KR20080066916A

KR20080066916A - 에프린 비2를 이용한 혈관신생 억제 방법

Info

Publication number: KR20080066916A
Application number: KR1020087005246A
Authority: KR
Inventors: 키미히코 후지사와; 타츠수로 이시바시; 타다히사 카기모토; 유키오 사사
Original assignee: 아쿠멘 바이오파마수티칼즈 케이.케이.; 고쿠리쓰다이가쿠호진 규슈다이가쿠
Priority date: 2005-10-05
Filing date: 2006-10-05
Publication date: 2008-07-17
Also published as: IL190395A0; EP1932534A1; AU2006300222A1; CA2623563A1; JPWO2007043629A1; US20090270315A1; CN101257915A; WO2007043629A1

Abstract

본 발명은 혈관형성 및 신혈관신생에 의해 유래된 질환이나 장해를 치료하는데 효과적인 방법 및 조성물, 혈관형성 및 혈관신생을 억제하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 유효량의 에프린 B2를 포함하며, 본 발명의 방법은 유효량의 에프린 B2를 투여하는 단계를 포함한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물 및 방법은 혈관형성 또는 혈관신생과 관련된 질환 또는 장해를 치료하는데 유용하다. 본 발명의 조성물 및 방법은 또한 망막의 혈관신생을 억제할 수 있다.

에프린 B2, Ephrin B2, 혈관신생, 신혈관형성,

Description

에프린 비2를 이용한 혈관신생 억제 방법{Methods For Suppressing Neovascularization Using EphrinB2}

본 발명은 혈관 형성(angiogenesis) 혹은 혈관 신생(neovascularization)을 억제하는 방법 및 그 조성물에 관한 것으로서 특히 에프린 B2를 이용한 방법이나 조성물에 관한 것이다.

혈관형성(angiogenesis)은 가령황반변성증(age related mascular degeneration), 당뇨병성망막증(diabetic retinopathy), 미숙아 망막증(retinopathy of premature)과 같은 다양한 안과 질병에 수반되는 특징이다.

혈관형성의 캐스케이드(cascade)는 수개의 매개물질(mediators)과 케모카인(chemokines) 의해 촉발된다.

예를 들면, 내피 세포 수용체인 티로신키나아제(tyrosine kinases, RTKs)는 다단계 혈관 생성 과정에 관여하는 중요한 매개물질(mediators)인 것으로 파악되고 있다.

혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial cell grwoth factor, VEGFs)를 포함하는 혈관형성 사이토카인(cytokines)이 최초로 발생되는 것은 모세혈관의 발생 개념과 유사한 측면이 있다.

더욱이 최근에는 혈관 형성(angiopoietins)/Tie2 시스템이 혈관 어셈블리 및 성숙(maturation)을 매개하는 리간드-수용체(ligand-receptor) 시스템인 것으로 확인되었다. VEGF/VEGF 수용체 및 혈관 형성(angiopoietins)/Tie2 군도 RTKs로 분류된다.

에프린의 수용체인 Eph 수용체는 8개의 EphA 수용체 및 6개의 EphB 수용체로 구성되어 있으며, 티로신 키나아제 수용체 가장 큰 그룹을 이룬다.

Eph 수용체 티로신 키나아제군은 RTKs의 새로운 부류를 대표한다.

상기 군이 신경 경로 설정 분자(neuronal pathfinding molecules)로 확인되었으나 혈관형성에서의 역할은 불분명하였다.

유전자 결핍 생쥐 및 성숙한 에프린 B2-lacZ 유전자 쥐를 이용한 실험에서는 EphB 수용체와 에프린 B 리간드가 동정맥분화(arteriovenous differentiation) 및 경계형성(境界形成)을 편성하는 혈관 어셈블리의 중요한 조절인자(regulator)인 것을 확인하였다.

한편 유전자 타게팅(targeting) 실험에서는, 에프린 B2가 동맥 내피 세포의 초기 마커이며, 이 수용체인 EphB4가 척추동물의 배아에서는 정맥 내피 세포의 상보적인 마커임이 밝혀졌다(비특허 문서 1, 2, 4, 및 6).

더욱이, 성인의 경우에 내피 세포는 그러한 비대칭적 동정맥발현 패턴을 나타내고 있으며, 그것은 에프린B/EphB 계가 혈관 호메오트타시스(homeostasis)를 억 제하는 역할을 하고, 그래서 성인의 경우 병리학적 혈관 형성을 억제할 가능성을 가지고 있는 것으로 시사되고 있다(비특허 문헌 3).

또한 Eph 수용체의 안타고니스트(antagonist, 항체 등)가 주로 암의 혈관 신생을 억제하는 반면 아고니스트(agonist)는 자극한다는 것이 보고되어 있다(특허문헌 1).

따라서, 에프린의 작용 태양을 결정하는 것과 특히 병리학적인 상태에 있는 혈관계를 조작하는데 이러한 분자가 어떻게 사용되는지 결정하는 것이 바람직하다.

미국에서 당뇨병성 망막증은 20세 ~ 65세 성인이 실명하게 되는 주요원인이다.

당뇨병성 망막증에 수반되는 병적상태로는 망막의 미소혈관증 및 이의 연속적인 허혈증이다.

망막증(retinopathy)에 있어서, 저산소증(hypoxia)이 망막의 혈관신생을 발생시킬 수 있다는 것은 잘 알려져 있다.

그러나 망막혈관신생에 의해 새롭게 형성된 맥관(vascular channel, 脈管)에서는 혈류가 관류하지 않아 망막이 허혈상태가 된다.

이것은 맥관(vascular channels)이 미성숙하거나 누출성 출혈(diapedetic) 때문이다.

더욱이 이러한 맥관(vascular channel, 脈管)은 때때로 초자체안방(vitreous chamber)을 관통한다.

당뇨병성망막증의 이상적인 치료는 신장 방향이 잘못되어 있는 혈관(blood vessel)의 혈관신생을 억제하고 저산소증 망막을 관류할 수 있을 뿐만 아니라 저산소증으로부터 지킬 수 있는 성숙한 맥관을 얻는 것이다.

가령황반변성은 유럽과 미국에서 성인의 주요 실명 원인이 되고 있으며, 일본에서도 주요 3대 원인 중 하나이다.

환반에 맥락막으로부터 신생 혈관이 유입되는 것인 병증의 본질이며, 이러한 비정상적인 신생혈관으로부터의 출혈, 망막박리(retinal detachment)에 의해 실명에 이른다.

따라서 이러한 비정상적인 신생 혈관이 발생을 억제하는 것이 시각 기능을 유지하는데 있어서 본질적인 치료방법이다.

신생 혈관의 신장(extension)은 색소상피(pigment epithelia)가 신생혈관을 덮음으로서 억제된다고 알려져 있으나 그 메카니즘이 잘 알려져 있지 않다.

참고문헌

다음의 참고문헌은 본원 출원에 함께 수록되어 있다.

특허 문헌 1: 미국 특허 출원 공개 번호 제2004/0136983호

비특허 문헌 1 : Adams, R.H., et al. (2001). Cell 104(l):57-69.

비특허 문헌 2: Adams, R.H., et al. (1999). Genes Dev 13(3):295-306.

비특허 문헌 3: Gale, N. W., et al. (2001). Dev Biol 230(2):151-160.

비특허 문헌 4: Gerety, S. S., et al. (1999). Mol Cell 4(3):403- 414.

비특허 문헌 5: Shin, D., et al. (2001). Dev Biol 230(2):139-150.

비특허 문헌 6: Wang, H.U., et al. (1998). Cell 93(5):741- 753.

본 발명은 혈관형성(angiogenesis) 또는 혈관신생(neovascularization)을 억제하는 방법, 조성물, 예방 및 치료제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한 혈관형성 또는 혈관신생과 관련된 질환(disease)이나 장해(disorder)의 치료에 효과적인 방법, 조성물 및 예방치료제를 제공한다.

본 발명은 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에서 DNA 합성을 저해하는 방법을 제공하며, 이 방법은 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)를 유효량의 에프린 B2와 접촉하게 하는 공정을 포함한다.

일 실시예로서, 상기 DNA 합성은 혈관내피세포 증식인자(vascular endothelial cell growth factor, VEGF), 알카리성 섬유아세포 증식 인자(basic fibrolast growth factor, bFGF), 혹은 혈소판유래증식인자(platelet derived growth factor, PDGF)에 의해 유도된다.

본 발명은 또한 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에서 p44/p42 MAP 키나아제 활성화를 저해하는 방법을 제공하고, 이 방법은 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)를 유효량의 에프린 B2와 접촉하게 하는 공정을 포함한다.

다른 실시예에서는 상기 p44/p42 MAP 키나아제 활성화가 VEGF, bFGF 또는 PDGF에 의해 유도된다.

본 발명은 또한 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)로부터의 맥관형성을 저해하는 방법을 제공하고, 이 방법은 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)를 유효량의 에프린 B2와 접촉하게 하는 방법을 포함한다.

일 실시예로 상기 맥관형성(tube formation)은 VEGF, bFGF 또는 PDGF에 의해서 유도된다.

일 실시예로, 상기 접촉 방법은 에프린 B2를 상기 동맥 내피세포(혹은 정맥 내피세포)를 갖는 포유동물에 투여하여 수행할 수 있다.

본 발명은 또한 망막으로부터의 혈관신생을 억제하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 에프린 B2의 유효량을 개체에 투여하는 것을 포함한다.

일 실시예로서 상기 개체는 망막 외부에 병적인 혈관형성 또는 혈관신생을 갖는 것이거나 또는 망막 외부에 병적인 혈관형성 또는 혈관신생을 가질 가능성이 있는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 혈관형성 또는 혈관 신생과 관련된 질환이나 장해를 치료하는 방법을 제공하는데 이 방법은 치료를 요하는 개체에 에프린 B2의 유효량을 투여하는 것을 포함한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포(또는 정맥 내피세포)에서 DNA 합성을 저해하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명은 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에서 p44/p42 MAP 키나아제 활성화를 억제하는데 효과적인 조성물을 제공한다.

본 발명은 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥 내피세포(또는 정맥내피세포)로부터 맥관이 형성되는 것을 억제하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 망막으로부터 혈관신생을 억제하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 혈관신생과 관련된 질병이나 비정상적 징후의 치료를 위한 의약 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포(또는 정맥 내피세포)의 DNA 합성 저해용 제제를 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포(또는 정맥 내피세포)에서의 p44/p42 MAP 키나아제 활성화 저해제를 제공한다.

본 발명은 또한 유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포(또는 정맥 내피세포)의 맥관(tube) 형성 저해제를 제공한다.

