JP3560609B2 - Elkリガンドと呼ばれる新規なサイトカイン - Google Patents
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Description
elkと呼ばれる細胞表面タンパク質は、チロシンキナーゼレセプターとして知られているタンパク質のファミリーのメンバーである。このファミリーのタンパク質は、リガンド結合で活性化される内因性キナーゼ活性を有する(Ullrichら,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51:713,1986)。elkの部分クローンは、最初、チロシンキナーゼ活性を発現するタンパク質についてスクリーニングされたラット脳cDNA発現ライブラリー中で発見された(Letwinら,Oncogene 3:621,1988)。その後、全縁elkコーディング領域に跨がる複合配列が、その部分クローンをプローブとして用いて、ラット脳cDNAライブラリー及び小脳ライブラリーから単離された複数の部分配列から誘導された(Lhotakら,Mol.Cell.Biol.11:2496,1991)。elkタンパク質は、hek(Boydら,J.Biol.Chem.267:3262,1992とWicksら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:1611,1992);hek同族体のmek4及びcek4(Sajjadiら,NewBiol.3:769,1991);eek(Chanら,Oncogene 6:1057,1991);erk(Chanら,前記文献);eck(Lindbergら,Mol.Cell.Biol.10:6316,1990);cek5(Pasquale,E.B.Cell Regulation 2:523,1991);及びeph(Hiraiら,Science 238:1717,1987)を含む多くの他のレセプターチロシンキナーゼと非常に密接に関連している。このサブファミリーのタンパク質は、それらの細胞質ドメインにおいてのみならず、それらの細胞外ドメインにおいても関連しており、41〜68%同一である。面白いことに、これら種々のレセプターの組織分布は多様である。例えば、elk mRNAの発現は精巣及び脳に限定されている(Lhotakら,前記文献)のに反して、eckはこれら同じ2種の組織だけでなく、肺、腸、腎臓、脾臓、卵巣、及び皮膚においても見出される。
レセプターチロシンキナーゼのリガンドは、それらレセプターを発現する細胞の成長、分化、及び生存に影響を及ぼす多様なタンパク質のグループである。今日まで、elkのリガンドは発見されていない。推定上のリガンドを同定すれば、elkタンパク質により調節されるであろう細胞プロセスの性質を調べるのに有用であることが判明するであろう。
発明の概要
本発明は、elkとして知られているラット細胞表面レセプターに結合するelkリガンド(elk−L)と呼ばれる新規なサイトカインを提供する。本発明は、このelk−Lタンパク質をコードする単離されたDNA、この単離されたDNAを含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞をelk−Lタンパク質の発現に適する条件下で培養することによりelk−Lを製造する方法も提供する。elk−Lタンパク質に対する抗体又はその免疫原性断片も開示されている。
発明の詳細な説明
本発明により、elkとして知られている細胞表面タンパク質に結合する新規なタンパク質リガンドをコードするcDNAが単離された。また、このelkリガンド(elk−L)cDNAを含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞をelk−Lの発現に適する条件下で培養して、その発現されたelk−Lを回収することにより組換えelk−Lポリペプチドを製造する方法も提供する。細胞外ドメインを含む可溶性のタンパク質を含む、精製elk−Lタンパク質も本発明に包含される。
本発明は、elk−L又はその抗原性断片であって、免疫原として働いてこのelk−L免疫原に特異的な抗体を生じさせることができるものも提供する。かくして、elk−L又はその抗原性断片に特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。
ここに開示した新規なサイトカインは、elk、つまりチロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであるラット細胞表面レセプターのリガンドである。このレセプターファミリーのメンバーは、リガンド結合で活性化されるキナーゼ活性を有する。細胞表面上のelkへのelk−Lの結合は、elkにより媒介される生物学的信号を起こすかも知れない。本発明のelkリガンドの1つの用途は、この生物学的信号の性質及びelk−Lがelkと一緒になってelkレセプターを保持する細胞の成長又は分化に果たし得る役割を検討するための研究道具としての用途である。elk mRNAの発現がラットの脳及び精巣で行われる(Lhotokら,前記文献)ので、elkが癌遺伝子を活性化できるという可能性が示唆されている(Letwinら,前記文献)。
本発明のelk−Lポリペプチドには、タンパク質精製試薬としての用途が見出されており、elk若しくはelk−L又はそれらの相互作用を検出するためのin vitroアッセイにおいて用いることもできる。elkリガンドのこれら及びその他の用途を以下で更に説明する。
クリーニングしようとするに際して核酸源として用いるのに適する細胞を同定するため、30を越える異なる型のマウス及びヒトの細胞を(ラットelk及び抗体Fcポリペプチドを含む融合タンパク質の形の)elkに結合する能力についてスクリーニングした。実施例2に記載したように、どの細胞型も検出可能なelk結合性を示さなかった。胎盤組織に成長因子及び分化因子が豊富なので、elk−Lクローンを単離しようと、ヒト胎盤cDNA発現ライブラリーをラットelk/Fcでスクリーニングした。胎盤がelk−Lを発現するかどうかは不明で、ヒトelk−Lに結合するラットelkの能力も不明であったが、実施例3に記載したようにヒトelk−L cDNAをうまく単離できた。ヒトelk−L cDNAクローンのコーティング領域のDNA配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号1及び配列番号2に記載する。
このコーディング領域を含むヒトelk−L cDNAをこの陽性クローンから単離して、カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systemsから入手できるクローニングベクターpBLUESCRIPT▲R▼ SK(−)の(マルチクローニング部位領域内の)Sma I部位に挿入した。pBLUESCRIPT▲R▼ SK(−)内のtele 7と名付けた大腸菌DH5α細胞内のこの生成組換えベクターを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに1992年10月9日に寄託し、受託番号ATCC69085が与えられた。この寄託は、ブダペスト条約の条項の下に行われた。
ヒトelk−L cDNAクローンの核酸配列及びコードされるアミノ酸配列とGenbank及びSwissproデータベースとの比較により、elkリガンドの配列は独特のものであることが分かった。この検索で、elkリガンドと限定された配列同一性を有する1つのアミノ酸配列を同定した。この配列は、B61タンパク質についての配列であり、ヒト臍静脈内皮細胞中でTNFにより誘発される新規な即時初期(immediate−early)応答遺伝子の産物として以前に同定されたものである(Holzmanら,Mol.Cell.Biol.10:5830,1990)。これら2つのタンパク質の細胞外ドメイン内の4つ全てのシステイン残基は保存されており、ヒトelk−LとB61間の全アミノ酸同一性は33%である。elkリガンドとは対照的に、B61タンパク質は分泌されることが報告されているが、疎水性尾状部で終端になっていて、グリコシルホスファチジルイノシトール結合によって膜に結合していることが示唆された(Holzmanら,前記文献)。B61タンパク質の機能は不明である。
ここで用いる“elk−L"という用語は、elkに結合することができ、かつここに開示した天然のelk−Lポリペプチドと相同性を示すポリペプチドであって、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列と80%を越える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの属を意味する。ヒトelk−Lは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は種々の霊長類細胞を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物種由来のelk−Lタンパク質のように、本発明の範囲内である。ここで用いる場合、“elk−L"という用語には、(細胞質ドメイン、膜貫通領域、及び細胞外ドメインを含む)膜結合タンパク質、並びにelk結合性を保持する短縮形(truncated)タンパク質が含まれる。かかる短縮形タンパク質には、例えば、細胞外(レセプター結合)ドメインだけを含む可溶性elk−Lが含まれる。
ヒトelk−L cDNAを放射標識して、種間ハイブリダイゼーションにより他の哺乳動物のelk−L cDNAを単離するプローブとして用いてもよい。例えば、他の哺乳動物種の胎盤組織から調製したcDNAライブラリーを放射標識ヒトelk−L cDNAでスクリーニングして、陽性クローンを単離することができる。また、種々の細胞系から単離したmRNAをノーザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、elk−L遺伝子のクリーニングに用いるのに適する哺乳動物elk−L mRNAの供給源を決定することができる。
以下の実施例3に記載したスクリーニング操作ではelk/Fc融合タンパク質を用いたが、elkを用いてelk−Lタンパク質の発現のためのクリーン及び候補細胞系をスクリーニングしてもよい。しかしながら、elk/Fc融合タンパク質には、容易に精製されるという利点がある。加えて、2つの別々の融合タンパク質鎖のFc領域間にジスルフィド結合を形成してダイマーを生成する。捜し求められるリガンドがマルチマーであろうという可能性から見て、elkリガンドの高親和性結合に潜在的利点があるので、このダイマー性elk/Fcレセプターを選んだ。
実施例1に記載したヒトIgG1Fc領域を他の抗体Fc領域に置き換えてもよい。他の適するFc領域は、プロテインA又はプロテインGと高い親和性で結合することができる領域であり、マウスIgG1のFc領域又はヒトIgG1Fc領域の断片が含まれ、例えば、分子間ジスルフィド結合を形成できるように少なくともヒンジ部を含む断片が含まれる。
本発明の1つの態様は、可溶性elk−Lポリペプチドを提供する。可溶性elk−Lポリペプチドは、天然elk−Lの細胞外ドメインの全部又は一部を含むが、そのポリペプチドを細胞膜上に停留するであろう膜貫通領域を欠く。可溶性elk−Lポリペプチドは、有利にも、合成された当初は分泌を促進するために天然の(又は異種起源の)シグナルペプチドを含むが、このシグナルペプチドは細胞からelk−Lが分泌されるとすぐに切り離される。用いることができる可溶性elk−Lポリペプチドは、elkレセプターに結合する能力を保持する。また、可溶性elk−Lは、この可溶性elk−Lタンパク質が分泌されることができることを条件として、膜貫通領域の一部又は細胞質ドメインの一部又は他の配列を含んでもよい。
