africano CVI (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et ai. (EMBO J. 10: 2821, 1991).

As sequências de controlo da transcrição e tradução para vectores de expressão de células hospedeiras de mamífero podem ser excisadas de genomas virais. As sequências de promotor e sequências de potenciador normalmente utilizadas são derivadas do vírus polioma, adenovírus 2, vírus 40 de símio (SV40) e citomegalovírus humano. As sequências de ADN derivadas do genoma virai de SV40, por exemplo a origem de SV40, promotor precoce e tardio, potenciador, locais de splicing e poliadenilação podem ser utilizados para proporcionar outros elementos genéticos para expressão de uma sequência de gene estrutural numa célula hospedeira de mamífero. Os promotores virais precoce e tardio são particularmente úteis pois ambos são facilmente obtidos a partir de um genoma virai como um fragmento que pode também conter uma origem virai de replicação (Fiers et al., Nature 273:113, 1978). Também se podem utilizar fragmentos de SV40 menores ou maiores, desde que seja incluída a sequência de aproximadamente 250 pb que se estende desde o local de HindiII até ao local de Bgl I localizado na origem virai de replicação de SV40.

Podem-se construir exemplos de vectores de expressão para utilização em células hospedeiras de mamífero como descrito por Okayama e Berg (Mol. Cell. Biol., 3_:280, 1983) . Um sistema útil para uma expressão de nível elevado, estável, de ADNc de mamífero em células epiteliais mamárias de murídeo, C127, pode ser construído substancialmente como descrito por Cosman et 24 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ al. (Mol. Immunol. 2_3:935, 1986). Um vector de expressão elevada útil PMLSV N1/N4, descrito por Cosman et al., Nature 312:768, 1984 foi depositado como ATCC 39890. Outros vectores de expressão de mamífero úteis estão descritos em EP-A-0367566, e pedido de patente U.S. com o N° de série 071701415, apresentado em 16 de Maio de 1991. Os vectores podem ser derivados de retrovírus. Em vez da sequência de sinal nativa e em adição a uma metionina iniciadora, pode-se adicionar uma sequência de sinal heteróloga, tal como a sequência de sinal para IL-7 descrita na patente dos Estados Unidos 4965195; a sequência de sinal para o receptor de IL-2 descrita em Cosman et al., Nature 312; 768 (1984); o péptido de sinal de IL-4 descrito em EP367566; o péptido de sinal do receptor de IL-1 tipo I descrito na patente US4968607; e o péptido de sinal do receptor de IL-1 do tipo II descrito no EP460846. A LERK-6 como proteína isolada, purificada ou homogénea de acordo com a invenção, pode ser produzida por sistemas de expressão recombinantes como descrito acima, ou purificada a partir de células que ocorrem naturalmente. A LERK-6 pode ser purificada até substancialmente à homogeneidade, como indicado por uma única banda de proteína por análise por electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE).

Um processo para produzir LERK-6 compreende cultivar uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão compreendendo uma sequência de ADN que codifica para LERK-6 sob condições suficientes para promover a expressão de LERK-6. A LERK-6 é então recuperada do meio de cultura ou extractos celulares, dependendo do sistema de expressão utilizado. Como é conhecido do perito na arte, os procedimentos para purificar uma proteína recombinante irão variar de acordo com factores como o tipo de células hospedeiras utilizadas e o facto de a proteína recombinante ser ou não segregada para o meio de cultura.

Por exemplo, quando se utilizam sistemas de expressão que segregam a proteína recombinante, o meio de cultura pode ser primeiro concentrado utilizando um filtro de concentração de proteínas disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Após o passo de concentração, o concentrado pode ser aplicado a uma matriz 25 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ de purificação, tal como um meio de filtração em gel. Alternativamente, pode-se utilizar uma resina de troca aniónica, por exemplo uma matriz ou substrato com grupos dietilaminoetilo (DEAE) pendentes. As matrizes podem ser acrilamida, agarose, dextrano, celulose ou outros tipos normalmente utilizados na purificação de proteínas. Alternativamente, pode-se utilizar um passo de troca catiónica. Os permutadores catiónicos adequados incluem várias matrizes insolúveis compreendendo grupos sulfopropilo ou carboximetilo. Os grupos sulfopropilo são preferidos. Por fim, pode-se utilizar um ou mais passos de cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa (RP-HPLC) utilizando meios de RP-HPLC hidrófobos (e.g. sílica gel com grupos metilo ou outros grupos alifáticos pendentes) para purificar ainda mais a LERK-6. Alguns ou todos os passos de purificação anteriores, em várias combinações, são bem conhecidos e podem ser utilizados para se obter uma proteína recombinante substancialmente homogénea. É possível utilizar uma coluna de afinidade compreendendo o domínio de ligação ao ligando de receptores hek/elk para purificar por afinidade polipéptidos de LERK-6 expressos. Os polipéptidos de LERK-6 podem ser removidos de uma coluna de afinidade utilizando técnicas convencionais, e.g., num tampão de eluição de concentração elevada de sal e em seguida dialisados num tampão de baixa concentração de sal para utilização ou por alteração do pH ou outros componentes, dependendo da matriz de afinidade utilizada. Alternativamente, a coluna de afinidade pode compreender um anticorpo que se liga a LERK-6. 0 Exemplo 5 descreve um procedimento para utilizar LERK-6 da invenção para produzir anticorpos monoclonais dirigidos contra LERK-6. A proteína recombinante produzida em cultura bacteriana pode ser isolada por ruptura inicial das células hospedeiras, centrifugação, extracção a partir de sedimentos celulares no caso de um polipéptido insolúvel ou a partir do fluido sobrenadante, no caso de um polipéptido solúvel, seguido de um ou mais passos de concentração, salting-out, troca iónica, purificação por afinidade ou cromatografia por exclusão de tamanhos. Por fim, a RP-HPLC pode ser utilizada para passos de purificação finais. As células microbianas podem ser rompidas 26 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ por qualquer método conveniente, incluindo ciclos de congelação-descongelação, ultra-sons, ruptura mecânica ou utilização de agentes de lise celular.

