JPH08503368A

JPH08503368A - Ｅｌｋリガンドと呼ばれる新規なサイトカイン

Info

Publication number: JPH08503368A
Application number: JP6512378A
Authority: JP
Inventors: ライマン，スチュワート; ベックマン，エム・パトリシア; バウム，ピーター・アール
Original assignee: Immunex Corp
Current assignee: Immunex Corp
Priority date: 1992-11-13
Filing date: 1993-11-15
Publication date: 1996-04-16
Anticipated expiration: 2019-09-02
Also published as: US5627267A; US5728813A; US5512457A; CA2148484A1; EP0669929B1; PT669929E; AU669960B2; AU5667594A; EP0669929A1; JP3560609B2; DK0669929T3; DE69334100D1; ES2279508T3; ATE350386T1; US6540992B1; WO1994011384A1; EP0669929A4; DE69334100T2; US5670625A; US20040022767A1

Abstract

(57)【要約】ｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）ポリペプチド並びにＤＮＡ配列、ベクター及びｅｌｋ−Ｌポリペプチドを提供するのに有用な形質転換された宿主細胞。このｅｌｋ−Ｌポリペプチドは、チロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーである細胞表面レセプターに結合する。

Description

【発明の詳細な説明】ＥＬＫリガンドと呼ばれる新規なサイトカイン発明の背景ｅｌｋと呼ばれる細胞表面タンパク質は、チロシンキナーゼレセプターとして知られているタンパク質のファミリーのメンバーである。このファミリーのタンパク質は、リガンド結合で活性化される内因性キナーゼ活性を有する（Ullrich ら，Cold Spring Harbor Symp．Quant．Biol．51：713，1986）。ｅｌｋの部分クローンは、最初、チロシンキナーゼ活性を発現するタンパク質についてスクリーニングされたラット脳ｃＤＮＡ発現ライブラリー中で発見された（Letwinら， Oncogene 3：621，1988）。その後、全縁ｅｌｋコーディング領域に跨がる複合配列が、その部分クローンをプローブとして用いて、ラット脳ｃＤＮＡライブラリー及び小脳ライブラリーから単離された複数の部分配列から誘導された（Lhot akら，Mol．Cell．Biol．11：2496，1991）。ｅｌｋタンパク質は、ｈｅｋ（Boy dら，J．Biol．Chem．267：3262，1992とWicksら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89：1611，1992）；ｈｅｋ同族体のｍｅｋ４及びｃｅｋ４（Sajjadiら，NewBio 1．3：769，1991）；ｅｅｋ（Chanら，Oncogene 6:1057，1991）；ｅｒｋ（Chan ら，前記文献）；ｅｃｋ（Lindbergら，Mol．Cell．Biol．10：6316，1990）；ｃｅｋ５（Pasquale，E．B．Cell Regulation 2：523，1991）；及びｅｐｈ（Hi raiら，Science 238：1717，1987）を含む多くの他のレセプターチロシンキナーゼと非常に密接に関連している。このサブファミリーのタンパク質は、それらの細胞質ドメインにおいてのみならず、それらの細胞外ドメインにおいても関連しており、４１〜６８％同一である。面白いことに、これら種々のレセプターの組織分布は多様である。例えば、ｅｌｋｍＲＮＡの発現は精巣及び脳に限定されている（Lhotakら，前記文献）のに反して、ｅｃｋはこれら同じ２種の組織だけでなく、肺、腸、腎臓、脾臓、卵巣、及び皮膚においても見出される。レセプターチロシンキナーゼのリガンドは、それらレセプターを発現する細胞の成長、分化、及び生存に影響を及ぼす多様なタンパク質のグループである。今日まで、ｅｌｋのリガンドは発見されていない。推定上のリガンドを同定すれば、ｅｌｋタンパク質により調節されるであろう細胞プロセスの性質を調べるのに有用であることが判明するであろう。発明の概要本発明は、ｅｌｋとして知られているラット細胞表面レセプターに結合するｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）と呼ばれる新規なサイトカインを提供する。本発明は、このｅｌｋ−Ｌタンパク質をコードする単離されたＤＮＡ、この単離されたＤＮＡを含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞をｅｌｋ−Ｌタンパク質の発現に適する条件下で培養することによりｅｌｋ−Ｌを製造する方法も提供する。ｅｌｋ−Ｌタンパク質に対する抗体又はその免疫原性断片も開示されている。発明の詳細な説明本発明により、ｅｌｋとして知られている細胞表面タンパク質に結合する新規なタンパク質リガンドをコードするｃＤＮＡが単離された。また、このｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）ｃＤＮＡを含む発現ベクター、及びこれら発現ベクターを含有する宿主細胞をｅｌｋ−Ｌの発現に適する条件下で培養して、その発現されたｅｌｋ−Ｌを回収することにより組換えｅｌｋ−Ｌポリペプチドを製造する方法も提供する。細胞外ドメインを含む可溶型のタンパク質を含む、精製ｅｌｋ− Ｌタンパク質も本発明に包含される。本発明は、ｅｌｋ−Ｌ又はその抗原性断片であって、免疫原として働いてこのｅｌｋ−Ｌ免疫原に特異的な抗体を生じさせることができるものも提供する。かくして、ｅｌｋ−Ｌ又はその抗原性断片に特異的なモノクローナル抗体を調製することができる。ここに開示した新規なサイトカインは、ｅｌｋ、つまりチロシンキナーゼレセプターファミリーのメンバーであるラット細胞表面レセプターのリガンドである。このレセプターファミリーのメンバーは、リガンド結合で活性化されるキナーゼ活性を有する。細胞表面上のｅｌｋへのｅｌｋ−Ｌの結合は、ｅｌｋにより媒介される生物学的信号を起こすかも知れない。本発明のｅｌｋリガンドの１つの用途は、この生物学的信号の性質及びｅｌｋ−Ｌがｅｌｋと一緒になってｅｌｋレセプターを保持する細胞の成長又は分化に果たし得る役割を検討するための研究道具としての用途である。ｅｌｋｍＲＮＡの発現がラットの脳及び精巣で行われる（Lhotokら，前記文献）ので、ｅｌｋが癌遺伝子を活性化できるという可能性が示唆されている（Letwinら，前記文献）。本発明のｅｌｋ−Ｌポリペプチドには、タンパク質精製試薬としての用途が見出されており、ｅｌｋ若しくはｅｌｋ−Ｌ又はそれらの相互作用を検出するためのin vitroアッセイにおいて用いることもできる。ｅｌｋリガンドのこれら及びその他の用途を以下で更に説明する。クローニングしようとするに際して核酸源として用いるのに適する細胞を同定するため、３０を越える異なる型のマウス及びヒトの細胞を（ラットｅｌｋ及び抗体Ｆｃポリペプチドを含む融合タンパク質の形の）ｅｌｋに結合する能力についてスクリーニングした。実施例２に記載したように、どの細胞型も検出可能なｅｌｋ結合性を示さなかった。胎盤組織に成長因子及び分化因子が豊富なので、ｅｌｋ−Ｌクローンを単離しようと、ヒト胎盤ｃＤＮＡ発現ライブラリーをラットｅｌｋ／Ｆｃでスクリーニングした。胎盤がｅｌｋ−Ｌを発現するかどうかは不明で、ヒトｅｌｋ−Ｌに結合するラットｅｌｋの能力も不明であったが、実施例３に記載したようにヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡをうまく単離できた。ヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡクローンのコーディング領域のＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１及び配列番号２に記載する。このコーディング領域を含むヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡをこの陽性クローンから単離して、カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systemsから入と名付けた大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの生成組換えベクターを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに１９９２年１０月９日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９０８５が与えられた。この寄託は、ブダベスト条約の条項の下に行われた。ヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡクローンの核酸配列及びコードされるアミノ酸配列とGenbank及びSwissproデータベースとの比較により、ｅｌｋリガンドの配列は独特のものであることが分かった。この検索で、ｅｌｋリガンドと限定された配列同一性を有する１つのアミノ酸配列を同定した。この配列は、Ｂ６１タンパク質についての配列であり、ヒト臍静脈内皮細胞中でＴＮＦにより誘発される新規な即時初期（immediate-early）応答遺伝子の産物として以前に同定されたものである（Holzmanら，Mol．Cell．Biol．10：5830，1990）。これら２つのタンパク質の細胞外ドメイン内の４つ全てのシステイン残基は保存されており、ヒトｅｌｋ−ＬとＢ６１間の全アミノ酸同一性は３３％である。ｅｌｋリガンドとは対照的に、Ｂ６１タンパク質は分泌されることが報告されているが、疎水性尾状部で終端になっていて、グリコシルホスファチジルイノシトール結合によって膜に結合していることが示唆された（Holzmanら，前記文献）。Ｂ６１タンパク質の機能は不明である。ここで用いる“ｅｌｋ−Ｌ”という用語は、ｅｌｋに結合することができ、かつここに開示した天然のｅｌｋ−Ｌポリペプチドと相同性を示すポリペプチドであって、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列と８０％を越える同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドの属を意味する。ヒトｅｌｋ−Ｌは、マウス、ラット、ウシ、ブタ、又は種々の霊長類細胞を含むがこれらに限定されない他の哺乳動物種由来のｅｌｋ−Ｌタンパク質のように、本発明の範囲内である。ここで用いる場合、“ｅｌｋ−Ｌ”という用語には、（細胞質ドメイン、膜貫通領域、及び細胞外ドメインを含む）膜結合タンパク質、並びにｅｌｋ結合性を保持する短縮形（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）タンパク質が含まれる。かかる短縮形タンパク質には、例えば、細胞外（レセプター結合）ドメインだけを含む可溶性ｅｌｋ− Ｌが含まれる。ヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡを放射標識して、種間ハイブリダイゼーションにより他の哺乳動物のｅｌｋ−ＬｃＤＮＡを単離するプローブとして用いてもよい。例えば、他の哺乳動物種の胎盤組織から調製したｃＤＮＡライブラリーを放射標識ヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡでスクリーニングして、陽性クローンを単離することができる。