可溶性elk−Lは、培養培地から所期のタンパク質を発現する無傷細胞を、例えば遠心分離により分離して、所期タンパク質の存在についてその培地(上澄み液)をアッセイすることによって同定すること(及びその不溶性膜結合同等物から区別すること)ができる。培地中でのelk−Lの存在は、そのタンパク質がその細胞から分泌されたこと、従って所期タンパク質が可溶型であることを示すものである。可溶性elk−Lは、このタンパク質の天然存在型であってもよい。
elk−Lの可溶型を用いることは一定の用途に有利である。組換え宿主細胞からのこれらタンパク質の精製は、これら可溶性タンパク質がその細胞から分泌されるので、容易なものとなっている。更に、可溶性タンパク質は一般に静脈内投与により適している。
可溶性elk−Lポリペプチドの例には、天然elk−Lタンパク質の全縁細胞外ドメインを含むものが含まれる。かかる可溶性elk−Lタンパク質の1つは、配列番号2のアミノ酸1(Ala)から213(Lys)までを含む。宿主細胞内で発現された当初は、この可溶性タンパク質は、用いる宿主細胞内で機能性である以下に記載した1つの異種起源シグナルペプチドを更に含んでもよい。また、このタンパク質は、天然シグナルペプチドを含んでもよく、その場合は、このelk−Lは配列番号2のアミノ酸−24(Met)から213(Lys)までを含む。本発明の1つの態様にいては、可溶性elk−Lは、最初、(N末端からC末端までに)酵母α因子シグナルペプチド、以下に記載しかつ米国特許第5,011,912号に記載されたFLAG▲R▼ペプチド及び配列番号2のアミノ酸1〜213を含む可溶性elk−Lを含む融合タンパク質として発現される。この組換え融合タンパク質は、酵母細胞内で発現されて酵母細胞から分泌される。FLAG▲R▼ペプチドは、このタンパク質を精製し易くし、その後にウシ粘膜エンテロキナーゼを用いてこの可溶性elk−Lから切り離される。本発明は、可溶性elk−Lタンパク質をコードするDNA配列を包含している。
可溶性ポリペプチドを含む短縮形elk−Lは、幾つかの慣用的技術のいずれによっても調製することができる。所期のDNA配列は、既知の技術を用いて化学的に合成することができる。DNA断片は、完全長クローン化DNA配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって作り、そしてアガロースゲルでの電気泳動によって単離することもできる。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有するリンカーを用いて所期DNA断片を発現ベクター内に挿入しても、またはそこに天然に存在する開裂部位においてその断片を消化してもよい。周知のポリメラーゼ連鎖反応操作を用いて所期タンパク質断片をコードするDNA配列を単離することもできる。更に別の方法として、既知の突然変異誘発法を用いて所期の位置に、例えば、細胞外ドメインの最後のアミノ酸についてのコドンのすぐ下流に、停止コドンを挿入してもよい。
もう1つのアプローチでは、酵素処理(例えば、Bal31エキソヌクレアーゼを用いるもの)を用いてDNA断片から末端ヌクレオチドを削除して特定の所期の末端を有する断片を得ることができる。市販されているリンカーの中には、Bal31消化により生成する平滑末端に連結することができ、かつ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有するものがある。また、DNA断片のN末端又はC末端を所期の点に再構築するオリゴヌクレオチドを合成することができる。このオリゴヌクレオチドは、所期のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有してもよく、そしてそのコーディング配列のN末端において開始コドン(ATG)を位置させてもよい。
本発明は、組換え型及び非組換え型の両方の精製elk−Lポリペプチドを提供する。所期の生物活性(例えば、elkに結合する能力)を保持する天然elk−Lタンパク質の変異体及び誘導体も、本発明の範囲内のものである。elk−L変異体は、天然elk−Lポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。ここで言及するelk−L変異体とは、天然elk−Lに実質的に相同性であるが、1又は2以上の欠失、挿入又は置換のために天然elk−L(ヒト、マウス又は他の哺乳動物種)のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。
この変異体アミノ酸配列は、好ましくは、天然elk−Lアミノ酸配列と少なくとも80%同一であり、最も好ましくは少なくとも90%同一である。この同一性のパーセンテージは、例えば、Devereuxら(Nucl.Acids Res.12:387,1984)により記載されUnivercity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWGCG)から入手できるGAPコンピュータープログラム,バージョン6.0を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。このGAPプログラムは、SmithとWaterman(Adv.Appl.Math 2:482,1981)により改訂されたNeedlemanとWunschのアラインメント法(J.Mol.Biol.48:443,1970)を利用するものである。GAPプログラムにとって好ましい欠如(default)パラメーターには次のものが含まれる:(1)ヌクレオチドについて一成分から成る比較マトリックス(同一については1の値を含み、非同一については0の値を含む)、及びSchwartzとDayhoff編,Atlas of Protein Sequence and Structure,National Biomedical Research Foundation,pp.353−358,1979に記載されたGribskovとBurgess,Nucl.Acids Res.14:6745,1986の加重比較マトリックス;(2)各ギャップについて3.0のペナルティー及び各ギャップにおける各記号について0.10のペナルティー;及び(3)末端ギャップについてはペナルティー無し。elk−L断片については、同一性のパーセンテージは、その断片中に存在する天然elk−Lタンパク質の部分に基づく。
天然アミノ酸配列の変異は、多くの既知技術のうちのいずれかによっても行うことができる。天然配列の断片に連結するのを可能にする制限部位が側面に配置された、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の座に突然変異を導入することができる。連結した後、得られた再構築配列は所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有する類縁体をコードする。
また、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を用いて、要求される置換、欠失、又は挿入に応じて変化させられた特定のコドンを有する変異遺伝子を提供することができる。上記の変異をもたらす好例となる方法は、Walderら(Gene 42:133,1986);Bauerら(Gene 37:73,1985);Craik(BioTechniques,January 1985,12−19);Smithら(Genetic Engineering:Principles and Methods,Plenum Press,1981);Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488,1985);Kunkelら(Methods in Enzymol.154:367,1987)により;及び米国特許第4,518,584号及び4,737,462号に開示されている。なお、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。
変異体は保存的に置換された配列を含んでもよく、これは、所与のアミノ酸残基が類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き換えられてもよいことを意味している。保存的置換の例には、Ile、Val、Leu、又はAla相互の置換の如き1つの脂肪族残基の他の残基との置換、又はLysとArg間;GluとAsp間;又はGlnとAsn間の如き1つの極性残基の他の残基との置換が含まれる。他のかかる保存的置換、例えば、類似の疎水性を有する全縁領域の置換が周知である。
グリコシル基、脂質基、リン酸基、アセチル基及びそれらに類した基の如き他の化学的部分と共有結合性又は凝集性複合体を形成することによってelk−Lを修飾してelk−L誘導体を作ることもできる。elk−Lの共有結合誘導体は、elk−Lアミノ酸側鎖上の又はelk−LポリペプチドのN末端若しくはC末端又はその細胞外ドメインにおける官能基にこれら化学的部分を連結することによって調製することができる。本発明の範囲内に入るelk−Lの他の誘導体には、N末端又はC末端融合のような組換え培養での合成による如き、elk−L又はその断片と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合性又は凝集性複合体が含まれる。例えば、この複合体は、elk−LポリペプチドのN末端においてシグナル又はリーダーポリペプチド配列(例えば、サッカロミセス属のα因子リーダー)を含んでもよい。このシグナル又はリーダーペプチドは、翻訳時又は翻訳後に、この複合体をその合成部位から細胞膜又は細胞壁の内側又は外側の部位に移動させる。
elk−Lポリペプチド融合体は、elk−Lの精製及び同定をし易くするために付加されたペプチドを含んでもよい。かかるペプチドには、例えば、米国特許第5,011,912号及びHoppら,Bio/Technology 6:1204,19888に記載されたポリHis又は抗原性同定ペプチドが含まれる。かかるペプチドの1つは、FLAG▲R▼ペプチド、つまりAsp−Tyr−Lys−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys(DYKDDDDK)である。これは、高度に抗原性であり、特異性モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供して速やかなアッセイと発現された組換えタンパク質の容易な精製を可能にする。この配列は、Asp−Lysペアリングのすぐ後の残基において、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に開裂されもする。このペプチドでキャップされた融合タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対しても抵抗性であり得る。4E11と呼ばれるマウスハイブリドーマは、一定の二価金属カチオンの存在下でこのペプチドDYKDDDDKに結合するモノクローナル抗体を産生し(参照によりここに組み入れられる米国特許第5,011,912号に記載されている)、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号HB9259の下に寄託されている。
本発明は、更に、天然パターンのグリコシル化を有するか又は有さないelk−Lポリペプチドを包含する。酵母又は哺乳動物発現系(例えば、COS−7細胞)内で発現されるelk−Lは、発現系の選択に依存して、分子量及びグリコシル化パターンにおいて天然elk−Lポリペプチドに類似していても有意に相違していてもよい。大腸菌の如き細菌発現系内でのelk−Lポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を与える。
