KR100271247B1

KR100271247B1 - 청력손실 치료용 제약학적 조성물

Info

Publication number: KR100271247B1
Application number: KR1019970707148A
Authority: KR
Inventors: 엘러 매걸
Original assignee: 스티븐 엠. 오드레; 암젠 인코포레이티드
Priority date: 1996-02-23
Filing date: 1997-02-14
Publication date: 2000-11-01
Also published as: CA2217565A1; DK0822829T3; CZ322797A3; NO974767D0; EA199700225A1; ATE211392T1; DE69709458D1; DE69709458T2; HUP9901758A3; ES2170938T3; KR19980703748A; WO1997030722A1; EP0822829B1; SK138697A3; JP4028598B2; PT822829E; NO974767L; AU2277997A; CN1181704A; EP0822829A1

Abstract

본 발명은 일반적으로 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF)를 투여함으로써 와우(및 전정) 모세포 및 나선 신경절 신경원의 손상이나 변성을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 더 특히 본 발명은 감각신경성 청력손실을 치료하는 방법에 관한 것이다.

Description

[발명의 명칭]

청력장애 치료를 위한 신경영양성 인자(GDNF)의 용도

[발명의 상세한 설명]

[발명의 배경]

본 발명은 일반적으로 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(이하 "GDNF"라 함) 단백질 산물을 투여함으로써, 모(毛)세포 및 청각 신경원 같은 내이 감각세포의 손상이나 변성을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 특히 본 발명은 여러 가지 원인으로 인한 청력 손실을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.

신경영양성 인자는 신경계에서 또는 신경계에 의해 자극된 비신경 조직에서 발견되는 자연 단백질로서, 특정 신경 및/또는 신경교세포 집단의 표현형 분화의 생존 및 유지를 촉진시키는 기능을 한다(Varon 등의 Ann. Rev. Neuroscience, 1 : 327, 1979; Thoenen 등의 Science, 229 : 238, 1985참조). 이 생리학적 역할 때문에, 신경영양성 인자는 상기와 같은 신경세포의 변성 및 신경 손상으로 인한 분화된 기능 손실을 치료하는데 유용하다. 신경 손상은 다음을 포함하는, 하나 또는 그 이상의 유형을 갖는 신경세포의 생존 및/또는 고유 기능을 위태롭게 하는 조건들에 의해 야기된다 : (1) 물리적 손상, 이는 축삭돌기의 변성(차례로 신경세포의 사멸을 유발) 및/또는 손상 부위 근처의 신경세포체의 변성을 야기한다, (2) 박동과 같은, 신경계의 부분에 대한 일시적 또는 영구적 혈류 중지(국소빈혈), (3) 각각 암 및 AIDS의 화학요법제인 시스플라티눔과 디데옥시사이티딘 같은 신경독에 대한 고의이거나 우연한 노출, (4) 당뇨병이나 신장 기능부전 같은 만성 대사 질병, 또는 (5) 특정 신경원 집단의 변성에 의해 유발되는, 다킨슨병, 알쯔하이머병 및 근위축성 축삭 경화증 같은 신경변성 질병, 특정 신경영양성 인자가 신경 손상 치료에 잠재적으로 유용하기 위해서는 손상된 신경 세포의 부류나 부류들이 이 인자와 반응해야 한다. 모든 신경원 집단이 모든 신경영양성 인자와 반응하지 않거나 이에 의해 똑같이 영향받지 않는다는 것이 확증되어 왔다.

확인된 첫번째 신경영양성 인자는 신경 성장 인자(이하 "NGF"라 함)이다. NGF는 정의된 영양 인자과의 제1부류로서 뉴로트로핀(neurotrophin)이라고 불리우며, 일반적으로 뇌-유래 신경영양성 인자(BDNF), 뉴로트로핀-3(NT-3), NT-4/5 및 NT-6을 포함한다(Thoenen, Treds. Neurosci., 14 : 165 - 170, 1991; Snider, Cell, 77 : 627 - 638, 1994; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18 : 223-253, 1995 참조). 이 뉴로트로핀은 trk 티로신 키나제 수용체과, 즉 trkA, trkB, trkC, 및 저친화성 p75 수용체를 통하여 작용한다고 알려져 있다(Snider, Cell, 77 : 627-638, 1994; Bothwell, Ann. Rev. Neurosci., 18 : 223 - 253, 1995; Chao 등의 TINS 18 : 321 - 326, 1995 참조).

신경교세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF)는, 중뇌 도파민작용성 신경원 전달물질 표현형을 자극시키고 생존을 촉진시키는 효능을 기초로 시험관내 검정하여 확인하고 정제한 최근에 발견된 단백질이다(Lin 등의 Science, 260 : 1130 - 1132, 1993 참조). GDNF는 단백질 중 형질질환 성장 인자 - 베타(TGF - β)와 일부 구조 상동성을 갖는 글리코실화된 이황화물 - 결합 동종이량체이다(Lin 등의 Science, 260 : 1130 - 1132, 1993; Krieglstein 등의 EMBO J., 14 : 736 - 742, 1995; Poulsen 등의 Neuron, 13 : 1245 - 1252, 1994 참조). GDNF mRNA는 말초신경계의 근육 및 쉬반세포에서 검출되었고(Henderson 등의 Sclence, 266 : 1062 - 1064, 1994; Trupp 등의, J. Cell Biol., 130 : 137 - 148, 1995 참조) 중추신경계의 I형 신경교성상세포에서 검출되었다(Schaar 등의 Exp. Neurol., 124 : 368-371, 1993 참조). 생체내에 외인성 GDNF로 처리하면, 흑질 신경원의 도파민작용성 표현형을 자극시키고 파킨슨병 동물 모델에서 축삭절단이나 도파민작용성 신경독에 의해 유도되는 기능 결핍을 회복시킨다(Hudson 등의 Brain Res. Bull., 36 : 425 - 432, 1995; Beck 등의 Nature, 373 : 339 - 341, 1995; Tomac 등의 Nature, 373 : 335 - 339, 1995; Hoffer 등의 Neurosci. Lett., 182 : 107 - 111, 1994 참조). 처음에는 도파민작용성 신경원에 비교적 특이할 것이라고 여겼으나, 최소한 시험관내에서 GDNF가 중뇌 도파민작용성 및 신체운동성 신경원에 비해 더 큰 신경영양성 표적 스펙트럼을 가질 수도 있음을 보여주는 증거가 판명되기 시작하고 있다(Yan 및 Matheson, Nature 373 : 341 - 344, 1995; Oppenheim 등의 Nature, 373 : 344 - 346, 1995; Trupp 등의 J. Cell Biol., 130 : 137 - 148, 1995 참조). 특히, GDNF가 생체와 시험관내 모두에서 뇌간 및 척수 콜린작용 운동성 신경원에 대해 신경영양성 효능을 갖는다고 밝혀졌으며(Oppenheim 등의 Nature, 373 : 344 - 346, 1995; Zurn 등의 Neuroreport, 6 : 113 - 118, 1994; Yan 등의 Nature, 373 : 341 - 344, 1995; Hender Son 등의 Science, 266 : 1062 - 1064, 1994 참조), 시험관내에서 광수용체와 같은 망막 신경원(1995년 11월 29일자로 제출한, 현개 계류중인 Louis의 미국특허 출원번호 제08/564,833호 참조), 시험관내 및 생체내 모두에서 망막 신경절 세포(1995년 11월 29일자로 제출한, 현개 계류중인 Yan의 미국특허 출원번호 제08/564,458호 참조) 및 시험관내 및 생체내 모두에서 배근신경절로 부터의 감각 신경원(1995년 11월 29일자로 제출한, Yan 등의 현재 계류중인 미국특허 출원번호 제08/564,844호 참조에 대해 신경영양성 효능을 갖는다고 밝혀졌다.

본 발명에 대한 일반적 흥미는, 파킨슨병과 관련된 손상을 포함하는 신경 손상 치료에 GDNF가 유용하다고 기술하고 있는, 1993년 4월 1일자 공개된 제WO 093/06116호(Lin 등의 Syntex - Synergen Neuroscience Joint Venture)에 관한 것이다. 또한 흥미 있는 것은 다일로카르핀-유도성 발작후에 GDNF mRNA가 검출될 수 있었고 비조절되었음을 보고한 Schmidt - kastner 등의 Mol. Brain Res., 26 : 325 - 330, 1994 문헌; 배양조건하에서 기초 전뇌 성상세포가 중간 수준의 GDNF mRNA를 발현하였으나, GDNF가 기초 전뇌 ChAT 활성도를 변경시키지 않았음을 보고한 Schaar 등의 Exp. Neurol., 124 : 368 - 371, 1993 및 Schaar 등의 Exp. Neurol., 130 : 387 - 393, 1994 문헌; 및 GDNF가 기초 전뇌 콜린작용성 신경원의 손상이나 변성 치료에 유용하다고 보고한, 1995년 9월 28일자 출원된 현재 계류중인 미국특허 출원번호 제O8/535,682호이다. GDNF가 모세포 및 청각 신경원 같은 내이 세포의 생존, 개생 또는 변성에 대한 보호를 촉진시킨다는 것이 예전에는 밝혀지지 않았다.

내이 코르티 기관내 신경상피 모세포가 소리를 신경 활성도로 변환시키고, 이 활성도는 제8뇌신경의 와우관 분할을 따라 전달된다. 이 신경은 세 유형의 신경원 섬유로 구성되어 있다(Spoendlin, H.H. In : Friedmann, I. Ballantyne, J., eds. Ultrastructural Atlas of the lnner Ear; London, Butterworth, pp. 133 - 164, 1984 참조) : (1) 구심성신경원, 이것은 나선 신경절에 위치하며 와우를 뇌간에 연결시킨다. (2) 원심성 올리브와우관 신경원, 이것은 상올리브형 복합체에서 시작한다. (3) 자율 아드레날린작용성 신경원, 이것은 경부 교감신경간에서 시작하며 와우를 신경지배한다. 인체에는 유수축삭을 갖는 약 30,000개의 구심성 와우 신경원이 존재하는데, 이 신경원 각각은 약 50층판, 및 4 - 6㎛ 직경으로 구성되어 있다. 이 조직학적 구조가 일정한 전도 속도의 기초를 형성하는데, 이것은 중요한 기능상 특징이다. 청각신경 길이의 도처에, 꼬인 로프와 같은 형태로 중심에 위치한 '첨단(apical)' 섬유와 겹쳐진 '기저(basal)' 섬유를 갖는 영양배열의 구심성 섬유가 존재한다. Spoendlin(Spoendlin, H.H. In : Naunton, R.F., Fernadex, C. eds. Evoked Electrical Activity in the Auditory Nervous System. London, Academic Press, pp.21 - 39, 1978 참조)은 형태학적 차이를 근거로 나선 신경절에서 2가지 유형의 구심성 신경원을 확인하였다 : 제I형 세포(95%)는 이극성이며 내부 모세포를 향하여 돌출되어 있는 유수 세포체와 축삭을 가지고 있다. 제II형 세포(5%)는 무수축삭을 갖는 단극성이며 코르티 기관의 외부 모세포쪽으로 돌출되어 있다. 각 내부 모세포는 약 20개 섬유에 의해 신경지배되는데, 이들 섬유 각각은 단지 하나의 세포에만 연접한다. 대조적으로, 각 외부 모세포는 약 6개 섬유에 의해 신경지배되는데 이들 각각의 섬유는 약 10개의 세포를 공급하기 위해 분지한다. 와우 내부의 이 섬유들은 다음으로 나뉜다: 1) 내부 나선군, 이것은 주로 동측성으로 발생하며 내부 모세포에 대한 구심성 신경원과 연접한다. 2) 보다 다수의 외부 방사군, 이것은 주로 대측성으로 발생하며 외부 모세포와 직접 연접한다. 특징적이거나 가장 좋은 빈도인 1빈도의 최소 역치가 존재하지만, 이 역치는 이와 같은 수준 이상 및 이하인 빈도로 급격히 생성된다(Pickles, J. O. In : Introduction to the Physiology of Hearing, London, Academic Press, pp. 71-106, 1982 참조). 따라서 단일 청각신경 섬유는 대역 필더(band-pass filter)로서 작용한다고 여겨진다. 그 기저막은 우선적으로 다른 진동수, 그것의 길이에 따른 다른 거리로 진동하고, 각 와우 신경 섬유의 진동수 선택성은 이 섬유가 연결되어 있는 내부 모세포의 선택성과 유사하다. 따라서, 각 와우 신경 섬유는 그것의 부근 섬유로부터의 다른 범위의 진동수를 포함하는 선회 곡선을 나타낸다(Evans, E.F. In : Beagley H.A. ed. Auditory investigation : The Scientiflc and Technological basis, New York, Oxford University Press, 1979 참조). 이 기작에 의하면, 복합 소리는 내이의 필터에 의해 구성 성분 진동수로 분류된다(진동수 분해).

사회 및 직업-관련 의사소통을 방해시키기에 충분한 정도의 청력손실은 미국 인구에 가장 일반적인 만성 신경장애중의 하나이다. 건강 - 인터뷰 데이터[Vital and health statistics. Series 10. No. 176. Washington, D.C.(DHHS publication no.(PHS) 90 - 1504 참조]를 근거로, 45세 미만인 사람들중 약 4%와 65세 또는 그 이상의 사람들중 약 29%가 신체 장애인 청력손실을 가지고 있음이 추정된다. 2,800만명 이상의 미국인이 청력장애를 가지고 있으며 이 군중 2백만명 만큼은 심한 난청이라고 평가되었다(A report of the task force on the National Strategic Plan. Bethesda, Md. : National Institute of Health, 1989 참조). 청력손실 이환은 나이와 함께 극적으로 증가한다. 1000명의 유아당 약 1명은 자립 구두 언어 발달에 방해받는 충분히 심각한 청력손실을 가지고 있다[Gentile, A. 등의 Characteristics of persons with impaired hearing : United States, 1962 - 1963. Series 10. No. 35. Washington, D.C. : Government printing office, 1967 (DHHS publication no.(PHS) 1000)](Human communication and its disorders : an overview. Bethesda, Md. National Institutes of health, 1970 참조). 75세 이상의 연령에서는 1000명의 사람 당 360명 이상이 신체장애인 청력손실을 가지고 있다[Vital and health statistics. Series 10. No. 176. Washington, D.C.(DHHS publication no.(PHS) 90 - 1504].

청각, 말 및 언어 장애에 대한 생산성 손실, 특수 교육 및 치료의 비용은 년당 300억달러를 초과할 수도 있다[1990 annual report of the National Deafness and other Communication Disorders Advisory Board. Washington, D.C. : Government Printing Office, 1991 (DHHS publication no. (NIH) 91-3189]. 심한 어린이 난청의 공통된 주요 원인은, 각각 전체인 약 13%와 9%를 구성하는 유전장애 및 수막염이다(Hotchkiss, D. Demographic aspects of hearing impairment : questions and answers. 2nd ed. washington, D.C. : Gallaudet University Press, 1989). 어린이 난청 원인중 약 50%에 달하는 이 원인은 알려지지 않고 있으나 유전적 원인이나 체질에 기인하는 것 같다(Nance WE, Sweeney A. Otolaryngol. Clin. North Am 1975; 8 : 19 - 48).

외부 청각관으로부터 중추신경계까지, 청각 경로를 따르는 어느 곳의 장애든지 청력손실을 초래할 수 있다. 청각기는 외이와 중이, 내이 및 청각신경과 중추 청각경로로 세분된다. 내이의 약 15,000개의 신경상피 세포(모세포)와 30,000개의 1순위 신경원(나선 신경절)인 작용에 의해 인체의 청각 정보는 기계적 신호로 부터 신경적으로 전도된 전기 충동으로 변환된다. 나선 신경절 신경원의 모든 중추 섬유는 교간뇌의 와우 핵에 연접을 형성한다. 신경원의 수는 와우에서 청각 뇌간 및 청각 뇌간 및 청각 피질까지 청력이 극적으로 증가하는 것과 관련 있다. 모든 청각 정보는 소위 내부 모세포라고 부르는 단지 15,000개 모세포에 의해 변환되는데, 이 중 3500개가 30,000개의 일차 청각 신경원의 약 90%와 연접을 형성하므로 이 3500개가 임계적으로 중요하다. 따라서, 청각 말초에서 비교적 다소의 세포가 손상되어도 실질적인 청력손실이 야기될 수 있다. 그러므로, 대부분 감각신경 손실의 원인은 내이의 손상 탓으로 돌릴 수 있다(Nadol, J.B., New England Journal of Medicine, 1993, 329 : 1092 - 1102 참조).