また、種々の細胞系から単離したｍＲＮＡをノーザンハイブリダイゼーションによりスクリーニングして、ｅｌｋ−Ｌ遺伝子のクローニングに用いるのに適する哺乳動物ｅｌｋ−ＬｍＲＮＡの供給源を決定することができる。以下の実施例３に記載したスクリーニング操作ではｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質を用いたが、ｅｌｋを用いてｅｌｋ−Ｌタンパク質の発現のためのクローン及び候補細胞系をスクリーニングしてもよい。しかしながら、ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質には、容易に精製されるという利点がある。加えて、２つの別々の融合タンパク質鎖のＦｃ領域間にジスルフィド結合を形成してダイマーを生成する。捜し求められるリガンドがマルチマーであろうという可能性から見て、ｅｌｋリガンドの高親和性結合に潜在的利点があるので、このダイマー性ｅｌｋ／Ｆｃレセプターを選んだ。実施例１に記載したヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域を他の抗体Ｆｃ領域に置き換えてもよい。他の適するＦｃ領域は、プロテインＡ又はプロテインＧと高い親和性で結合することができる領域であり、マウスＩｇＧ１のＦｃ領域又はヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域の断片が含まれ、例えば、分子間ジスルフィド結合を形成できるように少なくともヒンジ部を含む断片が含まれる。本発明の１つの態様は、可溶性ｅｌｋ−Ｌポリペプチドを提供する。可溶性ｅｌｋ−Ｌポリペプチドは、天然ｅｌｋ−Ｌの細胞外ドメインの全部又は一部を含むが、そのポリペプチドを細胞膜上に停留するであろう膜貫通領域を欠く。可溶性ｅｌｋ−Ｌポリペプチドは、有利にも、合成された当初は分泌を促進するために天然の（又は異種起源の）シグナルペプチドを含むが、このシグナルペプチドは細胞からｅｌｋ−Ｌが分泌されるとすぐに切り離される。用いることができる可溶性ｅｌｋ−Ｌポリペプチドは、ｅｌｋレセプターに結合する能力を保持する。また、可溶性ｅｌｋ−Ｌは、この可溶性ｅｌｋ−Ｌタンパク質が分泌されることができることを条件として、膜貫通領域の一部又は細胞質ドメインの一部又は他の配列を含んでもよい。可溶性ｅｌｋ−Ｌは、培養培地から所期のタンパク質を発現する無傷細胞を、例えば遠心分離により分離して、所期タンパク質の存在についてその培地（上澄み液）をアッセイすることによって同定すること（及びその不溶性膜結合同等物から区別すること）ができる。培地中でのｅｌｋ−Ｌの存在は、そのタンパク質がその細胞から分泌されたこと、従って所期タンパク質が可溶型であることを示すものである。可溶性ｅｌｋ−Ｌは、このタンパク質の天然存在型であってもよい。ｅｌｋ−Ｌの可溶型を用いることは一定の用途に有利である。組換え宿主細胞からのこれらタンパク質の精製は、これら可溶性タンパク質がその細胞から分泌されるので、容易なものとなっている。更に、可溶性タンパク質は一般に静脈内投与により適している。可溶性ｅｌｋ−Ｌポリペプチドの例には、天然ｅｌｋ−Ｌタンパク質の全縁細胞外ドメインを含むものが含まれる。かかる可溶性ｅｌｋ−Ｌタンパク質の１つは、配列番号２のアミノ酸１（Ａｌａ）から２１３（Ｌｙｓ）までを含む。宿主細胞内で発現された当初は、この可溶性タンパク質は、用いる宿主細胞内で機能性である以下に記載した１つの異種起源シグナルペプチドを更に含んでもよい。また、このタンパク質は、天然シグナルペプチドを含んでもよく、その場合は、このｅｌｋ−Ｌは配列番号２のアミノ酸−２４（Ｍｅｔ）から２１３（Ｌｙｓ）までを含む。本発明の１つの態様にいては、可溶性ｅｌｋ−Ｌは、最初、（Ｎ末端からＣ末端までに）酵母α因子シグナルペプチド、以下に記載しかつ米国特許１〜２１３を含む可溶性ｅｌｋ−Ｌを含む融合タンパク質として発現される。この組換え融合タンパク質は、酵母細胞内で発現されて酵母細胞から分泌される。テロキナーゼを用いてこの可溶性ｅｌｋ−Ｌから切り離される。本発明は、可溶性ｅｌｋ−Ｌタンパク質をコードするＤＮＡ配列を包含している。可溶性ポリペプチドを含む短縮形ｅｌｋ−Ｌは、幾つかの慣用的技術のいずれによっても調製することができる。所期のＤＮＡ配列は、既知の技術を用いて化学的に合成することができる。ＤＮＡ断片は、完全長クローン化ＤＮＡ配列の制限エンドヌクレアーゼ消化によって作り、そしてアガロースゲルでの電気泳動によって単離することもできる。制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有するリンカーを用いて所期ＤＮＡ断片を発現ベクター内に挿入しても、またはそこに天然に存在する開裂部位においてその断片を消化してもよい。周知のボリメラーゼ連鎖反応操作を用いて所期タンパク質断片をコードするＤＮＡ配列を単離することもできる。更に別の方法として、既知の突然変異誘発法を用いて所期の位置に、例えば、細胞外ドメインの最後のアミノ酸についてのコドンのすぐ下流に、停止コドンを挿入してもよい。もう１つのアプローチでは、酵素処理（例えば、Ｂａｌ３１エキソヌクレアーゼを用いるもの）を用いてＤＮＡ断片から末端ヌクレオチドを削除して特定の所期の末端を有する断片を得ることができる。市販されているリンカーの中には、Ｂａｌ３１消化により生成する平滑末端に連結することができ、かつ制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有するものがある。また、ＤＮＡ断片のＮ末端又はＣ末端を所期の点に再構築するオリゴヌクレオチドを合成することができる。このオリゴヌクレオチドは、所期のコーディング配列の上流に制限エンドヌクレアーゼ開裂部位を含有してもよく、そしてそのコーディング配列のＮ末端において開始コドン（ＡＴＧ）を位置させてもよい。本発明は、組換え型及び非組換え型の両方の精製ｅｌｋ−Ｌポリペプチドを提供する。所期の生物活性（例えば、ｅｌｋに結合する能力）を保持する天然ｅｌｋ−Ｌタンパク質の変異体及び誘導体も、本発明の範囲内のものである。ｅｌｋ −Ｌ変異体は、天然ｅｌｋ−Ｌポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の突然変異によって得ることができる。ここで言及するｅｌｋ−Ｌ変異体とは、天然ｅｌｋ−Ｌに実質的に相同性であるが、１又は２以上の欠失、挿入又は置換のために天然ｅｌｋ−Ｌ（ヒト、マウス又は他の哺乳動物種）のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。この変異体アミノ酸配列は、好ましくは、天然ｅｌｋ−Ｌアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であり、最も好ましくは少なくとも９０％同一である。この同一性のパーセンテージは、例えば、Devereuxら（Nucl．Acids Res．12：387，19 84）により記載されUnivercity of Wisconsin Genetics Computer Group（ＵＷＧＣＧ）から入手できるＧＡＰコンピュータープログラム，バージョン６．０を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。このＧＡＰプログラムは、SmithとWaterman（Adv．Appl．Math 2：482，1981）により改訂されたN eedlemanとWunschのアラインメント法（J．Mol．Biol．48：443，1970）を利用するものである。ＧＡＰプログラムにとって好ましい欠如（default）パラメーターには次のものが含まれる：（1）ヌクレオチドについて一成分から成る比較マトリックス（同一については１の値を含み、非同一については０の値を含む）、及びSchwartzとDayhoff編，Atlas of Protein Sequence and Structure，Na tional Biomedical Research Foundation，pp．353-358，1979に記載されたGrib skovとBurgess，Nucl．Acids Res．14：6745，1986の加重比較マトリックス；（ 2）各ギャップについて３．０のペナルティー及び各ギャップにおける各記号について０．１０のペナルティー；及び（３）末端ギャップについてはペナルティー無し。ｅｌｋ−Ｌ断片については、同一性のパーセンテージは、その断片中に存在する天然ｅｌｋ−Ｌタンパク質の部分に基づく。天然アミノ酸配列の変異は、多くの既知技術のうちのいずれかによっても行うことができる。天然配列の断片に連結するのを可能にする制限部位が側面に配置された、突然変異配列を含有するオリゴヌクレオチドを合成することによって特定の座に突然変異を導入することができる。連結した後、得られた再構築配列は所望のアミノ酸挿入、置換、又は欠失を有する類縁体をコードする。また、オリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘発法を用いて、要求される置換、欠失、又は挿入に応じて変化させられた特定のコドンを有する変異遺伝子を提供することができる。上記の変異をもたらす好例となる方法は、Walderら（Ge ne 42：133，1986）；Bauerら（Gene 37：73，1985）；Craik（BioTechniques， January 1985，12-19）；Smithら（Genetic Engineering：Principles and Meth ods，Plenum Press，1981）；Kunkel（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：488，1 985）；Kunkelら（Methods in Enzymol．154：367，1987）により；及び米国特許第４，５１８，５８４号及び４，７３７，４６２号に開示されている。なお、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。変異体は保存的に置換された配列を含んでもよく、これは、所与のアミノ酸残基が類似の物理化学的特徴を有する残基によって置き換えられてもよいことを意味している。保存的置換の例には、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、又はＡｌａ相互の置換の如き１つの脂肪族残基の他の残基との置換、又はＬｙｓとＡｒｇ間；ＧｌｕとＡｓｐ間；又はＧｌｎとＡｓｎ間の如き１つの極性残基の他の残基との置換が含まれる。他のかかる保存的置換、例えば、類似の疎水性を有する全縁領域の置換が周知である。グリコシル基、脂質基、リン酸基、アセチル基及びそれらに類した基の如き他の化学的部分と共有結合性又は凝集性複合体を形成することによってｅｌｋ−Ｌを修飾してｅｌｋ−Ｌ誘導体を作ることもできる。ｅｌｋ−Ｌの共有結合誘導体は、ｅｌｋ−Ｌアミノ酸側鎖上の又はｅｌｋ−ＬポリペプチドのＮ末端若しくはＣ末端又はその細胞外ドメインにおける官能基にこれら化学的部分を連結することによって調製することができる。本発明の範囲内に入るｅｌｋ−Ｌの他の誘導体には、Ｎ末端又はＣ末端融合のような組換え培養での合成による如き、ｅｌｋ −Ｌ又はその断片と他のタンパク質又はポリペプチドとの共有結合性又は凝集性複合体が含まれる。例えば、この複合体は、ｅｌｋ−ＬポリペプチドのＮ末端においてシグナル又はリーダーポリペプチド配列（例えば、サッカロミセス属のα 因子リーダー）を含んでもよい。このシグナル又はリーダーペプチドは、翻訳時又は翻訳後に、この複合体をその合成側から細胞膜又は細胞壁の内側又は外側の部位に移動させる。ｅｌｋ−Ｌポリペプチド融合体は、ｅｌｋ−Ｌの精製及び同定をし易くするために付加されたペプチドを含んでもよい。かかるペプチドには、例えば、米国特許第５，０１１，９１２号及びHoppら，Bio/Technology 6：1204，19888に記載されたポリＨｉｓ又は抗原性同定ペプチドが含まれる。かかるペプチドの１つは、 −Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）である。