生物活性又は結合性に必要ではないアミノ酸残基若しくは配列の種々の付加又は置換、又は末端残基若しくは内部残基又は配列の欠失をコードするDNA構築物を調製してもよい。例えば、elk−L細胞外ドメイン内のN−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を排除し、哺乳動物及び酵母発現系内でより相同性で炭水化物が少ない類縁体を発現させることができる。真核性ポリペプチド中のN−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn−X−Y(Xは、Pro以外のあらゆるアミノ酸であり、YはSer又はThrである)によって特徴付けられる。ヒトelk−Lタンパク質は、配列番号2のアミノ酸115〜117において、かかるトリプレットを1つ含む。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾は、Asn側鎖での炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加又は欠失をもたらすであろう。例えば、Asnが異なるアミノ酸によって置き換えられるように選んで1個のヌクレオチドを変化させれば、N−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質中のN−グリコシル化部位を不活性化する既知の操作には、米国特許第5,071,972号及びEP276,846に記載された操作が含まれる。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。
もう1つの例では、生物活性に必須でないCys残基をコードする配列を変化させてCys残基を欠失させるか又は他のアミノ酸と置き換わらせて、復元に際して誤った分子内ジスルフィド橋の形成を阻止することができる。その他の変異体は、KEX2プロテアーゼ活性が存在する酵母系内での発現を増進するために、隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって調製される。EP212,914は、タンパク質中のKEX2プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するために、部位特異的突然変異誘発法を用いることを開示している。残基を欠失、付加又は置換してArg−Arg、Arg−Lys、及びLys−Argペアを変化させることによってこれら隣接する塩基性残基の存在を排除し、KEX2プロテアーゼプロセシング部位を不活性化する。Lys−Lysペアリングは、KEX2開裂をかなり受けにくいので、Arg−Lys又はLys−ArgのLys−Lysへの転化は、KEX2部位の不活性化への保存的で好ましいアプローチに相当する。ヒトelk−Lは、配列番号2のアミノ酸242〜243、243〜244、及び246〜247において3つのKEX2プロテアーゼプロセシング部位を含有する。
本発明は、天然に存在するelk−L変異体も包含する。かかる変異体の例は、択一的なmRNAスプライシング(alternative mRNA splicing)から生じるか又はelk−Lタンパク質のタンパク質分解から生じるelk結合性が保持されたタンパク質である。mRNAの択一的なスプライシングは、例えば、タンパク質の天然に存在する可溶型の如き、短縮形ではあるが生物活性なelk−Lタンパク質を生成し得る。タンパク質分解が原因になり得る変異には、例えば、異なる型の宿主細胞内で発現させたときの、elk−Lタンパク質からの1又は2以上の末端アミノ酸(一般に1〜5末端アミノ酸)のタンパク質分解性除去による、N末端又はC末端における相違が含まれる。
本発明の範囲内に入る核酸配列には、温和な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下でここに開示した天然elk−Lヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ生物学的に活性なelk−Lをコードする単離されたDNA及びRNAが含まれる。温和なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sambrookら,Molecular Clonign:A Laboratory Manual,2 ed.Vol.1,pp.1.101−104,Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1989)に記載された条件を意味する。Sambrookらにより定義されているように、温和なストリンジェンシーの条件には、5×SSC,0.5%SDS,1.0mM EDTA(pH8.0)の前洗浄用溶液と約55℃,5×SSC,一晩のハイブリダイゼーション条件の使用が含まれる。苛酷なストリンジェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーションと洗浄が含まれる。熟練した技術者は、プローブの長さの如き要因に応じて必要なように温度及び洗浄溶液の塩濃度を調節できることを認識するであろう。
1を越えるコドンが同じアミノ酸をコードできる遺伝子コードの既知の縮重により、DNA配列が、配列番号1に提示した配列とは異なったものになってもなお配列番号1のアミノ酸配列を有するelk−Lタンパク質をコードすることができる。かかる変異体DNA配列は、沈黙突然変異(例えば、PCR増幅の間に起こるもの)から生じることも、また天然配列の故意の突然変異誘発の産物であることもある。
かくして、本発明は、生物活性なelk−Lをコードする次のものから選択される単離されたDNA配列を提供する:(a)天然哺乳動物elk−L遺伝子のコーディング領域に由来するDNA(例えば、配列番号1に提示したヌクレオチド配列を含むcDNA);(b)温和なストリンジェント条件下で(a)のDNAにハイブリダイゼーションでき、かつ生物活性なelk−LをコードするDNA;及び(c)(a)又は(b)で定義しDNAに対する遺伝子コードの結果としての縮重物であり、かつ生物活性なelk−LをコードするDNA。本発明は、かかるDNA配列によりコードされるelk−Lタンパク質を包含するものである。
配列番号1の天然DNA配列から変化したDNAであって、温和なストリンジェント条件下で天然DNA配列にハイブリダイズするであろう変異体DNAによりコードされるelk−Lタンパク質の例には、elk−L断片(可溶性又は膜結合断片)及び不活性化N−グリコシル化部位、不活性化KEX2プロテアーゼプロセシング部位、又は保存的アミノ酸置換を含む上記のようなelk−Lタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。他の哺乳動物種に由来するDNAであって、配列番号1のヒトDNAにハイブリダイズするであろうDNAによりコードされるelk−Lタンパク質も包含される。
elkに結合する必須の能力を有する変異体は、あらゆる適当なアッセイによって同定することができる。elk−Lの生物活性は、例えば、elkのリガンド結合ドメインへの結合について競合させること(即ち、競合結合アッセイ)によって測定することができる。
elk−Lポリペプチドについての競合結合アッセイの1つのタイプは、放射標識された可溶性ヒトelk−L、及び細胞表面elkを発現する無傷細胞を用いるものである。無傷細胞の代わりに、(elk/Fc融合タンパク質の如き)可溶性elkであってプロテインA又はプロテインGとその融合タンパク質のFc領域との相互作用により固相に結合したものを代用できるであろう。もう1つのタイプの競合結合アッセイは、elk/Fc融合タンパク質の如き放射標識された可溶性elk、及びelk−Lを発現する無傷細胞を用いるものである。また、可溶性elk−Lを固相に結合させてもよいであろう。
競合結合アッセイは、標準的方法を用いて行うことができる。例えば、放射標識elk−Lを用いて推定上のelk−L同族体と競合させ、表面結合elkに対する結合活性についてアッセイすることができる。競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより定性的結果を得ることも、スキャッチャードプロットを用いて定量的結果を得ることもできる。
また、可溶性elkを、カラムクロマトグラフィーマトリックス又は125Iの如き検出可能な部分の存在の分析に適する類似の支持体の如き固相に結合させてもよい。固相への結合は、例えば、プロテインA又はプロテインG含有マトリックスへのelk/Fc融合タンパク質の結合によって行うことができる。
elk−L(変異体を含む)の結合性は、上記のものと類似する競合アッセイにおいて複合化した可溶性elk(例えば、125I−elk/Fc)を用いて測定することもできる。しかしながら、この場合には、elk−Lを発現する無傷細胞、又は固体支持体に結合した可溶性elk−Lを用いて、推定上のelk変異体を含有するサンプルが、elk−Lへの複合化可溶性elkの結合について競合する程度を測定する。
本発明のelk−Lを結合アッセイに用いて、elkを発現する細胞を検出することができる。例えば、elk−L又は細胞外ドメイン又はその断片を125Iの如き検出可能な部分に複合化させることができる。125Iでの放射標識は、高い比活性にまで標識された機能性125I−elk−L分子を生成する幾つかの標準的方法のいずれによっても行うことができる。一方、発色反応又は蛍光反応を触媒できる酵素、ビオチン又はアビジンの如き他の検出可能な部分を用いてもよい。elk発現について試験すべき細胞を標識elk−Lに接触させてもよい。インキュベーション後、未結合標識elk−Lを除去し、その検出可能な部分を用いて測定する。
ここに開示したelkリガンドタンパク質を用いて、elk−Lに対する結合親和性に関してelkタンパク質の生物活性を測定することもできる。例を挙げると、elk−Lを結合親和性研究に用いて、異なる温度で保存されたか又は異なる細胞型内で産生されたelkタンパク質の生物活性を測定することができる。かくして、elkタンパク質の生物活性を、それを例えば調査研究に用いる前に確認することができる。
elk−Lタンパク質には、例えば、異なる条件下でのelkタンパク質の保存寿命及び安定性を追跡するために“品質保証”研究を行う人々により用いられ得る試薬としての用途が見出される。elkリガンドは、elkタンパク質の修飾(例えば、化学修飾、トランケーション、突然変異等)後に生物活性が維持されているかどうかを測定するのに用いることができる。elk−Lに対する修飾elkタンパク質の結合親和性を未修飾elkタンパク質のものと比較して、elkの生物活性へのその修飾のあらゆる不利な影響が検出される。
elkリガンドの別の用途は、タンパク質精製操作における試薬としての用途である。elk−L又はelk−L/Fc融合タンパク質を固体支持物質に慣用的技術によって付着させてアフィニティクロマトグラフィーによってelkを精製するのに用いることができる。
elk−Lポリペプチドは、ダイマー又はトリマーの如きオリゴマーとして存在することができる。オリゴマーは、異なるelk−Lポリペプチド上のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合によって連結される。本発明の1つの態様においては、elk−Lを抗体(IgG1)のFc領域に、elkリガンド結合ドメインへのelk−Lの結合を妨害しないようなやり方で融合させることによって、elk−Lダイマーが作られる。このFcポリペプチドを、好ましくは、(細胞外ドメインだけを含む)可溶性elk−LのC末端に融合させる。抗体由来ポリペプチドの種々の部分(Fcドメインを含む)に融合した異種起源のポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenaziら(PNAS USA 88:10535,1991)及びByrnら(Nature 344:677,1990)により記載されており、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。elk−L/Fc融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入する。このelk−L/Fc融合タンパク質は、抗体分子とほぼ同じように組み立てることができ、鎖間ジスルフィド結合をFcポリペプチド間で形成すると、二価のelk−Lが生成する。抗体の重鎖と軽鎖の両方で融合タンパク質を作る場合は、4つものelk−L細胞外領域eでlk−Lオリゴマーを形成することが可能である。また、2つの可溶性elk−Lドメインを米国特許第5,073,627号に記載されたGly4 SerGly5 Serリンカー配列の如きペプチドリンカーと連結させることもできる。