청력손실은 전도율 수준, 감각신경 수준 및 중추 수준이 원인일 수 있다. 전도성 청력손실은 외이나 중이와 관련된 손상에 의해 유발되며, 그 결과 내이액에 대해 고막과 소골에 의해 증폭되는 공기 매개 소리의 정상 경로가 파괴된다. 감각신경성 청력 손실은 와우의 손상이나 제8뇌신경의 청각 분열에 의해 유발된다. 중추성 청력손실은 중추 청각 경로의 손상에 기인한다. 이것들은 와우와 배측 올리브 핵 복합체, 하구, 중앙 슬상체, 측두엽내 청각 피질 및 상호연결되어 있는 구심성 및 원심성 섬유관으로 구성되어 있다(Adams R.D. and Maurice, V. Eds. in : Principles of Neurology, 1989. McGraw - Hill Information services Company. pp 226 - 246 참조).

앞서 언급한 바와 같이, 심한 어린이 난청 원인중 최소한 50%는 유전적 원인이다(Brown, k. S. Med. Clin. North AM. 1969; 53 : 741-72 참조). 유전적 체질이, 75세 이상 인구의 1/3에 영향을 미치는 노인성난청 - 또는 연령 - 관련 청각손실 - 의 주요 원인 인자라는 가능성을 고려한다면, 아마도 이 유전적 인자가 청력손실의 가장 공통된 단일 원인일 것이다. 유전적 이상은 전도성 청력손실 보다는 감각신경성 청력손실을 훨씬 더 일반적으로 나타낸다. 유전적으로 결정되는 감각신경성 청력손실은, 감각 신경 손실이 주요 원인은 아니라 할지라도, 특히 어린이에게서는 명백히 대다수이다(Nance WE, Sweeney A.0tolaryngol. Clin. North Am 1975; 8 : 19 - 48 참조). 감각신경 손실에 관한 가장 일반적인 증후군 형태는 바르덴부르그 증후군, 알포트 증후군 및 유셔 증후군이다.

일반적으로 사용되는 갖가지 약물은 내이신경독성 특성을 가지고 있다. 가장 잘 알려져 있는 것은 아미노글리코시드 항생제(Lerner, S.A, 등의 eds. Aminoglycoside ototoxicity. Boston : Little, Brown, 1981; Smith, C.R. 등의 N Engl. J. Med. 1980; 302 : 1106 - 9 참조), 루우프 이뇨제(Bosher, S.K., Acta 0tolaryngol. (Stockh)1980; 90 : 4 - 54 참조), 살리 실산연(Myers, E. N.등의 N. Engl. J. Med. 1965; 273 : 587-90 참조) 및 시스플라틴과 같은 항신생물제(Strauss, M. 등의 Laryngoscope 1983; 143 1263 - 5 참조)이다. 내이신경독성은 역시 에리트로마이신을 경구 또는 비경구 투여하는 중에도 나타났다(Kroboth, P.D. 등의 Arch. lntern Med. 1983; 1 : 169 - 79; Achweitzer, V.G., 0lson, N. Arch. 0tolaryngol. 1984; 110 : 258 - 60 참조).

대부분 내이신경독성 물질은, 와우, 특히 청각 모세포와 맥관선조-내이 내부의 분화된 상피성 기관이며 체액 및 전해질의 항상성을 초래함 - 를 손상시킴으로써 청력손실을 유발한다(Nadol, J.B. New England J. Med. 1993, 329 : 1092-1102참조). 모세포에 영향을 미치는 내이신경독성 투여 다년 후에 이차 신경 변성이 발생할 수도 있다. 어떤 내이신경독성 물질이 내이 내부에 선택적으로 농축되어, 전신투여를 중지시킴에도 불구하고, 결과적으로 진행성 감각신경 손실을 초래할 수도 있다는 증거가 있다(Federspil, P. 등의 J. Infect. Dis. 1976; 134 Suppl; S200 - S205 참조).

청각의 과자극으로 인한 외상이 난청의 또 다른 유도 원인이다. 소음으로 부터 외상까지 개별 감수성이 존재한다. 아큐페이셔널 세이프티 앤드 헬스 에이전시(Occupational Safety and Health Agency)가 인정한 수준 이하일지라도, 고-강도 소음에 노출된 일부의 사람에게서 임상적으로 중요한 감각신경성 청력손실이 유발될 수도 있다(Osguthorpe, J.D. ed. Washington D.C. : American Academy of 0tolaryngology - Head and Neck Surgery Foundation, 1988).

다발성경화증과 같은 무수(demyelinating) 진행이 감각신경성 청력손실을 유발할 수도 있다(Noffsinger, D 등의 Acta Otolaryngol Suppl(Stockh) 1972; 303 : 1-63 참조). 보다 최근에는 면역 - 매개 감각신경성 청력손실의 형태가 인지되었다(McCabe, B.F. Ann 0tol Rhinol Laryngol 1979; 88 : 585-9 참조). 청력손실은 보통 양측성이며, 급속히 진행되는데(수주 및 수달내에 측정됨), 전정 증상과 관련될 수도 있거나 관련되지 않을 수도 있다.

여러 가지 종양, 즉 일차성 종양과 전이성 종양 모두는 내이 또는 청신경을 침범함으로써, 전도성 청력손실이나 감각신경성 청력손실 중 하나를 발생시킬 수 있다(Houck, J. R. 등의 Otolaryngol Head Neck Surg 1992; 106 : 92-7 참조). 알려져 있지 않은 여러가지 변성 장애의 원인이 감각신경성 청력손실을 발생시킬 수도 있다. 감각신경성 청력손실, 일시적 현기증 및 이명을 변동시킴을 특징으로 하는 메니에르 증후군(Nadol, J. B. ed. Meniere's disease : pathogenesis, path ophysiology, diagnosis, and treatment,Amsterdam : kugler ＆ Ghedini 1989 참조)은, 비록 그 병인론이 알려지지 않았으나, 내이 내부의 체액 항상성 장애에 의해 유발된다고 여겨진다. 중간 정도 -대 -심각한 감각신경성 난청을 일으키는, 뜻밖의 특발성 감각신경성 청력 손실(Wilson, W.R. 등의 Arch 0tolaryngol 1980; 106 : 772 - 6)은 내이 국소빈혈 및 바이러스성 미로염을 포함하여 여러가지 원인에 기인 할 수도 있다.

노인성 난청, 즉 연령과 관련되는 청력손실은 75세 이상 사람들의 1/3이상에 영향을 미친다. 노인성난청과 가장 공동된 조직병리학적 상관은 신경상피(모)세포, 신경원, 및 말초성 청각계 맥관선조의 손실이다(Schuknecht H.F. Pathology of the Ear. Cambridge, Mass : Harvard University Press, 1974 : 388 - 403 참조). 노인성 난청은, 소음 외상, 내이신경독성 및 유전적으로 영향 받은 변성을 포함하여, 일생 동안의 몇몇 유해성 영향의 누적 결과로 인한 것이라고 여겨진다.

특정 신경영양성 인자가 발생중에 신경원 분화 및 생존을 조절하고(Korsching S. J. Neurosci. 13 : 2739-2748, 1993 참조), 어른에게서 손상 및 독소로부터 신경원을 보호하는(Hefti, Neurosci. 6 : 2155 - 2162, 1986; Apfel 등의 Ann Neurol 29 : 87 - 89, 1991; Hyman 등의 Nature 350 : 230 - 233, 1991; Knusel 등의 J. Neurosci. 12 : 4391 - 4402, 1992; Yan 등외 Nature, 360 : 753 - 755, 1992; Koliatsos 등의 Neuron, 10 : 359-367, 1993 참조)것으로 나다났다. 원 위치 혼성한 연구에 의해, 신경영양(neurotrophin) 수용체 TrkB 및 TrkC에 대한 mRNAs는 와우전정 신경절을 발육시킴으로써 발현되고(Ylikoski 등의 Hear. Res. 65 : 69 - 78 1993; Schecterson 등의 Hearing Res.73 : 92 - 100 1994 참조) BDNF 및 NT-3에 대한 mRNAs는 코르티 기관을 포함하여 내이에서 발견된다(Pirvola 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 9915 - 9919, 1992; Schecterson 등의 Hearing Res. 73 : 92 - 100, 1994; wheeler 등의 Hearing Res. 73 : 46 - 56, 1994 참조)는 것이 밝혀졌다.

결실된 BDNF 및/또는 NT-3 유전자를 지니고 있는 마우스에서 전정 및 청각계 발생시 BDNF와 NT-3의 조직학적 역할을 조사하였다(Ernfors 등의 Neuron 14 : 1153 - 1164 1995 참조). 와우 BDNF 돌연변이체는 제2형 나선 신경원이 손실되었는데, 외부 모세포 신경지배의 부재를 야기시킨다. NT-3 돌연변이체는 구심성 부족 및 나선 신경원의 87% 손실을 나타냈는데, 아마 이것은 제1형 신경원과 일치하며 내이 모세포를 신경지배할 것 같다. 이중 돌연변이체는 모든 전정 및 나선 신경원이 결여되어 있는, 부가 손실을 지녔다. 이들 유전자의 티로신 키나제 촉매 도메인에서의 배선 돌연변이를 지니고 있는 마우스들을 연구함으로써, 내이의 말초 감각계에서 표적 신경지배를 유지시키고 특이 신경원 집단을 생존시키기 위해 TrkB 및 TrkC 수용체가 필요하다는 것이 입증되었다(Schimmang 등의 Development, 121 : 3381 - 3391 1995 참조). Gao 등의 문헌(J. Neurosci. 15 : 5079 - 5087, 1995 참조)은, 해리된 배양액 내에서 생후 랫인 나선 신경절 신경원에 대한 NT-4/5, BDNF 및 NT-3인 생존 - 촉진 역가에 관하여 설명하고 있으며, NT-4/5가 항-암 약물인 시스플라틴의 신경독성 효과로 부터 이들 신경원을 보호했다는 것을 보여주었다. 또한, BDNF 및 NT-3이 해리된 배양액 내에서 성숙한 랫인 청각 신경원의 생존을 지지한다는 것이 증명되었다(Lef'e bvre 등의 NeuroReport 5 : 865 - 868, 1994 참조).

이전에는 청력손실 치료시 GDNF를 사용한다는 보고가 없었다. 청력장애는 심각한 고통이므로, 손상으로부터 청각 신경원 및 모세포를 보호할 수 있는 어떠한 약물 및 치료방법이라도 확인하는 것이 가장 이로울 것이다.

[발명의 요약]

본 발명은 내이 병변을 가지고 있는 피검자에게 치료학적 유효량의 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 투여함을 포함하는 감각신경성 청력손실을 치료하는 방법을 제공한다. 예를들어, 청력손실은 내이의 신경상피 모세포(와우 모세포) 또는 나선 신경절 신경원의 손상이나 변성과 관련될 수 있다.

본 발명은 모세포가 시스플라틴과 네오마이신 같은 내이신경독소의 독성 효과에 내성인 GDNF와 반응하고, 청각 신경원 역시 예를들어 시스플라틴, 네오마이신 및 살리실산염 같은 여러가지 내이신경독소의 독성 효과에 내성인 GDNF와 반응한다는 것에 관한 발견을 기초로 한다. 따라서, 모세포 및 나선 신경절 신경원의 보호, 생존 또는 재생을 촉진시키기 위해 치료학적 유효량의 GDNF 단백질 산물을 투여할 수 있다.

또한 전정기관에 대한 병변이나 장애 역시 그와 같은 병변이나 장애를 가지고 있는 피검자에게 치료학적 유효량인 GDNF 단백질 산물을 투여함으로써 치료될 수 있다는 사실을 발견하였다. 그와 같은 병변은 결과적으로 현기증, 혼란 또는 균형 상실을 초래한다.

상기 GDNF 단백질 산물에는 제1도에 나타낸 아미노산 서열(서열번호 : 1)로써 묘사되는 바와 같은 GDNF 단백질 뿐만 아니라 그것의 변이체 및 유도체도 포함될 것이다. 또한 그와 같은 GDNF 단백질 산물에는 [MET^-1] GDNF도 포함될 것이다.

본 발명에 따라, 약 1㎍/kg/일 내지 약 1OOmg/kg/일 범위의 투여량, 전형적으로 약 0.1mg/kg/일 내지 약 25mg/kg/일의 투여량, 보통 약 5m9/kg/일 내지 약 20mg/kg/일의 투여량으로 GDNF 단백질 산물을 비경구 투여할 수 있다. 또한 개별 환자의 요구량 및 투여 경로에 따라서, GDNF 단백질 산물을 매일 보다는 오히려 매주나 주당 몇 시간과 같이 더 낮은 빈도로 투여할 수 있다. 또한 GDNF 단백질 산물을 중이나 내이내로 직접 투여할 수도 있다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 더 적은 양의 GDNF 단백질 산물을 상기와 같이 투여할 수 있다는 것을 인식할 것인데, 예를 들면, 중이 또는 내이의 직접 투여량은 단일 주사나 다중 주사로 약 1㎍/귀내지 약 1mg/귀의 범위이다.

게다가 GDNF 단백질 산물을 BDNF 및 NT-3같은 제2치료제와 공동으로 또는 이와 함께 투여하고자 한다. 또한 본 발명은 감각 신경성 청력손실의 다양한 원인에 대한 모세포 및 청각 신경원의 손상이나 변성을 치료하기 위한 약제 또는 제약학적 조성물의 제조시 GDNF 단백질 산물의 용도를 제공한다. 그와 같은 제약학적 조성물에는 국소, 경구 또는 중이 및 내이 GDNF 단백질 산물 제제형이 포함되거나 와우 이식물과 공동으로 포함된다.

본 분야의 숙련된 기술자들은 또한, 하기에 더 기술되어 있는 세포치료수단 및 유전자 치료수단에 의하여 상기와 같은 투여 과정을 수행할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 예를들어, 유전자 치료수단에 있어, GDNF 단백질 산물을 생성시켜 분비시키기 위해 세포를 변형시켰다. 세포는 생체외 또는 생체내에서 변형시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시구체형태를 기술한 다음 발명의 상세한 설명을 고려하면 본 발명의 여러 가지 부가적인 양상 및 잇점들은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 자명해 질 것이다.

본 발명은 치료학적 유효량의 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 투여함으로써 감각신경성 청력손실을 예방 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 발명의 한 양상에 따른 방법들은 제약학적 조성물, GDNF-발현 세포의 이식 또는 GDNF 유전자 치료에 의해 치료학적 유효량의 GDNF 단백질 산물을 투여함으로써 손상된 모세포 및 청각 신경원을 치료하는 것이다. 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열로써 표현한 GDNF 단백질을 포함하여, 어떠한 생물학적 활성 GDNF 단백질 산물도-이의 변이체 및 유도체 포함-사용하여 본 발명을 실행할 수 있다. GDNF 단백질 산물의 경구, 비경구 또는 국소 전달 이외에도 세포 치료과정 및 유전자 치료과정에 의하여 투여하고자 한다.

본 발명은 배지내에 랫의 와우 및 성숙한 랫의 해리된 나선 신경절 신경원을 외이식 배양할 때 GDNF가 내이신경독소-유도성 세포 사멸로 부터 모세포를 보호한다는 초기 발견을 기초로 한다. 외인성 GNDF 단백질 산물을 투여하면, 축삭에서 세포체까지 신경영양성 인자의 수송이 중단됨으로써 야기되는 이 인자의 결여로 인한 손상이나 외상(예를들어, 소음 외상 및 시스플라틴과 아미노글리코시드 항생제의 급성 또는 만성 치료)으로 부터 모세포 및 나선 신경절 신경원이 보호될 것이다. 그와같은 치료는, 모세포 및/또는 청각 신경원이 환경적 소음 외상, 내이신경독소를 수반한 치료로 부터의 간헐적 손상에 대해 내성을 가지도록 하고, 노인성난청(연령-관련 청력손실), 유전적 감각신경성 변성 및 후특발성 청력손실 같은 병리학적 증상의 청력손실의 원인인 청각 신경원 및 모세포의 진행성 변성을 늦추며, 내이의 완전한 기능을 유지시킨다고 예상된다. 또한 더 우수하고 더 긴 와우 이식 수행을 위한 청각 신경원을 지지할 것이다.

