TWI710635B - 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種複製缺陷型腺病毒載體，其包含編碼人類無調同源物-1(Hath1)蛋白之核酸序列，該核酸序列可操作地連接至人類膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子。本發明亦關於一種利用該腺病毒載體在人類內耳中產生感覺細胞的組合物及方法。

Description

編碼人類無調同源物-1(HATH1)之腺病毒載體
大多數世界人口在其一生之中可能會經歷一定程度的聽力下降或平衡障礙。大約17%(3600萬)之美國成年人報導一定程度之聽覺損失，且在美國每1,000名兒童中就有約2-3名天生耳聾或聽覺不良(來自國家耳聾與其他交流障礙研究所(National Institute on Deafness and Other Communication Disorders；NIDCD)之統計資料)。
在聽覺及平衡性中，機械刺激藉由感覺毛細胞轉譯成神經信號，其受到損傷可造成諸多類型之聽覺損失及平衡障礙。例如由響亮噪音導致之機械損傷使耳蝸毛細胞彎曲至毛細胞不能再向聽覺神經轉導信號之程度。由於哺乳動物毛細胞不會自然再生，所以若毛細胞受到破壞，則會發生永久性聽覺損失。除作為聽覺損傷之主要原因的聽覺傷害以外，聽覺損失亦可由遺傳性症候群、細菌或病毒感染、使用處方藥物及老年性失聰(與年齡大相關之聽覺損失)所導致。類似地，平衡障礙，尤其前庭障礙可由感染、頭部損傷、藥物使用及年齡所導致。
針對聽覺損失之最常見治療涉及助聽器及耳蝸植入。全世界大約188,000人已接受耳蝸植入，其在美國包括大約41,599名成年人及25,500名兒童(NIDCD統計資料)。針對平衡障礙之治療選擇包括平衡再訓練、抗眩暈或抗噁心藥療及前庭復原療法。然而，若病症為進行性的，則該等療法可能會需要較長時間段，且針對平衡障礙之諸多療法不提供眩暈之永久性解除。當前，不存在針對涉及耳內感覺毛細胞損失或損傷之病症的有效醫學治療。
因此，仍需要可改善與感覺毛細胞之破壞或損失相關之病症的藥劑，該等病症諸如聽覺損失及平衡障礙。本發明提供此類藥劑。
本發明提供一種腺病毒載體，其包含：血清型5腺病毒基因組，其例外之處在於在VA RNA1區中缺失兩個鹼基對、E1區之一或多個內源性核苷酸缺失而致使E1區中之內源性基因功能性缺陷、E3區之一或多個內源性核苷酸缺失及E4區之一或多個內源性核苷酸缺失而致使E4區中之內源性基因功能性缺陷，其中右側反向末端重複序列(ITR)、E4區聚腺苷酸化序列及E4區啟動子保留；(b)SV40早期聚腺苷酸化序列；(c)編碼包含SEQ ID NO：1之人類無調同源物-1(Hath1)蛋白的核酸序列；(d)人類膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子；及(e)轉錄惰性間隔子(TIS)。要素(b)、(c)及(d)按相對於腺病毒基因組自3'至5'之順序位於腺病毒基因組之E1區中，且要素(e)位於腺病毒基因組之E4區中介於E4聚腺苷酸化序列與E4啟動子之間。
本發明亦關於一種利用上述腺病毒載體在人類內耳中產生感覺細胞的組合物及方法。
圖1為質體pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1)之示意圖。
圖2為腺病毒載體AdGFAP.HATH1.11D之示意圖。
本發明至少部分基於以下發現：可藉由向內耳遞送包含編碼人類無調同源物-1(Hath1)蛋白之核酸序列的血清型5腺病毒載體來產生感覺毛細胞。
如本文所用，術語「腺病毒載體」係指其中腺病毒基因組經操控以適應相對於腺病毒基因組而言為非原生的核酸序列的腺病毒。通常，腺病毒載體藉由以下產生：將一或多個突變(例如缺失、插入或取代)引入至腺病毒之腺病毒基因組中以適應非原生核酸序列至腺病毒中之插入。
腺病毒載體之病毒基因組的來源為人類血清型5腺病毒。人類腺病毒分類為子群A(例如血清型12、18及31)、子群B(例如血清型3、7、11、14、16、21、34、35及50)、子群C(例如血清型1、2、5及6)、子群D(例如血清型8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39及42-48)、子群E(例如血清型4)、子群F(例如血清型40及41)或未分類之血清群(例如，血清型49及51)。腺病毒血清型1至51(亦即Ad1至Ad51)可獲自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection；ATCC,Manassas,Virginia)。
本發明腺病毒載體為複製缺陷型。複製缺陷型腺病毒載體因為例如一或多個複製必需的基因功能或區域的缺陷，所以需要補充腺病毒基因組之複製所需之一或多個基因功能或區域，以使得腺病毒載體不在典型宿主細胞，尤其待由腺病毒載體感染之人類中之宿主細胞中複製。