As células hospedeiras de levedura transformadas são preferencialmente utilizadas para expressar LERK-β como um polipéptido segregado, de modo a simplificar a purificação. 0 polipéptido recombinante segregado a partir de uma fermentação de células hospedeiras de levedura pode ser purificado por métodos análogos aos descritos por Urdal et al. (J. Chromatog. 296:171, 1984). Urdal et al. descrevem dois passos sequenciais de HPLC de fase inversa para purificação de IL-2 humana recombinante numa coluna de HPLC preparativa.

Fragmentos úteis dos ácidos nucleicos de LERK-β incluem oligonucleótidos de sentido inverso ou directo compreendendo uma sequência de ácido nucleico de cadeia simples (quer de ARN, quer ADN) capaz de se ligar a sequências de ARNm de LERK-6 alvo (sentido directo) ou ADN de LERK-6 (sentido inverso) Os oligonucleótidos de sentido inverso ou directo de acordo com a presente invenção compreendem um fragmento da região codificante de ADNc de LERK-6. Este fragmento compreende geralmente pelo menos cerca de 14 nucleótidos, de preferência de cerca de 14 a cerca de 30 nucleótidos. A capacidade para derivar um oligonucleótido de sentido inverso ou directo, com base numa sequência de ADNc que codifica para uma determinada proteína está descrita, por exemplo, em Stein e Cohen (Câncer Res. 48:2659, 1988) e van der Krol et al. (BioTechniques 6:958, 1988). A ligação de oligonucleótidos de sentido inverso ou sentido directo a sequências de ácido nucleico alvo resulta na formação de dúplices que bloqueiam a transcrição ou tradução da sequência alvo por um de vários meios, incluindo a degradação aumentada dos dúplices, terminação prematura da transcrição ou tradução, ou por outros meios. Os oligonucleótidos de sentido inverso podem assim ser utilizados para bloquear a expressão de proteínas LERK-β. Os oligonucleótidos de sentido inverso ou directo compreendem também oligonucleótidos com esqueletos de glícido-fosfodiéster modificados (ou outras ligações glicídícas, tais como as descritas em WO91/06629) e em que estas ligações glicídícas 27 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ são resistentes a nucleases endógenas. Estes oligonucleótidos com ligações glicidicas resistentes são estáveis in vivo (i.e. são capazes de resistir a degradação enzimática) mas retêm especificidade de sequência para serem capazes de se ligar a sequências de nucleótidos alvo. Outros exemplos de oligonucleótidos de sentido directo ou sentido inverso incluem os oligonucleótidos que estão ligados de forma covalente a porções orgânicas, tais como os descritos no WO90/10448 e outras porções que aumentam a afinidade do oligonucleótido para uma sequência de ácido nucleico alvo, tal como uma poli(L-lisina). Além disso, podem-se ligar agentes intercalares, tais como elipticina e agentes alquilantes ou complexos metálicos a oligonucleótidos de sentido directo ou sentido inverso, para modificar especificidades de ligação do oligonucleótido de sentido directo ou sentido inverso para a sequência de nucleótidos alvo.

Os oligonucleótidos de sentido inverso ou directo podem ser introduzidos numa célula que contém a sequência de ácido nucleico alvo por qualquer método de transferência de genes, incluindo, por exemplo, transfecção de ADN mediada por CaP04~, electroporação, ou utilizando vectores de transferência de genes, tais como o vírus de Epstein-Barr. Os oligonucleótidos de sentido inverso ou directo são preferencialmente introduzidos numa célula que contém a sequência de ácido nucleico alvo, inserindo o oligonucleótido de sentido inverso ou sentido directo num vector retroviral adequado, contactando em seguida a célula com o vector retroviral contendo a sequência inserida, quer in vivo, quer ex vivo. Vectores retrovirais adequados incluem, mas não se limitam aos derivados do retrovírus de murídeo M-MuLV, N2 (um retrovírus derivado de M-MuLV) ou os vectores de cópia dupla designados por DCT5A, DCT5B e DCT5C (veja-se pedido PCT US90/02656).

Os oligonucleótidos de sentido directo ou sentido inverso também podem ser introduzidos numa célula contendo a sequência de nucleótidos alvo por formação de um conjugado com uma molécula de ligação ao ligando, tal como descrito em WO91/04753. As moléculas de ligação ao ligando adequadas incluem, mas não se limitam a, receptores de superfície celular, factores de crescimento, outras citóquinas ou outros ligandos que se ligam a receptores de superfície celular. De 28 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ preferência, a conjugação da molécula de ligação ao ligando não interfere substancialmente com a capacidade da molécula de ligação ao ligando se ligar à sua molécula ou receptor correspondente, ou bloquear a entrada do oligonucleótido de sentido directo ou sentido inverso, ou da sua versão conjugada, para dentro da célula.

Alternativamente, pode-se introduzir um oligonucleótido de sentido directo ou sentido inverso numa célula que contém a sequência de ácido nucleico alvo, por formação de um complexo de oligonucleótido-lípido, como descrito em W090/10448. 0 complexo oligonucleótido-lípido de sentido directo ou sentido inverso é de preferência dissociado na célula por uma lipase endógena.

Além do acima exposto, os exemplos seguintes são proporcionados para ilustrar concretizações particulares e não para limitar o âmbito da invenção. EXEMPLO 1