본 발명에 따라, GDNF 단백질 산물을 약 1㎍/kg/일 내지 약 1OOmg/kg/일 범위의 투여량, 전형적으로 약 0.1mg/kg/일 내지 약 25mg/kg/일의 투여량, 및 보통 약 5mg/kg/일 내지 약20mg/kg/일의 여량으로 중이내로 투여할 수 있다. 와우 이식 과정이나 내이 수술시와 같은 적절한 때에 이미 내이가 침버되는 경우에는 내이 내로 직접 GDNF 단백질 산물을 투여할 수도 있다. 그와 같은 경우에는 보다 소량의 GDNF 단백질 산물을 투여할 것인데, 예를들어 단일 주사나 다중 주사로 약 1㎍/귀 내지 약 1 mg/귀이다. 상기 인자를 만성 투여할 필요가 있을 경우에는, 이 인자가 연속 방출되도록 중이나 내이내에 도입시킬 캐뉼라 첨단에 알젯(Alzet) 미니-펌프를 부착시겨 둘 것이다. 또한 고막 대수포를 투과할 귀약(ear-drops)의 형태로 GDNF를 개발할 수도 있다. 게다가 BDNF 및 NT-3 뿐만 아니라, 다양한 내이 병인학 치료에 일반적으로 사용하거나 장차 사용할 다른 인자나 약물과 함께, 청각 신경원 변성치료를 위한 제2치료제의 유효량을 수반하여 GDNF 단백질 산물을 투여하고자 한다. 여러 가지 제약학적 제제형 및 다른 전달 기술은 하기에 더 상세히 기술되어 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "GDNF 단백질 산물"은 정제된 자연, 합성 또는 재조합 신경교세포주-유래 신경영양성 인자, 생물학적 활성 GDNF 변이체(삽입, 치환 및 결실 변이체 포함) 및 화학적으로 변형시킨 그것의 유도체를 포함한다. 또한 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 인체 GDNF와 실질적으로 상동인 GDNFs도 포함한다. GDNF 단백질 산물은 그것들의 생물학적 활성 형태로 동종이량체나 이종이량체로서 존재할 것이다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "생물힉적 활성"이란 GDNF 단백질 산물이 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 GDNF와 유사한 신경영양성 특성을 나타내나, 반드시 모두 이와 동일한 특성은 아니며, 반드시 이와 동일한 정도가 아님을 의미한다. 흥미 있는 특정 신경영양성 특성의 선택은 투여되는 GDNF 단백질 산물의 용도에 달려 있다.

본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 상동"이란 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 GDNF에 대한 상동성 정도를 갖는다는 것을 의미하는데, 즉 70%를 초과하는 정도가 바람직하고, 가장 바람직하게는 80%를 초과하며, 90%나 95%를 초과하는 것이 훨씬 더 바람직하다. 예를들어, 랫과 인체 단백질 사이의 상동성 정도는 약 93%인데, 선호되는 포유동물 GDNF가 유사하게 높은 상동성 정도를 가질 것이라 예상된다. 전형적으로, 본원에 기술한 상동성 백분율은 비교되는 상기 서열인 동일 아미노산과 일직선이 되게 하여 두 서열중 더 작은 서열에서 발견되는 아미노산 잔기의 백분율로서 계산하며, 이때 그와 같은 정렬을 돕기 위해 100개 아미노산 길이에 4개의 갭을 도입시킬 수 있다(as set forth by Dayhoff, in Atlas of Protein Sequence and Structure, Vol. 5, p. 124, National Biochemical Research Foundation, Washington, D.C. (1972), 이 문헌의 내용을 본원의 참고 문헌으로 인용함). 상기한 바와 같은 상동성 백분율은, 4개의, 접촉 아미노산 서열이라고 정의한 구성 성분과 함께, (갭 도입을 갖는) 두 서열중 더 큰 서열에서 발견될 수도 있는, 두 서열중 더 작은 서열에서 발견되는 구성성분의 백분율로서 계산하는 것이 바람직하다. 또한 실질적으로 상동인 것에는 서열번호 : 1의 GDNF에 대한 항체와 교차 - 반응시킴으로써 분리할 수 있는 어떠한 GDNF 단백질 산물, 또는 서열번호 : 1의 GDNF를 암호하는 유전자나 유전자 단편으로 혼성한시킴으로써 분리할 수 있는 유전자도 포힘된다.

본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 어떠한 수단으로도 본 발명에 따른 GDNF 단백질 산물을 분리하거나 생성시킬 수 있다. 본 발명에 유용한, GDNF 단백질 산물을 생산하는 전형적인 방법은 1994년 5월 23일자로 제출한 미국출원번호 제08/182,183호와 그것의 특허출원; 제W0 93/06116호(Lin 등의 Syntex - Synergen Neuroscience Joint Venture)로 공개된, 1992년 9월 17일자 제출된 PCT 출원번호 제 PCT/US92/07888호; 제 EP 610 254호로 공개된 유럽특허 출원번호 제 92921022.7호; 및 1995년 9월 28일자로 제출한 공동-소유, 공동-계류중인 미국출원번호 제08/535,681호("절두된 신경교세포주-유래 신경영양성 인자")에 기술되어 있으며, 이들 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한다.

포유동물 신경원 세포제제로부터나, GDNF를 분비하거나 발현하는 포유동물 세포주로부터 자연 발생적인 GDNF 단백질 산물을 분리할 수 있다. 예를들어, B49 신경교아종 세포의 무혈청 성장 조정 배지로부터 GDNF를 분리하는 것에 관하여 제WO 93/06116호에 기술되어 있다. 또한 GDNF 단백질 산물은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 공지되어 있는 어떠한 수단으로도 화학적으로 합성시킬 수 있다. 재조합 기술에 의해 GDNF 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직한데, 그 이유는 비교적 더 많은 양의 단백질을 더 고 순도로 획득할 수 있기 때문이다. 재조합 GDNF 단백질 산물의 형태로는 이 단백질의 글리코실화된 형태와 비글리코실화된 형태, 및 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포계에서 발현된 단백질이 포함된다.

일반적으로, 재조합 기술은 GDNF를 암호하는 유전자를 분리하고, 이 유전자를 적합한 벡터와 세포 유형에 클로닝시키고, 필요하다면 원하는 변이체를 암호하도록 유전자를 변형시키며, GDNF 단백질 산물을 생산하기 위해 이 유전자를 발현시킴을 포함한다. 택일적으로, 원하는 GDNF 단백질 산물을 암호하는 뉴클레오티드 서열을 화학적으로 합성할 수도 있다. 유전 코드나 대립형질 변이체의 동의성으로 인해 코돈 용도가 다른 뉴클레오티드 서열을 사용하여 GDNF 단백질 산물을 발현시키고자 한다. 제 W0 93/06116호에는 랫 GDNF 유전자인 cDNA 클론의 분리와 서열결정, 및 인체 GDNF 유전자의 cDNA 클론의 분리와 서열결정, 및 인체GDNF 유전자의 게놈 DNA 클론의 분리, 서열결정 및 발현에 관하여 기술되어 있다. 또한 제 WO 93/06116호에는 GDNF 단백질 산물을 발현시키기 위한 벡터, 숙주세포, 및 배양 성장 조건에 관하여 기술되어 있다. E. coli에서 GDNF 단백질 산물을 발현시키기에 적합한 부가 벡터에 관하여는 1991년 4월 24일자로 공개된 공개 유럽특허 출원번호 제EP O 423980호("간세포 인자")에 기술되어 있으며, 이 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한다. 성숙한 인체 GDNF를 암호하는 유전자의 DNA 서열및 이 GDNF의 아미노산 서열은 제W0 93/06116호의 제19도(서열번호 : 5)에 나타나 있다. 제19도는 GDNF의 프리-프로 부분에 대한 전체 암호화 서열을 나타낸 것은 아니지만, 인체 프리-프로 GDNF의 첫번째 50개 아미노산은 제W0 93/06116호의 제22도(서열번호 : 8)에 나타나 있다.

자연 발생적인 GDNF는 그것의 생물학적 활성 형태로서 이황화물 결합된 이량체이다. 박테리아계에서 발현시킨 후 분리한 물질은 본질적으로 생물학적 비활성이며, 단량체로서 존재한다. 생물학적 활성의 이황화물 결합된 이량체를 생산하기 위해서는 재생(refolding)이 필요하다. 박레리아계에서 발현된 GDNF를 재생시키고 자연화(naturation)시키기 위한 과정은 제W0 93/06116호에 기술되어 있다. GDNF 활성도를 측정하기 위한 표준 시험관내 검정은 제W0 93/06116호 및 1995년 9월 28일자로 제출된 공동-소유의 공동-계류중인 미국출원번호 제08/535,681호에 기술되어 있으며, 이를 본원의 참고문헌으로 인용한다.

A. GDNF 변이체

본원에 사용된 바와 같은 용어 "GDNF 변이체"는 자연 발생적인 GDNF의 아미노산 서열 이내의 잔기에서 아미노산을 결실시키고 ("결실 변이체"), 이 잔기내에 아미노산을 삽입시키거나("부가 변이체"), 이 잔기대신 아미노산을 치환시킨("치환 변이체") 폴리펩티드를 포함한다. 그와 같은 변이체는 상기 폴리펩티드를 암호하는 DNA내로 고유 뉴클레오티드 변화를 도입시키거나 원하는 폴리펩티드를 시험관내 화학 합성하여 제조한다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 많은 결실, 삽입 및 치환의 조합으로, 최종 분자가 GDNF 생물학적 활성도를 갖도록 제조할 수 있다는 것을 인식할 것이다.

하나 또는 그 이상의 선택 아미노산 잔기를 치환, 삭제 또는 결실시키기 위한 돌연변이유발 기술은 본 분야의 숙련된 기술자들에게 잘 알려져 있다(예를들어, 미국특허번호 제4,518,584호 참조, 이의 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용함). 변이체 구성시 2개의 주요 변수가 존재한다 : 돌연변이 부위의 위치와 돌연변이의 특징. GDNF 변이체를 고안하는데 있어 돌연변이 부위와 그 돌연변이인 특징을 선택하는 것은 변형시킬 GDNF 특성(들)에 달려있을 것이다. 돌연변이를 위한 부위를 개별적으로나 연속적으로 변이시킬 수 있는데, 예를들어, (1) 먼저 보존적 아미노산 선택물로 치환시킨 다음 획득된 결과에 따라 라디칼 선택물로 더 치환시키고, (2) 표적 아미노산 잔기를 결실시키거나, (3) 위치가 정해진 이 부위에 인접하는 아미노산 잔기를 삽입시킴으로써 변형시킬 수 있다. 1내지 20개 아미노산의 보존적 변화가 바람직하다. 일단 원하는 GDNF 단백질 산물의 아미노산 서열이 결정되면, 그 단백질의 발현에 사용될 핵산 서열은 쉽게 결정된다. N-말단 및 C-말단 결실 변이체 역시 단백질 가수분해 효소를 사용하여 생성시킬 수 있다.

GDNF 결실 변이체에 있어서, 결실은 대개 약 1내지 30개 잔기의 범위이고, 더 보통으로 약 1내지 10개 잔기이며, 전형적으로 약 1내지 5개의 인접 잔기이다. N-말단, C-말단 및 내부 서열내 결실을 의도하고자 한다. GDNF의 활성도를 변형시키기 위해 다른 TGF-β상과(super family)부류와의 낮은 상동성 부위내에 결실을 도입시킬 수 있다. 다른 TGF - β상과 서열과 실질적으로 상동성인 부위내에서의 도입이 GDNF 생물학적 활성도를 상당히 더 변형시키는 것 같다. 영향받은 도메인내에, 예를들어 시스테인 교차 결합된 도메인내에 GDNF 단백질 산물의 3차 구조를 보존시키기 위해 보존적 결실의 수를 선택할 것이다. 결실 변이체의 비제한적인 예로는 GDNF의 1내지 4O개 N-말단 아미노산이 결여된 절두형 GDNF 단백질 산물, 또는 GDNF의 상기 C-말단 잔기가 결여된 변이체, 또는 그의 조합체들이 포함되는데, 이것에 관하여는 본원의 참고문헌으로 인용한, 1995년 9월 28일자로 제출된 공동-소유, 공동-계류중인 미국출원번호 제08/535,681호에 기술되어 있다.

GDNF부가 변이체에 있어서, 아미노산 서열 부가는 전형적으로, 하나의 잔기에서 100개 또는 그 이상의 잔기를 포함하는 폴리펩티드의 길이까지로 범위가 정해진 N- 및/또는 C-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 내부 서열내 부가를 포함한다. 대개 내부 부가는 약 1내지 5개 잔기, 및 보통 약 1내지 3개 아미노산 잔기로 범위를 정할 수 있다. N-말단 부가 변이체의 예로는, [Met^-1]GDNF라고 명명한, N - 말단 메티오닐 잔기를 수반한 GDNF(박레리아 재조합 세포 배양액에서 GDNF를 직접 발현시킨 인공산물), 및 재조합 숙주세포로 부타 성숙한 GDNF의 분비를 촉진시키기 위해 GDNF인 N-말단에 이종성 N-말단 시그널 서열을 융합시킨 융합체가 포함된다. 그와 같은 시그널 서열은 대개 의도한 숙주 세포종으로 부터 수득할 것이며, 따라서 그 숙주세포종과 상동성일 것이다. 또한 부가는 다른 신경영양성 인자의 서열로부터 유래된 아미노산 서열도 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위해 바람직한 GDNF 단백질 산물은 재조합 인체[Met^-1]GDNF이다.

GDNF 치환 변이체는 GDNF 아미노산 서열중 최소한 하나의 아미노산 잔기를 제거하여 그곳에 다른 잔기를 삽입시킨 것이다. 그와 같은 치환 변이체는 대립형질 변이체를 포함하며, 이것은 그 종 집단에서의 자연 발생적인 뉴클레오티드 서열 변화를 특징으로 하는데, 결과적으로 아미노산 변화가 초래될 수 있거나 초래되지 않을 수 있다. 치환 변이체들(예를들어, 서열번호 : 50 참조)의 예는 본원의 참고문헌으로 인용한, 1995년 9월 28일자 제출된 공동-소유, 공동-계류중인 미국 출원 번호 제08/535,681호에 기술되어 있다.

GDNF 아미노산 서열의 특이 돌연변이는 글리코실화 부위(예를들어, 세린, 트레오닌 또는 아스파라긴)에 대한 변형과 관련될 것이다. 글리코실화의 부재 또는 단지 부분 글리코실화는 어떤 아스파라긴-결합 글리코실화 인식 부위에서 듣지 아니면 0-결합 탄수화물을 부가하여 변형시킨 상기 분자의 어떤 부위에서든지 아미노산이 치환되거나 결실되어 이루어진 것이다. 아스파라긴 - 결합 글리코실화 인식 부위는 고유 세포 글리코실화 효소에 의해 특이적으로 인식되는 트리펩티드 서열을 포함한다. 이 트리펩티드 서열은 Asn-Xaa-Thr이나 Asn-Xaa-Ser중 하나인데, 여기서 Xaa는 Pro이외의 어떤 아미노산일 수 있다. 글리코실화 인식 부위의 제1아미노산 위치나 제3아미노산 위치 중 하나 또는 둘 다에서 다양하게 아미노산 치환시키거나 결실시키면(및/또는 제2위치에서 아미노산 결실시키면) 이 변형된 트리펩티드 서열에서 결과적으로 비글리코실화가 초래된다. 따라서, 고유한 변형 뉴클레오티드 서열을 발현시키면 그 부위에서 글리코실화되지 않은 변이체가 생산된다. 택일적으로 글리코실화 부위를 부가하여 GDNF 아미노산 서열을 변형시킬 수도 있다.

GDNF 아미노산 잔기, 또는 "알라닌 주사(scanning) 돌연변이유발"이라고 부르는 돌연변이유발을 위한 부위를 확인하는 한 방법은 Cunningham 및 Wells의 문헌(Science, 244 : 1081 - 1085, 1989 참조)에 기술되어 있다. 이 방법으로, 아미노산 잔기 또는 표적 잔기군을 확인하여(예를들어, Arg, Asp, His, Lys 및 Glu 같은 하전 잔기) 세포내 또는 외부의 주변 수성 환경과 이 아미노산과의 상호작용에 영향을 미치는 중성적으로나 음성적으로 하전된 아미노산(알라닌 또는 폴리알라닌이 가장 바람직함)으로 대체시킨다. 그런 다음 치환 부위에 부가 또는 교체 잔기를 도입시킴으로써 치환에 대한 기능적 감수성을 나타내는 상기 도메인을 순환시킨다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시키기 위한 표적 부위를 결정하여, 그 DNA 서열 중 상응 표적 코돈이나 부위상에서 알라닌 주사 또는 무작위 돌연변이 유발을 수행한 후, 원하는 활성도와 활성도 정도를 갖는 최적 조합에 대하여 발현된 GDNF 변이체를 선별한다.

치환 돌연변이 유발에 있어 가장 흥미있는 부위는 곁사슬 크기, 전하, 및/또는 소수성 면에서 실질적으로 다른, 다양한 종의 GDNF 단백질에서 발견되는 아미노산 부위를 포함한다. 흥미있는 다른 부위는 다양한 종으로부터 수득한, GDNF-유사 단백질의 특정 잔기부위로서, 상기와 동일하다. 처음에, 이들 부위를 비교적 보존 방식으로 치환시킨다. 그와 같은 보존적 치환은 표 1의 표제, 우선 치환 아래에 나타나 있다. 만일 그러한 치환이 생물학적 활성도인 변화를 초래한다면, 더 많은 치환 변화(견본 치환)를 도입시키고/도입시키거나 다른 부가 또는 결실을 이루어 결과적으로 생성된 산물을 활성도에 대해 선별한다.