如本文所用，基因功能或基因組區域之缺陷定義為腺病毒基因組之充足的遺傳物質的破壞(例如缺失)以消除或削弱基因功能(例如，使得基因產物之功能降低至少約2倍、5倍、10倍、20倍、30倍或50倍)，其核酸序列全部或部分受到破壞(例如缺失)，藉此致使基因或基 因組區域「功能性缺陷」。破壞複製必需之基因功能通常並不需要缺失整個基因區。然而，出於為一或多個轉基因在腺病毒基因組中提供足夠間隔之目的，可能需要移除一或多個基因區之大多數。就此而言，腺病毒載體宜包含腺病毒基因組，其例外之處在於一或多個複製必需的基因或基因組區域之一或多個內源性核苷酸缺失而致使內源性基因或基因組區域功能性缺陷。儘管遺傳物質之缺失為較佳的，但遺傳物質突變亦適於破壞基因功能。複製必需之基因功能為腺病毒複製(例如繁殖)所必需之彼等基因功能且由例如腺病毒早期區(例如E1、E2及E4區)、晚期區(例如L1、L2、L3、L4及L5區)、病毒封裝中所涉及之基因(例如IVa2基因)及病毒相關性RNA(例如VA-RNA-1及/或VA-RNA-2)編碼。
複製缺陷型腺病毒載體較佳保留腺病毒基因組之至少一部分。腺病毒載體可包含腺病毒基因組之任何部分，包括蛋白質編碼區及非蛋白質編碼區。腺病毒載體可包含編碼任何適合之腺病毒蛋白質之核酸序列，該蛋白質諸如由早期區基因中之任一者編碼之蛋白質(亦即E1A、E1B、E2A、E2B、E3及/或E4區)；或由編碼病毒結構蛋白之晚期區基因中之任一者編碼之蛋白質(亦即L1、L2、L3、L4及L5區)。或者，腺病毒載體可包含腺病毒基因組之非蛋白質編碼區，包括例如一或多個啟動子、轉錄終止序列、或早期區或晚期區基因之聚腺苷酸化序列或一或多個反向末端重複(ITR)序列。在一個實施例中，本發明腺病毒載體保留至少右側反向末端重複序列(ITR)、E4區聚腺苷酸化序列及E4區啟動子。
複製缺陷型腺病毒載體可以任何適合方式修飾以引起腺病毒基因組之一或多個區域中關於繁殖之一或多個複製必需的基因功能的缺陷。腺病毒基因組之一或多個區域之一或多個複製必需的基因功能之缺陷的補充係指使用外源性手段來提供功能缺陷型複製必需之基因功 能。該補充可以任何適合之方式實現，例如藉由使用編碼經破壞之複製必需的基因功能的補充細胞及/或外源性DNA(例如輔助腺病毒)。
腺病毒載體可在腺病毒基因組之僅早期區(亦即E1-E4區)、腺病毒基因組之僅晚期區(亦即L1-L5區)、腺病毒基因組之早期區及晚期區兩者或所有腺病毒基因(亦即高容量腺病毒載體(HC-Ad))之一或多個複製必需的基因功能方面有缺陷。參見Morsy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95：965-976(1998)；Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94：1645-1650(1997)；及Kochanek等人，Hum.Gene Ther.,10：2451-2459(1999)。複製缺陷型腺病毒載體之實例揭示於美國專利5,837,511、5,851,806、5,994,106、6,127,175、6,482,616及7,195,896；及國際專利申請公開案WO 1994/028152、WO 1995/002697、WO 1995/016772、WO 1995/034671、WO 1996/022378、WO 1997/012986、WO 1997/021826及WO 2003/022311中。
腺病毒基因組之早期區包括E1、E2、E3及E4區。E1區包含E1A與E1B子區域，且E1區中複製必需的基因功能之一或多個缺陷可包括E1A與E1B子區域中之任一者或兩者中複製必需之基因功能的一或多個缺陷，因此需要補充腺病毒基因組的E1A子區域及/或E1B子區域以便腺病毒載體繁殖(例如形成腺病毒載體粒子)。E2區包含E2A與E2B子區域，且E2區中複製必需的基因功能之一或多個缺陷可包括E2A與E2B子區域中之任一者或兩者中複製必需之基因功能的一或多個缺陷，因此需要補充腺病毒基因組的E2A子區域及/或E2B子區域以便腺病毒載體繁殖(例如形成腺病毒載體粒子)。
E3區不包括任何複製必需的基因功能，使得E3區之部分或全部缺失無需為腺病毒載體繁殖(例如形成腺病毒載體粒子)而補充E3區中之任何基因功能。在本發明之上下文中，E3區定義為以編碼與來自人 類腺病毒5(NCBI參考序列AP_000218)之E3區的12.5K蛋白質具有高同源性的蛋白質之開放閱讀框架起始且以編碼與來自人類腺病毒5(NCBI參考序列AP_000224.1)之E3區的14.7K蛋白質具有高同源性的蛋白質之開放閱讀框架結束的區域。E3區可全部或部分缺失或全部或部分保留。缺失大小可經調整以便保留基因組接近符合最佳基因組封裝大小之腺病毒載體。較大缺失將幫助在腺病毒基因組中插入較大異源核酸序列。在本發明之一個實施例中，保留存在於E3區中之L4聚腺苷酸化信號序列。
E4區包含編碼多個內源性基因之多個開放閱讀框架(ORF)。E4區中除ORF6，且在一些情況下ORF3外之所有開放閱讀框架缺失的腺病毒載體無需為腺病毒載體繁殖(例如形成腺病毒載體粒子)而補充E4區中之任何基因功能。反之，E4區之ORF6，且在一些情況下ORF3遭到破壞或缺失的腺病毒載體(例如基於E4區之ORF6及/或ORF3中之複製必需的基因功能之缺陷)，在存在或不存在E4區之其他開放閱讀框架或原生E4啟動子、聚腺苷酸化序列及/或右側反向末端重複序列(ITR)中之任一者之破壞或缺失的情況下，均需要補充E4區(特定言之，E4區之ORF6及/或ORF3)以便腺病毒載體繁殖(例如形成腺病毒載體粒子)。
腺病毒基因組之晚期區包括L1、L2、L3、L4及L5區。必要時，腺病毒載體亦可在主要晚期啟動子(MLP)中具有突變，如國際專利申請公開案WO 2000/000628中所論述，其可致使腺病毒載體複製缺陷。
較佳地，含有複製必需的基因功能之一或多個缺陷之腺病毒基因組的一或多個區域宜為腺病毒基因組之一或多個早期區，亦即E1、E2及/或E4區，視情況具有E3區之部分或全部缺失。