本発明は、elk−L細胞外ドメイン又はその断片のオリゴマーであって、ジスルフィド相互作用により連結されているか又はスペーサーアミノ酸連結基を有するか若しくは有さない融合タンパク質として発現されるオリゴマーを提供する。例えば、elk−L細胞外ドメインのダイマーをIgG Fc領域連結基により連結することができる。
本発明は、elk−Lの発現のための組換え発現ベクター、及びこの発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。あらゆる適する発現系を用いることができる。これらベクターには、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子から誘導されたものの如き、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結されたelk−L DNA配列が含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、mRNAリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がelk−L DNA配列に対して機能的に関係をもつときは、機能できるように連結されている。かくして、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がelk−L DNA配列の転写を制御するなら、elk−L DNA配列に機能できるように連結されているといえる。通常は複製起点により付与されるところの所期の宿主細胞内で複製する能力、及び形質転換体を同定する選択遺伝子を、この発現ベクター内に更に組み込んでもよい。
加えて、elk−L遺伝子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。例えば、シグナルペプチド(分泌リーダー)のDNA配列をelk−L配列とインーフレームで融合させて、elk−Lが最初はシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図する宿主細胞内で機能性であるシグナルペプチドは、elk−Lポリペプチドの細胞外分泌を増進する。シグナルペプチドは、細胞からelk−Lが分泌されるとすぐにelk−Lポリペプチドから切り離される。
elk−Lポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら,Cloning Vectors:A Laboratory Manual,Elsevier,New York,(1985)に記載されている。ここに開示したDNA構築物から誘導されるRNAを用いてelk−Lポリペプチドを産生させるために、無細胞翻訳系を用いることもできるだろう。
原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌又は桿菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュウドモナス、ストレプトミセス、及びスタフィロコッカス属に入る他の種々の種が含まれる。大腸菌の如き原核宿主細胞内では、elk−Lポリペプチドは、原核宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにN末端メチオニン残基を含んでもよい。このN末端Metは、発現された組換えelk−Lポリペプチドから切り離すことができる。
原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に1又は2以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターpBR322(ATCC37017)の如き市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。pBR322は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。適切なプロモーター及びelk−L DNA配列が、このpBR322ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、pKK223−3(スェーデンン,ウプサラのPharmacia Fine Chemicals)及びpGEM1(米国,ウィスコンシン州,マジゾンのPromega Biotec)が含まれる。
組換え原核宿主細胞発現ベクターに普通に用いられるプロモーター配列には、β−ラクタマーゼ(ペニシリナーゼ)、ラクトースプロモーター系(Changら,Nature 275:615,1978;及びGoeddelら,Nature 281:544,1979)、トリプトファン(trp)プロモーター系(Goeddelら,Nucl.Acids Res.8:4057,1980;及びEP−A−36776)及びtacプロモーター(Maniatis,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,p.412,1982)が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλPLプロモーター及びcI857ts不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λPLプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドpHUB2(大腸菌株JMB9(ATCC37092)内に存在する)及びpPLc28(大腸菌RR1(ATCC53082)内に存する)が含まれる。
また、elk−Lを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属(例えば、S.セレビシエ)から発現させてもよい。ピキア(Pichia)又はクルイベロミセス(Kluyveromyces)の如き酵母の他の属も用いることができる。酵母ベクターは、2μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列(ARS)、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、3−ホスホグリセレートキナーゼ(Hitzemanら,J.Biol.Chem.255:2073,1980)又は他の解糖酵素(Hessら,J.Adv.Enzyme Reg.7:149,1968;及びHollandら,Biochem.17:4900,1978)、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−6−ホスフェートイソメラーゼ、3−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman,EPA−73,657に更に記載されている。もう1つの代用物は、Russellら(J.Biol.Chem.258:2674,1982)及びBeierら(Nature 300:724,1982)により記載されたグルコース被抑制性ADH2プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのpBR322からのDNA配列(Ampr遺伝子及び複製の起点)を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。
酵母α因子リーダー配列を用いて、elk−Lポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Kurjanら,Cell 30:933,1982;Bitterら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:5330,1984;米国特許第4,546,082号;及びEP324,274を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列は、1又は2以上の制限部位を含有するようにその3'末端の近くで修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。
酵母形質転換手順は、当業者が知られている。かかる手順の1つは、Hinnenら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 75:1929,1978に記載されている。Hinnenらの手順は、選択培地中でTrp+形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、0.67%酵母窒素原基、0.5%カザミノ酸、2%グルコース、10μg/mlアデニン及び20μg/mlウラシルからなる。
発現を誘発するために、ADH2プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッチ培地の例は、80μg/mlアデニン及び80μg/mlウラシルを補充した1%酵母エキス、2%ペプトン、及び1%グルコースからなる培地である。ADH2プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。
哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えelk−Lポリペプチドを発現することもできるであろう。昆虫細胞内での異種起源タンパク質の産生のためのバキュロウィルス系についての総説が、LuckowとSummers,Bio/Technology 6:47(1998)により記載されている。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のCOS−7系(ATCC CRL1651)(Gluzmanら,Cell 23:175,1981)、L細胞、C127細胞、3T3細胞(ATCC CCL163)、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒーラー細胞、及びBHK(ATCC CRL10)細胞系、及びアフリカミドリザル腎臓細胞系CV−1(ATCC CCL70)からMcMahanら(EMBO J.10:2821,1991)により記載された通りに誘導されたCV−1/EBNA−1細胞系が含まれる。
哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから切り取ることができる。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス2、シミアンウィルス40(SV40)、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。SV40ウィルスゲノム、例えば、SV40起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるDNA配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。ウィルス初期及び後期プロモーターは特に有用である。というのは、いずれもウィルスの複製起点を含有することもできる断片としてウィルスゲノムから容易に得ることができるからである(Fiersら,Nature 273:113,1978)。より小さな又はより大きなSV40断片も用いることができる。但し、SV40ウィルス複製起点部位内に位置するHind III部位からBgl I部位に及ぶ約250bp配列が含まれることを条件とする。