これは、高度に抗原性であり、特異性モノクローナル抗体により可逆的に結合されるエピトープを提供して速やかなアッセイと発現された組換えタンパク質の容易な精製を可能にする。この配列は、Ａｓｐ−Ｌｙｓペアリングのすぐ後の残基において、ウシ粘膜エンテロキナーゼによって特異的に開裂されもする。このペプチドでキャップされた融合タンパク質は、大腸菌内での細胞内分解に対しても抵抗性であり得る。４Ｅ１１と呼ばれるマウスハイブリドーマは、一定の二価金属カチオンの存在下でこのペプチドＤＹＫＤＤＤＤＫに結合するモノクローナル抗体を産生し（参照によりここに組み入れられる米国特許第５，０１１，９１２号に記載されている）、そしてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受託番号ＨＢ９２５９の下に寄託されている。本発明は、更に、天然パターンのグリコシル化を有するか又は有さないｅｌｋ −Ｌポリペプチドを包含する。酵母又は哺乳動物発現系（例えば、ＣＯＳ−７細胞）内で発現されるｅｌｋ−Ｌは、発現系の選択に依存して、分子量及びグリコシル化パターンにおいて天然ｅｌｋ−Ｌポリペプチドに類似していても有意に相違していてもよい。大腸菌の如き細菌発現系内でのｅｌｋ−Ｌポリペプチドの発現は、非グリコシル化分子を与える。生物活性又は結合性に必要ではないアミノ酸残基若しくは配列の種々の付加又は置換、又は末端残基若しくは内部残基又は配列の欠失をコードするＤＮＡ構築物を調製してもよい。例えば、ｅｌｋ−Ｌ細胞外ドメイン内のＮ−グリコシル化部位を修飾してグリコシル化を排除し、哺乳動物及び酵母発現系内でより相同性で炭水化物が少ない類縁体を発現させることができる。真核性ポリペプチド中のＮ−グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットＡｓｎ−Ｘ−Ｙ（Ｘは、Ｐｒｏ以外のあらゆるアミノ酸であり、ＹはＳｅｒ又はＴｈｒである）によって特徴付けられる。ヒトｅｌｋ−Ｌタンパク質は、配列番号２のアミノ酸１１５〜１１７において、かかるトリプレットを１つ含む。このトリプレットをコードするヌクレオチド配列への適切な修飾は、Ａｓｎ側鎖での炭水化物残基の結合を妨げる置換、付加又は欠失をもたらすであろう。例えば、Ａｓｎが異なるアミノ酸によって置き換えられるように選んで１個のヌクレオチドを変化させれば、Ｎ−グリコシル化部位を不活性化するのに十分である。タンパク質中のＮ−グリコシル化部位を不活性化する既知の操作には、米国特許第５，０７１，９７２号及びＥＰ２７６，８４６に記載された操作が含まれる。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。もう１つの例では、生物活性に必須でないＣｙｓ残基をコードする配列を変化させてＣｙｓ残基を欠失させるか又は他のアミノ酸と置き換わらせて、復元に際して誤った分子内ジスルフィド橋の形成を阻止することができる。その他の変異体は、ＫＥＸ２プロテアーセ活性が存在する酵母系内での発現を増進するために、隣接する二塩基性アミノ酸残基の修飾によって調製される。ＥＰ２１２，９１４は、タンパク質中のＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化するために、部位特異的突然変異誘発法を用いることを開示している。残基を欠失、付加又は置換してＡｒｇ−Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ｌｙｓ、及びＬｙｓ−Ａｒｇペアを変化させることによってこれら隣接する塩基性残基の存在を排除し、ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を不活性化する。Ｌｙｓ−Ｌｙｓペアリングは、ＫＥＸ２開裂をかなり受けにくいので、Ａｒｇ−Ｌｙｓ又はＬｙｓ−ＡｒｇのＬｙｓ−Ｌｙｓへの転化は、ＫＥＸ２部位の不活性化への保存的で好ましいアプローチに相当する。ヒトｅｌｋ−Ｌは、配列番号２のアミノ酸２４２〜２４３、２４３〜２４４、及び２４６〜２４７において３つのＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位を含有する。本発明は、天然に存在するｅｌｋ−Ｌ変異体も包含する。かかる変異体の例は、択一的なｍＲＮＡスプライシング（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｍＲＮＡｓｐｌｉｃｉｎｇ）から生じるか又はｅｌｋ−Ｌタンパク質のタンパク質分解から生じるｅｌｋ結合性が保持されたタンパク質である。ｍＲＮＡの択一的なスプライシングは、例えば、タンパク質の天然に存在する可溶型の如き、短縮形ではあるが生物活性なｅｌｋ−Ｌタンパク質を生成し得る。タンパク質分解が原因になり得る変異には、例えば、異なる型の宿主細胞内で発現させたときの、ｅｌｋ−Ｌタンパク質からの１又は２以上の末端アミノ酸（一般に１〜５末端アミノ酸）のタンパク質分解性除去による、Ｎ末端又はＣ末端における相違が含まれる。本発明の範囲内に入る核酸配列には、温和な又は苛酷なストリンジェンシーの条件下でここに開示した天然ｅｌｋ−Ｌヌクレオチド配列にハイブリダイズし、かつ生物学的に活性なｅｌｋ−Ｌをコードする単離されたＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。温和なストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、例えば、Sa mbrookら，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2 ed．Vol．1，pp．1．1 01-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，（1989）に記載された条件を意味する。Sambrookらにより定義されているように、温和なストリンジェンシーの条件には、５×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の前洗浄用溶液と約５５℃，５×ＳＳＣ，一晩のハイブリダイゼーション条件の使用が含まれる。苛酷なストリンジェンシーの条件には、より高温のハイブリダイゼーションと洗浄が含まれる。熟練した技術者は、プローブの長さの如き要因に応じて必要なように温度及び洗浄溶液の塩濃度を調節できることを認識するであろう。１を越えるコドンが同じアミノ酸をコードできる遺伝子コードの既知の縮重により、ＤＮＡ配列が、配列番号１に提示した配列とは異なったものになってもなお配列番号１のアミノ酸配列を有するｅｌｋ−Ｌタンパク質をコードすることができる。かかる変異体ＤＮＡ配列は、沈黙突然変異（例えば、ＰＣＲ増幅の間に起こるもの）から生じることも、また天然配列の故意の突然変異誘発の産物であることもある。かくして、本発明は、生物活性なｅｌｋ−Ｌをコードする次のものから選択される単離されたＤＮＡ配列を提供する：（a）天然哺乳動物ｅｌｋ−Ｌ遺伝子のコーディング領域に由来するＤＮＡ（例えば、配列番号１に提示したヌクレオチド配列を含むｃＤＮＡ）；（b）温和なストリンジェント条件下で（a）のＤＮＡにハイブリダイゼーションでき、かつ生物活性なｅｌｋ−ＬをコードするＤＮＡ；及び（c）（a）又は（b）で定義したＤＮＡに対する遺伝子コードの結果としての縮重物であり、かつ生物活性なｅｌｋ−ＬをコードするＤＮＡ。本発明は、かかるＤＮＡ配列によりコードされるｅｌｋ−Ｌタンパク質を包含するものである。配列番号１の天然ＤＮＡ配列から変化したＤＮＡであって、温和なストリンジェント条件下で天然ＤＮＡ配列にハイブリダイズするであろう変異体ＤＮＡによりコードされるｅｌｋ−Ｌタンパク質の例には、ｅｌｋ−Ｌ断片（可溶性又は膜結合断片）及び不活性化Ｎ−グリコシル化部位、不活性化ＫＥＸ２プロテアーゼプロセシング部位、又は保存的アミノ酸置換を含む上記のようなｅｌｋ−Ｌタンパク質が含まれるか、これらに限定されない。他の哺乳動物種に由来するＤＮＡであって、配列番号１のヒトＤＮＡにハイブリダイスするであろうＤＮＡによりコードされるｅｌｋ−Ｌタンパク質も包含される。ｅｌｋに結合する必須の能力を有する変異体は、あらゆる適当なアッセイによって同定することができる。ｅｌｋ−Ｌの生物活性は、例えば、ｅｌｋのリガンド結合ドメインへの結合について競合させること（即ち、競合結合アッセイ）によって測定することができる。ｅｌｋ−Ｌポリペプチドについての競合結合アッセイの１つのタイプは、放射標識された可溶性ヒトｅｌｋ−Ｌ、及び細胞表面ｅｌｋを発現する無傷細胞を用いるものである。無傷細胞の代わりに、（ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質の如き）可溶性ｅｌｋであってプロテインＡ又はプロテインＧとその融合タンパク質のＦｃ領域との相互作用により固相に結合したものを代用できるであろう。もう１つのタイプの競合結合アッセイは、ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質の如き放射標識された可溶性ｅｌｋ、及びｅｌｋ−Ｌを発現する無傷細胞を用いるものである。また、可溶性ｅｌｋ−Ｌを固相に結合させてもよいであろう。競合結合アッセイは、標準的方法を用いて行うことができる。例えば、放射標識ｅｌｋ−Ｌを用いて推定上のｅｌｋ−Ｌ同族体と競合させ、表面結合ｅｌｋに対する結合活性についてアッセイすることができる。競合的オートラジオグラフィープレート結合アッセイにより定性的結果を得ることも、スキャッチャードプロットを用いて定量的結果を得ることもできる。また、可溶性ｅｌｋを、カラムクロマトグラフィーマトリックス又は¹²⁵Ｉの如き検出可能な部分の存在の分析に適する類似の支持体の如き固相に結合させてもよい。固相への結合は、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧ含有マトリックスへのｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質の結合によって行うことができる。ｅｌｋ−Ｌ（変異体を含む）の結合性は、上記のものと類似する競合アッセイにおいて複合化した可溶性ｅｌｋ（例えば、¹²⁵Ｉ−ｅｌｋ／Ｆｃ）を用いて測定することもできる。しかしながら、この場合には、ｅｌｋ−Ｌを発現する無傷細胞、又は固体支持体に結合した可溶性ｅｌｋ−Ｌを用いて、推定上のｅｌｋ変異体を含有するサンプルが、ｅｌｋ−Ｌへの複合化可溶性ｅｌｋの結合について競合する程度を測定する。本発明のｅｌｋ−Ｌを結合アッセイに用いて、ｅｌｋを発現する細胞を検出することができる。例えば、ｅｌｋ−Ｌ又は細胞外ドメイン又はその断片を¹²⁵Ｉの如き検出可能な部分に複合化させることができる。125Ｉでの放射標識は、高い比活性にまで標識された機能性¹²⁵Ｉ−ｅｌｋ−Ｌ分子を生成する幾つかの標準的方法のいずれによっても行うことができる。一方、発色反応又は蛍光反応を触媒できる酵素、ビオチン又はアビジンの如き他の検出可能な部分を用いてもよい。ｅｌｋ発現について試験すべき細胞を標識ｅｌｋ−Ｌに接触させてもよい。インキュベーション後、未結合標識ｅｌｋ−Ｌを除去し、その検出可能な部分を用いて測定する。ここに開示したｅｌｋリガンドタンパク質を用いて、ｅｌｋ−Ｌに対する結合親和性に関してｅｌｋタンパク質の生物活性を測定することもできる。例を挙げると、ｅｌｋ−Ｌを結合親和性研究に用いて、異なる温度で保存されたか又は異なる細胞型内で産生されたｅｌｋタンパク質の生物活性を測定することができる。かくして、ｅｌｋタンパク質の生物活性を、それを例えば調査研究に用いる前に確認することができる。ｅｌｋ−Ｌタンパク質には、例えば、異なる条件下でのｅｌｋタンパク質の保存寿命及び安定性を追跡するために“品質保証”研究を行う人々により用いられ得る試薬としての用途が見出される。ｅｌｋリガンドは、ｅｌｋタンパク質の修飾（例えば、化学修飾、トランケーション、突然変異等）後に生物活性が維持されているかどうかを測定するのに用いることができる。