在一個實施例中，在本發明之腺病毒載體中缺失E1區及E4區之 一或多個內源性核苷酸，致使E1區中之內源性基因功能性缺陷且E4區中之內源性基因功能性缺陷(記為E1/E4缺陷型腺病毒載體)。本發明腺病毒載體可包含腺病毒基因組之E1區的至少一個複製必需的基因功能的缺失，且較佳包含E1區之全部複製必需的基因功能的缺失。就此而言，本發明腺病毒載體之E1區的缺失可包含E1A及E1B內源性基因之啟動子及編碼區的缺失。E4區之缺失宜包含E4區之至少一個複製必需的基因功能，且較佳包含E4區之全部複製必需的基因功能的缺失。就此而言，本發明腺病毒載體之E4區的缺失可包含E4區之全部內源性基因的缺失。除腺病毒基因組之E1區及E4區之缺失以外，可在本發明腺病毒載體中缺失E3區之一或多個內源性核苷酸，且本發明腺病毒載體較佳包含腺病毒基因組之非必需E3區之至少一個基因功能的缺失(記為E1/E3/E4缺陷型腺病毒載體)。除血清型5腺病毒基因組之E1、E3及E4區之缺失以外，本發明腺病毒載體亦宜包含病毒相關性RNA(例如VA-RNA-1及/或VA-RNA-2)中之一者的缺失。較佳地，本發明腺病毒載體包含VA-RNA-1區之缺失。VA-RNA-1區之缺失可具有任何適合之大小，但宜為1至10個鹼基對，較佳1至5個鹼基對，且最佳1至3個鹼基對或由以上各值中之任何兩者所界定之範圍。在一個實施例中，在腺病毒載體之VA RNA 1區中缺失兩個鹼基對。
在一較佳實施例中，本發明血清型5腺病毒載體之基因組包含E1區核苷酸356-3510(包括356及3510)之缺失、E3區核苷酸28,593-30,471(包括28,593及30,471)之缺失、E4區核苷酸32,827-35,563(包括32,827及35,563)之缺失及VA-RNA-1區核苷酸10,594及10595之缺失。然而，其他缺失可為適合的。舉例而言，可移除核苷酸356-3329或356-3510以產生複製必需的E1基因功能的缺陷，且核苷酸28,594-30,469可自腺病毒基因組之E3區缺失。
本發明腺病毒載體包含轉錄惰性間隔子(TIS)。轉錄惰性間隔子 序列提供多重複制缺陷型腺病毒載體(例如E1/E4缺陷型腺病毒載體)在補充細胞株中之生長，類似於藉由單一複製必需的基因功能缺陷之腺病毒載體(例如E1缺陷型腺病毒載體)所達成之生長。TIS序列可含有具有所需長度之任何核苷酸序列，諸如長度為至少約15個核苷酸(例如約15個核苷酸與約12,000個核苷酸之間)，較佳約100個核苷酸至約10,000個核苷酸，更佳約500個核苷酸至約8,000個核苷酸，甚至更佳約1,500個核苷酸至約6,000個核苷酸，且最佳約2,000至約3,000個核苷酸或由以上各值中之任何兩者所界定之範圍的序列。TIS序列相對於腺病毒基因組可為編碼或非編碼的且為原生或非原生的，但不會恢復缺陷區之複製必需的功能。TIS亦可含有表現卡匣。
在一個實施例中，轉錄惰性間隔子包含聚腺苷酸化序列及/或相對於腺病毒載體為非原生之基因。間隔要素可包含任何適合之聚腺苷酸化序列，諸如牛生長激素(BGH)、多瘤病毒、胸苷激酶(TK)、埃-巴二氏病毒(Epstein Barr Virus)(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)及牛乳頭狀瘤病毒(BPV)之聚腺苷酸化序列。較佳地，TIS序列包含猴病毒40(SV40)聚腺苷酸化序列。適合包含在TIS中之非原生基因之實例包括(但不限於)：編碼諸如pGUS、分泌性鹼性磷酸酶、螢光素酶、β-半乳糖苷酶及人類抗胰蛋白酶之標記蛋白之核酸序列；治療因子；諸如B3-19K、E3-14.7、ICP47、fas配位體及CTLA4之潛在免疫修飾物；生物失活序列(例如(i)不轉錄產生產物或(ii)編碼有缺陷或生物失活產物之序列)；及其他無害序列(例如β-葡萄糖醛酸酶基因)。
較佳地，TIS按相對於腺病毒基因組自5'至3'之順序包含：(i)來自猴病毒40(SV40)之聚腺苷酸化(poly(A))序列及轉錄終止序列，(ii)編碼β-葡萄糖醛酸酶基因之核酸序列，及(iii)來自牛生長激素(BGH)基因之聚腺苷酸化(poly(A))序列及轉錄終止序列。在腺病毒載體中使用轉錄惰性間隔子進一步描述於例如美國專利5,851,806及國際專利申請 公開案WO 1997/021826中。
藉由移除全部或部分腺病毒基因組，例如腺病毒基因組之E1、E3及E4區之一或多個內源性核苷酸，所得腺病毒載體能夠接受外源性核酸序列之插入，同時保持封裝至腺病毒衣殼內之能力。外源性核酸序列可插入於腺病毒基因組中之任何位置，只要該位置中之插入使得腺病毒載體粒子形成即可。外源性核酸序列較佳位於腺病毒基因組之E1區、E3區或E4區中。