Clonagem de ADNc de LERK-6 de murídeo

Este exemplo descreve um procedimento para isolar uma sequência de ADN que codifica para LERK-6 de murídeo da invenção. Uma biblioteca de ADNc de embrião de murídeo de 11,5 dias disponível comercialmente foi obtida da Clonetech Laboratories, Inc., Paio Alto, Califórnia. A biblioteca foi plaqueada de acordo com os procedimentos detalhados no manual fornecido pela Clonetech e pesquisada utilizando as sondas marcadas radioactivamente com 32P. As sondas foram cada uma produzidas utilizando técnicas convencionais. Em geral, fizeram-se amplificações por reacção em cadeia com polimerase (PCR) (Mullis e Faloons, Meth. Enzymol. 155:335-350, 1987) utilizando dois conjuntos de iniciadores. O primeiro conjunto, GATATTTACT GCCCGCACTA CAACAGCT SEQ ID NO:3 AGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC SEQ ID NO:4 foi utilizado para produzir fragmentos de ADN de cadeia dupla amplificados a partir de ADN de LERK-3. A LERK-3 é objecto dos pedidos de patente co-pendentes com os Nos de série 08/109745; 08/114426, 08/161132 e 08/240124 apresentados em 9 de Maio de 29 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ 1994. A sonda de LERK-3 compreendia os nucleótidos 260 a 481 da SEQ ID NO:l do pedido co-pendente com o N° de série 08/240124 apresentado em 9 de Maio de 1994. O segundo conjunto de iniciadores, ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G SEQ ID NO: 5 AGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT SEQ ID NO:6 foi utilizado para produzir fragmentos de ADN de cadeia dupla amplificados a partir de ADN de LERK-4. A LERK-4 também é objecto dos pedidos de patente co-pendentes com os Nos de série 08/109745; 08/114426, 08/161132 e 08/240124 apresentados em 9 de Maio de 1994. A sonda de LERK-3 compreendia os nucleótidos 110 a 467 da SEQ ID NO:3 do pedido co-pendente com o N° de série 08/240124 apresentado em 9 de Maio de 1994. Os fragmentos foram marcados radioactivamente com 32P e utilizados como sondas para pesquisar uma biblioteca embrionária de murideo. A pesquisa com as sondas foi realizada por procedimentos convencionais e identificaram-se os clones que hibridam. As condições de hibridação consistiam de 42°C e Starks a 50% lavado com 0,1X SSC a 63°C. Determinou-se a sequência de nucleótidos da inserção de ADNc de um clone individual isolado a partir da biblioteca embrionária de murideo, designado por clone λΐ3. Uma sequência de ADNc substancialmente completa da região codificante do clone de ADNc λΐ3 e a sequência de aminoácidos codificada por esta são apresentadas na SEQ ID NO:l e SEQ ID NO:2, respectivamente. A fase de leitura aberta dentro desta sequência codifica para uma proteína de 184 aminoácidos. Uma vez que os terminais N das proteínas da família LERK não são homólogos, pensa-se que o primeiro aminoácido de SEQ ID NO:l (Ala) está localizado no, ou muito próximo do terminal N nativo. Além disso, uma vez que a LERK-6 da presente invenção é homóloga a outras moléculas de LERK biologicamente activas, há uma probabilidade significativa de o ADNc de SEQ ID NO:l codificar para uma proteína biologicamente activa. A secreção desta proteína activa é possível através dos procedimentos descritos acima em relação à adição de uma metionina iniciadora adequada e uma sequência de sinal adequada, tal como a de IL-7 de murideo. A sequência 30 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ de aminoácidos de LERK-6 é 58% homóloga à de uma citóquina designada por LERK-3.

Um lisado celular contendo o ADN do clone λΐ3 (o ADNc de LERK-6 em XgtlO) foi depositado na American Type Culture Collection, Rockville, MD, EUA em 15 de Julho de 1994 e foi-lhe atribuído o número ATCC 75829. O depósito foi feito sob os termos do tratado de Budapeste. EXEMPLO COMPARATIVO 2 Clonagem de LERK-6 humana

Este exemplo descreve a clonagem de ácidos nucleicos que codificam para LERK-6 humana. A sequência de LERK-6 humana é de um clone genómico isolado após análise de uma biblioteca genómica humana com uma sonda de ADNc de LERK-6 de murídeo que codifica para os aminoácidos 30-173. Os filtros que contêm placas foram hibridados com a sonda marcada com 32P a 55°C, durante 24 h, lavados com 0,5 X SSC a 55°C e expostos a película de raios-X (Kodak XAR-5). Uma sequência de ácidos nucleicos contida neste clone é apresentada a seguir, também na SEQ ID NO: 7 e os aminoácidos codificados por esta são apresentados na SEQ ID NO:8: 6 TTC CAC GCA GOC GCG GGG GAC GAC G5C GGG GGC TAC ACG GTG GaG 46

Phe Hl a Ala Gly Ala Gly Aap Aap Gly Gly Gly Tyr Thr vai Gla 15 10 15 GTG AGC ATC AAT GAC TAC CTG GAC ATC TAC TGC CCG CAC TAT GGG GCG 94

Vai Ser Ile Asn Aap Tyr Leu Aap lie Tyr Cys Pro Hl a Tyr Gly Ala 20 25 30 CCG CTG CCG CCG GCC GAG CGC ATG GAG CAC TAC GTG CTG TAC ATG GTC 142

Pro Leu Pro Pro Ala Glu Arg Hat Glu Ula Tyr vai Leu Tyr Het vai 35 40 45 AAC GGC GAG GGC CAC GCC TCC TGC GAC CAC CGC CAG CGC GGC TTC AAG 190

Aen Gly Glu Gly Hia Ala Ser Cya Aap Ria Arp Gin Arg Gly phe Lya ' 50 55 60 CGC TGG GAG TGC AAC CGG CCC GCG GCG CCC GGG GGG CCG CTC AAG TTC 238

Arp Trp Glu Cye Aan Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Lya Phe 65 10 75 TCG GAG AAG TTC CAG CTC TTC ACG CCC TTC TCC CTG GGC TTC GAG TTC 286

Ser Glu Lya Phe Gin Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu Phe 80 85 90 95

CGG CCC GGC CAC GAG TAT TAC TAC ATC T

Arg Pro Gly Hla Glu Tyr Tyr Tyr Ile 100 314 31 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Em comparação com a LERK-6 de murídeo, a LERK-6 humana possui 98,077 porcento de semelhança e 93,269 porcento de identidade. EXEMPLO 3

Preparação da proteína de fusão elk:Fc solúvel

Este exemplo descreve a construção de um vector de expressão que codifica para uma proteína de fusão elk:Fc solúvel. Esta proteína de fusão pode ser utilizada nos testes de ligação do Exemplo 5, para determinar as características de ligação de LERK-6.