ｅｌｋ−Ｌに対する修飾ｅｌｋタンパク質の結合親和性を未修飾ｅｌｋタンパク質のものと比較して、ｅｌｋの生物活性へのその修飾のあらゆる不利な影響が検出される。ｅｌｋリガンドの別の用途は、タンパク質精製操作における試薬としての用途である。ｅｌｋ−Ｌ又はｅｌｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質を固体支持物質に慣用的技術によって付着させてアフィニティクロマトグラフィーによってｅｌｋを精製するのに用いることができる。ｅｌｋ−Ｌポリペプチドは、ダイマー又はトリマーの如きオリゴマーとして存在することができる。オリゴマーは、異なるｅｌｋ−Ｌポリペプチド上のシステイン残基間で形成されるジスルフィド結合によって連結される。本発明の１つの態様においては、ｅｌｋ−Ｌを抗体（ＩｇＧ１）のＦｃ領域に、ｅｌｋリガンド結合ドメインへのｅｌｋ−Ｌの結合を妨害しないようなやり方で融合させることによって、ｅｌｋ−Ｌダイマーが作られる。このＦｃポリペプチドを、好ましくは、（細胞外ドメインだけを含む）可溶性ｅｌｋ−ＬのＣ末端に融合させる。抗体由来ポリペプチドの種々の部分（Ｆｃドメインを含む）に融合した異種起源のポリペプチドを含む融合タンパク質の調製は、例えば、Ashkenaziら（PNAS USA8 8：10535，1991）及びByrnら（Nature 344：677，1990）により記載されており、これらは参照によりここに組み入れられるものとする。ｅｌｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする遺伝子融合体を適切な発現ベクター内に挿入する。このｅｌｋ−Ｌ／Ｆｃ融合タンパク質は、抗体分子とほぼ同じように組み立てることができ、鎖間ジスルフィド結合をＦｃポリペプチド間で形成すると、二価のｅｌｋ−Ｌが生成する。抗体の重鎖と軽鎖の両方で融合タンパク質を作る場合は、４つものｅｌｋ−Ｌ細胞外領域でｅｌｋ−Ｌオリゴマーを形成することが可能である。また、２つの可溶性ｅｌｋ−Ｌドメインを米国特許第５，０７３，６２７号に記載されたＧｌｙ₄ ＳｅｒＧｌｙ₅ Ｓｅｒリンカー配列の如きペプチドリンカーと連結させることもできる。本発明は、ｅｌｋ−Ｌ細胞外ドメイン又はその断片のオリゴマーであって、ジスルフィド相互作用により連結されているか又はスペーサーアミノ酸連結基を有するか若しくは有さない融合タンパク質として発現されるオリゴマーを提供する。例えば、ｅｌｋ−Ｌ細胞外ドメインのダイマーをＩｇＧＦｃ領域連結基により連結することができる。本発明は、ｅｌｋ−Ｌの発現のための組換え発現ベクター、及びこの発現ベクターで形質転換された宿主細胞を提供する。あらゆる適する発現系を用いることができる。これらベクターには、哺乳動物、微生物、ウィルス、又は昆虫遺伝子から誘導されたものの如き、適当な転写又は翻訳調節ヌクレオチド配列に機能できるように連結されたｅｌｋ−ＬＤＮＡ配列が含まれる。調節配列の例には、転写プロモーター、オペレーター、又はエンハンサー、ｍＲＮＡリボソーム結合部位、及び転写及び翻訳の開始及び終結を制御する適切な配列が含まれる。ヌクレオチド配列は、調節配列がｅｌｋ−ＬＤＮＡ配列に対して機能的に関係をもつときは、機能できるように連結されている。かくして、プロモーターヌクレオチド配列は、そのプロモーターヌクレオチド配列がｅｌｋ−ＬＤＮＡ配列の転写を制御するなら、ｅｌｋ−ＬＤＮＡ配列に機能できるように連結されているといえる。通常は復製起点により付与されるところの所期の宿主細胞内で複製する能力、及び形質転換体を同定する選択遺伝子を、この発現ベクター内に更に組み込んでもよい。加えて、ｅｌｋ−Ｌ遺伝子に本来存在しない適切なシグナルペプチドをコードする配列を発現ベクター内に組み込んでもよい。例えば、シグナルペプチド（分泌リーダー）のＤＮＡ配列をｅｌｋ−Ｌ配列とインーフレームで融合させて、ｅｌｋ−Ｌが最初はシグナルペプチドを含む融合タンパク質として翻訳されるようにしてもよい。意図する宿主細胞内で機能性であるシグナルペプチドは、ｅｌｋ −Ｌポリペプチドの細胞外分泌を増進する。シグナルペプチドは、細胞からｅｌｋ−Ｌが分泌されるとすぐにｅｌｋ−Ｌポリペプチドから切り離される。ｅｌｋ−Ｌポリペプチドの発現に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は高等真核細胞が含まれる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主で用いる適切なクローニング及び発現ベクターは、例えば、Pouwelsら，Cloning Vectors：AL aboratory Manual，Elsevier，New York，（1985）に記載されている。ここに開示したＤＮＡ構築物から誘導されるＲＮＡを用いてｅｌｋ−Ｌポリペプチドを産生させるために、無細胞翻訳系を用いることもできるだろう。原核生物には、グラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、大腸菌又は桿菌が含まれる。形質転換に適する原核宿主細胞には、例えば、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、並びにシュウドモナス、ストレプトミセス、及びスタフィロコッカス属に入る他の種々の種が含まれる。大腸菌の如き原核宿主細胞内では、ｅｌｋ− Ｌポリペプチドは、原核宿主細胞内での組換えポリペプチドの発現を容易にするためにＮ末端メチオニン残基を含んでもよい。このＮ末端Ｍｅｔは、発現された組換えｅｌｋ−Ｌポリペプチドから切り離すことができる。原核宿主細胞内で用いる発現ベクターは、一般に１又は２以上の表現型選択可能マーカー遺伝子を含む。表現型選択可能マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質耐性を付与するか又は独立栄養要求量を供給するタンパク質をコードする遺伝子である。原核宿主細胞に有用な発現ベクターの例には、クローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７０１７）の如き市販のプラスミドから誘導されるものが含まれる。ｐＢＲ３２２は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するので、形質転換細胞を同定するための簡単な手段を提供する。適切なプロモーター及びｅｌｋ−ＬＤＮＡ配列が、このｐＢＲ３２２ベクター内に挿入される。他の市販のベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（スェーデンン，ウプサラのPharmacia Fine Chemicals）及びｐＧＥＭ１（米国，ウィスコンシン州，マジソンのPromega Biotec）が含まれる。組換え原核宿主細胞発現ベクターに普通に用いられるプロモーター配列には、 β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースプロモーター系（Changら，N ature 275：615，1978；及びGoeddelら，Nature 281：544，1979）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddelら，Nucl．Acids Res．8：4057，1980 ；及びＥＰ−Ａ−３６７７６）及びｔａｃプロモーター（Maniatis，MolecularC loning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，p．412，1982 ）が含まれる。特に有用な原核宿主細胞発現系は、ファージλＰ_Lプロモーター及びｃＩ８５７ｔｓ不耐熱性レプレッサー配列を用いる。λＰ_Lプロモーターの誘導体を取り込んでいるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手できるプラスミドベクターには、プラスミドｐＨＵＢ２（大腸菌株ＪＭＢ９（ＡＴＣＣ３７０９２）内に存する）及びｐＰＬｃ２８（大腸菌ＲＲ１（ＡＴＣＣ５３０８２）内に存する）が含まれる。また、ｅｌｋ−Ｌを酵母宿主細胞内で、好ましくはサッカロミセス属（例えば、Ｓ．セレビシエ）から発現させてもよい。ピキア（Pichia）又はクルイベロミセス（Kluyveromyces）の如き酵母の他の属も用いることができる。酵母ベクターは、２μ酵母プラスミドからの複製起点の配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択可能なマーカー遺伝子を含有することが多いであろう。酵母ベクターに適するプロモーター配列には、とりわけ、メタロチオネイン、３−ホスホグリセレートキナーゼ（Hitzemanら，J．Biol．Chem．255：2073，1980）又は他の解糖酵素（ Hessら，J．Adv．Enzyme Reg．7：149，1968；及びHollandら，Biochem．17：49 00，1978）、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。酵母発現に用いるのに適する他のベクター及びプロモーターは、Hitzeman，ＥＰＡ−７３，６５７に更に記載されている。もう１つの代用物は、Russellら（J．Biol．Chem．258：2 674，1982）及びBeierら（Nature 300：724，1982）により記載されたグルコース被抑制性ＡＤＨ２プロモーターである。大腸菌内での選択及び複製のためのｐＢＲ３２２からのＤＮＡ配列（Ａｍｐ^r遺伝子及び複製の起点）を上記の酵母ベクター内に挿入することにより、酵母及び大腸菌の両方で複製可能なシャトルベクターを構築することができる。酵母α因子リーダー配列を用いて、ｅｌｋ−Ｌポリペプチドの分泌を行わせることができる。このα因子リーダー配列は、プロモーター配列と構造遺伝子配列の間に挿入されることが多い。例えば、Kurjanら，Cell 30：933，1982；Bitter ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81：5330，1984；米国特許第４，５４６，０８２号；及びＥＰ３２４，２７４を参照のこと。酵母宿主からの組換えポリペプチドの分泌を促進するのに適する他のリーダー配列は、当業者に知られている。リーダー配列は、１又は２以上の制限部位を含有するようにその３’末端の近くて修飾されていてもよい。これは、そのリーダー配列の構造遺伝子への融合を促進するであろう。酵母形質転換手順は、当業者が知られている。かかる手順の１つは、Hinnenら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 75：1929，1978に記載されている。Hinnenらの手順は、選択培地中でＴｒｐ⁺形質転換体を選択するものであって、その選択培地は、０．６７％酵母窒素原基、０．５％カザミノ酸、２％グルコース、１０μ ｇ／ｍ１アデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルからなる。発現を誘発するために、ＡＤＨ２プロモーター配列を含有するベクターにより形質転換された酵母宿主細胞を“リッチ”培地中で生育させてもよい。リッチ培地の例は、８０μｇ／ｍｌアデニン及び８０μｇ／ｍｌウラシルを補充した１％酵母エキス、２％ペプトン、及び１％グルコースからなる培地である。ＡＤＨ２プロモーターの抑制解除は、グルコースが培地から消費され尽くした時に起こる。哺乳動物又は昆虫宿主細胞培養系を用いて、組換えｅｌｋ−Ｌポリペプチドを発現することもできるであろう。昆虫細胞内での異種起源タンパク質の産生のためのバキュロウィルス系についての総説が、LuckowとSummers，Bio/Technology 6：47（1988）により記載されている。哺乳動物起源の株化細胞系も用いることができる。