本發明之複製缺陷型腺病毒載體可在提供複製缺陷型腺病毒載體中不存在之基因功能的補充細胞株中產生，但為產生高效價之病毒載體儲備液，需要以適合量進行病毒繁殖。該等補充細胞株為已知的且包括(但不限於)：293細胞(描述於例如Graham等人，J.Gen.Virol.,36：59-72(1977))、PER.C6細胞(描述於例如國際專利申請公開案WO 1997/000326及美國專利5,994,128及6,033,908)及293-ORF6細胞(描述於例如國際專利申請公開案WO 95/34671及Brough等人，J.Virol.,71：9206-9213(1997))。其他適合之補充細胞株包括經產生用於繁殖編碼轉基因之腺病毒載體的細胞，該等轉基因之表現抑制宿主細胞中之病毒生長(參見例如，美國專利申請公開案第2008/0233650號)。額外適合之補充細胞描述於例如美國專利6,677,156及6,682,929及國際專利申請公開案WO 2003/020879中。在一些情況下，細胞基因組無需包含核酸序列，其基因產物補充複製缺陷型腺病毒載體之全部缺陷。複製缺陷型腺病毒載體中所缺少之一或多個複製必需的基因功能可由輔助病毒供應，例如反式供應複製缺陷型腺病毒載體之複製所需的一或多個必需基因功能的腺病毒載體。或者，本發明腺病毒載體可包含非原生複製必需基因，該基因補充本發明複製缺陷型腺病毒載體中所缺少之一或多個複製必需的基因功能。舉例而言，E1/E4缺陷型腺病毒載體可經工程改造而含有編碼E4 ORF 6之核酸序列，該核酸序列自不 同腺病毒(例如具有不同於本發明腺病毒載體之血清型的腺病毒，或具有不同於本發明腺病毒載體之種類的腺病毒)獲得或衍生。
本發明腺病毒載體包含編碼人類無調同源物-1(Hath1)蛋白之核酸序列。Hath1為無調相關因子。無調相關因子為將支持細胞轉分化成耳中之感覺毛細胞的蛋白質之鹼性螺旋-環-螺旋(bHLH)家族的轉錄因子。該蛋白質之鹼性結構域負責DNA結合及蛋白質功能。無調相關因子發現於各種動物及昆蟲中，包括小鼠(小鼠無調同源物-1(Math1))、雞(雞無調同源物-1(Cath1))、爪蟾(Xenopus)(爪蟾無調同源物-1(Xath1))及人類(人類無調同源物-1(Hath1))。如Math1及Hath1之無調相關蛋白質已顯示出對毛細胞發育為必不可少的且可刺激耳中毛細胞再生(參見例如Groves等人，Annu.Rev.Neurosci.,36：361-381(2013))。Hath1進一步描繪於例如Ben-Arie等人，Human Molecular Genetics,5,1207-1216(1996)；及Mulvaney,J.與Dabdoub,A,J.Assoc.Res.Otolaryngol.,13(3)：281-289(2012)中，且無調相關因子大體上描述於國際專利申請案WO 00/73764中。
Hath1核酸及胺基酸序列分別以例如基因庫寄存編號U61148(GI編號1575354)及AAB41305.1(GI編號1575355)公開可用。較佳地，本發明腺病毒載體包含含SEQ ID NO：1之核酸序列，其編碼Hath1蛋白。
儘管編碼Hath1蛋白之核酸序列包含SEQ ID NO：1，但該核酸序列之諸多修飾及變化(例如突變)為可能的且在本發明之情況下為適合的。咸信無調相關因子之功能視蛋白質之螺旋-環-螺旋(HLH)部分，尤其HLH結構域之鹼性區域而定(Chien等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,93,13239-13244(1996))。因此，編碼Hath1蛋白之核酸序列的任何修飾宜位於該蛋白質之鹼性結構域之外，使得Hath1蛋白之功能得到保留或增強。
除編碼Hath1蛋白之核酸序列以外，本發明腺病毒載體較佳包含為核酸序列在宿主細胞中之表現做準備的表現控制序列，諸如啟動子、強化子、聚腺苷酸化信號、轉錄終止子、內部核糖體進入位點(IRES)及其類似者。例示性表現控制序列為此項技術中已知的且描述於例如Goeddel,Gene Expression Technology：Methods in Enzymology,第185卷，Academic Press,San Diego,California(1990)中。理想地，編碼Hath1之核酸序列可操作地連接至啟動子及聚腺苷酸化序列。該啟動子宜為組織特異性啟動子，亦即在既定組織中優先活化且當活化時引起基因產物在該組織中表現的啟動子。用於本發明腺病毒載體之組織特異性啟動子可基於其中編碼Hath1之核酸序列待表現之目標組織或細胞型進行選擇。用於本發明腺病毒載體之較佳組織特異性啟動子對支持細胞或感覺毛細胞為特異性的。在毛細胞中特異性活化之組織特異性啟動子包括例如無調啟動子或肌凝蛋白VIIa啟動子。在支持細胞中特異性活化之組織特異性啟動子包括例如hes-1啟動子及人類膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子。在一較佳實施例中，啟動子為包含SEQ ID NO：2之人類GFAP啟動子。人類GFAP蛋白為主要在中樞神經系統之星形膠質細胞、非髓磷脂形成許旺細胞(non-myelin forming Schwann cell)及其他精選細胞類型中表現的可溶性結構蛋白。在內耳之解剖學內，GFAP表現主要受限於感覺器官之支持細胞(亦即科蒂器(organ of Corti)之戴特氏細胞(Deiter's cell)及指狀細胞、位於耳道壺腹內的彼等細胞及橢圓囊斑/球囊斑中之外微紋區(extrastriolar region)之支持細胞)。
可用於本發明中之組織特異性啟動子的其他實例包括BRN.3C啟動子、BRN 3.1啟動子、POU ORF3因子啟動子、BRK1啟動子、BRK3啟動子、脊索蛋白(chordin)啟動子、頭蛋白(noggin)啟動子、jagged1啟動子、jagged2啟動子及notch1啟動子。