또한 본 발명은 유효량의 에프린 B2를 포함하는 망막의 혈관신생을 억제제를 제공한다.

또한 본 발명은 유효량의 에프린 B2를 포함하는, 망막의 혈관신생과 관련된 질환 또는 장해 치료제를 제공한다.

상기 언급된 방법 또는 저해제, 억제제, 예방 또는 치료제 및 조성물에 대한 일 실시예로서, 상기 에프린 B2는 천연의 에프린 B2 세포외 도메인(extracelluar domain)을 포함하고, 막관통 도메인(membrane-spanning domain) 및 세포질 도메인(cytoplasmic domain)은 포함하지 않는다.

또 다른 방법 또는 저해제, 억제제, 예방 또는 치료제 및 조성물에 대한 일 실시예로서 질환이나 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내혈관신생(intraocular neovascularization), 각막혈관신생, 망막혈관신생, 맥락막혈관신생, 당뇨병성 황반부종, 당뇨병성망막허혈, 당뇨병성망막부종, 당뇨병성망막증, 암, 류마티스 관절염, 자궁내막증, 탈모증으로 구성된 군으로부터 선택된다.

또한, 상기의 방법이나 저해제, 억제제, 예방 또는 치료제 및 상기의 조성물에 대한 또 다른 실시예로서, 질환이나 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내혈관신생, 각막혈관신생, 망막혈관신생, 맥락막혈관신생, 당뇨병성 황반부종, 당뇨병성망막허혈, 당뇨병성망막부종, 당뇨병성망막증으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.

도 1A는 VEGF, bFGF 또는 PDGF-BB를 처리한 HAoECs에 있어서, 에프린 B2 처리 및 EphB4의 처리가 티미딘(thymidine) 흡수에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.

도 1B는 VEGF, bFGF 또는 PDGF-BB를 처리한 HUVECs에 있어서, 에프린 B2 처리 및 EphB4처리가 티미딘 흡수에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.

도 1C는 미처리, s에프린 B2 또는 EphB4중 어느 하나로 처리된 그룹과 s에프린 B2 및 sEphB4로 처리된 그룹에 대해 7일 후의 VEGF로 자극을 준 내피세포의 형성을 보여주는 사진이다.

도 2A는 VEGF 또는 bFGF로 자극을 준 HAoEC에 있어서 EFK 인산화(phosphorylation)에 대한 에프린 B2의 효과를 보여주는 전기영동사진이다.

도 2B는 VEGF자극을 준 HAoECs의 VEFG 수용체 2(KDR) 자동인산화에 대한 에프린 B2의 효과를 나타낸 전기영동 사진이다.

Figure 3은 bFGF와 에프린 B2를 동시에 투여한 쥐의 각막에 발생한 신혈관신생의 정량분석 결과를 도시한 그래프이다.

도 4는 대조구(A)와 s에프린B를 처리한 모델(B)의 플랫마운트된(flat-mounted) 플루오레세인 덱스트란(fluorescein-dextran) 관류망막(perfused retinas)의 형태를 도시한 형광현미경사진이다.

도 5는 대조구(OIR)와 s에피린B2 처리된 모델(OIR + 에프린 B2)에 있어서 무관류영역의 면적비를 보여주는 그래프이다.

도 6은 대조구(OIR(A) 및 s에프린 B2를 처리한 모델(OIR 및 에프린 B2)(B)의 P17 신생아 마우스의 망막표면의 형태를 도시한 주사전자현미경 사진이다.

도 7은 bFGF 처리한 HUVEC에 있어서, 마우스 에프린 B2처리 및 인체 에프린B2처리에 의한 티미딘 흡수의 영향을 나타내는 나타내는 그래프이다.

도 8은 10 ng/mL의 인체 에프린 B2 처리(A), PBS 처리(B), 10ng/mL의 마우스 에프린 처리(C)를 실시한 안저(眼底) 상태를 나타내는 형광 사진이다.

에프린 B2/EphB4계는 맥관형성 및 혈관형성에 중요한 역할을 한다.

본 발명은, 에프린 B2가 내피세포(EC)의 DNA 합성 및 VDGF 및 bFGF 유도 p44/p42MAP 키나제 활성화를 억제한다는 결과에 기초를 두고 있다.

에프린 B2 또한 EC에 의한 맥관 형성(tube formation) 을 저해한다.

더욱이, 쥐를 이용한 각막미세주머니검정법(corneal micropocket assay) 및 각막 혈관 신생의 정량 분석에 의하면 에프린 B2가 bFGF 유도 각막 혈관 형성을 억제한다.

그 때문에, 에프린 B2/EphB4 및 그 항혈관형성 신호 경로를 타겟으로 하여 혈관 형성 의존적 질환을 치료하는데 유용하다.

본 발명을 더욱 상세하게 설명하기 전에 본 명세서에서 사용되는 용어를, 다른 지시가 없는 한, 하기와 같이 정의한다.

[정의]

「에프핀 B2」란, 그 밖에 다른 지시가 없는 한, (1) 천연의 에프린 B2 또는 그 세포외 도메인(extracellular domain), 바람직하게는 천연의 사람 에프린 B2와 실질적인 서열 유사성을 가지는 폴리펩타이드; 및 (2) 천연의 에프린 B2 또는 세포외 도메인(extracellular domain)이 관여하는 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 말한다.

「에프린 B2」는 천연의 에프린 B2(바람직하게는 천연의 사람 에프린 B2) 및 그 세포외 도메인(extracellular domain), 및 상기 천연의 에프린 B2 또는 세포외 도메인의 생물학적 활성을 가지는 그러한 유사체(analog) 및 개변체가 포함된다.

에프린 B2의 서열(sequence)은 공지되어 있으며, 해당 기술 분야의 당업자는 세포 외 도메인, 막관통 도메인(membrane-spanning domain), 세포질 도메 인(cytoplasmic domain)의 서열과 위치를 충분히 인식하고 있다.

천연 에프린 B2와 같은 ‘천연’ 분자는 인공적인 개입없이 존재하는 분자이다. 그러나 천연 에프린 B2는 또한 인공적인 개입 없이 존재하는 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)이기도 하다.

'전체 길이(full-length)' 에프린 B2는 세포외(extracellular) 및 세포내(intracellular) 도메인을 모두 포함하는 에프린 B2이다. 전체 길이 에프린 B2는 천연의 것이거나 천연의 에프린 B2의 유사체(analog)이거나 개변체(variant)일 수 있다.

천연 분자와 실질적인 배열 유사성을 갖는 폴리펩티드는 아미노산 수준에서 천연 분자와 적어도 약 30% 정도 유사하다.

바람직하게는 상기 폴리펩티드는 천연의 분자와 아미노산 레벨로 적어도 약40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 동일하고, 바람직하게는 적어도 약 98% 동일하며, 더욱 바람직하게는 약99% 동일, 보다 더 바람직하게는 100% 동일하다.

천연 분자와의 유사체(analog) 또는 개변체의 ‘퍼센트 동일성’ 혹은 ‘% 동일성’이란 용어는 천연분자의 아미노산 서열과 유사체 또는 개변체에서 볼 수 있는 아미노산 서열이 일치하는 정도를 백분율로 나타낸 것이다.

퍼센트 동일성은 LALIGN, ClustalW, 또는 BLAST와 같은 해당 기술 분야에서 확립된 임의의 방법 또는 알고리즘에 의해서 결정될 수 있다.

폴리펩티드는, 천연의 에프린 B2에 대한 수용체에 결합 할 수 있거나 혹은 EC의 DNA 합성, EC에 있어서의 세포외 시그널 제어 키나제(ERK) 인산화, EC 맥관 형성, 혈관 형성, 또는 혈관 신생을 저해 할 수 있는 경우에 천연 에프린 B2의 「생물학적 활성」을 갖는다.

EC의 DNA 합성, EC에 있어서의 ERK 인산화, EC 맥관 형성, 혈관 형성, 또는 혈관 신생을 저해하는 활성은 본 명세서에 기재한 바와 같이 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 결정될 수 있다.

유효량은 의도하는 목적을 달성할 수 있을 정도로 충분한 물질의 양을 의미한다.

예를 들어, DNA 합성을 저해하기 위한 에프린 B2의 유효량은, 생체에서 혹은 실험실에서 조건에 따라 좌우되나, DNA 합성의 양을 감소시키기에 충분한 양이다.

질환 또는 장해를 처치하기 위한 에프린 B2의 유효량은, 질환 또는 장해의 징후를 저감 또는 제거하거나 질환 또는 장해를 예방 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다.

어떤 소정의 물질의 유효량은, 물질의 성질, 투여 경로, 물질을 수용하는 동물의 크기 및 종, 및 물질을 주는 목적 등의 인자에 따라 달라질 수 있다.

각각의 사안에 있어서 유효량은, 해당 기술 분야에서 확립된 방법에 따라서, 당업자에 의해서 경험적으로 결정될 수 있다.

용어 「개체」란, 임의의 동물을 의미하는데, 바람직하게는 사람 또는 사람 이외의 포유동물이며, 더욱 바람직하게는 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 또는 영장류, 가장 바람직하게는, 사람을 의미한다.

「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」은, 생리학적으로 정상적인 상태가 아 닌 혈관의 형성 또는 신생을 의미한다.

이러한 혈관은 미숙하고 누출성이기 때문에 혈액을 관류시킬 수 없는 혈관이 될 수 있다.

또한, 「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」이란, 생리학적으로 정상적인 상태와는 다른 양식으로의 혈관 형성 또는 신생일 수 있다.

예를 들어, 염증 등의 자극을 받아 새로운 혈관이 형성되는 것을 언급할 수 있다.

「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생을 갖거나 또는 그러한 가능성이 있는 개체」란, 상기와 같은 혈관 형성 또는 혈관 신생이 이미 생기고 있는 개체, 혹은 그러한 혈관 형성 또는 혈관 신생을 일으키는 요인이 있을 수 있는 개체를 말한다.

후자의 개체는 「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」이 발생되는 징후를 보이는 질병이나 장해에 의해 영향을 받았지만 아직 그러한 징후를 보이지 않는 개체 즉, 병적인 혈관형성 또는 혈관 신생을 일으키는 자극을 받는 개체 등일 수 있다.

「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」은 「망막내」또는 「망막외」에 생길 수 있다. 「망막외」란 망막의 조직 외부를 말한다.

이러한 혈관 형성 또는 혈관 신생은 예를 들어 망막으로부터 내경계막을 관통해 초자체(vitreous)내로 향하는 혈관의 형성 또는 신생, 및 망막으로부터 맥락막으로 향하는 혈관의 형성 또는 신생이 있다.

「혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련된 질환 또는 장해」는 상기의 「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」을 일으키거나 「병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생」으 로 인해 개체에 장애(malfunction)를 초래하는 모든 질환 또는 장해를 말한다.

이러한 질환 또는 장해로서, 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 암, 만성 관절 류머티즘, 자궁 내막증, 및 탈모증을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

질환 또는 장해의 「처치(treating)」란, 질환 또는 장해의 징후의 저감 또는 완전한 제거( 「치료」라고도 말한다), 또는 질환 또는 장해의 발생을 예방 또는 지연 시키는 것을 말한다.

용어 「처치의 필요가 있다」라는 것은 치료자(caregiver, 예를 들어, 사람에 대해서는 의사, 간호사, 임상 간호사 등; 동물(인간을 제외한 포유동물)에 대해서는 수의사)에 의해 이루어지는 판단을 의미한다.

상기 판단은, 임의의 조성물에 의해 처치 가능한 상태의 결과로서 개체가 현재 질병을 앓고 있다거나 장래에 질병을 앓게 될 수 있다는 등 치료자의 견해 범위 내의 다양한 요인에 근거하여 이루어질 수 있다.

「조성물」은, 적어도 1개의 활성 성분을 포함하며, 이 조성물이 적용 또는 투여되는 대상의 세포, 조직, 기관 또는 동물(바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 마우스, 래트, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 가장 바람직하지는, 사람)에 있어서 해당 활성 성분이 가지는 효과를 발휘시키는 것을 목적으로 하는 물질의 조합을 말한다.

당업자는 활성 성분이 당업자의 요청에 근거해 희망되는 효과적인 결과를 가 져올지를 결정하는데 있어서 적절한 기술을 이해하고 인식하고 있을 것이다.

「약학적 조성물」은, 적어도 1개의 활성 성분을 포함하며, 동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하지는, 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말, 또는 영장류, 가장 바람직하게는 사람에 있어서 해당 활성 성분이 가지는 약학적 효과를 발휘시키는 것을 목적으로 하는 물질의 조합을 의미한다.

당업자는 활성 성분이 당업자의 요청에 근거해 희망되는 효과적인 결과를 가져올지를 결정하는데 있어서 적절한 기술을 이해하고 인식하고 있을 것이다.

「저해제」, 「억제제」, 및 「예방 및 치료제」라 함은 적어도 1개의 활성 성분이, 해당 활성 성분이 가지는 효과를 발휘하기 위해 적용 또는 투여에 적절한 형태로 조제된 것을 말한다.

상기 제제(agent)는 상기 조성물이 적용 또는 투여되는 대상의 세포, 조직, 기관 또는 동물(바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는, 마우스, 래트, 다른 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 말 또는 영장류, 가장 바람직하게는 사람)에 있어서, 활성 성분이 가지는 효과를 발휘 할 수 있다.

[내피세포에 대한 에프린 B2의 효과]

내피세포(Endothelial cells)는, VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB(PDGF의 B 서브유닛 이량체(dimer))와 같은 증식 인자에 반응하여 증식이 유도될 수 있다.

동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에 있어서, 에프린 B2는 VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB의 모든 자극에 의해서 유도된 DNA 합성을 저해한다.

도 1A를 통해 알 수 있듯이, 10ng/mL의 VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB에 의해서 유도된 DNA 합성의 증가량은, 200ng/mL의 에프린 B2에 의해서 각각 40%, 30%, 및 90% 저해되었다.

인간의 제대 정맥내피세포(HUVEC)를 사용하는 경우에도 거의 동일한 결과를 얻을 수 있다(그림 1 B참조).

DNA 합성에 대한 에프린 B2의 저해 효과는 세포사멸(apoptosis)에 의해 유발되지 않았다.

따라서, 에프린 B2는 VEGF, bFGF 및 PDGF 등에 의한 다양한 자극에 의해서 유도된 EC DNA 합성을 저해할 수 있다.

에프린 B2(EphB4) 수용체가 정맥 내피 세포에 대한 마커로 작용하는데, 동맥 내피 세포가 이러한 수용체를 가지고 있다고 알려진 바 없었으나 DNA 합성은 정맥 내피 세포 및 동맥 내피세포 모두에서 저해되었다.

반면에, VEGF 유도 맥관 형성은 EphB4의 처리에 의해서 영향을 받지 않는다.

에프린 B2는 증식 인자 유도 유사 분열 반응(mitogenic response)을 저해한다.

이것은, 에프린 B2가 동맥 및 정맥 모두의 내피세포에 대해 VEGF 및 bFGF 유도 ERK(p42/44) 인산화를 억제하기 때문이다.

그러나, 에프린 B2는 VEGF 수용체 2 자동인산화를 저해하지 않는데, 이것은 VEGF 기능을 저해하는 메카니즘과 같이 에프린 B2가 VEGF와 VEGF 수용체 2와의 사이의 신호전달(signal transduction)을 방해하지 않는다는 것을 나타낸다.

따라서, 에프린 B2는, 다른 동맥 또는 정맥 내피 세포에 대해 VEGF 유도 ERK 인산화를 저해하기 위해서 사용될 수 있다.

bFGF는 강력한 혈관 형성 인자이다.

에프린 B2는 bFGF에 의해서 유도된 EC세포 증식을 저해 할 수 있다.

에프린 B2의 투여는 bFGF에 의해 유도된 혈관 형성을 현저하게 차단한다.

반면에 EphB4의 투여에서는 현저한 효과를 나타내지 않는다.

[Effect of ephrinB2 in in vivo model]

각막미세주머니검정법(corneal micropocket assay)은 대표적인 혈관신생의 인체모델이다.

상기 모델에 있어서, bFGF에 의해 유도된 혈관신생은 에프린 B2를 투여함으로써 현저하게 차단시킬 수 있다.

반면에 EphB4의 투여시에는 상기와 같은 효과를 나타내지 않는다.

산소 유도 망막증(OIR) 모델은, 당뇨병성 망막증의 동물 모델이다.

이 동물 모델에 있어서, 에프린 B2는 망막외로 향하는 병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생을 억제하고, 한편 망막중의 혈관망의 형성 및 혈관 성숙을 증강 시킬 수 있다.

레이저 유도에 의한 맥락막 혈관 신생(CNV) 모델은, 가령황반변성증(AMD)의 실험적 질환 모델과 자리 매김되고 있다.

에프린 B2는, 상기 CNV를 억제 할 수 있다.

이와 같이, 에프린 B2는, 망막내의 생리적인 혈류를 억제하는 일 없이, 망막외로 향하는 병적인 신생 혈관(비유, 맥락막 신생 혈관, 안경계막관통 신생 혈관)의 신생을 억제 할 수 있다.

이에 따라 에프린 B2는 병적인 혈관형성이나 혈관 신생을 억제하는데 사용될 수 있다.

따라서, 에프린 B2는 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련된 다른 질환 또는 장해 뿐만 아니라 가령황반변성증(age-related macular degeneration), 허혈성 망막증(ischemic retinopathy), 안내 혈관 신생(intraocular neovascularization), 각막 혈관 신생(corneal neovascularization), 망막 혈관 신생(retinal neovascularization), 맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization), 당뇨병성황반부종(diabetic macular edema), 당뇨병성 망막허혈(diabetic retina ischemia), 당뇨병성 망막 부종(diabetic retinal edema), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 암(cancers), 만성 관절 류머티즘(rheumatoid arthritis), 자궁 내막증(endometriosis) 및 탈모증(alopecia)의 치료에 유용하다.

또 다른 실시형태에서는, 에프린 B2는 눈의 혈관 형성 또는 혈관 신생과 관련된 질환 또는 장해의 처치에 유용하다.

에프린 B2는, 주로 현재 사용되고 있는 광선 역학적 요법(PDT) 및 여러 가지의 항혈관 형성 약제에 의한 치료에 의해서 통상 일으켜지는, 망막의 생리학적혈류에 피해를 주지 않는다.

따라서, 에프린 B2를 이용함으로써, 예를 들어, 망막의 생리학적 혈류에 피 해를 주지 않고 병적인 맥락막 혈관 신생을 억제하면서 습윤 및 초기 건조의 AMD 치료를 할 수 있다.

또한, 망막의 생리학적 혈류에 피해를 주지 않고 병적인 안경계막관통 혈관 신생을 억제함으로써 당뇨병성 망막증을 치료 할 수 있다.

[에프린 B2의 사용 및 투여]

본 발명에 유용한 에프린 B2는 필요한 활성을 갖는 유사체 및 개변체를 포함한 모든 임의의 에프린 B2일 수 있다.

에프린 B2는, 본 발명의 효과를 가지는 한 그 구조가 한정되지 않는다.

에프린 B2는 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 막관통 도메인 및 세포질 도메인을 포함하지 않는 것이거나 혹은 전체 길이일 수 있다.

또한 에프린 B2는 단축화된 단편이어도 괜찮다.

본 발명에서 사용되는 에프린 B2는 천연에 존재하는 단백질을 단리 정제 한 것이거나 유전자 재조합에 의해 미생물 등에서 생성된 것이어도 무방하다.

예를 들어, 미국 특허 제 6,303,769호 혹은 Mo1 Immunol. 1995Nov; 32(16):1197-205에 기재된 인체 에프린 B2 cDNA의 배열을 참조하여, 공지된 기술을 사용하여 전체 길이 단백질, 세포외 도메인을 포함한 단백질 등을 제작 할 수 있다.

당업자는 당업자가 통상 이용하는 기술을 사용하여 천연의 에프린 B2를 바람직하게 변형시킬 수도 있다.

또한 의약품이나 시약으로 시판되고 있는 에프린 B2를 사용하여도 무방하다.

특히, 에프린 B2를 약학적 조성물에 이용하는 경우에는 의료용으로 통상 사용되는 순도로 정제 된 것을 사용하는 것이 바람직하다.

예를 들어, 면역 특성을 고려하면, 에프린 B2를 면역 글로불린(immunogloblulin)의 Fc도메인(바람직하게는 사람 IgG의 Fc도메인)에 융합하여 개체에 투여하기 적합한 임의의 형태로 적절하게 변형시킬 수 있다.

덧붙여 후술하는 실시예에서는, 그 입수 용이성 때문에 가용성 에프린 B2(통상, 세포외 도메인을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는다)를 사람 Fc에 융합한 단백질을 사용한다.

그러나 이것은, 본 발명의 효과가, 실시예로 사용한 에프린 B2로 한정되는 것을 나타내는 것은 아니다.

에프린 B2를 포함한 조성물은 그 조성물을 개체(예를 들면, 피험동물)에 투여하거나 표본(예를 들어 세포(예를 들면, 내피세포, 특히, 동맥 또는 정맥 내피세표), 조직, 혹은 기관)에 적용하는데 적합한 여러 가지의 형태로 변형될 수 있다.