哺乳動物宿主細胞内で用いる好例となる発現ベクターは、Okayama及びBerg(Mol.Cell.Biol.3:280,1983)により開示された通りに構築することができる。C127マウス乳房上皮細胞内の哺乳動物cDNAの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にCosmanら(Mol.Immunol.23:935,1986)により記載された通りに構築することができる。有用な高発現ベクターである、Cosmanら,Nature 312:768,1984に記載されたPMLSV N1/N4は、ATCC39890として寄託されている。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、EP−A−0367566、及び1991年5月16日に出願された米国特許出願第07/701,415号に記載されている。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。これらベクターをレトロウィルスから誘導してもよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第4,965,195号に記載されたインターロイキン−7(IL−7)についてのシグナル配列;Cosmanら,Nature 312:768(1984)に記載されたインターロイキン−2レセプターについてのシグナル配列;EP367,566に記載されたインターロイキン−4シグナルペプチド;米国特許第4,968,607号に記載されたI型インターロイキン−1レセプターシグナルペプチド;及びEP460,846に記載されたII型インターロイキン−1レセプターシグナルペプチドの如き、異種起源シグナル配列を付加してもよい。
本発明は、実質的に均質なelk−Lタンパク質であって、上記のような組換え発現系により産生させることも天然に存在する細胞から精製することもできるタンパク質を提供する。このelk−Lタンパク質は、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)による分析で単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質なまでに精製される。
このelk−Lタンパク質を産生する1つの方法は、elk−LをコードするDNA配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、elk−Lが発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に依存して、elk−Lタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。熟練した技術者は認識するであろうが、組換えelk−Lを精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びelk−Lが培養培地中に分泌されるかどうかといった要因に従って変動するであろう。
例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系用いる場合は、培養培地をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMilliprore Pellicon超濾過装置を用いて濃縮してもよい。濃縮工程後は、濃縮液をゲル濾過培地の如き精製マトリックスに適用することができる。また、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントのジエチルアミノエチル(DEAE)基を有するマトリックス又は支持体を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン交換工程を用いてもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性RP−HPLC媒体(例えば、ペンダントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル)を用いる1又は2以上の逆相高速液体クロマトグラフィー(RP−HPLC)工程を用いて、elk−Lを更に精製することができる。上述の幾つか又は全ての精製工程をいろいろに組み合わせて用いて、実質的に均質な組換えタンパク質を提供することができる。
elkのリガンド結合ドメインを含むアフィニティカラムを用いて、発現されたelk−Lポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。elk−Lポリペプチドを高塩類溶離緩衝液でアフィニティカラムから除き、次いで使用のために低塩類緩衝液中に透析してもよい。また、このアフィニティカラムは、elk−Lに結合する抗体を含んでもよい。実施例4には、本発明のelk−Lタンパク質を用いてelk−Lに向けられたモノクローナル抗体を生成させる操作が記載されている。
細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、宿主細胞をまず崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドなら細胞沈殿物から、可溶性ポリペプチドなら上澄み液から抽出した後、1又は2以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程のためにRP−HPLCを用いてもよい。微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる慣用的方法により崩壊させることができる。
形質転換酵母宿主細胞を用いて、好ましくはelk−Lを分泌ポリペプチドとして発現させる。これにより精製が簡単になる。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら(J.Chromatog.296:171,1984)により開示された方法と類似の方法により精製することができる。Urdalらは、組換えヒトIL−2の精製のための分取HPLCカラムでの2連続逆相HPLC工程を記載している。
核酸断片
本発明は、更に、ここに示したelk−Lヌクレオチド配列の断片を提供する。かかる断片は、望ましくは、配列番号1に示した配列の少なくとも約14のヌクレオチドを含む。前記断片のDNA及びRNA成分が、elk−L DNAの一本鎖型及び二本鎖型の両方と一緒にここに提供される。
かかるelk−L核酸断片の用途のうちの1つは、プローブとしての用途である。かかるプローブを種間ハイブリダイゼーション操作に用いて追加の哺乳動物種からelk−L DNAを単離することができる。一例として、elk−Lの細胞外ドメインに対応するプローブを用いることができる。これらプローブまたはin vitroアッセイにおいて及びノーザン及びサザーンブロットの如き操作においてelk−L核酸の存在を検出する用途が見出される。elk−Lを発現する細胞型を同定することができる。かかる操作は周知であるので、熟練した技術者は、特定の意図した用途に依存して、適する長さのプローブを選ぶことができる。
elk−L核酸の他の有用な断片は、一本鎖核酸配列(RNA又はDNAのいずれか)を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドであって、標的elk−L mRNA(センス)又はelk−L DNA(アンチセンス)配列に結合できるオリゴヌクレオチドである。本発明の、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、elk−L cDNAのコーディング領域の断片を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約14のヌクレオチド、好ましくは約14〜約30のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のcDNA配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作る能力は、例えば、Stein及びCohen,Cancer Res.48:2659,1988及びvan der Krolら,BioTechniques6:958,1988に記載されている。
標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重鎖の形成をもたらし、それは、それら二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段の1つにより又は他の手段により、翻訳(RNA)又は転写(DNA)を遮断する。。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、elk−Lタンパク質の発現を遮断することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖リン酸ジエステル主鎖(又はWO91/06629に記載された如き他の糖結合)を有するオリゴヌクレオチドを含み、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、in vivoで安定である(即ち、酵素分解に抵抗する)が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、WO90/10448に記載されたものの如き有機部分、及び標的核酸配列に対するそのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるポリ(L−リシン)の如き他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリプチシン(ellipticine)の如き介在物質、及びアルキル化剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて、そのセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を変化させてもよい。
アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、例えば、CaPO4媒介DNA形質移入、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子移動方法により又はエプスタイン−バーウィルスの如き遺伝子移動ベクターを用いることにより、導入することができる。好ましくは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、そのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウィルスベクター中に挿入してから、細胞をその挿入配列を含有するレトロウィルスベクターとin vivo又はex vivoのいずれかで接触させることにより導入する。適するレトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスM−MuLV,N2(M−MuLVから誘導されるレトロウィルス)、又はDCT5A、DCT5B及びDCT5Cと呼ばれる二重コピーベクター(PCT出願US90/02656を参照のこと)が含まれるが、これらに限定されない。
センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、WO91/04753に記載されているように、リガンド結合性分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することもできる。適するリガンド結合性分子には、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合性分子の複合化は、リガンド結合性分子のその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨げることがないか、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合型が細胞内に入るのを実質的に遮断することがないものである。