Um ADN e sequência de aminoácidos codificada para ADNc de elk de rato são apresentados em Lhotak et al. (Mol. Cell. Biol. 11:2496, 1991), aqui incorporado como referência. A proteína elk de rato tem um domínio extracelular de 538 aminoácidos, um domínio transmembranar de 25 aminoácidos e um domínio citoplasmático de 419 aminoácidos.

Um fragmento de ADNc de elk de rato foi fundido com a extremidade 5' do ADNc que codifica para a porção Fc de um anticorpo IgGl humano. O ADNc de elk de rato pode ser obtido de T. Pawson (Samuel Lunenfeld Research Institute, Mt. Sinai Hospital, Toronto). Introduziu-se um local de clivagem de endonuclease de restrição Asp718 a montante da região codificante de elk. Isolou-se um fragmento Asp718-Bglll de ADNc de elk de rato (compreendendo todo o domínio extracelular, a região transmembranar e uma pequena porção do domínio citoplasmático). O ADN que codifica para uma única cadeia de polipéptido compreendendo a região Fc de um anticorpo IgGl humano foi clonado no local de SpeI do vector pBLUESCRIPT SK® que está disponível comercialmente da Stratagene Cloning Systems, La Jolla, Califórnia. Este vector plasmídico é replicável em E. coli e contém um segmento poliligante que inclui 21 locais de restrição únicos. A sequência de nucleótidos do ADN clonado, juntamente com a sequência de aminoácidos do polipéptido Fc codificado por esta estão descritas no pedido PCT WO93/10151, aqui incorporado como referência. Introduziu-se um único local BglII e este inclui os codões para os aminoácidos três e 32 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ quatro do polipéptido Fc. 0 polipéptido Fc codificado estende-se desde a região de charneira N-terminal até ao terminal C nativo, i.e., é uma região Fc de anticorpo essencialmente de tamanho total. 0 fragmento de ADNc de elk Asp718-BglII acima descrito foi clonado no vector pBLUESCRIPT SK® contendo o ADNc de Fc, de modo que o ADNc de elk fica posicionado a montante do ADNc de Fc. 0 ADN de cadeia simples derivado da fusão de genes resultante foi mutado pelo método descrito em Kunkel (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:488, 1985) e Kunkel et al. (Methods in

Enzymol. 154:367, 1987) de modo a fundir perfeitamente todo o domínio extracelular de elk com a sequência Fc. 0 ADN mutado foi sequenciado para confirmar que os nucleótidos adequados foram removidos (i.e. que o ADN da região transmembranar e domínio citoplasmático parcial foram eliminados) e que as sequências de elk e Fc estavam na mesma fase de leitura. A proteína de fusão elk:Fc é de preferência sintetizada em células hospedeiras de mamífero, tais como células CV1-EBNA ou COS-7. A fusão de genes elk:Fc foi excisada e inserida num vector de expressão de mamífero designado por HAV-EO (Dower et al., J. Immunol. 142:4314, 1989). Transfectaram-se células hospedeiras de mamífero com o vector de expressão recombinante resultante e cultivaram-se para permitir a expressão transitória da proteína de fusão que foi segregada para o meio de cultura através do péptido de sinal elk. A proteína de fusão elk:Fc foi purificada por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de proteína A-Sepharose. EXEMPLO 4

Preparação da proteína de fusão hek:Fc solúvel

Este exemplo descreve a construção de um vector de expressão que codifica para uma proteína de fusão hek:Fc solúvel. Esta proteína de fusão pode ser utilizada nos testes de ligação do Exemplo 5, para determinar as características de ligação de LERK-6.

Um ADN e sequência de aminoácidos codificada para ADNc de hek humano é apresentado em Wicks et al. (Proc. Nat'l. Acad. Sei. USA, 89:1611, 1992), aqui incorporado como referência. 33 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Esta proteína hek compreende (do terminal N para o terminal C) um domínio extracelular, um domínio transmembranar e um domínio citoplasmático.

Dois fragmentos de ADN, um que codifica para um fragmento N-terminal do domínio extracelular de hek e o outro que codifica para um fragmento C-terminal do domínio extracelular de hek foram isolados por reacção em cadeia com polimerase (PCR), realizada sob condições convencionais, utilizando iniciadores de oligonucleótidos baseados na sequência de nucleótidos de hek publicada por Wicks et al., supra. 0 modelo para a PCR era ADNc preparado a partir de ARNm isolado de uma linha celular de leucemia de células T humanas designada por CCRF-HSB-2 (ATCC CCL120.1). Os produtos de PCR contendo a extremidade 5' do ADN de hek foram digeridos com Spel e HindIII para isolar um fragmento de ADN que se estende da extremidade 5' da sequência de hek humana madura (i.e., que não possui ADN que codifica para a sequência de sinal) até um local HindIII encontrado no gene hek. Os produtos de PCR que contêm a extremidade 3' do ADN do domínio extracelular de hek foram digeridos com HindIII e Ciai para isolar um fragmento que se estende desde o local HindIII interno até um local Ciai imediatamente a jusante da extremidade 3' da sequência que codifica para o domínio extracelular de hek. 0 local Ciai está num local de clonagem múltipla (mcs) introduzido imediatamente a jusante do domínio extracelular.

Isolou-se o ADN que codifica para uma muteína da região Fc de um anticorpo IgGl humano. Este ADN de muteína de Fc e o polipéptido codificado por este estão descritos no pedido de patente US com o N° de série 08/097827 intitulado "Novel Cytokine Which is a Ligand for 0X40" apresentado em 23 de Julho de 1993 o qual é aqui incorporado como referência. O ADN de muteína foi derivado de um ADN que codifica para o polipéptido Fc nativo por mutagénese dirigida para o local, realizada essencialmente como descrito por Deng e Nickoloff, Anal. Biochem. 200:81 (1992). A sequência de aminoácidos do polipéptido muteína de Fc é idêntica à do polipéptido Fc nativo descrito no pedido PCT WO93/10151, excepto que o aminoácido 19 foi alterado de Leu para Ala, o aminoácido 20 foi alterado de Leu para Glu e o aminoácido 22 foi alterado de 34 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

Gly para Ala. Esta muteína de Fc exibe uma afinidade reduzida para receptores de imunoglobulina.

