JP2005530479A - 代謝遺伝子ポリヌクレオチドおよびポリペプチド並びにそれらの使用 - Google Patents

代謝遺伝子ポリヌクレオチドおよびポリペプチド並びにそれらの使用 Download PDF

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Abstract

本発明は代謝研究の分野に関する。代謝性障害、例えば、肥満は、深刻かつ広く広がる公衆衛生上の問題である。代謝性障害の治療において有利であるＧＭＧ−３、ＧＭＧ−４、Ｃｌｕｓｔｅｒ１、ＧＭＧ−６Ａ、またはＧＭＧ−６Ｂポリペプチドが同定されている。これらの化合物は、体重の減少並びに代謝関連疾患および障害治療に有効であるはずである。これらの代謝関連疾患および障害には、高脂血症、アテローム性動脈硬化、糖尿病、および高血圧が含まれる。

Description

本発明は代謝研究の分野、特に、体重の減少に有効であり、かつ代謝関連疾患および障害の治療に有用な化合物の発見に関する。本発明の方法によって治療することが想定される代謝関連疾患または障害には、これらに限定されるものではないが、高脂血症、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、および高血圧症が含まれる。
以下の考察は本発明の理解を容易にしようとするものであり、本発明の先行技術であることを意図するものでもそれを認めるものでもない。
肥満は深刻で、広く蔓延し、かつ増加しつつある公衆衛生上の問題である。合衆国においては、人口の２０パーセントが肥満であり、欧州においては、僅かに低いパーセンテージが肥満である（Ｆｒｉｅｄｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６３２−６３４）。肥満は高血圧症、心血管疾患、糖尿病、および癌の他に呼吸器合併症および骨関節炎の危険性の増加を伴う（Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６３５−６４３）。僅かな体重の喪失でさえこれらの随伴状態を緩和する。
環境、食事、年齢および運動を含む生活様式因子が肥満において役割を果たすことが依然として認められてはいるが、双子の研究、家族集合体の分析、および養子縁組の研究は、全て、肥満が主として遺伝因子の結果であることを示す（Ｂａｒｓｈ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１）。これらの研究と一致して、同定される代謝関連遺伝子の数が増加しつつあるのは事実である。より徹底的に研究された遺伝子の幾つかには、レプチン（ｏｂ）およびその受容体（ｄｂ）、プロ−オピオメラノコルチン（Ｐｏｍｃ）、メラノコルチン−４−受容体（Ｍｃ４ｒ）、アグーチタンパク質（Ａy）、カルボキシペプチダーゼＥ（ｆａｔ）、５−ヒドロキシトリプタミン受容体２Ｃ（Ｈｔｒ２ｃ）、非分離塩基性へリックスループへリックス２（Ｎｈｌｈ２）、プロホルモンコンバターゼ１（ＰＣＳＫ１）、およびたる型タンパク質（ｔｕｂｂｙ）をコードするものが含まれる（Ｂａｒｓｈ等（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６４４−６５１において再考されている）。
本発明は、ヒト起源のジェンセットメタボリックジーンズ（Ｇｅｎｓｅｔ Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ Ｇｅｎｅｓ）−７、８、９、１０および１１（ＧＭＧ−７）、（ＧＭＧ−８；従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ ９と呼ばれている）、（ＧＭＧ−９；従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ １０と呼ばれている）、（ＧＭＧ−１０；従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ １７（ａ）と呼ばれている）および（ＧＭＧ−１１；従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ １９と呼ばれている）に基づく。ＧＭＧ−７Ａ（従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ ６（１９００）と呼ばれている）およびＧＭＧ−７Ｂ（従来、Ｃｌｕｓｔｅｒ ６（ｄ）と呼ばれている）はＧＭＧ−７のスプライス変種に相当する。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１はＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインを含んでなる。ＧＭＧ−７ＢはＧＭＧ−７Ａに存在するＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインを欠く。ＧＭＧ−９は、そのＮ末端近傍に、切り詰められた球状Ｃ１ｑ相同ドメインを含んでなる。ＡＰＭ１のＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの分析は、それが構造的に類似するＴＮＦαであることを示している。ＡＰＭ１との相同性により、生物学的活性も球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を除くポリペプチド断片内に存在し得る。ノーザンブロット分析の結果は、心臓および脳におけるＧＭＧ−７の発現、脳におけるＧＭＧ−８の発現、並びに脳および膵臓におけるＧＭＧ−１１の発現を示す。
本発明はＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１によってコードされるポリペプチドを含み、これらには完全長ポリペプチドおよびその断片が含まれ、好ましくは、それに限定しようとするものではないが、前記ポリペプチド断片はＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含む。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は、ヒトおよび他の哺乳動物における体重減少への有用性、体重増加の防止および血中グルコース濃度の制御を含む、ここに記載されるインビトロおよびインビボ生物学的活性を有する。より具体的には、断片を含むＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドの生物学的活性には、エピネフリンの投与、「脂質内」のｉ．ｖ．注射、または高脂肪試験食の投与によって生じる上昇した遊離脂肪酸濃度の低下の他に、筋肉細胞における脂肪酸酸化の増加、グルコース濃度の低下、エネルギー消費の調節、インシュリンに対する耐性および高脂肪／高スクロース食を消費する哺乳動物における体重低下が含まれる。本発明のポリペプチド断片は、完全長ポリペプチドと重複はするがそれとは異なる活性を有する。
したがって、本発明は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチド、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドを含むベクター、並びに前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドのために組換えられた細胞に加えて、体重の減少または代謝関連疾患および障害の治療のための、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドを含有する薬学的および生理学的許容可能組成物、並びに前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１薬学的および生理学的許容可能組成物の投与方法に向けられる。代謝関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストを同定するためのアッセイも本発明の一部である。
第１の局面において、本発明は、精製、単離、もしくは組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは脂質分割、脂質代謝、およびインシュリン様活性を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチド断片を特徴とする。好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は活性を有し、前記活性も脂質分割、脂質代謝、およびインシュリン様活性からなる群より選択される。好ましい態様において、前記ポリペプチド断片は、配列番号２の少なくとも６個の連続するアミノ酸および７１０個以下の連続するアミノ酸、配列番号４の少なくとも６個および４７１個以下の連続するアミノ酸、配列番号６の少なくとも６個の連続するアミノ酸および２０１個以下の連続するアミノ酸、配列番号８の少なくとも６個および４４６個以下の連続するアミノ酸、配列番号１０の少なくとも６個の連続するアミノ酸および２９６以下の連続するアミノ酸、または配列番号１２の少なくとも６個および２０５以下の連続するアミノ酸を含むか、それらを本質的に含むか、またはそれらからなる。
好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は配列番号２のアミノ酸２−７１０、１−２６２、２６３−７１０、１−２６３、２６４−７１０、１−５５２、５５３−７１０、５５４−７１０、５６１−７１０、５６８−７１０、５７５−７１０、５８０−７１０、５８１−７１０、１−２７５または２７６−７１０から選択される。他の好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−７Ｂポリペプチド断片は配列番号４のアミノ酸２−４７１、１−４４２、４４３−４７１、１−４４３、４４４−４７１、１−２６２、２６３−４７１、１−２６３、２６４−４７１、１−２７５または２７６−４７１から選択される。他の好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、４０−２０１、５４−２０１、６６−２０１、７０−２０１、または７１−２０１から選択される。他の好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−９ポリペプチド断片は配列番号８のアミノ酸２５−４４６、２２８−３５６、２２８−３６０、２２８−４３１、２２８−４４６、２３１−３５６、２３１−３６０、２３１−４３１、２３１−４４６、２３３−３５６、２３３−３６０、２３３−４３１、２３３−４４６、２３６−３５６、２３６−３６０、２３６−４３１、２３６−４４６、２４０−３５６、２４０−３６０、２４０−４３１、２４０−４４６、２４１−３５６、２４１−３６０、２４１−４３１、２４１−４４６、２４２−３５６、２４２−３６０、２４２−４３１、または２４２−４４６から選択される。他の好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、３２−２９６、３９−２９６、５２−２９６、６５−２９６、７１−２９６、７４−２９６、７７−２９６、７８−２９６、８１−２９６、８４−２９６、９０−２９６、９２−２９６、１０２−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他の好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５、５９−２０５、７１−２０５または７２−２０５から選択される。
より好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は配列番号２のアミノ酸２−７１０、１−２６２、１−２６３、５５３−７１０、５５４−７１０、５６８−７１０、５７５−７１０または１−２７５から選択される。他のより好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−７Ｂポリペプチド断片は配列番号４のアミノ酸２−４７１、１−４４２、１−４４３、１−２６２、１−２６３、または１−２７５から選択される。他のより好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、５４−２０１または６６−２０１から選択される。他のより好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−９ポリペプチド断片は配列番号８のアミノ酸２５−４４６、２２８−３５６、２２８−３６０、２２８−４３１、２２８−４４６、２３１−３５６、２３１−３６０、２３１−４３１、２３１−４４６、２４１−３５６、２４１−３６０、２４１−４３１または２４１−４４６から選択される。他のより好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、５２−２９６、７１−２９６、７４−２９６、８１−２９６、８４−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他のより好ましい態様においては、活性を有するＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５または５９−２０５から選択される。
さらに好ましい態様においては、前記ポリペプチド断片は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２において同定されるポリペプチド配列の対応連続アミノ酸と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
本発明は、さらに、（ａ）配列番号２、４、６、８、１０、または１２の対応アミノ酸ポリペプチドと少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である完全長、（ｂ）Ｎ末端Ｍｅｔが存在しない、配列番号２、４、６、８、１０、または１２の完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、（ｃ）シグナルペプチドを欠く、配列番号６、８、１０、または１２の成熟ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、（ｄ）配列番号２を含めて長さが６アミノ酸から７１０アミノ酸の間（完全長）のうちのいずれか１つの整数のものである配列番号２のＧＭＧ−７Ａポリペプチド、配列番号４を含めて長さが６アミノ酸〜４７１アミノ酸（完全長）のうちのいずれか１つの整数のものである配列番号４のＧＭＧ−７Ｂポリペプチド、配列番号６を含めて長さが６アミノ酸〜２０１アミノ酸（完全長）のうちのいずれか１つの整数のものである配列番号６のＧＭＧ−８ポリペプチド、配列番号８を含めて長さが６アミノ酸〜４４６アミノ酸（完全長）のうちのいずれか１つの整数のものである配列番号８のＧＭＧ−９ポリペプチド、または、配列番号１０含めて長さが６アミノ酸〜２９６アミノ酸（完全長）のうちのいずれか１つの整数のものである配列番号１０のＧＭＧ−１０ポリペプチド、または、配列番号１２を含めて長さが６アミノ酸〜２０５アミノ酸（完全長）のうちのいずれか１の整数のものである配列番号１２のＧＭＧ−１１ポリペプチド、（ｅ）配列番号２、４、６、８、１０、または１２のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのエピトープ担持断片、（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のポリペプチドのいずれかの対立遺伝子変種ポリペプチドからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むか、それらからなるか、またはそれらを本質的に含む精製または単離ポリペプチドを提供する。本発明は、さらに、上記（ａ）〜（ｆ）のポリペプチドの断片、例えば、生物学的活性を有するか、または生物学的機能的ドメイン（１つもしくは複数）を含むものに対する備えがある。
他の非常に好ましい態様においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、Ｃ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含んでなる精製、単離、または組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。好ましくは、前記ＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は配列番号２のアミノ酸２−７１０の少なくとも６個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。好ましくは、前記ＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１の少なくとも６個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。好ましくは、前記ＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸２４−２９６の少なくとも６個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。好ましくは、前記ＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５の少なくとも６個の連続アミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。好ましい態様において、Ｃ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含んでなり、かつ活性を有する前記ＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸２−７１０、２６３−７１０、２６４−７１０、５５３−７１０、５５４−７１０、５６１−７１０、５６８−７１０、５７５−７１０、５８０−７１０、５８１−７１０、または２７６−７１０から選択される。他の好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、４０−２０１、５４−２０１、６６−２０１、７０−２１０または７１−２０１から選択される。他の好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、３２−２９６、３９−２９６、５２−２９６、６５−２９６、７１−２９６、７４−２９６、７７−２９６、７８−２９６、８１−２９６、８４−２９６、９０−２９６、９２−２９６、１０２−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他の好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５、５９−２０５、７１−２０５または７２−２０５から選択される。
より好ましい態様において、Ｃ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含んでなり、かつ活性を有する前記ＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は、配列番号２のアミノ酸２−７１０、５５３−７１０、５５４−７１０、５６８−７１０、または５７５−７１０から選択される。他のより好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、５４−２０１、または６６−２０１から選択される。他のより好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、５２−２９６、７１−２９６、７４−２９６、８１−２９６、８４−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他のより好ましい態様において、活性を有する前記ＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５または５９−２０５から選択される。
代わりとして、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は、配列番号２の対応アミノ酸５６８−７１０と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一、配列番号６の対応アミノ酸５４−２０１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一、配列番号１０の対応アミノ酸１３５−２９６と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一、または配列番号１２の対応アミノ酸５３−２０５と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一のアミノ酸配列を含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなる。
さらなる好ましい態様において、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、（ｉ）遊離脂肪酸、（ｉｉ）グルコース、および／または（ｉｉｉ）トリグリセリドの（血液、血清または血漿のいずれかにおける）循環濃度を低下させることができる。遊離脂肪酸濃度低下活性、グルコース濃度低下活性、および／またはトリグリセリド濃度低下活性を示すさらに好ましい本発明のポリペプチドは、同じモル濃度で完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと同じか、もしくはそれを上回る活性を有し、同じであるか、もしくはそれを上回る過渡的活性を有し、および／または持続する活性を有する。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは筋肉脂質または遊離脂肪酸酸化を有意に刺激するものである。さらに好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは筋肉脂質または遊離脂肪酸酸化を有意に刺激するものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、前記ポリペプチドの存在下においてＣ２Ｃ１２細胞分化を生じ、非処理細胞と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、または４０％以上のオレエート酸化を生じるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、肝細胞株（好ましくは、ＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−２２１７））におけるレプチン取り込みを増加させるものである。
さらに好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、高脂肪食による血漿遊離脂肪酸の食後の増加を有意に減少させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、高脂肪食の結果としてのケトン体生成を有意に減少または排除するものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、骨格筋細胞におけるグルコース取り込みを増加させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、脂肪細胞におけるグルコース取り込みを増加させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、ニューロン細胞におけるグルコース取り込みを増加させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、赤血球細胞におけるグルコース取り込みを増加させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、脳におけるグルコース取り込みを増加させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、食事、特には、高炭水化物食に続く血漿グルコースの食後の増加を有意に減少させるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、食事、特には、高脂肪または高炭水化物食に続く血漿グルコースの食後の増加を有意に防止するものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、インシュリン感受性を高めるものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、耐糖能異常からインシュリン耐性への進行を阻害するものである。
さらなる好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボで多量体（例えば、ヘテロ多量体またはホモ多量体）を形成するものである。好ましい多量体はホモ二量体またはホモ三量体である。他の好ましい多量体は、少なくとも４、６、８、９、１０または１２のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドサブユニットを含むホモ多量体である。他の好ましい多量体は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを含むヘテロ多量体である。
さらなる好ましい態様は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのうちの１つを含む異種ポリペプチドを含む。
第２の局面において、本発明は、第１の局面において説明した前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする精製、単離、もしくは組換えポリヌクレオチド、またはそれらの相補体を特徴とする。本発明のさらに好ましい態様は、哺乳動物ゲノム配列、遺伝子、またはそれらの断片を含むか、またはそれらかなる組換え、精製、または単離ポリヌクレオチドを特徴とする。一局面において、この配列はヒト、マウスまたは他の哺乳動物から誘導される。好ましい局面においては、このゲノム配列は配列番号１、３、５、７、９、または１１に記載されるポリヌクレオチド配列のいずれか１つの少なくとも１２、１５、１８、２０、２２、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、１０００、２０００、５０００、１００００または５００００ヌクレオチドの連続する範囲、またはそれらの相補体を含む単離、精製、または組換えポリヌクレオチドを含み、前記連続する範囲は配列番号１、３、５、７、９、または１１のＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの対応ヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のヌクレオチド配列を含む。さらなる態様においては、これらのポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、一本鎖、および二本鎖である。
第３の局面において、本発明は、第２の局面において説明した前記ポリヌクレオチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる組換えベクターを特徴とする。
第４の局面において、本発明は、第３の局面において説明した前記組換えベクターを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる組換え細胞を特徴とする。さらなる態様は、本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞組換体を含む。
第５の局面において、本発明は、第１の局面において説明した前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよび、代わりとして、薬学的または生理学的に許容し得る希釈剤を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。
第６の局面において、本発明は、体重を減少させる方法であって、体重の減少を必要とする個体に第５の局面において説明される薬学的または生理学的に許容し得る組成物を提供または投与することを含む方法を特徴とする。
好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物で治療しようとする体重の減少を必要とする前記個体の同定は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のジェノタイピングまたは前記個体に由来する臨床試料における代謝ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルの測定を含む。好ましくは、前記臨床試料は、血漿、尿、および唾液からなる群より選択される。好ましくは、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は、健常非肥満患者と比較して、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは天然タンパク分解性開裂ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片のいずれか１つもしくは全ての血液、血清もしくは血漿濃度の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％減少で個体に投与される。
第７の局面において、本発明は、代謝関連疾患または障害の予防または治療方法であって、そのような治療を必要とする個体に第５の局面において説明した前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物を提供または投与することを含む方法を特徴とする。好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物で治療しようとする、そのような治療を必要とする前記個体の同定は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のジェノタイピングまたは前記個体に由来する臨床試料におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルの測定を含む。好ましくは、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群より選択される。好ましくは、前記代謝関連疾患または障害は、肥満、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病およびＩＩ型糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとするＩＩ型糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。好ましい態様において、前記個体は哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
関連する局面において、本発明の態様は、個体において所望の生物学的応答を生起または誘導する方法であって、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを含有する組成物を個体に提供または投与する工程を含み、前記生物学的応答が、
（ａ）遊離脂肪酸の循環（血液、血清、または血漿のいずれか）レベル（濃度）の調節（前記調節は、好ましくは低下である）、
（ｂ）グルコースの循環（血液、血清、または血漿のいずれか）レベル（濃度）の調節（前記調節は、好ましくは低下である）、
（ｃ）トリグリセリドの循環（血液、血清、または血漿のいずれか）レベル（濃度）の調節（前記調節は、好ましくは低下である）、
（ｄ）筋脂質または遊離脂肪酸酸化の刺激、
（ｃ）肝臓または肝細胞におけるレプチン取り込みの調節（前記調節は、好ましくは増加である）、
（ｅ）高脂肪食による血漿遊離脂肪酸の食後の増加の調節（前記調節は、好ましくは減少である）、
（ｆ）高脂肪食の結果としてのケトン体生成の調節（前記調節は、好ましくは減少または排除である）、
（ｇ）インシュリンに対する細胞または組織、特に、筋肉、脂肪細胞、肝臓または脳の感受性の増加、および
（ｈ）耐糖能異常からインシュリン耐性への進行の阻害
からなる群より選択され、
並びにさらに、前記生物学的応答が同じモル濃度のインシュリン単独によって生起または誘導される生物学的応答よりも有意に大きい、すなわち、少なくとも１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、５０％、７５％、１００％または５００％大きい方法を含む。さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を患う人物において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を患う人物において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を患う人物において体重を制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を患う人物において体重を制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせることなく、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを患う人物において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせることなく、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを患う人物において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせることなく、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）のみを患う人物において体重を制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせることなく、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）のみを患う人物において体重を制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、本発明は、ＮＩＤＤＭ患者の補完治療において、インシュリン分泌促進物質（好ましくは、経口形態）またはインシュリン感作薬（好ましくは、経口形態）と組み合わせて、それらの体重またはグルコース制御の改善に用いることができる。好ましくは、経口インシュリン分泌促進物質は１，１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジドから選択されるスルホニル尿素である。好ましくは、インシュリン感作薬はメトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択される。
本発明は、さらに、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬なしに、ＮＩＤＤＭ患者単独の体重またはグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、ＩＤＤＭ患者の補完治療において、インシュリン分泌促進物質（好ましくは、経口形態）またはインシュリン感作薬（好ましくは、経口形態）と組み合わせて、それらの体重またはグルコース制御の改善に用いることができる。好ましくは、インシュリン分泌促進物質は１，１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジドから選択されるスルホニル尿素である。好ましくは、インシュリン感作薬はメトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択される。
本発明は、さらに、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬なしに、ＩＤＤＭ患者単独の体重またはグルコース制御を改善する方法を提供する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、同時に、別々に、または連続的に用いられる、例えば別々の投与単位の形態の、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬と、付随的または同時のいずれかで投与することができる（分泌促進物質の前後のいずれかまたは感作薬の前後のいずれか）。したがって、本発明は、さらに、ＮＩＤＤＭまたはＩＤＤＭ患者における体重またはグルコース制御の改善に同時に、別々に、または連続的に用いるための組合せ調製品として、薬学的または生理学的に許容し得る組成物およびインシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬の組成物を提供する。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン感作薬としての使用方法をさらに提供する。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る化合物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を患う人物においてインシュリン感受性を改善する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る化合物の本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、インシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、Ｉ型糖尿病）を患う人物においてインシュリン感受性を改善する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る化合物の本発明は、インシュリン治療なしに、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、ＩＩ型糖尿病）を患う人物においてインシュリン感受性を改善する方法として用いることができる。
第８の局面において、本発明は、第１の局面において説明したＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、およびＧＭＧ−１１ポリペプチドを作製する方法であって、タンパク分解性開裂、組換え法および人為的合成からなる群より選択される方法を特徴とする。
第９の局面において、本発明は、組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片または完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドの作製方法であって、その乳が前記組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片または完全長タンパク質を含有するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を提供し、および前記組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片または前記完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドを前記非ヒト哺乳動物の乳から精製することを含む方法を提供する。一態様において、前記非ヒト哺乳動物はウシ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、またはマウスである。別の態様において、この方法は、組換え完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドを前記乳から精製することを含み、および前記タンパク質をインビトロで開裂して所望のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片を得ることをさらに含む。
第１０の局面において、本発明は、本発明のポリペプチドに特異的に結合することができる精製または単離抗体を特徴とする。この態様の一局面において、この抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２に記載されるポリペプチド配列のうちの１つの少なくとも６の連続アミノ酸、少なくとも８の連続アミノ酸、または少なくとも１０の連続アミノ酸を含むポリペプチドに結合することができる。
第１１の局面において、本発明は、代謝関連疾患もしくは障害の治療および／または体重の減少もしくは増加への、第１の局面において説明したポリペプチドの使用を特徴とする。好ましくは、前記代謝関連疾患および障害は、肥満、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病およびＩＩ型糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとするＩＩ型糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。好ましい態様において、前記個体は哺乳動物、好ましくは、ヒトである。
第１２の局面において、本発明は、ヒトまたは動物身体の治療方法において用いるための、本発明の第１の局面のポリペプチド、または本発明の第５の局面の組成物を提供する。
第１３の局面において、本発明は、美容上の目的で体重を減少させる方法であって、第５の局面において説明される前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物、または第１の局面において説明したポリペプチドを個体に提供することを含む方法を特徴とする。好ましくは、前記体重減少のため、前記個体は少なくとも２０および２５以下のＢＭＩを有する。代わりとして、前記体重増加のためには、前記個体は、好ましくは、少なくとも１５および２０以下のＢＭＩを有する。
第１４の局面において、本発明は、体重の減少のためおよび／または代謝関連疾患もしくは障害の治療もしくは予防のための、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。好ましくは、前記代謝関連疾患もしくは障害は、肥満、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病およびＩＩ型糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとするＩＩ型糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。好ましい態様において、前記個体は哺乳動物、好ましくは、ヒトである。好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物で治療しようとする前記個体の同定は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のジェノタイピングまたは前記個体に由来する臨床試料におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルの測定を含む。好ましくは、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群より選択される。
第１５の局面において、本発明は、美容上の理由で体重を減少させるための、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。
第１６の局面において、本発明は、インシュリン耐性の治療方法であって、第５の局面において説明した前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物、または第１の局面において説明したポリペプチドを個体に提供することを含む方法を特徴とする。
第１７の局面において、本発明は、肥満であるか、絶食時高インシュリン血症を有するか、またはその両方を有する正常グルコース寛容（ＮＧＴ）の個体の治療方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。
さらなる好ましい態様において、本発明は、妊娠性糖尿病を患う個体の治療方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。妊娠性糖尿病は妊娠期間、通常、妊娠の第２または第３三半期の間の個体における糖尿病の発症を指す。
さらなる好ましい態様において、本発明は、絶食時グルコース障害（ＩＦＧ）を患う個体の治療方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。絶食時グルコース障害（ＩＦＧ）は、個体における絶食時血漿グルコース濃度が上昇しているが明白な糖尿病の診断がない、すなわち、１２６ｍｇ／ｄｌ未満および１１０ｍｇ／ｄｌ以下の血漿グルコース濃度の状態である。
さらなる好ましい態様において、本発明は、個体における耐糖能異常（ＩＧＴ）の治療および予防方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。ＩＧＴを減少または防止するための、すなわち、インシュリン耐性を正常化するための治療薬および方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行を遅延または防止することができる。さらに、インシュリン耐性を減少または防止するための治療薬および方法を提供することにより、本発明はインシュリン耐性症候群の出現を減少および／または予防するための方法を提供する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、多嚢胞卵巣症候群（ＰＣＯＳ）を患う被検体の治療方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。ＰＣＯＳは閉経前女性の最も一般的な障害のうちにあるものであり、この集団の５〜１０％を冒す。インシュリン感作薬、例えば、トログリタゾンがＰＣＯＳにおいて有効であることが示されており、かつ、例えばインシュリン耐性のヒトにおいて、インシュリン作用、インシュリン分泌、卵巣ステロイド産生および線維素溶解における血管が改善される（Ｅｈｒｍａｎ等（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：１２３０）。したがって、本発明は、インシュリン耐性を減少させ、血中グルコースを正常化させ、したがって、ＰＣＯＳを治療および／または予防するための方法を提供する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、インシュリン耐性を有する被検体の治療方法における、第５の局面において説明した薬学的または生理学的に許容し得る組成物を特徴とする。
さらなる好ましい態様においては、インシュリン耐性を有する被検体を本発明の方法に従って治療し、インシュリン耐性を減少または治癒させる。インシュリン耐性は感染および癌にも関連する場合があるため、本発明の方法によるインシュリン耐性の予防または減少は感染および癌を予防または減少し得る。
さらなる好ましい態様においては、本発明の方法を被検体、例えば、インシュリン耐性を発症する危険性が高まっていることが公知である者におけるインシュリン耐性の発症を予防するのに用いる。
したがって、上記試験または当前記技術分野において公知の他の試験のいずれかを被検体がインシュリン耐性であることを決定するのに用いることができ、次にその患者を本発明の方法に従って治療してインシュリン耐性を減少または治癒させることができる。代わりとして、本発明の方法を被検体、例えば、インシュリン耐性を発症する危険性が高まっていることが公知である者におけるインシュリン耐性の発症の予防に用いることもできる。
第１８の局面において、本発明は、代謝関連疾患または障害の予防または治療方法であって、そのような治療を必要とする個体に、第５の局面において説明した前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物を提供または投与することを含む方法を特徴とする。好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物で治療しようとする、そのような治療を必要とする前記個体の同定は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１単一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）のジェノタイピングまたは前記個体に由来する臨床試料におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドもしくはｍＲＮＡレベルの測定を含む。好ましくは、前記臨床試料は、血液、血清、血漿、尿、および唾液からなる群より選択される。好ましくは、前記代謝関連疾患もしくは障害は、肥満、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病およびＩＩ型糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとするＩＩ型糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＦＩＶ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。好ましい態様において、前記個体は哺乳動物、好ましくは非ヒト、好ましくはネコまたはイヌである。
第１９の局面において、本発明は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を用いてＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片活性の１以上のアンタゴニストについて化合物をスクリーニングする方法であって、前記活性が脂質分配、脂質代謝、およびインシュリン様活性から選択されるがこれらに限定されるものではない方法を特徴とする。