상기와 같은 형태를 조제하는 방법은 해당기술분야에서 주지되어 있다.

즉 본 발명은 또한 에프린 B2의 소정의 용도에 적절한 처방물을 제공한다.

소정의 용도에 적절한 처방물이란, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 「동맥내피세포 (또는 정맥내피세포)에 있어서의 DNA 합성을 저해하기 위한 저해제」, 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에 있어서의 p44/p42 MAP 키나제 활성화를 저해제」, 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)로부터의 맥관 형성을 저해하기 위한 저해 제」, 「망막으로부터의 혈관 신생을 억제하기 위한 억제제」등을 들 수 있다.

상기와 같이 에프린 B2를 포함한 처방물은, 에프린 B2의 작용을 방해하지 않고 상기 개체 또는 표본에 유해한 작용을 주지 않는 한, 에프린 B2 이외의 다른 성분을 포함할 수 있다.

이러한 처방물의 개체(예를들어, 피실험동물)에의 투여 또는 표본(예를 들면, 세포(예를 들어 내피세포, 특히, 동맥내피세포 또는 정맥내피세포) 조직, 혹은 기관)에의 적용은, 처방물중의 에프린 B2가 상기 개체 또는 표본에 접촉하는 양식으로 수행된다.

또한, 에프린 B2를 포함한 약학적 조성물은 개체의 투여에 적절한 여러 가지의 형태의 처방물일 수 있다.

이러한 형태의 처방물을 조제하는 방법은 해당 기술 분야에 주지되어 있다.

즉, 본 발명은 에프린 B2를 소정의 용도에 적절하게 맞도록 한 처방물도 제공한다.

소정의 용도에 적절한 처방물이란, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에 있어서의 DNA 합성을 저해하기 위한 저해제」, 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)에 있어서의 p44/p42MAP 키나제 활성화를 저해하기 위한 저해제」, 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)로부터의 맥관 형성을 저해하기 위한 저해제」, 「망막으로부터의 혈관 신생을 억제하기 위한 억제제」, 「혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련하는 질환 또는 장해의 처치를 위한 예방·치료제」등을 들 수 있다.

본 명세서에서는 「동맥내피세포(또는 정맥내피세포)」라고 하는 문언이 이용되고 있지만, 본 발명의 바람직한 실시태양은 동맥내피세포에 대한 것이다.

본 발명에서는 또한, 에프린 B2를 포함한 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 암, 만성 관절 류머티즘, 자궁 내막증, 및 탈모증으로 되는 군으로부터 선택되는 질환 또는 장해의 치료(처치)를 위한 약학적 조성물 혹은 예방·치료제를 제공한다.

에프린 B2는, 상기 질환 또는 장해 중 적어도 1개를 치료 또는 예방 할 수 있다.

이러한 에프린 B2를 포함한 조성물은 유효량의 에프린 B2와 약학적으로 수용 가능한 캐리어(담체)를 포함할 수 있다.

이 조성물은, 에프린 B2의 작용을 방해하지 않는 한, 약학적으로 수용 가능한 다른 성분(에프린 B2 이외의 혈관 신생 억제제를 포함한다)을 포함해도 괜찮다.

본 발명에서는 또한, 에프린 B2를 주로 포함한 약학적 조성물 혹은 예방·치료제도 제공된다.

에프린 B2는, 투여 경로에 적합하도록 약학적으로 수용 가능한 캐리어와 혼합하여 경구투여하거나 근육내 또는 정맥내 주사로 전신 투여될 수 있다.

생리학적으로 수용 가능한 여러 가지의 캐리어가 에프린 B2를 투여하기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 처방물은 당업자에게 공지되어 있으며, Remlngton's

Pharmaceutlmcal Sclences(제18판), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishlng Company, Easton, PA, Pollock 등에 기재되어 있다.

에프린 B2는, 바람직하게는, 비경구투여된다(예를 들면, 근육내, 복강내, 정맥내, 안내, 초자체내, 또는 피하 주사에 의해서, 혹은 이식에 의해서).

비경구투여를 위한 처방물은 멸균된 수용액 또는 비수용성 용액, 현탁액, 혹은 유화액의 형태일 수 있다.

수용성 캐리어로는 물, 완충수, 생리 식염수 등 여러 가지가 사용될 수 있다.

다른 적절한 비히클(vehicles)의 예로서는, 폴리프로필렌글리콜, 폴리에틸렌클리콜, 식물유, 젤라틴, 경화 나파렌(hydrogenated naphalenes), 및 올레인산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르를 들 수 있다.

이러한 처방물은 또, 보존제, 습윤제, 완충화제, 유화제, 및/또는 분산제와 같은 보조 물질을 포함할 수 있다. 생체 적합성, 생분해성의 락타이드폴리머(lactide polymer), 락타이드/글리콜라이드 코폴리머(lactide/glycolid copolymer), 또는 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌 코폴리머가, 활성 성분의 방출을 제어하기 위해서 사용될 수 있다.

혹은, 에프린 B2는, 경구 섭취에 의해서 투여될 수 있다.

경구 사용을 의도한 처방물은 해당 기술 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 고체 또는 액체 형태로 조제될 수 있다.

이 조성물은 보다 조호성이 좋은 조제물을 제공하기 위해서 필요에 따라 입미제, 향미제, 착색제, 착향제, 및 보존제를 포함할 수 있다.

경구투여용의 고체 투여 형태의 처방물로 캅셀제(capsules), 정제, 환약, 분제, 과립제를 들 수 있다.

일반적으로 이러한 처방물은, 비독성의 약학적으로 수용 가능한 부형제와 혼합된 활성 성분을 포함한다.

이것들로서는 예를들어, 탄산칼슘(calcium carbonate), 탄산나트륨(sodium carbonate), 락토스(lactose), 수크로오스(sucrose), 글루코오스(glucose), 만니톨(mannitol), 셀룰로오스(cellulose), 전분(starch), 인산 칼슘(calcium phosphate), 인산 나트륨(sodium phosphate), 카올린(kaolin)등과 같은 불활성 희석제를 들 수 있다. 결합제, 완충화제, 및/또는 활택제(예를 들어, 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate))도 사용될 수 있다.

또한, 정제 및 환약은, 장용 코팅(enteric coatings)과 함께 조제될 수 있다.

경구투여용의 액체 투여 형태의 처방물로서는, 약학적으로 수용 가능한 유제, 용액제, 현탁제, 시럽제, 및 연젤라틴 캅셀제를 들 수 있다.

이러한 형태의 처방물은 해당 물이나 기름 매체(oil medium)와 같이 기술분야에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제를 포함하고 또, 습윤제, 유화제, 현탁화제 등의 제제를 포함할 수 있다.

에프린 B2는 또한 패치(patch), 눈에의 직접 적용 혹은 이온 침투법에 의해서 국소적으로 투여될 수 있다.

에프린 B2는, 예를 들면, 미국 특허 제5,672,659호, 제5,595,760호에 기재되 어 있듯이 지속 방출 처방물로서 제공될 수 있다.

즉시 또는 지속 방출 조성물의 사용은 치료되는 장해의 성질에 따른다.

장해가 급성 또는 초급성 장해인 경우에는 지속 방출 처방물보다 즉시 방출 형태로의 치료가 매우 적합하다.

혹은, 예방 또는 장기 치료에 대해서는, 지속 방출 처방물이 적절하다.

에프린 B2는 또한 이식물(implant)을 통해 전달될 수 있다.

이러한 이식물은 생분해성 및/또는 생체 적합성 이식물이거나 혹은 비생분해성 이식물일 수 있다.

이식물은 활성 성분에 대해서 투과성 또는 비투과성일 수 있다.

눈 이식물(ocular implat)은, 전안방 또는 후안방과 같은 안방에 삽입되거나 강막(sclera), 맥락막 횡단강(transchoroidal space), 또는 초자체(vitreous)의 외면의 무혈관 영역에 이식될 수 있다.

매우 적합한 실시태양에, 눈 이식물은, 강막 위와 같은 무혈관 영역에 배치되어 치료 대상 부위, 예를 들면, 안내강 및 눈의 황반에의 약물의 경강막 확산을 가능하게 한다.

또한 경강막 확산의 부위는 바람직하게는 황반의 근처이다.

에프린 B2의 전달을 위한 이식물의 예로서는, 미국 특허 제 3,416,530; 3,828,777; 4,014,335; 4,300,557; 4,327,725; 4,853,224; 4,946,450; 4,997,652; 5,147,647; 5,164,188; 5,178,635; 5,300,114; 5,322,691; 5,403,901; 5,443,505; 5,466,466; 5,476,511; 5,516,522; 5,632,984; 5,679,666; 5,710,165; 5,725,493; 5,743,274; 5,766,242; 5,766,619; 5,770,592; 5,773,019; 5,824,072; 5,824,073; 5,830,173; 5,836,935; 5,869,079; 5,902,598; 5,904,144; 5,916,584; 6,001,386; 6,074,661; 6,110,485; 6,126,687; 6,146,366; 6,251,090; 및 6,299,895, 그리고 WO 01/30323 및 WO 01/28474(상기 모든 특허문헌은 참고문헌으로 본 명세서에 원용된다.)에 기재된 디바이스를 들 수 있으나, 이것으로 한정되지 않는다.

[투여량]

1회 투여제형을 제조하기 위해서 캐리어 재료와 결합하는 활성 성분의 양은, 처치하는 개체 및 특정의 투여 형태에 따라 유동적이다.

일반적으로는, 에프린 B2는 질환의 징후를 저감 또는 제거하기에 충분한 양이 투여되어야 한다.

처방에 있어서 1회분 투여량을 몸무게 1kg 당 1 μg에서 100 mg으로 하는 것이 일반적으로 혈관 신생 장해의 치료에 유용하다.

눈에 직접 투여하는 경우는 매우 적합하게는 안내 농도가 약 1 ng/mL에서 100ng/mL가 되도록 투여된다.

투여량을 단회투여로서 투여하거나 여러 번 분할하여 투여할 수 있다.다.

일반적으로 수개월 이상의 긴 투여 기간이 필요하게 될 수 있으나, 일반적으로 최소 수주에 걸쳐 설정된 간격으로 정해진 투여량(desired dosage)이 투여 되어야 한다.

당업자는, 정확한 개개의 투여량이 투여 시간, 투여 경로, 처방물의 성질, 배지속도(the rate of excretion), 치료 되는 특정의 장해, 장해의 상태(경중), 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 및 성별 등 여러 가지의 인자에 따라 유동적일 수 있다는 것을 이해할 것이다.