Um vector recombinante contendo o ADN da muteína de Fc foi clivado com Ciai e Notl que clivam o vector numa região poliligante imediatamente a montante e a jusante, respectivamente, da inserção de ADN da muteína de Fc. Isolou-se o fragmento que codifica para a muteína de Fc desejada. 0 polipéptido muteína de Fc estende-se desde a região de charneira do terminal N até ao terminal C nativo, i.e. é uma região Fc de anticorpo essencialmente de tamanho total. Os fragmentos das regiões Fc, e.g., os que estão truncados na extremidade C-terminal, também podem ser utilizados. Os fragmentos contêm de preferência múltiplos resíduos de cisteína (pelo menos os resíduos de cisteína na região de charneira) para permitir a formação de ligações dissulfureto entre as porções de polipéptido Fc de duas proteínas de fusão hek:Fc separadas, criando dímeros. 0 vector de expressão de mamífero designado por SMAG4 foi clivado com Spel e Notl. 0 vector SMAG4 compreende uma sequência que codifica para o péptido de sinal de interleucina-7 de murídeo (descrito na patente US 4965195) inserido no vector de expressão elevada de mamífero pDC201 (descrito em Sims et al., Science 241:585, 1988 e no pedido PCT WO 89/03884) que também é capaz de replicação em E. coli. A Spel cliva o vector imediatamente a jusante da sequência que codifica para o péptido de sinal IL-7. A Notl cliva aproximadamente 155 pb a jusante do local Spel num local de clonagem múltipla do vector. Isolou-se o fragmento Spel/Notl grande contendo as sequências de vector e o péptido de sinal de IL-7 que codifica para ADN.

Fez-se uma ligação de quatro vias para inserir os dois fragmentos de ADN que codificam para hek e o fragmento de ADN que codifica para muteína de Fc descritos acima no vector de expressão SMAG4 clivado com Spel/Notl. As células de E. coli foram transfectadas com a mistura de ligação e o vector de recombinação desejado foi isolado a partir destas. O vector isolado codifica para uma proteína de fusão que compreende (desde o terminal N até ao terminal C) o péptido de sinal IL-7 35 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ de murídeo, ο domínio extracelular de hek, quatro aminoácidos codificados pelo mcs introduzido e a muteína de Fc.

O vector de expressão foi então co-transfectado com o plasmídeo pSV3.NE0 em células CV1/EBNA. A linha celular CV1/EBNA (ATCC CRL 10478) foi derivada a partir de uma linha celular de rim de macaco como descrito em McMahan et al. (EMBO J.r 1_0:2821, 1991). O vector pSV3.NEO expressa o antigénio T de SV40 que não é produzido pelas células hospedeiras. O vector pSV3.NEO é semelhante a pSV3 (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7J3:2072, 1981) mas contém adicionalmente um gene de resistência a neomicina. As células transformadas foram cultivadas para permitir a expressão transitória da proteína de fusão que é segregada para o meio de cultura através do péptido de sinal IL-7 de murídeo. A proteína de fusão pode ser purificada numa coluna de proteína A-Sepharose, eluída e utilizada para pesquisar células quanto à capacidade de se ligar à proteína hek:Fc ou proteína elk:Fc. EXEMPLO 5: Estudo de ligação A capacidade da LERK-6 se ligar a elk ou hek pode ser determinada utilizando o seguinte teste. Preparam-se células que expressam LERK-6 na superfície celular. O ADN de LERK-β é amplificado por PCR. Os iniciadores utilizados na PCR são seleccionados para definir os terminais da região codificante do ADN de LERK-6 e também incluem um local de restrição Xhol na extremidade 5' e um local Notl na extremidade 3' do ADN amplificado. O iniciador 5' incluía adicionalmente uma sequência Kozak de consenso a montante do codão de iniciação.

Os produtos de reacção são digeridos com Xhol e Notl e inseridos num vector de expressão clivado com Sall (que é compatível com Xhol) e Notl. O vector de expressão pode ser pDC410 que é um vector de expressão de mamífero que também se replica em E. coli. O pDC410 é semelhante a pDC406 (McMahan et al., EMBO J.10:2821, 1991) . O local de clonagem múltipla de pDC410 (mcs) difere do de pDC406 na medida em que contém locais de restrição adicionais e três codões de terminação (um em cada fase de leitura) . Um promotor de polimerase de T7 a jusante do mcs facilita a sequenciação do ADN inserido no mcs. Além disso, a origem de replicação de EBV é substituída por 36 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ ADN que codifica para ο antigénio Τ grande de SV40 (dirigido por um promotor de SV40) em pDC410.

As células CV1-EBNA-1 em placas de 10 cm2 são transfectadas com o vector de expressão recombinante contendo ADN de LERK-6. A linha celular CV-l/EBNA-1 (ATCC CRL 10478) expressa de forma constitutiva o antigénio-1 nuclear de EBV dirigido pelo potenciador/promotor imediato-precoce de CMV. A CV1-EBNA-1 é derivada da linha celular de rim de macaco verde africano CV-1 (ATCC CCL 70) como descrito por McMahan et al. (EMBO J. 10:2821, 1991) .