[표 1]

상기 아미노산에 대한 보존적 변형(및 암호한 핵산 서열에 대한 상응 변형)으로, 자연 GDNF의 특성과 유사한 기능적 및 화학적 특성을 갖는 GDNF 단백질 산물이 생산된다고 예상된다. 대조적으로, 다음을 유지시키는 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써, GDNF 단백질 산물의 기능적 및/또는 화학적 특성의 실질적인 변형을 수행할 수 있다 : (a) 치환 영역의 폴리펩티드 골격 구조, 예를들어, 시트 또는 나선 입체 형태, (b) 표적 부위에서 상기 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 곁사슬 크기. 일반적인 곁사슬 특성을 기초로 자연 발생적인 잔기들은 다음 군으로 나뉜다:

1) 소수성 : 노르로이신, Met, Ala, Val, Leu, lle;

2) 중성 친수성 : Cys, Ser, Thr;

3) 산성 : Asp, Glu;

4) 염기성 : Asn, Gln, His, Lys, Arg;

5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기 : Gly, Pro; 및

6) 방향성 : Trp, Tyr, Phe.

비-보존적 치환은 이들 종류 중 한 부류를 다른 부류로 교환시키는 것과 관련될 수 있다. 그와 같이 치환시킨 잔기를, 다른 TGF - β상과 단백질과 상동성인 GDNF 단백질인 부위내로, 또는 이 분자의 비-상동성 부위내로 도입시킬 수 있다.

B. GDNF 유도체

본원 명세서에 주어진 기술분야의 숙련된 기술자들은 GDNF 또는 GDNF 변이체의 화학적으로 변형된 유도체를 제조할 수 있다. 유도체화를 위해 가장 적합한 화학 성분에는 수용성 중합체가 포함된다. 수용성 중합체는 단백질에 부착되며 수성 환경, 예를들어, 생리학적 환경에서 침전되지 않으므로, 가장 바람직하다. 바람직하게, 이 중합체는 치료학적 산물이나 조성물의 제조를 위해 제약학적으로 용인 가능할 것이다. 본 분야의 숙련된 기술자들은 상기 중합체 단백질 결합체가 치료학적으로 사용될 것인지의 여부와, 만일 그렇다면, 요구 투여량, 순환 시간, 단백질 가수 분해에 대한 저항성 및 다른 고려할 사항들을 기초로 원하는 중합체를 선택할 수 있을 것이다. 유도체를 원하는 형태로(즉, 삼투성 펌프에 의해, 또는 더 바람직하게, 주사나 주입에 인해, 또는 경구, 폐 또는 다른 전달 경로용으로 더 제형화시킨 형태로써) 투여하고, 그 유효성을 결정함으로써 유도체화의 유효성을 확인할 수 있다.

적합한 수용성 중합체에는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체류, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리 - 1,3 - 디옥솔란, 폴리 - 1, 3, 6 - 트리옥산, 에틸렌/무수말레산 공중합체, 폴리아미노산류(동종중합체나 무작위 공중합체 중 하나) 및 덱스트란이나 폴리(n-비닐 피롤리돈) 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 동종중합체류, 폴리프로필렌 산화물/에틸렌 산화물 공중합체류, 폴리옥시에틸화된 폴리올류(예를들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그것들의 혼합물이 포함되나 이에 국한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가, 물내에서 안정하므로, 제조시 유리할 것이다.

중합체는 어떤 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않을 수도 있다. 폴리에틸렌 글리콜에 대하여, 바람직한 분자량은 취급하고 제조하기에 용이한 약 2kDa 내지 약 10OkDa의 범위이다. (용어 "약"은 폴리에틸렌 글리콜 제제에 있어 어떤 분자들의 무게는 상태 분자량보다 더 많을 것이고, 어떤 분자들은 그 보다 더 적을 것이라는 것을 나타내는 것이다). 원하는 치료학적 프로필에 따라 다른 크기를 사용할 수도 있다(예를들어, 원하는 지속된 방출기간, 효과, 만약 존개한다면, 생물학적 활성도, 취급의 용이, 항원성의 정도나 결여 및 치료학적 단백질 또는 변이체에 대한 폴리에틸렌 글리콜의 다른 공지된 효과).

상기와 같이 부착시킨 중합체 분자의 수는 다양할 것이며, 본 분야의 숙련된 기술자들은 기능상 효과를 확인할 수 있을 것이다. 기술자들은 모노-유도체화할 수 있거나, 동일하거나 다른 화학 성분들(예를들어, 다른 무게를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 같은 중합체들)과 함께 디-, 트리-, 테트라- 또는 다소 조합의 유도체화를 제공할 수 있다. 단백질(또는 펩티드) 분자에 대한 중합체 분자의 비율은, 반응 혼합물내 그것들의 농도에 따라 다양할 것이다. 일반적으로, 원하는 유도체화의 정도(예를들어, 모노-, 디-, 트리-등), 선택한 중합체의 분자량, 중합체가 분지된 것인지 비분지된 것인지인 여부 및 반응조건과 같은 인자들에 의해 최적 비율(반응인 효율면에서, 즉 과량의 비반응 단백질이나 중합체가 존재하지 않는다는 면에서)이 결정될 것이다.

단백질의 기능적 또는 항원성 도메인에 대한 효과를 고려하여 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 다른 화학성분)를 부착시켜야 한다. 본 분야의 숙련된 기술자들에게 용이한 여러가지 부착 방법들이 있다. 예를들어, 그 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용한 제EP 0 401384호(G - CSF에 대한 PEG 결합)를 참조하고, Malik 등의 Exp. Hematol., 20 : 1028 - 1035, 1992문헌(트레실 염화물을 사용한 GM - CSF의 폴리에틸렌 글리콜화에 관하여 보고하고 있음)도 참조하시오. 예를들어, 폴리에틸렌 글리콜을 유리 아미노기 또는 유리 카르복실기 같은 반응기에 의해 아미노산 잔기를 통하여 공유결합시킬 수 있다. 반응기는 활성화된 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합될 수 있는 기들이다. 유리 아미노기를 갖는 아미노산 잔기에는 리신 잔기 및 N-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 유리 카르복실기를 갖는 아미노산 잔기에는 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 및 C-말단 아미노산 잔기가 포함될 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜 분자(들)을 부착시키는 반응기로서 설프히드릴기가 사용될 수도 있다. 치료학적 목적으로, N-말단이나 리신기에서의 부착과 같은 아미노기에서의 부착이 바람직하다. 만일 수용체 결합이 필요하면, 수용체 결합용으로 중요한 잔기에서의 부착은 피해야 한다.

특히 기술자들이 N-말단에서 화학적으로 변형된 단백질을 원할 수도 있다. 기술자들은 본 조성물의 실례로서 폴리에틸렌 글리콜을 사용할 경우 다양한 폴리에틸렌 글리콜 분자(분자량, 분지 등에 의함), 반응 혼합물내 단백질(또는 펩티드)에 대한 폴리에틸렌 글리콜 분자인 비율, 수행할 폴리에틸렌 글리콜화 반응의 유형 및 선택된, N-말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질을 수득하는 방법으로부터 선택할 수 있다. N-말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 제제를 수득하는 방법(즉, 필요하다면 이 성분을 다른 모노폴리에틸렌 글리콜화된 성분들로부터 분리시킴)은 폴리에틸렌 글리콜화된 단백질 분자집단으로부터 N-말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화된 물질을 정제하는 것일 수도 있다. 특정 단백질의 유도체화에 이용가능한 다른 유형의 일차 아미노기(N-말단 대 리신)의 차별적인 반응성을 사용하는 환원성 알킬화에 의해 선택적 N - 말단 화학 변형을 수행할 수 있다. 고유 반응조건하에서, 카르보닐기 함유 중합체를 수반하여 N-말단에서 실질적으로 단백질인 선택 유도체화를 획득한다. 예를들어, 기술자들은 리신 잔기의 e-아미노기와 단백질의 N-말단 잔기의 a-아미노기 사이에서 pka 차이의 잇점을 얻을 수 있도록 하는 pH에서 반응을 수행함으로써 단백질을 선택적으로 N-말단적으로 폴리에틸렌 글리콜화시킬 수 있다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한 수용성 중합체의 부착은 다음과 같이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N-말단에서 우선적으로 일어나며 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 발생하지 않는다. 환원성 알킬화를 이용할 경우, 수용성 중합체는 상기한 유형일 수 있으며 단백질에 결합하는 단일 반응성 알데히드를 가져야 한다. 단일 반응성 알데히드를 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜 프로데온알데히드를 사용할 수도 있다.

본 발명은 원핵-발현 GDNF를 최소한 하나의 폴리에틸렌 글리콜 분자에 결합시킨 유도체, 또는 그의 변이체의 용도뿐만 아이라 아실이나 알킬 결합에 의해 하나 또는 그 이상의 폴리에틸렌 글리콜 분자를 부착시킨 GDNF, 또는 그의 변이체의 용도를 예상한다.

본 분야에 공지된 폴리에틸렌 글리콜화 반응 중 어떠한 반응으로도 폴리에틸렌 글리콜화를 수행할 수 있다. 예를들어 다음 문헌을 참조하시오 : Focus on Growth Factors, 3 (2) : 4-10, 1992; 제EP O 154 316호, 이 명세서를 본원의 참고문헌으로 인용함; 제EP 0 401 384호; 및 폴리에틸렌 글리콜화에 관련된, 본원에서 인용한 다른 공개문헌들. 반응 폴리에틸렌 글리콜 분자(또는 구조유사성 반응 수용성 중합체)와 함께 아실화 반응이나 알킬화 반응시겨 폴리에틸렌 글리콜화를 수행할 수 있다.

아실화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 폴리에틸렌 글리콜의 활성 에스테르 유도체를 GDNF 단백질이나 변이체와 반응시키는 것을 포함한다. 어떤 공지된 반응 PEG 분자나 그 후에 발견된 반응 PEG 분자도 GDNF 단백질 또는 변이체를 폴리에틸렌 글리콜화 시키는데 사용할 수 있다. 바람직한 활성화 PEG 에스테르는 N-하이드록시숙시니미드에 대해 에스테르화된 PEG이다. 본원에 사용된 바와 같이, "아실화"란 PEG같은 수용성 중합체와 치료학적 단백질 사이에서의 다음 유형의 결합을 제한없이 포함하고자 한다 : 아미드, 카르바메이트, 우레탄등. Bioconjugate Chem., 5 : 133 - 140, 1994 문헌을 참조하시오. 반응 조건은 폴리에틸렌 글리콜화 기술분야에 공지되어 있는 조건들 중 어느 조건 또는 그 후에 발견된 조건들로부터 선택할 수 있지만, 변형될 GDNF나 변이체를 불활성화시킬 온도, 용매 및 pH인 조건은 피해야 한다.

아실화에 인한 폴리에틸렌 글리콜화는 일반적으로 폴리 - 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 생성시킬 것이다. 바람직하게, 연결 결합은 아미드일 것이다. 또한 바람직하게, 결과 산물은 실질적으로 오직(예를들어, ＞ 95%) 모노-, 디- 또는 트리-폴리에틸렌 글리콜화된 것일 것이다. 그러나, 사용한 특정 반응조건에 따라 더 높은 정도의 폴리에틸렌 글리콜화를 지닌 일부 종이 형성될 수 도 있다. 원한다면, 혼합물로부터 더 정제된 폴리에틸렌 글리콜화 종을 분리할 수 있으며, 특히, 표준정제기술, 그중에서도 투석, 염석, 한외여과, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 및 전기영동을 포함하는 기술로써 비반응된 종을 분리할 수 있다.

알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화는 대개 환원제의 존재에서 PEG의 말단 알데히드 유도체를 GDNF 단백질 또는 변이체와 반응시키는 것을 포함한다. 알킬화에 의한 폴리에틸렌 글리콜화 역시 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 생성시킬 수 있다. 게다가, 기술자들은 폴리에틸렌 글리콜화가 실질적으로 GDNF 단백질 또는 변이체의 N-말단에 있는 a-아미노기에서만 유리하도록(즉, 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 단백질) 반응 조건을 조작할 수 있다. 모노폴리에틸렌 글리콜화나 폴리폴리에틸렌 글리콜화중 어느 경우에나 -CH₂-NH-기에 의해 PEG기를 단백질에 부가시키는 것이 바람직하다. 특히 -CH₂-기와 관련하여, 본원에서는 이 유형인 결합을 "알킬" 결합이라고 언급한다.

모노폴리에틸렌 글리콜화된 산물을 생성시키는 환원성 알킬화에 의한 유도체화에는 유도체화에 유용한 다른 유형의 일차 아미노기(N - 말단대 리신)인 차별적인 반응성을 이용한다. 리신 잔기의 e-아미노기와 단백질의 N-말단 잔기에 있는 a-아미노기 사이에서 pka 차이의 잇점을 얻을 수 있도록 하는 pH에서 이 반응을 수행한다. 그와 같은 선택적 유도체화에 의해, 단백질에 대한, 알데히드와 같은 반응기를 포함하는 수용성 중합체의 부착이 조절된다 : 중합체와의 결합은 단백질의 N-말단에서 우선적으로 일어나는데 리신 곁사슬 아미노기와 같은 다른 반응기의 유의 변형은 발생되지 않는다. 한 중요한 양상에 있어, 본 발명은 실질적으로 균질한 제제인 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자(GDNF 단백질 또는 변이체는 실질적으로 오직(즉, ＞ 95%) 단일 위치에서 중합체 분자에 부착시킨 것을 의미함)인 실질적으로 상동성 제제의 용도를 예상한다. 더 특별하게, 폴리에틸렌 글리콜을 사용한다면, 본 발명은 가능성 있는 항원성 결합기가 결여되어 있고, GDNF 단백질 또는 변이체에 직접 결합된 폴리에틸렌 글리콜 분자를 갖는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체의 용도도 포함한다.

따라서, 본 발명에 따라 사용할 GDNF 단백질 산물에는 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체가 포함될 수 있다고 예상되는데, 여기서 PEG 기(들)은 아실기나 알킬기에 의해 부착시킨다. 상기한 바와 같이, 그러한 산물은 모노-폴리에틸렌 글리콜화된 것이거나 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 것(예를들어, 2-6개, 바람직하게 2-5개 PEG기 함유)일 수 있다· 대개 아미노산의 a - 또는 e- 아미노기에서 PEG기를 단백질에 부착시키지만, 또한 단백질에 부착된 어떠한 아미노기에서도 PEG기를 부착시킬 수 있다고 예상되는데, 이 아미노기는 적합한 반응조건하에서 PEG기에 부착되도록 충분히 반응성이다.

아실화 및 알킬화 접근법 모두에 사용한 중합체 분자는 상기한 수용성 중합체 중에서 선택할 수 있다. 아실화를 위한 활성 에스테르 또는 알킬화를 위한 알데히드 같이 단일 반응기를 갖도록, 선택한 중합체를 변형시켜서 중합체화 정도가 본 발명에서 제공한 대로 조절될 수 있도록 해야 한다. 전형적인 반응 PEG 알데히드는 물에 안정한, 폴리에틸렌 글리콜 프로피온 알데히드이거나 그것의 모노 C1-C10 알콕시 또는 아릴록시 유도체이다(미국 특허 번호 제5,252,714호 참조). 이 중합체는 분지된 것이거나 분지되지 않은 것일 수도 있다. 아실화 반응에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 에스테르기를 가져야 한다. 본 환원성 알킬화에 있어, 선택한 중합체(들)은 단일 반응 알데히드기를 가져야 한다. 일반적으로, 자연 발생적인 글리코실 잔기로 부터는 수용성 중합체를 선택하지 않을 것인데, 그 이유는 이 중합체가 보통 포유동물 재조합 발현계에 인해 더 알맞게 만들어지기 때문이다. 이 중합체는 어떠한 분자량도 가질 수 있으며, 분지되거나 분지되지 않은 것일 수도 있다.

본원에 사용하기 위해 특히 선호되는 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. 본원에 사용한 바와 같이, 폴리에틸렌 글리콜은, 모노-(C1-C10)알콕시- 또는 아릴록시-폴리에틸렌 글리콜 같은, 다른 단백질을 유도체화시키는데 사용한 PEG의 형태중 어떠한 형태도 포함하는 것을 의미한다.

일반적으로, 생물학적 활성 물질을 활성화된 중합체 분자와 반응시키는데 사용되는 어떠한 적힙한 조건하에서도 화학 유도체화를 수행할 수 있다. 폴리에틸렌 글리콜화된 GDNF 단백질 또는 변이체를 제조하는 방법은 대개 다음 단계들을 포함한다 : (a) 상기 단백질이 하나 또는 그 이상의 PEG기에 부착되도록 하는 조건하에서 GDNF 단백질 또는 변이체를 폴리에틸렌 글리콜(예를들어 PEG인 반응 에스테르 또는 알데히드 유도체)과 반응시키는 단계 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계, 일반적으로, 아실하 반응을 위한 최적 반응 조건은 공지된 변수들 및 원하는 결과를 기초로 경우에 따라 결정할 것이다.

예를들어, PEG : 단백질의 비율이 커질수록 폴리-폴리에틸렌 글리콜화된 산물의 백분율은 많아질 것이다. 실질적으로 균질한 집단인 모노-중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자를 생성시키는 환원성 알킬화는 일반적으로 다음 단계들을 포함할 것이다 : (a) 환원성 알킬화 조건하에서, 즉 상기 GDNF 단백질 또는 변이체의 아미노 말단에 있는 a-아미노기를 선택적으로 변형시키기에 적합한 pH에서 GDNF 단백질 또는 변이체를 반응 PEG분자와 반응시키는 단계; 및 (b) 반응 산물(들)을 수득하는 단계.