また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、WO90/10448に記載されているようにオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスの形成により、導入することができる。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内で解離される。
以下の実施例は、特定の態様を説明するために示したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例1
可溶性elk/Fc融合タンパク質の調製
この実施例は、elkリガンド(elk−L)をコードするcDNAクローンを検出するのに用いるための可溶性elk/Fc融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築を説明するものである。ラットelk cDNAについてのDNA及びコードされるアミノ酸配列は、参照によりここに組み入れられるLhotakら(Mol.Cell.Biol.11:2496,1991)に示されている。このラットelkタンパク質は、538アミノ酸細胞外ドメイン、25アミノ酸膜貫通ドメイン、及び419アミノ酸細胞質ドメインを有する。
ラットelk cDNA断片を、ヒトIgG1抗体のFc部分をコードするcDNAのN末端に融合させた。このラットelk cDNAは、T.Pawson(トロントのSamuel Lunenfeld Research Institute,Mt.Sinai Hospital)から入手した。Asp718制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をelkコーディング領域の上流に導入した。ラットelk cDNAのAsp718−Bgl II断片(全縁細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞質ドメインの小部分を含む)を単離した。
ヒトIgG1抗体のFc領域を含む単鎖ポリペプチドをコードするDNAを、カリフォルニア州ラジュラのStratagene Cloning Systemsから市販されているpBLUESCRIPT SK▲R▼ベクターのSpe I部位にクローン化した。このプラスミドベクターは大腸菌内で複製可能であって21の独特な制限部位を含むポリリンカーセグメントを含有する。独特なBgl II部位を挿入Fcコーディング配列の5'末端の近くに、Bgl II部位がFcポリペプチドのアミノ酸3及び4のコドンを包含するように導入した。
コードされるFcポリペプチドは、N末端ヒンジ部から天然C末端までに及ぶ、即ち、本質的に完全長の抗体Fc領域である。Fc領域の断片、例えば、C末端終端で先端を切られた断片も用いることができる。これら断片は、鎖間ジスルフィド結合が、2つの別々のelk/Fc融合タンパク質のFcポリペプチド部分の間に形成されて、上で説明したようなダイマーが生成できるように、複数のシステイン残基(少なくともヒンジ部におけるシステイン残基)を含有するのが好ましい。
上記のAsp718−Bgl II elk cDNA断片を、このFc cDNAを含有するpBLUESCRIPT SK▲R▼ベクター内に、このelk cDNAがFc cDNAの上流に位置するようにクローン化した。得られた遺伝子融合体から誘導した一本鎖DNAを、elkの全縁細胞外ドメインをFc配列に完全に融合させるために、Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488,1985)及びKunkelら(Methods in Enzymol.154:367,1987)に記載された方法によって突然変異誘発した。この突然変異誘発DNAを配列分析して、妥当なヌクレオチドが除去されたこと(即ち、膜貫通領域及び部分細胞質ドメインDNAが削除されたこと)及びelk配列とFc配列が同じリーディングフレーム内にあることを確認した。次いで、この融合cDNAを切り出して、pCAV/DHFRと呼ばれる哺乳動物発現ベクター内に挿入した。このpCAV/DHFRベクターは、PCT出願WO90/05183に記載されたpCAV/NOTに類似するが、選択可能なマーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)遺伝子を更に含有している。このDHFR遺伝子は、そのベクターを取り込んだ別のDHFR-哺乳動物細胞をメトトレキセート(MTX)の存在下で生育させる場合に、それらに選択性の利点を付与する。
elk/Fc融合タンパク質は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞培養物中で合成される。このelk/Fc融合体含有発現ベクターをCV−1細胞(ATCC CCL70)及びCOS−7細胞(ATCC CRL1651)内に形質移入した。これらは両方ともサルの腎臓から誘導したものである。elk/Fc融合タンパク質発現レベルは、CV−1細胞及びCOS−7細胞のいずれにおいても比較的低かった。従って、293細胞(形質転換一次ヒト胎児腎臓細胞,ATCC CRL1573)内での発現を試みた。
elk/Fc遺伝子融合体をHAV−EO(Dowerら,J.Immunol.142:4314,1989)と呼ばれる哺乳動物発現ベクター内に挿入した。HAV−EO/elk/Fcベクターで形質移入した293細胞を回転ビン内で培養して、elkシグナルペプチドにより培養培地内に分泌される融合タンパク質を一過性発現させた。この融合タンパク質をプロテインAセファロースカラムで精製し、溶出し、そして実施例2及び3に記載するように、elk/Fcタンパク質に結合する能力について細胞をスクリーニングするのに用いた。
実施例2:elk/Fc結合についての細胞のスクリーニング
elkリガンドをクローン化しようと、種々の細胞型をelk/Fcに結合する能力についてスクリーニングして核酸源として有用な候補細胞型を同定した。実施例1で産生させて精製した組換えラットelk/Fcタンパク質を、市販のEnzymobead放射性ヨウ素化試薬(BioRad)をメーカーの使用説明書に従って用いて放射標識した。この125I−elk/Fcタンパク質は、試験した幾つかの細胞系のいずれにも特異的結合性を示さなかった。Na125Iでのelk/Fcタンパク質の直接標識が生物活性を損なわせたかも知れないという懸念から、2工程結合アッセイを開発した。
この2工程結合アッセイは、細胞を非放射標識elk/Fcとインキュベートした後、125I−マウス抗ヒトFc抗体とインキュベートすることを含むものであった。後者の抗体は、細胞に結合したあらゆるelk/Fc融合タンパク質のFc部分と結合するであろう。
このマウス抗ヒトFc抗体は、ペンシルバニア州ウェストグローブのJackson Immunoresearch Laboratories,Inc.から入手した。この抗体は、Fcγレセプターに結合したFcタンパク質への最小限の結合を示すに過ぎなかった。この抗体をクロラミンT法を用いて標識した。簡単に説明すると、P6カラムをメーカーの使用説明書に従って調製した。マイクロヒュージ管(microfuge tube)内で、10μgの抗体を10μlのPBS中に溶解させた。2000μCiの無担体Na125Iを添加してその溶液をよく混合した。次いで、15μlの調製したばかりのクロラミンTの溶液(0.05Mリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.2)中32μg/ml)を添加してその混合液を室温で30分間インキュベートした。この混合液をすぐにP6カラムに適用した。次いで、溶出液の100〜150μl画分を採集することによってこのカラムから放射標識抗体を溶出させた。結合培地(25mg/mlウシ血清アルブミン、2mg/mlアジ化ナトリウム、20mM Hepes(pH7.2)を含有するRPMI1640)をピーク画分に添加して各画分の総容量を2mlにした。放射性ヨウ素化により、5〜10×1015cpm/mmolタンパク質の範囲の比活性が得られた。
スクリーニング操作は次の通りである。約2×106細胞を96ウェルプレート内で培養した。150μl結合培地を各ウェルに添加してから、細胞をelk/Fcの存在下又は不存在下で37℃で1時間緩やかに攪拌しながらインキュベートした。この96ウェルプレートの遠心分離によりその混合液から細胞を沈殿させ、PBSで洗浄し、再度遠心分離し、そして結合培地中に再懸濁した。次いで、細胞を上記のように調製した125I−マウス抗ヒトFc抗体と37℃で1時間インキュベートした。負のコントロールとして、細胞を125I−マウス抗ヒトFc抗体と過剰の未標識抗ヒトFc抗体の存在下でもインキュベートした。125I−抗体と1時間インキュベートした後、細胞と未結合の125I−抗体を、本質的にDowerら,J.Immunol.132:751,1984により記載された通りに、フタレートオイル分離法により分離した。細胞結合125I−抗体及びフリーの125I−抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。このアッセイではelk/Fcに結合した細胞型は見出されなかった。
これまでスクリーニングしなかった追加の細胞型を含む細胞を3番目の操作によりelk/Fc結合性についてアッセイした。細胞をelk/Fcとインキュベートした後、ビオチニル化抗ヒトFc抗体とインキュベートし、続いてストレプトアビジン−フィコエリトリン(Becton Dickinson)とインキュベートした。このビオチニル化抗体は、Jackson Immunoresearch Laboratoriesから購入したものである。ストレプトアビジンは、抗ヒトFc抗体に付いたビオチン分子に結合して、そして、その抗ヒト抗体がelk/Fc融合タンパク質のFc部分に結合する。フィコエリトリンは、検出可能な標識として役立つ蛍光性フィコビリタンパク質である。この標識の蛍光信号は、各細胞型について、FACScan▲R▼フローサイトメーター(Becton Dickinson)を用いて測定した。
上記の3種の操作の少なくとも1種によりelk/Fcに結合する能力についてスクリーニングした細胞には、次の一般的カテゴリーに属する約30の異なる細胞型が含まれていた:一次マウス胎児脳細胞、マウス胎児肝臓細胞系、マウス胎児脳細胞系、及びヒト肺癌(線維芽細胞様)細胞系。elk/Fc結合性について陽性と見なされる細胞型は同定されなかった。
実施例3:ヒト胎盤cDNAライブラリーからのelkリガンドcDNAの単離
実施例2でアッセイしたどの細胞型も検出可能なelk/Fc結合性を示さなかった。ヒト胎盤cDNAライブラリーをelkリガンドcDNAの可能性ある供給源として選んだ。というのは、胎盤組織には、成長及び分化因子が豊富だからである。上で説明したように、elkリガンドはelk(対応するレセプター)を発現する細胞の成長、生存、又は分化にある役割を果たしているようである。しかしながら、elk/Fc融合体を用いてクローンをスクリーニングするので、胎盤にFcレセプターが比較的豊富であるという事実が、クリーニングを試みるのに潜在的な問題をもたらした。
Larsenら(J.Exp.Med.,172:1559,1990)に記載されている通りに、プラスミドpDC302中にヒト胎盤cDNAライブラリーを調製した。pDC302は、大腸菌内でも複製する哺乳動物発現ベクターである(Mosleyら,Cell 59:335,1989)。簡単に説明すると、Haymerleら(Nucleic Acids Res.14:8615,1986)により記載されたのと類似のアダプター法により、胎盤cDNAをpDC302のBgl II部位内にクローン化した。