適する哺乳動物宿主細胞系の例には、サル腎臓細胞のＣＯＳ−７系（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Gluzmanら，Cell 23：175，1981）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ（ＡＴＣＣＣＲＬ１０）細胞系、及びアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）からMcM ahanら（EMBO J．10：2821，1991）により記載された通りに誘導されたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系が含まれる。哺乳動物宿主細胞発現ベクターのための転写及び翻訳制御配列は、ウィルスゲノムから切り取ることができる。普通に用いられるプロモーター配列及びエンハンサー配列は、ポリオーマウィルス、アデノウィルス２、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウィルスから誘導される。ＳＶ４０ウィルスゲノム、例えば、ＳＶ４０起点、初期及び後期プロモーター、エンハンサー、スプライス部位、及びポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いて、哺乳動物宿主細胞内での構造遺伝子配列の発現のための他の遺伝子要素を与えてもよい。ウィルス初期及び後期プロモーターは特に有用である。というのは、いずれもウィルスの複製起点を含有することもできる断片としてウィルスゲノムから容易に得ることができるからである（Fiersら，Nature 273：113，1978）。より小さな又はより大きなＳＶ４０断片も用いることができる。但し、ＳＶ４０ウィルス複製起点部位内に位置するＨｉｎｄIII部位からＢｇｌＩ部位に及ぶ約２５０ｂｐ配列が含まれることを条件とする。哺乳動物宿主細胞内で用いる好例となる発現ベクターは、Okayama及びBerg（M ol．Cell．Biol．3：280，1983）により開示された通りに構築することができる。Ｃ１２７マウス乳房上皮細胞内の哺乳動物ｃＤＮＡの安定な高レベル発現に有用な系は、実質的にCosmanら（Mol．Immunol．23：935，1986）により記載された通りに構築することができる。有用な高発現ベクターである、Cosmanら，Natu re 312：768，1984に記載されたＰＭＬＳＶＮ１／Ｎ４は、ＡＴＣＣ３９８９０として寄託されている。追加の有用な哺乳動物発現ベクターは、ＥＰ−Ａ−０３６７５６６、及び１９９１年５月１６日に出願された米国特許出願第０７／７０１，４１５号に記載されている。なお、これらは参照によってここに組み入れられるものとする。これらベクターをレトロウィルスから誘導してもよい。天然のシグナル配列の代わりに、米国特許第４，９６５，１９５号に記載されたインターロイキン−７（ＩＬ−７）についてのシグナル配列；Cosmanら，Nature 312： 768（1984）に記載されたインターロイキン−２レセプターについてのシグナル配列；ＥＰ３６７，５６６に記載されたインターロイキン−４シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号に記載されたＩ型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチド；及びＥＰ４６０，８４６に記載されたII型インターロイキン−１レセプターシグナルペプチドの如き、異種起源シグナル配列を付加してもよい。本発明は、実質的に均質なｅｌｋ−Ｌタンパク質であって、上記のような組換え発現系により産生させることも天然に存在する細胞から精製することもできるタンパク質を提供する。このｅｌｋ−Ｌタンパク質は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）による分析で単一のタンパク質バンドにより示されるように、実質的に均質なまでに精製される。このｅｌｋ−Ｌタンパク質を産生する１つの方法は、ｅｌｋ−ＬをコードするＤＮＡ配列を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞を、ｅｌｋ−Ｌが発現する条件下で培養することを含む。次いで、用いた発現系に依存して、ｅｌｋ−Ｌタンパク質を培養培地又は細胞抽出液から回収する。熟練した技術者は認識するであろうが、組換えｅｌｋ−Ｌを精製する操作は、用いた宿主細胞の型及びｅｌｋ−Ｌが培養培地中に分泌されるかどうかといった要因に従って変動するであろう。例えば、組換えタンパク質を分泌する発現系用いる場合は、培養培地をまず市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、Amicon又はMillipore Pellicon超濾過装置を用いて濃縮してもよい。濃縮工程後は、濃縮液をゲル濾過培地の如き精製マトリックスに適用することができる。また、アニオン交換樹脂、例えば、ペンダントのジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基を有するマトリックス又は支持体を用いてもよい。マトリックスは、アクリルアミド、アガロース、デキストラン、セルロース又はタンパク質精製に普通に用いられる他のタイプであってもよい。また、カチオン交換工程を用いてもよい。適するカチオン交換体には、スルホプロピル基又はカルボキシメチル基を含む種々の不溶性マトリックスが含まれる。スルホプロピル基が好ましい。最後に、疎水性ＲＰ−ＨＰＬＣ媒体（例えば、ペンタントのメチル又は他の脂肪族基を有するシリカゲル）を用いる１又は２以上の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）工程を用いて、ｅｌｋ −Ｌを更に精製することができる。上述の幾つか又は全ての精製工程をいろいろに組み合わせて用いて、実質的に均質な組換えタンパク質を提供することができる。ｅｌｋのリガンド結合ドメインを含むアフィニティカラムを用いて、発現されたｅｌｋ−Ｌポリペプチドをアフィニティ精製することも可能である。ｅｌｋ− Ｌポリペプチドを高塩類溶離緩衝液でアフィニティカラムから除き、次いで使用のために低塩類緩衝液中に透析してもよい。また、このアフィニティカラムは、ｅｌｋ−Ｌに結合する抗体を含んでもよい。実施例４には、本発明のｅｌｋ−Ｌタンパク質を用いてｅｌｋ−Ｌに向けられたモノクローナル抗体を生成させる操作が記載されている。細菌培養で産生した組換えタンパク質は、通常、宿主細胞をまず崩壊させ、遠心分離し、不溶性ポリペプチドなら細胞沈殿物から、可溶性ポリペプチドなら上澄み液から抽出した後、１又は２以上の濃縮、塩析、イオン交換、アフィニティ精製又はサイズ排除クロマトグラフィー工程により単離される。最後に、最終精製工程のためにＲＰ−ＨＰＬＣを用いてもよい。微生物細胞は、凍結−解凍の繰り返し、音波処理、機械的崩壊、又は細胞溶解剤の使用を含むあらゆる慣用的方法により崩壊させることができる。形質転換酵母宿主細胞を用いて、好ましくはｅｌｋ−Ｌを分泌ポリペプチドとして発現させる。これにより精製が簡単になる。酵母宿主細胞発酵から分泌された組換えポリペプチドは、Urdalら（J．Chromatog．296：171，1984）により開示された方法と類似の方法により精製することができる。Urdalらは、組換えヒトＩＬ−２の精製のための分取ＨＰＬＣカラムでの２連続逆相ＨＰＬＣ工程を記載している。核酸断片本発明は、更に、ここに示したｅｌｋ−Ｌヌクレオチド配列の断片を提供する。かかる断片は、望ましくは、配列番号１に示した配列の少なくとも約１４のヌクレオチドを含む。前記断片のＤＮＡ及びＲＮＡ成分が、ｅｌｋ−ＬＤＮＡの一本鎖型及び二本鎖型の両方と一緒にここに提供される。かかるｅｌｋ−Ｌ核酸断片の用途のうちの１つは、プローブとしての用途である。かかるプローブを種間ハイブリダイゼーション操作に用いて追加の哺乳動物種からｅｌｋ−ＬＤＮＡを単離することができる。一例として、ｅｌｋ−Ｌの細胞外ドメインに対応するプローブを用いることができる。これらプローブまたはin vitroアッセイにおいて及びノーザン及びサザーンブロットの如き操作においてｅｌｋ−Ｌ核酸の存在を検出する用途が見出される。ｅｌｋ−Ｌを発現する細胞型を同定することができる。かかる操作は周知であるので、熟練した技術者は、特定の意図した用途に依存して、適する長さのプローブを選ぶことができる。ｅｌｋ−Ｌ核酸の他の有用な断片は、一本鎖核酸配列（ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）を含むアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドであって、標的ｅｌｋ−ＬｍＲＮＡ（センス）又はｅｌｋ−ＬＤＮＡ（アンチセンス）配列に結合できるオリゴヌクレオチドである。本発明の、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、ｅｌｋ−ＬｃＤＮＡのコーディング領域の断片を含む。そのような断片は、一般に、少なくとも約１４のヌクレオチド、好ましくは約１４〜約３０のヌクレオチドを含む。所与のタンパク質のｃＤＮＡ配列に基づいてアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを作る能力は、例えば、Stein及びCohen， Cancer Res．48：2659，1988及びvan der Krolら，BioTechniques6：958，1988 に記載されている。標的核酸配列へのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドの結合は、二重鎖の形成をもたらし、それは、それら二重鎖の分解の増進、転写又は翻訳の早期終結を含む幾つかの手段の１つにより又は他の手段により、翻訳（ＲＮＡ）又は転写（ＤＮＡ）を遮断する。。かくして、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、ｅｌｋ−Ｌタンパク質の発現を遮断することができる。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドは、更に、修飾された糖リン酸ジエステル主鎖（又はＷＯ９１／０６６２９に記載された如き他の糖結合）を有するオリゴヌクレオチドを含み、かかる糖結合は内因性ヌクレアーゼに抵抗性である。抵抗性糖結合を有するかかるオリゴヌクレオチドは、in vivoで安定である（即ち、酵素分解に抵抗する）が、標的ヌクレオチド配列に結合できる配列特異性を保持している。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの他の例には、ＷＯ９０／１０４４８に記載されたものの如き有機部分、及び標的核酸配列に対するそのオリゴヌクレオチドの親和性を高めるポリ（Ｌ−リシン）の如き他の部分に共有結合しているオリゴヌクレオチドが含まれる。更になお、エリブチシン（elliptlcine）の如き介在物質、及びアルキル化剤又は金属錯体を、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドに付けて、そのセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドの標的ヌクレオチド配列への結合特異性を変化させてもよい。アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、例えば、ＣａＰＯ₄媒介ＤＮＡ形質移入、エレクトロポレーションを含むいずれかの遺伝子移動方法により又はエプスタイン−バーウィルスの如き遺伝子移動ベクターを用いることにより、導入することができる。好ましくは、アンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、そのアンチセンス又はセンスオリゴヌクレオチドを適するレトロウィルスベクター中に挿入してから、細胞をその挿入配列を含有するレトロウィルスベクターとin vivo又はex vivoのいずれかで接触させることにより導入する。