실질적으로 균질한 집단인 모노-중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체 분자에 있어, 환원성 알킬한 반응조건이란 GDNF 단백질 또는 변이체의 N-말단에 수용성 중합체 성분을 선택적으로 부착시킬 수 있는 조건이다. 그러한 반응 조건은 대개 리신 아미노기와 N-말단에 있는 a-아미노기 사이의 pka 차이를 제공한다(pka란 상기 아미노기중 50%는 양성자 첨가되어 있고 50%는 그러하지 않을 때의 pH이다). 이 pH 역시 사용할 단백질에 대한 중합체의 비율에 영향을 미친다. 일반적으로, pH가 보다 더 낮으면, 단백질에 대해 더 많은 과량의 중합체가 요구될 것이다(즉, 반응 N-말단 a-아미노기가 적을 수록 최적 조건을 획득하기 위해 더 많은 중합체가 필요하다). 만일 pH가 더 높다면, 중합체 : 단백질 비율은 그 만큼 많을 필요는 없다(즉, 더 많은 반응기가 이용되므로 더 적은 중합체 분자가 요구된다). 본 발명을 위한 pH는 대개 3-9범위, 바람직하게는 3-6범위 이내일 것이다.

또 다른 중요한 고려할 사항은 중합체의 분자량이다. 일반적으로, 중합체의 분자량이 더 클 수록, 더 적은 중합체 분자가 단백질에 부착될 수 있다. 유사하게, 이 변수들을 최적화할 때 중합체의 분지도 고려해야 한다. 일반적으로, 분자량이 더 클수록(또는 더 많이 분지되어 있을수록) 중합체 : 단백질 비율은 더 크다. 대개, 본원에서 의도하는 폴리에틸렌 글리콜화 반응을 위해 바람직한 평균 분자량은 약 2kDa 내지 약 1OOkDa이다. 바람직한 평균 분자량은 약 5kDa 내지 약 50 kDa이며, 특히 바람직하게 약 12kDa내지 약 25kDa이다. GDNF 단백질 또는 변이체에 대한 수용성 중합체의 비율은 대개 1:1내지 100:1의 범위일 것이며, 바람직하게 1:1내지 20:1(폴리에틸렌 글리콜화를 위해)이며 1:1내지 5:1(모노폴리에틸렌 글리콜화를 위해)이다.

상기한 조건들을 사용하여 환원성 일킬화시키면, 아미노 말단에서 a-아미노기를 갖는 어떠한 GDNF 단백질 또는 변이체에도 중합체가 선택적으로 부착될 것이며, 실질적으로 균질한 제제인 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결힙체가 제공될 것이다. 본원에 사용한 용어 "모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체"란 GDNF 단백질 또는 GDNF변이체 단백질 분자에 부착된 단일 중합체 분자로 이루어진 조성물을 의미한다. 바람직하게 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체는 리신 아미노 곁사슬기가 아니라 N-말단에 위치하는 중합체 분자를 가질 것이다. 이 제제는 90%이상의 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체가 바람직할 것이며, 95% 이상의 모노중합체/GDNF 단백질(또는 변이체) 결합체가 더욱 바람직할 것인데, 그 나머지 관찰 가능한 분자들은 비반응된 것이다(즉, 중힙체 성분이 결여된 단백질).

본 환원성 알킬화에 있어, 환원제는 수용액에 안정해야 하고 환원 알킬화의 초기 과정에서 형성되는 쉬프 염기만을 바람직하게 환원시킬 수 있어야 한다. 바람직한 환원제는 소디움 보로하이드리드, 소디움 시아노보로하이드리드, 디메틸아민 보란, 트리메틸아민 보란 및 디리딘 보란중에서 선택할 수 있다. 용매, 반응시간, 온도 등과 같은 다른 반응 변수들, 및 산물의 정제 수단들은 수용성 중합체를 수반한 단백질의 유도체화와 관련되는 공개 정보를 근거로 경우에 따라 결정할 수 있다(본원에 인용된 공개 문헌 참조).

C. GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물

GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물은 일반적으로 제약학적 및 생리학적으로 용인가능한 하나 또는 그이상의 제제형 물질과 함께 치료학적 유효량의 GDNF 단백질 산물을 포함한다. 알맞은 제제형 물질은 항산화제, 방부제, 착색제, 항료제, 부형제, 유화제, 현탁제, 용매, 충진제, 팽창제, 완충액, 운반 매개체, 희석제, 보형약 및 / 또는 제약학적 보조제를 포함하지만 이것으로 제한되지는 않는다. 예를들어, 적당한 부형제는 주사용액, 생리학적 식염수 또는 인조 외림프일 수 있으며 비경구 투여용 조성물에 공통적인 그외의 물질이 보충될 것이다. 중성 완충 식염수 또는 혈청 알부민과 혼합한 식염수도 전형적인 부형제이다.

부형제인 주요 용매는 현실적으로 수성이거나 비수성 중 하나일 것이다. 또한, 부형제는 pH, 오스몰농도, 점성도, 정화도, 색, 멸균도, 안정성, 분해속도 또는 제제형의 향을 변형시키거나 유지시키기 위한 제약학적으로 용인가능한 그외의부형제를 포함할 것이다. 유사하게, 부형제는 GDNF 단백질 산물의 유리율을 변형시키거나 유지시키기 위한, 또는 고막을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 흡수나 침투를 촉진시키기 위한 그외의 제약학적으로 용인가능한 부형제도 포함할 것이다. 이러한 부형제는 단위 투여 또는 복수 투여 형태로 중이(middle-ear) 투여를 위한 투여량을 제형화하기 위하여 일반적으로 및 통상적으로 사용되는 물질이다.

일단 치료학적 조성물이 제형화되면, 용액, 현탁액, 겔, 유제, 고체 또는 탈수 분말이나 동결건조 분말로 멸균 바이알에 보관될 것이다. 이러한 제제형은 즉석 사용 형태 또는 동결건조된 것과 같이 투여전에 재구성할 필요가 있는 형태로 보관될 것이다.

최적의 제약학적 제제형은 투여 경로와 바람직한 투여량과 같은 고려사항에 따라 본 분야의 숙련자들에 의해 결정될 것이다. 예를들어 본원에서 참고문헌으로 인용한 문헌인 Remington의 Pharmaceutical Sciences, 18th Ed.(1990, Mack Pub|ishing Co., Easton, PA 18042) pages 1435-1712를 참조하라. 이러한 제제형은 물리적인 상태, 안정성, 생체내 유리율 및 본 GDNF 단백질, 변형체 및 유도체의 생체내 정화율에 영향을 미칠 것이다.

서서히 유리되는 중이 제제형, 흡입 합제 또는 경구 활성 제제형과 같은 그외의 효과적인 투여형도 생각된다. 예를들어, 지속적으로 유리되는 제제형에서 GDNF 단백질 산물은 중합체 화합물 (폴리아세트산, 폴리글리콜산 등과 같은) 또는 리포솜의 미립자 제제내로 삽입되거나 결합될 수 있다. 히알루론산(Hylauronic acid)도 사용될 수 있으며, 이것은 혈행내 존속기간을 증진시키는 효과를 가질 것이다.

또한 GDNF 단백질 산물의 제약학적 조성물은 예를들어, 고막 주입 또는 주사에 의한 중이 투여를 위해 제형화될 것이며, 서서히 유리되거나 또는 지속적인 순환 제제형도 포함할 것이다. 이처럼 중이 투여되는 치료학적 조성물은 전형적으로 발열물질이 없는, 제약학적으로 용인가능한 부형제내에 GDNF 단백질 산물을 함유하는 용인가능한 중이 수성 용액의 형태이다. 바람직한 부형제 중 하나는 멸균 증류수이다.

또한 GDNF 단백질 산물을 함유하는 특정 제제형은 경구투여되는 것으로 간주된다. 이러한 방식으로 투여되는 GDNF 단백질 산물은 캡슐로 싸고, 고체 투여 형태의 조제시에 통상적으로 사용되는 담체와 함께 또는 없이 제형하될 수 있다. 캡슐은 생체내이용율이 최대이고 전-전신성 분해가 최소일 때 위장관에서 제제형의 활성 부분이 유리되도록 제조될 것이다. 부가적인 부형제는 GDNF 단백질 산물의 흡수가 용이하도록 하기 위해 포함될 것이다. 희석제, 향신료, 낮은 융점의 왁스, 식물성 오일, 윤활제, 현탁제, 정제 붕해제 및 결합제도 사용될 수 있다.

중이 용액, 현탁액 및 연고를 포함한 국부적인 귀 제제의 제제형은 본 분야인 숙련자들에게 공지되어 있다 [Remington의 Pharmaceutical Sciences, 18th Edition, Chapter 86, pages 1581 - 1592, Mack Publishing Company, 1990 문헌 참조]. 중이에 대한 주입을 포함한 그외의 투여방법도 이용가능하며, 그러한 투여방법에 적당한 중이 제제를 생산하는 방법 및 수단 또한 공지되어 있다.

본 출원에서 사용된 바와 같이, "중이"는 고막과 내이 사이의 공간을 말한다. 이 장소는 모든 내이 조직의 외부이고, GDNF가 고막을 통해 침투하도록 제제형을 개발하더라도 침투 과정이 이 부위에 접근하기 위해 필요한 것은 아니다. 한편, 물질은 고막을 통해 중이로 주입될 것이며 반복적인 투여가 필요할 경우에는 고막에 구멍을 만들 것이다. 이러한 계의 예에는 삽입물 및 이러한 부위에 치료학적 물질을 수송하는데 이용되는, "국부적으로" 가하는 점적약, 겔 또는 연고가 포함된다. 중이의 감염(보통 어린이에게서)과 같은 경우에 고막의 개방은 병원 방문시에 매우 흔히 행하는 과정이다. 구멍은 며칠 후에 자연적으로 닫힌다.,

내이 질환이나 손상 치료에 대하여 기술하고 있는 GDNF 단백질 산물의 이용에 있어서, 국부적으로 가하는 제제형은 중이 및 내이로의 치료학적 약물의 침투 및 수송을 돕는 약물을 포함하는 것 또한 바람직하다. 그러한 약물은 본 분야에 공지되어 있다. 예를들어, Ke등의 미국 제5,221,696호에는 각막을 통한 안제제의 침투를 강화하는 물질의 용도에 대해 기술되어 있다.

내이계는 와우 및 전정 기관과 같은 내이의 조직층 내부, 사이 또는 그 둘레에 있는 모든 조직 성분에 대해 적합하게 이용되는 계이다. 이 위치는 맥관선조, 라이스너막, 코르티 기관, 나선인대 및 와우 신경원과 같은 와우의 상이한 구조를 포함한다. 단백질이 와우창 막을 통해 내이의 외림프내로 침투하는 것으로 나타났으므로, 침투 과정이 이들 구조에 도달하게 할 필요는 없다. 와우창 막을 통해 내이내로 침투에 의해 GDNF를 도입시키기에 특히 적합한 부형제는 인조 외림프이다. 이 용액은 280-30O mOsm 및 pH 7.2의 탈이온수내 1.O% 둘베코 인산-완충 식염수 용액내의 1O.OO mM D-글루코스, 1.5 mM CaCl, 1.5 mM MgCl로 이루어진다. 다른 제제 또한 축적주사에 인해 수송되는 단백질이 서서히 또는 지속적으로 유리되도록 하는, 중이내로 주사가능한 중심체 또는 리포솜과 같은 약물과 함께 GDNF 단백질 산물의 제제형을 함유할 것이다. GDNF 단백질 산물의 내이 도입에 대한 그외의 적당한 방법은 GDNF 단백질 산물을 함유하는 삽입가능한 약물 수송 기구 및 터널을 통한 와우-이식을 포함하며, 따라서 GDNF는 내이로 계속적으로 수송될 수 있다.

본 발명의 귀 치료 제제, 특히 국부 제제는 본 분야에 잘 알려져 있는 바와 같이 다른 성분, 예컨대 중이에 용인가능한 방부제, 긴장제, 공동용매, 복합제, 완충제, 항미생물제, 항산화제 및 계면활성제를 함유할 것이다. 예를들어, 적합한 긴장 강화제는 알칼리 금속 할로겐화물(바람직하게는 염화나트륨 또는 염화칼륨), 만니톨, 소르비톨 등을 포함한다. 귀로 주입될 제제형이 내림프와 외림프의 오스몰농도와 양립하도록 충분한 긴장 강화제를 가하는 것이 바람직하다. 적당한 방부제는 염화벤잘코늄, 티메로살, 펜에틸알콜, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로르헥시딘, 소르브산 등을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 과산화수소 또한 방부제로 사용될 수 있다. 적합한 공동용매는 글리세린, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 적당한 복합제는 카페인, 폴리비닐피롤리돈, 베타-시클로덱스트린 또는 히드록시프로필-베타-시클로덱스트린을 포함한다. 완충액은 붕산염, 시트르산염, 인산염, 중탄산염 또는 트리스- HCl 과 같은 통상적인 완충액일 수 있다.

제제형 성분은 중이 또는 내이의 투여 부위에 용인가능한 농도로 존재한다. 예컨대, 완충액은 생리학적 pH 또는 그 보다 약간 낮은 pH, 일반적으로 약 5내지 약 8인 pH 범위로 조성물을 유지시키기 위해 사용된다.

국소적인 접촉을 최대화하고 와우창 막을 통한 흡수를 촉진시키기 위하여, 부가적인 제제형 성분은 중이에 투여되는 치료제가 더 오래 머물도록 하는 물질을 포함할 수 있다. 적당한 물질은 중이 제제의 점성도를 높이는 폴리머 또는 겔형성물질을 포함한다. 내이 치료제의 유리를 조절하기 위한(예를들어, 계속적인 수송 및 그것의 연장) 본 발명의 제제형의 적합성은 본 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 다른 귀 제제도 여전히 정제제조에 적합한, 비-독성 중이 치료에 용인가능한 부형제와 혼합하여 유효량의 GDNF 단백질 산물을 함유할 것이다. 살균수 또는 그 외의 적당한 부형제에 정제를 용해시킴으로써, 중이 치료 용액은 단위 투여 형태로 제조될 수 있다. 적당한 부형제는 탄산칼슘, 탄산나트륨 또는 중탄산나트륨과 같은 불활성 희석제 또는 녹말, 겔라틴 또는 아카시아와 같은 결합제를 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다.

GDNF 단백질 산물의 투여/수송

GDNF 단백질 산물은 피하, 근육내, 정맥내, 폐내외, 경피적, 초내 또는 대뇌내 경로를 통해 비경구적으로 투여될 수 있다. 내이 상태를 치료하기 위해, GDNF 단백질 산물은 국부 적용, 삽입, 주사, 이식, 세포치료 또는 유전자치료에 의해 중이로(또는, 특히 침투방법이 이미 적절한 위치에 있는 경우에는 내이로 직접) 투여될 수 있다. 예를들어, 생분해가능한 폴리머 매트릭스에 박혀 있는 신경영양성 인자를 함유하는, 서서히 유리되는 삽입물이 GDNF 단백질 산물을 수송할 수 있다. GDNF 단백질 산물은 그것이 혈액뇌장벽을 통과하도록 하기 위해 화학적으로 변이되거나 포장된 형태로 대뇌외적으로 투여되거나 장벽을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 침투를 도울 수 있는 하나 또는 그 이상의 약물과 함께 투여될 것이다.

유사하게, GDNF 단백질 산물은 중이 또는 내이에 투여되거나, 귀의 막을 가로질러 GDNF 단백질 산물의 침투 또는 수송을 도울 수 있는 하나 또는 그 이상의 약물과 함께 고막의 최상부에 투여될 것이다. 투여 빈도는 제형화되는 GDNF 단백질 산물의 약력학적 변수 및 투여 경로에 의존할 것이다.

특정 투여량은 체중, 신체 표면 면적 또는 기관의 크기를 고려하여 계산될 것이다. 상기 언급한 각 제제형으로 치료하기에 알맞은 투여량을 결정할 필요가 있는 보다 정확한 계산은 본 분야의 숙련자들에 의해 일상적으로 이루어지며, 특히 본원에 기술된 투여량 정보 및 검정을 고려하여 일상적으로 실시되는 작업의 범위에 속한다. 적당한 투여량은 특유의 투여량-반응 데이터와 결부시켜 사용되는 투여량을 결정하기 위한 기정 검정을 이용하여 확정될 것이다. 내이 투여 제제형에 사용된 투여량은 전신 주사나 경구 투여에 사용되는 양에 비해 대단히 작다는 것은 본 분야의 숙련자들에게 자명할 것이다. 상기 상태의 치료방법과 관련된 최종적인 투여 양생법은 약물 작용을 변화시키는 여러 인자, 즉 연령, 상태, 체중, 환자의 성별 및 평소의 음식, 감염의 심각성, 투여시간 및 그외의 임상 인자들을 고려하여 주치의에 의해 결정될 것이다. 연구가 진행될수록, 다양한 질병과 조건을 치료하기 위한 적당한 투여량 수준에 관한 더 많은 정보가 쏟아질 것이다.