pDC302内の胎盤cDNAライブラリーで形質移入した大腸菌株DH5α細胞をプレートして、プレート当たり約500コロニーを得た。コロニーを各プレートから掻き取って、プールし、そして各プールからプラスミドDNAを調製した。次いで、約2000コロニーに相当するプールDNAを用いて、不完全集密層(sub−confluent layer)のCV−1/EBNA−1細胞をDEAE−デキストランを使用して形質移入した後、Luthmanら(Nucleic Acids Res.11:1295,1983)及びMcCutchanら(J.Natl.Cancer Inst.41:351,1986)に記載されたのと類似のクロロキン処理を行った。このCV−1/EBNA−1細胞系(ATCC CRL10478)は、CMV即時初期エンハンサー/プロモーターから推進されたEBV核抗原−1を構成的に発現する。CV1−EBNA−1はアフリカミドリザル腎臓細胞系CV−1(ATCC CCL70)からMcMahanら(EMBO J.10:2821,1991)により記載された通りに誘導した。
CV−1/EBNA−1細胞をcDNAライブラリーで形質移入するために、それら細胞を完全培地(10%(v/v)ウシ胎児血清(FCS)、50U/mlペニシリン、50U/mlストレプトマイシン、2mM L−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM))内で維持し、そして複数の単一ウェル有孔スライド(single−well chambered slide)(Lab−Tek)上に2×105細胞/ウェルの密度でプレートした。スライドを1mlヒトフィブロネクチン(PBS中10μg/ml)と30分間前処理した後でPBSで1回洗浄した。粘着細胞層から培地を除去して、66.6μM硫酸クロロキンを含有する1.5ml完全培地と置き換えた。次いで、0.2mlのDNA溶液(クロロキンを含有する完全培地中2μg/DNA,0.5mg/ml DEAE−デキストラン)をそれら細胞に添加して5時間インキュベートした。インキュベーション後、この培地を除去して、10%DMSOを含有する完全培地の添加によって2.5〜20分間衝撃を与えた後、その溶液を新しい完全培地と置き換えた。これら細胞を2〜3日間培養して挿入した配列を一過性発現させた。
CV−1/EBNA−1細胞の形質移入単層を、elk−Lの発現について、本質的にGearingら(EMBO J.8:3667,1989)により記載された通りにスライドオートラジオグラフィーによりアッセイした。形質移入CV−1/EBNA−1細胞(有孔スライドに粘着している)を脱脂粉乳を含む結合培地(BM−NFDM)(25mg/mlウシ血清アルブミン(BSA)、2mg/mlアジ化ナトリウム、20mM Hepes(pH7.2)及び50mg/ml脱脂粉乳を含有するRPMI1640)で1回洗浄した。次いで、細胞をBM−NFDM(1μg/ml)中でelk/Fcと室温で1時間インキュベートした。インキュベーション後、これら有孔スライド中の細胞単層をBM−NFDMで3回洗浄して未結合elk/Fc融合タンパク質を除去してから、実施例2で調製した40ng/ml125I−マウス抗ヒトFc抗体(1:50希釈液)と室温で1時間インキュベートした。これら細胞をBM−NFDMで3回洗浄した後、リン酸塩緩衝液(PBS)で2回洗浄して未結合125I−マウス抗ヒトFc抗体を除去した。細胞をPBS(pH7.3)中の2.5%グルタルアルデヒド中で室温で30分間インキュベートし、PBS中で2回洗浄し、そして風乾することにより固定した。細胞を含有するこれら有孔スライドをPhosphorimager(Molecular Dynamics)に一晩露光してから、コダックGTNB−2写真乳剤(6×水希釈液)に浸して暗室内で3〜5日間4℃で遮光ボックス内で露光した。次いで、これらスライドをコダックD19現像剤(40g/500ml水)中で約4分間現像し、水中で濯ぎ、そしてAgfa G433C定着液中で定着させた。これらスライドを25〜40の倍率の顕微鏡で個別に検査して、明るい背景と対照的なオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、elk−Lを発現する陽性細胞を同定した。
このスライドオートラジオグラフィー法を用いて、1つの形質移入体プールのアッセイによりelk/Fc結合について明らかに陽性である多数の細胞が示されるまでに、約300,000のcDNAを約2,000のcDNAのプールにスクリーニングした。次いで、このプールを500のプールに分配し、そしてスライドオートラジオグラフィーにより再度スクリーニングして陽性プールを同定した。この500のプールからの個々のコロニーを、検出可能なelk/Fc結合活性を有する表面タンパク質の合成を行う単一クローン(クローン#E7)が同定されるまでスクリーニングした。このクローンを単離し、そしてそのcDNA挿入体を配列決定した。
クローンE7のヒトelkリガンドcDNAのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号1及び2に示す。このcDNA挿入体の長さは2111bpである。この配列中には、82、85、及び346アミノ酸配のタンパク質をコードできそうな3つの妥当な大きさのオープンリーディングフレームがある。これら3つのうち、小さい方の2つのオープンリーディングフレームは、有効な翻訳開始コドン並びにシグナル配列の両方を欠いている。かくして、346アミノ酸オープンリーディングフレームについてのDNA配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号1及び2に示す。配列番号2のタンパク質はI型膜貫通タンパク質であり、N末端シグナルペプチド(アミノ酸−24〜−1)、細胞外ドメイン(アミノ酸1〜213)、膜貫通ドメイン(アミノ酸214〜241)、及び細胞質ドメイン(アミノ酸242〜322)を有する。シグナル配列を切り離した後の天然タンパク質の予測分子量は、35,180ダルトンである。この成熟タンパク質は、9.006の推定p Iを有する。307bpの5'非コーディング配列及び763bpの3'非コーディング配列がコーディング領域の側面に位置している。
ヒトelk−L cDNAをBsu361(これは停止コドンの下流を開裂する)での消化によってクローンE7から切り出した後、クレノウフラグメントで処理してBsu361消化末端を平滑にし、続いてSma I(これは開始コドンの上流を開裂して平滑末端を生成する)で処理した。全縁コーディング領域を含むこの切り出したcDNAをpBLUESCRIPT▲R▼ SK(−)(カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systems)の(マルチクローニング部位内の)Sma I部位内にクローン化した。大腸菌DH5α細胞内のこの得られたベクター(pBLUESCRIPT▲R▼ SK(−)内のtele 7と名付けた)は、米国メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(ATCC)に1992年10月9日に寄託し、受託番号ATCC69085が与えられた。この寄託は、ブダペスト条約の条項の下に行った。
実施例4:elk−Lに対するモノクローナル抗体
この実施例は、elk−Lに対するモノクローナル抗体の調製を説明するものである。elk−LをCOS−7又はCV−1/EBNA−1細胞の如き哺乳動物宿主細胞内で発現し、そしてelk/Fcアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。精製elk−L(又は細胞外ドメインの如きその断片)は、慣用的技術、例えば、米国特許第4,411,993号に記載された技術を用いてelk−Lに対するモノクローナル抗体を生成させるのに用いることができる。簡単に説明すると、完全フロイントアジュバント中に乳化させて免疫原としてのelk−Lでマウスを免疫感作し、そして10〜100μgの範囲の量で皮下又は腹腔内注射する。10〜12日後、これら免疫感作動物を不完全フロイントアジュバント中に乳化させた追加のelk−Lでブースター投与する。その後、1〜2週間毎の免疫感作スケジュールで、マウスに周期的にブースター投与する。ドットブロットアッセイ又はELISA(酵素結合免疫吸着アッセイ)によってelk−L抗体を試験するために、眼窩後方放血又は尾先端切除により血清サンプルを周期的に採取する。
適切な抗体力価を検出したら、生理食塩水中のelk−Lの静脈内注射を陽性動物に最後に1回行う。3〜4日してから、それら動物を殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をマウスメラノーマ細胞系、例えば、NS1又は好ましくはP3×63Ag8.653(ATCC CRL1580)と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、それらをHAT(ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン)選択培地中で複数のマイクロタイタープレートにプレートして、未融合細胞、メラノーマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。
これらハイブリドーマ細胞を精製elk−Lに対する反応性についてELISAにより、Engvallら,Immunochem.8:871,1791及び米国特許第4,703,004号に開示された技術を適合させることによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Beckmannら(J.Immunol.144:4212,1990)に記載された抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系BALB/cマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗elk−Lモノクローナル抗体を含有する腹水を生成させることができる。また、ハイブリドーマ細胞をin vitroでフラスコ又は回転ビン中で種々の技術によって生育させることができる。マウス腹水中に産生したモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿させた後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。また、elk−Lへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることができるように、プロテインA又はプロテインGへの抗体の結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーも用いることができる。
実施例5:ノーザンブロット分析
種々の組織におけるelk−Lの発現を調べるために、いろいろな組織からの2μgのポリA+mRNA(カリフォルニア州パロアルトのClonetechから入手可能)を含有するヒト組織ノーザンブロットをelk−Lリボプローブでプローブした。5'及び3'非コーディング配列を、Sma I及びBsu Iで消化することによってelkリガンドcDNAから除去し、そのコーディング領域をpBLUESCRIPT SK(−)ベクター(カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systems)内に挿入した。リボプローブは、elk−L cDNAをSfi Iで切断し、T3RNAポリメラーゼプロモーターを用いてelk−Lコーディング配列の3'最大450ヌクレオチドを転写することにより調製した。ブロットをこのリボプローブで63℃でハイブリダイズし、次いでまず1×SSC/0.1%SDSで68℃で1時間洗浄してから、0.1×SSC/0.1%SDSで68℃で30分間洗浄した。このブロットを増感紙の間にはさんだX線フィルムに−70℃で11日間曝した。主要3.5kbメッセージが、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、及び脾臓で認められた。