好ましい態様において、前記化合物は小分子量有機もしくは無機化合物、タンパク質、ペプチド、炭水化物、または脂質から選択されるが、これらに限定されるものではない。
上述の、およびここで説明される方法の好ましい局面において、個体に投与されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの量は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドの循環（血液、血清、もしくは血漿）レベル（濃度）をそれらの正常レベル（非肥満個体におけるレベル）とするのに十分なものである。「正常レベル」は、全ての循環ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド（完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１タンパク質およびそれらの断片）の総濃度または全ての循環タンパク分解性開裂ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドのみの濃度として指定することができる。
上述の、およびここで説明される方法のさらなる好ましい局面において、体重減少は、部分的にまたは完全に、ａ）皮下脂肪組織および／またはｂ）内臓（網嚢）脂肪組織のいずれかの質量の減少によるものである。
本発明のいずれの態様においても、完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドをＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片またはそれらをコードするポリヌクレオチドの代わりに特異的に用いることができる。
本発明をより詳細に説明する前に、以下の定義を示してここで本発明を説明するのに用いられる用語の意味および範囲を説明および定義する。
ここで交換可能に用いられる場合、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」および核酸という用語は、一本鎖または二重鎖形態のいずれかの、１ヌクレオチドを上回るＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列を含む。これらの用語は「修飾ヌクレオチド」を包含し、これは、例としてであって限定ではないものとして、（ａ）代替連結基、（ｂ）プリンの類似形態、（ｃ）ピリミジンの類似形態、または（ｄ）類似糖を含む少なくとも１つの修飾を含む。類似連結基、プリン、ピリミジン、および糖の例については、例えば、ＰＣＴ公報第ＷＯ９５／０４０６４号を参照のこと。本発明のポリヌクレオチド配列はあらゆる公知の方法によって調製することができ、これには、合成、組換え、生体外産生、またはそれらの組合せに加えて、当該技術分野において公知のあらゆる精製法の利用が含まれる。
ポリヌクレオチド構築体、組換えポリヌクレオチドおよび組換えポリペプチドという用語は、ここでは、当該技術分野におけるそれらの使用と一致して用いられる。「上流」および「下流」という用語も、ここでは、当該技術分野におけるそれらの使用と一致して用いられる。「塩基対」および「Ｗａｔｓｏｎ ＆ Ｃｒｉｃｋ塩基対」という用語は、ここでは交換可能に、かつ当該技術分野におけるそれらの使用と一致して用いられる。同様に、「相補的」、「それらの相補体」、「相補体」、「相補的ポリヌクレオチド」、「相補的核酸」および「相補的ヌクレオチド配列」という用語は、ここでは交換可能に、かつ当該技術分野におけるそれらの使用と一致して用いられる。
「精製された」という用語は、ここでは、他の化合物から分離されている本発明のポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドベクターを説明するのに用いられ、この他の化合物には、これらに限定されるものではないが、他の核酸、炭水化物、脂質およびタンパク質（例えば、ポリヌクレオチドの合成において用いられた酵素）が含まれる。「精製された」は、例えば、直鎖ポリヌクレオチドからの共有結合的に閉鎖したポリヌクレオチドの分離、またはその逆をも指し得る。試料の少なくとも約５０％、６０％、７５％、または９０％が単一のポリヌクレオチド配列を含むとき、ポリヌクレオチドは実質的に純粋である。幾つかの場合、これは立体配座（直鎖対共有結合的に閉鎖）間の決定を含む。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、典型的には、核酸試料の約５０、６０、７０、８０、９０、９５、９９％重量／重量を構成する。ポリヌクレオチド純度または均一性は当該技術分野において公知の幾つかの手段、例えば、試料のアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くそのゲルの染色による単一ポリヌクレオチドバンドの可視化によって示すことができる。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において公知の他の手段を用いることによってより高い解像度を達成することができる。
同様に、「精製された」という用語は、ここでは、他の化合物から分離されている本発明のポリペプチドを説明するのに用いられ、この他の化合物には、これらに限定されるものではないが、核酸、脂質、炭水化物および他のタンパク質が含まれる。幾つかの好ましい態様においては、試料のポリペプチド分子の少なくとも約５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％が単一のアミノ酸配列を有するとき、ポリペプチドは実質的に純粋である。幾つかの好ましい態様においては、実質的に純粋なポリペプチドは、典型的には、タンパク質試料の約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％重量／重量を構成する。ポリペプチド純度または均一性は当該技術分野において公知の幾つかの方法、例えば、試料のアガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くそのゲルの染色による単一ポリペプチドバンドの可視化によって示すことができる。特定の目的のため、ＨＰＬＣまたは当該技術分野において公知の他の方法を用いることによってより高い解像度を達成することができる。
さらに、ここで用いられる場合、「精製された」という用語は完全な純度を必要とせず、相対的な定義であることが意図される。出発物質または天然物質の少なくとも１桁、好ましくは２もしくは３桁、より好ましくは４もしくは５桁までの精製が明白に考慮される。代わりとして、精製を異種ポリヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはその両方）またはポリペプチドに対する「少なくとも」パーセント純度で表すこともできる。好ましい態様として、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９６％、９８％、９９％、９９．５％または１００％純粋である。さらなる好ましい態様として、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは異種ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対して９０％〜１００％の小数点以下第３位に至るまでのあらゆる数の範囲をとる「少なくとも」純度を有する（例えば、少なくとも９９．９９５％純粋）。加えて、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度は、担体溶液以外の全ての材料および化合物に対する（上述の）パーセンテージとして表示することができる。小数点以下第３位に至るまでの各々の数字を純度の個々の種として主張することができる。
「単離された」という用語は、その物質がその元の環境（例えば、それが天然である場合には自然環境）から取り出されていることを必要とする。例えば、生活動物内に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されてはいないが、自然系内における幾つかの、または全ての共存物質から分離されている同じポリヌクレオチドもしくはＤＮＡまたはポリペプチドは単離されている。そのようなポリヌクレオチドはベクターの一部であり得、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは組成物の一部であり得、そのベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではない状況では依然として単離されている。
「単離された」の定義から明確に排除されるものは、天然染色体（例えば、染色体スプレッド）、人工染色体ライブラリ、ゲノムライブラリ、およびインビトロ核酸調製品または形質移入／形質転換宿主細胞調製品のいずれかとして存在するｃＤＮＡライブラリであり、これらの宿主細胞はインビトロ不均一調製品であるか、または単一コロニーの不均一集団として塗布されている。５’ＥＳＴがベクター分子における核酸インサートの数の５％（または、代わりとして、１％、２％、３％、４％、１０％、２５％、５０％、７５％、もしくは９０％、９５％、もしくは９９％）未満を構成する上記ライブラリも明確に排除される。さらに、全細胞ゲノムＤＮＡまたは全細胞ＲＮＡ調製品（機械的に剪断されているか、または酵素的に消化されている前記全細胞調製品を含む）が明確に排除される。さらに明確に排除されるものは、インビトロ調製品または電気泳動（そのブロット転移を含む）によって分離された不均一混合物のいずれかとしての上記全細胞調製品であり、ここで、本発明のポリヌクレオチドは電気泳動媒体中で異種ポリヌクレオチドからさらに分離はされていない（例えば、アガロースゲルまたはナイロンブロットにおける不均一バンド集団からの単一バンドの切り出しによる分離）。
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に相補的であり、かつ標的ヌクレオチド配列とのハイブリダイズに用いられる特定のオリゴヌクレオチド配列を示す。プライマーは、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合の開始点としての役目を果たす。
「プローブ」という用語は、試料中に存在する特定のポリヌクレオチド配列を同定するのに用いることができる定義された核酸セグメントを示し、前記核酸セグメントは同定しようとする特定のポリヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を含む。
「ポリペプチド」という用語はアミノ酸のポリマーを指し、そのポリマーの長さには関わらない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はポリペプチドの発現後修飾を指定することも排除することもない。例えば、グリコシル基、アセチル基、ホスフェート基、脂質基等の共有結合基を含むポリペプチドがポリペプチドという用語によって明確に包含される。１以上のアミノ酸の類似物（例えば、非天然アミノ酸、無関係の生物学的系においてのみ天然に生じるアミノ酸、哺乳動物系に由来する修飾アミノ酸等を含む）を含むポリペプチド、天然および非天然の両方の、当該技術分野において公知の他の修飾に加えて、置換連結を有するポリペプチドもこの定義に含まれる。
理論によって制限されることなく、本発明の化合物／ポリペプチドは食事性脂質の肝臓および周辺組織間への分配を調節することが可能であり、したがって、「肝臓および周辺組織間への食事性脂質の分配に関与する疾患」を治療することが可能である。「周辺組織」という用語は、筋肉および脂肪組織を含むものを意味する。好ましい態様において、本発明の化合物／ポリペプチドは食事性脂質を筋肉に向けて分配する。代わりの好ましい態様においては、食事性脂質は脂肪組織に向けて分配される、他の好ましい態様においては、食事性脂質は肝臓に向けて分配される。さらに他の好ましい態様においては、本発明の化合物／ポリペプチドは、筋肉による食事性脂質、好ましくは遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増加または減少させる。食事性脂質には、これらに限定されるものではないが、トリグリセリドおよび遊離脂肪酸が含まれる。
食事性脂質の分配が関与するものと信じられる好ましい疾患には、糖尿病並びに糖尿病関連疾患および障害、例えば、糖尿病、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭもしくはＩＩ型糖尿病）およびインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭもしくはＩ型糖尿病）が含まれる。本発明の方法によって治療しようとする糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、網膜症、神経障害、および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の肥満関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。
「異種」という用語は、ここで用いられる場合、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド以外のあらゆるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドを示すことが意図される。
「含む」、「からなる」および「から本質的になる」という用語は、それらの標準的な意味に従って定義される。Ｍ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に記載の定義された意味は当該技術分野における定義された意味を制御し、連邦巡回控訴裁判所判例法の管理に記載の定義された意味はＭ．Ｐ．Ｅ．Ｐ．に記載の意味を制御する。これに留意して、各々の用語に付随する特定の意味を付加するため、本願を通して、これらの用語を互いの代わりに用いることができる。
本発明の特定のポリヌクレオチド「のための宿主細胞組換体」という用語は、人の手によって前記細胞中に天然では見出されれない方法で前記ポリヌクレオチドを含むように改変されている宿主細胞を意味する。例えば、前記細胞に一時的に、または安定に、本発明のポリヌクレオチドを形質移入または形質導入することができる。
ここで用いられる「肥満」という用語はＷＨＯ体重分類において定義されている（Ｋｏｐｅｌｍａｎ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０４：６３５６４３）。体重不足は１８．５未満（やせ型）、健常は１８．５〜２４．９（正常）、グレード１体重超過は２５．０〜２９．９（体重超過）、グレード２体重超過は３０．０〜３９．０（肥満）、グレード３体重超過は４０．０以上のＢＭＩである。ＢＭＩは肥満度指数（病的肥満）であり、ｋｇ／ｍ2である。胴回りも代謝合併症の危険性を示すのに用いることができ、男性において９４ｃｍ以上の胴回りは危険性の増加を示し、１０２ｃｍ以上は実質的な危険性の増加を示す。同様に、女性について、８８ｃｍ以上は危険性の増加を示し、８８ｃｍ以上は実質的な危険性の増加を示す。胴回りは肋骨の下縁と骨盤の上縁の間の中点でｃｍで測定する。肥満の他の尺度には、これらに限定されるものではないが、カリパスを用いたｃｍでの皮脂厚の測定値である皮脂厚、および主として電解質溶液であるために赤身伝導電流が脂肪よりも良好であるという原理に基づくバイオインピーダンスが含まれる。末端を横切って印加された弱電流に対する抵抗（インピーダンス）の測定が、経験的に導かれた式を用いる体脂肪の見積もりをもたらす。
「糖尿病」という用語は、ここで用いられる場合、以下のリストに含まれるがこれらに限定されるものではない方法のいずれかからなされる糖尿病の通常の診断を包含することが意図される。すなわち、糖尿病の症状（例えば、多尿、多飲、多食）に加えて２００ｍｇ／ｄｌ以上の日常的血漿グルコースレベル（ここで、日常的血漿グルコースは食事もしくは飲料消費のタイミングに関わらず１日のあらゆる時間で定義される）、１２６ｍｇ／ｄｌ以下の８時間絶食時血漿グルコースレベル、および水に溶解した７５ｇ無水グルコースを経口投与した２時間後の２００ｍｇ／ｄｌ以上の血漿グルコースレベル。
「耐糖能異常（ＩＧＴ）」という用語は、ここで用いられる場合、フランク、ＮＩＤＤＭおよび正常グルコース寛容（ＮＧＴ）の間の中間であるインシュリン耐性を伴う状態を示すことが意図される。ＩＧＴ集団の高いパーセンテージが正常グルコース寛容を伴う人物に対してＮＩＤＤＭまで進行することが公知である（Ｓａｄ等、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ １９８８；３１９：１５００−６）。したがって、ＩＧＴを低減または防止するための、すなわち、インシュリン耐性を正常化するための治療薬および方法を提供することにより、ＮＩＤＤＭへの進行を遅延または防止することができる。ＩＧＴは、冒された人物の食後グルコース応答を２時間食後血漿グルコースレベルによる評価で異常であると決定する手順によって診断される。この試験においては、グルコースの測定量が患者にもたらされ、血液グルコースレベルが規則的な間隔、通常、最初の２時間については３０分毎、その後は１時間毎に測定される。「正常」または非ＩＧＴ個体においては、グルコースレベルは最初の２時間で１４０ｍｇ／ｄｌ未満のレベルまで上昇し、次いで急速に下降する。ＩＧＴ個体においては、血液グルコースレベルはより高く、レベルの下降はより遅い速度である。
「インシュリン耐性症候群」という用語は、ここで用いられる場合、高血圧および冠動脈疾患（ＣＡＤ）、例えば、早発性アテローム性血管疾患の両方の発症において重要な役割を果たす一連の事象を発動する、インシュリン耐性を補償する試みから生じる異常の集団を包含することが意図される。血漿トリグリセリドの増加およびＨＤＬ−コレステロール濃度の減少、ＣＡＤに関連することが公知である状態もインシュリン耐性に関連することが報告されている。したがって、インシュリン耐性を減少または防止するための治療薬および方法を提供することにより、本発明はインシュリン耐性症候群の発症を低減および／または防止するための方法を提供する。
「多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）」という用語は、ここで用いられる場合、閉経前女性の病因学的に割り当てられていない障害であって、この集団の５〜１０％を冒し、高アンドロゲン症、慢性無排卵、インシュリン作用の欠陥、インシュリン分泌、卵巣ステロイド産生および線維素溶解を特徴とする障害を示すことが意図される。ＰＣＯＳを患う女性はしばしばインシュリン耐性であり、３０および４０歳台にグルコース非寛容またはＮＩＤＤＭを発症する危険性が高まっている（Ｄｕｎａｉｆ等（１９９６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ８１：３２９９）。高アンドロゲン症も、Ａ型症候群から妖精症および脂肪萎縮性糖尿病を介してＢ型症候群まで、これらの状態が閉経前女性において生じるとき、様々な多様インシュリン耐性状態の特徴である。高インシュリン血症自体が高アンドロゲン症を生じることが示唆されている。インシュリン感作薬、例えば、トログリタゾンがＰＣＯＳにおいて有効であり、特に、例えばインシュリン耐性のヒトにおいて、インシュリン作用、インシュリン分泌、卵巣ステロイド産生および繊維素溶解における欠陥が改善されることが示されている（Ｅｈｒｍａｎ等（１９９７）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １００：１２３０）。
「インシュリン耐性」という用語は、ここで用いられる場合、静脈内グルコース寛容試験または絶食時インシュリンレベルの測定を含むがこれらに限定されるものではない幾つかの方法のいずれかによってなされる、インシュリン耐性の通常の診断を包含することが意図される、絶食時インシュリンレベルの高さとインシュリン耐性度の間には優れた相関が存在することが公知である。したがって、どの正常グルコース寛容（ＮＧＴ）個体がインシュリン耐性を有するのかを同定する目的で、絶食時インシュリンレベルの上昇をインシュリン耐性の代替マーカーとして用いることができる。これを実施する別の方法は、Ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎｏ．３，ｐｐ．１１８８（１９９５）に開示されるようなアプローチに従うこと、すなわち、治療群に入れる最初の基準として肥満を選択することである。幾らかの肥満被検体は耐糖能異常（ＩＧＴ）を有するのに対して、他のものは正常グルコース寛容（ＮＧＴ）を有する。本質的に、全ての肥満被検体はインシュリン耐性であるため、すなわち、ＮＧＴ肥満被検体でさえインシュリン耐性であり、かつ絶食時高インシュリン血症を患う。したがって、本発明による治療の標的は、肥満であるか、または絶食時高インシュリン血症を患うか、またはその両方であるＮＧＴ個体と定義することができる。
インシュリン耐性の診断は正常血糖性グルコースクランプ試験を用いて行うこともできる。この試験は一定のインシュリン注入および可変速度グルコース注入の同時投与を含む。３〜４時間続くこの試験の間、グルコースレベルを５〜１０分毎に測定し、次いで可変速度グルコース注入を調整して血漿グルコースレベルを変化しないままにすることにより、血漿グルコース濃度を正常血糖レベルで一定に保つ。それらの環境下で、血流へのグルコース流入の速度は体内におけるグルコース処理の全体速度と等しい。基底状態（インシュリン注入なし）におけるグルコース処理の速度とインシュリン注入状態との間の差はインシュリン介在のグルコース取り込みを表す。正常個体において、インシュリンは身体グルコース処理全体の活発かつ大きな増加を生じ、それに対してＮＩＤＤＭにおいては、このインシュリンの効果は大きく鈍り、正常の僅か２０〜３０％である。ＩＧＴまたはＮＧＴを有するインシュリン耐性被検体においては、インシュリン刺激グルコース処理の速度は正常およびＮＩＤＤＭの間のほぼ中間である。例えば、約１００ｕＵ／ｍｌの定常状態血漿インシュリン濃度（生理学的レベル）で、正常被検体におけるグルコース処理速度は約７ｍｇ／ｋｇ／分である。ＮＩＤＤＭ被検体においては約２．５ｍｇ／ｋｇ／分であり、ＩＧＴを有する患者（またはＮＧＴを有するインシュリン耐性被検体）においては約４〜５ｍｇ／ｋｇ／分である。これは再現性が高く正確な試験であり、これらの範疇内の患者を区別することができる。被検体がよりインシュリン耐性になるに従って絶食時インシュリンレベルが上昇することも公知である。絶食時インシュリンレベルの高さと正常血糖性グルコースクランプ試験によって測定されるインシュリン耐性の強度との間には優れた正の相関が存在し、したがって、これは、絶食時インシュリンレベルをインシュリン耐性の代替尺度として用いる理論的根拠を提供する。
「肝臓および末梢組織の間での食事性脂質の分配に作用する作用物質」という用語は、前述のように、肝臓および末梢組織の間の食事性脂質の分配を調節する本発明の化合物またはポリペプチドを指す。好ましくは、この作用物質は、筋肉による食事性脂質、好ましくは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の酸化を増減させる。好ましくは、この作用物質は、個体の体重を増減させるか、または肥満関連疾患もしくは障害、例えば、肥満、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、またはＩＩ型糖尿病）およびインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭまたはＩ型糖尿病）の治療もしくは予防に用いられる。本発明の方法によって治療しようとする糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、網膜症、神経障害、腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の肥満関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。
「肝臓および抹消組織の間での食事性脂質の分配に作用する作用物質に対する応答」という用語は薬物の効力を指し、これには化合物を代謝する能力、プロドラッグを活性薬物に変換する能力、並びに個体における薬物の薬物動力学（吸収、分布、排除）および薬力学（受容体関連）が含まれるがこれらに限定されるものではない。
「肝臓および末梢組織の間での食事性脂質の分配に作用する作用物質に対する副作用」という用語は、薬物の主要薬理学的作用の拡張から生じる治療の悪影響または薬物と独自の宿主因子との相互作用から生じる特異的な有害反応を指す。「肝臓および末梢組織の間での食事性脂質の分配に作用する作用物質に対する副作用」は有害反応、例えば、皮膚科学的、血液学的もしくは肝臓学的毒性を含み得るがこれらに限定されるものではなく、さらに、胃および腸潰瘍、血小板機能の障害、腎損傷、腎炎、大量の水性分泌を伴う血管運動性鼻炎、血管神経性浮腫、全身性蕁麻疹、並びに気管支喘息から咽頭浮腫および気管支収縮、低血圧、およびショックを含む。
「ＧＭＧ−７Ａ−、ＧＭＧ−７Ｂ−、ＧＭＧ−８−、ＧＭＧ−９−、ＧＭＧ−１０−、またはＧＭＧ−１１−関連疾患および障害」という用語は、ここで用いられる場合、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の異常機能を含むか、またはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１レベルもしくは活性を調節することによって治療もしくは予防することができるあらゆる疾患もしくは障害を指す。「ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の異常機能」には、これらに限定されるものではないが、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の異常発現レベル（増加もしくは減少のいずれかであり、好ましくは減少）、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の異常活性（増加もしくは減少のいずれか）、およびリガンドもしくは結合パートナーとの異常相互作用（増加もしくは減少のいずれか）が含まれる。「異常」が意味するものは、正常細胞、組織、もしくは患者において見られるか、または病気の発症前に細胞、組織、もしくは患者において見られるタイプもしくは活性のレベルからの変化である。好ましい態様において、これらのＧＭＧ−７Ａ−、ＧＭＧ−７Ｂ−、ＧＭＧ−８−、ＧＭＧ−９−、ＧＭＧ−１０−、またはＧＭＧ−１１−関連疾患および障害は、肥満並びに前述の代謝関連疾患および障害を含む。
「美容治療」という用語は、個体の体重を増減させる本発明の化合物またはポリペプチドでの治療を含むものであり、ここで、その個体は臨床的に肥満でも臨床的に痩身でもない。したがって、これらの個体は、臨床的肥満のカットオフを下回り（例えば、２５ｋｇ／ｍ2未満）、かつ臨床的痩身のカットオフを上回る（例えば、１８．５ｋｇ／ｍ2超）の肥満度指数（ＢＭＩ）を有する。加えて、これらの個体は、好ましくは健常である（例えば、本発明の代謝関連疾患または障害を患ってはいない）。「美容治療」は、幾つかの状況においては、脂肪組織のより局所的な増加、例えば、ウェストもしくはヒップ周囲、またはヒップおよび大腿周囲の特異的な増加または喪失を包含するものである。これらの脂肪組織の局所的な増加または喪失は、例えば、ウェストまたはヒップのサイズの増加または減少によって同定することができる。
「予防する」という用語は、ここで用いられる場合、肥満またはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１に関連する異常の肉体的徴候を予防するため、疾患または状態の臨床的症状の発症前に化合物を投与することを指す。
「治療する」という用語は、ここで用いられる場合、臨床的症状が発症した後に化合物を投与することを指す。
「治療を必要とする」という用語は、ここで用いられる場合、個体または動物が治療を必要とするか、または治療から利益を受けるという、介護者（例えば、ヒトの場合は医師、看護士、看護医等、非ヒト哺乳動物を含む動物の場合は獣医）によってなされる判断を指す。この判断は、介護者の専門技術の範囲内にあるが、その個体または動物が本発明の化合物によって治療可能である状態の結果として病気であるか、もしくは病気になるという知識を含む様々な要素に基づいてなされる。
「治療の必要を認知する」という用語は、上記「美容治療」の下で論じられるように美容上の理由で体重を減らすことを個体が望む潜在的な決定を指す。他の態様においては、「治療の必要を認知する」という用語は、動物の所有者がその動物の美容治療をなす決定を指し得る。
「個体」または「患者」という用語は、ここで用いられる場合、哺乳動物、好ましくは、マウス、ラット、他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、または霊長類、最も好ましくは、ヒトを含むあらゆる動物を指す。この用語はオスもしくはメスもしくはその両方を指定することがあり、またはオスもしくはメスを排除することがある。
「非ヒト動物」という用語は、ここで用いられる場合、鳥類および、より一般的には、哺乳動物、好ましくは、霊長類、動物、例えば、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ロバ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギまたは齧歯類、より好ましくは、ラットまたはマウスを含むあらゆる動物を指す。「動物」および「哺乳動物」という用語の両方は、「非ヒト」という用語が先行しない限り、ヒト被験者を明確に包含する。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、高脂肪／スクロース食を与えられた哺乳動物において血漿遊離脂肪酸、グルコース、およびトリグリセリドの食後応答を有意に減少させることができ、それに対してレプチン、インシュリンまたはグルカゴンのレベルには影響を及ぼさない。加えて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、インビトロおよび生体外で、筋肉遊離脂肪酸酸化を調節し、好ましくは、酸化を増加させる。さらに、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、高脂肪／スクロース食を与えられている哺乳動物における体重増加を調節する。
本発明は、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）の分配における、エネルギーホメオスタシスを制御する重要な新規ツールとしてのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの使用を包含する。有意に循環から脂質を除去し、かつＦＦＡ酸化を生じることができる組織のうち、筋肉が定量的に最も重要であるものと信じられる。
［発明の好ましい態様］
Ｉ．本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、または ＧＭＧ−１１ポリペプチド
インビトロおよびインビボで測定可能な活性を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドが同定されている。これらの活性には、これらに限定されるものではないが、高脂肪／スクロース食を与えられている哺乳動物における血漿遊離脂肪酸、グルコース、およびトリグリセリドの食後応答の調節、好ましくは、減少（実施例６）、インビトロおよび生体外での筋肉遊離脂肪酸酸化の変化、好ましくは、増加（実施例１０）、並びに高脂肪／スクロース食の哺乳動物における持続的体重減少が含まれる。インビトロおよびインビボでのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性の他のアッセイも提供され（例えば、実施例２、５、７、９、１１）、当該術分野における通常の技術を有するものが同等のアッセイを設計することができる。
「ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド」という用語は、「完全長」ポリペプチドおよび「完全長」ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの断片の両方を含む（上述の種の各々を特に指定することもできる）。
ここで用いられる「無傷の」または「完全長」ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドが意味するものは、Ｎ末端メチオニンからＣ末端停止コドンまでの、あらゆるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの完全長ポリペプチド配列である。無傷の、または完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの例を配列表に見出すことができる。
「代謝関連活性」という用語は、ここで用いられる場合、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドについてここで説明される、少なくとも１つの、好ましくは全ての活性を指す。これらの活性を決定するためのアッセイがここに提供され（例えば、実施例２、５−７、９−１１）、当該技術分野における通常の技術を有するものが同等のアッセイを設計することができる。任意に、「代謝関連活性」は脂質分配、脂質代謝、およびインシュリン様活性、またはこれらの範疇の１つのうちにある活性からなる群より選択することができる。「脂質分配」活性が意味するものは、脂肪組織、肝臓、および筋肉を含む主要組織群の間への食事性脂質の局在化を達成する能力である。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、筋肉、肝臓または脂肪組織への脂質の分配において役割を果たす。「脂質代謝」活性が意味するものは、脂質の代謝に影響を及ぼす能力である。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、血漿中の遊離脂肪酸のレベルに影響を及ぼすことに加えて、遊離脂肪酸酸化実験によって筋肉中の脂質の代謝を調節し、好ましくは、増加させ（実施例２、６、８、９、１０）、かつ血漿および筋肉中のトリグリセリドのレベルに一時的に影響を及ぼす（実施例６、８、１１）能力を有する。「インシュリン様」活性が意味するものは、血漿中のグルコースのレベルを調節するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの能力である。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、インシュリンの効果と同様に、インシュリンレベルには有意に衝撃を与えることはないが、グルコースレベルに衝撃を与える（実施例７および８）。これらの効果は無傷の（完全長）ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在下で変化することがあり、または完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドと比較してＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の存在下で有意に高くなり得る。
「有意に高い」という用語は、ここで用いられる場合、同じアッセイにおける非処理細胞と比較した、代謝関連アッセイにおけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの活性の比較を指す。ここで用いられる場合、「有意」が意味するものは、当該技術分野における通常の技術を有するものによって典型的に決定される統計的有意である。例えば、データは典型的には平均±ＳＥＭとして算出され、ｐ値≦０．０５が統計的に有意と考えられる。統計解析は、典型的には、各々の研究における適切さに応じて、対応のないスチューデントのｔ検定または対応のあるスチューデントのｔ検定のいずれかを用いて行う。非処理細胞と比較した、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在の結果としての活性の有意変化の例には、所定のパラメータにおける少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％の増加または減少が含まれる。全てである必要はないが、測定可能なパラメータのうちの１つ以上が、非処理細胞と比較して、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在下で有意に変化する。
代表的な「代謝関連アッセイ」が実施例に示される。これらのアッセイには、これらに限定されるものではないが、食後応答の測定方法、遊離脂肪酸酸化の測定方法、および体重調節の測定方法が含まれる。好ましい態様においては、非ヒト動物、好ましくはマウス、において食後応答を測定する。好ましい態様においては、食事性脂質、好ましくは、遊離脂肪酸および／またはトリグリセリドの変化を測定する。他の態様においては、グルコース、インシュリン、およびレプチンを含むがこれらに限定されるものではない、他の生理学的パラメータを測定する。他の好ましい態様においては、遊離脂肪酸酸化を細胞においてインビトロまたは生体外で、好ましくは、非ヒト動物、好ましくはマウス、の筋肉細胞もしくは組織において測定する。さらに他の好ましい態様においては、高脂肪／スクロース食のヒトまたは非ヒト動物、好ましくは、齧歯類（ラットもしくはマウス）、霊長類、イヌ、ネコまたはブタにおいて体重調節を測定する。任意に、「代謝関連活性」は、ここで具体的に指定されていない他の活性を含む。一般には、肥満および代謝研究の分野に関連する「測定可能なパラメータ」は、遊離脂肪酸レベル、遊離脂肪酸酸化、トリグリセリドレベル、グルコースレベル、インシュリンレベル、レプチンレベル、食物摂取、体重、レプチンおよびリポタンパク質の結合、取り込みおよび分解並びに脂肪分解刺激受容体（ＬＳＲ）発現からなる群より選択することができる。
これらの代謝関連アッセイにおいて、好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、食後脂肪血、遊離脂肪酸レベル、トリグリセリドレベル、グルコースレベル、遊離脂肪酸酸化、および体重からなる群より選択される測定可能なパラメータの少なくとも１つにおいて有意な変化を生じる。代わりとして、好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、ＬＳＲ活性の増加、レプチン活性の増加およびリポタンパク質活性の増加からなる群から選択される測定可能なパラメータの少なくとも１つにおいて有意な変化を有する。「ＬＳＲ」活性が意味するものは、細胞の表面上での、もしくは特定の立体配座でのＬＳＲの発現の他に、レプチンおよびリポタンパク質を結合、取り込み、および分解するその能力である。「レプチン」活性が意味するものは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解の他に、血液脳関門を横切るその輸送、および潜在的に、ＬＳＲが必ずしも介在因子ではないか、または唯一の介在因子でないこれらの出現である。同様に、「リポタンパク質」活性が意味するものは、ＬＳＲによるその結合、取り込みおよび分解の他に、ＬＳＲが必ずしも介在因子ではないか、または唯一の介在因子ではないこれらの出現である。
本発明は、とりわけ、単離、精製または組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドに狙いが定められる。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、美容治療として、または代謝関連疾患もしくは障害の治療もしくは予防のいずれかのため、体重を減少させるか、または、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドのアンタゴニストを用いて、増加させるために有用である。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、とりわけ、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性のアゴニストもしくはアンタゴニストのスクリーニングアッセイにおいて；ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド特異的抗体の産生のため；および診断アッセイにおいて有用でもある。美容治療、または代謝関連疾患、障害もしくは状態の治療もしくは予防に用いられる場合、１種類以上のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１またはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片を被検体に与えることができる。したがって、完全長タンパク質の様々な断片を組み合わせて様々な治療措置において用いるための「カクテル」とすることができる。
完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは以下のものを含む別々の領域を含んでなる：
１．配列番号６のアミノ酸約１〜２７、配列番号８のアミノ酸約１〜２４、配列番号１０のアミノ酸約１〜２３、または配列番号１２のアミノ酸約１〜３２のＮ末端推定シグナルペプチド配列；
２．配列番号１０のアミノ酸約４５〜１４６のコラーゲン様領域；
３．配列番号２のアミノ酸約５７９〜７１０、配列番号６のアミノ酸約６９−２０１、配列番号１０のアミノ酸約１４９〜２８５、または配列番号１２のアミノ酸約７０〜２０５のＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメイン；および
４．配列番号８のアミノ酸約４５〜１１０の、Ｎ末端に配置された、切り詰められた球状Ｃ１ｑ相同ドメイン。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、上記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの変種、断片、類似体および誘導体を含み、これには修飾ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドが含まれる。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、好ましくは、単離形態で提供され、部分的に、または実質的に精製されていてもよい。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのいずれか１つの組換え産生バージョンは、Ｓｍｉｔｈらによって記載される一工程法（（１９８８）Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）またはここで説明されるか、もしくは当該技術分野において公知の方法によって実質的に精製することができる。本発明のポリペプチドは、天然または組換え源から、本発明のポリペプチドに対する抗体を用いて、タンパク質精製の技術分野において公知の方法によって精製することもできる。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの部分的精製またはその選択を含む本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの調製も明確に考慮される。これらの粗製調製品は、おそらくは多少の追加精製工程を伴うが断片の完全な精製の前の、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを発現する細胞の濃縮の結果であるものと想定される。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを発現する細胞はペレットの状態で存在し、例えば、それらを溶解するか、または粗製ポリペプチドを凍結乾燥する。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は、長さが、少なくとも６個の連続するアミノ酸から完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドより１アミノ酸少ないものまでのあらゆる整数であり得る。したがって、配列番号１０のポリペプチドについては、ＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は、例えば、６から２９５の間のあらゆる整数の連続アミノ酸であり得る。「整数」という用語はここではその数学的な意味で用いられ、したがって、代表的な整数には、これらに限定されるものではないが、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４および２９５が含まれる。
上記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の各々は、さらに、そのＮ末端およびＣ末端の面から指定することができる。例えば、配列番号１０のあらゆる所定の無傷で連続する完全長ポリペプチド配列上の、配列番号１０の６個の連続するアミノ酸から完全長ポリペプチドより１アミノ酸少ないものまでの断片が占めることができるＮ末端およびＣ末端位置の全ての組合せが本発明に含まれる。したがって、６個の連続するアミノ酸断片は、２９６連続アミノ酸断片の１−６、２−７、３−８、４−９、５−１０、６−１１、７−１２、８−１３、９−１４、１０−１５、１１−１６、１２−１７、１３−１８、１４−１９、１５−２０、１６−２１、１７−２２、１８−２３、１９−２４、２０−２５、２１−２６、２２−２７、２３−２８、２４−２９、２５−３０、２６−３１、２７−３２、２８−３３、２９−３４、３０−３５、３１−３６、３２−３７、３３−３８、３４−３９、３５−４０、３６−４１、３７−４２、３８−４３、３９−４４、４０−４５、４１−４６、４２−４７、４３−４８、４４−４９、４５−５０、４６−５１、４７−５２、４８−５３、４９−５４、５０−５５、５１−５６、５２−５７、５３−５８、５４−５９、５５−６０、５６−６１、５７−６２、５８−６３、５９−６４、６０−６５、６１−６６、６２−６７、６３−６８、６４−６９、６５−７０、６６−７１、６７−７２、６８−７３、６９−７４、７０−７５、７１−７６、７２−７７、７３−７８、７４−７９、７５−８０、７６−８１、７７−８２、７８−８３、７９−８４、８０−８５、８１−８６、８２−８７、８３−８８、８４−８９、８５−９０、８６−９１、８７−９２、８８−９３、８９−９４、９０−９５、９１−９６、９２−９７、９３−９８、９４−９９、９５−１００、９６−１０１、９７−１０２、９８−１０３、９９−１０４、１００−１０５、１０１−１０６、１０２−１０７、１０３−１０８、１０４−１０９、１０５−１１０、１０６−１１１、１０７−１１２、１０８−１１３、１０９−１１４、１１０−１１５、１１１−１１６、１１２−１１７、１１３−１１８、１１４−１１９、１１５−１２０、１１６−１２１、１１７−１２２、１１８−１２３、１１９−１２４、１２０−１２５、１２１−１２６、１２２−１２７、１２３−１２８、１２４−１２９、１２５−１３０、１２６−１３１、１２７−１３２、１２８−１３３、１２９−１３４、１３０−１３５、１３１−１３６、１３２−１３７、１３３−１３８、１３４−１３９、１３５−１４０、１３６−１４１、１３７−１４２、１３８−１４３、１３９−１４４、１４０−１４５、１４１−１４６、１４２−１４７、１４３−１４８、１４４−１４９、１４５−１５０、１４６−１５１、１４７−１５２、１４８−１５３、１４９−１５４、１５０−１５５、１５１−１５６、１５２−１５７、１５３−１５８、１５４−１５９、１５５−１６０、１５６−１６１、１５７−１６２、１５８−１６３、１５９−１６４、１６０−１６５、１６１−１６６、１６２−１６７、１６３−１６８、１６４−１６９、１６５−１７０、１６６−１７１、１６７−１７２、１６８−１７３、１６９−１７４、１７０−１７５、１７１−１７６、１７２−１７７、１７３−１７８、１７４−１７９、１７５−１８０、１７６−１８１、１７７−１８２、１７８−１８３、１７９−１８４、１８０−１８５、１８１−１８６、１８２−１８７、１８３−１８８、１８４−１８９、１８５−１９０、１８６−１９１、１８７−１９２、１８８−１９３、１８９−１９４、１９０−１９５、１９１−１９６、１９２−１９７、１９３−１９８、１９４−１９９、１９５−２００、１９６−２０１、１９７−２０２、１９８−２０３、１９９−２０４、２００−２０５、２０１−２０６、２０２−２０７、２０３−２０８、２０４−２０９、２０５−２１０、２０６−２１１、２０７−２１２、２０８−２１３、２０９−２１４、２１０−２１５、２１１−２１６、２１２−２１７、２１３−２１８、２１４−２１９、２１５−２２０、２１６−２２１、２１７−２２２、２１８−２２３、２１９−２２４、２２０−２２５、２２１−２２６、２２２−２２７、２２３−２２８、２２４−２２９、２２５−２３０、２２６−２３１、２２７−２３２、２２８−２３３、２２９−２３４、２３０−２３５、２３１−２３６、２３２−２３７、２３３−２３８、２３４−２３９、２３５−２４０、２３６−２４１、２３７−２４２、２３８−２４３、２４０−２４５、２４１−２４６、２４２−２４７、２４３−２４８、２４４−２４９、２４５−２５０、２４６−２５１、２４７−２５２、２４８−２５３、２４９−２５４、２５０−２５５、２５１−２５６、２５２−２５７、２５３−２５８、２５４−２５９、２５５−２６０、２５６−２６１、２５７−２６２、２５８−２６３、２５９−２６４、２６０−２６５、２６１−２６６、２６２−２６７、２６３−２６８、２６４−２６９、２６５−２７０、２６６−２７１、２６７−２７２、２６８−２７３、２６９−２７４、２７０−２７５、２７１−２７６、２７２−２７７、２７３−２７８、２７４−２７９、２７５−２８０、２７６−２８１、２７７−２８２、２７８−２８３、２７９−２８４、２８０−２８５、２８１−２８６、２８２−２８７、２８３−２８８、２８４−２８９、２８５−２９０、２８６−２９１、２８７−２９２、２８８−２９３、２８９−２９４、２９０−２９５および２９１−２９６からなる群より選択される位置を占めることができる。２９０個の連続するアミノ酸断片は、１−２９０、２−２９１、３−２９２、４−２９３、５−２９４、６−２９５および７−２９６からなる群より選択される位置を占めることができる。同様に、配列番号１０における６アミノ酸から２９５アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片、配列番号２における６アミノ酸から７０９アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片、配列番号４における６アミノ酸から４７０アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片、配列番号６における６アミノ酸から２００アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片、配列番号８における６アミノ酸から４４５アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片、配列番号１２における６アミノ酸から２０４アミノ酸の間のサイズの他の全ての断片によって占められる位置が本発明に含まれ、かつこれら２つの例に基づいて直ちに思い描くこともでき、したがって、本明細書を不必要に長文化させない目的のみのため、個々に列挙することはしない。さらに、配列番号１０における６から２９５個の間の連続するアミノ酸の断片、配列番号２における６から７０９個の間の連続するアミノ酸の断片、配列番号４における６から４７０個の間のアミノ酸の断片、配列番号６における６から２００個の間のアミノ酸の断片、配列番号８における６から４４５個の間のアミノ酸の断片、配列番号１２における６から２０４個の間のアミノ酸の断片によって占められる位置が本発明に含まれ、かつこれら２つの例に基づいて直ちに思い描くこともでき、したがって、本明細書を不必要に長文化させない目的のみのため、個々に列挙することはしない。加えて、６個の連続するアミノ酸から他のあらゆる完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドより１アミノ酸少ないものまでの断片によって占められる位置もこれら２つの例に基づいて思い描くことができ、したがって、本明細書を不必要に長文化させない目的のみのため、個々に列挙することはしない。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、代わりに、式「ｎからｃ」（包括的）によって記載することができる。ここで、「ｎ」はポリペプチドの（配列表によって定義される）最Ｎ末端アミノ酸位置に等しく、「ｃ」は（配列表によって定義される）最Ｃ末端アミノ酸位置に等しく、さらに、「ｎ」は１から本発明の完全長ポリペプチド配列のアミノ酸数マイナス６までの整数に等しく、「ｃ」は７から完全長ポリペプチド配列のアミノ酸数までの整数に等しく、並びに、「ｎ」は「ｃ」よりも少なくとも６小さい整数である。したがって、配列番号１０に示される配列について、「ｎ」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９または２９０からなるリストから選択されるあらゆる整数であり、かつ「ｃ」は、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９１、２９３、２９４、２９５または２９６からなる群より選択されるあらゆる整数である。「ｎ」および「ｃ」位置の全ての組合せが本発明の具体的な態様として含まれる。さらに、式「ｎ」〜「ｃ」は「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ１−ｃ２」と修正することができ、ここで、「ｎ１−ｎ２」および「ｃ１−ｃ２」は、配列表のアミノ酸位置を表す、上述のあらゆる２つの整数から選択される位置範囲を表す。代替式には、「ｎ１−ｎ２」〜「ｃ」および「ｎ」〜「ｃ１−ｃ２」が含まれる。好ましい態様において、本発明のＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のｎ１＝２４、ｎ２＝１５５、およびｃ＝２９６により、本発明のＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６の式ｎ１＝２８、ｎ２＝７１、およびｃ＝２０１により、並びに本発明のＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２の式ｎ１＝３３、ｎ２＝７２、およびｃ＝２０５により記載することができる。