As células transfectadas são cultivadas durante 24 horas e as células em cada placa são então divididas numa placa de 24 poços. Após cultura por mais 48 horas, faz-se um teste de ligação pelo seguinte procedimento. As células transfectadas (cerca de 4 x 104 células/poço) são lavadas com BM-NFDM que é o meio de ligação (RPMI 1640 contendo albumina de soro bovino 25 mg/ml, azida de sódio 2 mg/ml, Hepes 20 mM, pH 7,2) ao qual se adicionou leite em pó não gordo 50 mg/ml. As células são então incubadas durante 1 hora a 37°C com várias concentrações da proteína de fusão elk:Fc preparada no Exemplo 2 ou proteína de fusão hek:Fc preparada no Exemplo 3. As células são então lavadas e incubadas com uma concentração saturante constante de um anti-IgG humana de ratinho marcado com 125I em meio de ligação, com agitação cuidadosa, durante 1 hora a 37°C. Após lavagem extensiva, as células são libertadas por tripsinização. O anti-IgG humana de ratinho utilizado acima é dirigido contra a região Fc da IgG humana e pode ser obtido do Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc., West Grove, PA. O anticorpo é marcado com iodo radioactivo utilizando o método de cloramina-T convencional. O anticorpo irá ligar-se à porção Fc de qualquer proteína de fusão elk:Fc ou hek:Fc que se ligou às células. Em todos os testes, a ligação não específica de 125I-anticorpo é testada na ausência de elk:Fc (ou hek:Fc), bem como na presença de elk:Fc (ou hek:Fc) e um excesso molar de 200 vezes de anticorpo anti-IgG humana de ratinho, não marcado. 37 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ Ο 125I-ant icorpo ligado à célula é quantificado num contador gama, Autogamma da Packard. Os cálculos de afinidade (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sei. 51:660, 1949) são gerados em RS/1 (programa BBN, Boston, MA) corrido num computador Microvax. EXEMPLO 6

Anticorpos monoclonais contra LERK-6

Este exemplo ilustra um método para preparar anticorpos monoclonais contra LERK-6. A LERK-6 purificada, um seu fragmento, tal como o domínio extracelular, péptidos sintéticos ou células que expressam LERK-6, podem ser utilizados para produzir anticorpos monoclonais contra LERK-6, utilizando técnicas convencionais, por exemplo, as técnicas descritas na patente US 4411993. Em resumo, os ratinhos são imunizados com LERK-6 como imunogénio emulsionado em adjuvante de Freund completo e injectados com quantidades que variam de 10-100 pg, subcutânea ou intraperitonealmente. Dez a doze dias mais tarde, os animais imunizados levam um reforço com LERK-6 adicional emulsionado em adjuvante de Freund incompleto. Os ratinhos levam um reforço periódico em seguida, num esquema de imunização semanal ou bissemanal. Recolhem-se periodicamente amostras de soro por sangramento retro-orbital, ou excisão da ponta da cauda, para testar quanto a anticorpos de LERK-6 por teste de dot blot, ELISA (teste imunoabsorvente com enzima ligada) ou inibição da ligação de hek ou elk.

Após detecção de um título de anticorpo adequado os animais positivos recebem uma última injecção intravenosa de LERK-6 em solução salina. Três a quatro dias mais tarde, os animais são sacrificados, as células de baço são recolhidas e fundidas com uma linha celular de mieloma de murídeo, e.g., NS1 ou de preferência P3x63AG8.653 (ATCC CRL 1580). As fusões produzem células de hibridoma que são plaqueadas em placas de microtítulo múltiplas num meio selectivo HAT (hipoxantina, aminopterina e timidina) para inibir a proliferação de células não fundidas, híbridos de mieloma e híbridos de células de baço.

As células de hibridoma sao pesquisadas por ELISA quanto à reactividade contra LERK-6 purificada por adaptações das 38 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ técnicas descritas em Engvall et al. Immunochem 8_:871, 1971 e na patente US 4703004. Uma técnica de pesquisa preferida é a técnica de captura de anticorpos descrita em Beckmann et al., (J. Immunol. 144:4212, 1990) . As células de hibridoma positivas podem ser injectadas intraperitonealmente em ratinhos BALB/c isogénicos para produzir ascites contendo concentrações elevadas de anticorpos monoclonais anti-LERK-6-L. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser crescidas in vitro em frascos ou garrafas rotativas, por várias técnicas. Os anticorpos monoclonais produzidos em ascites de ratinho podem ser purificados por precipitação com sulfato de amónio, seguido de cromatografia de exclusão em gel. Alternativamente, a cromatografia de afinidade baseada na ligação do anticorpo a proteína A ou proteína G também pode ser utilizada, tal como o pode a cromatograf ia de afinidade baseada na ligação a LERK-6. EXEMPLO 7

Produção de ratinhos transgénicos que sobre-expressam LERK-6

Este exemplo descreve um procedimento para produzir ratinhos transgénicos que sobre-expressam LERK-6. Os ratinhos transgénicos que sobre-expressam LERK-6 podem ser estudados para determinar os efeitos biológicos da sobre-expressão. Os pró-núcleos de ratinho (B16/J) são microinjectados com ADN de LERK-6 de acordo com o método descrito por Gordon et al., Science 214:1244-1246 (1981). Em geral, os ovos de ratinho fertilizados com pró-núcleos visíveis são primeiro colocados numa câmara de injecção e mantidos no lugar com uma pipeta pequena. Utiliza-se uma pipeta de injecção para injectar o gene que codifica para LERK-6 (e.g. clone #6C) nos pró-núcleos do ovo. Os ovos injectados são (i) transferidos para o oviducto de uma fêmea pseudográvida de 0,5 dias p.c.; ou (ii) cultivados in vitro na fase de duas células (durante a noite) e transferidos para o oviducto de uma fêmea pseudográvida de 0,5 dias p.c.; ou (iii) cultivados in vitro até à fase de blastocisto e transferidos para o útero de uma fêmea pseudográvida de 2,5 dias p.c.. De preferência, qualquer uma das primeiras duas opções pode ser utilizada, uma vez que evitam a cultura in vitro extensa e, de preferência, deverão ser transferidos aproximadamente 20-30 ovos microinjectados para evitar ninhadas pequenas. 39 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL: (i) REQUERENTE: Douglas P. Cerretti (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Citóquina designada por LERK-6 (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 8 (iv) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: Immunex Corporation (B) RUA: 51 University Street (C) CIDADE: Seattle

(D) ESTADO: WA

(E) PAÍS: EUA (F) CÓDIGO POSTAL: 98101 (v) FORMATO LEGÍVEL EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete (B) COMPUTADOR: Apple Macintosh (C) SISTEMA OPERATIVO: System 7.1 (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, Versão #1.25 (vi) DADOS DO PRESENTE PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US -a atribuir— (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO SOBRE REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: Stephen L. Malaska (B) NÚMERO DE REGISTRO: 32,655 (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/PROCESSO: 2826 (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (206) 587-0430 (B) TELEFAX: (206) 233-0644 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 555 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NÃO