脳及び精巣がelkレセプターを発現すると報告されたただ二つの組織である(Lhotakら,前記文献)のだが、elk−L mRNAは全成体脳内に検出可能なレベルでは存在しなかった。脳内での発現が非常に低レベルであるか又は異なる領域に限定されており、従って上述の技術により検出されなかった可能性がある。この組織を更に調べるために、8日齢及び若年成体ラットからの切開した脳をelk−L DNAでプローブした。elk−Lは発達中のラットの脳内で発現されるようで、嗅球内で高レベルに発現された。嗅球内でのelk−Lの発現は、成体期まで続くようである。面白いことに、脳が休止するのとは対照的に、嗅球は哺乳動物の生涯全体にわたって活発に再生される。
第2ノーザンブロットにより、elk−L mRNA発現は、ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)内のTNFにより上方調節されることが明らかになった。HUVEC内のB61 mRNAは、それら細胞をIL−1又はTNFで処理することにより誘発可能であることが示された(Holzmanら,前記文献)。elk−LとB61の間の相同性の程度からみて、HUVEC mRNA(休止細胞又はTNFで誘発された細胞からのもの)のノーザンブロットを上記のelk−Lリボプローブでプローブした。他の組織内で見られる主要3.5kb種は、TNFでの処理後に特異的に誘発された。
実施例6:サザーンブロット分析
いろいろな種におけるelk−L DNAの存在を次のようにして調べた。いろいろな種からのEcoR I消化DNA(カリフォルニア州パロアルトのClonetech)からなるブロットを予備ハイブリダイゼーション緩衝液中で63℃で予備ハイブリダイズした。次いで、このブロットをランダムプライムした(random primed)クローンE7プローブ(全縁elk−Lコーディング領域に対応する)でプローブして高ストリンジェンシーに洗浄した(1×SSC/0.1%SDSで63℃で63分間、次いで0.1×SSC/0.1%SDSで63℃で30分間)。ブロットの像をPhosphorimager(Molecular Dynamics)で現像した。この遺伝子は、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、及び酵母さえも含む広く多様な種の中に高度に保存されていることが見出された。
実施例7:結合研究
elkレセプターへのelk−Lの結合性を調べるために、変則的間接スキャッチャード分析法を案出した。この間接アッセイは、elk/Fcを直接放射標識するとこのタンパク質の結合特異性を不活性化するので必要である。このアッセイ操作は次の通りであった。
12ウェルプレート中のCV−1−EBNA−1細胞(実施例3に記載したもの)(2.5×105細胞/ウェル)をクローンE7elk−L cDNAを含有する発現ベクターで形質移入した。この形質移入細胞を2日間培養してelk−Lタンパク質を発現させてから、BM−NFDM(実施例2に記載した結合培地,やはり50mg/ml脱脂粉乳を含有する)で洗浄し、そして実施例1で調製した種々の濃度のelk/Fc融合タンパク質と37℃で1時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、そして実施例2で調製した一定の飽和化濃度(40ng/ml)の125I−標識マウス抗ヒトIgG抗体と結合培地中でゆっくり攪拌しながら37℃で1時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理によって採取した。細胞及び未結合125I−抗体を、本質的にDowerら,J.Immunol.132:751,1984に記載された通りに、フタレートオイル分解法により分離した。
フリーの125I−抗体及び細胞結合125I−抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。その結合曲線をスキャッチャード・コーディネート・システム(Scatchard,Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949)で再プロットした。親和性計算値は、Microvaxコンピューターで作動するRS/1(マサチューセッツ州ボストンのBBN Software)で得た。単一の高親和性結合成分を同定した。CV−1 EBNA−1形質移入体上で発現されたelk−L結合部位は、elk/Fcについて1.08×109M-1の親和定数(KA)を有した。この親和定数は、種々のラット中性細胞系(neutral cell line)上で発現された天然リガンドへのelk/Fcの結合について認められた親和性とよく整合している。
配列表
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:1041塩基対
(B)型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:cDNA to mRNA
(iii)ハイポセティカル:No
(iv)アンチセンス:No
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:CDS
(B)存在位置:1...1041
(ix)配列の特徴:
(A)名称/記号:mat peptide
(B)存在位置:73..1038
(ix)配列;配列番号:1:
(2)配列番号2の情報:
(i)配列の特性:
(A)長さ:346アミノ酸
(B)型:アミノ酸
(D)トポロジー:直鎖状
(ii)配列の種類:タンパク質
(xi)配列;配列番号2:
Claims (18)
- elkに結合できるelk−Lタンパク質をコードする単離されたDNAであって、以下のa)−g)からなるグループから選択されるDNA:
a) 配列番号1のヌクレオチド1〜1041のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
b) 配列番号1のヌクレオチド73〜1041のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
c) 配列番号1のヌクレオチド1〜711のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
d) 配列番号1のヌクレオチド73〜711のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
e) a)ないしd)のDNAにストリンジェントな条件下(55℃、5×SSC)でハイブリダイゼーション可能なDNAの相補体であり、そして、elkに結合できるelk−Lタンパク質をコードするDNA;
f) 1またはそれより多くのヌクレオチドの欠失、挿入若しくは置換に因って、a)ないしd)のDNAとは異なるヌクレオチド配列を含み、そして、そして、elkに結合できるelk−Lタンパク質をコードするDNA;及び
g) a)ないしf)で定義されたDNAに遺伝子コードの結果として縮重するDNA。 - 以下のa)−d)
a) 配列番号1のヌクレオチド1〜1041のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
b) 配列番号1のヌクレオチド73〜1041のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;
c) 配列番号1のヌクレオチド1〜711のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA;及び
d) 配列番号1のヌクレオチド73〜711のヌクレオチド配列を含むDNAを含むDNA
からなるグループから選択される、請求項1に記載の単離されたDNA。 - elkに結合できるelk−Lタンパク質をコードする単離されたDNAであって、以下のa)−c)からなるグループから選択されるDNA:
a) 配列番号2のアミノ酸1−322を含むelk−Lタンパク質をコードするDNA;
b) 配列番号2のアミノ酸1−213を含むelk−Lタンパク質をコードするDNA;及び
c) 1またはそれより多くのアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換に因って、配列番号2のアミノ酸1−322若しくは1−213とは異なるアミノ酸配列を含み、そして、elkに結合できる、elk−Lタンパク質をコードするDNA。 - 以下のa)−b)
a) 配列番号2のアミノ酸1−322を含むelk−Lタンパク質をコードするDNA;及び
b) 配列番号2のアミノ酸1−213を含むelk−Lタンパク質をコードするDNA
からなるグループから選択される、請求項3に記載の単離されたDNA。 - 請求項1−4のいずれか1項に記載のDNAを含む発現ベクター。
- elk−Lポリペプチドを製造する方法であって、請求項5のベクターで形質転換された宿主細胞をelk−Lの発現を促進する条件下で培養し、そしてその培養物からelk−Lポリペプチドを回収することを含む方法。
- 請求項1−4のいずれか1項に記載のDNAによってコードされる精製されたelk−Lタンパク質。
- N末端アミノ酸配列Ala−Thr−Pro−Leu−Ala−Lys−Asn−Leu−Glu−Pro−Val−Ser−により特徴付けられる、請求項7に記載のelk−Lタンパク質。
- 配列番号2のアミノ酸1−322及び1−213からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項7又は8に記載のelk−Lタンパク質。
- 請求項7−9のいずれか1項に記載のelk−Lタンパク質又は前記elk−Lタンパク質の断片と免疫反応性である抗体であって、前記タンパク質及び前記免疫反応性の断片の双方と免疫反応性である、前記抗体。
- 前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項10に記載の抗体。
- 配列番号1のヌクレオチド配列の少なくとも14ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸分子、又は前記核酸分子のDNA若しくはRNA相補体。
- 請求項7−9のいずれか1項に記載のelk−Lタンパク質が他のポリペプチドに結合したもの、を含むelk−Lポリペプチド融合体。
- 2ないし4の可溶性elk−Lポリペプチドを含むオリゴマーであって、前記可溶性elk−Lポリペプチドは各々、配列番号2のアミノ酸1−213、又は、1若しくはそれより多くのアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換に因って、配列番号2のアミノ酸1−213とは異なるアミノ酸配列を含み、そして、elkに結合できる、ここにおいて、前記オリゴマーはelkに結合できる、前記オリゴマー。
- 前記ポリペプチドの各々のアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸1−213(elk−Lの細胞外ドメイン)、及び前記細胞外ドメインの断片、ここにおいて、前記断片はelkに結合可能である、から選択される、請求項14に記載のオリゴマー。
- 可溶性elk−Lポリペプチド及びFcポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記可溶性elk−Lポリペプチドは、配列番号2のアミノ酸1−213、又は、1若しくはそれより多くのアミノ酸の欠失、挿入若しくは置換に因って、配列番号2のアミノ酸1−213とは異なるアミノ酸配列を含み、そして、elkに結合できる、前記融合タンパク質。
- 前記ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2のアミノ酸1−213(elk−Lの細胞外ドメイン)、及び前記細胞外ドメインの断片、ここにおいて、前記断片はelkに結合可能である、から選択される、請求項16の記載の融合タンパク質。
- 請求項16又は17に記載の融合タンパク質を2つ含むダイマーであって、前記融合タンパク質がジスルフィド結合によってつながれている、前記ダイマー。
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