さらに、配列番号２の６から７１０個の間の連続するアミノ酸のポリペプチド、配列番号４の６から４７１個の間の連続するアミノ酸のポリペプチド、配列番号６の６から２０１個の間の連続するアミノ酸のポリペプチド、配列番号８の６から４４６個の間の連続するアミノ酸のポリペプチド、または配列番号１２の６から２０５個の間の連続するアミノ酸のポリペプチドによって示される位置が本発明に含まれ、かつこれら２つの例に基づいて直ちに思い描くこともでき、したがって、本明細書を不必要に長文化させない目的のみのため、個々に列挙することはしない。加えて、６個の連続するアミノ酸から完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドよりも１アミノ酸少ないものによって占められる位置もこれら２つの例に基づいて思い描くことができ、したがって、本明細書を不必要に長文化させない目的のみのため、個別に列挙することはしない。
これらの具体的な態様、並びにここで説明される他のポリペプチドおよびポリヌクレオチド断片の態様は、「少なくとも」指定されたサイズまたは指定されたＮ末端および／またはＣ末端位置、それに「等しい」、それ「以下」、それ「未満」、「少なくとも＿であるが＿以下」または「＿から＿」であるとして修飾することができる。本発明のあらゆる態様を説明するのに用いられる全ての範囲は、他に具体的に記載されない限り、包括的であることに注意されたい。
本発明には、上述のＮ末端およびＣ末端位置によって指定されるあらゆる個々の断片またはアミノ酸残基のサイズによって指定されるあらゆる断片の排除に対する備えもある。加えて、上述のＮ末端およびＣ末端位置またはアミノ酸残基のサイズによって指定されるあらゆる数の断片を個別の種として排除することができる。さらに、上述のＮ末端およびＣ末端位置またはアミノ酸残基のサイズによって指定されるあらゆる数の断片があらゆる組合せでポリペプチド断片を構築することができ、さらに、任意に、非ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列を含むことができる。
好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は配列番号２のアミノ酸２−７１０、１−２６２、２６３−７１０、１−２６３、２６４−７１０ １−５５２、５５３−７１０、５５４−７１０、５６１−７１０、５６８−７１０、５７５−７１０、５８０−７１０、５８１−７１０、１−２７５または２７６−７１０から選択される。他の好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−７Ｂポリペプチド断片は配列番号４のアミノ酸２−４７１、１−４４２、４４３−４７１、１−４４３、４４４−４７１、１−２６２、２６３−４７１、１−２６３、２６４−４７１、１−２７５または２７６−４７１から選択される。他の好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、４０−２０１、５４−２０１、６６−２０１、７０−２０１、または７１−２０１から選択される。他の好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−９ポリペプチド断片は配列番号８のアミノ酸２５−４４６、２２８−３５６、２２８−３６０、２２８−４３１、２２８−４４６、２３１−３５６、２３１−３６０、２３１−４３１、２３１−４４６、２３３−３５６、２３３−３６０、２３３−４３１、２３３−４４６、２３６−３５６、２３６−３６０、２３６−４３１、２３６−４４６、２４０−３５６、２４０−３６０、２４０−４３１、２４０−４４６、２４１−３５６、２４１−３６０、２４１−４３１、２４１−４４６、２４２−３５６、２４２−３６０、２４２−４３１、または２４２−４４６から選択される。他の好ましい態様において、活性を有するＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、３２−２９６、３９−２９６、５２−２９６、６５−２９６、７１−２９６、７４−２９６、７７−２９６、７８−２９６、８１−２９６、８４−２９６、９０−２９６、９２−２９６、１０２−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他の好ましい態様において、活性を有するＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５、５９−２０５、７１−２０５または７２−２０５から選択される。
より好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−７Ａポリペプチド断片は配列番号２のアミノ酸２−７１０、１−２６２、１−２６３、５５３−７１０、５５４−７１０、５６８−７１０、５７５−７１０または１−２７５から選択される。他のより好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−７Ｂポリペプチド断片は配列番号４のアミノ酸２−４７１、１−４４２、１−４４３、１−２６２、１−２６３、または１−２７５から選択される。他のより好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−８ポリペプチド断片は配列番号６のアミノ酸２８−２０１、５４−２０１または６６−２０１から選択される。他のより好ましい態様において、前記活性を有するＧＭＧ−９ポリペプチド断片は配列番号８のアミノ酸２５−４４６、２２８−３５６、２２８−３６０、２２８−４３１、２２８−４４６、２３１−３５６、２３１−３６０、２３１−４３１、２３１−４４６、２４１−３５６、２４１−３６０、２４１−４３１または２４１−４４６から選択される。他のより好ましい態様において、活性を有するＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は配列番号１０のアミノ酸８−２９６、９−２９６、２４−２９６、５２−２９６、７１−２９６、７４−２９６、８１−２９６、８４−２９６、１１０−２９６、１１１−２９６、１２０−２９６、１３２−２９６、１３５−２９６、１４８−２９６、１５４−２９６または１５５−２９６から選択される。他のより好ましい態様において、活性を有するＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、５３−２０５、５４−２０５または５９−２０５から選択される。
さらに他の好ましい態様において、本発明は、配列番号１０の少なくとも１１５個であるが１７５個以下の連続するアミノ酸を含むＧＭＧ−１０ポリペプチド断片を特徴とし、ここで、前記少なくとも１１５個および１７５個以下の連続するアミノ酸の２４個以下はＧＭＧ−１０のコラーゲン様領域に存在する。好ましくは、このＧＭＧ−１０ポリペプチド断片は、少なくとも１２５個であるが１６５個以下、または少なくとも１４０個であるが１６５個のアミノ酸を含み、かつ２４個以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在し、より好ましくは、少なくとも１２５個であるが１６５個以下、または少なくとも１４０個であるが１６５個以下のアミノ酸を含み、かつ１２個以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在し、または、少なくとも１４０個で１５０個以下のアミノ酸を含み、かつ８個以下のアミノ酸がコラーゲン様領域に存在する。好ましくは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は哺乳動物、好ましくは、ヒトまたはマウスであるが、最も好ましくはヒトである。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片は、修飾ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片を含めて、上述のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の変種、断片、類似体および誘導体を含む。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、修飾ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを含めて、上述のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの変種、断片、類似体および誘導体を含む。
変種
当該技術分野における通常の技術を有する者は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列の幾つかのアミノ酸はそのタンパク質の構造または機能に有意の効果を及ぼすことなく変更できることを認めるであろう。活性を決定する配列内に重要なアミノ酸が存在する。したがって、本発明は、さらに、上述の代謝関連活性を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの変種を含む。そのような変種には、天然突然変異または当該技術分野において公知の一般則に従って活性に対する多少の効果を有するように選択されたヒトの操作のいずれかに由来する、１以上のアミノ酸欠失、挿入、反転、反復、および置換を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列が含まれる。表現型的にサイレントのアミノ酸置換を行う方法に関する指針を以下に示す。
変化に対するアミノ酸配列の寛容を研究するための２つの主要なアプローチが存在する（Ｂｏｗｉｅ等（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７，１３０６−１０参照）。第１の方法は、突然変異を自然選択によって受容または拒絶のいずれかをする評価プロセスに依存する。第２のアプローチは、クローン化遺伝子の特定の位置にアミノ酸変化を導入するのに遺伝子工学を用い、機能性を維持する配列の同定のための選択またはスクリーニングを用いる。
これらの研究は、タンパク質がアミノ酸置換に対して驚くほど寛容であることを明らかにし、どのアミノ酸変化がタンパク質の特定の位置で許容されそうであるかを示している。例えば、最も埋もれたアミノ酸残基は非極性側鎖を必要とし、それに対して表面側鎖の特徴は一般にほとんど保存されない。他のそのような表現型的にサイレントの置換はＢｏｗｉｅら（前記）およびそこで引用される参考文献によって記述されている。
本発明によるポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換の場合、１個もしくは数個のアミノ酸を「等価」アミノ酸で置換することができる。「等価」アミノ酸という表現は、ここでは、そのポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が実質的に変化しないことをペプチド化学の分野における通常の技術を有する者が期待できるように、類似の特性を有するアミノ酸のうちの１つの代わりに用いることができるあらゆるアミノ酸を指すのに用いられる。
具体的な態様において、好ましい置換の表題の下に関心保存置換が表１に示される。そのような置換が生物学的活性の変化を生じる場合、表１において例示的置換と称され、またはアミノ酸のクラスに関して以下にさらに説明される、より実質的な置換を導入し、その生成物をスクリーニングする。
Figure 2005530479
 ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの機能または免疫学的同一性における実質的な修飾は、（ａ）置換の領域における、例えば、シートもしくはらせん立体配座としてのポリペプチド主鎖の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の塊の維持に対するそれらの効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けられる。
（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５）側鎖の方向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ
（６）芳香性：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存性置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーの別のクラスへの交換を生じる。そのような置換残基を保存置換部位、または、より好ましくは、残りの（非保存）部位に導入することもできる。
変異は当該技術分野において公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド介在（部位特異的）突然変異生成、アラニン走査、およびＰＣＲ突然変異生成を用いて作製することができる。部位特異的突然変異生成［Ｃａｒｔｅｒ等、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１３：４３３１（１９８６）；Ｚｏｌｌｅｒ等、Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１０：６４８７（１９８７）］、カセット突然変異生成［Ｗｅｌｌｓ等、Ｇｅｎｅ，３４：３１５（１９８５）］、制限選択突然変異生成［Ｗｅｌｌｓ等、Ｐｈｉｌｏｓ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄｏｎ ＳｅｒＡ，３１７：４１５（１９８６）］または他の公知の技術をクローン化ＤＮＡに対して行い、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１変種ＤＮＡを生成させることができる。
走査アミノ酸分析も連続配列に沿う１以上のアミノ酸の同定に用いることができる。特に、好ましい走査アミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。そのようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン、およびシステインが含まれる。アラニンがこの群のうちで典型的に好ましい走査アミノ酸であり、これは、それがベータ炭素以外の側鎖を排除し、かつその変種の主鎖立体配座を変更することが少ないものと思われるためである［Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ ａｎｄ Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９）］。また、アラニンは、それが最も一般的なアミノ酸であるため、典型的に好ましい。さらに、それは埋没および露出位置の両方において頻繁に見出される［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１５０：１（１９７６）］。アラニン置換が適切な量の変種を生じない場合、アイソテリック（ｉｓｏｔｅｒｉｃ）アミノ酸を用いることができる。
機能に必須である本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列内のアミノ酸は当該技術分野において公知の方法、例えば、部位特異的突然変異生成またはアラニン走査突然変異生成によって同定することもできる（例えば、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ等（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４４：１０８１−５参照）。後者の手順は分子中の全ての残基で単一アラニン突然変異を導入する。その後、生じる突然変異分子を、上述のアッセイを用いて代謝関連活性について試験する。非常に望ましい改善された特徴、例えば凝集の少なさ、を備えるタンパク質を生成し得る、荷電アミノ酸の他の荷電または中性アミノ酸での置換が特に関心のあるものである。凝集は活性を低下させるだけではなく、凝集体が免疫原性であり得るため、薬学的または生理学的に許容し得る処方を調製するときに問題となり得る（例えば、Ｐｉｎｃｋａｒｄ等（１９６７）Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：３３１−３４０；Ｒｏｂｂｉｎｓ等（１９８７）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３６：８３８−４１；およびＣｌｅｌａｎｄ等（１９９３）Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ １０：３０７−７７参照）。
したがって、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの断片、誘導体、類似体、または相同体は、例えば、（ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が保存もしくは非保存アミノ酸残基（好ましくは、保存アミノ酸残基）で置換され、そのような置換アミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい（すなわち、非天然アミノ酸であり得る）もの、または（ｉｉ）１以上のアミノ酸残基が置換基を有するもの、または（ｉｉｉ）ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドが別の化合物、例えば、その断片の半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が上記形態の断片、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ融合領域ペプチドもしくはリーダーもしくは分泌配列または上記形態の断片もしくはプロタンパク質配列の精製に用いられる配列と融合しているものであり得る。そのような断片、誘導体および類似体は、ここの教示から、当該技術分野における熟練者の範囲内にあるものと判断される。
本発明のさらなる態様は、少なくとも１つの保存アミノ酸置換であるが、５０以下の保存アミノ酸置換、４０以下の保存アミノ酸置換、３０以下の保存アミノ酸置換、および２０以下の保存アミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのアミノ酸配列を含むポリペプチドに関する。少なくとも１つであるが１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１以下の保存アミノ酸置換を有する、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１断片のアミノ酸配列を含むポリペプチドも提供される。
加えて、アミノ酸は身体内部でＬまたはＤのいずれかのキラリティを有する。幾つかの態様においては、身体内部での半減期を延ばすため、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片内のアミノ酸のキラリティを変更することが好ましい。したがって、幾つかの態様においては、１個以上のアミノ酸が好ましくはＬ配置である。他の態様においては、１個以上のアミノ酸が好ましくはＤ配置である。
同一性パーセント
本発明のポリペプチドは、上述のように、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと少なくとも５０％同一、少なくとも６０％同一、または７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドもまた含む。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドアミノ酸配列と、少なくとも、例えば、９５％「同一」であるアミノ酸配列を有するポリペプチドが意味するところは、そのアミノ酸配列が、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドアミノ酸配列の各１００アミノ酸当たり５個までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列と同一であることである。参照配列は、配列番号２、４、６、８、１０、または１２に示される配列に相当する配列を有するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドである。したがって、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るために、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド配列と比較して、その配列中のアミノ酸残基の５％まで（１００のうちの５）を挿入、欠失、または別のアミノ酸で置換することができる。これらの変更はアミノもしくはカルボキシ末端またはそれらの末端位置の間のどこでも、その配列またはその配列内の１以上の連続する基のいずれかの個別の残基に散在させることができる。
実際上の問題として、あらゆる特定のポリペプチドがＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドとパーセンテージ同一であるかどうかは公知のコンピュータプログラムを用いて慣習的に決定することができる。そのようなアルゴリズムおよびプログラムには、決してこれらに限定されるものではないが、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡ、およびＣＬＵＳＴＡＬＷが含まれる（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５：２４４４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５：４０３−４１０；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２（２）：４６７３−４６８０；Ｈｉｇｇｉｎｓ等（１９９６）Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２６６：３８３−４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２５：３３８９−３４０２；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）。特に好ましい態様においては、タンパク質および核酸配列相同性を、当該技術分野において公知であるＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（「ＢＬＡＳＴ」）を用いて評価する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：２２６４−８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ等、１９９０，１９９３，１９９７，全て前出を参照）。特には、５つの具体的なＢＬＡＳＴプログラムが以下の作業の実施に用いられる。
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３はアミノ酸照会配列をタンパク質配列データベースと比較する。
（２）ＢＬＡＳＴＮはヌクレオチド照会配列をヌクレオチド配列データベースと比較する。
（３）ＢＬＡＳＴＸは照会ヌクレオチド配列（両鎖）の６フレーム概念的翻訳産生物をタンパク質配列データベースと比較する。
（４）ＴＢＬＡＳＴＮは照会タンパク質配列を全ての６リーディングフレームにおいて翻訳されたヌクレオチド配列データベース（両鎖）と比較する。
（５）ＴＢＬＡＳＴＸはヌクレオチド照会配列の６フレーム翻訳をヌクレオチド配列データベースの６フレーム翻訳と比較する。
これらのＢＬＡＳＴプログラムは、ここで「高得点セグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを照会アミノ酸もしくは核酸配列と好ましくはタンパク質もしくは核酸配列データベースから得られる試験配列との間で同定することにより、相同配列を同定する。高得点セグメント対は、好ましくは、その多くが当該技術分野において公知である得点行列によって同定される（すなわち、整列化される）。好ましくは、用いられる得点行列はＢＬＯＳＵＭ６２行列である（Ｇｏｎｎｅｔ等（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−５；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１参照）。好ましさには劣るが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０行列を用いることもできる（例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ， ｅｄｓ，（１９７８）Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ；Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照）。ＢＬＡＳＴプログラムは同定された全ての高得点セグメント対の統計的有意性を評価し、好ましくは、優位性のユーザー指定閾値、例えば、ユーザー指定相同パーセントを満たすセグメントを選択する。好ましくは、高得点セグメントの統計的有意性は、Ｋａｒｌｉｎの統計的有意性式を用いて評価する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，（１９９０）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８７：２２６４−８を参照）。ＢＬＡＳＴプログラムはデフォルトパラメータまたはユーザーによって与えられる修正パラメータで用いることができる。好ましくは、パラメータはデフォルトパラメータである。
照会配列（本発明の配列）とグローバル配列整列とも呼ばれる対象配列との最良の全体一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ等、（１９９０）Ｃｏｍｐ Ａｐｐ Ｂｉｏｓｃｉ ６：２３７−２４５のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列整列においては、照会配列と対象配列の両方がアミノ酸配列である。前記グローバル配列整列の結果は同一パーセント表示である。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸整列において用いられる好ましいパラメータは：Ｍａｔｒｉｘ＝ＰＡＭ ０、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝２、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝２０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ＝２５、Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝配列長、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝２４７または対象アミノ酸配列の長さの小さい方。
対象配列が内部欠失のためではなくＮまたはＣ末端欠失のために照会配列よりも短い場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムはグローバル同一パーセントを算出するときに対象配列のＮおよびＣ末端切り詰めを考慮しないため、同一パーセントでの結果を手動で修正しなくてはならない。照会配列に対してＮおよびＣ末端で切り詰められている対象配列については、対象配列のＮおよびＣ末端であって対応する対象残基と一致／整列しない照会配列の残基数を照会配列の総塩基のパーセントとして算出することにより、同一パーセントを修正する。残基が一致／整列するかどうかはＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定する。次に、このパーセンテージを、指定されたパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出された同一性パーセントから減じ、最終同一性パーセント評点に到達する。この最終同一性パーセント評点が本発明の目的に用いられるものである。照会配列と一致／整列しない対象配列のＮおよびＣ末端に対する残基のみが同一性パーセント評点を手動調整する目的で考慮される。すなわち、対象配列の最ＮおよびＣ末端残基の外側の照会アミノ酸残基のみ。
例えば、９０アミノ酸残基対象配列を１００残基照会配列と整列させて同一性パーセントを決定する。対象配列のＮ末端で欠失が生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢ整列はＮ末端の第１残基と一致／整列しない。１０個の非対残基は配列の１０％を表し（一致しないＮおよびＣ末端の残基数／照会配列中の残基の総数）、それ故、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出された同一性パーセント評点から１０％を減じる。残りの９０残基が完全に一致した場合、最終同一性パーセントは９０％である。
別の例において、９０残基対象配列を１００残基照会配列と比較する。今回は欠失が内部であり、それ故、対象配列のＮまたはＣ末端に照会と一致／整列しない残基は存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出された同一性パーセントを手動で修正することはしない。今一度、照会配列と一致／整列しない、ＦＡＳＴＤＢ整列における表示で対象配列のＮおよびＣ末端の外側の残基位置のみを手動で修正する。他の手動修正は本発明の目的のためには行わない。
産生
この開示を通して、どこでＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドが論じられようとも、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１断片、変種および誘導体がＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの好ましいサブセットとして含まれることが明確に意図されていることに注意すること。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、好ましくは、ヒトもしくは哺乳動物組織試料から単離し、またはヒトもしくは哺乳動物遺伝子からヒトもしくは哺乳動物細胞において発現させる。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは当該技術分野において公知の日常的な発現方法を用いて作製することができる。所望のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをあらゆる好都合な宿主に適する発現ベクターにライゲートする。真核生物および原核生物宿主系の両方を組換えポリペプチドの形成において用いる。次に、そのポリペプチドを溶解した細胞または培養培地から単離し、その目的とする用途に必要な程度まで精製する。精製は当該技術分野において公知のあらゆる技術、例えば、示差抽出、塩分画、クロマトグラフィー、遠心分離等による。例えば、様々なタンパク質精製方法について、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙを参照のこと。
代わりの態様において、本発明のポリペプチドはミルクから単離される。これらのポリペプチドは完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドとして精製することができ、適切であるならば、次にこれらをインビトロで開裂してＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片を生成することができ、または、代わりとして、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片自体をミルクから精製することができる。多数の方法のうちのいずれをもミルクからの本発明のポリペプチドの精製に用いることができ、これには、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｎｅｗ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｓｉｍｏｎ Ｒｏｅ，ＡＥＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｒｗｅｌｌ；Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０；Ｗｉｌｋｉｎｓ ａｎｄ Ｖｅｌａｎｄｅｒ（１９９２）４９：３３３−８；米国特許第６，１４０，５５２号；第６，０２５，５４０号；Ｈｅｎｎｉｇｈａｕｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１，ｐｐ．３−８（１９９０）；Ｈａｒｒｉｓ等（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ７：３１−７；Ｄｅｇｅｎｅｒ等（１９９８）Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ ７９９：１２５−３７；Ｗｉｌｋｉｎｓ（１９９３）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．０（１７ ｐａｒｔ Ａ）：３９（これらの各々の開示全体は参照することによりここに組み込まれる）において教示されるものが含まれる。典型的な態様においては、ミルクを、例えば比較的低速で、遠心分離して脂質画分を分離し、次に水性上清をより高速で遠心分離して残留「乳精」画分からミルク中のカゼインを分離する。しばしば、生医学的タンパク質がこの乳精画分中に見出され、標準クロマトグラフィーまたはタンパク質精製に一般に用いられる他の手順、例えば、本願の他所で説明されるものを用いてこの画分から単離することができる。好ましい態様の１つにおいては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドに特異的な抗体を用いて、例えば、アフィニティクロマトグラフィーを用いてＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドを精製する。加えて、特定のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片を単離するのに方法、例えば、電気泳動的な、または特定のサイズのタンパク質を単離するための他の方法を用いることができる。これらの方法を用いて単離するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドが哺乳動物のミルク中に天然に存在することが発見されているため、天然のものであり得、または、以下で説明されるように、非ヒト哺乳動物の乳腺におけるタンパク質の組換え産生の結果であってもよい。そのような態様の１つにおいては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１を異種抗原性ポリペプチド配列との誘導タンパク質として産生し、その抗原性配列を、例えば標準イムノアフィニティ方法論を用いる、タンパク質の精製に用いることができる。
加えて、化学合成によってより短いタンパク質断片を生成させることができる。代わりとして、本発明のタンパク質はヒトまたは非ヒト動物の細胞または組織から抽出する。タンパク質を精製するための方法は当該技術分野において公知であり、粒子の破壊への洗浄剤またはカオトロピック剤の使用とそれに続く示差抽出並びにイオン交換クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、密度による沈降、およびゲル電気泳動によるポリペプチドの分離が含まれる。
配列番号１、３、５、７、９または１１におけるものを含むいずれのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−ｃＤＮＡもＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの発現に用いることができる。発現させようとするＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１をコードする核酸は、発現ベクターにおいて、通常のクローニング技術を用いて、プロモーターに作動可能に連結させる。発現ベクター内のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ｃＤＮＡインサートは：完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド（後に修飾される）、６アミノ酸から完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドより小さいあらゆる整数まで、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片、または変種および％類似ポリペプチドのコーディング配列を含むことができる。
発現ベクターは当該技術分野において公知の哺乳動物、酵母、昆虫または細菌発現系のいずれかであり、それらのうちの幾つかがここで説明されている。商業的に入手可能なベクターおよび発現系が、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含む様々な供給者から入手可能である。所望であれば、発現を増強し、かつ適切なタンパク質の折り畳みを促進するため、Ｈａｔｆｉｅｌｄら、米国特許第５，０８２，７６７号（その開示は参照することによりそれら全体がここに組み込まれる）によって説明されるように、配列のコドンコンテキストおよびコドン対形成を、発現ベクターを導入する発現生物について最適化することができる。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのいずれか１つをコードする核酸が開始部位の役割を果たすメチオニンを欠く場合、通常の技術を用いて開始メチオニンを核酸の第１コドンの隣に導入することができる。同様に、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドｃＤＮＡに由来するインサートがポリＡシグナルを欠く場合、例えば、ＢａｌＩおよびＳａｌＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素を用いてｐＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からポリＡシグナルをスプライスし、それを哺乳動物発現ベクターｐＸＴ１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に組み込むことにより、この配列を構築体に追加することができる。ｐＸＴ１はＬＴＲおよびモロニーネズミ白血病ウイルスに由来するｇａｇ遺伝子の一部を含む。構築体におけるＬＴＲの位置は効率的で安定な形質移入を可能にする。このベクターは単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーターおよび選択可能なネオマイシン遺伝子を含む。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１をコードする核酸は、ＰＣＲにより、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ヌクレオチド配列を含むベクターから、所望のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ｃＤＮＡに相補的であり、かつ５’プライマーに組み込まれたＰｓｔＩおよび対応するｃＤＮＡ３’プライマーの５’末端のＢｇｌＩＩの制限エンドヌクレアーゼ配列を含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１をコードする配列がポリＡシグナルに対して適正に位置することを保証するように注意を払うことで得ることができる。生じるＰＣＲ反応から得られる精製ポリヌクレオチドをＰｓｔＩで消化し、エンドヌクレアーゼで末端平滑化し、ＢｇｌＩＩで消化し、精製し、および今やポリＡシグナルを含み、かつＢｇｌＩＩで消化したｐＸＴ１にライゲートする。
マウスＮＩＨ３Ｔ３細胞へのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１発現ベクターの形質移入が宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入の一態様である。ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの宿主細胞への導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン介在形質移入、カチオン性脂質介在形質移入、エレクトロポレーション、形質導入、感染、または他の方法によって達成することができる。そのような方法は多くの標準実験マニュアル、例えば、Ｄａｖｉｓら（（１９８６）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）に記載されている。本発明のポリペプチドは、組換えベクターを欠く宿主細胞によって実際に発現させることができることが特に考慮される。
本発明のポリペプチドは、組換え細胞培養物から、硫酸アンモニウムもしくはエタノール沈殿、酸抽出、アニオンもしくはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む公知の方法によって回収および精製することができる。最も好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）を精製に用いる。本発明のポリペプチド、好ましくは、分泌形態は、直接単離されたものであろうと培養されたものであろうと、体液、組織および細胞を含む天然資源から精製した生成物、化学合成手順の生成物、並びに、例えば細菌、酵母、高等植物、昆虫、および哺乳動物細胞を含む、原核生物もしくは真核生物宿主から組換え技術によって産生された産生物から回収することもできる。
組換え産生手順において用いられる宿主に依存して、本発明のポリペプチドはグリコシル化されていても、または非グリコシル化であってもよい。好ましくは、本発明のポリペプチドは非グリコシル化である。加えて、本発明のポリペプチドは、幾つかの場合には宿主介在プロセスの結果として、開始修飾メチオニン残基を含むこともできる。したがって、一般に翻訳開始コドンによってコードされるＮ末端メチオニンが、全ての真核生物細胞における翻訳の後には、あらゆるタンパク質から高い効率で除去されることは当該技術分野において公知である。ほとんどのタンパク質のＮ末端メチオニンはほとんどの原核生物においても効率的に除去されるが、幾つかタンパク質については、Ｎ末端メチオニンが共有結合するアミノ酸の性質に依存して、この原核生物除去プロセスは非効率である。
ここで論じられるベクター構築体を含む宿主細胞を包含することに加えて、本発明は、内在性遺伝物質（例えば、コーディング配列）を欠失もしくは置換するように、および／または本発明のポリヌクレオチドと作動可能に会合し、かつ内在性ポリヌクレオチドを活性化、変更、および／または増強する遺伝物質（例えば、異種ポリヌクレオチド配列）を含むように加工されている脊椎動物起源、特には、哺乳動物起源の一次、二次、および不死化宿主細胞をも包含する。例えば、当該技術分野において公知の技術を用いて、相同組換えにより異種制御領域（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー）および内在性ポリヌクレオチド配列を作動可能に会合させることができる。例えば、１９９７年６月２４日発行の米国特許第５，６４１，６７０号；１９９６年９月２６日公開の国際公開ＷＯ９６／２９４１１；１９９４年８月４日公開の国際公開ＷＯ９４／１２６５０；Ｋｏｌｌｅｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：８９３２−５；Ｋｏｌｌｅｒ等（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：８９２７−３１；およびＺｉｊｌｓｔｒａ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５−８（これらの各々の開示は参照することによりそれら全体が組み込まれる）を参照のこと。
修飾
加えて、本発明のポリペプチドは、当該技術分野において公知の技術を用いて化学的に合成することができる（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，１９８３ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；およびＨｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ等（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：１０５−１１参照）。例えば、ペプチドシンセサイザを用いることにより本発明の比較的短い断片を合成することができる。さらに、所望であるならば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸類似体を置換または付加としてこの断片配列に導入することができる。非古典的アミノ酸には、これらに限定されるものではないが、一般アミノ酸のＤ異性体、２，４−ジアミノ酪酸、ａ−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、ｇ−Ａｂｕ、ｅ−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ｂ−アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、ｂ−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、Ｎａ−メチルアミノ酸、および一般的なアミノ酸類似体が含まれる。さらに、アミノ酸はＤ（右旋性）またはＬ（左旋性）であり得る。