為使蛋白質產生最佳化，編碼Hath1之核酸序列進一步包含位於編碼Hath1之序列下游之聚腺苷酸化序列。可使用任何適合之聚腺苷酸化序列，包括合成優化序列以及牛生長激素(BGH)、多瘤病毒、胸苷激酶(TK)、埃-巴二氏病毒(EBV)、人類乳頭狀瘤病毒(HPV)及牛乳頭狀瘤病毒(BPV)之聚腺苷酸化序列。聚腺苷酸化序列較佳為猴病毒40(SV40)早期聚腺苷酸化序列，其為SV40早期RNA產物之聚腺苷酸化序列(參見例如Carswell,S.及Alwine,J.C.,Mol.Cell.Biol.,9(10)：4248-4258(1989))。除啟動子及聚腺苷酸化序列以外，編碼Hath1之核酸序列宜包含所有經正確配置之恰當轉錄信號(及轉譯信號(適當時))，使得該核酸序列在其所引入之細胞中得到恰當表現。必要時，該核酸序列亦可併入剪接位點(亦即剪接受體及剪接供體位點)以促進mRNA產生。
組織特異性啟動子、編碼Hath1蛋白之核酸序列及SV40早期聚腺苷酸化序列可以任何適合之定向定位於本發明腺病毒載體內，只要不阻礙腺病毒載體之產生且編碼Hath1之核酸序列在宿主細胞中得到有效表現即可。一般而言，啟動子將定位於編碼Hath1之核酸序列之上游，且SV40早期聚腺苷酸化序列將定位於編碼Hath1之核酸序列之下游。在一個實施例中，腺病毒載體可按相對於腺病毒基因組自5'至3'之順序包含前述要素：組織特異性啟動子(例如人類GFAP啟動子)、編碼Hath1蛋白之核酸序列及SV40早期聚腺苷酸化序列。或者，腺病毒載體可按相對於腺病毒基因組自3'至5'之順序包含前述要素：SV40早期聚腺苷酸化序列、編碼Hath1蛋白之核酸序列及組織特異性啟動子(例如人類GFAP啟動子)。編碼Hath1蛋白之核酸序列以及可操作地連接至其上的組織特異性啟動子及SV40早期poly(a)序列可插入於腺病毒基因組中之任何位置，只要該位置中之插入允許形成腺病毒載體粒子即可。較佳地，編碼Hath1之核酸序列位於腺病毒基因組之E1區 或E4區中。在一較佳實施例中，按相對於腺病毒基因組自3'至5'之順序，用SV40早期聚腺苷酸化序列、編碼Hath1蛋白之核酸序列及人類GFAP啟動子替換腺病毒基因組之E1區。
本發明腺病毒載體可包含例如SEQ ID NO：3之核酸序列。
本發明提供一種包含本文所述之腺病毒載體及其對應之載劑(例如醫藥學上可接受之載劑)的組合物。該組合物宜為生理學上可接受之(例如醫藥學上可接受之)組合物，其包含載劑，較佳生理學上(例如醫藥學上)可接受之載劑及腺病毒載體。在本發明之情況下可使用任何適合之載劑，且該等載劑已為此項技術中所熟知的。載劑之選擇將部分地由該組合物之特定用途(例如投與至動物)及用於投與該組合物之特定方法決定。理想地，在複製缺陷型腺病毒載體之情況下，該醫藥組合物較佳不含具有複製能力的腺病毒。該醫藥組合物視情況可為無菌的。
適合組合物包括水性及非水性等張無菌溶液，其可含有抗氧化劑、緩衝劑及抑菌劑；及水性及非水性無菌懸浮液，其可包括懸浮劑、增溶劑、增稠劑、穩定劑及防腐劑。該組合物可以單位劑量或多劑量形式存在於諸如安瓿及小瓶之密封容器中，且可以經冷凍乾燥(經凍乾)狀態儲存，僅需要在即將使用之前添加無菌液體載劑，例如水。可自無菌散劑、粒劑及錠劑製備即用型溶液及懸浮液。較佳地，載劑為緩衝鹽水溶液。更佳地，腺病毒載體為經調配用於保護腺病毒載體在投與之前免遭破壞之組合物的一部分。舉例而言，該組合物可經調配用於減少腺病毒載體在諸如玻璃器皿、注射器或針之用於製備、儲存或投與腺病毒載體之裝置上的損失。該組合物可經調配用於降低腺病毒載體之光敏度及/或溫度靈敏度。為此目的，該組合物較佳包含醫藥學上可接受之液體載劑，諸如上文所述之彼等載劑，及選自由聚山梨醇酯80、L-精胺酸、聚乙烯吡咯啶酮、海藻糖及其組合組 成之群的穩定劑。使用此類組合物將延長腺病毒載體之存放期，且有助於其投與。關於含腺病毒載體之組合物的調配物進一步描述於例如美國專利6,225,289、美國專利6,514,943及國際專利申請公開案WO 2000/034444中。
該組合物亦可經調配用於增強轉導效率。此外，一般熟習此項技術者應瞭解，腺病毒載體可存在於含其他治療劑或生物活性劑之組合物中。舉例而言，諸如布洛芬(ibuprofen)或類固醇之控制炎症的因子可為該組合物之一部分，用於減少與腺病毒載體之活體內投與相關之腫脹及炎症。可存在抗生素(亦即殺微生物劑及殺真菌劑)來治療現有感染及/或降低將來感染之風險，諸如與基因轉運程序相關之感染。
本發明亦提供一種在有需要之人類之內耳中產生感覺細胞的方法。該方法包含投與包含本文所述之本發明腺病毒載體的組合物，因此編碼Hath1蛋白之核酸序列得到表現且在內耳中產生感覺細胞。如本文所用，術語「治療(treatment)」、「治療(treating)」及其類似術語係指獲得所需藥理學及/或生理作用。較佳地，該作用為治療性的，亦即該作用部分地或完全地治癒疾病及/或可歸因於該疾病之不良症狀。為此目的，本發明方法包含向人類投與「治療有效量」之組合物。「治療有效量」係指可有效以一定劑量及持續所需時間段達成所需治療結果之量。治療有效量可根據以下因素而變化：諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重及本發明腺病毒載體在個體中引發所需反應之能力。舉例而言，本發明組合物之治療有效量為引起Hath1蛋白以治療人類之聽覺損失或平衡障礙之水準表現的量。
或者，藥理學及/或生理作用可為預防性的，亦即該作用完全地或部分地預防疾病或其症狀。就此而言，本發明方法包含投與「預防有效量」之包含本發明腺病毒載體的組合物。「預防有效量」係指可 有效以一定劑量及持續所需時間段達成所需治療結果(例如預防疾病發作)之量。治療性或預防性功效可藉由所治療患者之定期評定來監測。