GDNF의 계속적인 투여 또는 지속적인 수송이 주어진 치료에 바람직할 것으로 생각된다. 계속적인 투여는 주입 펌프를 이용하는 것과 같은 기계적 방법을 통해 이루어 질 수 있는 반면에, 연속적이거나 거의 연속적인 다른 투여 방식도 실시될 것으로 예상된다. 예를들어, 화학적 유도 또는 캡슐하는 결정된 투여량 양생법에 기초하여 예언할 수 있는 양으로 계속적인 존재 효과를 갖는 단백질의 지속적인 유리 형태가 되게 한다. 따라서, GDNF 단백질 산물은 이러한 계속적인 투여가 유효하도록 유도하거나 다른 방법으로 제형화한 단백질을 포함한다.

GDNF 단백질 산물 세포 치료, 예컨대 GDNF 단백질 산물을 생산하는 세포의 중이 또는 내이 이식 또한 고찰된다. 이러한 실시형태는 GDNF 단백질 산물의 생물학적 활성 형태를 합성하고 분비할 수 있는 세포를 환자에게 이식하는 것에 관계한다. 이러한 GDNF 단백질 산물-생산 세포는 GDNF 단백질 산물의 자연적인 생산 세포(B49 글리오블라스토마 세포와 유사)이거나, 그것의 발현 및 분비를 촉진시키기에 적당한 벡터내 원하는 GDNF 단백질 산물을 암호하는 유전자로 형질 전환시킴으로써 증가되는 GDNF 단백질 산물을 생산하는 능력을 가진 재조합 세포일 것이다. 외래 종의 GDNF 단백질 산물이 투여되는 환자에게서 일어날 수 있는 면역 반응을 최소화하기 위해, GDNF 단백질 산물을 생산하는 천연 세포는 인체 기원이며 인체 GDNF 단백질 산물을 생산하는 것이 바람직하다. 이식 세포는 조직 주변인 침윤을 막기 위해 캡슐화할 것이다. 인체 또는 비-인체 동물 세포는, GDNF 단백질 산물은 유리시키지만 주변 조직으로 부터 유해한 다른 인자나 환자의 면역계에 의한 세포 파괴를 방지하는 생체적합성, 반투과성의 중합성 봉입체 또는 막 내로 환자에게 이식될 것이다. 예를들어 이식물과 같은 것은 GDNF 단백질 산물을 생산하여 외림프내로 직접 유리시키기 위해 중이의 와우창 막에 부착시킬 것이다.

또한 환자 자신의 세포도 GDNF 단백질 산물을 생산하기 위해 생체외에서 형질전환될 것이며, 캡슐화되지 않고 직접 이식될 것으로 생각된다. 예컨대, 코르티 기관 지지 세포를 회수하고 적당한 벡터로 형질전환시켜 세포를 배양한 다음 원하는 GDNF 단백질 또는 GDNF 단백질 변이체를 생산하여 유리시키는 환자의 내이로 다시 이식될 것이다.

핵산 구조물 또는 그외의 적당한 수송 벡터의 국부적인 주사를 통해 표적 내이 세포내로 GDNF 단백질 산물에 대한 암호 유전자를 삽입함으로써 생체내 GDNF 단백질 산물 유전자 치료도 생각할 수 있다 [Hefti, J. Neurobiol., 25 : 1418-1435, 1994 참조]. 예를들어, GDNF 단백질 산물을 암호하는 핵산 서열은 내이 세포로 수송하기 위한 아데노-결합 바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터에 함유될 것이다. 택일적인 바이러스성 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 허피스 단신 바이러스(Herpes simplex virus), 유두종바이러스 벡터를 포함하지만 이것으로 한정되지는 않는다. 생체내 또는 생체외에서 적당한 물리학적 전이는 리포솜-중재 전이, 직접 주사(있는 그대로의 DNA), 수용체-중재 전이(리간드-DNA 복합체), 일렉트로포레이션, 인산칼슘 침전 또는 미립자 충격(유전자 주입기)에 의해 이룰 수 있을 것이다.

살아있는 세포의 막 캡슐화에 대한 방법학은 본 분야의 숙련자들에게 친숙하며, 캡슐화된 세포의 제조와 환자에 대한 이식은 불필요한 실험작업없이 이루어질 것이다. 예를들어, 미국특허번호 제4,892,538호, 제5,011,472호 및 제5,106,627호를 참조하고, 각각은 특정하게 본원에서 참고문헌으로 인용하였다. 캡슐화 생존 세포계는 본원에서 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT 출원 제W091/10425호에 기술되어 있다. 본원에서 참고문헌으로 인용한 Aebischer 등의 PCT출원 제W091/10470호, Winn 등의 Exper. Neurol., 113 : 322-329, 1991, Aebischer 등의 Exper. Neurol., 111:269-275, 1991; Tresco 등의 ASAI0, 38:17-23, 1992 문헌 또한 참조하라. 리포솜 운반체, 생분해되는 입자 또는 주(beads) 및 축적주사와 같은 지속적-또는 조절-수송 방식의 다양한 제형화 기술 또한 본 분야인 숙련자들에게 공지되어 있다.

본원에 기술된 GDNF 단백질 산물 제제형은 동물뿐만 아니라리 인체에 적용될 것이며, 용어 "환자"는 제한된 형식으로 해석되지 않는다. 동물에 적용할 경우에, 투여량 범위는 상기한 바와 같을 것이다.

본 발명의 다른 양상 및 장점은 하기 실시예를 참조하여 인지될 것이다. 실시예 1은 와우 이식편 배양계내에서 유모 세포에 대한 GDNF 단백질 산물의 투여 효과를 기술하고 있다. 실시예 2는 와우로부터 생성된 분리 세포 배양액에서 나선신경절 신경원에 대한 GDNF 단백질 산물의 투여 효과를 기술한 것이다. 코르티 기관의 이식편 배양액 연구 결과 및 성숙한 랫의 나선신경절 신경원 배양 결과는 GDNF 단백질 산물이 이독소에 대항하여 코르티 기관의 청각신경원과 유모 세포에 대해 신경영양성 활성 및 방어 활성을 가짐을 입증하였다.

[실시예]

[실시예 1]

GDNF 단백질 산물은 이독성에 대하여 와우 유모 세포를 보호한다.

물질

하기 실시예에서 사용한 물질은 다음과 같이 수득하였다.

코르티 기관의 해부 용액 :

1.5g/L D-글루코스(깁코 BRL의 덱스트로스 카탈로그 #15023-021)를 함유하는 둘베코 인산완충식염수(PBS;1x, 염화칼슘 비함유, 염화마그네슘 비함유, 깁코 BRL의 카탈로그 #14190-136).

GDNF 단백질 산물 용액

정제된 인체 재조합 GDNF 단백질 산물을 5% 소혈청 알부민을 함유하는 D-PBS(증류수로 제조한 인산완충식염수)내 1mg/ml용액으로 제조하였다. 용액을 분취하여 -85℃에 보관하였다. 일련의 희석액(정상 배양 배지에 대하여 0.1; 1; 10; 25; 50ng/ml)을 96마이크로 평판에 제조하였다. 1O-배 농축된 GDNF 단백질 산물 용액 1Oml를, 이독소를 포함하거나 그렇지 않은 (대조) (90μl) 코르티 기관의 이식편 배양 배지에 가하였다. 평판배양일에 GDNF 단백질 산물 처리를 시작하였다. 2일째에, 이독소만을 함유하는 배지, 이독소와 GDNF를 함유하는 배지 또는 둘다 함유하지 않는 배지(대조)로 배지를 교환하였다.

랫의 코르티 기관 이식편 제조

P3-P4위스타 랫(Wistar rat)으로부터 코르티 기관의 이식편을 수득하였다. 랫의 목을 베어 아래턱을 절개하고 피부를 제거하였다. 해부 용액에 측두골을 모아서 귀의 캡슐을 들어내고 연골성의 와우 캡슐을 조심스럽게 측두골에서 분리하였다. 분리된 와우는 다른 해부를 위해 해부용액과 함께 다른 페트리접시에 옮겼다. 중추 제8신경 조직을 잡아 제거하기 위해 예리한 핀셋을 이용하여 손상되지 않은 코르티 기관을 수득한 다음 선조 맥관막을 위나 아래에서 시작하여 조심스럽게 벗겨내었다. 글루코스로 보충한 차가운 PBS를 함유하며 배양 준비가 되어 있는 35-mm 직경의 페트리접시에 코르티 기관을 옮겨 담았다.

와우 이식편 배양 방법

코팅되지 않은 96마이크로평판에서 와우 이식편을 배양하였다 . 하나의 코르티 기관을 웰에 놓고 배지에 띄웠다. 이식편을 정상적인 배지에 24시간동안 두었다(90 μl/웰). GDNF 단백질 용액(10μl)을 '처리' 배지에 가하고 10 μl의 배지를 대조에 가하였다. 배양한지 24시간 후, 배지를 교환하고 GDNF 단백질 용액(1O μl)을 수반하거나 수반하지 않는(대조) 이독소-함유 배지(90μl)에 노출시켰다. 배양액을 3일동안 부가적으로 항온하였다. 그런 다음 O.1M D-PBS에서 4% 파라포름알데히드와 함께 실온으로 이식편을 고정시키고 면역염색 처리하였다.

유모 세포의 FITC-팔로이딘 염색

코르티 기관에서 유모 세포를 확인하고 그 수를 세기 위하여, 유모 세포의 부동모 다발에 자연적으로 존재하는 악틴을 표지하는 데에 직접적인 면역염색법을 이용하였다. 이식편을 D - PBS(웰당 200 μl)로 3회 세척하고, 실온으로 15분간 D-PBSO에 1% 트리톤 X-1OO으로 투과시켰다. D-PBS로 3회 세척 후, 이식편을 실온에서 45분간 FITC-표지 팔로이딘(저장용액으로부터 1:60 희석, 50 μl/웰)과 함께 항온하였다. 팔로이딘은 매우 민감하므로 평판을 알루미늄 호일로 덮었다. D-PBS로 3회 더 세척 후, 커버글라스로 덮고 메니큐어액으로 밀봉한 현미경 슬리이드상의 소량의 글리세롤에 표지된 이식편을 놓아 두었다. FITC 필터 및 형광 광학을 이용하는 니콘 디아포트-300 역형광 현미경(Nikon Diaphot-300 inverted fluorescence microscope)으로 이식편을 관찰하였다.

유모 세포수의 결정

각 실험에 대하여 2내지 4개의 와우를 사용하였다. 각 와우는 175㎛의 길이로 2-3 번잘라 유모 세포의 수를 세었다. 와우의 중회전 부분만 분석하였다. 각 실험을 몇차례 반복하였다. 대조 및 시스플라스틴 - 또는 네오마이신 - 처리 배지에서의 유모 세포의 수는 항목당 40개의 와우를 분석하여 얻었다.

결과

부유하는 이식편 배지내 유모 세포는 4일간의 실험기간동안 생존하였다. 따라서 이독소의 부재시와 처리시에 4일간의 실험기간말에 존재하는 팔로이딘-염색 세포의 수는 105.4 ±6.9(n=28)였다. 평판 후 2일째에 이식편에 가한 이독소는 시험판내에서 4일후에 관찰된 유모 세포 수를 상당히 감소시켰다. 평판한지 24시간 후에 35㎍/ml의 시스플라틴에 노출시키면 약 80%의 유모 세포가 손실되었다 : 초기 유모 세포수의 21.2%±6.0(n=40)만이 생존하였고(표 2 참조), 0.8mM의 네오마이신에 노출시킨 후에는 유모 세포의 7.4% ±4.7(n=43)만이 생존하였다(표 2 참조).

[표 2]

평판일에 또는 평판한지 24시간후에 이식편 배지에 GDNF를 가하였다. 평판한지 24시간후에 시스플라틴(35㎍/ml)을 가하고, 배지를 3일 더 배양하였다. 유모 세포를 FITC-팔로이딘으로 염색하였다. 와우 세포를 175㎛인 길이로 2-3번 잘라 중회전의 유모 세포수를 세었다. 결과는 시험관내에서 4일후에 비처리 배지에 존재하는 유모 세포의 백분율로 표시한다(105.4±6.9; n=28). 각 수는 평균±SD의 n와우이다.

^*P＜0.05에서의 시스플리틴 단독과 상당한 차이를 보임(t-검정)

ND : 측정되지 않음

이러한 두 처리 사이의 코르티 기관의 형태는 현저하게 다르다 : 네오마신으로 처리하면 유모 세포가 거의 모두 손실되는 반면에, 남겨둔 것들은 여전히 전형적인 4열 구조를 이루었다(3열의 외유모 세포와 1열의 내유모 세포). 반면에 시스플라틴으로 처리하면 4열 구조가 현저하게 파괴되었고, 생존 세포는 불규칙적으로 위치하였다.

평판시에 GDNF를 가한 배지(전처리)는, 이독소에 3일(2-4일)간 노출시 상당한 수인 유모 세포가 생존하였다. 시스플라틴에 노출시킨 배지에 있어서, 0.05ng/ml만큼 낮은 농도의 GDNF로 처리하면 생존하는 유모 세포가 21%(비처리 배지) 내지 35% 증가하였다. 최대 방어 활성도는 0.1ng/ml의 GDNF에 달하였다(표 3 참조). 네오마이신에 노출시킨 배지는 0.1ng/ml의 GDNF에서 7%내지 22%의 유모 세포수가 증가하였다; 최대 GDNF활성도(37% 생존)는 10ng/ml인 GDNF 에서 나타났다(표 3 참조). GDNF처리는 네오마이신-처리 배지의 4열 구조를 보호하였지만, 시스플라틴에 의한 파괴는 막지 못했다

이독성으로부터 유모 세포를 구하는 GDNF의 능력을 더 실험하기 위해, 평판한지 24시간후에 GDNF를 가함과 동시에 배지를 독소에 노출시키는 실험을 실시하였다(공동처리), 결과는, 이러한 실험에서의 전형적인 GDNF가 독소에 노출시키기 전에 제공되는 것과 같은 정도로 유모세포를 구할 수 있음을 시사한다(표 2 및 3 참조)

[표 3]

평판일에(전처리) 또는 평판한지 24시간후에(공동 처리)이식편 배지에 GDNF를 가하였다. 평판한지 24시간후에 네오마이신(0.8M)을 가하고 배지를 3일 더 배양하였다. 유모 세포를 FITC-팔로이딘으로 염색하였다. 길이 175㎛로 와우를 2-3번 잘라 중회전의 유모 세포수를 세었다. 결과는 시험관내에서 비처리 배지에 4일후에 존재하는 유모 세포의 백분율로 표시한다(105.4±6.9; n=28). 각 수는 n와우의 평명균±SD이다.

^★p＜0.05에서의 네오마이신 단독과 상당한 차이를 보임(t-검정)

ND : 측정되지 않음

[실시예 2]

GDNF 단백질 산물은 내이 청각 신경원(나선신경절 신경원)의 생존을 촉진시키고 이독소로부터 그것을 보호한다

물질

하기 실시예에서 사용한 물질은 다음과 같이 수득하였다.

세포 배양 배지

높은 포도당의 둘베코 변형 이글 배지(DMEM; #11965-092), 햄의 F12 배지(F12; #11765-021), B27 배지 보충물(#17504 - 010), 페니실린/스트렙토마이신(#15070-014), L-글루타민(#25030-016), 둘베코 인산완충식염수(D-PBS; #14190-052), 마우스 라미닌(#23017 - 015), 소의 혈청 알부민 및 분획V(#110-18-017)는 모두 미국 뉴욕 그랜드 아일랜드에 소재하는 깁코/BRL로부터 수득하였다. 말의 열 - 불활성 혈청은 미국 유타 로간에 소재하는 하이클론에서 수득하였다. 폴리 - L - 오르니틴 브롬화수소산염(P - 3655), 소의 인슐린(I - 5500), 인체 트란스페린(T - 2252), 푸트레신(P - 6024), 프로게스테론(P-6149) 및 셀렌산나트륨(S-9133)은 미국 미주리주 세인트루이스에 소재하는 시그마 케미칼 캄파니에서 구입하였다. 파파이인, 데옥시리보뉴클레아제 I(DNA 아제) 및 난 알부민(파파인 분리 시스템)은 미국 뉴저지주 프리홀드(Freehold)에 소재하는 워팅톤 바이오케 미칼스에서 구입하였다. 팔콘 멸균 96-웰 마이크로평판(#3072), 조직 배양 플라스틱 용품 및 폴리프로필렌 원심분리관은 미국 캘리포니아 옥스나드 소재 벡톤-디킨슨에서 구입하였다. 텍스 20㎛ 나일론망(Nitex 20㎛ nylon mesh)(#460)은 미국 뉴욕 엘름스포드 소재 테트코(Tetko)에서 구입하였다. 4" 해부 핀셋과 4" 해부 가위는 미국 워싱턴 DC소재 로보츠 서지칼에서 구입하였다.