本発明は、翻訳の間またはその後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、ホスホリル化、アミド化、公知の保護／防御基による誘導体化、タンパク分解性開裂、抗体分子もしくは他の細胞性リガンドへの連結等によって差別的に修飾されているポリペプチドを包含する。多数の化学的修飾のいずれをも、臭化シアン、トリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、ＮａＢＨ4による特異的化学的開裂、アセチル化、ホルミル化、酸化、還元、ツニカマイシンの存在下での代謝性合成等を含むがこれらに限定されるものではない公知技術によって行うことができる。
本発明によって包含されるさらなる翻訳後修飾には、例えば、Ｎ−連結もしくはＯ−連結炭水化物鎖、Ｎ末端もしくはＣ末端の処理、アミノ酸主鎖への化学的部分の付加、Ｎ−連結もしくはＣ−連結炭水化物鎖の化学的修飾、および原核生物宿主細胞発現の結果としてのＮ末端メチオニン残基の付加もしくは欠失が含まれる。ポリペプチドは、検出可能なラベル、例えば、酵素、蛍光、同位体もしくはアフィニティラベルで修飾してそのポリペプチドの検出および単離を可能にすることもできる。
さらなる利点、例えば、ポリペプチドの溶解度、安定性および循環時間の増加をもたらす本発明のポリペプチドの化学的修飾誘導体も本発明によって提供される。米国特許第４，１７９，３３７号を参照のこと。誘導体化のための化学的部分は水溶性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、エチレングリコール／プロピレングリコール共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール等から選択することができる。ポリペプチドは、分子内の無作為の位置で、または分子内の予め決定された位置で修飾することができ、かつ１、２、３もしくはそれ以上の付加化学的部分を含んでいてもよい。
ポリマーはいかなる分子量のものであってもよく、分岐であっても非分岐であってもよい。ポリエチレングリコールについては、好ましい分子量は、取り扱いおよび製造を容易にするため、約１ｋＤａから約１００ｋＤａ（「約」という用語は、ポリエチレングリコールの調製において、述べられた分子量よりも幾つかの分子は重く、幾つかは軽いことを示す）である。所望の治療プロフィール（例えば、所望の徐放持続時間、生物学的活性に対するものがあるのであればその効果、取り扱いの容易さ、抗原性の程度もしくは欠如、および治療用タンパク質もしくは類似体に対するポリエチレングリコールの他の公知の効果）に依存して、他のサイズを用いることができる。
ポリエチレングリコール分子（または他の化学的部分）は、ポリペプチドの機能的または抗原性ドメインに対する効果を考慮しながらポリペプチドに付加するべきである。当該技術分野における熟練者が利用可能な幾つかの付加方法、例えば、ＥＰ ０ ４０１ ３８４（参照することによりここに組み込まれる）（Ｇ−ＣＳＦへのＰＥＧのカップリング）が存在する。塩化トレシルを用いるＧＭ−ＣＳＦのペギル化を報告するＭａｌｉｋ等（１９９２）Ｅｘｐ Ｈｅｍａｔｏｌ（８）：１０２８−３５も参照のこと。例えば、ポリエチレングリコールはアミノ酸残基により、反応性基、例えば、遊離アミノもしくはカルボキシル基を介して共有結合させることができる。反応性基は活性化ポリエチレングリコール分子が結合し得るものである。遊離アミノ基を有するアミノ酸残基はリジン残基およびＮ末端アミノ酸残基を含み得る。遊離カルボキシル基を有するものはアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基およびＣ末端アミノ酸残基を含み得る。スルフィドリル基をポリエチレングリコール分子の結合のための反応性基として用いることもできる。治療の目的で好ましいものはアミノ基での結合、例えば、Ｎ末端またはリジン基での結合である。
Ｎ末端が化学的に修飾されたタンパク質を特に望むことができる。ポリエチレングリコールを本発明の組成物の説明として用いて、様々なポリエチレングリコール分子（分子量、分岐等により）、反応混合物におけるポリエチレングリコール分子のタンパク質（ポリペプチド）分子に対する割合、実施しようとするペギル化反応のタイプ、および選択されたＮ末端ペギル化タンパク質を得る方法から選択することができる。Ｎ末端ペギル化調製品を得る（すなわち、必要であれば、この部分を他のモノペギル化部分から分離する）方法は、ペギル化タンパク質分子の集団からのＮ末端ペギル化物質の精製によるものであり得る。Ｎ末端が化学的に修飾された選択性タンパク質は還元性アルキル化によって達成することができ、これは、特定のタンパク質における誘導体化に利用可能な、異なるタイプの一級アミノ基の差別的反応性（リジン対Ｎ末端）を利用する。適切な反応条件の下で、カルボニル基含有ポリマーを用いるＮ末端での、実質的に選択的なタンパク質の誘導体化を達成する。
多量体
本発明のポリペプチドは単量体または多量体（すなわち、二量体、三量体、四量体およびより高次の多量体）の形態であり得る。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの単量体および多量体、それらの調製、並びにそれらを含有する組成物（好ましくは、薬学的または生理学的に許容し得る組成物）に関する。具体的な態様において、本発明のポリペプチドは単量体、二量体、三量体または四量体である。さらなる態様において、本発明の多量体は少なくとも二量体、少なくとも三量体、または少なくとも四量体である。
本発明によって包含される多量体はホモマーであってもヘテロマーであってもよい。ここで用いられる場合、ホモマーという用語は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドに対応するポリペプチド（ここで説明されるポリペプチド断片、変種、スプライス変種、およびこれらのポリペプチド断片に対応する融合タンパク質を含む）のみを含む多量体を指す。これらのホモマーは、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含むことができる。具体的な態様において、本発明のホモマーは同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドのみを含む多量体である。別の具体的な態様においては、本発明のホモマーは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチド断片を含む多量体である。具体的な態様において、本発明の多量体はホモ二量体（例えば、同一または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）またはホモ三量体（例えば、同一および／または異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む）である。さらなる態様においては、本発明のホモマー性多量体は少なくともホモ二量体、少なくともホモ三量体、または少なくともホモ四量体である。
ここで用いられる場合、ヘテロマーという用語は、本発明のポリペプチドに加えて１つ以上の異種ポリペプチド（すなわち、異なるタンパク質またはそれらのポリペプチドに対応する）を含む多量体を指す。具体的な態様において、本発明の多量体はヘテロ二量体、ヘテロ三量体、またはヘテロ四量体である。さらなる態様においては、本発明のヘテロマー性多量体は少なくともヘテロ二量体、少なくともヘテロ三量体、または少なくともヘテロ四量体である。
本発明の多量体は疎水性、親水性、イオン性、および／または共有結合の結果であり得、および／または、例えばリポソーム形成による、間接的な連結であり得る。したがって、一態様において、本発明の多量体、例えば、ホモ二量体またはホモ三量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で互いに接触するときに形成される。別の態様において、本発明のヘテロ多量体、例えば、ヘテロ三量体またはヘテロ四量体は、本発明のポリペプチドが溶液中で本発明のポリペプチドに対する抗体（本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチド配列に対する抗体を含む）と接触するときに形成される。他の態様においては、本発明の多量体は本発明のポリペプチドとの、および／またはその間での共有結合によって形成される。そのような共有結合には、（例えば、配列表に引用されているか、または寄託されたクローンによってコードされるポリペプチドに含まれる）ポリペプチド配列に含まれる１つ以上のアミノ酸残基が関与し得る。ある場合においては、共有結合は、天然（すなわち、自然界に存在する）ポリペプチド内で相互作用する、ポリペプチド配列内に位置するシステイン残基間の架橋である。別の場合には、共有結合は化学的または組換え操作の結果である。代わりとして、そのような共有結合には、本発明の融合タンパク質中の異種ポリペプチドに含まれる１つ以上のアミノ酸残基が関与し得る。
一例において、共有結合は本発明の融合タンパク質に含まれる異種配列の間でのものである（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照）。特定の例において、共有結合は、（ここで説明される）本発明のＦｃ融合タンパク質に含まれる異種配列の間でのものである。別の特定の例においては、本発明の融合タンパク質の共有結合は、共有結合多量体を形成することが可能である別のタンパク質に由来する異種ポリペプチド配列、例えば、オセテオプロテゲリンの間でのものである（例えば、国際公開ＷＯ９８／４９３０５を参照。その内容は参照することによりその全体がここに組み込まれる）。別の態様においては、本発明の２つ以上のポリペプチドがペプチドリンカーを介して結合する。例には、米国特許第５，０７３，６２７号（参照することによりここに組み込まれる）に記載されるペプチドリンカーが含まれる。ペプチドリンカーによって分離される複数の本発明のポリペプチドを含むタンパク質は、通常の組換えＤＮＡ技術を用いて生成することができる。
本発明の多量体ポリペプチドを調製するための別の方法は、ロイシンジッパーまたはイソロイシンジッパーポリペプチド配列に融合した本発明のポリペプチドの使用を含む。ロイシンジッパーおよびイソロイシンジッパードメインは、それらが見出されるタンパク質の多量体化を促進するポリペプチドである。ロイシンジッパーは元来幾つかのＤＮＡ結合性タンパク質において同定され、それ以来様々な異なるタンパク質において見いだされている（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ等（１９８８）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ ２：７８６−８００）。公知のロイシンジッパーのうちには二量体化または三量体化する天然ペプチドおよびそれらの誘導体がある。本発明の可溶性多量体タンパク質を生成するに適するロイシンジッパードメインの例は、ＰＣＴ出願ＷＯ９４／１０３０８（参照することによりここに組み込まれる）に記載されるものである。溶液中で二量体化または三量体化するポリペプチド配列に融合する本発明のポリペプチドを含む組換え融合タンパク質を適切な宿主細胞において発現させ、当該技術分野において公知の技術を用いて生じる可溶性多量体融合タンパク質を培養上清から回収する。
本発明の三量体ポリペプチドは強化された生物学的活性の利点を提供し得る。好ましいロイシンジッパー部分およびイソロイシン部分は三量体を優先的に形成するものである。一例は、Ｈｏｐｐｅ等、ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ（１９９４）３４４：１９１−５および米国特許出願第０８／４４６，９２２号（参照することによりここに組み込まれる）に記載される、肺表面活性物質プロテインＤ（ＳＰＤ）から誘導されるロイシンジッパーである。天然三量体性タンパク質から誘導される他のペプチドを本発明の三量体性ポリペプチドの調製において用いることができる。別の例においては、本発明のタンパク質を、Ｆｌａｇ（登録商標）ポリペプチド配列を含有する本発明の融合タンパク質に含まれるＦｌａｇ（登録商標）およびポリペプチド配列の間の相互作用によって会合させる。さらなる態様においては、本発明のタンパク質を、本発明のＦｌａｇ（登録商標）融合タンパク質に含まれる異種ポリペプチド配列および抗Ｆｌａｇ（登録商標）抗体の間の相互作用によって会合させる。
本発明の多量体は当該技術分野において公知の化学的技術を用いて生成させることができる。例えば、本発明の多量体に含めることを望むポリペプチドを、当該技術分野において公知のリンカー分子およびリンカー分子長最適化技術を用いて化学的に架橋させることができる（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。加えて、本発明の多量体は、その多量体に含めることを望むポリペプチドの配列内に位置するシステイン残基の間に１つ以上の分子間架橋を形成する、当該技術分野において公知の技術を用いて生成させることができる（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。さらに、本発明のポリペプチドを、そのポリペプチドのＣ末端またはＮ末端にシステインまたはビオチンを付加して定型的に修飾することができ、かつ当該技術分野において公知の技術を適用してこれらの修飾ポリペプチドの１つ以上を含有する多様体を生成させることができる（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。さらに、少なくとも３０の当該技術分野において公知の技術を、本発明の多量体に含めることを望むポリペプチド成分を含有するリポソームの生成に適用することができる（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。
代わりとして、本発明の多量体は当該技術分野において公知の遺伝子工学技術を用いて生成させることができる。一態様においては、本発明の多量体に含まれるポリペプチドを、ここで説明される融合タンパク質技術または当該技術分野において公知の他の方法を用いて組換え的に生成する（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号を参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。特定の態様においては、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を、リンカーポリペプチドをコードする配列にライゲートした後、さらにポリペプチドの翻訳産生物を元のＣ末端からＮ末端への逆の方向にコードする合成ポリヌクレオチド（リーダー配列を欠く）にライゲートすることにより、本発明のホモ二量体をコードするポリヌクレオチドを生成する（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。別の態様においては、ここで説明される組換え技術または当該技術分野において公知の他の方法を適用して、膜貫通ドメイン（または疎水性もしくはシグナルペプチド）を含み、かつ膜再構成技術によってリポソーム内に組み込むことができる本発明の組換えポリペプチドを産生させる（例えば、米国特許第５，４７８，９２５号参照。これは参照することによりその全体がここに組み込まれる）。
ＩＩ．本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド
好ましいポリヌクレオチドは本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするものである。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチドは様々な方法で用いることができ、これには、これらに限定されるものではないが、その活性のアンタゴニストおよびアゴニストについてのスクリーニングアッセイにおいて用いる他に、その活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングアッセイ、診断スクリーニング、および抗体の産生に加えて、代謝関連疾患および障害の治療および／または予防および／または体重の減少を含むがこれらに限定されるものではない様々な方法で用いるためのその精製を容易にする、組換え細胞におけるポリペプチドの発現が含まれる。
本発明は、ここで説明される、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよびそれらの変種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。これらのポリヌクレオチドは、精製されていても、単離されていても、および／または組換体であってもよい。全ての場合において、本発明の望ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドは、ここで説明および考慮される、代謝関連活性を有する本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするものである。
断片
ポリヌクレオチド断片は、全体として、完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは指定されたＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドヌクレオチド配列の、全てではなく、部分として同じである配列を有するポリヌクレオチドである。そのような断片は「フリースタンディング」、すなわち、他のポリヌクレオチドの一部であったりそれに融合したりしないものであり得、またはそれらが一部もしくは領域を形成する別の非ＧＭＧ−７Ａ、−ＧＭＧ−７Ｂ、−ＧＭＧ−８、−ＧＭＧ−９、−ＧＭＧ−１０、または−ＧＭＧ−１１（異種）ポリヌクレオチド内に含まれていてもよい。しかしながら、幾つかのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド断片は単一のポリヌクレオチド内に含まれ得る。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドは、１８個の連続する塩基から無傷のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする完全長ポリヌクレオチド配列まで、例えば、配列番号１、３、５、７、９、または１１における完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドポリヌクレオチド配列を含む。この態様の一局面においては、ポリヌクレオチドは、本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１１、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７４０、７７０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２４２、１２５０、１３００、１３３８、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６３０、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０、または２２５７個の連続するヌクレオチドを含む。
上述の好ましい核酸サイズに加えて、さらなる好ましい核酸は少なくとも１８個のヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８と、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１またはここでの他所に記載される無傷のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドｃＤＮＡの最３’ヌクレオチド位置を表す整数との間のあらゆる整数と定義される。
本発明の好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、それらの５’および３’位置に関してさらに指定されている、上述のように長さが少なくとも１８ヌクレオチドの核酸断片である。５’および３’位置は、下記配列表に記載される位置番号によって表される。対立遺伝子および分解並びに他の変種については、位置１はＯＲＦの最５’ヌクレオチドと定義され、すなわち、開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は残りのヌクレオチドと共に連続的に番号付けされる。したがって、長さが少なくとも１８個の連続するヌクレオチドであるポリヌクレオチド断片が本発明のポリペプチドをコードする無傷のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド上で占めることができる５’および３’ヌクレオチド位置の全ての組合せが個別の種として本発明に含まれる。５’および３’位置によって指定されるポリヌクレオチド断片は直ちに想起することができ、したがって、単に本明細書を不必要に長文化させない目的で個々に列挙することはしない。
なお、本発明のポリヌクレオチド断片の上記種は、代わりに、式「ｘ〜ｙ」で記載してもよく、ここで、「ｘ」はポリヌクレオチドの最５’ヌクレオチド位置に等しく、かつ「ｙ」は最３’ヌクレオチド位置に等しく、さらに、「ｘ」は１と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から１８を引いた数との間の整数に等しく、「ｙ」は１９と、本発明のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から１８を引いたヌクレオチド数との間の整数に等しく、「ｘ」は「ｙ」よりも少なくとも１８少ない整数である。
本発明は、上述の５’および３’位置によって指定される本発明のポリヌクレオチド断片またはヌクレオチドのサイズによって指定されるポリヌクレオチドのあらゆる種の排除に対する備えもある。上述の５’および３’位置またはヌクレオチドのサイズによって指定されるあらゆる数の断片を排除することができる。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド断片は、１８個の連続する塩基から本発明の好ましい態様のセクションＩＩにおいて説明されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片をコードする完全長ポリヌクレオチドまでを含む。この態様の一局面においては、ポリヌクレオチドは本発明のポリヌクレオチドの少なくとも１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、５２５、５３０、５３５、５４０、５４５、５５０、５５５、５６０、５６５、５７０、５７５、５８０、５８５、５９０、５９５、６００、６０５、６１０、６１１、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７４０、７７０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２４２、１２５０、１３００、１３３８、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１５５０、１６００、１６３０、１６５０、１７００、１７５０、１８００、１８５０、１９００、１９５０、２０００、２０５０、２１００、２１５０、２２００、２２５０または２２５７個の連続するヌクレオチドを含む。
上述の好ましい核酸サイズに加えて、さらなる好ましい核酸は少なくとも１８個のヌクレオチドを含み、ここで、「少なくとも１８」は１８と、ここでのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１断片ｃＤＮＡの最３’ヌクレオチド位置に対応する整数との間のあらゆる整数と定義される。
本発明の好ましいポリヌクレオチドとしてさらに含まれるものは、それらの５’および３’位置に関してさらに指定されている、上述のように長さが少なくとも１８ヌクレオチドの核酸断片である。５’および３’位置は、下記配列表に記載される位置番号によって表される。対立遺伝子および分解並びに他の変種については、位置１は読み取り枠（ＯＲＦ）の最５’ヌクレオチドと定義され、すなわち、開始コドン（ＡＴＧ）のヌクレオチド「Ａ」は残りのヌクレオチドと共に連続的に番号付けされる。したがって、長さが少なくとも１８個の連続するヌクレオチドであるポリヌクレオチド断片が本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１断片ポリヌクレオチド上で占めることができる５’および３’ヌクレオチド位置の全ての組合せが個別の種として本発明に含まれる。５’および３’位置によって指定されるポリヌクレオチド断片は直ちに想起することができ、したがって、単に本明細書を不必要に長文化させない目的で個々に列挙することはしない。
なお、本発明のポリヌクレオチド断片の上記種は、代わりに、式「ｘ〜ｙ」で記載してもよく、ここで、「ｘ」はポリヌクレオチドの最５’ヌクレオチド位置に等しく、「ｙ」は最３’ヌクレオチド位置に等しく、さらに、「ｘ」は１と、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数から１８を引いた数との間の整数に等しく、「ｙ」は９と、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチド配列のヌクレオチド数との間の整数に等しく、「ｘ」は「ｙ」よりも少なくとも１８少ない整数である。「ｘ」および「ｙ」位置の全ての組合せが本発明の具体的な態様として含まれる。さらに、式「ｘ」〜「ｙ」は「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ１−ｙ２」と修飾することができ、ここで、「ｘ１−ｘ２」および「ｙ１−ｙ２」は配列表のあらゆる２つのヌクレオチド位置から選択される位置範囲を表す。代替式には「ｘ１−ｘ２」〜「ｙ」および「ｘ」〜「ｙ１−ｙ２」が含まれる。
これらの具体的な態様、およびここで説明される他のポリヌクレオチド断片態様は、「少なくとも」指定されたサイズまたは指定された５’および／または３’位置、それに「等しい」、それ「以下」、それ「未満」、「少なくとも＿であるが＿以下」または「＿〜＿」であるとして修飾することができる。
本発明は、上述の５’および３’位置によって指定される本発明のポリヌクレオチド断片またはヌクレオチドのサイズによって指定されるポリヌクレオチドのあらゆる種の排除に対する備えもある。上述の５’および３’位置またはヌクレオチドのサイズによって指定されるあらゆる数の断片を排除することができる。
変種
他の好ましい態様においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドの変種が想起される。ポリヌクレオチドの変種は、この用語がここで用いられる場合、その配列が参照ポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。ポリヌクレオチドの変種は天然変種、例えば、天然対立遺伝子変種であってもよく、または天然に生じることが知られていない変種であってもよい。そのようなポリペプチドの非天然変種は、ポリヌクレオチド、細胞または生物に適用されるものを含む突然変異生成技術によって作製することができる。一般には、相違は、参照および変種のヌクレオチド配列が全体として非常に類似し、かつ多くの領域において同一であるように制限される。
上述のものとは実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重のため、依然として本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド変種も明確に想起される。上述の縮重変種を生成すること、例えば、特定の宿主についてのコドン発現を最適化する（例えば、ヒトｍＲＮＡ内のコドンを他の哺乳動物または細菌宿主細胞に好ましいものに変化させる）ことも当該技術分野における熟練者には日常的である。
上述のように、変種ポリヌクレオチドは天然に生じる、例えば、天然対立遺伝子変種であってもよく、または組換え法によって生じるものでもよい。「対立遺伝子変種」が意図するものは、生物の染色体上の所定の遺伝子座を占める遺伝子の幾つかの代替形態の１つである（例えば、Ｂ．Ｌｅｗｉｎ，（１９９０）Ｇｅｎｅｓ ＩＶ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。非天然変種は、当該技術分野で公知の突然変異生成技術を用いて産生させることができる。そのような核酸変種には、ヌクレオチド置換、欠失、または付加によって産生されるものが含まれる。これらの置換、欠失、または付加は１つ以上のヌクレオチドを含む。コーディング領域の変化は保存または非保存アミノ酸置換、欠失または付加を生じ得る。これらの中で特に好ましいものは、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの特性および活性を変化させないサイレント置換、負荷および欠失である。これに関しては保存置換も好ましい。
変種ポリヌクレオチド中に存在するヌクレオチド変化は、好ましくはサイレントであり、これは、それらがそのポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸を変更しないことを意味する。しかしながら、ヌクレオチド変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸置換、付加、欠失、融合および切り詰めも生じ得る。
ヌクレオチド置換が１つ以上のアミノ酸変化を生じる場合、好ましいＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドには、本発明の好ましい態様のセクションＩにおいて説明される１つ以上の代謝関連活性を保持するものが含まれる。
「同じ活性を保持する」が意味するものは、変種ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをアッセイにおいて用いることにより測定される活性がここで実施例セクションにおいて説明されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを用いて測定される活性の少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であり、かつ１０１％、１０２％、１０３％、１０４％、１０５％、１１０％、１１５％、１２０％または１２５％以下であることである。
活性が「増加している」が意味することは、変種ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをアッセイにおいて用いることにより測定される活性がここで実施例セクションにおいて説明されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを用いて測定される活性の少なくとも１２５％、１３０％、１３５％、１４０％、１４５％、１５０％、１５５％、１６０％、１７０％、１８０％、１９０％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４５０％、または５００％であることである。
活性が「低下している」が意味することは、変種ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドをアッセイにおいて用いることにより測定される活性がここで実施例セクションにおいて説明されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを用いて測定される活性の少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、７５％、８０％、９０％または９５％だけ低下していることである。
同一性パーセント
本発明は、さらに、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１のポリヌクレオチド配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％同一である配列を有する核酸分子または本発明の好ましい態様のセクションＩにおいて説明される代謝関連活性を有するポリペプチドをコードするそれらの断片に向けられる。もちろん、遺伝子暗号の縮重のため、当該技術分野における熟練者は、配列番号１、３、５、７、９、もしくは１１に示される核酸分子と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一である核酸分子またはそれらの断片の多数が生物学的活性を有するポリペプチドをコードすることを直ちに認識する。実際、これらのヌクレオチド配列の分解変種が全て同じポリペプチドをコードするため、上述の比較アッセイの実施なしであっても、これは熟練技術者には明瞭である。さらに、分解変種ではないような核酸分子について、合理的な数が生物学的活性を有するポリペプチドをコードすることは当該技術分野において認められる。これは、熟練技術者が、本発明の好ましい態様のセクションＩにおいてさらに前述されるように、タンパク質の機能に有意に影響を及ぼすことがほとんどありそうもないか、または全くありそうもないアミノ酸置換（例えば、ある脂肪族アミノ酸の第２脂肪族アミノ酸での置換）を十分に承知しているためである。
本発明の参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば、９５％「同一」であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、そのポリヌクレオチド配列がＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチド当たり５つまでの点突然変異を含み得ることを除いて、そのポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照ヌクレオチドと同一であることが意図される。換言すると、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るには、参照配列中の５％までのヌクレオチドを欠失、挿入、または別のヌクレオチドと置換させることができる。照会配列は全配列であっても、ここで説明されるように指定されるいかなる断片であってもよい。
あらゆる特定の核酸分子またはポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかを決定および定義する方法は公知のコンピュータプログラムを用いることによって行うことができる。照会配列（本発明の配列）とグローバル配列整列とも呼ばれる対象配列との間の最良の全体的一致を決定するための好ましい方法は、Ｂｒｕｔｌａｇ等（（１９９０）Ｃｏｍｐｕｔ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｓｃｉ．Ｊｕｌ；６（３）：２３７−４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータプログラムを用いて決定することができる。配列整列において、照会および対象配列は両ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、まずＵをＴに変換することによって比較することができる。前記グローバル配列整列の結果は同一パーセント表示である。ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＤＢ整列において同一性パーセントを算出するのに用いられる好ましいパラメータは以下の通りである。Ｍａｔｒｉｘ＝Ｕｎｉｔａｒｙ、ｋ−ｔｕｐｌｅ＝４、Ｍｉｓｍａｔｃｈ Ｐｅｎａｌｔｙ＝１、Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｐｅｎａｌｔｙ＝３０、Ｒａｎｄｏｍｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｅｎｇｔｈ＝０、Ｃｕｔｏｆｆ Ｓｃｏｒｅ＝１、Ｇａｐ Ｐｅｎａｌｔｙ＝５、Ｇａｐ Ｓｉｚｅ Ｐｅｎａｌｔｙ ０．０５、Ｗｉｎｄｏｗ Ｓｉｚｅ＝５００または対象ヌクレオチド配列の長さのいずれか小さい方。
対象配列が５’または３’欠失のためであって内部欠失のためではなく照会配列よりも短い場合、それらの結果に対して手動修正を施さなければならない。これは、ＦＡＳＴＤＢプログラムが同一性パーセントを算出するときに対象配列の５’および３’切り詰めを考慮しないためである。照会配列に対して５’および３’末端で切り詰められた対象配列については、一致／整列していない、対象配列の５’および３’である照会配列の塩基数を照会配列の全塩基のパーセントとして算出することによって同一性パーセントを修正する。ヌクレオチドが一致／整列しているかどうかはＦＡＳＴＤＢ配列整列の結果によって決定する。次に、このパーセンテージを、指定されたパラメータを用いて上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出された同一性パーセントから減じて最終同一性パーセント評点に到達する。この修正評点が本発明の目的に用いられるものである。ＦＡＳＴＤＢ整列による表示で、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’ヌクレオチドの外側のヌクレオチドのみが同一パーセント評点の手動調整の目的で算出される。
例えば、９０ヌクレオチド対象配列を１００ヌクレオチド照会配列と整列させて同一性パーセントを決定する。欠失が対象配列の５’末端に生じ、したがって、ＦＡＳＴＤＢ整列は５’末端の最初の１０ヌクレオチドの一致／整列を示さない。この１０個の非対ヌクレオチドは配列の１０％（一致しない５’および３’末端のヌクレオチド数／照会配列中のヌクレオチドの総数）を表し、それ故、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出された同一パーセント評点から１０％を減じる。残りの９０ヌクレオチドが完全に一致する場合、最終同一性パーセントは９０％である。
別の例においては、９０ヌクレオチド対象配列を１００ヌクレオチド照会配列と比較する。今回は欠失が内部欠失であり、照会と一致／整列しない対象配列の５’または３’のヌクレオチドは存在しない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出された同一性パーセントを手動修正することはない。今一度、照会配列と一致／整列しない対象配列の５’および３’のヌクレオチドのみを手動で修正する。他の手動修正は本発明の目的のためには行わない。
融合
さらなる異種アミノ酸配列のコーディング配列にインフレームで融合する、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが本発明にさらに含まれる。本発明のポリペプチドを、例えば非コーディング５’および３’配列、ベクター配列、精製、プロービング、もしくはプライミングに用いられる配列を含むがこれらに限定されるものではない、さらなる非コーディング配列と共にコードする核酸も本発明に含まれる。例えば、異種配列には、転写並びにｍＲＮＡ処理、例えば、リボゾーム結合およびｍＲＮＡの安定性において役割を果たし得る転写非翻訳配列が含まれる。異種配列は、代わりとして、さらなる機能性を提供するさらなるコーディング配列を含むことができる。したがって、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をタグ配列、例えば、融合タンパク質の精製を容易にするペプチドをコードする配列に融合することができる。本発明のこの局面の特定の好ましい態様において、タグアミノ酸配列はヘキサヒスチジンペプチド、例えば、とりわけ、ｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）において提供されるタグであり、それらの多くは商業的に入手可能である。例えば、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の通所の精製に対する備えがある（Ｇｅｎｔｚ等（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：８２１−４参照）。インフルエンザヘマグルチニンタンパク質から誘導されるエピトープに対応する「ＨＡ」タグが精製に有用な別のペプチドである（Ｗｉｌｓｏｎ等（１９８４）Ｃｅｌｌ ３７：７６７−７８参照）。上述のように、他のそのような融合タンパク質には、ＦｃにＮまたはＣ末端で融合するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ｃＤＮＡが含まれる。
ＩＩＩ．本発明の組換えベクター
「ベクター」という用語は、ここでは、二本鎖または一本鎖のいずれかであり、かつ宿主細胞または単細胞もしくは多細胞宿主生物における移行が求められる少なくとも１つの関心ポリヌクレオチドを含む、環状または直鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を示すのに用いられる。
本発明は、ここで説明されるポリヌクレオチドのいずれか１つを含む組換えベクターに関する。
本発明は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む一群の組換えベクターを包含する。
第１の好ましい態様においては、本発明の組換えベクターを適切な細胞宿主における挿入されたポリヌクレオチドの増幅に用い、このポリヌクレオチドはその組換えベクターが複製される毎に増幅される。挿入されるポリヌクレオチドは本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするものであり得る。
本発明による組換えベクターの第２の好ましい態様は、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターからなる。具体的な態様内では、発現ベクターは、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、好ましくは本発明において説明される修飾ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１を発現させるのに用いられ、次にそれを精製し、かつ、例えば、代謝関連疾患の治療として、または単に個体の体重を減少させるのに用いることができる。
発現は適切なシグナルがそのベクター内に与えられていることを必要とし、前記シグナルは宿主細胞において関心遺伝子の発現を誘導する様々な調節要素、例えば、ウイルスおよび哺乳動物の両方の源からのエンハンサー／プロモーターを含む。一般に、産生物を発現する恒久的で安定な細胞クローンを確立するための優勢薬物選択マーカーが本発明の発現ベクターに含まれるが、これは、それらが薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に連結させる要素であるためである。
特には、本発明は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドのうちで選択される調節配列の制御の下で、または代わりに、外来性調節配列の制御の下で、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはここで説明される修飾ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１、またはそれらの変種もしくは断片をコードする核酸を含む発現ベクターに関する。
したがって、本発明の好ましい発現ベクターは、（ａ）それらに作動可能に連結するコーディングポリヌクレオチドの発現を駆動する調節配列、および（ｂ）適切な細胞宿主および／または宿主生物におけるその発現を許容する調節配列に作動可能に連結する、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１コーディング配列からなる群より選択される。
本発明のベクターにおいて見出すことができる要素の幾つかを以下のセクションにおいてさらに詳細に説明する。
１）本発明の発現ベクターの一般的な特徴
本発明による組換えベクターには、これらに限定されるものではないが、ＹＡＣ（酵素人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ファージ、ファージミド、コスミド、プラスミド、または染色体、非染色体、半合成もしくは合成ＤＮＡからなるものであり得る直鎖ＤＮＡ分子さえも含まれる。そのような組換えベクターは、以下のものの組立体を含む転写単位を含有する。
（１）遺伝子発現における調節の役割を有する遺伝要素（１種類もしくは複数種類）、例えば、プロモーターまたはエンハンサー。エンハンサーは、長さが通常約１０〜３００ｂｐの、プロモーターに作用して転写を増加させるＤＮＡのシス作用性要素である。
（２）ｍＲＮＡに転写され、かつ最終的にポリペプチドに翻訳される、（１）において説明した調節要素に作動可能に連結する構造またはコーディング配列。
（３）適切な転写開始および終止配列。
酵母または真核生物発現系において用いようとする構造単位は、好ましくは、翻訳されたタンパク質の宿主細胞による細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含む。代わりとして、組換えタンパク質がリーダーまたは輸送配列なしに発現された場合には、Ｎ末端残基を含むことができる。この残基は、次に、発現した組換えタンパク質から開裂されて最終産生物をもたらしてももたらさなくてもよい。
一般には、組換え発現ベクターは、複製起点、宿主細胞の形質転換を許容する選択可能マーカー、および下流構造配列の転写を指示する高度発現遺伝子から誘導されるプロモーターを含む。異種構造配列は、適切な相において、翻訳開始および終止配列並びに、好ましくは、細胞膜周辺腔または細胞外媒体への翻訳されたタンパク質の分泌を指示することが可能なリーダー配列と共に組み立てられる。ベクターが哺乳動物宿主細胞における所望の配列の形質移入および発現に適合する具体的な態様においては、好ましいベクターは所望の宿主における複製起点、適切なプロモーターおよびエンハンサーを含み、かつあらゆる必要なリボゾーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与および受容部位、転写終止配列、並びに５’隣接非転写配列をも含む。必要とされる非転写遺伝要素を提供するのに、例えばＳＶ４０起源の、ＳＶ４０ウイルスゲノム、早期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位から誘導されるＤＮＡ配列を用いることができる。
２）調節要素
プロモーター
本発明の発現ベクターにおいて用いられる適切なプロモーター領域は、異種遺伝子を発現させる細胞宿主を考慮して選択される。関心核酸配列の発現を制御するのに用いられる特定のプロモーターは、それが標的細胞における核酸の発現を指示することが可能である限り、重要ではないものと信じられる。したがって、ヒト細胞が標的である場合、核酸コーディング領域をヒト細胞において発現することが可能であるプロモーター、例えば、ヒトまたはウイルスプロモーターに隣接させて、かつその制御の下に位置付けることが好ましい。
適切なプロモーターは、それが制御する核酸に関して異種であってもよく、または代わりとして、発現させようとするコーディング配列を含む未変性ポリヌクレオチドに対して内在性であってもよい。加えて、プロモーターは、一般には、構築体プロモーター／コーディング配列が挿入されている組換えベクター配列に関して異種である。
プロモーター領域はあらゆる所望の遺伝子から、例えば、ＣＡＴ（クロラムフェニコールトランスフェラーゼ）ベクター並びに、より好ましくは、ｐＫＫ２３２−８およびｐＣＭ７ベクターを用いて選択することができる。好ましい細菌プロモーターは、ＬａｃＩ、ＬａｃＺ、Ｔ３もしくはＴ７バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ｇｐｔ、ｌａｍｂｄａ ＰＲ、ＰＬおよびｔｒｐプロモーター（欧州特許第００３６７７６号）、ポリヘドリンプロモーター、またはバキュロウイルスに由来するｐ１０タンパク質プロモーター（Ｋｉｔ Ｎｏｖａｇｅｎ）（Ｓｍｉｔｈ等（１９８３）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３：２１５６−６５；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ等、１９９２）、ｌａｍｂｄａ ＰＲプロモーターであり、またはｔｒｃプロモーターでもある。
真核生物プロモーターには、ＣＭＶ最初期、ＨＳＶチミジンキナーゼ、早期および後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、並びにマウスメタロチオネイン−Ｌが含まれる。加えて、特定の細胞型に特異的なプロモーター、例えば、脂肪組織、筋肉組織、または肝臓における発現を促進するものを選択することができる。好都合のベクターおよびプロモーターの選択は当該技術分野における通常の技術のレベル内にある。
プロモーターの選択は遺伝子工学の分野における熟練者の能力の範囲内にある。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｖｏｌ．１，２，３（１９８９）を参照することができ、またはＦｕｌｌｅｒ等（１９９６）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｉｎ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに記載の手順を参照することもできる。
他の調節要素
ｃＤＮＡインサートが用いられる場合、典型的には、遺伝子転写体の適正なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルを含めることが望まれる。ポリアデニル化シグナルの性質は本発明の実施の成功に重要であるとは信じられず、あらゆるそのような配列、例えば、ヒト成長ホルモンおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを用いることができる。ターミネーターも発現カセットの要素として考慮される。これらの要素はメッセージレベルを増強し、かつカセットから他の配列までを通しての読み取りを最小化するのに役立つ。