適合之劑量及給藥方案可由一般技術者已知之習知的範圍確定技術確定。理想地，單一劑量之腺病毒載體包含約1×105或大於1×105個粒子(其亦稱為粒子單位(pu))之腺病毒載體，例如約1×106或大於1×106個粒子、約1×107或大於1×107個粒子、約1×108或大於1×108個粒子、約1×109或大於1×109個粒子或約3×108或大於3×108個粒子之腺病毒載體。或者或此外，單一劑量之腺病毒載體包含約3×1014個粒子或小於3×1014個粒子之腺病毒載體，例如約1×1013個粒子或小於1×1013個粒子、約1×1012個粒子或小於1×1012個粒子、約3×1011個粒子或小於3×1011個粒子、約1×1011個粒子或小於1×1011個粒子、約1×1010個粒子或小於1×1010個粒子或約1×109個粒子或小於1×109個粒子之腺病毒載體。因此，單一劑量之腺病毒載體可包含在由上述各值中之任何兩者所界定之範圍內的粒子數量的腺病毒載體。舉例而言，單一劑量之腺病毒載體可包含1×105-1×1014個粒子、1×107-1×1012個粒子、1×108-1×1011個粒子、3×108-3×1011個粒子、1×109-1×1012個粒子、1×109-1×1011個粒子、1×109-1×1010個粒子或1×1010-1×1012個粒子之腺病毒載體。換言之，單一劑量之腺病毒載體可包含例如，約1×106pu、2×106pu、4×106pu、1×107pu、2×107pu、4×107pu、1×108pu、2×108pu、3×108pu、4×108pu、1×109pu、2×109pu、3×109pu、4×109pu、1×1010pu、2×1010pu、3×1010pu、4×1010pu、1×1011pu、2×1011pu、3×1011pu、4×1011pu、1×1012pu、2×1012pu、3×1012pu或4×1012pu之腺病毒載體。當然，其他投藥途徑可需要較小或較大劑量來達成治療作用。劑量及投藥途徑之任何所需變化可由一般熟習此項技術者使用此項技術中已知之常規技術確定。
內耳結構之內部空間為有限的。應謹慎監控直接投與至內耳結構中之醫藥組合物的體積，因為強加過多組合物將損傷感覺上皮。對於人類患者而言，所投與之體積較佳為約1μl至約500μl(例如約10μl至約400μl)之組合物。舉例而言，可投與約10μl至約200μl(例如約15μl、20μl、30μl、40μl、50μl、60μl、70μl、80μl、90μl、100μl、125μl、150μl、175μl或由上述各值中之任何兩者所界定之範圍)之組合物。在一個實施例中，用醫藥組合物替換內耳結構之全部流體內容物，例如耳蝸或半規管。在另一實施例中，將包含本發明方法之表現載體的醫藥組合物緩慢釋放於內耳結構中，使得機械性創傷降至最低。
在本發明方法之一個實施例中，在指定治療期期間，宜向人類內耳投與包含編碼Hath1之腺病毒載體的組合物僅一次。換言之，本發明方法包含向人類內耳投與單一劑量之本發明腺病毒載體。在其他實施例中，向人類內耳投與組合物兩次或兩次以上(亦即多次)可為有利的。因此，本發明提供向人類內耳投與兩個或兩個以上劑量之本發明腺病毒載體。舉例而言，可向同一隻耳朵投與包含本發明腺病毒載體之組合物至少兩次。當向人類內耳投與組合物多次時，可視人類對組合物之第一次投藥及後續投藥之反應而定，使各投藥相隔數天、數週、數月或甚至數年。舉例而言，多次投藥可相隔約1週至約4週(例如2週或3週)，或約30天至約90天(例如約40天、約50天、約60天、約70天、約80天或由以上各值中之任何兩者所界定之範圍)。然而，該組合物之多次投與(例如3、4、5、6或超過6次投與)可相隔任何適合之天數(例如各劑量之間相隔2、7、10、14、21、28、35、42、49、56、63、70、77、85天或85天以上)、月數(例如各劑量之間相隔1、3、6或9個月)或年數(例如各劑量之間相隔1、2、3、4、5年或5年以上)，只要編碼Hath1蛋白之核酸序列得到充分表現且在內耳中產生感 覺細胞即可。
理想地，向人類投與該組合物來治療與內耳中之感覺毛細胞之損失、損傷或缺失相關之病症，諸如聽覺損失及平衡障礙。就此而言，可向患有聽覺損失或平衡障礙之人類或患有聽覺損失及平衡障礙兩者之人類投與該組合物。聽覺損失可由科蒂器之毛細胞損傷所導致，該損傷歸因於細菌感染或病毒感染、遺傳、物理損傷、聽覺傷害及其類似者。儘管聽覺損失易於鑑別，但平衡障礙表現出廣泛種類之可容易歸於其他疾病的併發症。平衡障礙之症狀包括定向力障礙、頭暈、眩暈、噁心、視力模糊、笨拙及頻繁跌倒。藉由本發明方法所治療之平衡障礙較佳涉及周邊型前庭障礙(亦即前庭器紊亂)，該周邊型前庭障礙涉及歸因於感覺毛細胞之損傷或缺乏而出現機械刺激功能不良轉譯成神經衝動。在實施例中，向人類投與該組合物來治療重度至極度兩側聽覺損失。
可使用此項技術中已知的任何適合方法向人類之內耳投與組合物。人類之內耳由骨質迷路組成，其為包含兩個主要部分之通道系統：(a)專用於聽覺之耳蝸及(b)專用於平衡之前庭系統。該組合物宜向耳蝸或前庭系統，或向耳蝸及前庭系統兩者投與。不管投藥途徑如何，本發明腺病毒載體必須達至內耳之感覺上皮，例如耳蝸及/或前庭系統之感覺上皮。因此，最直接的投藥途徑需要允許進入內耳結構之內部的外科程序。經由耳蝸造口術(cochleostomy)之接種允許表現載體直接投與至與聽覺相關之內耳區域中。耳蝸造口術涉及：穿過耳蝸壁進行鑽孔，例如在鐙骨動脈下方之耳軟骨囊中，如Kawamoto等人，Molecular Therapy,4(6),575-585(2001)中所述；及釋放包含腺病毒載體之組合物。內淋巴室之投藥特別適用於將組合物投與至負責聽覺之內耳區中。或者，可經由管切開擴張術(canalostomy)向半規管投與組合物。管切開擴張術在前庭系統及耳蝸中提供轉基因表現，而耳 蝸造口術並未在前庭空間中提供高效轉導。使用管切開擴張術降低耳蝸功能損傷之風險，因為儘可能直接地注射至耳蝸空間中可引起毛細胞之機械損傷(Kawamoto等人，同上)。投藥程序亦可在流體(例如人工外淋巴液)下進行，其可包含用於緩解治療或投藥程序之副作用的因子，諸如細胞凋亡抑制劑或消炎劑。