필요한 투여량의 변동의 폭은 여러 가지의 투여 경로에 따른 각각의 유효성을 고려해 예측 될 수 있다.

예를 들면, 경구투여는, 일반적으로, 정맥내 또는 초자체내 주사에 의한 투여에 비해 보다 많은 투여량이 필요할 것이 예측된다.

이러한 투여량 조절은 이것은 해당 기술 분야에서 공지된 것으로서 경험을 통해 얻어진 표준적인 최적화 절차를 이용해 조절될 수 있다.

정확한 치료를 위한 유효 투여량 및 방법(patterns)은, 바람직하게는, 상기의 인자를 고려해 주치의에 의해서 결정된다.

미리 존재하고 있는 혈관 신생 질환을 치료하는 것 외에, 에프린 B2는, 이러한 장해의 발병을 예방 또는 지연시키기 위해서 예방적으로 투여될 수 있다.

예방적인 적용에 있어서, 에프린 B2는, 특정의 혈관 신생 장해가 되기 쉬운 혹은 그 위험성이 있는 개체에 투여된다.

또한 투여되는 정확한 양은 개체의 건강 상태, 체중 등과 같은 여러 가지의 인자에 따른다.

이하, 실시예에 근거해 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이 실시예에 의해 제한되지 않는다.

[실시예]

이하의 실시예에 있어서, 하기의 약어는 하기의 의미를 가진다. 정의되어 있지 않은 약어는 일반적으로 수용되고 있는 의미를 가진다.

℃= 섭씨

hr = 시간

min = 분

sec = 초

μM = 마이크로 몰 농도

mM = 밀리 몰 농도

M = 몰 농도

ml = 밀리리터

μl = 마이크로리터

mg = 밀리그람

μg = 마이크로그람

DMEM = Dulbecco's modified Eagle's medium

ITS = Insulin-transferrin-selenium

FBS =소 태아 혈청(fetal bovine serum)

MEM = 변형 이글 배양지(modified Eagle's medium)

PBS = 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline)

VEGF = 혈관 내피 세포 증식 인자(vascular endothelial cell growth factor)

FGF = 섬유 아세포 증식 인자(fibroblast growth factor)

PDGF = 혈소판 유래 증식 인자(Platelet derived growth factor)

SDS = 도데실 황산나트륨(Sodium dodecyl sulfate)

PAGE = 폴리아크릴 아미드겔 전기 영동(polyacrylamide gel electrophoresis)

EC = 내피세포(endothelial cell )

HUVEC = 사람 제대 정맥 내피 세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell)

HAoEC = 사람 대동맥 내피 세포(Human Aortic Endothelial Cell)

OIR = 산소 유도성 망막증(oxygen-induced retinopathy)

CNV = 맥락막 혈관 신생(choroidal neovascularization)

AMD = 가령황반변성증(age-related macular degeneration)

본 실시예에 대해서는, 에프린 B2 및 EphB4로서 그러한 입수 용이성을 위해서 가용성 단백질(이하, 각각 「s에프린 B2」 및 「sEphB4」라고 하는; 이것들은, 세포외 도메인을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 단백질이다)을 이용했다.

마우스 s에프린 B2 및 sEphB4는 R&D Systems, Inc.(614 McKinley Place NE, Minneapolis 55413, USA)에서 입수했다(상기 s에프린 B2 및 sEphB4는 사람 Fc 도메 인과 융합한 형태이다).

하기 실시예 5에 기재한 바와 같이 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질 또한 에프린 B2로서 사용했다.

이하에 기재된 실험은 특별히 언급하지 않은 한 3회 반복하였으며, 대표적인 실험에서 얻어진 데이터(평균±SD)를 사용하였다.

정상 분포한 집단에 대한 스튜던트 t-검정을 하였으며, p가 0.05 미만인 경우에 통계학적 유의성이 있는 것으로 간주했다.

[실시예1:에프린 B2에 의한 증식 인자에 의해서 자극된 EC의 증식 및 이동의 저해]

증식 인자에 의해서 자극된 혈관내피세포에 대한 에프린 B2 및 EphB4의 효과를 조사하기 위해서, [³H]티미딘 흡수(uptake)―HAoEC 및 HUVEC의 DNA 합성 및 내피 맥관 형성 검정을 실시했다.

1.[³H] 티미딘 흡수(thymidine uptake)―HAoEC 및 HUVEC의 DNA 합성

사람의 대동맥내피세포 및 사람의 제대내피세포를 Clonetics Corp.(San Diego, California, USA)에서 구입하여 10%의 소 태아 혈청(FBS)을 보충한 Clonetics EGM 배양기 내에서 유지하였다.

내피세포 증식 보충물도, Clonetics에 의해 제공되었다.

HAoEC 및 HUVEC를, 1형 콜라겐으로 코팅 된 디쉬(Iwaki, Japan) 상의 내피 세포 증식 배지(Clonetics Corp., San Diego, California, USA)에서 5% CO₂, 95% 공기 중 37℃의 환경에서 배양하고, 배지를 2~3일에 한번씩 교환하였다.

4~5 계대의 세포를 실험에 이용했다.

EC를 에프린 B2 혹은 EphB4 200ng/mL의 존재 혹은 비존재 하에서 10ng/mL의 VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB와 함께 10%의 FCS를 포함한 DMEM(Nacalai tesque, Japan)에서 18시간 처리했다.

그 다음에, 상기 세포를 20μCi/mL의 [메틸-³H]티미딘 (Amersham)에 6시간동안 노출시켰다.

상기 세포를, 트립신으로 처리하고 자동 세포 채취기를 이용해 유리 섬유 필터 상에 회수한 후 [메틸-³H] 티미딘 흡수를 직접 β 카운터 상에서 측정했다.

결과를 도 1A와 도 1B에 나타내었다.

VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB로 처리된 사람 대동맥내피세포(HAoEC)를 미처리 컨트롤과 비교하였을때, DNA 합성이 310배에 증가했다.

에프린 B2는 이러한 자극에 의해서 자극된 DNA 합성을 저해하나 sEphB4나 s에프린 B2+sEphB4는 그렇지 않았다.

도 1A와 도 1B는 각각 HAoEC(그림 1A) 및 HUVEC(그림 1B)에 대한 VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB로 유도된 DNA 합성에 대한 s에프린 B2의 효과를 나타낸다.

도의 부호는 각각, C: 컨트롤(미처리), B2: s에프린 B2처리, B4:sEphB4 처리 를 나타낸다.

도의 * 표시는 그 결과가, 증식 인자로 자극하지 않는 미처리의 경우에 대해서 유의차가 있는 것을 나타내고 ** 표시는 같은 증식 인자로 자극했지만, s에프린 B2 또는 sEphB4로 처리하고 있지 않는 경우와 유의차가 있는 것을 나타낸다.

도 1A에 나타낸 바와 같이 10ng/mL의 VEGF, bFGF, 또는 PDGF-BB로 유도된 DNA 합성의 증가량은, 200 ng/mL의 s에프린 B2에 의해서, 각각40%, 30%, 및 90% 저해되었다.

사람흉대정맥내피세포(HUVEC)에 대해도 거의 같은 결과를 얻었다(도 1B).

(data not shown). 이 인큐베이션 기간중에, 현저한 아포토시스(apoptosis) 세포는 관찰되지 않았다(데이터 도시하지 않음).

2.내피맥관 형성 검정(assay)

‘빙냉(氷冷) 젤라틴 용액’(10×M199, H₂O, 0.53 M NaHCO₃, 200 mM L-글루타민, I형 콜라겐, 0.lM NaOH, 100:27.2:50:10:750:62.5(용량비))과 세포와 젤라틴 용액의 비율이 1:4인3×106 cells/mL의 농도를 가진 1×기본 배양지(이하를 참조)내의 ‘세포’를 함께 혼합하여 콜라겐 겔을 제조했다.

37℃에서 30분간 겔화한 후, 상기 겔을 40 ng/ml의 bFGF, 40의 ng/ml VEGF 및 80 nM의 PMA를 보충한 1%의 FBS, 1×ITS, 2mM의 L-글루타민, 50㎍/ml의 아스코르빈산, 26.5mM의 NaHCO₃, 100units/ml의 페니실린 및 110 units/ml의 streptomycin 으로 구성된 1× 기본 배지 상에 놓았다.

겔화 직후에 s에프린 B2 및 sEphB4(각 200ng/mL)를 1×기본 배양지에 첨가했다.

맥관 형성을 정량하기 위해서, 기본 배지를 첨가하고 48시간 이후에 고출력(20×) 시야(視野) 주변의 맥관의 수를 측정했다.

맥관은 100μm의 길이를 초과하는 1 이상의 내피세포로 구성된 연장된 구조물로 정의된다.

100㎛의 광학적 단락에 의해 분리된 5개의 독립된 시야를 각 웰(well)에 대해서 평가하고, 20× 시야 주변의 맥관의 평균수를 측정했다.

Boehringer Mannheim에서 구입한 셀 증식 킷 II를 이용하여 세포 상해성(cytoxicity)을 평가 하였다.

또한, 대조구(미처리), s에프린 B2 혹은 sEphB4로 처리된 그룹 및 s에프린과 sEphB4로 모두 처리된 그룹에 대해 처리 7일 후에 VEGF로 자극된 내피세포의 형태를 관찰하였다.

도 1C는 대조구(미처리), s에프린 B2 또는 sEphB4으로 처리, s에프린 B2와 sEphB4를 모두 처리 7일 후, VEGF로 자극된 내피세포의 맥관 형성 상태를 나타내는 사진이다.

VEGF에 의해 유도된 맥관 형성은, 7일째에는, 대조구와 비교하였을 때, s에프린 B2 처리군에서 감소하고 있었다(그림 1C).

반대로, VEGF에 의해서 유도된 맥관 형성은, sEphB4 처리에 의해서 영향을 받지 않았다.

따라서, 에프린 B2는, VEGF, bFGF, 및 PDGF를 포함한 여러 가지의 자극에 의해서 유도되는 EC의 DNA 합성을 저해 할 수 있다는 것을 알 수 있었다.

에프린 B2의 정확한 메카니즘은 분명하지 않지만, DNA 합성이 감소된 것은 세포 상해성의 평가에 의해 현저한 세포사멸(apoptosis) 세포가 없었던 것으로 보아 세포사멸(apoptosis)에 의해서 일으켜진 것은 아니다고 생각된다.

DNA 합성이 정맥내피세포 및 동맥내피세포의 양쪽 모두에서 저해되는 것은 놀라운 일이다. 왜냐하면, 에프린 B2의 수용체(EphB4)는, 정맥내피세포의 마커이지만, 동맥내피세포는 이러한 수용체를 가지는 것으로 알려져 있지 않기 때문이다.