上述の適切なＤＮＡ配列を含むベクターは、適切な宿主を形質転換して所望のポリペプチドまたはポリヌクレオチドの発現を可能にするに用いることができる。
３）選択可能マーカー
そのようなマーカーは同定可能な変化を細胞に付与し、これは発現構築体を含む細胞の容易な同定を可能にする。形質転換宿主細胞を選択するための選択可能マーカー遺伝子は、好ましくは、真核生物細胞培養についてはジヒドロフォレートレダクターゼもしくはネオマイシン耐性、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）についてはＴＲＰ１、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）においてはテトラサイクリン、リファンピシンもしくはアンピシリンであり、あるいはミコバクテリアについてはレバンサッカラーゼであり、この後者のマーカーは陰性選択マーカーである。
４）好ましいベクター
細菌ベクター
代表的ではあるが非限定的な例として、細菌用途に有用な発現ベクターは選択可能マーカーおよびｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ ３７０１７）の遺伝要素を含む商業的に入手可能なプラスミドから誘導される細菌性複製起点を含むことができる。そのような商業的ベクターには、例えば、ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）が含まれる。
多数の他の適切なベクター、例えば、以下の細菌ベクターが当該技術分野における熟練者に公知であり、かつ商業的に入手可能である。ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｂｓ、ｐＤ１０、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６Ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＱＥ−３０（ＱＩＡｅｘｐｒｅｓｓ）。
バキュロウイルスベクター
本発明のポリペプチドの発現に適するベクターは、昆虫細胞および昆虫細胞株において増殖可能であるバキュロウイルスベクターである。特に適する宿主ベクター系は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａから誘導されるＳＦ９細胞株（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ １７１１）の形質移入に用いられるｐＶＬ１３９２／１３９３バキュロウイルス転移ベクター（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）である。
バキュロウイルス発現系におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの発現に適する他のベクターには、Ｃｈａｉ等（１９９３；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １８（Ｐｔ ３）：２５９−７３）；Ｖｌａｓａｋ等（１９８３；Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １３５：１２３−６）；およびＬｅｎｈａｒｄ等（１９９６；Ｇｅｎｅ １６９：１８７−９０）に記載のものが含まれる。
プラスミドベクター
本発明のポリペプチドの発現に適するベクターは、ＳＶ４０誘導複製基点を含み、かつＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ１６５０；Ｎ°ＣＲＬ１６５１）の一時的形質移入に用いることができるプラスミドベクターである。ＣＯＳ細胞の一時的形質移入に適するプラスミドベクターには、これに限定されるものではないが、ＣＤＭ８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
ウイルスベクター
具体的な態様の１つにおいては、ベクターはアデノウイルスから誘導される。本発明による好ましいアデノウイルスベクターは、Ｆｅｌｄｍａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｇ（１９９６；Ｓｅｍｉｎ Ｉｎｔｅｒｖ Ｃａｒｄｉｏｌ １：２０３−８）またはＯｈｎｏ等（１９９４；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６５：７８１−４）に記載のものである。本発明のこの具体的な態様による別の好ましい組換えアデノウイルスは、２もしくは５（Ａｄ２もしくはＡｄ５）型ヒトアデノウイルスまたは動物起源のアデノウイルスである（フランス特許出願第９３．０５９５４号）。
レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、一般に、好ましくはヒトを含む哺乳動物に、インビボで外来性ポリヌクレオチドを転移させるための選りすぐりの組換え遺伝子送達系であるものと理解される。これらのベクターは細胞への遺伝子の効率的な送達をもたらし、転移された核酸は宿主の染色体ＤＮＡに安定して組み込まれる。
本発明のレトロウイルスインビトロもしくはインビボ遺伝子送達ビヒクルの調製または構築に特に好ましいレトロウイルスには、ミンクセルフォーカスインデューシングウイルス（Ｍｉｎｋ−Ｃｅｌｌ Ｆｏｃｕｓ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、マウス肉腫ウイルス、細網内皮症ウイルスおよびラウス肉腫ウイルスからなる群より選択されるレトロウィルスが含まれる。特に好ましいマウス白血病ウイルスには、４０７０Ａおよび１５０４Ａウイルス、Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９９）、Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−２４５）、Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−５９０）、Ｒａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−９９８）並びにモロニーマウス白血病ウイルス（ＡＴＣＣ Ｎｏ ＶＲ−１９０；ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２４２９８号）が含まれる。特に好ましいラウス肉腫ウイルスには、Ｂｒｙａｎ高力価（ＡＴＣＣ Ｎｏｓ ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８）が含まれる。他の好ましいレトロウイルスベクターは、Ｒｏｔｈ等（１９９６）、ＰＣＴ出願第ＷＯ９３／２５２３４号、ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／０６９２０号、Ｒｏｕｘ等（（１９８９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８６：９０７９−８３）、Ｊｕｌａｎ等（１９９２）Ｊ Ｇｅｎ． Ｖｉｒｏｌ ３：３２５１−３２５５およびＮｅｄａ等（（１９９１）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６６：１４１４３−６））に記載されるものである。
本発明によって考慮されるさらに別のウイルスベクター系はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）からなる。アデノ随伴ウイルスは、効率的な複製および生産的なライフサイクルのために別のウイルス、例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスをヘルパーウイルスとして必要とする天然欠損ウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ等（１９９２）Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １５８：９７−１２９）。これは、そのＤＮＡを非分割細胞に組み込むことができ、かつ安定した組み込みを高頻度で示す僅かなウイルスのうちの１つでもある（Ｆｌｏｔｔｅ等（１９９２）Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ７：３４９−５６；Ｓａｍｕｌｓｋｉ等（１９８９）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ６３：３８２２−８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ等（１９８９）Ａｍ Ｊ Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ ５９：５６１−５６９）。ＡＡＶの有利な特徴の１つは、形質転換細胞に対して一時細胞を形質導入するその減少した効力から誘導される。
５）組換えベクターの送達
本発明のポリヌクレオチドの発現を達成するため、これらの構築体を細胞内に送達しなければならない。この送達は、細胞株を形質転換するための実験室手順における場合にはインビトロで、または特定の疾患状態の治療における場合にはインビボもしくは生体外で達成することができる。
機構の１つは、発現構築体が感染性ウイルス粒子内に封入されているウイルス感染である。
ポリヌクレオチドを培養哺乳動物細胞に移送するための幾つかの非ウイルス法も本発明によって考慮され、これには、これらに限定されることなしに、リン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ等（１９７３）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５４：５３６−９；Ｃｈｅｎ等（１９８７）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ７：２７４５−５２）、ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，（１９８５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ５：１１８８−９０）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ等（１９８６）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ６：７１６−８；Ｐｏｔｔｅｒ等（１９８４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：７１６１−５．）、直接微量注入（Ｈａｒｌａｎｄ等（１９８５）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０１：１０９４−９）、ＤＮＡ積載リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８２）Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ ７２１：１８５−９０；Ｆｒａｌｅｙ等（１９７９）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７６：３３４８−５２）、および受容体介在形質移入（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，（１９８７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６２：４４２９−３２；Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７：８８７−９２）が含まれる。これらの技術の幾つかをインビボまたは生体外用途に上手く適合させることができる。
一度発現ポリヌクレオチドが細胞内に送達されると、それはレシピエント細胞のゲノム内に安定して組み込まれ得る。この組込みは同種組換えによる同族位置および方向（遺伝子置換）であってもよく、または無作為の非特異的位置（遺伝子増強）であってもよい。さらなる態様においては、核酸は細胞中に分離されたＤＮＡのエピソームセグメントとして安定して維持され得る。そのような核酸セグメント、すなわち、「エピソーム」は、宿主細胞のサイクルとは独立の、またはそれと同期する維持および複製を可能にするのに十分な配列をコードする。
タンパク質またはペプチドをインビボで脊椎動物の細胞内部に送達するための方法の具体的な態様の１つは、生理学的に許容し得る担体および本発明のポリペプチドを作動可能にコードする裸のポリヌクレオチドを含む調製品を、細胞を含む組織の隙間空間に導入する工程を含み、それにより裸のポリヌクレオチドが細胞の内部に取り込まれて生理学的効果を有する。これは、特に、インビトロでの転移に適用可能であるが、インビボに適用することもできる。
「裸の」ポリヌクレオチドを含むインビトロおよびインビボで用いるための組成物は、ＰＣＴ出願第ＷＯ９０／１１０９２号（Ｖｉｃａｌ Ｉｎｃ．）および同様にＰＣＴ出願第ＷＯ９５／１１３０７号（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ、ＩＮＳＥＲＭ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｅ ｄ’Ｏｔｔａｗａ）に加えてＴａｓｃｏｎ等（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２：８８８−８９２およびＨｕｙｇｅｎ等（（１９９６）Ｎａｔ Ｍｅｄ ２：８９３−８）の論文に記載される。
本発明のさらに別の態様においては、本発明のポリヌクレオチド構築体を含む本発明の裸のポリヌクレオチドの細胞内への転移を微粒子銃（バイオリスティック）で進行させることができ、前記粒子は、例えば、Ｋｌｅｉｎ等（（１９９０）Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ １７：９７−１０３）によって記載される、高速に加速されたＤＮＡ被覆微粒子弾であり、その高速はそれらが細胞膜を貫いて細胞を殺すことなくそれらに侵入することを可能にする。
さらなる態様においては、本発明のポリヌクレオチドをリポソーム内に包摂することができる（Ｇｈｏｓｈ ａｎｄ Ｂａｃｃｈａｗａｔ，（１９９１）Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ ４：８７−１０３；Ｗｏｎｇ等（１９８０）Ｇｅｎｅ １０：８７−９４；Ｎｉｃｏｌａｕ等（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１５７−７６）。これらのリポソームは、レプチン、トリグリセリド、または他の公知ＬＳＲリガンドをリポソーム膜に組み込むことにより、ＬＳＲを発現する細胞を標的とすることができる。
具体的な態様において、本発明はここで説明されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのインビボ産生のための組成物を提供する。これは、このポリペプチドを作動可能にコードする溶液中の裸のポリヌクレオチドを生理学的に許容し得る担体中に含み、かつ組織に導入してその組織の細胞に前記ポリペプチドを発現させるのに適する。
所望の宿主生物に注入しようとするベクター量は注入部位に従って変化する。指示用量として、０．１〜１００μｇのベクターを動物体内、好ましくは哺乳動物体内、例えば、マウス体内に注入する。
本発明によるベクターの別の態様においては、それをインビトロで宿主細胞、好ましくは、治療しようとする動物から予め収集された宿主細胞、より好ましくは、筋肉細胞のような体細胞に導入することができる。次の工程において、所望のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは所望のそれらの断片をコードするベクターで形質転換されている細胞を、組換えタンパク質を体内で局所的または全身的に送達するため、動物体内に再導入する。
ＩＶ．本発明の組換え細胞
本発明の別の目的は、宿主細胞組換体、すなわち、ここで説明されるポリヌクレオチドのうちの１つ、より正確には、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、例えば、「本発明のポリヌクレオチド」において説明されるもののいずれか１つで形質転換または形質移入されているものからなる。これらのポリヌクレオチドは一時的な、または安定した形質移入の結果として細胞内に存在し得る。本発明は、組換えベクター、例えば、「本発明の組換えベクター」において説明されるもののいずれか１つで形質転換（原核細胞）または形質移入（真核細胞）されている宿主細胞を含む。
一般には、本発明の組換え宿主細胞は、ここで説明される本発明のポリヌクレオチドまたは組換えベクターの少なくとも１つを含む。
本発明の組換えベクターのレシピエントして用いられる好ましい宿主細胞は以下の通りである。
ａ）原核宿主細胞：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）株（Ｉ．Ｅ．ＤＨ５−α株）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、サルモネラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、並びにシュードモナス、ストレプトミセスおよびスタフィロコッカス等の種に由来する株。
ｂ）真核宿主細胞：ＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＣＬ２；Ｎ°ＣＣＬ２．１；Ｎ°ＣＣＬ２．２）、Ｃｖ１細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＣＬ７０）、ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ１６５０；Ｎ°ＣＲＬ１６５１）、Ｓｆ−９細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ１７１１）、Ｃ１２７細胞（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ−１８０４）、３Ｔ３（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＲＬ−６３６１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ Ｎ°ＣＣＬ−６１）、ヒト腎臓２９３（ＡＴＣＣ Ｎ°４５５０４；Ｎ°ＣＲＬ−１５７３）、ＢＨＫ（ＥＣＡＣＣ Ｎ°８４１００５０１；Ｎ°８４１１１３０１）、ＰＬＣ細胞、ＨｅｐＧ２、およびＨｅｐ３Ｂ。
宿主細胞中の構築体は、通常の方法で、組換え配列によってコードされる遺伝子産生物の産生に用いることができる。
適切な宿主の形質転換およびその宿主の適切な細胞密度までの成長の後、選択されたプロモーターを適切な手段、例えば、温度シフトまたは化学誘導によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。
好ましい態様においては、組換えベクター、例えば、「本発明の組換えベクター」において説明されるもののいずれか１つで安定して、または一時的に形質移入されている細胞によって発現される組換えタンパク質を培養上清から回収する。
代わりとして、細胞を（典型的には遠心分離によって）収集し、物理的または化学的手段によって破壊して、得られた粗製抽出物をさらなる精製のために保持することができる。
タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結・解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むあらゆる好都合な方法によって破壊することができる。そのような方法は熟練技術者に公知である。
さらに、本発明によると、これらの組換え細胞をインビトロで、または動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはマウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、ウシ、およびヒトを含まない霊長類からなる群より選択されるものにおいてインビボで創出することができる。インビトロで創出された組換え細胞は、例えば、後に外科的に動物に移植することもできる。動物においてインビボで組換え細胞を創出する方法は当該技術分野において公知である。
本発明は、ａ）外来性（異種）ポリヌクレオチドを標的遺伝子の内在性染色体ＤＮＡに挿入し、ｂ）内在性染色体ＤＮＡを欠失させ、および／またはｃ）内在性染色体ＤＮＡを外来性ポリヌクレオチドで置換するように加工されている、脊椎動物起源、好ましくは哺乳動物起源、特にはヒト起源の、一次、二次、または不死化相同組換え宿主細胞も包含する。ポリヌクレオチド配列の挿入、欠失、および／または置換は標的遺伝子のコーディング配列および／または標的遺伝子と作動可能に関連する調節領域、例えば、プロモーターおよびエンハンサー配列に対するものであり得る。
本発明は、さらに、インビトロまたはインビボで相同組換え宿主細胞を作製する方法であって、通常は細胞中で発現しない標的遺伝子の発現が変更されている方法に関する。好ましくは、この変更は、正常成長条件下、または標的遺伝子によってコードされるポリペプチドを産生するのに適する条件下で標的遺伝子の発現を生じる。この方法は、（ａ）インビトロまたはインビボで細胞にポリヌクレオチド構築体を形質移入し、該ポリヌクレオチド構築体は（ｉ）ターゲッティング配列、（ｉｉ）調節配列および／またはコーディング配列、および（ｉｉｉ）必要であれば、非対スプライスドナー部位を含み、それにより形質移入細胞を産生する工程と、（ｂ）形質移入細胞をインビトロまたはインビボで相同組換えに適する条件下において維持する工程とを含む。
本発明は、さらに、細胞中の標的遺伝子の発現をインビトロまたはインビボで変更する方法に関し、該遺伝子は通常細胞中では発現せず、該方法は（ａ）インビトロまたはインビボで細胞にポリヌクレオチド構築体を形質移入し、該ポリヌクレオチド構築体は（ｉ）ターゲッティング配列、（ｉｉ）調節配列および／またはコーディング配列、および（ｉｉｉ）必要であれば、非対スプライスドナー部位を含み、それにより形質移入細胞を産生する工程と、（ｂ）形質移入細胞をインビトロまたはインビボで相同組換えに適する条件下において維持し、それにより相同組換え細胞を産生する工程と、（ｃ）相同組換え細胞をインビトロまたはインビボで遺伝子の発現に適する条件下において維持する工程とを含む。
本発明は、さらに、細胞中の標的内在性遺伝子の発現をインビトロまたはインビボで変更することによって本発明のポリペプチドを作製する方法に関し、該遺伝子は通常細胞中で発現せず、該方法は（ａ）インビトロで細胞にポリヌクレオチド構築体を形質移入し、該ポリヌクレオチド構築体は（ｉ）ターゲッティング配列、（ｉｉ）調節配列および／またはコーディング配列、および（ｉｉｉ）必要であれば、非対スプライスドナー部位を含み、それにより形質移入細胞を産生する工程と、（ｂ）形質移入細胞をインビトロまたはインビボで相同組換えに適する条件下において維持し、それにより相同組換え細胞を産生する工程と、（ｃ）相同組換え細胞をインビトロまたはインビボで遺伝子の発現に適する条件下において維持し、それによりポリペプチドを作製する工程とを含む。
本発明は、さらに、標的遺伝子の、遺伝子が通常は発現しない細胞型における発現を変更するポリヌクレオチド構築体に関する。これは、ポリヌクレオチド構築体が標的細胞の染色体ＤＮＡに挿入されるときに生じ、ここで、ポリヌクレオチド構築体は（ａ）ターゲッティング配列、（ｂ）調節配列および／またはコーディング配列、および（ｃ）必要であれば、非対スプライスドナー部位を含む。上述のポリヌクレオチド構築体であって、ポリペプチドをコードし、かつ染色体ＤＮＡとの相同組換えの後に標的内在性遺伝子とインフレームであるポリヌクレオチドをさらに含むポリヌクレオチド構築体がさらに含まれる。
当該技術分野において公知の技術、例えば、米国特許第６，０５４，２８８号、第６，０４８，７２９号、第６，０４８，７２４号、第６，０４８，５２４号、第５，９９４，１２７号、第５，９６８，５０２号、第５，９６５，１２５号、第５，８６９，２３９号、第５，８１７，７８９号、第５，７８３，３８５号、第５，７３３，７６１号、第５，６４１，６７０号、第５，５８０，７３４号、国際公開第ＷＯ９６／２９４１１号、第ＷＯ９４／１２６５０号、およびＫｏｌｌｅｒ等（１９９４）Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０：７０５−７３０に記載の科学論文（これらの各々の開示は参照することによりそれら全体が組み込まれる）に記載されるものにより、これらの組成物を生成することができ、かつ方法を実施することができる。
哺乳動物、典型的にはヒト細胞におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の発現は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ゲノム配列または動物細胞中のゲノムにおけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１遺伝子対応物を本発明によるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリヌクレオチドで置換したｃＤＮＡ配列を挿入することで、欠損させることができ、または代わりとして、増強させることができる。これらの遺伝子の変更は、前述の特定のＤＮＡ構築体を用いる相同組換えイベントによって生じさせることができる。
用いることができる宿主細胞の１種は哺乳動物接合体、例えば、マウス接合体である。例えば、マウス接合体を、関心精製ＤＮＡ分子、例えば、１００ｍＭ ＮａＣｌ、３０μＭスペルミン、および７０μＭスペルミジンを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５０μＭ ＥＤＴＡ中で１ｎｇ／ｍｌ−ＢＡＣインサートについて−３ｎｇ／μｌ−Ｐ１バクテリオファージの濃度範囲に予め調製されている精製ＤＮＡ分子を用いる微量注入に処することができる。微量注入しようとするＤＮＡが大サイズを有する場合、Ｓｃｈｅｄｌ等（（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６２：２５８−６１）に記載のように、このＤＮＡの機械的破壊を回避するため、ポリアミンおよび高塩濃度を用いることができる。
ここで説明されるＤＮＡ構築体を含む本発明のポリヌクレオチドのいずれか１つを胚性幹（ＥＳ）細胞株、好ましくは、マウスＥＳ細胞株に導入することができる。ＥＳ細胞株は前移植胚盤胞の内部細胞塊の多能性中立細胞から誘導される。好ましいＥＳ細胞株は以下の通りである。ＥＳ−Ｅ１４ＴＧ２ａ（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１８２１）、ＥＳ−Ｄ３（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ１９３４およびＮｏ．ＣＲＬ−１１６３２）、ＹＳ００１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１１７７６）、３６．５（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１１１１６）。ＥＳ細胞を中立状態で維持するため、この胚表現型を保存する適切なシグナルを提供し、かつＥＳ細胞接着のマトリックスの役目を果たす成長阻害フィーダー細胞の存在下でそれらを培養する。好ましいフィーダー細胞は、Ａｂｂｏｎｄａｎｚｏ等（１９９３；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ ２２５：８０３−２３）に記載されるように培養状態で維持され、かつＲｏｂｅｒｔｓｏｎ（（１９８７）Ｅｍｂｒｙｏ−ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｉｎ：Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ Ｅｄ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｉｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ．ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）に記載されるように照射により、またはＰｅａｓｅおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９９０；Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ １９０：２０９−１１）に記載されるように阻害濃度のＬＩＦの存在により成長が阻害されている、事実上あらゆるマウス株の第１３〜第１４日胚の組織から確立される一次胚性線維芽細胞である。
宿主細胞中のこれらの構築体は、通常の方法で、組換え配列によってコードされる遺伝子産生物の産生に用いることができる。
適切な宿主の形質転換およびその宿主の適切な細胞密度までの成長の後、適切な手段、例えば、温度シフトまたは化学的誘導によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞をさらなる期間培養する。細胞を、典型的には、遠心分離によって収集し、物理的または化学的手段によって破壊して、生じる粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、凍結・解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含むあらゆる都合のよい方法によって破壊することができる。そのような方法は熟練技術者に公知である。
Ｖ．トランスジェニック動物
本発明は、本発明の組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを発現する非ヒト動物および植物を産生するための方法および組成物も提供する。これらの動物および植物はトランスジェニックであり得、すなわち、それらの細胞の各々がＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードする遺伝子を含むか、または代わりとして、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを動物もしくは植物の体細胞、例えば、哺乳動物の乳腺分泌上皮細胞に導入することができる。好ましい態様において、非ヒト動物は哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、またはウサギである。
トランスジェニック動物、例えば、哺乳動物を作製する方法は当該技術分野における熟練者に公知であり、あらゆるそのような方法を本発明において用いることができる。簡潔に述べると、トランスジェニック動物は、例えば、多能性幹細胞、例えば、関心ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むＥＳ細胞を形質移入することによって産生することができる。次に、上手く形質転換されたＥＳ細胞を早期段階胚に導入した後、同じ種の哺乳動物の子宮に移植する。特定の場合において、これらの形質転換（「トランスジェニック」）細胞は生じる動物の生殖系列の一部を含み、それらのトランスジェニック細胞を生殖系列に含む成体動物を続いて他の動物と交尾させ、それにより、最終的に、その導入遺伝子をそれらの細胞の各々に有し、かつその導入遺伝子をそれらの子孫の各々に安定に伝達することができるトランスジェニック動物の集団を産生することができる。ポリヌクレオチドを導入する他の方法、例えば、関心ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを微量注入によって受精卵または早期段階胚に導入する方法を用いることができる。代わりとして、導入遺伝子を含むレトロウイルスでの接合体の感染により、導入遺伝子を動物に導入することもできる（Ｊａｅｎｉｓｃｈ，Ｒ．（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７３、１２６０−１２６４）。トランスジェニック動物の作製方法は、例えば、Ｗａｌｌ等（１９９２）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９９２ ４９：１１３−２０、Ｈｏｇａｎ等（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、ＷＯ９１／０８２１６、または米国特許第４，７３６，８６６号に記載されている。
好ましい方法においては、ポリヌクレオチドを受精卵母細胞に微量注入する。典型的には、標準技術を用いて受精卵母細胞に微量注入した後、「前移植胚」が得られるまでインビトロで培養する。そのような前移植胚は、好ましくは、約１６〜１５０の細胞を含む。受精卵母細胞を前移植段階まで培養するための方法は、例えば、Ｇｏｒｄｏｎ等（（１９８４）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１０１，４１４）、Ｈｏｇａｎ等（（１９８６）Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏ．Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ）（マウス胚について）、Ｈａｍｍｅｒ等（（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ，３１５，６８０）（ウサギおよびブタ胚について）、Ｇａｎｄｏｌｆｉ等（（１９８７）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８１、２３−２８）；Ｒｅｘｒｏａｄ等（（１９８８）Ｊ．Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．６６、９４７−９５３）（ヒツジ胚について）、並びにＥｙｅｓｔｏｎｅ等（（１９８９）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．８５、７１５−７２０）、Ｃａｍｏｕｓ等（（１９８４）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｆｅｒｔ．７２、７７９−７８５）、およびＨｅｙｍａｎ等（（１９８７）Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ ２７，５９６８）（ウシ胚について）に記載されており、それらの各々の開示はそれらの全体がここに組み込まれる。その後、前移植胚を標準法によって適切なメスに移し、導入遺伝子が導入されるときの発達の段階に依存して、トランスジェニックまたはキメラ動物を誕生させる。
導入遺伝子組込みの頻度が低い場合があるため、ここで説明される方法のいずれかを用いる前移植胚における導入遺伝子組み込みの検出が望ましい場合がある。多数の方法のいずれをも、前移植胚における導入遺伝子の存在の検出に用いることができる。例えば、１つ以上の細胞を前移植胚から除去し、除去した細胞（１つもしくは複数）における導入遺伝子の有無をあらゆる標準方法、例えば、ＰＣＲを用いて検出することができる。代わりとして、標準方法を用いて、子宮内で、または分娩後に導入遺伝子の存在を検出することができる。
本発明の特に好ましい態様においては、組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをそれらのミルク中に分泌するトランスジェニック哺乳動物が産生される。乳腺は高度に効率的なタンパク質産生器官であるため、そのような方法はタンパク質濃縮物をグラム毎リットル範囲で、場合によっては、それ以上で産生するのに用いることができる。好ましくは、乳腺における発現は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺特異的プロモーターおよび、任意に、他の調節要素に作動可能に連結させることによって達成される。適切なプロモーターおよび他の要素には、これらに限定されるものではないが、哺乳動物短および長ＷＡＰ、アルファ、ベータ、およびカッパカゼイン、アルファおよびベータラクトグロブリン、ベータ−ＣＮ５’遺伝子から誘導されるものの他に、マウス乳腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターが含まれる。そのようなプロモーターおよび他の要素は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウサギ、およびモルモットを含むがこれらに限定されるものではないあらゆる哺乳動物から誘導することができる。プロモーターおよび他の調節配列、ベクター、並びに他の関連技術は、例えば、Ｃｌａｒｋ（１９９８）Ｊ Ｍａｍｍａｒｙ Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ Ｎｅｏｐｌａｓｉａ ３：３３７−５０、Ｊｏｓｔ等（１９９９）Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７：１６０−４、米国特許第５，９９４，６１６号、第６，１４０，５５２号、第６，０１３，８５７号、Ｓｏｈｎ等（１９９９）ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１８：８４５−５２、Ｋｉｍ等（１９９９）Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｊａｐａｎ）１２６：３２０−５、Ｓｏｕｌｉｅｒ等（１９９９）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６０：５３３−９、Ｚｈａｎｇ等（１９９７）Ｃｈｉｎ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈ １３：２７１−６、Ｒｉｊｎｋｅｌｓ等（１９９８）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ７：５−１４、Ｋｏｒｈｏｎｅｎ等（１９９７）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２４５：４８２−９、Ｕｕｓｉ−Ｏｕｋａｒｉ等（１９９７）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ６：７５−８４、Ｈｉｔｃｈｉｎ等（１９９６）Ｐｒｏｔ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ ７：２４７−５２、Ｐｌａｔｅｎｂｕｒｇ等（１９９４）Ｔｒａｎｓｇｅｎ Ｒｅｓ ３：９９−１０８、Ｈｅｎｇ−Ｃｈｅｒｌ等（１９９３）Ａｎｉｍａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：８９−１０７、およびＣｈｒｉｓｔａ等（２０００）Ｅｕｒｏ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６７：１６６５−７１（これらの各々の開示全体は参照することによりここに組み込まれる）によって提供される。
別の態様においては、本発明のポリペプチドを、そのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを乳腺の体細胞、例えば、乳分泌上皮細胞にインビボで導入することによって、ミルク中に産生させることができる。例えば、プラスミドＤＮＡを、乳頭管を介して、例えば、ＤＥＡＥ−デキストランと会合させて（例えば、Ｈｅｎｓ等（２０００）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １５２３：１６１−１７１参照）、構築体の受容体介在飲食作用を導き得るリガンドと会合させて（例えば、Ｓｏｂｏｌｅｖ等（１９９８）２７３：７９２８−３３を参照）、またはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、例えば、テナガザル白血病ウイルスにおいて（例えば、Ａｒｃｈｅｒ等（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４参照）注入することができる。これらの態様のいずれにおいても、ポリヌクレオチドは上述の乳腺特異的プロモーター、または代わりとして、あらゆる強力に発現するプロモーター、例えば、ＣＭＶもしくはＭｏＭＬＶ ＬＴＲに作動可能に連結させることができる。
本発明における使用に対するあらゆるベクター、プロモーター、調節要素等の適合性は、乳腺上皮細胞のような細胞、例えば、ＭａｃＴ細胞（ウシ乳腺上皮細胞）またはＧＭＥ細胞（ヤギ乳腺上皮細胞）にインビトロで形質移入し、それらの細胞における形質移入および発現の効率を評価することにより、予め評価することができる。
インビボ投与については、ポリヌクレオチドをあらゆる適切な処方で、いずれかの濃度範囲（例えば、（１〜５００μｇ／ｍｌ、好ましくは５０〜１００μｇ／ｍｌ）、いずれかの容積（例えば、１〜１００ｍｌ、好ましくは１〜２０ｍｌ）で投与することができ、かついずれかの回数（例えば、１、２、３、５、または１０回）、いずれかの頻度（例えば、１、２、３、５、１０、またはあらゆる日数毎）に投与することができる。適切な濃度、頻度、投与様式等は、特定のポリヌクレオチド、ベクター、動物等に依存し、かつ当該技術分野における熟練者が容易に決定することができる。
好ましい態様においては、Ａｒｃｈｅｒ等（（１９９４）ＰＮＡＳ ９１：６８４０−６８４４）に記載のように、レトロウイルスベクター、例えば、テナガザル白血球ウイルスベクターが用いられる。レトロウイルスの感染は典型的には細胞分割を必要とするため、例えばエストロジオールベンゾエート、プロゲステロン、レセルピン、またはデキサメタゾンのような因子を用いて、乳腺における細胞分割をベクターの投与と共に刺激することができる。さらに、ポリブレン等のアクセサリ化合物を用いてレトロウイルスおよび他の感染方法を容易にすることができる。
ミルクからＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを得るためのここで説明される方法のいずれにおいても、例えばヘキセトール、エストロゲン、および／またはプロゲステロンを用いる、乳汁分泌誘導のあらゆる標準法を用いて、得られるミルクの量、したがって、産生されるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの量を増強することができる。
そのような態様において用いられるポリヌクレオチドは、完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１断片のいずれかをコードし得る。典型的には、コードされたポリペプチドは、ミルク中へのタンパク質の分泌を保証するシグナル配列を含む。完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１配列が用いられる場合、その完全長タンパク質を、例えば、ミルクから単離して、適切なプロテアーゼを用いてインビトロで開裂させることができる。代わりとして、第２のプロテアーゼコーディングポリヌクレオチドを動物または乳腺細胞に導入することもでき、それにより、プロテアーゼの発現がインビボでのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの開裂を生じさせ、それにより、ミルクからのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１断片の直接単離が可能となる。
ＶＩ．本発明の薬学的または生理学的に許容し得る組成物
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは非ヒト動物および／またはヒトに単独で、またはそれらが適切な担体もしくは賦形剤（１種類もしくは複数種類）と混合されている薬学的もしくは生理学的に許容し得る組成物中で投与することができる。薬学的または生理学的に許容し得る組成物は治療上有効な用量で提供される。治療上有効な用量は、ここで説明される方法によって決定される代謝関連疾患または障害の症状または生理学的状態の予防または緩和を生じるのに十分なＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの量を指す。治療上有効な用量は、体重の減少または体重増加の予防または体重増加速度の増加の防止に、美容上の理由でこの影響を望む人物において必要な、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの量を指すこともできる。本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの治療上有効な投与量は、連続する周期的な使用または投与で体重減少または体重増加を促進するのに適合する投与量である。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの処方および投与の技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見出すことができる。
治療または予防に本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを用いることができる他の疾患または障害には、これらに限定されるものではないが、肥満並びに肥満関連疾患および障害、例えば、肥満、耐糖能異常、インシュリン耐性、アテローム性動脈硬化、アテローム性疾患、心臓病、高血圧、脳卒中、Ｘ症候群、非インシュリン依存性真性糖尿病（ＮＩＤＤＭ、もしくはＩＩ型糖尿病）およびインシュリン依存性真性糖尿病（ＩＤＤＭ、もしくはＩ型糖尿病）が含まれる。本発明の方法によって治療しようとする糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、網膜症、神経障害、腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の肥満関連障害には、高脂血症および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の肥満関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、仕事もしくは運動の間の身体的性能の増強または一般的な幸福の感覚の増強に用いることもできる。身体的性能活性には、歩行、走行、跳躍、持ち上げおよび／または登坂が含まれる。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらのアンタゴニストは、失読症、注意欠陥障害（ＡＤＤ）、注意欠陥／機能亢進障害（ＡＤＨＤ）、および精神医学的障害、例えば、脂肪酸代謝の調節、特には、特定の長鎖多不飽和脂肪酸の産生による分裂病の治療に用いることもできる。
本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは単独で、または他の薬学的もしくは生理学的に許容し得る化合物と組み合わせて提供し得ることが明確に考慮される、肥満または他の疾患および障害の治療に有用な他の化合物は現在当該技術分野において公知である。
好ましい態様において、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、ここで説明され、かつ当該技術分野において公知である方法を用いるインシュリン耐性および糖尿病の治療において有用であり、かつその治療において用いられる。特には、好ましい態様は、動物またはヒト被検体におけるグルコース代謝の治療的改変および調節のためのプロセスであって、治療を必要とする（代わりとして、定時毎日ベースで）被検体に、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド（または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、前記動物またはヒト被検体において血漿グルコースレベルを減少させるのに十分な投与量および期間投与することを含むプロセスに関する。
さらに好ましい態様は、糖尿病の予防または治療のための方法であって、治療を必要とする（代わりとして、定時毎日ベースで）被検体に、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド（または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）を、前記動物またはヒト被検体において血漿グルコースレベルを減少させるのに十分な投与量および期間投与することを含む方法に関する。
投与経路
適切な投与経路には、当該技術分野において公知の方法を用いる、経口、経鼻、直腸、経粘膜、もしくは腸管投与、筋肉内、皮下、髄内注射に加えてくも膜下腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、鼻内、肺内（吸入）もしくは眼内注射を含む非経口送達が含まれる。体重減少の促進に特に有用な化合物の投与方法は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを長期間にわたって送達するための装置の、例えばレシピエントの腹腔への、外科的移植を含む。他の特に好ましい投与形態はエアロゾルおよびデポー処方である。本発明の医薬の徐放性処方、特に、デポーが明確に考慮される。
組成物／配合物
本発明に従って用いられる薬学的または生理学的に許容し得る組成物および医薬は、通常の方法で、賦形剤および補助剤を含む１種類以上の生理学的に許容し得る担体を用いて配合することができる。適正な配合は選択される投与経路に依存する。
ここで説明される特定の医薬は、薬学的または生理学的に許容し得る担体および少なくとも１種類の、本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドであるポリペプチドを含む。注射のため、本発明の薬剤を水溶液、好ましくは、生理学的に適合するバッファ、例えば、ハンクス液、リンゲル液、または生理食塩バッファ、例えば、リン酸塩もしくは重炭酸塩バッファ中に処方することができる。経粘膜投与については、浸透させようとする障壁に適する浸透剤が配合物中に用いられる。そのような浸透剤は、一般に、当該技術分野において公知である。