另一直接內耳投藥途徑為藉由向圓窗進行注射或局部施用而穿過圓窗。對於將腺病毒載體遞送至外淋巴隙中而言，經由圓窗之投藥為尤其較佳的。已在經由圓窗投與表現載體之後，在耳蝸及前庭神經元及耳蝸感覺上皮中觀察到轉基因表現(Staecker等人，Acta Otolaryngol,121,157-163(2001))。在另一實施例中，可經由內迷路(IL)輸注穿過橢圓窗向內耳投與組合物，以便將組合物遞送至外淋巴隙中。在某些情況下，投與多種施加及/或採用多種途徑，例如耳蝸造口術及管切開擴張術可為適合的，從而確保支持細胞充分暴露於腺病毒載體中。用於向內耳遞送本發明組合物的尤其較佳方法描述於例如美國專利7,387,614中。
包含本發明腺病毒載體之組合物可存在於允許腺病毒載體之控制釋放或持續釋放的裝置之中或之上，該裝置諸如海綿、網狀物、機械儲集器或泵或機械植入物。舉例而言，可將浸於包含腺病毒載體之組合物中的生物相容性海綿或膠體鄰近於圓窗置放，表現載體滲透穿過其達至耳蝸內(如Jero等人，Hum.Gene Ther.,12：539-548(2001)中所描述)。在另一實施例中，可使用微量滲透泵(mini-osmotic pump)提供腺病毒載體歷經長時間段(例如5至7天)之持續釋放，允許投與小體積之包含腺病毒載體之組合物，其可防止對內源性感覺細胞之機械損傷。該組合物亦可以持續釋放調配物形式投與(參見例如美國專利5,378,475)，其包含例如明膠、硫酸軟骨素、聚磷酸酯(諸如對苯二甲酸雙-2-羥乙酯(BHET))或聚乳酸-乙醇酸。
儘管並非較佳的，但包含本發明腺病毒載體之組合物可以非經腸、肌內、靜脈內或腹膜內投與。若向患者非經腸投與，則腺病毒載體宜特異性靶向感覺上皮細胞，諸如支持細胞。舉例而言，腺病毒載體可靶向有疤痕之感覺上皮來促進外源性毛細胞產生，從而替換經破壞之內源性毛細胞。可藉由缺失纖維、五鄰體或六鄰體之區域，將各種原生或非原生配位體插入鞘蛋白之部分中及其類似者對腺病毒載體進行修飾，以改變表現載體對潛在宿主細胞上之受體的結合特異性或識別。一般熟習此項技術者應瞭解，非經腸投與可需要大劑量或多次投藥以將表現載體有效遞送至適合宿主細胞中。
在一個實施例中，本發明方法包含經由內迷路(IL)輸注向人類投與包含約20μL與90μL之間的本發明組合物(濃度為5.0×1011個粒子(vp)/毫升之腺病毒載體)的單一劑量。
在一個實施例中，本發明方法包含經由內迷路(IL)輸注以約10微升/分鐘至約20微升/分鐘之輸注速率向人類投與包含約20μL與90μL之間的本發明組合物(濃度為5.0×1011個粒子(vp)/毫升之腺病毒載體)的單一劑量。
本發明方法可為涉及其他治療型態之治療方案的一部分。舉例而言，本發明方法可對已用一或多種藥物或手術治療、正用其治療或將用其治療之人類進行。此外，本發明方法可與誘導內耳中之支持細胞增殖之增殖劑結合使用，該等增殖劑諸如血管內皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、表皮生長因子(EGF)、E2F及細胞週期上調因子。本發明方法亦可與諸如耳蝸植入物之聽覺裝置的植入結合進行。
可使用此項技術中已知之各種手段確定內耳中之感覺細胞(例如毛細胞)產生。舉例而言，可經由掃描電子顯微法或經由偵測肌凝蛋白VIIa來偵測感覺毛細胞，該肌凝蛋白VIIa為由免疫化學偵測到之毛 細胞特異性蛋白質。然而，僅存在感覺毛細胞未必暗示存在用於識別環境刺激之功能系統。功能性感覺細胞必須可操作地連接至神經通路，使得機械刺激轉譯為由大腦所識別之神經衝動。因此，儘管毛細胞產生之偵測適於判定編碼Hath1之核酸序列於目標組織之成功表現，但感覺細胞之產生較佳引起人類個體之感官知覺的改良。就此而言，個體意識之檢查為感官知覺變化之指示。
個體偵測聲音之能力之變化可經由執行簡單聽覺測試來評定，諸如通常由視聽檢查師執行之音調測試。在大多數哺乳動物中，對不同頻率之反應指示感官知覺之變化。在人類中，語言理解亦為適合的。舉例而言，個體有可能聽到話語但無法理解。感官知覺之變化藉由區分不同類型聲音刺激(諸如自背景噪音區分語言)之能力及藉由理解話語來指示。話語臨限值及鑑別測試適用於該等評估。
亦可使用各種技術達成對平衡、運動意識及/或對運動刺激之反應時序之變化的評估。可藉由比較對運動刺激之反應(增益)或引發反應之時序(相位)的量值來量測前庭功能。可使用鞏膜探查線圈針對前庭-動眼反射(Vestibulo-Ocular Reflex；VOR)增益及相位對動物進行測試以評估感官知覺之改良。眼震電描記術(Electronystagmography；ENG)記錄響應於刺激之眼球移動，該等刺激諸如移動的或閃爍的光、身體重新定位、半規管內之流體移動及其類似者。就此而言，使用旋轉椅或移動平台評估移動期間之平衡亦為適用的。
以下實例進一步說明本發明，但當然不應解釋為以任何方式限制其範疇。
實例1
此實例說明產生本發明血清型5腺病毒載體之方法。