(iv) ANTI-SENTIDO: NÃO 40 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ (vii) FONTE IMEDIATA: (Β) CLONE: LERK-6 (ix) CARACTERÍSTICA:

(A) NOME/CHAVE: CDS (B) LOCALIZAÇÃO: 1..552 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA : SEQ ID NO:1: GCC CGG GCC AAC GCT GAC CGA TAC GCA GTC TAC TGG AAC CGT AGC AAC 48 Ala Arg Ala Aan Ala Asp Arg Tyr Ala val Tyr Trp Asn Arg Ser Asn 1 5 10 IS ccc AGG TTT CAG GTG AGC GCT GTG GGT GAT GGC GGC GGC TAT ACC GTG 96 Pro Arg Phe Gin val Ser Ala Val Gly Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Val 20 25 30 GAG GTG AGC ATC AAC GAC TAC CTG GAT ATC TAC TGC CCA CAC TAC ggg 144 Glu Vai Ser Ile Asn Asp Tyr Leu Asp Ile Tyr Cys Pro His Tyr Gly 35 40 45 GCG CCG CTG CCC CCG GCT GAG CGC ATG GAGTCGG TAC ATC CTG TAC ATG 192 Ala Pro Leu Pro Pro Ala Glu Arg Met Glu Arg Tyr Ile Leu Tyr Met 50 55 60 GTG AAT GGT GAG GGC CAC GCC TCC TGT GAC CAC CGG CAG CGA GGC TTC 240 Vai Asn Gly Glu Gly His Ala Ser Cys Asp His Arg Gin Arg Gly Phe 65 10 75 80 AAG CGC TGG GAA TGC AAC CGG CCC GCA GCG CCC GGG GGA CCC CTC AAG 288 Lys Arg Trp Glu Cys Asn Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Lys 85 90 95 TTC TCA GAG AAG TTC CAA CTC TTC ACC CCC TTT TCC CTG GGC TTT GAG 336 Phe Ser Glu Lys Phe Gin Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu 100 105 110 TTC CGG CCT GGC CAC GAA TAC TAC TAC ATC TCT GCC ACA CCT CCC AAC 384 Phe Arg Pro Gly His Glu Tyr Tyr Tyr Ile Ser Ala Thr Pro Pro Asn 11S 120 125 CTC GTG GAC CGA CCC TGC CTG CGA CTC AAG GTT TAT GTG CGT CCA ACC 432 Leu Vai Asp Arg Pro Cys Leu Arg Leu Lys Val Tyr Val Arg Pro Thr 130 135 140 AAT GAG ACC CTG TAT GAG GCT CCA GAG CCC ATC TTC ACC AGT AAC AGC 480 Aan Glu Tbr Leu Tyr Glu Ala Pro Glu Pro Ile Phe Thr Ser Asn Ser 14S 150 155 160 TCC TGC AGC GGC CTG GGT GGC TGC CAC CTC TTC CTC ACC ACC GTC CCT 528 Ser Cya Ser Gly Leu Gly Gly Cys His Leu Phe Leu Thr Thr Val Pro 165 no 175 GTG CTG TGG TCC CTT CTG GGC TCC TAG S5S Vai Leu Trp Ser Leu Leu Gly Ser 180 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO : 2 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 184 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 41 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2 ) . Ala Arg 1 Ala Asn Ala 5 Asp Arg Tyr Ala Val 10 Tyr Trp Asn Arg Ser 15 Asn Pro Arg Phe Gin 20 Val Ser Ala Val Gly 25 Asp Gly Gly Gly Tyr 30 Thr Val Glu Vai Ser 35 Xle Asn Asp Tyr Leu Asp 40 Xle Tyr Cys Pro 45 His Tyr Gly Ala Pro 50 Leu Pro Pro Ala Glu 55 Arg Met Glu Arg Tyr 60 Xle Leu Tyr Met Vai Aan 65 Gly Glu Gly Ris Ala 70 Ser Cys Asp Hls 75 Arg Gin Arg Gly Phe BO Lys Arg Trp Glu Cys 85 Asn Arg Pro Ala Ala 90 Pro Gly Gly Pro Leu Lys 95 Phe Ser Glu Lys 100 Phe Gin Leu Phe Thr 105 Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu 110 Phe Arg Pro 115 Gly Hls Glu Tyr Tyr Tyr 120 Xle Ser Ala Thr 125 Pro Pro Asn Leu vai 130 Aap Arg Pro Cys Leu 135 Arg Leu Lys Val Tyr 140 Val Arg Pro Thr Asn Glu 145 Thr Leu Tyr Glu Ala 150 Pro Glu Pro Xle 155 Phe Thr Ser Asn Ser 160 Ser Cys Ser Gly Leu 165 Gly Gly Cys Hls Leu 170 Phe Leu Thr Thr Val 175 Pro Val Leu Trp Ser 180 Leu Leu Gly Ser (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GATATTTACT GCCCGCACTA CAACAGCT 28 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO 42 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ (iv) ANTI-SENTIDO: ΝΟ (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4 AGAGAAGGCG CTGTAGCGCT GGAAC 25 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:5 ACGTAGTCTA CTGGAACTCC AGTAACCCCA G 31 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

(iii) HIPOTÉTICA: NO

(iv) ANTI-SENTIDO: NO (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6 AGCCTCAAGC ACTGGCCAGA ACTCTCTCTG GAGT 34 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 314 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc pata ARNm

(iii) HIPOTÉTICA: NO 43 ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ (iv) ANTI-SENTIDO: ΝΟ (ix) CARACTERÍSTICA: (Α) ΝΟΜΕ/CHAVE: CDS (Β) LOCALIZAÇÃO: 2..313 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:7: G TTC CAC GCA GGC GCG GGG GAC GAC GGC GGG GGC TAC ACG GTG GAG 46