항체 및 관련 시약

신경원세포성 특이 에놀라제(NSE)토끼의 다클론성 항체는 케미콘에서 구입하였다(#AB951). 비오틴화된 염소의 항-토끼 lgG(#BA-1OOO) 및 과산화효소-복합 아비딘/비오틴 복합체(ABC엘리트; 키트 PK-6100)는 미국 캘리포니아 벌링게임에 소재하는 벡터 라보라토리스에서 구입하였다. 3', 3'-디아미노벤지딘은 미국 펜실베니아 웨스트 체스터에 소재하는 카펠 라보라토리스에서 구입하였다. PBS내 수퍼블록 차단 완충액은 미국 일리노이 록포드에 소재하는 피어스에서 구입하였다. 트리톤 X-100(X100), 노니데트 P-40(N6507) 및 과산화수소(30%, v/v; H1009)는 시그마에서 구입하였다. 그외의 모든 시약은 달리 특정하지 않는 한 미주리주 세인트루이스 소재 시그마 케미칼 캄파니에서 구입하였다.

이독소

시스플라틴(플라티놀 - AQ, #NDC 0015-3220-22)은 미국 뉴저지주 프린스톤 소재 브리스톨 - 마이어스 - 스퀴브에서 구입하였고, 살리실산나트륨은 미국 뉴저지주 필립스버그 소재 제이. 티. 베이커에서 구입하였으며(#3872-01), 네오마이신은 시그마에서 구입하였다(#N1142).

방법

배지 제조

기초 배지는 DMEM과 F12배지의 1:1 혼합물로 제조하였고, 50배 농축 저장 용액으로 가하는 B27 배지 보충물로 보충하였다. B27 배지 보충물은 비오틴, L-카르니틴, 코르티코스테론, 에탄올아민, D(+) - 갈락토스, 환원된 글루다티온, 리놀레산, 리놀렌산, 프로게스테론, 푸트레신, 레티닐 아세테이트, 셀레늄, T3(트리오도-1-티로닌, DL-알파-토코페롤; 비타민 E), DL-알파-토코페롤 아세테이트, 소의 혈청 알부민, 카탈라아제, 인슐린, 초산화물 디스뮤타제 및 트란스 페린으로 구성된다. L-글루타민은 최종 농도가 약 2mM, 페니실린은 약 1OOIU/I 및 스트렙토마이신은 약 1OOmg/l가 되도록 가하였다. 말의 열-불활성 혈청은 최종 농도가 약 2.5%가 되도록 가하고, D-포도당은 최종 농도가 약 5g/l, HEPES 완충제는 약 20mM, 소의 인슐린은 약 2.5mg/ml, 인체 트란스페린은 약 O.1mg/ml가 되도록 가하였다. 혼합 후, pH를 약 7.3으로 조절하고 배지를 4℃로 유지시켰다. 실험기간 중 변형되는 것을 최소화하기 위하여, 배지는 사용 직전에 신선하게 제조하였다. 단백질 흡착을 최소화하기 위하여 전반적으로 플리스틱 피펫과 용기를 사용하였다.

GDNF 단백질 산물 용액

5%소의 혈청 알부민을 함유하는 D-PBS(증류수로 제조한 인산완충식염수)내 1mg/ml 용액으로서 정제된 인체 재조합 GDNF 단백질 산물을 제조하였다. 용액을 분취하여 -85℃에 보관하였다. 일련의 희석액을 96-웰 마이크로평판에 준비하였다. 10배 농축된 1Oμl의 GDNF 단백질 산물 용액을, 배양 배지를 포함하는 세포 배지(90μl)에 가하였다. 대조 배지에는 5% 알부민과 함께 D-PBS를 가하였다(1Oμl). 세포를 접종한지 1시간 후 또는 24시간 후에 이독소와 함께 또는 단독으로 GDNF 단백질 산물을 배지에 가하였다.

이독소 제조

최종 농도가 약 1O^-4M이 되도록 웰당 1Oμl씩 저장 용액(약 1O^-3M)에서 직접 네오마이신을 가하였다. 배양 배지로 시스플라틴을 희석하여 저장용액(1mg/ml)에서 20㎍/ml의 용액이 되도록 하였고, 최종 농도가 2㎍/ml가 되도록 웰당 10μl씩 가하였다.

배지 하층

하층 및 신경돌기 곁가지에 대한 나선신경절 세포의 최적 결합을 원조하기 위하여, 하기 방법에 따라 폴리-L-오르니틴에 이어 라미닌으로 잇따라 코팅함으로써 미량역가 평판의 표면(배지 하층)을 변형시켰다. 실온에서 적어도 1시간동안 0.1M 붕산(pH 8.4)내 O.1mg/ml의 폴리오르니틴 멸균 용액으로 평판 표면을 완전히 덮은 다음 수퍼-Q 액(Super-Q water)으로 멸균 세척하였다. 세척 용액을 뽑아낸 다음 PBS내의 1O㎍/ml의 마우스 리미닌 용액을 가하고 2시간동안 37℃에서 항온하였다. 결과의 재현성을 보장하기 위해 평판을 사용하기 직전에 이러한 과정을 실시하였다.

랫의 나선신경절 세포 배지 제조

생후 3주내지 4주된 위스타 랫(메인 바 하버 소재 잭슨 라보라 토리스에서 수득)에 다음 용액[케타민(100mg/ml); 크실라진(20mg/ml) 및 아코프로마진 말레이트(910mg/ml)가 3 : 3 : 1 비율로 혼합된 용액]을 과투여하고 목을 베어 죽였다. 또한 와우를 수반하는 측두골을 잘라내어 장래에 대비하여 1.5g/L의 포도당을 수반하는 PBS내로 무균적으로 옮겼다. 실험 당 최대 30개의 와우를 처리하였다. 와우를 열고, 뼈의 와우축을 갖는 코르티 기관을, 5ml의 분리 배지(HBSS내 120단위의 파파인 및 2000단위의 DNA아제)를 함유하는 50ml 멸균관에 모았다. 약 200rpm의 회전 플랫포옴 진탕기에서 약 37℃로 30분간 조직을 배양한 다음 분리 용액을 신선한 것으로 교체하고, 30분 더 배양하였다. 불로 다듬은 파스퇴르 피펫을 통해 분쇄하여 세포를 분산시킨 다음 비분리된 조직을 제거하기 위해 40㎛의 니텍스 나일론 망에서 걸르고 IEC 임상 원심분리기를 이용하여 200 ×g에서 5분간 원심분리하였다. 그 결과 생성된 세포 펠릿은 난 알부민과 약 500단위의 DNA아제를 함유하는 HBSS에 현탁시키고, 4% 난 알부민 용액(HBSS내)의 상층에 깐 다음 500 ×g로 약 6분간 원심분리하였다. 최종 펠릿을 약 6ml인 배양 배지에 현탁시키고 미리 코팅된 평판에 90μl/웰씩 접종하였다.

나선신경절 세포의 면역조직화학

신경원세포성 특이 에놀라제(NSE)에 대한 면역조직화학 염색에 의하여 나선신경절 신경원을 확인하였다. 나선신경절 세포 배지를 실온에서 약10분간 D-PBS내 8% 파라포름알데히드로 고정시키고, 배양 배지에 100μl/웰씩 가한 다음 100μl의 4% 파라포름알데히드로 10분간 더 교체하였고 D-PBS(6-mm웰당 200μl)로 3회 세척하였다. 1% 노니데트 P-4O을 함유하는 PBS내 수퍼블록 차단 완충액에서 고정된 배지를 항온하여 항체의 침투를 증가시켰다. 토끼의 다클론성 항-NSE 항체(케미콘에서 구입)를 동일한 완충용액내 1:6000 희석액에 가하였고, 배지를 회전 진탕기에서 37℃로 2시간동안 배양하였다. D-PBS로 3회 세척 후, 약 1:300 희석액에서 염소의 항-토끼 비오틴화된 1gG(미국 캘리포니아 벌링게임 소재 벡터 라보라토리스에서 구입한 벡타스테인 키트)를 사용하여 나선신경절 세포-결합 항체를 검출하였다. 37℃에서 약 1시간동안 세포와 함께 이차 항체를 항온하였다. 그런 다음 세포를 D-PBS로 3회 세척하였다. 1:300으로 희석한 아비딘-비오틴 과산화효소 복합체로 이차 항체를 표지하고 37℃에서 약 60분간 세포를 항온하였다. D-PBS로 3회 더 세척한 후, 0.04% 3', 3'-디아미노벤지딘-(HCI)₄, O.O6% NiCl₂및 O.O2% 과산화수소를 포함하는 0.1M 트리스-HCl, pH 7.4 용액에서 표지된 세포 배지를 5분간 반응시켰다.

나선신경절 세포 생존율의 결정

배양한지 여러 시간후에(24시간, 3일 및 4일), 랫의 나선신경절 세포 배지를 고정시키고 처리한 다음 상기와 같이 NSE에 대해 면역염색하였다. 그런 다음 브라이트-라이트 광학(bright -light optics)으로 200 × 배율에서 배지를 관찰하였다. 6-mm 웰에 존재하는 모든 NSE-양성 신경원의 수를 세었다. 생존가능한 나선신경절 세포는 15-4O㎛에 걸친 크기의 원형 몸체를 가지며 신경염성 돌기를 갖는 것이 특징이다. 불규칙적인 소포성의 핵주위부세포체 또는 붕괴된 신경돌기를 갖는 것처럼 변질의 징후를 보이는 나선신경절 세포의 수는 세지 않았다(그러나 대부분의 변질된 나선신경절 세포는 배지하층으로부터 분리하였다). 세포수는 세포/6-mm웰 또는 대조 세포 밀도에 대한 상대적인 배수 변화중 하나로 나타내었다.

결과

랫의 나선신경절 신경원 배지는 이독소에 대한 생존과 보호에 끼치는 GDNF 단백질 산물의 영향을 설명하는데 사용하였다. 나선신경절 세포는 생후 3내지 4주된 랫의 와우에서 수득하였다. B27 배지 보충물, 2.5%의 말의 열-불활성 혈청, D-포도당, HEPES, 인슐린 및 트란스페린을 보충한 DMEM/F12내 분리 세포를 2웰당 약 1와우의 밀도로 폴리오르니틴-라미닌-코팅된 마이크로 평판에 접종하였다. 배지는 신경원성 및 비신경원성 세포 혼합물로 구성하였다. 그러나, 존재하는 유일한 신경원은 나선신경절 신경원이었으며 그것은 NSE면역활성의 존재하에 의해 확인하였다. 접종 농도에서(2웰내로 1개의 분리 코르티 기관을 접종), 접종한지 24시간 후 웰당 NSE-양성 세포의 수는 대조 조건(비처리)하에서 127±17(n=7)이었다. 실험의 종반부에, 접종 후 4일깨에 웰당 신경원의 수는 64±4.7로 감소하였는데, 24시간 후 시험관내 대조 조건하에서 존재하는 수의 50.5%±3.7이다.

GDNF 단백질 산물의 투여 효과는 시스플라틴과 같은 공지된 이독소의 독성 효과에 저항하는 능력 뿐만 아니라 배양된 랫의 나선신경절 신경원의 생존 및 형태학적 성숙에 대하여 평가하였다. 접종한지 24시간 후에 나선신경절 세포 배지를 인체 재조합 GDNF 단백질 산물(50ng/ml∼0.1ng/ml에 걸쳐) 단독으로 또는 시스플리틴(35㎍/ml)과 함께 처리하였다. 접종한지 24시간 후에, 1ng/ml와 10ng/ml의 GDNF로 처리한 것(각각 127 ±17; 126 ±24 및 125 ±19신경원/웰)과 대조 배지의 청각 신경원의 수는 다르지 않았다. 3일 뒤 1ng/ml 농도의 GDNF로 처리한 것은 신경원세포성 세포의 수가 현저하게 증가하지 않았다. 그러나 영양의 차이는 현저하였다 : 신경원세포의 몸통은 대조 배지에서 보다 더 크고 섬유는 더 길고 더많이 생산되었다. 1Ong/ml의 GDNF로 처리한 배지에서, 24시간후에 존재하는 신경원의 약 72%가 생존하였으며 이것은 대조 배지보다 44% 증가한 것이다(표 4 참조). 영양효과는 1ng/ml의 GDNF로 처리한 배지보다 더 강력하였다.

또한 GDNF는 시스플라틴 독성으로부터 나선신경절 신경원을 보호하였다(표 4 참조). 접종 후 24시간만에 5㎍/ml의 시스플라틴에 노출시킨 것은, 4일 후에 신경원의 초기수(24시간)의 약 94%가 손실되었다. GDNF를 시스플라틴과 함께 가했을 때, 4일 후에 발견된 신경원인 수는 현저히 많았다. GDNF의 이러한 방어 효과는 투여량에 의존하였다 : 1ng/ml, 10ng/ml 및 25ng/ml 농도의 GDNF에 대하여 각각 독성 처리 개시일에 존재하는 신경원의 20.1±5.1; 27.5±3.2 및 32.8±1.0이 발견되었다(데이타는 나타나 있지 않음). 이러한 결과는 GDNF에 반응하는 신경원의 약 63%(나선신경절 신경원 개체의 약 44%)가 시스플라틴 독성으로부터 보호될 수 있음을 시사한다.

[표 4]

평판한지 24시간 후에 분리된 나선신경절 신경원 배지에 GDNF와 시스플라틴을 가하였다. 배양액을 3일 더 항온하고, NSE-면역반응 세포의 수를 세어 신경원의 수를 측정하였다. 신경원 세포수는 시험관내에서 24시간 후에 존재하는 신경원의 백분율로 나타낸다. 각 결과는 n배양의 평균±SD이다.

^★p＜0.05에서 시스플라틴 단독일 때와 현저한 차이를 보임(t-검정)

^★★p＜0.05에서 비처리 대조와 현처한 차이를 보임(t-검정)

[실시예3]

GDNF 단백질 산물은 와우 유모 세포의 생체내 생존을 돕는다.

하기 실시예는 GDNF 단백질 산물인 내이 투여가 동물 모델내에서 이독소에 대항하여 와우 유모 세포를 보호함을 설명한다. GDNF는 와우의 기저회전(basal turn)에 뚫려 있는 구멍을 관통해 고실계내로 밀어 넣은 캐뉼라를 통해 내이로 삽입된다. 캐뉼라는 14일동안 1시간에 0.5μl씩 방출되도록 GDNF(50ng/ml)를 담은 알제트 미니-펌프(Alzet mini-pump)와 연결하였다. 캐뉼라 삽입 2일 후 시스플라틴 근육주사를 시작하였는데, 15일동안 매일 1mg/ml씩 또는 5일간격으로 7.5mg/kg씩 2회 투여하였다(제2도에 삽입). 실험은 27일 후에 종결하였다. 유모 세포를 FITC-팔로이딘으로 염색하고 와우의 중회전(중회전 부분의 적어도 20%)에서 그 수를 세었다. 결과는 GDNF로 처리한 귀(우이)와 처리하지 않은 귀(좌이)에 대한 각각의 기니피그의 유모 세포 손실 백분율로 나타내었다.

물질

하기 실시예에 사용된 물질은 다음과 같이 수득하였다.

미니-펌프 조제 물질 :

카탈로그 번호 BB317-85인 의료용 비닐 튜빙 사이즈 V/4(Medical vinyl tubing size V/4)를 보랍 프로덕츠[(800)331-7724]로부터 구입하였다. 피셔 브랜드의 5ml 플라스틱 피펫을 사용하였다. 카탈로그 #8004853 0G의 마이크로루멘 폴리이미드 튜빙(탐파 플로리다에서 구입)을 사용하였다. 실리콘 메디칼 프로덕트 MDX 4-4210은 미국 미시간 미드랜드 소재 다우 코닝 코포레이션에서 구입하였다. 알제트 삼투 미니-펌프 유출 조절기 및 알제트 삼투 미니-펌프(카탈로그 번호 2002)를 미국 캘리포니아 팔로 알토 소재 알차 코포레이션에서 구입하였다. 테이프(타임메드 테이프)(TimeMed tape). 생산번호 11975-0인 프로실-28은 플로리다 게인스빌에 소재하는 PCR 인코포레이티드에서 구입하였다. 정제된 인체 재조합 GDNF 단백질 산물은 D-PBS와 0.1% BSA내 50ng/ml 용액으로 제조하였다. PBS에 용해시킨 멸균된 0.1% 메틸렌 블루(카탈로그 #M-9140)와 미네랄 오일(카탈로그 #400-5)은 시그마에서 구입하였다.