適するレトロウィルスベクターには、マウスレトロウィルスＭ−ＭｕＬＶ，Ｎ２（Ｍ−ＭｕＬＶから誘導されるレトロウィルス）、又はＤＣＴ５Ａ、ＤＣＴ５Ｂ及びＤＣＴ５Ｃと呼ばれる二重コピーベクター（ＰＣＴ出願ＵＳ９０／０２６５６を参照のこと）が含まれるが、これらに限定されない。センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、ＷＯ９１／０４７５３に記載されているように、リガンド結合性分子を有する複合体の形成によって、標的ヌクレオチド配列を含有する細胞内に導入することもできる。適するリガンド結合性分子には、細胞表面レセプター、成長因子、他のサイトカイン、又は細胞表面レセプターに結合する他のリガンドが含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、リガンド結合性分子の複合化は、リガンド結合性分子のその対応する分子又はレセプターに結合する能力を実質的に妨げることがないか、又はセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその複合型が細胞内に入るのを実質的に遮断することがないものである。また、センス又はアンチセンスオリゴヌクレオチドを、標的核酸配列を含有する細胞内に、ＷＯ９０／１０４４８に記載されているようにオリゴヌクレオチド −脂質コンプレックスの形成により、導入することができる。このセンス又はアンチセンスオリゴヌクレオチド−脂質コンプレックスは、好ましくは、内因性リパーゼにより細胞内で解離される。以下の実施例は、特定の態様を説明するために示したものであって、本発明の範囲を限定するものではない。実施例１可溶性ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質の調製この実施例は、ｅｌｋリガンド（ｅｌｋ−Ｌ）をコードするｃＤＮＡクローンを検出するのに用いるための可溶性ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質をコードする発現ベクターの構築を説明するものである。ラットｅｌｋｃＤＮＡについてのＤＮＡ及びコードされるアミノ酸配列は、参照によりここに組み入れられるLhotak ら（Mol．Cell．Biol．11：2496，1991）に示されている。このラットｅｌｋタンパク質は、５３８アミノ酸細胞外ドメイン、２５アミノ酸膜貫通ドメイン、及び４１９アミノ酸細胞質ドメインを有する。ラットｅｌｋｃＤＮＡ断片を、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ部分をコードするｃＤＮＡのＮ末端に融合させた。このラットｅｌｋｃＤＮＡは、T．Pawson（トロントのSamuel Lunenfeld Research Institute，Mt．Sinai Hospital）から入手した。Ａｓｐ７１８制限エンドヌクレアーゼ開裂部位をｅｌｋコーディング領域の上流に導入した。ラットｅｌｋｃＤＮＡのＡｓｐ７１８−ＢｇｌII断片（全縁細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び細胞質ドメインの小部分を含む）を単離した。ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含む単鎖ポリペプチドをコードするＤＮＡを、カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systemsから市販されているベクターは大腸菌内で複製可能であって２１の独特な制限部位を含むポリリンカーセグメントを含有する。独特なＢｇｌII部位を挿入Ｆｃコーディング配列の５ ’末端の近くに、ＢｇｌII部位がＦｃポリペプチドのアミノ酸３及び４のコドンを包含するように導入した。コードされるＦｃポリペプチドは、Ｎ末端ヒンジ部から天然Ｃ末端までに及ぶ、即ち、本質的に完全長の抗体Ｆｃ領域である。Ｆｃ領域の断片、例えば、Ｃ末端終端で先端を切られた断片も用いることができる。これら断片は、鎖間ジスルフィド結合が、２つの別々のｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク雪のＦｃポリペプチド部分の間に形成されて、上で説明したようなダイマーが生成できるように、複数のシステイン残基（少なくともヒンジ部におけるシステイン残基）を含有するのが好ましい。上記のＡｓｐ７１８−ＢｇｌII ｅｌｋｃＤＮＡ断片を、このＦｃｃＤＮＡｃＤＮＡの上流に位置するようにクローン化した。得られた遺伝子融合体から誘導した一本鎖ＤＮＡを、ｅｌｋの全縁細胞外ドメインをＦｃ配列に完全に融合させるために、Kunkel（Proc．Natl．Acad．Sci．USA 82：488，1985）及びKunkel ら（Methods in Enzymol．154：367，1987）に記載された方法によって突然変異誘発した。この突然変異誘発ＤＮＡを配列分析して、妥当なヌクレオチドが除去されたこと（即ち、膜貫通領域及び部分細胞質ドメインＤＮＡが削除されたこと）及びｅｌｋ配列とＦｃ配列が同じリーディングフレーム内にあることを確認した。次いで、この融合ｃＤＮＡを切り出して、ｐＣＡＶ／ＤＨＦＲと呼ばれる哺乳動物発現ベクター内に挿入した。このｐＣＡＶ／ＤＨＦＲベクターは、ＰＣＴ出願ＷＯ９０／０５１８３に記載されたｐＣＡＶ／ＮＯＴに類似するが、選択可能なマーカーとしてジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子を更に含有している。このＤＨＦＲ遺伝子は、そのベクターを取り込んだ別のＤＨＦＲ^-哺乳動物細胞をメトトレキセート（ＭＴＸ）の存在下で生育させる場合に、それらに選択性の利点を付与する。ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質は、好ましくは、組換え哺乳動物細胞培養物中で合成される。このｅｌｋ／Ｆｃ融合体含有発現ベクターをＣＶ−１細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）及びＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）内に形質移入した。これらは両方ともサルの腎臓から誘導したものである。ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質発現レベルは、ＣＶ−１細胞及びＣＯＳ−７細胞のいずれにおいても比較的低かった。従って、２９３細胞（形質転換一次ヒト胎児腎臓細胞，ＡＴＣＣＣＲＬ１５７３）内での発現を試みた。ｅｌｋ／Ｆｃ遺伝子融合体をＨＡＶ−ＥＯ（Dowerら，J．Immunol．142：4314 ，1989）と呼ばれる哺乳動物発現ベクター内に挿入した。ＨＡＶ−ＥＯ／ｅｌｋ／Ｆｃベクターで形質移入した２９３細胞を回転ビン内で培養して、ｅｌｋシグナルペプチドにより培養培地内に分泌される融合タンパク質を一過性発現させた。この融合タンパク質をプロテインＡセファロースカラムで精製し、溶出し、そして実施例２及び３に記載するように、ｅｌｋ／Ｆｃタンパク質に結合する能力について細胞をスクリーニングするのに用いた。実施例２：ｅｌｋ／Ｆｃ結合についての細胞のスクリーニングｅｌｋリガンドをクローン化しようと、種々の細胞型をｅｌｋ／Ｆｃに結合する能力についてスクリーニングして核酸源として有用な候補細胞型を同定した。実施例１で産生させて精製した組換えラットｅｌｋ／Ｆｃタンパク質を、市販の Enzymobead放射性ヨウ素化試薬（BioRad）をメーカーの使用説明書に従って用いて放射標識した。この¹²⁵Ｉ−ｅｌｋ／Ｆｃタンパク質は、試験した幾つかの細胞系のいずれにも特異的結合性を示さなかった。Ｎａ¹²⁵Ｉでのｅｌｋ／Ｆｃタンパク質の直接標識が生物活性を損なわせたかも知れないという懸念から、２工程結合アッセイを開発した。この２工程結合アッセイは、細胞を非放射標識ｅｌｋ／Ｆｃとインキュベートした後、¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体とインキュベートすることを含むものであった。後者の抗体は、細胞に結合したあらゆるｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分と結合するであろう。このマウス抗ヒトＦｃ抗体は、ペンシルバニア州ウエストグローブのJacksonI mmunoresearch Laboratories，Inc．から入手した。この抗体は、Ｆｃγレセプターに結合したＦｃタンパク質への最小限の結合を示すに過ぎなかった。この抗体をクロラミンＴ法を用いて標識した。簡単に説明すると、Ｐ６カラムをメーカーの使用説明書に従って調製した。マイクロヒュージ管（microfuge tube）内で、１０μｇの抗体を１０μｌのＰＢＳ中に溶解させた。２０００μＣｉの無担体Ｎａ¹²⁵Ｉを添加してその溶液をよく混合した。次いで、１５μｌの調製したばかりのクロラミンＴの溶液（０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．２）中３２μｇ／ｍｌ）を添加してその混合液を室温で３０分間インキュベートした。この混合液をすぐにＰ６カラムに適用した。次いで、溶出液の１００〜１５０ μｌ画分を採集することによってこのカラムから放射標識抗体を溶出させた。結合培地（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Hepes（ｐＨ７．２）を含有するＲＰＭＩ１６４０）をピーク画分に添加して各画分の総容量を２ｍｌにした。放射性ヨウ素化により、５〜１０×１０¹⁵ｃｐｍ／mmolタンパク質の範囲の比活性が得られた。スクリーニング操作は次の通りである。約２×１０⁶細胞を９６ウェルプレート内で培養した。１５０μｌ結合培地を各ウェルに添加してから、細胞をｅｌｋ／Ｆｃの存在下又は不存在下で３７℃で１時間緩やかに攪拌しながらインキュベートした。この９６ウェルプレートの遠心分離によりその混合液から細胞を沈殿させ、ＰＢＳで洗浄し、再度遠心分離し、そして結合培地中に再懸濁した。次いで、細胞を上記のように調製した¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体と３７℃で１時間インキュベートした。負のコントロールとして、細胞を¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体と過剰の未標識抗ヒトＦｃ抗体の存在下でもインキュベートした。¹²⁵ Ｉ−抗体と１時間インキュベートした後、細胞と未結合の¹²⁵Ｉ−抗体を、本質的にDowerら，J．Immunol．132：751，1984により記載された通りに、フタレートオイル分離法により分離した。細胞結合¹²⁵Ｉ−抗体及びフリーの¹²⁵Ｉ−抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。このアッセイではｅｌｋ／Ｆｃに結合した細胞型は見出されなかった。これまでスクリーニングしなかった追加の細胞型を含む細胞を３番目の操作によりｅｌｋ／Ｆｃ結合性についてアッセイした。細胞をｅｌｋ／Ｆｃとインキュベートした後、ビオチニル化抗ヒトＦｃ抗体とインキュベートし、続いてストレプトアビジン−フィコエリトリン（Becton Dickinson）とインキュベートした。このビオチニル化抗体は、Jackson Immunoresearch Laboratoriesから購入したものである。ストレプトアビジンは、抗ヒトＦｃ抗体に付いたビオチン分子に結合して、そして、その抗ヒト抗体がｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ部分に結合する。フィコエリトリンは、検出可能な標識として役立つ蛍光性フィコビリタローサイトメーター（Becton Dickinson）を用いて測定した。上記の３種の操作の少なくとも１種によりｅｌｋ／Ｆｃに結合する能力についてスクリーニングした細胞には、次の一般的カテゴリーに属する約３０の異なる細胞型が含まれていた：一次マウス胎児脳細胞、マウス胎児肝臓細胞系、マウス胎児脳細胞系、及びヒト肺癌（線維芽細胞様）細胞系。