DNA 합성에 대한 효과와 일치하는 것으로 보아, 에프린 B2는 VEGF에 의해서 유도된 EC맥관 형성을 저해 할 수 있다.

[실시예2: 증식 인자로 유도된 p42/44 ERK 인산화 및 수용체 자동 인산화에 대한 에프린 B2의 효과]

내피세포에서 VEGF 또는 bFGF로 유도된 유사 분열 반응을 에프린 B2가 저해하는 메카니즘에 대해서, 내피세포의 VEGF 또는 bFGF로 자극된 ERK(p42/44) 인산화에 대한 에프린 B2의 효과를 웨스턴 분석에 의해서 조사하였다.

EC를 s에프린 B2 50ng/mL의 존재 또는 부존재 하의 EGM-DMDM(3% FBS 포함)(Nacalaitesque, Japan)에서 1시간 동안 방치했다.

또한 10 ng/mL의 bFGF 또는 10 ng/mL의 VEGF로 EC를 5분간 처리했다(대조구 는 미처리함).

내피세포에서 추출한 단백질 시료의 조제 및 웨스턴 블로팅은 이하에 의한다. 전세포 라이세이트, 사이트 졸 추출물 또는 핵추출물은 내피세포로부터 분리하였다.

웨스턴 블로팅은 면역 침강(immunoprecipitation)을 이용하거나 이용하지 않고 수행되었다.

단백질 시료를, 도데실 황산나트륨-폴리아크릴 아미도겔 전기 영동(SDS-PAGE)에 의해서 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 전기장을 이용하여 이동하였다(electrophoretic transfer).

스킴 밀크(skim milk)로 블로킹 한 후, 블롯(blots)을 phosphotyrosine 혹은 KDR(sc-504)에 대한 항체(Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, California, USA)에서 구입)와 함께 4℃에서 하룻밤 배양하였다(1:500).

세정 후, 멤브레인(membranes)을 호스래디시 퍼록시데이즈(horseradish peroxidase)로 표지된 2차 항체(Bio-Rad, Richmond, California, USA)(1:3000)을 함께 1시간 동안 실온에서 배양하였다.

제조업자의 지시서에 따라서 아머샴(Amersham) 증강 화학 발광(Enhanced Chemiluminscence, ECL) 검출 시스템을 이용하여 가시화를 수행하였다.

도 2A는 VEGF 또는 bFGF로 자극한 HAoEC에 있어서의 ERK 인산화에 대한 에프린 B2의 효과를 나타내는 전기 영동 사진이다(p44/p42: 총 ERK).

ERK 인산화는, 10ng/mL의 VEGF로의 처리 또는 25ng/mL의 bFGF로의 처리에 의 해서 증가했다.

s에프린 B2는, VEGF 및 bFGF 유도 ERK 인산화를 모두 억제했다.

예를 들어, 200 ng/mL의 s에프린 B2는, VEGF 유도 ERK 인산화를 70% 저해했다.

따라서, VEGF 자극 및 bFGF 자극에 의한 HAoEC에 있어서의 ERK 인산화를 에프린 B2가 저해한 것을 알 수 있다.

다음으로 VEGF에 의해 자극된 HUVEC에 있어서 VEGF 수용체 2(KDR) 자동 인산화에 대해 검토했다.

EC를 50ng/mL의 s에프린의 존재 혹은 비존재 하의 EGM-DMEM(3%의 FCS 포함)에서 1시간 동안 방치했다.

또한 EC를 10 ng/mL의 bFGF 혹은 10ng/mL의 VEGF로 5분간 처리했다(대조구는 미처리했음).

상기와 같은 방법에 의해서, 수용체(KDR)을 세포 라이세이트(cell lysates)로부터 면역 침강(IP)시키고, phosphotyrosine 항체(PY20)로 블롯팅을 수행하였다.

Figure 2B is an electrophoretic photograph showing the effects of ephrinB2 on VEGF receptor 2 (KDR) autophosphorylation in VEGF-stimulated HAoECs.

도 2B는 VEGF로 자극한 HAoEC에 있어서의 VEGF 수용체 2(KDR) 자동 인산화에 대한 에프린 B2의 효과를 나타내는 전기영동 사진이다.

도 2B는 에프린 B2가 VEGF 자극한 HAoEC에 있어서 VEGF 수용체 2의 자동 인 산화에 대해서 현저한 효과가 없는 것을 나타내 보인다.

VEGF 수용체 2 자동 인산화는 10 ng/mL의 VEGF에 의해서 14배 증가했다.

s에프린 B2는, VEGF 수용체 2 자동 인산화를 저해하지 않았다.

상기 언급한 두 개의 phosphorylation 검정에서도 HUVEC를 이용한 경우에도 거의 동일한 결과를 얻었다(데이터 도시하지 않음).

따라서, 에프린 B2가, 내피세포(동맥정맥)에 대해 VEGF 또는 bFGF로 유도된 ERK 인산화를 저해하는 것을 알 수 있었다.

이 효과는 아마, 적어도 일부는, 에프린 B2가 이러한 세포의 VEGF 또는 bFGF로 유도된 증식을 저해하는 활성을 설명 할 수 있다.

그러나, 에프린 B2는, VEGF 수용체 2의 자동 인산화를 저해하지 않는다.

따라서, 에프린 B2는, VEGF 기능을 저해하는 메카니즘으로서 VEGF와 VEGF 수용체 2 사이의 신호 전달을 방해하지 않는다.

[실시예 3: 마우스 각막에 있어서의 에프린 B2의 동시 투여에 의한 bFGF로 유도한 혈관 형성의 저해]

알칼리성 FGF(bFGF)는, 강력한 혈관 형성 인자인 것이 알려져 있다.

에프린 B2는, bFGF에 의해서 유도된 EC세포 증식을 저해 할 수 있으므로, 에프린 B2가 혈관 형성을 억제 할 수 있는지에 대해서 검토했다.

우리는 Kenyon, B.M. et al., (1996) Ophthalmol. Vis. Sci., Vol. 37(8):1625-1632에 의해 이미 공개된 방법에 약간이 변형을 가하여 쥐에 대해 막미 세주머니검정법(corneal micropocket assay) 및 각막의 신혈관신생의 정량적인 분석을 수행하였다.

요약하면, 90 ng의 사람 bFGF를 포함한 0.3μl의 Hydron pellet(IFN Sciences, New Brunswick, New Jersey, USA)를 조제해, 수컷 BALB/c 마우스의 각막에 이식했다.

s에프린 B2 또는 sEphB4(100 ng/pellet)를, bFGF/Hydron 용액에 직접 첨가했다.

The pellet was positioned 1.0 mm from the corneal limbus.

pellet를 각막연(corneal limbus)으로부터 1.0 mm인 위치에 배치했다.

이식 후, 오플록사신(ofloxacin)/점안제를 각 안(眼에) 적용했다.

6일 후, 동물을 도살해, 그리고 각막 혈관을 사진 촬영했다.

마우스 각막의 혈관 신생의 정량 분석은 소프트웨어 패키지 NIH Image를 이용하여 수행하였다.

그 결과, pellet의 이식의 6일 후, 새로운 혈관이 발생된 것을 확인하였다.

bFGF는, 마우스 각막에 대해 혈관 형성을 극적으로 유도했다.

게다가 bFGF로 유도한 각막 혈관 신생에 대한 s에프린 B2 또는 sEphB4의 효과를 검토했다.

s에프린 B2의 투여에 의해, bFGF에 의해서 유도된 혈관 형성은 현저하게 차단 되었지만, sEphB4의 투여에서는 효과는 없었다.

도 3은 bFGF와 에프린 B2를 동시 투여한 마우스 각막에 있어서의 혈관 신생 의 정량 분석 결과를 나타낸 것이다.

도 3의 세로축은, 혈관 신생을 가지는 영역의 면적의 수치이며, bFGF의 존재하에서의 혈관 신생을 가지는 영역을 100%로 했을 경우의 비율을 나타낸다(%).

바(bars, 가로축)는, 각 군에 있어서의 모든 동물에 대한 SD이다(1군에 대해 n=6).

정량 분석에 의해서, bFGF로 유도한 각막 혈관 신생이, 에프린 B2에 의해서 완전하게 저해된 것이 확인되었다(그림 3).

[실시예 4·산소 유도성 망막 혈관 신생에 대한 에프린 B2의 효과]

C57BL/6J 마우스(SLC Japan으로부터 입수)를 이용하고, 아래와 같이 산소 유도성 망막증(OIR) 모델을 제작했다.

생후 7일째(P7)의 마우스와 그 어미를 75% 고산소 상태로 한 상자에 5일간 넣었다.

5일 동안 고산소 상태에 두었던 생후 12일째(P12) 쥐를 통상의 20% 산소농도 상태에 되돌려, 그 후의 망막 혈관 반응에 대해 관찰했다.

상기와 같이 처치한 마우스는, 광범위한 망막 혈관 신생의 발달을 나타냈다.

망막 혈관 신생은, P19의 동물에서 100% 발생율을 나타내었다.

P19에서 신생 혈관 다발은 명백하게 나타났으며, 특히 중간 주변부에 있고, 내경계막으로부터 초자체로 향해 신장되었다.

망막 혈관 신생에 대한 에프린 B2의 효과를 검토하기 위해서, P13 및 P15의 OIR 마우스에, 100μL의 PBS 중 s에프린 B2를 200μg(n=6마리) 또는 대조구에 PBS만 200μL(n=6마리)을, 하루에 1회, 복강내 주사했다.

P17의 망막 혈관 신생을 평가했다.

하기와 같은 프로토콜에 따라서, 플루오레신 덱스트란 혈관조영법을 이용해 플랫 마운트한 망막을 평가했다(Lab Invest. 2004; 84(8): 973-80).

우선, 마우스를 깊이 마취시켜 2×10⁶ 분자량 플루오레신 덱스트란(Sigma 社)의 50mg/mL 용액을 체중 1g 당 0.03mL 분량으로 좌심실에 관류하도록 하였다.

눈을 적출하여 적어도 3시간 동안 4%의 파라포름알데히드로 고정하였다.

그 다음에, 각막과 수정체를 없애고 주위 망막을 해부하여 형광 현미경하에서의 시험을 위해서 현미경 슬라이드상에 플랫 마운트했다.

대조구 및 s에프린B-처리 모델에 대해 플랫 마운트한 플루오레신 덱스트란 관류 망막의 형광 현미경 사진을 그림 4에 나타내었다(A: 대조구 OIR 모델, B: s에프린 B -처리 모델).

s에프린B-처리 모델을 플랫 마운트 망막의 중심부에서 주변부로 갈수록 명료하게 흰 것을 볼 수 있다(그림 4B).