미니-펌프 제조과정

비닐 튜브를 약 4인치로 잘라 소형 바이스에 고정시켰다. 마이크로루멘 폴리이미드 튜브(7mm)를 비닐 튜브의 끝에 넣었다. 대략 염기 10과 치료제 1의 비율로 가하여 실리콘을 혼합하였다. 미세한 탐침을 사용하여 비닐 튜브의 입구에 작은 방울을 놓고, 3.75mm의 비닐 튜브만 남기고 비닐내로 마이크로루멘 튜브를 밀어넣었다. 탐침의 실리콘 방울을 이용하여 마이크로루멘 튜브 둘레에, 끝에서 0.5mm에 작은 볼(small ball)을 생성시키고, 밤새 건조시켰다.

피펫에 3층의 동심 테이프를 가함으로써 5ml 피펫의 직경을 증가시켰다. 피펫을 감싸지 않은 부분에는 일정한 갭이 남아 있었다. 피펫 둘레에 V/4튜빙을 감고, 두개의 늘어진 튜빙 끝과 모든 코일 사이에 연속 접촉면이 존재하도록 코일을 조절하였다. 테이프의 얇은 두 스트립은 피펫상의 테이프 단부와 나란히 정렬시켜 코일을 알맞게 고정시켰다. 최소 1시간동안 건조한 후, 늘어진 끝이 대충 피펫과 평행하게 정렬시키고 테이프의 한쪽 스트립을 제자리에 고정시켰다. 코일에 튜빙을 고정시키기 위해 특제품 풀 한 방울을 가하였다. 밤새 건조시킨 후, 테이프를 제거하고 피펫에서 코일을 벗겨내었다. 유출 조절기를 늘어진 한쪽끝에 삽입하고 특제품 풀 한방울로 고정시켰다.

물에서 1% 프로실-28로 코일을 씻어내리고 물로 철저하게 세척한 다음 70% 에탄올로 씻어내렸다. 주사기나 공기 진공방식으로 에탄올을 제거하였다. 적어도 30분간 코일을 공기 진공으로 건조기에 두고, 밀폐된 건조기에 밤새 둔 다음 가스 살균하였다. 부하 과정중에, 코일 기구는 GDNF 액체, 오일 및 염료의 중력 유도운동을 최대한 막기 위해 수평으로 두었다. 펌프나 코일내에 기포가 형성되는 것도 피하였다. 펌프를 멸균 PBS에 잠기게 하여 37℃에서 밤새 항온하였다.

수직 위치로 펌프를 잡고 메틸렌 염료를 펌프에 부하하였다. 염료가 부하된 주사기를 펌프내로 완전히 삽입하고 펌프가 넘칠때까지 염료를 주입하였다. 펌프내에 기포가 생기는 것을 막았다. 멸균된 V/4튜빙의 소단편을 유출 조절기상에 놓았다. V/4튜빙과 연결된 주사기를 사용하여 약 1Omm의 캐뉼라 팁 내부로, 총 부피가 230μl가 되도록 PBS+0.1 BSA내에 50ng/ml의 농도로 GDNF를 부하하였다. 부형제 대조 실험의 경우, 동부피의 PBS+0.1% BSA를 펌프내로 부하하였다. V/4튜빙인 소단편을 제거하였다. 2mm의 공간과 7mm의 미네랄 오일을 펌프 유체와 라인 유체(주입 유체) 사이에 끼우는 방식으로 코일 기구내로 미네랄 오일을 주사기로 부하하였다. 유출 조절기는 펌프내로 완전히 삽입하였다.

내이로의 펌프 삽입

물질 :

조직 접착제-시아노아크릴레이트는 미국 미네소타 세인트폴에 소재하는 베트본드 티슈 어드헤시브, 3M 애니멀 케어 프로덕츠에서 구입하였다. 카르복실레이트 시멘트 ESPE 듀어론(카탈로그 #O3828)은 미국 펜실베니아 노리스타운에 소재하는 ESPE-프리미어 세일즈 코포레이션에서 구입하였다. 메틸 메타크릴레이트는 미국 일리노이 윌링에 소재하는 랑 젯 아크릴릭, 랑 덴탈 매뉴팩츄어링 캄파니에서 구입하였다. 해부 기구는 로보츠 서지칼에서 구입하였다. 크실라진, 케타민 및 부프레노핀을 이용하였다. 윤활제 안연고(Lubricant Ophthalmic Ointment)(AKWA Tears)는 미국 루이지애나 애비타에 소재하는 아콘 인코포레이티드에서 구입하였다. 자일로케인 2%(카탈로그 번호 NDC 0186-0160-01)는 아스트리(ASTRA)에서 구입하였다. 의학용 등급의 실리콘 윤활제(기술번호 51.300)는 유니메드에서 구입하였다. 듀어론 풀버 분말 카르복실레이트-시멘트(카탈로그 번호 D-82229)는 ESPE, 시펠드에서 구입하였다. 황산염 연고(바시트라신 아연-네오마이신, 카탈로그 번호 0168-0012-31)는 포우게라(Fougera)에서 구입하였다.

방법 :

크실라진 10mg/kg, 케타민 40mg/kg 및 부프레노핀 0.05mg/kg 혼합물로 알비노 기니피그(250-350g)를 마취시켰다. 우이 영역을 두정 전방 약 2cm에서 시작하여 견갑골 후방의 4-5cm까지 하방으로, 이후방으로 깎았다. 깎은 영역을 베타딘으로 세척하였다. 윤활제 안연고를 양 눈에 발랐다. 절개되는 조직내로 자일로케인을 피하주사하였다. 무균 기술을 이용하여 이후방을 절개하였다. 중이강을 노출시키고 와우를 가시하하기 위해 가느다란 바늘침으로 수포에 구멍을 뚫었다. 가느다란 바늘침으로 와우창 아래에 기저회전의 골벽내로 수동적으로 작은 구멍을 뚫었다. 실리콘 방울이 뼈에 닿을 때까지 대략 고실계관의 중간쯤까지 캐뉼라 팁을 구멍으로 삽입하였다. 시아노아크릴레이트 한 방울을 수포 구멍에 떨어뜨렸다. 시아노아크릴레이트 위의 캐뉼라 둘레에 카르복실레이트 시멘트를 발랐다. 일단 시멘트가 굳으면 배치가 확정되고 실리콘 그리스 층위에 카르복실레이트 시멘트로 구멍의 잉여분을 덮었다. 삽입될 펌프를 수용할 수 있도록 견갑골 사이에 피하 포켓을 만들었다. 멸균 PBS에 용해시킨 3ml 니트로두라존 용액으로 데하 포켓을 1회 세척한 다음 감염되는 것을 막기 위하여 3ml의 멸균 PBS + 1% 젠타마이신을 가하였다. 니트로푸라존 분말을 창상 주변에 가한 후에 창상 클립으로 창상의 가장자리를 가까이 붙였다.

방음 장치 :

물질 :

시스플라틴(플라티놀-AQ)(카탈로그 번호 NDC O015-3220-22)은 미국 뉴저지 프린스톤에 소재하는 브리스톨-마이어스 스퀴브 라보라토리스에서 구입하였다.

과정 :

미니-펌프 이식 후 이틀째에 시스플라틴 투여(복강내 투여)를 시작하였다. 전형적인 투여방법을 이용하였다 : 5일 간격으로 7.5mg/kg씩 2회 투여 또는 15일동안 매일 1mg/kg씩 투여

관류 :

4주 후, 크실라진 및 케타민 혼합물로 기니피그를 극도로 마취시키고 얼음처럼 차가운 PBS에 이어 얼음처럼 차가운 PBS내 4% 파라포름알데히드를 심장을 관통하여(transcardially) 관류하였다. 측두곡을 제거하고 고정 후를 위해 골질의 와우를 4%로 밤새 4% 파라포름 알데히드에 두었다.

염색

표면 형성법 및 팔로이딘 염색법을 유모 세포 염색에 이용하였다. 가느다란 바늘침 또는 #11 블레이드로 골질의 와우를 열었다. 가느다란 핀셋으로 맥관선조를 제거하였다. PBS를 채운 페트리 접시에서 가느다란 바늘침을 이용하여 골질의 와우측으로부터 조심스럽게 기저막을 잘라내었다. 원형그대로 제거하기 위해 주의해야 한다. 팔로이딘 염색 과정은 시험관내 이식을 실시하는 것과 유사하며 다음의 내용은 다르다 : 투과는 20-30분간 실시하였고, 팔로이딘은 90분간 가하였다. 중회전 및 기저회전의 한 부분인 첨부를 60 × 22 유리 커버 글라스에 올려 놓았다. 소량의 벡타쉴드를 장착한 배지를 가하고 시료를 22 × 22mm 커버 글리스로 덮은 다음 증발을 막기 위해 매니큐어 액으로 봉하였다.

데이터 분석

FITC 필터 세트가 달린 현미경 아래에서 각 와우를 실험하였다.

기저막인 미드턴(midturn)으로부터 손실된 최대 유모 세포를 갖는 여덟개의 부분을 선택하여 부착된 컴퓨터 프린터로 사진을 찍었다. 사진을 이용하여 수동적으로 유모 세포의 수를 세었다. 각 동물에서, 좌이(대조, 즉 GDNF 주입 안함)에서 손실된 유모 세포를 우이(GDNF 주입)에서 손실된 유모 세포와 비교하였다.

결과

시스플라틴을 주입하면 와우에서 유모 세포가 상당히 손실된다. 15일동안 매일 1mg/kg의 시스플라틴을 주입한 세 마리 기니피그의 좌이에서 분석한 중회전 절편에서의 이러한 손실은 49.2%; 21.2% 및 46.9%였다. 또한 매일 1mg/kg씩 주입하는 대신에 7.5mg/kg씩 2회 시스플라틴을 주입한 기니피그에서, 좌이 유모 세포의 42%가 손실되었다. 각 기니피그의 오른쪽 내이로 GDNF를 삽입하면 유모 세포 손실이 상당히 감소하였다. 와우에서 계산된 총 유모 세포수에 대한 손실된 유모 세포수의 비는 다음과 같았다 : 좌이(대조)에서는 각각 241/486; 113/530 및 244/513인 반면에, 상대편 우이(GDNF 처리)는 83/492; 28/498 및 126/512였다. 각 동물에서 좌이와 우이 사이에 유모세포 손실 증가를 나타내는 비는 세 동물에 대해 순서대로 ×3; ×4.2 및 ×1.9이다. 7.5 mg/kg의 시스플라틴을 주입한 기니피그에서도, GDNF로 처리한 귀에 비해 처리하지 않은 귀(왼쪽)에서 유모 세포 손실이 2배 증가하였다(제2도 참조). GDNF 대신에 부형제를 가한 미니-펌프를 이식한 동물에서, 좌이(비처리 귀) 및 우이(이식한 귀)에서 발견되는 유모 세포수의 차이는 없었다.

[실시예 4]

GDNF 단백질을 주입하면 와우 유모 세포의 생체내 생존을 촉진시킨다.

하기 실시예는 GDNF 단백질 산물을 중이에 가했을 때 동물 모델내 이독성에 대항하여 와우 유모 세포를 보호함을 입증한다. PBS+1%BSA내 1mg/ml의 농도로 고막을 통해 125-135μl의 GDNF를 오른쪽 중이로 1회 주입하였다. 7.5mg/kg의 GDNF를 2회 주입한 후 1일째에 5일 간격으로 시스플라틴 근육내 투여를 시작하였다. 2차 시스플리틴 투여 후 3일째에 실험을 종결하였다. 유모 세포를 FITC-팔로이딘으로 염색하고 와우의 중회전(중회전 부분의 최소한 20%)에서 그 수를 측정하였다. 결과는 GDNF로 처리한 귀(우이)와 처리하지 않은 귀(좌이)에 대해 각각의 기니피그의 유모 세포 손실 백분율로 나다낸다(제3도 참조).

물질

본 실험에서 사용한 물질은 실시예 3에서 사용한 것과 동일하였다.

과정

크실라진 10mg/kg, 케타민 40mg/kg 및 부프레노핀 0.05mg/kg 혼합물로 알비노 기니피그(무게 600-700g)를 마취시켰다. 외과수술용 현미경 하에서, 막에 27게이지의 바늘침을 삽입하여 우이의 고막에 구멍을 만들었다. 고막의 다른 위치에 인체 단백질 GDNF(PBS + 1% BSA내 1mg/ml인 농도)를 중이강에 주입하여 강이 완전히 차도록 하였다(125-135μl). 일부 동물은 GDNF대신에 부형제(PBS+O.1%BSA)만을 주입하였다. 다음날 시스플리틴을 근육내 투여하였다(7.5mg/kg). 5일 후에 동일한 농도로 2차 투여를 실시하였다. 3일 후(총 실험 기간으로는 8일), 동물을 희생시켜 실시예 3에 기술한 바와 같이 조직을 고정시키고 와우를 분석하였다.

결과

시스플라틴을 주입한 네마리의 기니피그는 8일째에 와우내 유모 세포가 상당히 손실된 것으로 나다났다. GDNF를 투여하지 않은 좌이에 있어서, 와우인 중회전의 유모 세포 손실은 34%, 47%, 및 41%였다. 오른쪽 중이의 강내로 1mg/ml의 GDNF를 주입한 것은 이러한 손실이 상당히 감소하였다 : 각각 16%; 23%; 21% 및 29%(제3도 참조). 우이내로 GDNF 대신에 부형제를 투여한 기니피그는 우이(GDNF 처리) 및 좌이(비처리)간의 유모 세포수에 차이를 보이지 않았다.

본 발명의 실시에 있어서, 전술한 바람직한 실시형태를 참조하여 다양한 변형 및 수정이 본 분야의 숙련자들에 의해 일어날 수 있을 것으로 기대된다.

서열목록

(1) 서열들에 관한 일반정보 :

(i) 출원인 : 엘러 매걸

(ii) 발명의 명칭 : 신경교세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물을 사용하여 감각신경성 청력손실 및 전정장애를 예방 및 치료하는 방법

(iii)서열의 갯수 : 1

(iv) 통신 주소 :

(A) 수신인 : 암젠 인코포레이티드

(B) 가 : 디하빌랜드 드라이브 1840

(C) 시 : 사우전드 오크스

(D) 주 : 캘리포니아

(E) 국명 : 미국

(F) 우편번호 : 91320

(v) 컴퓨터 판독 형태 :

(A) 매체타입 : 플로피 디스크

(B) 컴퓨터 : 범용 IBM PC

(C) 운영 체계 : PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어 : PatentIn Release # 1.0, Version # 1.25

(vi) 현출원 데이터 :

(A) 출원번호 :

(B) 출원일 :

(C) 분류 :

(vii) 대리인/관리인 정보 :

(A) 성명 : 커리, 다니엘 알.

(B) 등록번호 : 32,727

(C) 참조/문서번호 : A-392

(viii) 통신 정보 :

(A) 전화번호 : 805-447-8102

(B) 전화 전송 : 805-499-8011

(C) 텔렉스 :

(2) 서열 번호 1에 대한 정보 :

(i) 서열의 특성 :

(A) 서열의 길이 : 134 아미노산 잔기

(B) 서열의 타입 : 아미노산

(D) 토플로지 : 직쇄상

(ix) 특징적 부분:

(A) 특징기호: 성숙한 인체 GDNF에 대한 추정 아미노산 서열

(xi)서열 1 :

Claims

(정정) 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열을 가지며, 내이의 와우모세포, 전정모세포 및 청각 신경원의 생존을 촉진시키거나 기능을 활성화시키는 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물의 치료학적 유효량을 함유하는, 청력손실이나 전정 증상 또는 둘다의 원인이 되는 내이 세포의 손상 또는 변성치료용 제약학적 조성물.
제1항에 있어서, 청력 손실은 내이의 와우모세포 손상이나 변성과 관련된 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제3항에 있어서, 청각 신경원은 나선 신경절 신경원임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 신경교 세포주-유래 신경영양성 인자(GDNF) 단백질 산물에 대한 변이체의 치료학적 유효량을 함유하는, 청력 손실이나 전정 증상 또는 둘다의 원인이 되는 내이 세포의 손상 또는 변성 치료용 제약학적 조성물로서, 상기 변이체는 정렬을 돕기 위해 아미노산 100개에 대하여 4개까지의 갭을 도입하여 정렬시켰을 때 서열번호 : 1에 나타낸 아미노산 서열과 70%이상 동일하며, 상기 GDNF 단백질 산물은 내이의 와우모세포, 전정모세포 및 청각신경원의 생존을 촉진시키거나 기능을 활성화시킨다.
제1항 또는 제4항에 있어서, GDNF 단백질 산물이 [Met^-1] GDNF임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, GDNF 단백질 산물의 치료학적 유효량은 약 1㎍/kg/일 내지 약 1OOmg/kg/일임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제1항 또는 제4항에 있어서, GDNF 단백질 산물을 세포 치료수단-여기서 세포는 GDNF 단백질 산물을 생성하고 분비하도록 변형시킨 것임-또는 유전자 치료수단에 의해 투여함을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제7항에 있어서, 세포는 생체의 변형시킨 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.
제7항에 있어서, 세포는 생체내 변형시킨 것임을 특징으로 하는 제약학적 조성물.