Phe His Ala Gly Ala Gly Asp Asp Gly Gly Gly Tyr Thr Vai Glu 15 10 15 GTG AGC ATC ΑΛΤ GAC TAC CTG GAC ATC TAC TGC CCG CAC TAT GGG GCG 94 Vai Ser Zle Asn Asp Tyr Leu Asp zle Tyr Cys Pro His Tyr Gly Ala 20 25 30 CCG CTG CCG CCG GCC GAG CGC ATG GAG CAC TAC GTG CTG TAC ATG GTC 142 Pro Leu Pro Pro Ala Glu Arg Met Glu His Tyr Vai Leu Tyr Met Vai 35 40 45 AAC GGC GAG GGC CAC GCC TCC TGC GAC CAC CGC CAG CGC GGC TTC AAG 190 Aan Gly Glu Gly His Ala Ser Cys Asp His Arg Gin Arg Gly Phe Lys 50 55 60 CGC TGG GAG TGC AAC CGG CCC GCG GCG CCC GGG GGG CCG CTC AAG TTC 238 Arg Trp Glu Cye A81) Arg Pro Ala Ala Pro Gly Gly Pro Leu Lys Phe 65 70 75 TCG GAG AAG TTC CAG CTC TTC ACG CCC TTC TCC CTG GGC TTC GAG TTC 286 Ser Glu Lys Phe Gin Leu Phe Thr Pro Phe Ser Leu Gly Phe Glu Phe 80 85 90 95 CGG ccc GGC CAC GAG TAT TAC TAC ATC T 314 Arg Pro Gly His Glu Tyr Tyr Tyr Ile 100 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 104 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (Xi ) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 8: Phe His 1 Ala Gly Ala 5 Gly Asp Asp Gly Gly 10 Gly Tyr Thr Vai Glu 15 Vai Ser Zle Asn Αβρ 20 Tyr Leu Asp Zle Tyr 25 Cys Pro His Tyr Gly Ala 30 Pro Leu Pro Pro 35 Ala Glu Arg Met Glu His 40 Tyr vai Leu Tyr Met Vai 45 Asn Gly Glu 50 Gly His Ala Ser Cys 55 Asp His Arg Gin Arg 60 Gly Phe Lys Arg Trp Glu Cys 65 Asn Arg Pro 70 Ala Ala Pro Gly Gly 75 Pro Leu Lys Phe Ser 80 Glu Lys Phe Gin Leu 85 Phe Thr Pro Phe Ser 90 Leu Gly Phe Glu Phe 95 Arg

Pro Gly His Glu Tyr Tyr Tyr Ile 100

Lisboa

Claims (17)

1. ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Sequência de ácido nucleico isolada que codifica para um polipéptido que se liga a hek/elk, em que o polipéptido é pelo menos 90% idêntico a uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre: (a) aminoácidos 1-134 de SEQ ID NO:2; (b) aminoácidos 1-145 de SEQ ID NO:2; e (c) aminoácidos 1-184 de SEQ ID NO:2.
2. 2. Sequência de ácido nucleico isolada que codifica para um polipéptido que se liga a hek/elk, seleccionada de entre: (a) uma sequência de ácido nucleico compreendendo a sequência de SEQ ID NO:l; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica para a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO:2; (c) uma sequência de ácido nucleico que híbrida sob condições de rigor elevado com o complemento da sequência de ácido nucleico de (a) ou (b); e (d) uma sequência de ácido nucleico que, devido à degenerescência do código genético, codifica para um polipéptido com a sequência de aminoácidos de um polipéptido codificado por uma sequência de ácido nucleico de (a) ou (c).
3. 3. Polipéptido isolado que se liga a hek/elk, em que o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90% idêntica a uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre: (a) aminoácidos 1-134 de SEQ ID NO: 2; (b) aminoácidos 1-145 de SEQ ID NO:2; e (c) aminoácidos 1-184 de SEQ ID NO:2.
4. 4. Polipéptido codificado por uma sequência de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 2.
5. 5. Vector de expressão compreendendo uma sequência de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2. ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ 2/3
6. 6. Célula hospedeira transfectada ou transformada com o vector de expressão de acordo com a reivindicação 5.
7. 7. Processo para produzir um polipéptido que se liga a hek/elk, compreendendo cultivar uma célula hospedeira de acordo com a reivindicação 6 sob condições que promovem a expressão, e recuperar o polipéptido a partir do meio de cultura.
8. 8. Anticorpo isolado que polipéptido de acordo com reivindicação 4.
9. 9. Anticorpo isolado de que é um anticorpo monoclonal. se liga especif icamente a um a reivindicação 3 ou a acordo com a reivindicação 8
10. 10. Mamífero não humano transgénico, em que todas as suas células germinativas e somáticas contêm uma sequência de ADN de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2 introduzida no referido mamífero, ou num ancestral do referido mamífero, numa fase embrionária.
11. 11. Método para separar células com um receptor hek/elk na sua superfície, a partir de uma mistura de células em suspensão, compreendendo contactar as células na mistura com uma superfície de contacto que possui um polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou reivindicação 4, e separar a superfície de contacto da suspensão.
12. 12. Método in vitro para fornecer uma molécula desejada a uma célula com hek/elk na sua superfície, compreendendo contactar a célula com uma proteína de fusão compreendendo um polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 e a molécula desejada.
13. 13. Composição compreendendo o polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 e um ou mais diluentes, emulsionantes, solubilizantes, adjuvantes e/ou transportadores farmaceuticamente adequados.
14. 14. Polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 para utilização como um medicamento. ΕΡ Ο 785 716 /ΡΤ 3/3
15. 15. Polipéptido de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 4 para o fabrico de um medicamento para utilização em terapia.
16. 16. Sequência de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1 que codifica para um polipéptido que se liga a hek/elk, em que o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre: (a) aminoácidos 1-134 de SEQ ID N0:2; (b) aminoácidos 1-145 de SEQ ID N0:2; e (c) aminoácidos 1-184 de SEQ ID N0:2.
17. 17. Polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 3 que se liga a hek/elk, em que o polipéptido compreende uma sequência de aminoácidos seleccionada de entre: (a) aminoácidos 1-134 de SEQ ID N0:2; (b) aminoácidos 1-145 de SEQ ID N0:2; e (c) aminoácidos 1-184 de SEQ ID N0:2. Lisboa,