이것은, 망막내에 플루오레신 덱스트란이 관류될 수 있는 정상적인 혈관이 존재하는 것을 나타낸다.

OIR 모델(도 4A)에 비해서 s에프린B-처리 모델에서는 정상 혈관의 존재가 비교적 많이 관찰되었다.

또한, 플랫 마운틴된 플루오레신 덱스트란 관류 망막의 형광 현미경 사진을 비관류 영역의 면적을 측정하기 위해 소프트웨어를 이용하였다.

도 5는 대조구(OIR) 및 s에프린 B2 처리 모델(OIR+s에프린 B2)의 무관류영역의 면적비를 그래프로 나타낸 것이다.

도 5의 세로축은, 무관류 영역의 면적비를 나타낸 것인데, OIR 모델의 무관류 영역의 면적을100%로 했을 경우의 비율을 나타낸다(%).

바(bars, 가로축)는 각 군에 있어서의 모든 동물에 대한 SD이다(1군에 대해 n=6).

도 5로부터 s에프린 처리 모델은, 컨트롤 모델과 비교해 무관류 영역의 면적이 감소하고 있는 것을 알 수 있다.

s에프린 B2 처리 모델과 대조구의 망막 무혈관비는, 통계학적으로 의미가 있다(도 5에서 **으로 표시 된 것: p<0.01).

또한, 주사형 전자현미경(SEM)을 이용하여 신생 혈관의 신생에 대한 s에프린 B2의 효과를 검토했다.

Cell Tissue Res. (1992) 270:165-172에 이미 기재된 바와 같이 혈관 시스템의 분석을 위해 최적화된 조건 하에서 주사 투과 전자 현미경(scanning transmission electron microscopy)으로 관찰하였다.

히타치 H-800 투과형 현미경 및 S-800 주사 전자 현미경으로 사진 촬영했다.

도 6은 대조구(OIR)(A) 및 s에프린 B2 처리 모델(OIR+에프린 B2)(B)의 P17 신생아 마우스의 망막 표면을 나타내는 SEM 사진이다(초자체측으로부터 망막을 바 라본 것).

도 6A의 대조구 사진에 대해서는, 망막으로부터 초자체내로 향하는 비정상인 신생 혈관(내 경계 막관통 신생 혈관)의 신생이 관찰되었다(특히, 사진의 우측에서의 구멍과 같은 부분).

도 6의 s에프린 B2 처리된 모델의 사진에서는 그러한 구멍과 같은 부분은 관찰되지 않은 것으로 보아 초자체내로 신혈관의 신생이 억제된 것으로 보인다.

따라서, OIR 마우스를 s에프린 B2처리함으로써, 내경계막(the membrane)에 대해 거의 평행 방향으로 성장하는 혈관망을 볼 수 있었지만, 초자체 방향으로 발생하는 신혈관 신생이 억제되었다.

또한, s에프린 B2 처리에 의해, 망막의 혈류 자체를 줄어들지 않았다.

이것은, 혈관 발달에 있어서 s에프린 B2의 중요한 역할이다.

s에프린 B2는, 망막외로 향하는(본 실시예의 경우, 초자체에 대해서 신장 한다) 병적인 혈관 신생을 억제할 뿐만 아니라, 망막 중의 혈관망의 형성 및 혈관 성숙을 증강시키는 역할을 할 수 있다. 이러한 효과는, 당뇨병성 망막증의 치료에 가장 적절하게 적용될 수 있다.

[실시예 5: 사람 에프린 B2에 의한 혈관 신생 억제 효과]

본 실시예에서는, 사람의 DNA 라이브러리에서 유래된 에프린 B2와 사람 Fc의 융합 단백질을 제작해, 그 혈관 신생 억제 효과의 평가를 실시했다.

1.사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질의 제작

하기와 같이, 사람 에프린 B2의 cDNA 단편을 사람 IgG1 항체의 Fc부분을 코드 하고 있는 cDNA의 5'말단에 융합시켰다.

이 사람 에프린 B2의 cDNA의 서열은 미국 특허 제 6,303,769호 혹은 Mo1 Immunol. 1995 Nov; 32(16): 1197-205를 참고로 했다.

Fc의 클로닝을 하기와 같이 수행하였다. 사람의 패장(비장이라고도 함, spleen) cDNA 라이브러리(100ng)를 주형으로 하여 순서 방향 프라이머: GAA GAT CTC CCA AAT CTT GTG ACA AAA CTC (서열 번호 1) 및 역방향 프라이머:GCG GCC GCT CAT TTA CCC GGA GA (서열 번호 2)를 이용하고 KODplus(TOYOBO)를 이용하여 PCR을 실시했다.

증폭된 약 700bp의 DNA 단편을 정제하여 정제된 DNA 단편을 Teasy 벡터(Promega)에 서브 클로닝 해, 사람 IgG1Fc인 것을 확인했다.

사람 에프린 B2의 클로닝을 하기와 같이 수행하였다.

사람 태반 cDNA 라이브러리(100ng)를 주형으로서 순서 방향 프라이머 :GCG AAG CTT ACC ATG GCT GTG AGA AGG GAC(서열 번호 3) 역방향 프라이머 :GCG AGA TCT GGC CAC TTC GGA ACC GAG GAT(서열 번호 4)를 이용하고 KODplus(TOYOBO)를 이용하고 PCR를 실시했다.

증폭된 약 680bp의 DNA 단편을 정제 했다.

정제 한 DNA 단편을 Teasy 벡터(Promega)에 서브 클로닝 해, 염기 배열을 확인했는데, 상기 사람 에프린 B2 cDNA의 염기 배열의 1-678번째의 염기 위치에서 나 타나는 678 bp의 DNA 단편이었다.

사람 에프린 B2 DNA 단편에 의해 코딩되는 단백질은, 사람 에프린 B2단백질의 세포외 도메인을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인은 포함하지 않는다고 추정된다.

클론된 EFN-B2 DNA 단편에 있어서, 5'말단을 HindIII, 3'말단을 Bg1II 제한 효소로 처리했으며, Fc의 DNA 단편의 5'말단을 BglII, 3'말단을 NotI 제한 효소로 처리했다.

이러한 단편을 포유동물계 발현 벡터 pcDNA4-Myc-His A(Invitrogen)를 HindIII 및 NotI 제한 효소로 처리한 것과 DNA Ligation kit ver. 2.1(TAKAM)을 이용해 3자 라이게이션(three-piece ligation)을 실시했다.

라이게이션에 의해 얻은 벡터를 대장균 XL21에 형질 전환했다.

생육한 대장균 콜로니로부터 핵외 유전자(플라스미드)를 정제 해, 염기 배열을 확인했는데, 사람 EFN-B2(1-678bp)-Fc였다.

이 핵외 유전자(플라스미드)를 HEK293 세포에 도입해, 이하의 배양 조건에서 배양했다.

배양지는, DMEM(Sigma)에 10% FBS(Biowest Fetal Bovine Serum) 및 항생 물질(GIBCO 1% 페니실린 및 1% 스트렙토마이신)을 첨가한 것을 이용했다.

5% CO₂ 인큐베이터내에서 37℃로 3일간 배양했다.

에프린 B2 안정 발현주(cell line)를 인산 칼슘법(calcium phosphate method)에 따르는 유전자 도입 및 Zeocin 250μg/mL(invivogen)에 의한 약제 선택에 의해서 취득했다.

안정 발현주로부터 배양상청을 모으는 경우는, GIT 배지(Nihon Pharmaeutical Co., Ltd.)에서 배양했다.

다음으로 에프린 B2-Fc 안정 발현주(stable cell line)로부터, 하기와 같이 발현 단백질을 정제 했다.

약 100 mL 배양상청을 회수하여 원심분리(1100 rpm, 5분, 4℃)해 죽은 세포 등의 찌꺼기를 제거했다.

거기에 프로테인 A-세파로스(sepharose) 100μL를 더해 4℃에서 2시간 회전시켰다.

그 후, 원심분리(2000 rpm, 5분, 4℃)에 의해 상청(supernatant)을 제거하고 침전물(sepharose+에프린 B2)에 세정 완충액(10mM Tris-HCl ph7.4, 150mM NaCl, 0.1% NP40)을 첨가하여 비특이적 흡착 단백질을 제거했다.

이 세정 조작을 3회 수행하였다.

3회 세정 후, 용출 완충액(0.lM 글리신 pH 3.0) 70μL을 더해 10분간 빙상에 방치하고 원심분리(2000 rpm, 2분 , 4℃) 후에 침전물을 수거했다.

이 조작을 7회 반복했다.

모은 상청의 단백 농도를 OD280의 흡광도에서 측정했다.

단백 농도가 높았던 것을 회수하여 1M Tris-HC1 pH8.0의 1/10을 첨가하고 중화 해, 인 완충 생리 식염수로 하룻밤 투석을 실시했다.

투석 후 샘플을 회수해, BCA법에 의해서 단백질을 정량 분석을 하였다.

동시에 비환원화 또는 환원화 상태로 SDS-PAGE를 실시해, 분자량에 의해서 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질인 것을 확인했다.

2. [³H] 티미딘 흡수―HUVEC의 DNA 합성

실시예 1과 같은 방법으로 상기 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질에 대해 HUVEC의 DNA 합성에 대한 효과를 조사하였다.

단, EC를, 10% FCS를 포함한 DMEM(Nacalai tesque, Japan)에서 18시간 동안 처리하였다. 상기 FCS는 1nM, 10nM 혹은 100nM의 사람 에프린 B2-Fc 단백질의 존재 혹은 비존재 하의 0.6nM bFGF를 가진다.

여기서, 포지티브 컨트롤로서 100 nM의 마우스 에프린 B2-사람 Fc chimeric 단백질(R&D Systems, Inc. (614 McKinley Place NE, Minneapolis 55413, USA))을 사용했다.

도 7에 HUVEC에 의한 티미딘 흡수 결과를 나타내었다.

도 7의 세로축은 bFGF 및 에프린 B2처리가 없는 경우에 대한 비율(%)을 나타낸다.

에프린 B2 처리를 가하지 않고 bFGF(0.6nM)로 HUVEC를 자극했을 경우, bFGF 를 처리하지 않은 대조구와 비교해 봤을때 DNA 합성을 약 5배 증가하였다.

100 nM의 사람 에프린 B2-사람 Fc합성 단백질은 bFGF에 의한 자극이 없어도 DNA 합성을 저해했다.