ｅｌｋ／Ｆｃ結合性について陽性と見なされる細胞型は同定されなかった。実施例３：ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーからのｅｌｋリガンドｃＤＮＡの単離実施例２でアッセイしたどの細胞型も検出可能なｅｌｋ／Ｆｃ結合性を示さなかった。ヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーをｅｌｋリガンドｃＤＮＡの可能性ある供給源として選んだ。というのは、胎盤組織には、成長及び分化因子が豊富だからである。上で説明したように、ｅｌｋリガンドはｅｌｋ（対応するレセプター）を発現する細胞の成長、生存、又は分化にある役割を果たしているようである。しかしながら、ｅｌｋ／Ｆｃ融合体を用いてクローンをスクリーニングするので、胎盤にＦｃレセプターが比較的豊富であるという事実が、クローニングを試みるのに潜在的な問題をもたらした。 Larsenら（J．Exp．Med.，172：1559，1990）に記載されている通りに、プラスミドｐＤＣ３０２中にヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｐＤＣ３０２は、大腸菌内でも複製する哺乳動物発現ベクターである（Mosleyら，Cell 59 ：335，1989）。簡単に説明すると、Haymerleら（Nucleic Acids Res．14：8615 ，1986）により記載されたのと類似のアダプター法により、胎盤ｃＤＮＡをｐＤＣ３０２のＢｇｌII部位内にクローン化した。ｐＤＣ３０２内の胎盤ｃＤＮＡライブラリーで形質移入した大腸菌株ＤＨ５α 細胞をプレートして、プレート当たり約５００コロニーを得た。コロニーを各プレートから掻き取って、プールし、そして各プールからプラスミドＤＮＡを調製した。次いで、約２０００コロニーに相当するプールＤＮＡを用いて、不完全集密層（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔｌａｙｅｒ）のＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞をＤＥＡＥ−デキストランを使用して形質移入した後、Luthmanら（NucleicAc ids Res．11：1295，1983）及びMcCutchanら（J．Natl．Cancer Inst．41：351 ，1986）に記載されたのと類似のクロロキン処理を行った。このＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系（ＡＴＣＣＣＲＬ１０４７８）は、ＣＭＶ即時初期エンハンサー／プロモーターから推進されたＥＢＶ核抗原−１を構成的に発現する。ＣＶ１ −ＥＢＮＡ−１はアフリカミドリザル腎臓細胞系ＣＶ−１（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）からMcMahanら（EMBO J．10：2821，1991）により記載された通りに誘導した。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞をｃＤＮＡライブラリーで形質移入するために、それら細胞を完全培地（１０％（v/v）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミンを含有するダルベッコ修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ））内で維持し、そして複数の単一ウェル有孔スライド（single-well chambered slide）（Lab-Tek）上に２×１０⁵ 細胞／ウェルの密度でプレートした。スライドを１ｍｌヒトフィブロネクチン（ＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌ）と３０分間前処理した後でＰＢＳで１回洗浄した。粘着細胞層から培地を除去して、６６．６μＭ硫酸クロロキンを含有する１．５ｍｌ完全培地と置き換えた。次いで、０．２ｍｌのＤＮＡ溶液（クロロキンを含有する完全培地中２μｇＤＮＡ，０．５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン）をそれら細胞に添加して５時間インキュベートした。インキュベーション後、この培地を除去して、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地の添加によって２．５〜２０分間衝撃を与えた後、その溶液を新しい完全培地と置き換えた。これら細胞を２〜３日間培養して挿入した配列を一過性発現させた。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の形質移入単層を、ｅｌｋ−Ｌの発現について、本質的にGearingら（EMBO J．8：3667，1989）により記載された通りにスライドオートラジオグラフィーによりアッセイした。形質移入ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞（有孔スライドに粘着している）を脱脂粉乳を含む結合培地（ＢＭ−ＮＦＤＭ）（２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭ Hepes（ｐＨ７．２）及び５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有するＲＰＭＩ１６４０）で１回洗浄した。次いで、細胞をＢＭ−ＮＦＤＭ（１μｇ／ｍｌ）中でｅｌｋ／Ｆｃと室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、これら有孔スライド中の細胞単層をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄して未結合ｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質を除去してから、実施例２で調製した４０ｎｇ／ｍｌ¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体（１：５０希釈液）と室温で１時間インキュベートした。これら細胞をＢＭ−ＮＦＤＭで３回洗浄した後、リン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄して未結合¹²⁵Ｉ−マウス抗ヒトＦｃ抗体を除去した。細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．３）中の２．５％グルタルアルデヒド中で室温で３０分間インキュベートし、ＰＢＳ中で２回洗浄し、そして風乾することにより固定した。細胞を含有するこれら有孔スライドをPhosphorimager（Molecular Dynamics）に一晩露光してから、コダックＧＴＮＢ−２写真乳剤（６×水希釈液）に浸して暗室内で３〜５日間４℃で遮光ボックス内で露光した。次いで、これらスライドをコダックＤ１９現像剤（４０ｇ／５００ｍｌ水）中で約４分間現像し、水中で濯ぎ、そしてAgfa Ｇ４３３Ｃ定着液中で定着させた。これらスライドを２５〜４０の倍率の顕微鏡で個別に検査して、明るい背景と対照的なオートラジオグラフィーの銀粒子の存在により、ｅｌｋ−Ｌを発現する陽性細胞を同定した。このスライドオートラジオグラフィー法を用いて、１つの形質移入体プールのアッセイによりｅｌｋ／Ｆｃ結合について明らかに陽性である多数の細胞が示されるまでに、約３００，０００のｃＤＮＡを約２，０００のｃＤＮＡのプールにスクリーニングした。ついで、このプールを５００のプールに分配し、そしてスライドオートラジオグラフィーにより再度スクリーニングして陽性プールを同定した。この５００のプールからの個々のコロニーを、検出可能なｅｌｋ／Ｆｃ結合活性を有する表面タンパク質の合成を行う単一クローン（クローン＃Ｅ７）が同定されるまでスクリーニングした。このクローンを単離し、そしてそのｃＤＮＡ挿入体を配列決定した。クローンＥ７のヒトｅｌｋリガンドｃＤＮＡのコーディング領域のヌクレオチド配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。このｃＤＮＡ挿入体の長さは２１１１ｂｐである。この配列中には、８２、８５、及び３４６アミノ酸配のタンパク質をコードできそうな３つの妥当な大きさのオープンリーディングフレームがある。これら３つのうち、小さい方の２つのオープンリーディングフレームは、有効な翻訳開始コドン並びにシグナル配列の両方を欠いている。かくして、３４６アミノ酸オープンリーディングフレームについてのＤＮＡ配列及びコードされるアミノ酸配列を配列番号１及び２に示す。配列番号２のタンパク質はＩ型膜貫通タンパク質であり、Ｎ末端シグナルペプチド（アミノ酸− ２４〜−１）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜２１３）、膜貫通ドメイン（アミノ酸２１４〜２４１）、及び細胞質ドメイン（アミノ酸２４２〜３２２）を有する。シグナル配列を切り離した後の天然タンパク質の予測分子量は、３５，１８０ダルトンである。この成熟タンパク質は、９．００６の推定ｐＩを有する。３０７ｂｐの５’非コーディング配列及び７６３ｂｐの３’非コーディング配列がコーディング領域の側面に位置している。ヒトｅｌｋ−ＬｃＤＮＡをＢｓｕ３６１（これは停止コドンの下流を開裂する）での消化によってクローンＥ７から切り出した後、クレノウフラグメントで処理してＢｓｕ３６１消化末端を平滑にし、続いてＳｍａＩ（これは開始コドンの上流を開裂して平滑末端を生成する）で処理した。全縁コーディング領域を含のStratagene Cloning Systems）の（マルチクローニング部位内の）ＳｍａＩ部位内にクローン化した。大腸菌ＤＨ５α細胞内のこの得られたベクター（pBLU のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に１９９２年１０月９日に寄託し、受託番号ＡＴＣＣ６９０８５が与えられた。この寄託は、ブダペスト条約の条項の下に行った。実施例４：ｅｌｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体この実施例は、ｅｌｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体の調製を説明するものである。ｅｌｋ−ＬをＣＯＳ−７又はＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞の如き哺乳動物宿主細胞内で発現し、そしてｅｌｋ／Ｆｃアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。精製ｅｌｋ−Ｌ（又は細胞外ドメインの如きその断片）は、慣用的技術、例えば、米国特許第４，４１１，９９３号に記載された技術を用いてｅｌｋ−Ｌに対するモノクローナル抗体を生成させるのに用いることができる。簡単に説明すると、完全フロイントアジュバント中に乳化させた免疫原としてのｅｌｋ−Ｌでマウスを免疫感作し、そして１０〜１００μｇの範囲の量で皮下又は腹腔内注射する。１０〜１２日後、これら免疫感作動物を不完全フロイントアジュバント中に乳化させた追加のｅｌｋ−Ｌでブースター投与する。その後、１〜２週間毎の免疫感作スケジュールで、マウスに周期的にブースター投与する。ドットブロットアッセイ又はＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）によってｅｌｋ−Ｌ抗体を試験するために、眼窩後方放血又は尾先端切除により血清サンプルを周期的に採取する。適切な抗体力価を検出したら、生理食塩水中のｅｌｋ−Ｌの静脈内注射を陽性動物に最後に１回行う。３〜４日してから、それら動物を殺し、脾臓細胞を採取し、そして脾臓細胞をマウスメラノーマ細胞系、例えば、ＮＳ１又は好ましくはＰ３×６３Ａｇ８．６５３（ＡＴＣＣＣＲＬ１５８０）と融合させる。