経口摂取することができる薬学的または生理学的に許容し得る調製品には、ゼラチン製のプッシュフィットカプセルに加えて、ゼラチンおよび可塑剤、例えば、グリセロールまたはソルビトールで作製されたソフト密封カプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、充填剤、例えば、ラクトース、結合剤、例えば、デンプン、および／または潤滑剤、例えば、タルクまたはステアリン酸マグネシウム、および任意に、安定化剤と混合された活性成分を含むことができる。ソフトカプセルにおいては、活性化合物を適切な液体、例えば、脂肪油、液体パラフィン、または液体ポリエチレングリコールに溶解または懸濁させることができる。加えて、安定化剤を添加することができる。経口投与のための全ての配合物は、そのような投与に適する投与量であるべきである。
頬投与については、組成物は、通常の方法で配合された錠剤またはロゼンジの形態をとり得る。
吸入による投与については、本発明に従って用いるための化合物は、加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾル噴霧の形態で、適切な気体状噴霧剤、例えば、二酸化炭素を用いて都合よく送達される。加圧エアロゾルの場合、投与単位は、秤量された量を送達するバルブを提供することによって決定することができる。化合物および適切な粉末基剤、例えば、ラクトースまたはデンプンの粉末混合物を含む、吸入器または吹き入れ器において用いるための、例えばゼラチンの、カプセルおよびカートリッジを配合することができる。
これらの化合物は、注入による、例えば、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に配合することができる。注射用の配合物は単位投与形態、例えば、アンプルまたは複数用量容器中に保存剤を添加して提示することができる。それらの組成物は、水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンの形態をとることができ、かつ配合剤、例えば、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤を含むことができる。
非経口投与用の薬学的または生理学的に許容し得る配合物には、水溶性形態の活性化合物の水溶液が含まれる。水性懸濁液はその懸濁液の粘度を高める物質、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含むことができる。任意に、懸濁液は適切な安定化剤または化合物の溶解度を高めて非常に濃縮された溶液の調製を可能にする薬剤を含むことができる。
代わりとして、活性成分は、使用に先立って適切なビヒクル、例えば、無菌発熱物質非含有水で戻すための粉末または凍結乾燥形態でもあってもよい。
前述の配合物に加えて、化合物をデポー調製品として配合することもできる。そのような長期作用性配合物は、移植（例えば、皮下もしくは筋肉内）によって、または筋肉内注射によって投与することができる。したがって、例えば、化合物を適切なポリマーもしくは疎水性材料（例えば、許容し得る油中のエマルジョンとして）もしくはイオン交換樹脂と共に、または可溶性の劣る誘導体、例えば、可溶性の劣る塩として配合することができる。
加えて、徐放系、例えば、治療薬を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを用いて、化合物を誘導体化することができる。様々な徐放材料が確立されており、当該技術分野における熟練者に公知である。徐放カプセルは、それらの化学的性質に依存して、化合物を数週間から１００日を超えるまで放出する。
治療薬の化学的性質および生物学的安定性に依存して、タンパク質安定化の追加の方策を用いることができる。
薬学的または生理学的に許容し得る組成物は適切な固体またはゲル相担体または賦形剤を含むこともできる。そのような担体または賦形剤の例には、これらに限定されるものではないが、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖、デンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、およびポリマー、例えば、ポリエチレングリコールが含まれる。
有効投与量
本発明において用いるための薬学的または生理学的に許容し得る組成物には、活性成分がそれらの意図する目的を達成するの有効な量含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療上有効な量は、治療する被検体の既存の症状の発現を防止するか、またはそれを緩和するのに有効な量を意味する。有効量の決定は、特にはここに提供される詳細な開示に鑑み、当該技術分野における熟練者の能力のうちにある。
本発明の方法において用いられるあらゆる化合物について、最初に細胞培養アッセイから治療上有効な用量を推定することができる。例えば、インビトロ系におけるレプチンまたはリポタンパク質の摂取または結合の増加を示す濃度点または範囲を含むか、または包含する循環濃度範囲を達成する用量を動物モデルにおいて配合することができる。そのような情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するのに用いることができる。
治療上有効な用量は患者における症状の緩和を生じる化合物の量を指す。そのような化合物の毒性および治療効力は、例えばＬＤ５０（試験集団の５０％に対して致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効である用量）を決定するための、細胞培養または実験動物における標準薬学的手順によって決定することができる。毒性および治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０およびＥＤ５０の間の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。
これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータはヒトにおいて用いるための一連の投与量の配合において用いることができる。そのような化合物の投与量は、好ましくは、毒性がほとんどないかもしくは全くない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、この範囲内で、用いられる投与形態および利用される投与形態に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投与量は、個々の医師が患者の状態の観点から選択することができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ等、１９７５，“Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”，Ｃｈ．１参照）。
投与量および間隔は、特定の状況に依存して、体重の減少または増加を維持または防止するのに十分である活性化合物の血漿レベルが得られるように、個別に調整することができる。これらの効果を達成するのに必要な投与量は個々の特徴および投与経路に依存する。
投与間隔も最少有効濃度の値を用いて決定することができる。化合物は、最少有効濃度を上回る血漿レベルをその時間の１０〜９０％、好ましくは３０〜９０％、最も好ましくは５０〜９０％で維持する投与計画を用いて投与するべきである。局所投与または選択的摂取の場合、薬物の有効局所濃度は血漿濃度に関連しなくてもよい。
投与される組成物の量は、もちろん、治療する被検体、被検体の体重、苦しみの重篤度、投与様式および処方医の判断に依存する。
循環血漿トリグリセリドリッチリポタンパク質のレベルの減少を含む所望の結果を達成するために毎日または定期的ベースで投与することができる本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの量の好ましい投与量範囲は、０．０５〜１．０ｍｇ／体重ｋｇの範囲をとる。より好ましい投与量範囲は０．１〜５ｍｇ／ｋｇである。より好ましい用量は０．２５〜２．５ｍｇ／ｋｇである。もちろん、これらの１日投与量は、少量で１日の間に周期的に送達または投与することができる。なお、これらの投与量範囲は単に好ましい範囲であり、本発明に対する制限を意味するのものではない。
ＶＩＩ．治療方法
本発明は、とりわけ、代謝関連疾患および障害の予防または治療方法であって、そのような治療を必要とする個体に本発明のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを提供することを含む方法に向けられる。好ましくは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドはインビトロまたはインビボのいずれかで代謝関連活性を有する。好ましくは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは、好ましくは経口摂取される医薬組成物の状態で個体に提供される。好ましくは、個体は哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。好ましい態様において、代謝関連疾患または障害は、アテローム性動脈硬化、心血管疾患、耐糖能異常、インシュリン耐性、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病および脂肪萎縮性糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとする糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、網膜症、神経障害および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症、高トリグリセリド血症、および高尿酸血症が含まれる。本発明のさらに他の代謝関連疾患または障害には、悪疫質、萎縮病、ＡＩＤＳ関連の体重減少、癌関連の体重減少、新形成関連の体重減少、摂食障害、および過食症が含まれる。好ましい態様において、医薬組成物中のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは美容上の理由で健常個体における体重の調節に用いられる。
本発明は、代謝関連疾患および障害の予防または治療方法であって、そのような治療を必要とする個体に、本発明のアッセイ（本発明の好ましい態様のセクションＶＩおよび実施例において説明される）によって同定される化合物を提供する方法をも特徴とする。好ましくは、これらの化合物は、細胞においてインビトロで、筋肉において生体外で、または動物モデルにおいて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果にアンタゴナイズまたはアゴナイズする。代わりとして、これらの化合物は、レプチンおよび／またはリポタンパク質取り込みおよび／または結合に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果にアゴナイズまたはアンタゴナイズする。任意に、これらの化合物は、インビトロまたはインビボでのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドとＬＳＲとの相互作用、結合、または取込みを防止する。好ましくは、この化合物は、好ましくは経口摂取される医薬組成物の状態で個体に提供される。好ましくは、個体は哺乳動物、最も好ましくはヒトである。好ましい態様において、代謝関連疾患または障害は肥満および代謝関連疾患および障害、例えば、アテローム性動脈硬化、心臓病、インシュリン耐性、高血圧症、脳卒中、Ｘ症候群、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および脂肪萎縮性糖尿病からなる群より選択される。本発明の方法によって治療しようとする糖尿病関連合併症には、微小血管障害性病変、眼の病変、網膜症、神経障害および腎病変が含まれる。心臓病には、これらに限定されるものではないが、心不全、冠不全、および高血圧が含まれる。本発明の化合物によって治療しようとする他の代謝関連障害には、高脂血症、高トリグリセリド血症、および高尿酸血症が含まれる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療との組合せで、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン治療との組合せで、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者において体重を制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、単独でインシュリン治療との組合せなしに、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者において血中グルコースを制御する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、単独でインシュリン治療との組合せなしに、幾らかの個体、特にはＩＩ型糖尿病またはインシュリン耐性を患う者において体重を制御する方法として用いることができる。さらなる好ましい態様においては、体重の制御は、部分的に、または全体的に、（１）皮下脂肪組織および／または（２）内臓（網嚢）脂肪組織の質量の減少による。
さらなる好ましい態様において、本発明は、特に幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者において、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬との組み合わせでそれらの体重またはグルコース制御を改善する補完治療において用いることができる。好ましくは、インシュリン分泌促進物質は１，１−ジメチル−２−（２−モルホリノフェニル）グアニジンフマレート（ＢＴＳ６７５８２）またはトルブタミド、トラザミド、クロルプロパミド、グリベンクラミド、グリメピリド、グリピジドおよびグリダジドから選択されるスルホニル尿素である。好ましくは、インシュリン感作薬はメトホルミン、シグリタゾン、トログリタゾンおよびピオグリタゾンから選択される。
本発明は、単独で、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬なしに、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者の体重またはグルコース制御を改善する方法をさらに提供する。
さらなる好ましい態様において、本発明は、同時に、別々に、または連続的に用いられる、例えば別々の投与単位の形態の、インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬と、付随的または同時のいずれかで投与することができる（分泌促進物質の前後のいずれかまたは感作薬の前後のいずれか）。したがって、本発明は、さらに、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者における体重またはグルコース制御の改善に同時に、別々に、または連続的に用いるための組合せ調製品として、薬学的または生理学的に許容し得る組成物および経口インシュリン分泌促進物質またはインシュリン感作薬の組成物に対する備えがある。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る組成物の本発明は、インシュリン感作薬としての使用方法をさらに提供する。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る本発明は、インシュリン治療と組み合わせて、幾らかの個体、特にはＩ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者においてインシュリン感受性を改善する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る本発明は、インシュリン治療との組み合わなしに、幾らかの個体、特にはＩＩ型糖尿病、またはインシュリン耐性を患う者においてインシュリン感受性を改善する方法として用いることができる。
さらなる好ましい態様において、前記薬学的または生理学的に許容し得る本発明は、耐糖能異常からインシュリン耐性への進行の阻害剤としての使用方法をさらに提供する。
ＶＩＩＩ．ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと相互作用するリガンド
本発明の目的のため、リガンドは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはその断片もしくは変種の１つと結合することが可能であるか、あるいはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変種をコードするポリヌクレオチドの発現を調節することが可能である分子、例えば、タンパク質、ペプチド、抗体またはあらゆる合成化合物を意味する。
本発明によるリガンドスクリーニング方法においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの推定リガンドとして試験しようとする生物学的試料または定義された分子を対応する精製ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、例えば、ここで説明される組換え細胞宿主によって産生される対応精製組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと、このタンパク質と試験しようとする推定リガンド分子との複合体を形成するため、接触させる。
説明例として、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、または配列番号２、４、６、８、１０、および１２からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは１００アミノ酸の連続スパンを含む断片と薬物もしくは小分子、例えば、組合せ化学アプローチによって生成される分子との相互作用を研究するため、Ｗａｎｇ等（１９９７）によって記載されるＨＰＬＣ法と連携する微量透析またはＢｕｓｈ等（１９９７）によって記載されるアフィニティキャピラリ電気泳動法（それらの開示は参照することにより組み込まれる）を用いることができる。
さらなる方法においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、または配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２の配列からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは１００アミノ酸の連続スパンを含む断片と相互作用するペプチド、薬物、脂肪酸、リポタンパク質、または小分子を、以下のようなアッセイを用いて同定することができる。結合について試験しようとする分子を検出可能な標識、例えば、蛍光、放射能、または酵素タグで標識し、固定化ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片と特異的結合を生じさせる条件下で接触させる。非特異的結合分子を除去した後、適切な手段を用いて結合分子を検出する。
様々な候補物質または分子をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドとの相互作用についてアッセイすることができる。これらの物質または分子には、それらに限定することなしに、天然もしくは合成有機化合物または生物学的起源の分子、例えば、ポリペプチドが含まれる。候補物質または分子がポリペプチドを含む場合、このポリペプチドはファージベースの無作為ペプチドライブラリに属するファージクローンの結果としての発現産生物であり得、または代わりとして、そのポリペプチドは２ハイブリッドスクリーニングアッセイの実施に適するベクターにクローン化されたｃＤＮＡライブラリの結果としての発現産生物であり得る。
Ａ．アフィニティクロマトグラフィーによって得られる候補リガンド
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、または配列番号２、４、６、８、１０、および１２の配列からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは１００アミノ酸の連続スパンを含むそれらの断片と相互作用するタンパク質もしくは他の分子は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、もしくはそれらの断片を収容するアフィニティカラムを用いて見出すこともできる。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片は、適切なカラムマトリックス、例えば、アガロース、Ａｆｆｉ Ｇｅｌ（登録商標）、または当該技術分野における熟練者に馴染みの他のマトリックスへの化学カップリングを含む通常の技術を用いてカラムに結合させることができる。この方法の幾つかの態様においては、アフィニティカラムは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片がグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合するキメラタンパク質を収容する。細胞性タンパク質の混合物または上述の発現タンパク質のプールをこのアフィニティカラムに適用する。次に、カラムに結合するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片と相互作用するタンパク質もしくは他の分子を単離し、Ｒａｍｕｎｓｅｎ等（１９９７）（その開示は参照することにより組み込まれる）に記載の２−Ｄ電気泳動ゲルで分析することができる。代わりとして、アフィニティカラム上に保持されるタンパク質を電気泳動ベースの方法によって精製し、配列決定することもできる。同じ方法を、抗体の単離、ファージ呈示産生物のスクリーニング、またはファージ呈示ヒト抗体のスクリーニングに用いることができる。
Ｂ．光学バイオセンサー法によって得られる候補リガンド
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、または配列番号２、４、６、８、１０、もしくは１２の配列からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは１００アミノ酸の連続スパンを含む断片と相互作用するタンパク質は、Ｅｄｗａｒｄｓ ａｎｄ Ｌｅａｔｈｅｒｂａｒｒｏｗ（１９９７）およびＳｚａｂｏ等（１９９５）（それらの開示は参照することにより組み込まれる）に記載の光学センサーを用いることによってスクリーニングすることもできる。この技術は、標識分子の必要性なしに、分子間の相互作用をリアルタイムで検出することを可能にする。この技術は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象に基づく。簡単に述べると、試験しようとする候補リガンド分子を表面（例えば、カルボキシメチルデキストランマトリックス）に結合させる。光線を、試験しようとする試料を含まない側の表面に向け、その表面によって反射させる。ＳＰＲ現象は角度および波長の特定の関連で反射光の強度の減少を生じさせる。候補リガンド分子の結合は表面上の屈折率の変化を生じ、その変化はＳＰＲシグナルの変化として検出される。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片と相互作用することができる候補リガンド分子もしくは物質をスクリーニングするため、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片を表面上に固定する。この表面は、アッセイしようとする候補分子が流動する細胞の一局面を含む。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片上の候補分子の結合をＳＰＲシグナルの変化として検出する。試験する候補分子はタンパク質、ペプチド、炭水化物、脂質、または組合せ化学によって生成される小分子であり得る。光学バイオセンサー法による候補リガンドのスクリーニングは、それらの表面で内在性もしくは組換え発現ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドを示す真核もしくは原核細胞または脂質小胞を固定化することによって行うこともできる。
この方法の主な利点は、それがＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよびＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドと相互作用する分子の間の会合速度の決定を可能にすることである。したがって、強い、または逆に、弱い会合定数により、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド、またはそれらの断片と相互作用するリガンド分子を特異的に選択することが可能である。
Ｃ．２ハイブリッドスクリーニングアッセイによって得られる候補リガンド
酵母２ハイブリッド系はインビボでのタンパク質−タンパク質相互作用を研究するように設計されており（Ｆｉｅｌｄｓ ａｎｄ Ｓｏｎｇ、１９８９）（その開示は参照することによりその全体がここに組み込まれる）、酵母Ｇａｌ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインへのおとりタンパク質の融合に頼る。この技術は米国特許第５，６６７，９７３号および第５，２８３，１７３号にも記載されており、両特許の技術的教示は参照することによりここに組み込まれる。
２ハイブリッドアッセイによるライブラリスクリーニングの一般的な手順は、Ｈａｒｐｅｒ等（１９９３）によって記載されるように、もしくはＣｈｏ等（１９９８）によって記載されるように、またはＦｒｏｍｏｎｔ−Ｒａｃｉｎｅ等（１９９７）によっても記載されるように行うことができ、これらの開示は参照することによりそれらの全体がここに組み込まれる。
おとりタンパク質またはポチペプチドは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたは配列番号２、４、６、８、１０、および１２の配列からなる群より選択されるポリペプチドの少なくとも６アミノ酸、好ましくは少なくとも８〜１０アミノ酸、より好ましくは少なくとも１２、１５、２０、２５、３０、４０、５０、もしくは１００アミノ酸の連続スパンを含むそれらの断片を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
より正確には、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変種がＧＡＬ４タンパク質のＤＮＡ結合ドメインをコードするポリヌクレオチドに融合しており、その融合ヌクレオチド配列が適切な発現ベクター、例えば、ｐＡＳ２もしくはｐＭ３に挿入されている。
次に、ヒトｃＤＮＡライブラリを、そのヒトｃＤＮＡインサートがＧＡＬ４タンパク質の転写ドメインをコードするベクター内のヌクレオチド配列に融合するように、特別に設計されたベクター内で構築する。好ましくは、用いられるベクターはｐＡＣＴベクターである。ヒトｃＤＮＡライブラリのヌクレオチドインサートによってコードされるポリペプチドは「餌」ポリペプチドと呼ばれる。
第３のベクターは検出可能なマーカー遺伝子、例えば、転写活性化ドメインおよびＤＮＡ結合ドメインの両方を含む完全Ｇａｌ４タンパク質の結合に応答する調節配列の制御下に置かれるベータガラクトシダーゼ遺伝子またはＣＡＴ遺伝子を含む。例えば、ベクターｐＧ５ＥＣを用いることができる。
２種類の異なる酵母株も用いられる。説明的ではあるが非限定的な例として、２種類の異なる酵母株は以下のものであり得る。
Ｙ１９０：その表現型は（ＭＡＴａ、Ｌｅｕ２−３、１１２ ｕｒａ３−１２、ｔｒｐ１−９０１、ｈｉｓ３−Ｄ２００、ａｄｅ２−１０１、ｇａｌ４Ｄｇａｌ１８０Ｄ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ＬａｃＺ、ＬＹＳ ＧＡＬ−ＨＩＳ３、ｃｙｈr）である。
Ｙ１８７：その表現型は（ＭＡＴａ ｇａｌ４ ｇａｌ８０ ｈｉｓ３ ｔｒｐ１−９０１ ａｄｅ２−１０１ ｕｒａ３−５２ ｌｅｕ２−３、−１１２ ＵＲＡ３ ＧＡＬ−ｌａｃＺｍｅｔ-）であり、Ｙ１９０の逆接合型である。
簡単に述べると、２０μｇのｐＡＳ２／ＧＭＧ−７Ａ、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−７Ｂ、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−８、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−９、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−１０、またはｐＡＳ２／ＧＭＧ−１１および２０μｇのｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリを酵母株Ｙ１９０に同時形質転換する。それらの形質転換体を、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンを欠くがヒスチジン合成阻害剤３−ＡＴ（５０ｍＭ）を含有する無機培地上での成長について選択する。陽性コロニーを、フィルターリフトアッセイによってベータガラクトシダーゼについてスクリーニングする。次に、二重陽性コロニー（Ｈｉｓ+、ｂｅｔａ−ｇａｌ+）を、ヒスチジン、ロイシンを欠くがトリプトファンおよびシクロヘキシミド（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有するプレート上で成長させ、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−７Ａ、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−７Ｂ、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−８、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−９、ｐＡＳ２／ＧＭＧ−１０、またはｐＡＳ２／ＧＭＧ−１１プラスミドの喪失およびｐＡＣＴ−ｃＤＮＡライブラリプラスミドの保持について選択する。Ｈａｒｐｅｒ等（１９９３）およびＢｒａｍ等（１９９３）（これらの開示は参照することによりそれらの全体がここに組み込まれる）によって記載されるＧａｌ４融合体として、得られたＹ１９０株をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１または無関係対照ポリペプチド、例えば、シクロフィリンＢ、ラミン、もしくはＳＮＦ１を発現するＹ１８７株と接合させ、フィルターリフトアッセイによってベータガラクトシダーゼについてスクリーニングする。対照Ｇａｌ４融合体との接合の後にｂｅｔａ ｇａｌ-である酵母クローンは偽陽性と考えられる。
本発明による２ハイブリッド法の別の態様においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの断片もしくは変種と細胞性タンパク質との相互作用を、Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ Ｔｗｏ Ｈｙｂｒｉｄ Ｓｙｓｔｅｍ ２（カタログ番号Ｋ１６０４−１、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いて評価することができる。そのキットに添付されるマニュアル（その開示は参照することによりここに組み込まれる）に説明されるように、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの一部をコードする核酸を、それらが酵母転写活性化因子ＧＡＬ４のＤＮＡ結合ドメインをコードするＤＮＡとインフレームになるように発現ベクターに挿入する。所望のｃＤＮＡ、好ましくはヒトｃＤＮＡを、それらがＧＡＬ４の活性化ドメインをコードするＤＮＡとインフレームとなるように第２発現ベクターに挿入する。これら２つの発現プラスミドで酵母を形質転換し、その酵母を、発現ベクターの各々の選択可能マーカーの発現に加えてＨＩＳ３遺伝子のＧＡＬ４依存性発現を選択する選択培地上に置く。ヒスチジンを欠く培地上で成長可能な形質転換体をＧＡＬ４依存性ｌａｃＺ発現についてスクリーニングする。ヒスチジン選択およびｌａｃＺアッセイの両方において陽性である細胞がＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドと最初に選択されたｃＤＮＡインサートによってコードされるタンパク質またはペプチドとの相互作用を含む。
ＩＸ．ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性の調節因子を同定するためのアッセイ
本発明は、細胞中のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１の活性を調節する１以上の化合物についてスクリーニングする方法であって、試験しようとする潜在的化合物を細胞に提供することを含む方法を特徴とする。用いることができる例示的アッセイは実施例セクションにおいて説明される。これらのアッセイに、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独の効果と比較したそれらの阻害または刺激活性について試験しようとする化合物を加える。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドの添加に基づいて効果を観察する他のアッセイを、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性の調節またはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドの細胞上での存在に対する効果についてのスクリーニングに用いることもできる。必須工程は、未知化合物を適用した後、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのみを細胞に適用したときに見られるものからの変化についてのアッセイを監視することである。変化は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独と比較して、その化合物に加えてＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在下において有意に異なるものと定義される。この場合、有意に異なるとは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％の測定可能な効果における「増加」または「減少」である。
「調節」という用語は、ここで用いられる場合、活性の測定可能な変化を指す。例としては、これらに限定されるものではないが、脂肪分解刺激受容体（ＬＳＲ）調節、レプチン調節、リポタンパク質調節、血漿ＦＦＡレベル、ＦＦＡ酸化、ＴＧレベル、グルコースレベル、および体重が含まれる。これらの効果はインビトロ、または好ましくは、インビボであり得る。活性の調節は活性の増加または減少のいずれかであり得る。したがって、ＬＳＲ活性は増減することがあり得、レプチン活性は増減することがあり得、およびリポタンパク質活性は増減することがあり得る。同様に、ＦＦＡ、ＴＧ、グルコースレベルおよび体重はインビボで増加または減少することあり得る。遊離脂肪酸酸化はインビボまたは生体外で増減することがあり得る。
「ＬＳＲ」活性が意味するところは、細胞表面上での、もしくは特定の立体配座でのＬＳＲの発現に加えて、レプチンおよびリポタンパク質を結合、取込み、および分解するその能力である。「レプチン」活性が意味するところは、ＬＳＲによるその結合、取込みおよび分解に加えて、血液脳関門を横切るその輸送、および潜在的に、ＬＳＲが必ずしも介在因子ではないか、もしくは唯一の介在因子ではないこれらの出現である。同様に、「リポタンパク質」活性が意味するところは、ＬＳＲによるその結合、取込みおよび分解の他に、ＬＳＲが必ずしも介在因子ではないか、または唯一の介在因子ではないこれらの出現である。例示的アッセイは実施例において示される。これらのアッセイおよび他の匹敵するアッセイを、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性を調節する化合物の決定／同定に用いることができる。幾つかの場合においては、好ましくは全ての活性が改変されるが、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド活性の全てではなく幾らかを調節する化合物の同定が重要であり得る。
「増加する」という用語は、ここで用いられる場合、それが存在しない状態でのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果と比較して、幾つかの測定可能な方法においてＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの活性を増加させる化合物の能力を指す。この化合物の存在の結果として、例えば、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独の存在下における対照と比較して、レプチン結合および／または取込みが増加する。好ましくは、活性の増加は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在下における活性のレベルと比較して、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％である。好ましくは、限定されることを意図するものではないが、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドはＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含むＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片である。
同様に、「減少する」という用語は、ここで用いられる場合、それが存在しない状態でのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果と比較して、幾つかの測定可能な方法において活性を減少させる化合物の能力を指す。例えば、化合物の存在は、マウスにおけるＦＦＡ、ＴＧ、およびグルコースの血漿濃度を減少させる。また、化合物の存在の結果として、例えば、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独の存在下における対照と比較して、レプチン結合および／または取込みが減少する。好ましくは、活性の減少は、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独の存在下における活性のレベルと比較して、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％である。好ましくは、限定されることを意図するものではないが、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドはＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含むＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片である。
本発明は、体重の減少を必要とする個体において体重を減少させる潜在的な化合物を同定するための方法であって、（ａ）細胞をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよび候補化合物と接触させることと、（ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、グルコース取込みもしくは酸化の増加、血中脂質もしくはトリグリセリドレベルの減少、リポタンパク質結合、取込みもしくは分解の増加、ＦＦＡ酸化の増加からなる群より選択される結果を検出することと、（ｃ）前記結果が前記細胞をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独と接触させるときの前記結果と異なる場合、前記結果が前記潜在的化合物を同定することとを含む方法を特徴とする。
代わりとして、本発明は、体重の増加を必要とする個体において体重を増加させる潜在的な化合物を同定するための方法であって、（ａ）細胞をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよび候補化合物と接触させることと、（ｂ）ＬＳＲ調節、レプチン調節、グルコース取込みもしくは酸化の減少、血中脂質もしくはトリグリセリドレベルの増加、リポタンパク質結合、取込みもしくは分解の減少、ＦＦＡ酸化の減少からなる群より選択される結果を検出することと、（ｃ）前記結果が前記細胞をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド単独と接触させるときの前記結果と異なる場合、前記結果が前記潜在的化合物を同定することとを含む方法を特徴とする。
さらに他の好ましい態様において、前記潜在的化合物は、ペプチド、ペプチドライブラリ、非ペプチドライブラリ、ペプトイド、脂肪酸、リポタンパク質、医薬、抗体、小分子、プロテアーゼおよびプロテアーゼ阻害剤からなる群より選択される。
Ｘ．エピトープおよび抗体融合
本発明の好ましい態様はエピトープ担持ポリペプチドおよびエピトープ担持ポリペプチド断片に向けられる。これらのエピトープは「抗原性エピトープ」または「抗原性エピトープ」および「免疫原性エピトープ」の両方であり得る。「免疫原性エピトープ」はタンパク質の一部であって、そのポリペプチドが免疫原であるときにインビボで抗体応答を誘起するタンパク質の一部と定義される。他方、抗体が結合するポリペプチドの領域は「抗原性決定基」または「抗原性エピトープ」と定義される。タンパク質の免疫原性エピトープの数は、一般に、抗原性エピトープの数より少ない。例えば、Ｇｅｙｓｅｎ等（１９８３）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８１：３９９８４００２を参照のこと。なお、特定のエピトープが免疫原性ではない可能性もあるが、それでもあらゆるエピトープに対する抗体をインビトロで作製できるためそれは有用である。
エピトープは僅か３つのアミノ酸をそのエピトープに独自の空間配座で含むことができる。一般には、エピトープは少なくとも６個のそのようなアミノ酸、より頻繁には少なくとも８〜１０個のそのようなアミノ酸からなる。好ましい態様において、抗原性エピトープは３〜５０のいずれかの整数である幾つかのアミノ酸を含む。エピトープとして機能する断片はあらゆる通常の手段によって産生させることができる。例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，Ｒ．Ａ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２：５１３１−５１３５（１９８５）を参照のこと。さらに米国特許第４，６３１，２１１号に記載される。免疫原性エピトープを構成するアミノ酸を決定するための方法には、Ｘ線結晶学、二次元核磁気共鳴、およびエピトープマッピング、例えば、Ｈ．Ｍａｒｉｏ Ｇｅｙｓｅｎ等（１９８４）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：３９９８−４００２、ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５６４号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号に記載のＰｅｐｓｃａｎ法が含まれる。別の例は、Ｊａｍｅｓｏｎ ａｎｄ Ｗｏｌｆ，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．４：１８１−１８６（１９８８）のアルゴリズムである（これらの参考文献は参照することによりそれらの全体が組み込まれる）。Ｊａｍｅｓｏｎ−Ｗｏｌｆ抗原性分析は、例えば、コンピュータプログラムＰＲＯＴＥＡＮをデフォルトパラメータで用いて行うことができる（Ｖｅｒｓｉｏｎ ４．０ Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、ＤＮＡＳＴＡＲ、Ｉｎｃ．、１２２８ Ｓｏｕｔｈ Ｐａｒｋ Ｓｔｒｅｅｔ Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。
本発明のエピトープ担持断片は、好ましくは、本発明のポリペプチドの６〜５０アミノ酸（すなわち、包括的に６〜５０のあらゆる整数）を含む。６と配列表の完全長配列の整数との間にある抗原性断片も本発明に含まれる。６と本発明のポリペプチドの完全長配列の整数との間にある配列の全ての組合せが含まれる。エピトープ担持断片は、本発明のポリペプチド断片について上述されるように、連続するアミノ酸残基の数（亜属として）または具体的なＮ末端およびＣ末端位置（種として）のいずれかによって指定することができる。本発明のあらゆる数のエピトープ担持断片を同じ方法で排除することもできる。
抗原性エピトープは、例えば、そのエピトープを特異的に結合するモノクローナル抗体を含む抗体の産生に有用である（Ｗｉｌｓｏｎ等、１９８４；およびＳｕｔｃｌｉｆｆｅ，Ｊ．Ｇ．等、１９８３参照）。これらの抗体は、次に、様々な技術、例えば、ここで説明されるような診断および組織／細胞同定技術において、並びに精製法において用いられる。
同様に、免疫原性エピトープは当該技術分野において公知の方法による抗体の誘導に用いることができる（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、前出、Ｗｉｌｓｏｎ等、前出、Ｃｈｏｗ，Ｍ．等；（１９８５）およびＢｉｔｔｌｅ，Ｆ．Ｊ．等、（１９８５）参照）。好ましい免疫原性エピトープには配列表のポリペプチドが含まれる。免疫原性エピトープは、必要であれば、担体タンパク質、例えば、アルブミンと共に動物系（例えば、ウサギまたはマウス）に提示することができる。僅かに８〜１０アミノ酸を含む免疫原性エピトープが、少なくとも変性ポリペプチド中の直鎖エピトープに結合することが可能な抗体を産生するのに十分であることが示されている（例えば、ウェスタンブロットにおいて）。
本発明のエピトープ担持ポリペプチドは、インビボ免疫化、インビトロ免疫化、およびファージ呈示法を含むがこれらに限定されるものではない、当該技術分野において公知の方法による抗体の産生に用いられる（例えば、Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ等、前出、Ｗｉｌｓｏｎ等、前出、およびＢｉｔｔｌｅ等、１９８５参照）。インビボ免疫化が用いられる場合、動物を遊離ペプチドで免役することができる。しかしながら、ペプチドを巨大分子担体、例えば、キーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）または破傷風トキソイドにカップリングさせることにより、抗ペプチド抗体力価を高めることができる。例えば、システイン残基を含むペプチドをリンカー、例えば、−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）を用いて担体にカップリングさせることができ、それに対して、他のペプチドはより一般的な連結剤、例えば、グルタルアルデヒドを用いて担体にカップリングさせることができる。動物、例えば、ウサギ、ラットおよびマウスは、遊離もしくは担体結合ペプチドのいずれかで、例えば、約１００μｇのペプチドもしくは担体タンパク質およびフロイントのアジュバントを含有するエマルジョンを腹腔内および／または皮内注射することによって免役する。幾らかの追加免疫注射が、例えば、約２週間の間隔で、抗ペプチド抗体の有用な力価を提供するのに必要となることがあり、それは、例えば、固体表面に吸着された遊離ペプチドを用いるＥＬＩＳＡアッセイによって検出することができる。免疫動物からの血清中の抗ペプチド抗体の力価は、例えば、当該技術分野において公知の方法による固体支持体上のペプチドへの吸着および選択された抗体の溶出による、抗ペプチド抗体の選択によって高めることができる。
当該技術分野における熟練者が認め、かつ上述のように、免疫原性または抗原性エピトープを含むがこれらに限定されるものではない本発明のポリペプチドを異種ポリペプチド配列に融合させることができる。例えば、本発明のポリペプチドを、免疫グロブリン（ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ）の定常領域含有部分、または定常領域の一部（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ドメイン全体およびそれらの一部の両方を含むそれらのあらゆる組合せ）と融合させることができ、これはキメラペプチドを生じる。これらの融合タンパク質は精製を容易にし、インビボでの半減期の増加を示す。これは、例えば、ヒトＣＤ４−ポリペプチドの最初の２つのドメインおよび哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の様々なドメインからなるキメラタンパク質について示されている（例えば、欧州特許公報第０，３９４，８２７号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ等、１９８８参照）。ＩｇＧ部分のためにジスルフィド連結二量体構造を有する融合タンパク質は、それらの単量体ポリペプチドもしくは断片単独よりも、他の分子の結合および中和においてより効率的でもあり得る（例えば、Ｆｏｕｎｔｏｕｌａｋｉｓ等、１９９５参照）。上記エピトープをコードする核酸をエピトープタグとして関心遺伝子と組み換え、発現ポリペプチドの検出および精製を補助することができる。
遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、またはコドンシャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」と呼ぶ）の技術により本発明のさらなる融合タンパク質を産生することができる。ＤＮＡシャッフリングは、本発明のポリペプチドの活性を調節し、それによりそれらのポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストを効率的に産生させるのに用いることができる。例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３４，２５２号、第５，８３７，４５８号、並びにＰａｔｔｅｎ、Ｐ．Ａ．等、（１９９７）、Ｈａｒａｙａｍａ，Ｓ．、（１９９８）、Ｈａｎｓｓｏｎ，Ｌ．Ｏ．等（１９９９）、およびＬｏｒｅｎｚｏ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，Ｒ．、（１９９８）を参照のこと（これらの文書の各々は参照することによりここに組み込まれる）。一態様においては、本発明のコーディングポリヌクレオチド、またはそれらによってコードされるポリペプチドの１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片等を１種類以上の異種分子の１つ以上の成分、モチーフ、切片、部分、ドメイン、断片等と組換えることができる。
抗体
本発明は、さらに、本発明のポリペプチド、より具体的には、本発明のポリペプチドのエピトープを特異的に結合する抗体およびＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）に関する。本発明の抗体には、ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹが含まれる。ここで用いられる場合、「抗体」（Ａｂ）という用語は、一本鎖全抗体を含む全抗体、およびそれらの抗原結合性断片を含むものである。好ましい態様においては、これらの抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）並びにＶLもしくはＶHドメインのいずれかを含む断片を含むがこれらに限定されるものではない、本発明のヒト抗原結合性抗体断片である。これらの抗体は、トリおよび哺乳動物を含むあらゆる動物起源のものであり得る。好ましくは、これらの抗体はヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリである。
一本鎖抗体を含む抗原結合性抗体断片は可変領域（１つもしくは複数）を単独で、または以下のものの全体もしくは一部との組合せで含むことができる。ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメイン。本発明にさらに含まれるのは、可変領域（１つもしくは複数）と、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインとのあらゆる組合せである。本発明は、さらに、本発明のポリペプチドを特異的に結合するキメラ、ヒト化、並びにヒトモノクローナルおよびポリクローナル抗体を含む。本発明は、さらに、本発明の抗体に対して抗イディオタイプである抗体を含む。
本発明の抗体は単特異的、二特異的、三特異的であり得、またはより多くの多特異性を有することができる。多特異的抗体は本発明のポリペプチドの異なるエピトープに特異的であり得、または本発明のポリペプチドに加えて異種組成物、例えば、異種ポリペプチドもしくは固体支持物質の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Ｔｕｔｔ，Ａ．等（１９９１）、米国特許第５，５７３，９２０号、第４，４７４，８９３号、第５，６０１，８１９号、第４，７１４，６８１号、第４，９２５，６４８号、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．等（１９９２）を参照のこと。
本発明の抗体は、その抗体によって認識されるか、またはその抗体が特異的に結合する、本発明のポリペプチドのエピトープ（１つもしくは複数）またはエピトープ担持部分（１つもしくは複数）の観点から説明または指定することができる。本発明の分泌タンパク質のタンパク質の場合、抗体は本発明の核酸によってコードされる完全長タンパク質、本発明の核酸によってコードされる成熟タンパク質（すなわち、シグナルペプチドの開裂によって生じるタンパク質）、本発明の核酸によってコードされるシグナルペプチド、または本発明の他のあらゆるポリペプチドを特異的に結合することができる。したがって、エピトープ（１つもしくは複数）またはエピトープ担持ポリペプチド部分（１つもしくは複数）は、ここで説明されるように、例えば、Ｎ末端およびＣ末端位置、連続するアミノ酸残基のサイズ、またはここで説明される他の方法によって指定することができる。本発明のあらゆるエピトープまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体は個々の種として排除することもできる。したがって、本発明は、本発明の指定されたポリペプチドを特異的に結合する抗体を含み、かつその排除も考慮する。
本発明の抗体は、それらの交差反応性の観点から説明または指定することもできる。本発明のポリペプチドの他のあらゆる類似体、オルトログ、または相同体を特異的に結合しない抗体が含まれる。本発明のポリペプチドに対する同一性が９５％未満、９０％未満、８５％未満、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、および５０％未満（当該技術分野において公知であり、かつここで説明される方法を用いて、例えば、ＦＡＳＴＤＢおよびここに記載されるパラメータを用いて算出される）であるポリペプチドを結合しない抗体も本発明に含まれる。本発明のポリヌクレオチドと（ここで説明される）厳密なハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのみに結合する抗体が本発明にさらに含まれる。本発明の抗体は、それらの結合アフィニティの観点から説明または指定することもできる。好ましい結合アフィニティには、５×１０-6Ｍ、１０-6Ｍ、５×１０-7Ｍ、１０-7Ｍ、５×１０-8Ｍ、１０-8Ｍ、５×１０-9Ｍ、１０-9Ｍ、５×１０-10Ｍ、１０-10Ｍ、５×１０-11Ｍ、１０-11Ｍ、５×１０-12Ｍ、１０-12Ｍ、５×１０-13Ｍ、１０-13Ｍ、５×１０-14Ｍ、１０-14Ｍ、５×１０-15Ｍ、および１０-15Ｍ未満の解離定数またはＫｄ値を有するものが含まれる。
本発明の抗体は、これらに限定されるものではないが、インビトロおよびインビボ診断および治療方法の両方を含む、本発明のポリペプチドを精製、検出、および標的化する当該技術分野において公知の方法を含む用途を有する。例えば、これらの抗体は、生物学的試料における本発明のポリペプチドのレベルを定性的および定量的に測定するためのイムノアッセイにおける用途を有する（例えば、Ｈａｒｌｏｗ等、１９８８参照）。
本発明の抗体は単独で、または他の組成物と組み合わせて用いることができる。これらの抗体は、異種ポリペプチドにＮもしくはＣ末端で組換え的に融合することができ、またはポリペプチドもしくは他の組成物に化学的に結合（共有および非共有結合を含む）することができる。例えば、本発明の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用な分子およびエフェクタ分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物もしくは毒素に組換え的に融合または結合することができる。例えば、ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号、欧州特許第０３９６３８７を参照のこと。
本発明の抗体は当該技術分野において公知のあらゆる適切な方法によって調製することができる。例えば、ポリクローナル抗体を含有する血清の産生を誘導するため、本発明のポリペプチドまたはそれらの抗原性断片を動物に投与することができる。「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。「抗体」という用語は、少なくとも１つの結合ドメインを含んでなるポリペプチドまたはポリペプチドの群を指し、ここで、結合ドメインは、抗原の抗原性決定基の特徴に相補的な、内表面形状との三次元結合空間および電荷分布が形成されるような抗体分子の可変ドメインの折り畳みから形成され、これは抗原との免疫学的反応を可能にする。「モノクローナル抗体」という用語は、真核、原核、もしくはファージクローンを含む単一のクローンから誘導される抗体を指し、それを産生する方法ではない。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換体、およびファージ呈示技術の使用を含む当該技術分野において公知の様々な技術を用いて調製することができる。
ハイブリドーマ技術は当該技術分野において公知のものを含む（例えば、Ｈａｒｌｏｗ等、１９８８、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ等、１９８１）（前記参考文献は参照することによりそれら全体が組み込まれる）。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、ハイブリドーマ産生抗体から、酵素、例えば、パパイン（Ｆａｂ断片を産生）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生）を用いるタンパク分解性開裂によって産生させることができる。
代わりとして、本発明の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用により、または当該技術分野において公知の方法を用いる化学合成により産生させることができる。例えば、本発明の抗体は、当該技術分野において公知の様々なファージ呈示法を用いて調製することができる。ファージ呈示法においては、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を担持するファージ粒子の表面上に呈示される。所望の結合特性を有するファージを、レパートリーまたは組合せ抗体ライブラリ（例えば、ヒトまたはマウス）から、抗原、典型的には、固体表面またはビーズに結合または補足されている抗原を用いて直接選択することによって選択する。これらの方法において用いられるファージは、典型的には、ファージ遺伝子ＩＩＩもしくは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換え的に融合するＦａｂ、Ｆｖもしくはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む糸状ファージである。本発明の抗体の作製に用いることができるファージ呈示法の例には、Ｂｒｉｎｋｍａｎ Ｕ．等（１９９５）、Ａｍｅｓ， Ｒ．Ｓ．等（１９９５）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．等（１９９４）、Ｐｅｒｓｉｃ，Ｌ．等（１９９７）、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．等（１９９４）、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４、ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、並びに米国特許５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号および第５，７３３，７４３号に開示されるものが含まれる。
上記参考文献に開示されるように、ファージ選択の後、抗体コーディング領域をファージから単離し、ヒト抗体を含む全抗体または他のあらゆる所望の抗原結合性断片の産生に用い、かつ哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含むあらゆる所望の宿主において発現させることができる。例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片を組換え的に産生する技術を、当該技術分野において公知の方法、例えば、ＷＯ９２／２２３２４、Ｍｕｌｌｉｎａｘ，Ｒ．Ｌ．等（１９９２）、およびＳａｗａｉ，Ｈ．等（１９９５）、およびＢｅｔｔｅｒ，Ｍ．等（１９８８）に開示されるものを用いて利用することもできる。
一本鎖Ｆｖおよび抗体を産生するのに用いることができる技術の例には、米国特許第４，９４６，７７８号および第５，２５８，４９８号、Ｈｕｓｔｏｎ等（１９９１）、Ｓｈｕ，Ｌ．等（１９９３）、並びにＳｋｅｒｒａ，Ａ．等（１９８８）に開示されるものが含まれる。ヒトにおける抗体のインビボ使用およびインビトロ検出アッセイを含む幾つかの用途については、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を用いることが好ましいものであり得る。キメラ抗体の産生方法は当該技術分野において公知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ、（１９８５）、Ｏｉ等、（１９８６）、Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．等（１９８９）、および米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと。ＣＤＲ−グラフト化（欧州特許第０２３９４００号、ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，５３０，１０１号、および第５，５８５，０８９号）、ベニヤリングおよびリサーフェーシング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ ｏｒ ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第０５９２１０６号、欧州特許第０５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ Ｅ．Ａ．、１９９１、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ Ｇ．Ｍ．等、１９９４、Ｒｏｇｕｓｋａ Ｍ．Ａ．等、１９９４）、並びに鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む様々な技術を用いて抗体をヒト化することができる。ヒト化抗体は、上記ファージ呈示法を含む、当該技術分野において公知の様々な方法によって作製することができる。米国特許第４，４４４，８８７号、第４，７１６，１１１号、第５，５４５，８０６号、および第５，８１４，３１８号、ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、並びにＷＯ９１／１０７４１も参照のこと。
本発明のポリペプチドに組換え的に融合または化学的に結合（共有および非共有結合を含む）されている抗体がさらに本発明に含まれる。これらの抗体は本発明のポリペプチド以外の抗原に特異的であり得る。例えば、抗体を、本発明のポリペプチドを特定の細胞表面受容体に特異的な抗体に融合または結合させることにより、インビボまたはインビトロのいずれかで、特定の細胞型を本発明のポリペプチドの標的とするのに用いることができる。本発明のポリペプチドに融合または結合している抗体は、インビトロイムノアッセイおよび当該技術分野において公知の方法を用いる精製方法において用いることもできる（例えば、Ｈａｒｂｏｒ等、前出、ＷＯ９３／２１２３２；欧州特許第０４３９０９５号、Ｎａｒａｍｕｒａ，Ｍ．等、１９９４、米国特許第５，４７４，９８１号、Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｏ．等、１９９２、Ｆｅｌｌ，Ｈ．Ｐ．等、１９９１）。
本発明は、さらに、可変領域以外の抗体ドメインに融合または結合する本発明のポリペプチドを含有する組成物を含む。例えば、本発明のポリペプチドを抗体Ｆｃ領域、またはそれらの一部に融合または結合させることができる。本発明のポリペプチドに融合する抗体部分は、ヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインまたは全ドメインもしくはそれらの部分のあらゆる組合せを含むことができる。ポリペプチドのインビボ半減期を増加させるため、または当該技術分野において公知の方法を用いるイムノアッセイにおいて用いるため、本発明のポリペプチドを上記抗体部分に融合または結合させることができる。ポリペプチドを上記抗体部分に融合または結合させて多量体を形成することもできる。例えば、本発明のポリペプチドに融合するＦｃ部分は、Ｆｃ部分間のジスルフィド結合により、二量体を形成することができる。より高次の多量体形態は、ポリペプチドをＩｇＡおよびＩｇＭの一部に融合させることによって作製することができる。本発明のポリペプチドを抗体部分に融合または結合させるための方法は当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第５，３３６，６０３号、第５，６２２，９２９号、第５，３５９，０４６号、第５，３４９，０５３号、第５，４４７，８５１号、第５，１１２，９４６号、欧州特許第０３０７４３４号、欧州特許第０３６７１６６、ＷＯ９６／０４３８８、ＷＯ９１／０６５７０、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ，Ａ．等（１９９１）、Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．Ｘ．等（１９９５）；およびＶｉｌ，Ｈ．等（１９９２）を参照のこと。
本発明は、さらに、本発明のポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストとして作用する抗体に関する。例えば、本発明は、本発明のポリペプチドとの受容体／リガンド相互作用を部分的に、または完全に破壊する抗体を含む。受容体特異的抗体およびリガンド特異的抗体の両方が含まれる。リガンド結合は妨げないが受容体活性化は妨げる受容体特異的抗体が含まれる。受容体活性化（すなわち、シグナル伝達）はここで説明される技術または当該技術分野において公知の他の方法によって決定することができる。リガンド結合および受容体活性化の両方を妨げる受容体特異的抗体も含まれる。同様に、リガンドを結合してそのリガンドの受容体への結合を妨げる中和抗体に加えて、リガンドを結合し、それにより受容体活性を妨げるが、リガンドの受容体結合を妨げることのない抗体が含まれる。さらに、受容体を活性化する抗体が含まれる。これらの抗体は、リガンド介在受容体活性化によって影響を受ける生物学的活性の全てまたは全て未満のいずれかに対するアゴニストとして作用し得る。これらの抗体は、ここで説明される特異的活性を含む生物学的活性に対するアゴニストまたはアンタゴニストとして指定することができる。上記抗体アゴニストは当該技術分野において公知の方法を用いて作製することができる。例えば、ＷＯ９６／４０２８１、米国特許第５，８１１，０９７号、Ｄｅｎｇ，Ｂ．等（１９９８）、Ｃｈｅｎ，Ｚ．等（１９９８）、Ｈａｒｒｏｐ，Ｊ．Ａ．等（１９９８）、Ｚｈｕ，Ｚ．等（１９９８）、Ｙｏｏｎ，Ｄ．Ｙ．等（１９９８）、Ｐｒａｔ，Ｍ．等（１９９８）Ｊ．、Ｐｉｔａｒｄ，Ｖ．等（１９９７）、Ｌｉａｕｔａｒｄ，Ｊ．等（１９９７）、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎ．Ｇ．等（１９９７）Ｊ．、Ｔａｒｙｍａｎ，Ｒ．Ｅ．等（１９９５）、Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．等（１９９８）、Ｂａｒｔｕｎｅｋ，Ｐ．等（１９９６）を参照のこと。
上述したように、本発明のポリペプチドの抗体は、次に、当該技術分野における熟練者に公知の技術を用いて、本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するのに利用することができる（例えば、ＧｒｅｅｎｓｐａｎおよびＢｏｎａ（１９８９）、並びにＮｉｓｓｉｎｏｆｆ（１９９１）参照）。例えば、ポリペプチド多量体化に結合して競合的に阻害するか、または本発明のポリペプチドのリガンドへの結合を阻害する抗体を、ポリペプチド多量体化または結合ドメインを「模倣し」、結果として、ポリペプチドまたはそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプの産生に用いることができる。そのような中和抗イディオタイプ抗体は、本発明のポリペプチドの結合またはそのリガンド／受容体の結合に用いることができ、それによりその生物学的活性を遮断することができる。
本発明は、本発明の突然変異完全長もしくは成熟ポリペプチドまたは突然変異ポリペプチドのエピトープを含むそれらの断片もしくは変種に特異的に結合することができる精製もしくは単離抗体にも関する。別の好ましい態様において、本発明は、本発明のポリペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸を含み、かつ突然変異を生じる特性によってコードされ得る少なくとも１つのアミノ酸を含むポリペプチドに結合することが可能な抗体に関する。
野生型であろうとトランスジェニックであろうと、抗体の結合が望まれるものとは異なる本発明のポリペプチドの種を発現する非ヒト動物もしくは哺乳動物および本発明のポリペプチドを発現しない動物（すなわち、ノックアウト動物）は、抗体の調製に特に有用である。遺伝子ノックアウト動物は本発明のポリペプチドの露出部分の全てまたはほとんどを外来抗原として認識し、したがって、より広いエピトープ列で抗体を産生する。さらに、僅かに１０〜３０のアミノ酸を有するより小さいポリペプチドは、本発明のポリペプチドのいずれか１つへの特異的結合を獲得する上で有用であり得る。加えて、抗原性配列に類似する本発明のポリペプチドの種を産生する動物の液性免疫系は、その動物固有のポリペプチド種と抗原配列との相違を優先的に認識し、その抗原配列におけるこれらの独自部位に対する抗体を産生する。そのような技術は、本発明のポリペプチドのいずれか１つに特異的に結合する抗体を得る上で特に有用である。
いずれかのプロトコルで調製される抗体調製品は、生物学的試料中の抗原担持物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である。それらは、生物学的試料における抗原の存在の同定にも半定性的または定性的に用いられる。これらの抗体は、そのタンパク質を発現する細胞を殺すか、または体内のタンパク質のレベルを低下させるための治療用組成物において用いることもできる。
本発明の抗体は、当該技術分野において公知の放射性、蛍光または酵素標識のいずれか１つによって標識することができる。
したがって、本発明は、生物学的試料における本発明による本発明のポリペプチドの存在を特異的に検出するための方法であって、以下の工程を含む方法にも向けられる。
ａ）本発明のポリペプチドを含むことが疑われる生物学的試料を得る工程。
ｂ）生物学的試料を、抗原−抗体結合に適する条件下で、本発明のポリペプチドを特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体と接触させる工程。
ｃ）形成される抗原−抗体複合体を検出する工程。
本発明は、生物学的試料における本発明のポリペプチドの存在をインビトロで検出するための診断キットであって、
ａ）任意に標識される、本発明のポリペプチドを特異的に結合するポリクローナルまたはモノクローナル抗体、および
ｂ）形成される抗原−抗体複合体の検出を可能にする試薬であって、特に上記モノクローナルまたはポリクローナル抗体がそれ自体標識されていない場合、任意に標識を担持するか、または標識試薬によってそれ自体が認識され得るものである試薬
を含むキットに関する。
Ａ．ハイブリドーマ融合によるモノクローナル抗体産生
説明されるように同定および単離されるペプチドのいずれかのエピトープに対するモノクローナル抗体は、マウスハイブリドーマから、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｃ．，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５（１９７５）の古典的方法またはそれらの派生法に従って調製することができる。簡潔に述べると、マウスに数マイクログラムの選択されたタンパク質またはそれらから誘導されたペプチドを数週間にわたって繰り返し接種する。次に、そのマウスを屠殺し、脾臓の抗体産生細胞を単離する。それらの脾臓細胞をポリエチレングリコールによりマウスミエローマ細胞と融合させ、アミノプテリンを含有する選択培地（ＨＡＴ培地）上でのその系の増殖によって過剰の非融合細胞を破壊する。上手く融合した細胞を希釈し、希釈物のアリコートをマイクロタイタープレートのウェルに入れて、そこで培養物の成長を継続する。抗体産生クローンを、イムノアッセイ手順、例えば、元来Ｅｎｇｖａｌｌ，Ｅ．、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ ７０：４１９（１９８０）に記載されるＥｌｉｓａおよびそれらの派生法によりウェルの上清中の抗体を検出することによって同定する。選択された陽性クローンを増殖させ、それらのモノクローナル抗体産生物を使用のために収集することができる。モノクローナル抗体産生の詳細な手順は、Ｄａｖｉｓ，Ｌ．等Ｂａｓｉｃ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ．Ｓｅｃｔｉｏｎ ２１−２に記載されている。
好ましい態様においては、前記モノクローナル抗体はＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性の断片に特異的であり、ここで、前記生物学的に活性は脂質分配、脂質代謝、およびインシュリン様活性からなる群より選択される。好ましくは、しかしながらこれらに限定しようとするものではないが、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片はＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含む。好ましい態様において、前記ポリペプチド断片は、配列番号２の少なくとも６個の連続するアミノ酸および７１０個以下の連続するアミノ酸、配列番号４の少なくとも６個および４７１個以下の連続するアミノ酸、配列番号６の少なくとも６個の連続するアミノ酸および２０１個以下の連続するアミノ酸、配列番号８の少なくとも６個および４４６個以下の連続するアミノ酸、配列番号１０の少なくとも６個および２９６個以下の連続するアミノ酸、または配列番号１２の少なくとも６個および２０５個以下の連続するアミノ酸を含む。
Ｂ．免疫によるポリクローナル抗体産生
単一タンパク質の異種エピトープに対する抗体を含有するポリクローナル抗血清は、適切な動物を上述の、非修飾であっても免疫原性を増強するように修飾されていてもよい、発現タンパク質またはそれらから誘導されるペプチドで免役することによって調製することができる。有効なポリクローナル抗体産生は、抗原および宿主種の両方に関連する多くの因子によって影響を受ける。例えば、小分子は他のものよりも免疫原性に劣る傾向にあり、かつ担体およびアジュバントの使用を必要とすることがある。また、宿主動物は接種部位および用量に応じて変化し、抗原の不適切または過剰の両方の用量は低力価抗体を生じる。複数の皮内部位に投与される小用量（ｎｇレベル）の抗原が最も確実であるように思われる。ウサギに有効な免疫プロトコルをＶａｉｔｕｋａｉｔｉｓ，Ｊ．等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．３３：９８８−９９１（１９７１）に見出すことができる。
追加免疫注射を定期的な間隔で施し、例えば、既知濃度抗原に対する寒天中での二重免疫拡散法によって半定量的に決定される、それらの抗体力価が下降し始めたときに抗血清を収集する。例えば、Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ，Ｏ．等、Ｃｈａｐ．１９：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｄ．Ｗｉｅｒ（ｅｄ）Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ（１９７３）を参照のこと。抗体のプラトー濃度は、通常、血清の０．１〜０．２ｍｇ／ｍｌ（約１２□Ｍ）の範囲にある。抗原に対する抗血清の親和性は、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｄ．、Ｃｈａｐ．４２：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２ｄ Ｅｄ．（Ｒｏｓｅ ａｎｄ Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒ．Ｓｏｃ．Ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９８０）によって記載されるように、競合結合曲線を作成することによって決定する。
好ましい態様においては、前記ポリクローナル抗体はＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはそれらの生物学的に活性の断片に特異的であり、ここで、前記生物学的に活性は脂質分配、脂質代謝、およびインシュリン様活性からなる群より選択される。好ましくは、しかしながらこれらに限定しようとするものではないが、前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片はＣ末端球状Ｃ１ｑ相同ドメインの全てまたは一部を含む。好ましい態様において、前記ポリペプチド断片は、配列番号２の少なくとも６個の連続するアミノ酸および７１０個以下の連続するアミノ酸、配列番号４の少なくとも６個および４７１個以下の連続するアミノ酸、配列番号６の少なくとも６個の連続するアミノ酸および２０１個以下の連続するアミノ酸、配列番号８の少なくとも６個および４４６個以下の連続するアミノ酸、配列番号１０の少なくとも６個および２９６個以下の連続するアミノ酸、または配列番号１２の少なくとも６個および２０５個以下の連続するアミノ酸を含み、本質的にそれらからなり、またはそれらからなる。
いずれかのプロトコルに従って調製される抗体調製品は、生物学的試料中の抗原担持物質の濃度を決定する定量的イムノアッセイにおいて有用である。それらは生物学的試料中の抗原の存在を同定するのにも半定性的または定性的に用いられる。これらの抗体は、そのタンパク質を発現する細胞を殺すか、または体内のタンパク質のレベルを減少させるための治療用組成物において用いることもできる。
本発明の他の特徴および利点を実施例において説明する。これらは例示のみのものであり、いかなる意味においても本発明を限定するものではない。本願を通して、様々な刊行物、特許および公開特許出願が引用される。本願において参照されるそれらの刊行物、特許および公開特許出願の開示は参照することにより本開示に組み込まれる。
以下の実施例は、説明のためであって限定の手段としてではなく提供される。当該技術分野における通常の技術を有する者は、その全てが本発明の一部を形成するここでの開示に基づいて等価のアッセイおよび方法を設計することができる。
実施例１：ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１発現のノーザン分析
異なるヒト組織（成人および胎児）および細胞株に加えて、異なる発達段階のマウス胚におけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１発現の分析は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入したポリＡ+ＲＮＡブロット（例えば、＃７７８０−１、７７５７−１、７７５６−１、７７６８−１および７７６３−１）を用いることによって達成される。ＲＮＡプローブの標識は、ＡｍｂｉｏｎからのＲＮＡ Ｓｔｒｉｐ−ＥＺキットを製造者の指示に従って用いて行う。ＲＮＡプローブのＲＮＡブロットへのハイブリダイゼーションは、Ｕｌｔｒａｈｙｂハイブリダイゼーション液（Ａｍｂｉｏｎ）で行う。簡潔に述べると、ブロットを５８℃（低厳密性）または６５℃（高厳密性）で３０分間予備ハイブリダイズする。標識プローブ（２ｘ１０6ｃｐｍ／ｍｌ）を添加した後、ブロットを一晩（１４〜２４時間）ハイブリダイズさせ、２×２０分、５０℃で２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（低厳密性）を用いて、２×２０分、５８℃で１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（中厳密性）を用いて、および２×２０分、６５℃で１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ（高厳密性）を用いて洗浄する。洗浄が完了した後、ブロットをホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）上に１〜３日露出する。
実施例２：代謝関連活性のインビトロ試験
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの様々な調製品および様々な配列変種の活性を、以下に示されるものを含む様々なインビトロアッセイを用いて評価する。これらのアッセイは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドアンタゴニストおよびアゴニストの開発に用いることができるものの例示でもある。それを行うため、上記アッセイにおける候補分子の存在下でのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの、例えば、レプチンおよび／またはＬＳＲ活性に対する効果を、そのアッセイにおける候補分子の不在下でのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果と比較する。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは高カフェテリア食のマウスにおいて体重を減少させる（実施例５）ため、これらのアッセイは体重を減少（または増加）させるための候補治療を同定する役目も果たす。
肝細胞株：
ＬＳＲに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効力の試験は、例えばＰＬＣ、ＨｅｐＧ２、Ｈｅｐ３Ｂ（ヒト）、Ｈｅｐａ１−６、ＢＰＲＣＬ（マウス）、またはＭＣＡ−ＲＨ７７７、ＭＣＡ−ＲＨ８９９４（ラット）を含む肝細胞株を用いて行うことができる。
ＢＰＲＣＬマウス肝細胞（ＡＴＣＣ保管所）を、３００，０００細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレート（第０日）においてグルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（高グルコース）（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ、１９９２）中に置く。第２日に培地を交換する。第３日に、集密単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で１回洗浄する。細胞を、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有するＤＭＥＭにおける組換えＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の濃度を増加させながら、３７℃で３０分間インキュベートする。１０ｎｇ／ｍＬ125Ｉ−マウスレプチン（比活性、２２１００ｃｐｍ／ｎｇ）の添加の後、インキュベーションを３７℃で３時間継続する。単層を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで連続的に２回、次にＰＢＳ／ＢＳＡで１回、続いてＰＢＳで連続的に２回洗浄する。細胞を、０．２４ｍＭ ＥＤＴＡを含有する０．１Ｎ ＮａＯＨで溶解する。溶解物をチューブに集め、ガンマカウンタでカウントする。
血液脳関門モデル：
脳におけるレプチン輸送に対するＧＭＧ−３、ＧＭＧ−４、Ｃｌｕｓｔｅｒ１、ＧＭＧ−６Ａ、またはＧＭＧ−６Ｂポリペプチドの効果は脳誘導細胞を用いて決定することができる。想起される方法の１つは、ＬＳＲまたは他の受容体を介するレプチン（もしくは他の分子）輸送に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を試験するのに脳毛細管内皮細胞および星状細胞の同時培養を用いる、Ｄｅｈｏｕｃｋ等（Ｊ Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ ５４：１７９８−８０１，１９９０を参照することにより、あらゆる数字、表、または図面を含むその全体がここに組み込まれる）によって記載される血液／脳関門モデルを用いることである。
このアッセイは脳へのレプチン輸送に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの潜在的効果の指標であり、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド変種を、脳においてＬＳＲまたは他の受容体を介するレプチン輸送を調節するそれらの能力についてスクリーニングするのに用いることができる。加えて、ＬＳＲまたは他の受容体を介するレプチン輸送に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果の推定アゴニストまたはアンタゴニストもこのアッセイを用いてスクリーニングすることができる。血液／脳関門を横切るレプチンの輸送の増加は、おそらくは、満腹因子としてのその作用を増加させる。
ＬＳＲ発現のＦＡＣＳ分析
ＬＳＲに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果は、抗ＬＳＲ抗体および蛍光二次抗体を用いるフローサーフェースサイトメトリーにより細胞表面でのＬＳＲ発現のレベルを測定することによって決定することもできる。フローサイトメトリーは、生物学的粒子の特徴の測定に用いられるレーザーベースの技術である。フローサイトメトリーの基礎をなす原理は、光が散乱し、励起源からの光が移動する粒子に命中したときに蛍光が放射されるというものである。
これは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドおよび変種に加えて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの推定アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングに容易に適合させることができる高スループットアッセイである。２つのアッセイが以下に示される。抗体、細胞株およびＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド類似体は実験に依存して変化するが、ヒト細胞株、ヒト抗ＬＳＲ抗体およびＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片をヒトの治療に用いようとする変種、アゴニスト、およびアンタゴニストのスクリーニングに用いることができる。
アッセイ１：
細胞を、収集およびＦＡＣＳによる分析に先立ち、未変性ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片のいずれかで前処理する（または、処理しない）。細胞を非酵素的解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を用いて収集した後、抗ＬＳＲ ８１Ｂの１：２００希釈液または１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ中の無関係抗血清と共に４℃で１時間インキュベートする。同じバッファで２回洗浄した後、ヤギ抗ウサギＦＩＴＣ結合抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｇｉｌｂｅｒｔｓｖｉｌｌｅ、ＰＡ）を細胞に添加し、続いて４℃で３０分間さらにインキュベートする。洗浄後、細胞を２％ホルマリンにおいて固定する。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）でフローサイトメトリー分析を行う。
アッセイ２：
細胞を、分析に先立ち、Ｔ１７５フラスコ内で製造者の指示に従って４８時間培養する。
細胞をＦＡＣＳバッファ（１×ＰＢＳ／２％ＦＢＳ、フィルター滅菌）で１回洗浄し、フラスコから１０ｍＬのＦＡＣＳバッファ中に手動で掻き落とす。その細胞懸濁液を１５ｍＬ円錐管に移し、１２００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離する。上清を廃棄し、細胞を４℃に冷却した１０ｍＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させる。細胞のカウントを行い、細胞密度をＦＡＣＳバッファで１×１０6細胞／ｍＬの濃度に調整する。分析のため、１ミリリットルの細胞懸濁液を４８ウェルプレートの各ウェルに加えた。細胞を１２００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離する。プレートをチェックして細胞がペレット化していることを確実なものとし、上清を除去し、プレートをボルテックスミキサーにかけることにより細胞を再懸濁させる。１ミリリットルのＦＡＣＳバッファを各ウェルに添加した後、１２００ｒｐｍで５分間、４℃で遠心分離する。この説明される細胞洗浄を合計で３回行った。
スクリーニング実験において滴定して適正作業希釈（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００、または１：１００００）を決定した一次抗体を、総容量５０μＬ ＦＡＣＳバッファ中の細胞に添加する。プレートを４℃で１時間、光から保護してインキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞を上述のように３回洗浄する。スクリーニング実験において滴定して適正作業希釈（例えば、１：２５、１：５０、１：１００、１：２００、１：４００、１：５００、１：８００、１：１０００、１：２０００、１：４０００、１：５０００、または１：１００００）を決定した適切な二次抗体を、総容量５０μＬのＦＡＣＳバッファ中の細胞に添加する。プレートを４℃で１時間、光から保護してインキュベートする。インキュベーションに続いて、細胞を上述のように３回洗浄する。最終洗浄後直ちに、細胞を５００μＬのＦＡＣＳバッファに再懸濁させ、ＦＡＣＳ取得管に移す。試料を光から保護された氷上に置き、１時間以内に分析する。
蛍光顕微鏡による検出でのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの細胞結合および取り込み
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合：１ｍｇ／ｍＬ濃度の精製ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを、Ｓｉｇｍａ’ｓ ＦｌｕｏｒｏＴａｇ ＦＩＴＣ結合キット（ストックＮｏ．ＦＩＴＣ−１）を用いてＦＩＴＣで標識する。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを標識するため、小規模結合についてＳｉｇｍａ Ｈａｎｄｂｏｏｋに概述されるプロトコルに従う。
細胞培養：Ｃ２Ｃ１２マウス骨格筋細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）およびＨｅｐａ−１−６マウス肝細胞（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）を、６ウェルプレートに、ウェル当たり２×１０5細胞の細胞密度で接種する。分析に先立ち、Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐａ−１−６細胞を保管所の指示に従って２４〜４８時間培養する。細胞が８０％集密となったときアッセイを行う。
顕微鏡を用いるＦＩＴＣ標識ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド細胞結合および取り込み、Ｃ２Ｃ１２およびＨｅｐａ−１−６細胞を、ヒトＬＳＲに対する抗体（８１Ｂ：ヒトＬＳＲのＮ末端配列、マウスＬＳＲと交差反応しない、および９３Ａ：Ｃ末端配列、マウスＬＳＲと交差反応する）またはｇＣ１ｑｒに対する抗血清（９５３）の存在／不在下において、３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートする。ＬＳＲ抗体を２μｇ／ｍＬの濃度で培地に添加する。抗ｇＣ１ｑｒ抗血清を、２．５μＬ非希釈血清（高濃度）または１：１００希釈（低濃度）の容量で培地に添加する。指定された抗体と共にインキュベートした後、ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−７Ａ、−ＧＭＧ−７Ｂ、−ＧＭＧ−８、−ＧＭＧ−９、−ＧＭＧ−１０、または−ＧＭＧ−１１ポリペプチド（５０ｎＭ／ｍＬ）を各細胞培養ウェルに添加する。細胞を再度３７℃、５％ＣＯ2で１時間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２×洗浄し、細胞をウェルから１ｍＬのＰＢＳ中に掻き入れる。細胞懸濁液をエッペンドルフ管に移し、１０００ｒｐｍで２分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を２００μＬのＰＢＳに再懸濁させる。ＦＩＴＣ−ＧＭＧ−７Ａ、−ＧＭＧ−７Ｂ、−ＧＭＧ−８、−ＧＭＧ−９、−ＧＭＧ−１０、または−ＧＭＧ−１１ポリペプチドの結合および取り込みを蛍光顕微鏡により４０×倍で分析する。
このアッセイは、細胞へのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの取り込みおよび／または結合を促進または防止する作用物質の同定に有用であり得る。
リポタンパク質受容体としてのＬＳＲに対する効果
ＬＳＲのリポタンパク質結合、内部移行および分解活性に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果も試験することができる。リポタンパク質受容体としてのＬＳＲの測定はＢｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ（（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：４６２８−３６；あらゆる図面、表、または数字を含むその全体がここに組み込まれる）に記載されている。ＬＳＲ（または他の受容体）のリポタンパク質結合、内部移行および分解活性に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を、非処理細胞をさらなる対照として用いて、未変性ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドのものと比較することができる。このアッセイは、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの活性および阻害変種に加えて、代謝関連活性のアゴニストおよびアンタゴニストについてのスクリーニングに用いることもできる。
ヒト肝臓ＰＬＣ細胞（ＡＴＣＣ保管所）を、３００，０００細胞／ウェルの密度で、６ウェルプレートにおいて、グルタミンおよびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ（高グルコース）中に置く（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ、１９９２）（第０日）。第２日に培地を交換する。第３日に、集密単層をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）（２ｍＬ／ウェル）で１回洗浄する。細胞を３７℃で３０分間、１０ｎｇ／ｍＬヒト組換えレプチンと共に、０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ ＣａＣｌ2、３．７ｇ／Ｌ 重炭酸ナトリウム、ｐＨ７．５を含有するＤＭＥＭにおいてインキュベートした後、さらに３０分、３７℃で、漸増濃度のＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと共にインキュベートする。０．８ｍＭオレエートおよび２０μｇ／ｍＬ125Ｉ−ＬＤＬを添加した後、インキュベーションを３７℃で２時間継続する。単層を、０．２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで連続的に２回洗浄し、続いてＰＢＳ／ＢＳＡで１回洗浄した後、ＰＢＳで連続的に２回洗浄する。125Ｉ−ＬＤＬのオレエート誘導結合、取り込みおよび分解の量を従来記載される通りに測定する（Ｂｉｈａｉｎ ＆ Ｙｅｎ、１９９２、前出）。結果は３回の決定の平均として示す。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドはリポタンパク質受容体としてのＬＳＲの活性の増加につながる。ＬＤＬのオレエート誘導結合および取り込みは、分解と比較して、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドによる影響をより多く受ける。このＬＳＲ活性の増加は、潜在的に、食後の状態の間のトリグリセリドに富むリポタンパク質のクリアランスの増強を生じさせる。したがって、より多くの食事性脂肪が、脂肪組織に蓄積されるのではなく、肝臓を介して除去される。
このアッセイは、ＬＳＲ活性（または他の受容体を介するリポタンパク質取り込み、結合および分解）を増加または減少させ、したがって、トリグリセリドに富むリポタンパク質のクリアランスの速度に影響を及ぼす化合物（またはアゴニストもしくはアンタゴニスト）の効率の決定に用いることができる。