0.6 nM의 bFGF에 의해서 유도된 DNA 합성은 1 nM, 10 nM, 및 100 nM의 사람 에프린 B2-사람 Fc합성 단백질의 경우 각각 10%, 30%, 95% 저해되었다(도 7).

저해되었다.

상기 배양 기간 중에 현저한 세포사멸(apoptosis) 세포는 관찰되지 않았다(데이터 도시하지 않음).

[실시예 6: CNV 모델에 대한 에프린 B2의 평가]

AMD의 생태 모델로 여겨지는 레이저 유도성 맥락막 혈관 신생(CNV) 모델을 이용하여 사람 에프린 B2-사람 Fc합성 단백질의 혈관 신생 억제 효과를 평가했다.

피실험동물

6마리의 키노몰구스 원숭이(cynomolgus monkey)에서 얻은 12개의 안구를 이용했다.

상기 동물들은 모두 고통이 없게 취급하였고, Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.으로부터 무병원 상태로 수용했다.

실험은 염산 케타민으로 전신 마취를 수행하고 진행되었다.

실시예는 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd.에 대해 실험동물 윤리 위원회에 의해 승인된 윤리 기준(승인 번호 c189-001)에 따라서 수행되었다.

실험적 맥락막 혈관 신생(CNV)의 유도

실험적 CNV는 상기 원숭이의 눈의 안저부(fundus)의 후극부(posterior pole)에 대해 다색 레이저(파장 647 nm)(Novus Omni Laser; Lumenis, Santa Clara, Calif)를 사용한 광응고(photocoagulation)에 의해서 유도되었다.

스포트의 크기는 직경 100μm이며, 조사 시간은 0.1초였다. 각막 표면에서의 출력은 700 mW였다. 콘택트렌즈를 이용하여 중심 포비아(fovia)를 제외한 부분에 8개소의 화상부위를 만들었다.

에프린 B2투여 방법과 농도

레이저 조사 직후와 조사 후 5일, 즉 2회에 걸쳐서 상기 실시예 5에서 조제한 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질의 초자체내 투여를 실시했다.

초자체 내에서 에프린 B2의 농도가 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL가 되도록 조정한 PBS 용액을 0.1 mL씩 27G 바늘을 이용하여 모양체선평부(ciliary ring)로부터 안내에 주사했다.

네가티브 콘트롤로서 PBS 0.1mL가 주사되었다.

포지티브 컨트롤로서 10 ng/mL 및 100 ng/mL 상기 마우스 에프린 B2-사람 Fc chimeric protein을 이용했다.

CNV의 평가

레이저 조사 후 10일째에 형광 안저 조영검사를 실시해서, 맥락막 신생 혈관 을 평가했다.

0.l mL/kg의 5% 플루오레신 Na를 정맥내 투여해, 안저 카메라(TRC-50EX, Topcon Corporation)로 형광 안저 촬영을 실시했다.

주사 개시 5 내지 6 분 후의 형광 안저 사진에 대해 맥락막 신생 혈관의 투과성 충진을 평가했다.

상기 사진에 대한 평가는 숙련된 안과 전문의에 의해 이루어졌다.

중간 투광체의 혼탁 때문에 평가 불능인 3개의 눈을 제외하고, 형광 색소의 투과성 충진이 현저한 각 레이져 스포트로 보아 병변이 활동성이 있는 것으로 판정되었다.

도 8은 하기의 처리를 가한 안저의 형광 사진이다.

도 8(A)은, 10 ng/mL의 사람 에프린 B2 처리, 도 8(B)는 네가티브 콘트롤(PBS 처리), 그리고 도 8(C)는, 10 ng/mL의 마우스 에프린 B2 처리 결과이다.

PBS를 주사한 네가티브 컨트롤에서는, 10/16은 활동성이 있는 CNV였다.

한편, 에프린 B2 투여군에서는, CNV의 활동성 병변의 비율은 1ng/mL에서는 5/16, 10 ng/mL에서는 0/8, 100 ng/mL에서는 3/8 이었다.

10 ng/mL 및 100 ng/mL의 마우스 에프린 B2-사람 Fc chimeric protein을 사용한 포지티브 컨트롤군에서는 5/8 및 5/16이 활동성이 있는 CNV였다.

상기와 같이, 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질은, HUVEC를 이용한 인비트로 시스템에서 농도 의존적으로 증식능을 억제했다.

특히 100 nM의 농도에서는 그 증식 억제능은 95%였다.

또한 사람 에프린 B2-사람 Fc 합성 단백질은, 레이저 유도성 CNV 모델에 대해 신생 혈관의 발생을 억제했다. 초자체중의 농도는 10 ng/mL로 유효했다.

레이져 모델로 이동된 색소 표피에서는 에프린 B2가 발현되었다(데이터 도시하지 않음).

따라서, 에프린 B2가 색소 표피에 발현됨으로써 신생 혈관의 신생이 중단되는 것으로 추측된다.

본 실시예의 결과로 에프린 B2의 신생 혈관의 신생을 억제 효과가 입증되었다.

본 발명의 조성물 및 방법은 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련한 질환 또는 장해의 처치에 효과적이다.

특히, 본 발명의 조성물 및 방법은, 망막내의 생리적인 혈류를 억제하지 않고 망막외의 병적인 혈관 형성 및 혈관 신생을 억제하는 것이 가능하다.

따라서, 본 발명의 조성물 및 방법은, PDT 및 여러 가지의 항혈관 형성 약제(예를 들어, 항VEGF제)를 주사하는 현재의 치료법에 비해, AMD 및 당뇨병성 망막증과 같은 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련한 안과 질환의 처치에 있어서 특히 효과적이다.

<110> Aqumen Biopharmaceuticlas K K <120> Methods For Suppressing Neovascularization Using EphrinB2 <130> IN2008-PCTKR001 <150> JP2005-292406 <151> 2005-10-05 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Rrimer <400> 1 gaagatctcc caaatcttgt gacaaaactc 30 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 gcggccgctc atttacccgg aga 23 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gcgaagctta ccatggctgt gagaagggac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 gcgagatctg gccacttcgg aaccgaggat 30

Claims

동맥내피세포를 유효량의 에프린 B2와 접촉시키는 공정을 포함하는, 동맥내피 세포에서의 DNA 합성 저해 방법.
제1항에 있어서,

상기 DNA 합성은 혈관 내피 세포 증식 인자, 알칼리성 섬유아세포 증식인자, 또는 혈소판 유래 증식 인자에 의해서 유도되는 것인, DNA 합성 저해 방법.
동맥내피세포를 유효량의 에프린 B2와 접촉시키는 공정을 포함한, 동맥내피세포에서의 p44/p42MAP 키나제 활성화 저해 방법.
제3항에 있어서,

상기 p44/p42MAP 키나제 활성화는 혈관내피세포 증식 인자, 알칼리성 섬유아세포 증식 인자, 또는 혈소판 유래 증식 인자에 의해서 유도되는 것인 p44/p42 키나제 활성화 제해 방법.
동맥내피세포를 유효량의 에프린 B2와 접촉시키는 공정을 포함한, 동맥내피세포로부터 맥관 형성을 저해하는 방법.
제5항에 있어서,

상기 맥관 형성은, 혈관내피세포 증식 인자, 알칼리성 섬유아세포 증식 인자, 또는 혈소판 유래 증식 인자에 의해서 유도되는 것인 맥관 형성을 저해하는 방법.
제1항 또는 제6항에 있어서,

상기 에프린 B2가, 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 저해 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 동맥내피세포를 가지는 포유동물에 상기 에프린 B2를 투여함으로써 행해지는 저해방법.
유효량의 에프린 B2를 개체에 투여하는 공정을 포함하는 망막으로부터의 혈관 신생을 억제하는 방법.
제9항에 있어서,

상기 개체는 망막 외에 병적인 혈관 형성 또는 혈관 신생을 가지거나 또는 생길 가능성이 있는 것인 망막으로부터 혈관 신생을 억제하는 방법.
청구항 11

처치의 필요가 있는 개체에 유효량의 에프린 B2를 투여하는 공정을 포함하는 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련하는 질환 또는 장해의 처치 방법.
제11항에 있어서,

상기 질환 및 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 암, 만성 관절 류머티즘, 자궁 내막 증, 탈모증으로 되는 군으로부터 선택되는 것인 질환 또는 장해의 처치 방법.
제12항에 있어서,

상기 질환 또는 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 및 당뇨병성 망막증으로 되는 군으로부터 선택되는 것인 질환 또는 장해의 처치 방법.
청구항 14

제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 에프린 B2가, 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular)을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 혈관 신생을 억제하는 방법 및 질환 또는 장해의 처치 방법.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피 세포의 DNA 합성을 저해하기 위한 조성물.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포의 p44/p42MAP 키나제 활성화를 저해하기 위한 조성물.
유효량의 에프린 B2를 포함하는, 동맥내피세포로부터 맥관 형성을 저해하기 위한 조성물.
유효량의 에프린 B2를 포함하는, 망막으로부터의 혈관 신생을 억제하기 위한 조성물.
청구항 19

유효량의 에프린 B2를 포함하는 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련하는 질환 또는 장해의 처치를 위한 약학적 조성물.
제 19항에 있어서,

상기 질환 또는 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각 막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 암, 만성 관절 류머티즘, 자궁 내막증, 및 탈모증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제20항에 있어서,

상기 질환 또는 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
제15항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 에프린 B2는 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 세포질 도메인이나 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 조성물
유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포에서의 DNA 합성 저해제.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포의 p44/p42MAP 키나제 활성화 저해제.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 동맥내피세포로부터의 맥관 형성 저해제.
제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 에프린 B2가, 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 저해제.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 망막 혈관 신생 억제제.
제27항에 있어서,

상기 에프린 B2가, 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 억제제.
유효량의 에프린 B2를 포함하는 혈관 형성 또는 혈관 신생에 관련하는 질환 또는 장해의 예방 및 치료제.
제29항에 있어서,

상기 질환 또는 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 당뇨병성 망막증, 암, 만성 관절 류머티즘, 자궁내막증, 및 탈모증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 질환 또는 장해의 예방 및 치료제.
제30항에 있어서,

상기 질환 또는 장해는 가령황반변성증, 허혈성 망막증, 안내 혈관 신생, 각막 혈관 신생, 망막 혈관 신생, 맥락막 혈관 신생, 당뇨병성황반부종, 당뇨병성 망막허혈, 당뇨병성 망막 부종, 및 당뇨병성 망막증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 질환 또는 장해의 예방 및 치료제.
제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,

상기 에프린 B2는 천연의 에프린 B2의 세포외 도메인(extracellular domain)을 포함하지만, 세포질 도메인 및 막관통 도메인을 포함하지 않는 것인 예방 및 치료제.