融合によりハイブリドーマ細胞が生成し、それらをＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択培地中で複数のマイクロタイタープレートにプレートして、未融合細胞、メラノーマハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害する。これらハイブリドーマ細胞を精製ｅｌｋ−Ｌに対する反応性についてＥＬＩＳＡにより、Engvallら，Immunochem．8：871，1971及び米国特許第４，７０３，００４号に開示された技術を適合させることによってスクリーニングする。好ましいスクリーニング技術は、Beckmannら（J．Immunol．144：4212，1990）に記載された抗体捕捉技術である。陽性ハイブリドーマ細胞を同系ＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔内注射して、高濃度の抗ｅｌｋ−Ｌモノクローナル抗体を含有する腹水を生成させることができる。また、ハイブリドーマ細胞をin vitroでフラスコ又は回転ビン中で種々の技術によって生育させることができる。マウス腹水中に産生したモノクローナル抗体を硫酸アンモニウム沈殿させた後、ゲル排除クロマトグラフィーによって精製することができる。また、ｅｌｋ−Ｌへの結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることができるように、プロテインＡ又はプロテインＧへの抗体の結合性に基づくアフィニティクロマトグラフィーも用いることができる。実施例５：ノーザンブロット分析種々の組織におけるｅｌｋ−Ｌの発現を調べるために、いろいろな組織からの２μｇのポリＡ＋ｍＲＮＡ（カリフォルニア州パロアルトのClonetechから入手可能）を含有するヒト組織ノーザンブロットをｅｌｋ−Ｌリボプローブでプローブした。５’及び３’非コーディング配列を、ＳｍａＩ及びＢｓｕＩで消化することによってｅｌｋリガンドｃＤＮＡから除去し、そのコーディング領域をpB LUESCRIPT SK（-）ベクター（カリフォルニア州ラジョラのStratagene Cloning Systems）内に挿入した。リボプローブは、ｅｌｋ−ＬｃＤＮＡをＳｆｉＩで切断し、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを用いてｅｌｋ−Ｌコーディング配列の３’最大４５０ヌクレオチドを転写することにより調製した。ブロットをこのリボプローブで６３℃でハイブリダイズし、次いでまず１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８℃で１時間洗浄してから、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６８ ℃で３０分間洗浄した。このブロットを増感紙の間にはさんだＸ線フィルムに− ７０℃で１１日間曝した。主要３．５ｋｂメッセージが、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、及び膵臓で認められた。脳及び精巣がｅｌｋレセプターを発現すると報告されたただ二つの組織である（Lhotakら，前記文献）のだが、ｅｌｋ−ＬｍＲＮＡは全成体脳内に検出可能なレベルでは存在しなかった。脳内での発現が非常に低レベルであるか又は異なる領域に限定されており、従って上述の技術により検出されなかった可能性がある。この組織を更に調べるために、８日齢及び若年成体ラットからの切開した脳をｅｌｋ−ＬＤＮＡでプローブした。ｅｌｋ−Ｌは発達中のラットの脳内で発現されるようで、嗅球内で高レベルに発現された。嗅球内でのｅｌｋ−Ｌの発現は、成体期まで続くようである。面白いことに、脳が休止するのとは対照的に、嗅球は哺乳動物の生涯全体にわたって活発に再生される。第２ノーザンブロットにより、ｅｌｋ−ＬｍＲＮＡ発現は、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）内のＴＮＦにより上方調節されることが明らかになった。ＨＵＶＥＣ内のＢ６１ｍＲＮＡは、それら細胞をＩＬ−１又はＴＮＦで処理することにより誘発可能であることが示された（Holzmanら，前記文献）。ｅｌｋ−ＬとＢ６１の間の相同性の程度からみて、ＨＵＶＥＣｍＲＮＡ（休止細胞又はＴＮＦで誘発された細胞からのもの）のノーザンブロットを上記のｅｌｋ−Ｌリボプローブでプローブした。他の組織内で見られる主要３．５ｋｂ種は、ＴＮＦでの処理後に特異的に誘発された。実施例６：サザーンブロット分析いろいろな種におけるｅｌｋ−ＬＤＮＡの存在を次のようにして調べた。いろいろな種からのＥｃｏＲＩ消化ＤＮＡ（カリフォルニア州パロアルトのClonet ech）からなるブロットを予備ハイブリダイゼーション緩衝液中で６３℃で予備ハイブリダイズした。次いで、このブロットをランダムプライムした（random p rimed）クローンＥ７プローブ（全縁ｅｌｋ−Ｌコーディング領域に対応する）でプローブして高ストリンジェンシーに洗浄した（１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６３℃で６０分間、次いで０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで６３℃で３０分間）。ブロットの像をPhosphorimager（Molecular Dynamics）で現像した。この遺伝子は、サル、ラット、マウス、イヌ、ウシ、ウサギ、ニワトリ、及び酵母さえも含む広く多様な種の中に高度に保存されていることが見出された。実施例７：結合研究ｅｌｋレセプターへのｅｌｋ−Ｌの結合性を調べるために、変則的間接スキャッチャード分析法を案出した。この間接アッセイは、ｅｌｋ／Ｆｃを直接放射標識するとこのタンパク質の結合特異性を不活性化するので必要である。このアッセイ操作は次の通りであった。１２ウェルプレート中のＣＶ−１−ＥＢＮＡ−１細胞（実施例３に記載したもの）（２．５×１０⁵細胞／ウェル）をクローンＥ７ｅｌｋ−ＬｃＤＮＡを含有する発現ベクターで形質移入した。この形質移入細胞を２日間培養してｅｌｋ− Ｌタンパク質を発現させてから、ＢＭ−ＮＦＤＭ（実施例２に記載した結合培地，やはり５０ｍｇ／ｍｌ脱脂粉乳を含有する）で洗浄し、そして実施例１で調製した種々の濃度のｅｌｋ／Ｆｃ融合タンパク質と３７℃で１時間インキュベートした。その後、細胞を洗浄し、そして実施例２で調製した一定の飽和化濃度（４０ｎｇ／ｍｌ）の¹²⁵Ｉ−標識マウス抗ヒトＩｇＧ抗体と結合培地中でゆっくり攪拌しながら３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞をトリプシン処理によって採取した。細胞及び未結合¹²⁵Ｉ−抗体を、本質的にDowerら，J．Imm unol．132：751，1984に記載された通りに、フタレートオイル分離法により分離した。フリーの¹²⁵Ｉ−抗体及び細胞結合125Ｉ−抗体をPackard Autogammaカウンターで定量した。その結合曲線をスキャッチャード・コーディネート・システム（ Scatchard，Ann．N．Y．Acad．Sci．51：660，1949）で再プロットした。親和性計算値は、Microvaxコンピューターで作動するＲＳ／１（マサチューセッツ州ボストンのBBN Software）で得た。単一の高親和性結合成分を同定した。ＣＶ−１ＥＢＮＡ−１形質移入体上で発現されたｅｌｋ−Ｌ結合部位は、ｅｌｋ／Ｆｃについて１．０８×１０⁹Ｍ^-1の親和定数（Ｋ_A）を有した。この親和定数は、種々のラット中性細胞系（neutral cell line）上で発現された天然リガンドへのｅｌｋ／Ｆｃの結合について認められた親和性とよく整合している。配列表（２）配列番号：１の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：1041塩基対（Ｂ）型：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：cDNA to mRNA （iii）ハイポセティカル：No （iv）アンチセンス：No （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：CDS （Ｂ）存在位置：1...1041 （ix）配列の特徴：（Ａ）名称／記号：mat peptide （Ｂ）存在位置：73..1038 （xi）配列；配列番号：１：（２）配列番号２の情報：（ｉ）配列の特性：（Ａ）長さ：346アミノ酸（Ｂ）型：アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ii）配列の種類：タンパク質（xi）配列；配列番号２：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9358−4ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ｄ 8310−2Ｊ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者バウム，ピーター・アールアメリカ合衆国ワシントン州98115，シアトル，サーティーフォース・アベニュー・ノース・イースト6027

Claims

【特許請求の範囲】１．ｅｌｋに結合できるｅｌｋ−Ｌタンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、配列番号１のヌクレオチド１〜１０４１、７３〜１０４１、１〜７１１、及び７３〜７１１からなる群から選ばれる配列と少なくとも８０％同一であるヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ。２．前記ＤＮＡが、配列番号１のヌクレオチド１〜１０４１、７３〜１０４１、１〜７１１、及び７３〜７１１からなる群から選ばれるヌクレオチド配列を含む、請求項１の単離されたＤＮＡ。３．ｅｌｋに結合できるｅｌｋ−Ｌタンパク質をコードする単離されたＤＮＡであって、前記ｅｌｋ−Ｌタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１〜３２２及び１〜２１３からなる群から選ばれる配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、単離されたＤＮＡ。４．前記ｅｌｋ−Ｌタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１〜３２２及び１〜２１３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項３の単離されたＤＮＡ。５．請求項１、２、３、又は４のＤＮＡ配列を含む発現ベクター。６．ｅｌｋ−Ｌポリペプチドを製造する方法であって、請求項５のベクターで形質転換された宿主細胞をｅｌｋ−Ｌの発現を促進する条件下で培養し、そしてその培養物からｅｌｋ−Ｌポリペプチドを回収することを含む方法。７．Ｎ末端アミノ酸配列Ala-Thr-Pro-Leu-Ala-Lys-Asn-Leu-Glu-Pro-Val-Ser-により特徴付けられる精製された生物学的に活性な成熟ｅｌｋ−Ｌタンパク質。８．配列番号２のアミノ酸１〜３２２及び１〜２１３からなる群から選ばれるアミノ酸配列を含む、請求項７の精製されたｅｌｋ−Ｌ。９．配列番号２のアミノ酸１〜３２２及び１〜２１３からなる群から選ばれる配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、精製されたｅｌｋ−Ｌタンパク質。 10．請求項８のｅｌｋ−Ｌタンパク質と免疫反応性である抗体又はその免疫原性断片。 11．前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項10の抗体。 12．配列番号１のヌクレオチド配列の少なくとも約１４ヌクレオチドの配列を含む単離された核酸分子又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡ相補体。