筋肉分化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞株；ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７７２、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を完全ＤＭＥＭ（ｗ／グルタミン、ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ等）＋１０％ＦＣＳに低密度（約１５〜２０％）で接種する。２日後、それらは８０〜９０％集密になる。この時点で培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清に交換して分化を可能にする。培地は毎日交換する。Ｃ２Ｃ１２分化の正確な時間経過は、とりわけ、それらがいかに長時間継代され、かついかにしてそれらが維持されているかに依存するが、２％ウマ血清中で３〜４日後に多量の筋管細胞形成が生じる。
筋肉分化に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在の効果を試験するため、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片（１〜２．５μｇ／ｍＬ）を、接種の翌日、細胞が依然としてＤＭＥＭ ｗ／１０％ＦＣＳ中にあるときに添加する。細胞塗布の２日後（前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片を最初に添加した１日後）、約８０〜９０％集密で、培地をＤＭＥＭ＋２％ウマ血清＋前記ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片に交換する。
筋肉細胞の脂肪酸酸化に対する効果
Ｃ２Ｃ１２細胞を２μｇ／ｍＬのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの存在または不在下において４日間分化させる。第４日に、１−14Ｃ−オレエート（０．２ｍＭ）から14ＣＯ2への変換を９０分間測定することにより、オレエート酸化速度を決定する。この実験は、活性ポリペプチドおよびペプチドに加えて、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドのアゴニストおよびアンタゴニストまたは活性化因子および阻害因子についてのスクリーニングに用いることができる。
オレエート酸化の速度に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の効果を分化Ｃ２Ｃ１２細胞（マウス骨格筋細胞；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１７７２）および肝細胞株（Ｈｅｐａ１−６；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ ＣＲＬ−１８３０）において比較することができる。培養細胞を製造者の指示に従って維持する。オレエート酸化アッセイは従来記載される通りに行う（Ｍｕｏｉｏ等（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ３３８；７８３−７９１）。簡潔に述べると、ほぼ集密の単球を低血清分化培地ＤＭＥＭ、２．５％ウマ血清）中に４日間保持すると、その時点で筋管細胞の形成は最大になる。肝細胞を、１０％ＦＣＳを補足した同じＤＭＥＭ中に２日間保持する。実験の１時間前、培地を除去して１ｍＬの予備インキュベーション培地（ＭＥＭ、２．５％ウマ血清、３ｍＭグルコース、４ｍＭグルタミン、２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１％ ＦＦＡ遊離ＢＳＡ、０．２５ｍＭオレエート、５μｇ／ｍＬゲンタマイシン）を添加する。酸化実験の開始時に、14Ｃ−オレイン酸（１μＣｉ／ｍＬ、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を添加し、２．５μｇ／ｍＬのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはポリペプチド断片の不在／存在下において３７℃で９０分間インキュベートする。インキュベーション期間の後、０．７５ｍＬの培地を取り出し、筋肉ＦＦＡ酸化実験について以下に説明されるように、14Ｃ−酸化産生物についてアッセイする。
培養細胞におけるオレエート酸化に続くトリグリセリドおよびタンパク質分析
オレエート酸化アッセイ用培地の移動の後、細胞を氷上に置く。トリグリセリドおよびタンパク質含量を決定するため、細胞を１ｍＬの１×ＰＢＳで洗浄して残留培地を除去する。各ウェルに３００μＬの細胞解離溶液（Ｓｉｇｍａ）を加え、３７℃で１０分間インキュベートする。プレートを叩いて細胞をゆるめ、０．５ｍＬの１×ＰＢＳを添加した。その細胞懸濁液を適切なエッペンドルフ管に移し、各ウェルをさらなる０．５ｍＬの１×ＰＢＳですすいで適切なエッペンドルフ管に移す。試料を１０００ｒｐｍで１０分間、室温で遠心分離する。上清を廃棄し、７５０μＬの１×ＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを細胞ペレットに添加する。細胞懸濁液を渦攪拌し、氷上に１時間置く、その後、試料を１３０００ｒｐｍで２０分間、４℃で遠心分離する。上清を新たな管に移し、分析するまで−２０℃で凍結する。各試料中のトリグリセリドレベルの定量的測定を、Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧＰＯ−ＴＲＩＮＤＥＲ酵素キットを用いて決定する。マニュアルに概述されるその手順を、以下を除いて堅守する：アッセイは４８ウェルプレートにおいて行い、３５０μＬの試料容量をアッセイし、対照ブランクは３５０μＬのＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓからなり、そして標準はキットにおいて提供される１０μＬの標準プラス６９０μＬのＰＢＳ／２％ｃｈａｐｓを含んでいた。試料の分析は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔを用いて５５０ｎｍの波長で行う。タンパク質分析は、２５μＬの各上清試料に対して、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者の指示に従って用いて行う。試料の分析は、Ｐａｃｋａｒｄ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏｕｎｔを用いて５５０ｎｍの波長で行う。
筋肉細胞によるインビトログルコース取り込み
Ｌ６筋肉細胞をヨーロピアンカルチャーコレクション（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得、７〜１１継代で用いる。細胞を標準組織培養培地ＤＭＥＭにおいて維持し、従来記載されているように（Ｗａｌｋｅｒ，Ｐ．Ｓ．等（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，ＪＢＣ ２６５：１５１６−１５２３；およびＫｉｌｐ，Ａ．等（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：２５３５−２５４４、それらの開示は参照することによりそれらの全体がここに組み込まれる）、インシュリン（１０-8Ｍ）の存在または不在下において、［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片と共に、またはそれなしで用いてグルコース取り込みを評価する。２ＤＧの取り込みは対照（インシュリンまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の添加なし）と比較した変化パーセンテージとして表す。値は実験当たり４ウェルの組の平均±ＳＥＭとして示す。ウェルのセット間の相違をスチューデントのｔ検定によって評価し、確率値ｐ＜０．０５を有意と考える。
実施例３：高脂肪食を給餌したマウスに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
約６週齢のＣ５７Ｂｌ／６マウス（群当たり８匹）を用いて実験を行う。全てのマウスは個別に収容する。マウスは、各実験を通して、高脂肪食で維持する。この高脂肪食（カフェテリア食；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃ．からのＤ１２３３１）は以下の組成を有する：タンパク質ｋｃａｌ％ １６、スクロースｋｃａｌ％ ２６、および脂肪ｋｃａｌ％ ５８。脂肪は主として水素化ヤシ油で構成される。
マウスに高脂肪食を６日間給餌した後、イソフルラン麻酔を用いて微小浸透圧ポンプを挿入し、完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片、生理食塩水、および無関係ペプチドをマウスに１８日間皮下投与（ｓ．ｃ．）するのに用いる。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドは１００、５０、２５、および２．５μｇ／日の用量で与え、無関係ペプチドは１０μｇ／日で与える。高脂肪食の第１、第３および第５日、次いで治療の開始後毎日体重を測定する。最終血液試料を心臓穿刺によって採取し、トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、グルコース、レプチン、およびインシュリンレベルを決定するに用いる。毎日の消費食物の量も各群について決定する。
実施例４：ヒトにおける代謝関連活性の試験
ヒトにおけるＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効力の試験は医師の推奨および確立された指針に従って行う。マウスにおいて試験したパラメータをヒトにおいても試験する（例えば、食物摂取、体重、ＴＧ、ＴＣ、グルコース、インシュリン、レプチン、ＦＦＡ）。生理学的因子が短期間にわたる変化を示すことが予想される。体重増加における変化はより長期間を必要とするかもしれない。加えて、食事を注意深く観察する必要がある。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、好ましくは生物学的に活性のそれらのポリペプチド断片を、７０ｋｇの人物当たり約６ｍｇタンパク質または毎日約１０ｍｇの１日用量で与える。他の用量、例えば、毎日１ｍｇまたは５ｍｇから毎日２０ｍｇ、５０ｍｇ、または１００ｍｇまでも試験する。
実施例５：マウス脂肪萎縮性糖尿病モデルにおける代謝関連活性の試験
従来、レプチンは、先天性リポジストロフィを患うマウスにおいてインシュリン耐性および真性糖尿病を逆行させることが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ等、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９）；あらゆる図面、数字、または表を含むその全体がここに組み込まれる）。レプチンは、脂肪萎縮性糖尿病の異なるリポジストロフィマウスモデルにおいては有効性に劣ることが見出された（Ｇａｖｒｉｌｏｖａ等、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；あらゆる図面、数字、または表を含むその全体がここに組み込まれる）。本発明は、このモデルにおけるインシュリン耐性および高血糖の減少へのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの単独での、またはレプチン、レプチンペプチド（米国仮出願第６０／１５５，５０６号）、または他の化合物との組合せでの使用を包含する。アッセイには、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを実施例３（または実施例６〜８）に前述される方法を用いて投与することを除いて、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いる、Ｇａｖｒｉｌｏｖａら（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０）において従来記載されるものが含まれる。我々の実験において典型的に測定される他の因子、例えば、レプチン、ＦＦＡ、およびＴＧレベル（上記実施例３、または実施例６〜８参照）の他に、マウスのグルコースおよびインシュリンレベルを試験し、食物摂取および肝臓重量を監視する。
実施例６：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿遊離脂肪酸に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後脂肪血（ＰＰＬ）に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を試験する。
この実験において用いられるマウスは実験に先立って２時間絶食させ、その後、基線血液試料を採取する。全ての血液試料は、ＥＤＴＡ被覆毛細管を用いて尾から採取する（各時点で５０μＬ）。時間０（８：３０ＡＭ）で、標準高脂肪食（６ｇバター、６ｇヒマワリ油、１０ｇ脱脂粉乳、１０ｇスクロース、Ｎｂ＃６、ＪＦ、ｐｇ．１に従って新鮮に調製した１２ｍＬ蒸留水）を強制給餌によって全ての動物に与える（ｖｏｌ．＝体重の１％）。
高脂肪食の直後、１００μＬ生理食塩水中に２５μｇのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをｉ．ｐ．注射する。同じ用量（１００μＬ中２５μｇ／ｍＬ）を４５分および１時間４５分に再度注射する。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注射する。非処理および処理動物を交互に取り扱う。
血液試料を１時間間隔で採取し、直ちに氷上に置く。各時点の後に遠心分離することにより血漿を調製する。血漿を−２０℃で保持し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）およびグルコースを標準試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定する。利用可能な血漿の量が限られているため、グルコースはプールされた試料を用いて２回決定する。各時点で、処置群当たり８匹の動物全てからの等容量の血漿をプールする。
実施例７：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿レプチンおよびインシュリンに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後脂肪血（ＰＰＬ）の間の血漿レプチンおよびインシュリンレベルに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を試験する。実験手順は、０、２および４時間でのみ血液を抜き取ってＲＩＡによるレプチンおよびインシュリンの決定に必要なより多量の血液試料を準備したことを除いて、実施例６において説明されたものと同じである。
簡潔に述べると、１６匹のマウスを実験に先立って２時間絶食させた後、基線血液試料を採取する。全ての血液試料は、ＥＤＴＡ被覆毛細管を用いて尾から採取する（各時点で１００μＬ）。時間０（９：００ＡＭ）で、標準高脂肪食（実施例６を参照）を強制給餌によって全ての動物に与える（ｖｏｌ．＝体重の１％）。高脂肪食の直後、１００μＬ生理食塩水中２５μｇのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドをｉ．ｐ．注射する。同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）を４５分および１時間４５分に再度注射する（処置群）。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注射する。非処置および処置動物を交互に取り扱う。
血液試料を直ちに氷上に置き、血漿を各時点の後に遠心分離によって調製する。血漿を−２０℃で保持し、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）を標準試験キット（Ｗａｋｏ）を用いて２４時間以内に決定する。レプチンおよびインシュリンはＲＩＡ（ＭＬ−８２ＫおよびＳＲＩ−１３Ｋ、ＬＩＮＣＯ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｃｈａｒｌｅｓ、ＭＯ）により製造者のプロトコルに従って決定する。しかしながら、２０μＬの血漿のみを用いる。各々の決定は２回行う。利用可能な血漿の量が限られるため、レプチンおよびインシュリンは両処置群において各々２匹の動物の４つのプールにおいて決定する。
実施例８：Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける血漿ＦＦＡ、ＴＧおよびグルコースに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスにおける食後脂肪血（ＰＰＬ）の間の血漿ＦＦＡ、ＴＧ、グルコース、レプチンおよびインシュリンレベルに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果が説明されている。高脂肪食の正常Ｃ５７ＢＬ６／Ｊマウスに与えられたＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド（２．５μｇ／日）から生じる体重減少も示されている（実施例３）。
実験手順は実施例６において説明されるものに類似する。簡潔に述べると、１４匹のマウスを実験に先立って２時間絶食させた後、基線血液試料を採取する。全ての血液試料は、ＥＤＴＡ被覆毛細管を用いて尾から採取する（各時点で５０μＬ）。時間０（９：００ＡＭ）で、標準高脂肪食（実施例６参照）を強制給餌によって全ての動物に与える（ｖｏｌ．＝体重の１％）。高脂肪食の直後、１００μＬ生理食塩水中２５μｇのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを４匹のマウスにｉ．ｐ．注射する。同じ用量（１００μＬ中２５μｇ）を４５分および１時間４５分に再度注射する。第２の治療群には５０μｇのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを同じ間隔で３回投与する。対照動物には生理食塩水（３×１００μＬ）を注射する。非処置および処置動物を交互に取り扱う。
血液試料を直ちに氷上に置く。各時点の後に遠心分離によって血漿を調製する。血漿を−２０℃で保持し、標準試験キット（Ｓｉｇｍａ ａｎｄ Ｗａｋｏ）を用いて遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、トリグリセリド（ＴＧ）およびグルコースを２４時間以内に決定する。
実施例９：エピネフリン注射後のＦＦＡに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
マウスにおいては、高脂肪／スクロース試験食の胃内投与の後に血漿遊離脂肪酸が増加する。これらの遊離脂肪酸は、ほとんど、脂肪分解酵素、すなわち、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）および肝臓リパーゼ（ＨＬ）の活性によって産生される。これらの種においては、これらの酵素は、内皮に結合するものおよび血漿中を自由に循環するものの両方ともかなりの量で見出される。血漿遊離脂肪酸の別の源は、β−アドレナリン作動性刺激の後に脂肪組織から遊離脂肪酸を放出するホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ）である。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドもＨＳＬによって放出される遊離脂肪酸の代謝を調節するかどうかを試験するため、マウスにエピネフリンを注射する。
２群のマウスにエピネフリン（５μｇ）を腹腔内注射によって投与する。処置群にＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド（２５μｇ）をエピネフリンの１時間前および再度エピネフリンと共に注射し、それに対して対照動物には生理食塩水を投与する。血漿を単離し、遊離脂肪酸およびグルコースを上述の通り測定する（実施例８）。
実施例１０：筋肉ＦＦＡ酸化に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
筋肉遊離脂肪酸酸化に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を調べるため、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの無処置の後肢筋を単離し、オレエートを基質として用いてＦＦＡ酸化を測定する（Ｃｌｅｅ，Ｓ．Ｍ．等、Ｐｌａｓｍａ ａｎｄ ｖｅｓｓｅｌ ｗａｌｌ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｌｉｐａｓｅ ｈａｖｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｒｏｌｅｓ ｉｎ ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ ４１，５２１−５３１（２０００）；Ｍｕｏｉｏ，Ｄ．Ｍ．，Ｄｏｈｍ，Ｇ．Ｌ．，Ｔａｐｓｃｏｔｔ，Ｅ．Ｂ．＆ Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．Ｌｅｐｔｉｎ ｏｐｐｏｓｅｓ ｉｎｓｕｌｉｎ’ｓ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅｓ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｏｂｅｓｅ ｏｂ／ｏｂ ｍｉｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２７６，Ｅ９１３−９２１（１９９９））。単離された筋肉におけるオレエート酸化を従来記載される通りに測定する（Ｃｕｅｎｄｅｔ等（１９７６）Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ５８：１０７８−１０８８；Ｌｅ Ｍａｒｃｈａｎｄ−Ｂｒｕｓｔｅｌ，Ｙ．，Ｊｅａｎｒｅｎａｕｄ，Ｂ．＆ Ｆｒｅｙｃｈｅｔ，Ｐ．Ｉｎｓｕｌｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｓ ｉｎ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｏｌｅｕｓ ｍｕｓｃｌｅ ｏｆ ｌｅａｎ ａｎｄ ｏｂｅｓｅ ｍｉｃｅ．Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２３４、Ｅ３４８−Ｅ３５８（１９７８））。簡潔に述べると、マウスを頸部脱臼によって屠殺し、ヒラメ筋およびＥＤＬ筋を後肢から迅速に単離する。各々の筋肉の遠位腱を縫合糸の断片に結び、異なる培地の間の移動を容易にする。全てのインキュベーションは３０℃で、４％ＦＦＡ非含有ウシ血清アルブミン（ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ、ＲＩＡ級、Ｓｉｇｍａ）および５ｍＭグルコース（Ｓｉｇｍａ）を補足した１．５ｍＬのＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ重炭酸バッファ（１１８．６ｍＭ ＮａＣｌ、４．７６ｍＭ ＫＣｌ、１．１９ｍＭ ＫＨ2ＰＯ4、１．１９ｍＭ ＭｇＳＯ4、２．５４ｍＭ ＣａＣｌ2、２５ｍＭ ＮａＨＣＯ3、１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４）中において行う。オレエート（Ｓｉｇｍａ）の合計濃度は実験を通して０．２５ｍＭである。全ての培地はインキュベーションに先立って酸素化する（９５％Ｏ2；５％ＣＯ2）。気体混合物は、実験を通して、ガスウォッシャー（Ｋｏｎｔｅｓ Ｉｎｃ．、Ｖｉｎｅｌａｎｄ、ＮＪ）を介して通気することによって水和する。
筋肉を３０分間、酸素化しながらインキュベーション培地ですすぐ。その後、それらの筋肉を新鮮な培地（１．５ｍＬ）に移し、１μＣｉ／ｍＬ［１−14Ｃ］オレイン酸（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）の存在下において３０℃でインキュベートする。この培地を収容するインキュベーションバイアルを、Ｗｈａｔｍａｎ紙の断片（１．５ｃｍ×１１．５ｃｍ）を担持する中心ウェルが懸垂するゴム隔壁で密封する。
一定の酸素化を伴う１０分の初期インキュベーション期間の後、気体循環を取り除いて系を外部環境に対して閉鎖し、筋肉を３０℃で９０分間インキュベートする。この期間の最後に、０．４５ｍＬのＳｏｌｖａｂｌｅ（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を中心ウェル内のＷｈａｔｍａｎ紙上に注入し、バイアルを氷上に移動させることによって筋肉によるオレエート酸化を停止させる。
５分後、筋肉を培地から取り除き、０．５ｍＬ培地のアリコートも取り出す。バイアルを再度冷却し、シリンジを用いてゴム隔壁を穿刺することにより１ｍＬの３５％過塩素酸を培地中に注入する。酸性化培地から放出されるＣＯ2を中心ウェル内のＳｏｌｖａｂｌｅによって収集する。３０℃で９０分の収集期間の後、Ｗｈａｔｍａｎ紙を中心ウェルから取り除き、１５ｍＬのシンチレーション液（ＨｉｏｎｉｃＦｌｏｕｒ、Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＣＴ）を収容するシンチレーションバイアルに入れる。14Ｃ放射能の量を液体シンチレーション計数によって定量する。オレエート酸化の速度を９０分／筋肉ｇにおいて産生されるｎｍｏｌオレエートで表す。
オレエート酸化に対する完全長ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチド断片の効果を試験するため、これらのタンパク質を２．５μｇ／ｍＬの最終濃度で培地に添加し、この手順を通して培地中に維持する。
実施例１１：マウスから単離した筋肉および肝臓中のトリグリセリドに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドによって誘導されるＦＦＡ酸化の増加が筋肉または肝臓へのＦＦＡ送達の増加をも伴うかどうかを決定するため、マウスのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド処置の後に後肢筋および肝臓トリグリセリド含量を測定する。後肢筋に加えて肝臓試料を処置および非処置動物から取り出し、標準脂質抽出法（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ，Ｍ．等、Ｄｉｒｅｃｔ ａｎｔｉｄｉａｂｅｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｌｅｐｔｉｎ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９４：４６３７−４６４１（１９９７））に従ってトリグリセリドおよび遊離脂肪濃度を決定し、続いて標準試験キットを用いてＴＧおよびＦＦＡ分析を行う。
実施例１２：Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ注射後のＦＦＡに対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果
２群のマウスにＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ−２０％（Ｃｌｉｎｔｅｃ）の３０μＬボーラスを静脈内（尾静脈）注射して血漿ＦＦＡの急激な増加を生じさせ、それにより腸吸収を回避する（Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄは栄養療法において用いられる静脈内脂肪エマルジョンである）。処置群（ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド処置）にはＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ投与の３０および６０分前にＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド（２５μｇ）を注射し、それに対して対照群（□対照）には生理食塩水を投与する。血漿を単離し、ＦＦＡを前述の通りに測定する。その後、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ注射によって誘導されるピークに続く血漿ＦＦＡの減衰に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を監視する。
実施例１３：筋肉細胞によるインビトログルコース取り込み
Ｌ６筋肉細胞をヨーロピアンカルチャーコレクション（Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ）から得て７〜１１継代で用いる。細胞を標準組織培養培地ＤＭＥＭに維持し、グルコース取り込みを、従来記載されているように（Ｗａｌｋｅｒ，Ｐ．Ｓ．等（１９９０）Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ ｍＲＮＡ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．ＪＢＣ ２６５：１５１６−１５２３；およびＫｉｌｐ，Ａ．等（１９９２）Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｘｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｂｙ ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ ｉｎ Ｌ６ ｍｕｓｃｌｅ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：２５３５−２５４４、これらの開示は参照することによりそれらの全体がここに組み込まれる）、［3Ｈ］−２−デオキシグルコース（２ＤＧ）をＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドと共に、またはそれなしで、インシュリン（１０-8Ｍ）の存在または不在下において用いて評価する。２ＤＧの取り込みは対照（インシュリンまたはＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１の添加なし）と比較した変化パーセントとして表す。値は実験当たり４ウェルの組の平均±ＳＥＭとして示す。ウェルの組の間の相違をスチューデントのｔ検定によって評価し、確率値ｐ＜０．０５を有意であると考える。
実施例１４：齧歯類糖尿病モデルにおける代謝関連活性のインビボ試験
代謝プロフィールは肥満および糖尿病の様々な動物モデルの間で異なるため、複数モデルの分析を行って高血糖症、高インシュリン血症、高脂血症および肥満に対するＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの効果を分類する。実験動物のコロニー内の突然変異および食事療法に対する異なる感受性が、可能な肥満およびインシュリン耐性に関連する非インシュリン依存性真性糖尿病を患う動物モデルを開発している。遺伝モデル、例えば、マウスにおけるｄｂ／ｄｂおよびｏｂ／ｏｂ（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，（１９８２）３１：１−６を参照）並びにズッカーラットにおけるｆａ／ｆａが、疾患の病態生理の理解および新規抗糖尿病化合物の効力の試験のため、様々な研究室によって開発されている（Ｄｉａｂｅｔｅｓ，（１９８３）３２：８３０−８３８；Ａｎｎｕ Ｒｅｐ Ｓａｎｋｙｏ Ｒｅｓ Ｌａｂ（１９９４）４６：１−５７）。ホモ接合動物、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＵＳによって開発されたＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ−ｄｂ／ｄｂマウスは肥満、高血糖症、高インシュリン血症およびインシュリン耐性であり（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ，（１９９０）８５：９６２−９６７）、それに対して、異種接合体は痩身かつ正常血糖である。ｄｂ／ｄｂモデルにおいて、マウスは年齢と共にインシュリン減少症を進行的に発症し、これは血糖レベルの制御が不十分であるときにヒトＩＩ型糖尿病の後期段階において観察される一般的な特徴である。膵臓の状態およびその経過はモデルに従って変化する。このモデルはＩＩ型真性糖尿病のものに類似するため、本発明の化合物を血糖およびトリグリセリド低下活性について試験する。ズッカー（ｆａ／ｆａ）ラットは重度の肥満、高インシュリン血症、およびインシュリン耐性であり（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ．Ｓｈａｆｒｉｒ，ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ．Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ、Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）、ｆａ／ｆａ突然変異はマウスｄｂ突然変異のラット等価物であり得る（Ｆｒｉｅｄｍａｎ等、Ｃｅｌｌ ６９：２１７−２２０、１９９２；Ｔｒｕｅｔｔ等、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８：７８０６、１９９１）。タビー（ｔｕｂ／ｔｕｂ）マウスは、有意の高血糖症なしに、肥満、中度のインシュリン耐性および高インシュリン血症を特徴とする（Ｃｏｌｅｍａｎ等、Ｊ．Ｈｅｒｅｄｉｔｙ ８１：４２４、１９９０）。
従来、レプチンは、先天性リポジストロフィを患うマウスにおいてインシュリン耐性および真性糖尿病を逆行させることが報告された（Ｓｈｉｍｏｍｕｒａ等、Ｎａｔｕｒｅ ４０１：７３−７６（１９９９））。レプチンは、脂肪萎縮性糖尿病の異なる脂肪代謝異常マウスモデルにおいては有効性に劣ることが見出されている（Ｇａｖｒｉｌｏｖａ等、Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０（２０００）；あらゆる図面、数字、または表を含むその全体がここに組み込まれる）。
化学的に誘導される糖尿病のストレプトゾトシン（ＳＴＺ）モデルを、肥満の不在下における高血糖症の効果を調べるために試験する。ＳＴＺ処置動物はインシュリン欠乏性であり、重篤の高血糖症である（Ｃｏｌｅｍａｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３１：１，１９８２；Ｅ．Ｓｈａｆｒｉｒ，ｉｎ Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｍｅｌｌｉｔｕｓ；Ｈ．Ｒｉｆｋｉｎ ａｎｄ Ｄ．Ｐｏｒｔｅ，Ｊｒ．Ｅｄｓ．（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｅｄ．４，１９９０），ｐｐ．２９９−３４０）。肥満の重篤性が遺伝モデルよりも少なく、過食症、高インシュリン血症およびインシュリン耐性なしに発症する、化学的に誘導される肥満のグルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）モデル（Ｏｌｎｅｙ， Ｓｃｉｅｎｃｅ １６４：７１９、１９６９；Ｃａｍｅｒｏｎ等、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ５：４１、１９７８）も調べる。最後に、肥満を誘導するための非化学的、非遺伝的モデルには、齧歯類に高脂肪／高炭水化物（カフェテリア食）食を随意に給餌することが含まれる。
本発明は、上記齧歯類糖尿病モデルのいずれかもしくは全てにおいて、あるいはＩ型もしくはＩＩ型糖尿病または従来記載される他の好ましい代謝疾患を患うヒトあるいは他の哺乳動物に基づくモデルにおいてインシュリン耐性および高血糖症を減少させるためのＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの使用を包含する。本発明の組成物においては、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを、所望であれば、他の適合する薬理学的に活性の抗糖尿病薬、例えば、インシュリン、レプチン（米国仮出願第６０／１５５，５０６号）、またはトログリタゾンと、単独で、または組み合わせて会合させることができる。アッセイには、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドを腹腔内、皮下、筋肉内または静脈内投与することを除いて、Ａ−ＺＩＰ／Ｆ−１マウスを用いる、Ｇａｖｒｉｌｏｖａら（（２０００）Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１９１０−６；（２０００）Ｎａｔｕｒｅ ４０３：８５０）に従来記載されるものが含まれる。マウスのグルコースおよびインシュリンレベルを試験し、我々の実験において典型的に測定冴える他の因子、例えば、レプチン、ＦＦＡ、およびＴＧレベルの他に、食物摂取および肝臓重量を監視する。
ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドの抗高血糖活性のインビボアッセイ
遺伝的に改変された肥満糖尿病マウス（ｄｂ／ｄｂ）（オス、７〜９週齢）を、２２℃および５０％相対湿度の標準実験室条件下で収容し（７〜９マウス／ケージ）、随意のＰｕｒｉｎａ齧歯類固形試料および水の餌で維持する。処置に先立ち、各動物の尾静脈から血液を集め、Ｏｎｅ Ｔｏｕｃｈ Ｂａｓｉｃ Ｇｌｕｃｏｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅｓｃａｎ）を用いて血中グルコース濃度を決定する。２５０〜５００ｍｇ／ｄｌの血漿グルコースレベルを有するマウスを用いる。各々の処置群は７匹のマウスからなり、これらは研究の開始時に平均グルコースレベルが各群で等しくなるように分配されている。ｄｂ／ｄｂマウスに、イソフルラン麻酔を用いて挿入した微小浸透圧ポンプにより、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチド、生理食塩水および無関係ペプチドを皮下（ｓ．ｃ．）投与する。血液を尾静脈から１時間毎に４時間および投与後２４、３０時間にサンプリングし、血中グルコース濃度について分析する。食物を投与後０〜４時間から回収し、その後再導入する。個々の体重および平均食物消費（各々のケージ）も２４時間後に測定する。群（生理食塩水処置に対してＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１処置を比較する）間の有意差をスチューデントのｔ検定を用いて評価する。
インビボインシュリン感受性アッセイ
インビボインシュリン感受性を、以下のプロトコルによる２工程高インシュリン性−正常血糖性クランプを利用することによって調べる。実施例２において説明される様々なモデルのいずれかまたは全ての齧歯類を実験手順に先立って少なくとも１週間収容する。頚静脈および頸動脈カテーテルを配置するための手術を、無菌条件下で、ケタミンおよびキシラジン（ｉ．ｍ．）麻酔を用いて行う。術後、全ての齧歯類の意識を取り戻させ、個別のケージに入れる。ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、もしくはＧＭＧ−１１ポリペプチドまたはビヒクルを、完全に回復した後、頚静脈を介して続く２日間投与する。最後の処置の１６時間後、高インシュリン性−正常血糖性クランプを行う。齧歯類を拘束装置に入れて４μＣｉ［３−3Ｈ］グルコース（ＮＥＮ）のボーラスを投与した後、トレーサーを０．２μＣｉ／分（２０μｌ／分）の用量で連続注入する。トレーサー注入開始の２時間後、基礎測定のため、３つの血液試料（各々０．３ｍｌ）を１０分間隔（−２０〜０分）で収集する。その後、インシュリン注入を開始し（５ｍＵ／ｋｇ／分）、１００μｌ血液試料を１０分毎に採取して血漿グルコースを監視する。正常血糖に到達させ、かつそれを維持するため、血漿グルコースレベルに基づき、第２ポンプを用いて３０％グルコース溶液を注入する。一度５ｍＵ／ｋｇ／分インシュリンで定常状態が確立されたら（安定なグルコース注入速度および血漿グルコース）、グルコース、［３−3Ｈ］グルコースおよびインシュリンを測定するため、３つのさらなる血液試料（各々０．３ｍｌ）を得る（１００〜１２０分）。次に、より高用量のインシュリン（２５ｍＵ／ｋｇ／分）を投与し、グルコース注入速度を第２正常血糖クランプに調整して、血液試料を２２０〜２４０分に採取する。グルコース特異的活性を除タンパク質血漿において決定し、Ｒｄおよび肝グルコース排出（ＨＧＯ）の算出を記述されるように行う（Ｌａｎｇ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １３０：４３、１９９２）。次に、基底期間並びに５および２５ｍＵ／ｋｇ／分注入の後の血漿インシュリンレベルを決定し、ＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１処置およびビヒクル処置齧歯類の間で比較する。
グルコースホメオスタシスのインシュリン調節は２つの主要成分を有する；周辺グルコース取り込みの刺激および肝グルコース排出の抑制。グルコースクランプにおいてトレーサー実験を用いることで、インシュリン受容体のどの部分がＧＭＧ−７Ａ、ＧＭＧ−７Ｂ、ＧＭＧ−８、ＧＭＧ−９、ＧＭＧ−１０、またはＧＭＧ−１１ポリペプチドによる影響を受けるのかを決定することができる。
［配列表の詳細な説明］
配列番号１はＧＭＧ−７ＡのｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号２は配列番号１のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を表す。
配列番号３はＧＭＧ−７ＢのｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号４は配列番号３のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を表す。
配列番号５はＧＭＧ−８のポリヌクレオチド配列を表す。
配列番号６は配列番号５のポリヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を表す。
配列番号７はＧＭＧ−９のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号８は配列番号７のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を表す。
配列番号９はＧＭＧ−１０のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号１０は配列番号９のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を表す。
配列番号１１はＧＭＧ−１１のｃＤＮＡ配列を表す。
配列番号１２は配列番号１１のｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列を表す。

Claims (11)

  1. 代謝関連疾患または障害の治療または予防方法であって、ポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片を含有する組成物を個体に投与する工程を含み、前記ポリペプチドは、
    （ａ）配列番号２、
    （ｂ）配列番号４、
    （ｃ）配列番号６、
    （ｄ）配列番号８、
    （ｅ）配列番号１０、および
    （ｆ）配列番号１２
    からなる群より選択される、方法。
  2. 前記代謝関連疾患または障害が、
    （ａ）肥満、
    （ｂ）耐糖能異常、
    （ｃ）インシュリン耐性、
    （ｄ）Ｘ症候群、および
    （ｅ）ＩＩ型糖尿病
    からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ポリペプチド断片が、
    （ａ）配列番号２のアミノ酸２−７１０、
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸１−２６２、
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸１−２６３、
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸１−２７５、
    （ｅ）配列番号２のアミノ酸５５３−７１０、
    （ｆ）配列番号２のアミノ酸５５４−７１０、
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸５６８−７１０、
    （ｈ）配列番号２のアミノ酸５７５−７１０、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸２−４７１、
    （ｊ）配列番号４のアミノ酸１−２６２、
    （ｋ）配列番号４のアミノ酸１−２６３、
    （ｌ）配列番号４のアミノ酸１−２７５、
    （ｍ）配列番号４のアミノ酸１−４４２、
    （ｎ）配列番号４のアミノ酸１−４４３、
    （ｏ）配列番号６のアミノ酸２８−２０１、
    （ｐ）配列番号６のアミノ酸５４−２０１、
    （ｑ）配列番号６のアミノ酸６６−２０１、
    （ｒ）配列番号８のアミノ酸２５−４４６、
    （ｓ）配列番号８のアミノ酸２２８−３５６、
    （ｔ）配列番号８のアミノ酸２２８−３６０、
    （ｕ）配列番号８のアミノ酸２２８−４３１、
    （ｖ）配列番号８のアミノ酸２２８−４４６、
    （ｗ）配列番号８のアミノ酸２３１−３５６、
    （ｘ）配列番号８のアミノ酸２３１−３６０、
    （ｙ）配列番号８のアミノ酸２３１−４３１、
    （ｚ）配列番号８のアミノ酸２３１−４４６、
    （ａａ）配列番号８のアミノ酸２４１−３５６、
    （ｂｂ）配列番号８のアミノ酸２４１−３６０、
    （ｃｃ）配列番号８のアミノ酸２４１−４３１、
    （ｄｄ）配列番号８のアミノ酸２４１−４４６、
    （ｅｅ）配列番号１０のアミノ酸２４−２９６、
    （ｆｆ）配列番号１０のアミノ酸１３２−２９６、
    （ｇｇ）配列番号１０のアミノ酸１３５−２９６、
    （ｈｈ）配列番号１０のアミノ酸１４８−２９６、
    （ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、
    （ｊｊ）配列番号１２のアミノ酸５３−２０５、
    （ｋｋ）配列番号１２のアミノ酸５４−２０５、および
    （ｌｌ）配列番号１２のアミノ酸５９−２０５
    からなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. （ａ）配列番号２のアミノ酸２−７１０、
    （ｂ）配列番号２のアミノ酸１−２６２、
    （ｃ）配列番号２のアミノ酸１−２６３、
    （ｄ）配列番号２のアミノ酸１−２７５、
    （ｅ）配列番号２のアミノ酸５５３−７１０、
    （ｆ）配列番号２のアミノ酸５５４−７１０、
    （ｇ）配列番号２のアミノ酸５６８−７１０、
    （ｈ）配列番号２のアミノ酸５７５−７１０、
    （ｉ）配列番号４のアミノ酸２−４７１、
    （ｊ）配列番号４のアミノ酸１−２６２、
    （ｋ）配列番号４のアミノ酸１−２６３、
    （ｌ）配列番号４のアミノ酸１−２７５、
    （ｍ）配列番号４のアミノ酸１−４４２、
    （ｎ）配列番号４のアミノ酸１−４４３、
    （ｏ）配列番号６のアミノ酸２８−２０１、
    （ｐ）配列番号６のアミノ酸５４−２０１、
    （ｑ）配列番号６のアミノ酸６６−２０１、
    （ｒ）配列番号８のアミノ酸２５−４４６、
    （ｓ）配列番号８のアミノ酸２２８−３５６、
    （ｔ）配列番号８のアミノ酸２２８−３６０、
    （ｕ）配列番号８のアミノ酸２２８−４３１、
    （ｖ）配列番号８のアミノ酸２２８−４４６、
    （ｗ）配列番号８のアミノ酸２３１−３５６、
    （ｘ）配列番号８のアミノ酸２３１−３６０、
    （ｙ）配列番号８のアミノ酸２３１−４３１、
    （ｚ）配列番号８のアミノ酸２３１−４４６、
    （ａａ）配列番号８のアミノ酸２４１−３５６、
    （ｂｂ）配列番号８のアミノ酸２４１−３６０、
    （ｃｃ）配列番号８のアミノ酸２４１−４３１、
    （ｄｄ）配列番号８のアミノ酸２４１−４４６、
    （ｅｅ）配列番号１０のアミノ酸２４−２９６、
    （ｆｆ）配列番号１０のアミノ酸１３２−２９６、
    （ｇｇ）配列番号１０のアミノ酸１３５−２９６、
    （ｈｈ）配列番号１０のアミノ酸１４８−２９６、
    （ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸３３−２０５、
    （ｊｊ）配列番号１２のアミノ酸５３−２０５、
    （ｋｋ）配列番号１２のアミノ酸５４−２０５、および
    （ｌｌ）配列番号１２のアミノ酸５９−２０５
    からなる群より選択される、単離ポリペプチド断片。
  5. 担体および請求項４に記載のポリペプチド断片のうちの１以上を含有する、組成物。
  6. 請求項４に記載のポリペプチド断片のいずれか１つをコードする、単離ポリヌクレオチドまたはその相補体。
  7. （ａ）ＤＮＡ、
    （ｂ）ＲＮＡ、
    （ｃ）ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、
    （ｄ）一本鎖、および
    （ｅ）二本鎖
    からなる群より選択される、請求項６に記載のポリヌクレオチド：
  8. 担体および請求項７に記載の単離ポリヌクレオチドを含有する、組成物。
  9. 請求項７に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  10. 担体および請求項９に記載のベクターを含む、組成物。
  11. 請求項９に記載のベクターを含む、形質転換宿主細胞。
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