使用描述於例如美國專利6,475,757中之ADFASTTM方案構築包含含E1、E3及E4區缺失之血清型5腺病毒基因組且編碼Hath1蛋白的腺 病毒載體。使用ADFASTTM程序構築編碼整個血清型5腺病毒載體基因組之質體。藉由兩個連續群落生長步驟，在細菌中達成最終載體基因組之單一基因純系之分離。在引入至補充腺病毒載體生長之哺乳動物細胞中後，此AdFASTTM質體轉化為病毒載體。隨後經由連續繼代進行後續擴大以產生腺病毒載體儲備液。用於構築表現Hath1之血清型5腺病毒載體之步驟概述於下文中。
質體之構築
用限制酶消化記為pAd3511gfa2.HATH1.sv之質體來凝膠提取GFAP.HATH1表現卡匣。對包含E1、E3及E4區缺失之血清5型腺病毒基因組及含有SV40 poly(A)及轉錄終止序列、β-葡糖醛酸酶基因及牛生長激素(BGH)基因poly(A)及轉錄終止序列之轉錄惰性間隔子的鹼基質體(記為pAdE1(BN)E3(10)E4(TIS1))進行線性化且純化。使pAdE1(BN)E3(10)E4(TIS1)質體與GFAP.HATH1表現卡匣在大腸桿菌(E.coli)中同源重組，得到質體pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1)。
為確保全長腺病毒載體質體之選殖性，使用pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1)ADFASTTM質體DNA之等分試樣，藉由限制連續稀釋法使DH10B大腸桿菌轉型。自含有最少群落之最高稀釋盤中選出界限分明且經分離之群落。製備小規模純化質體DNA且其用Hind III+SpeI消化以經由RFLP分析確認質體完整性。使用對應陽性之小規模純化DNA產生另一系列之限制稀釋，其隨後用於使DH10B大腸桿菌轉型。使用來自盤上含有最少群落之單一群落的液體培養物之等分試樣產生小規模純化DNA，接著使用ApaI進一步確認質體完整性。陽性純系之剩餘液體培養物用於對LB康黴素(kanamycin)盤進行劃線。藉由HISPEEDTM質體大套組(Qiagen,Venlo,The Netherlands)，遵循製造商之方案擴大單一細菌轉型體以製備無內毒素ADFASTTM質體 DNA。藉由BglI、EcoRV、HindIII、KpnI及BamHI+PacI限制性核酸內切酶消化確認所得質體製備。pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1)之圖譜展示於圖1中。隨後測定pAdE1(GFAP.Hath1)E3(10)E4(TIS1)之DNA序列。
載體轉化
用300μL Pac I限制性核酸內切酶消化18μg不含內毒素之pAdE1(GFAP.HATH1)E3(10)E4(TIS1)且藉由苯酚氯仿異戊醇(PCI)進行純化。簡言之，將100μL PCI添加至限制性反應，藉由劇烈反轉進行混合，在微量離心機中以13,000RPM旋轉兩分鐘，且將上層水相轉移至新管中。藉由添加30μL(0.1體積)之5M NaCl及800μL絕對乙醇使DNA沈澱，在冰上培育10分鐘，且隨後在微量離心機中以13,000RPM旋轉10分鐘，且傾析出上清液。用500μL之70%乙醇洗滌離心塊，如上進行離心及傾析，且風乾DNA離心塊。將DNA再懸浮於30μL TE中，且藉由在260nm下之吸光度測定DNA濃度。使用POLYFECTTM試劑(Qiagen,Venlo,The Netherlands)，用4μg經Pac I消化且經純化的DNA轉染293-ORF6細胞，且將該等細胞在37℃下，在5% CO2中培育三天。使用轉染溶解產物(藉由三個凍融循環產生)起始連續繼代以產生高效價溶解產物。在藉由PCR確認之後，使用高效價溶解產物擴大AdGFAP.HATH1.11D腺病毒載體。
AdGFAP.HATH1.11D腺病毒載體之構築
為構築腺病毒載體AdGFAP.HATH1.11D，亦稱作GV501A(其譜圖展示於圖2中)及CGF166，使用標準程序，用限制性核酸內切酶PacI消化ADFASTTM質體pAdE1(GFAP.HATH1)E3(10)E4(TIS1)且將其轉染至293-ORF6細胞內。將來自經轉染細胞之腺病毒載體溶解產物連續繼代五次以提高AdGFAP.HATH1.11D/GV501A溶解產物之效價且擴大其體積，且產生高效價(HT2)儲備液。將用於GV501A轉染及構築之 293-ORF6細胞維持於限制訪問的細胞培養室中以確保與其他活動隔離。此外，在另一病毒培養室中，在用於維持隔離且限制訪問的程序下，執行AdGFAP.HATH1.11D/GV501A載體之轉染、連續繼代及產生。在HT2代，藉由PCR分析確認AdGFAP.HATH1.11D/GV501A載體之一致性及完整性。隨後使用HT2溶解產物產生腺病毒載體儲備液擴大。
Hath1轉基因表現分析
在小鼠橢圓囊模型中，基於HATH1驅動之感覺細胞再生，證實AdGFAP.HATH1.11D載體之功能性轉基因表現。此實驗之結果顯示，AdGFAP.HATH1.11D載體能夠誘導感覺細胞再生，且因此產生功能性HATH1蛋白。此外，使用經修改之Hath1 mRNA表現分析，針對Hath1轉基因mRNA之表現對AdGFAP.HATH1.11D進行測試。該分析涉及用AdGFAP.HATH1.11D感染293細胞且在感染後24小時分離全部RNA。藉由半定量RT-PCR方法量測Hath1特異性mRNA表現。此分析之結果顯示觀察到基於RNA/DNA及僅DNA之引子及探針之Hath1表現的證據。
此實例之結果確認產生血清型5腺病毒載體，其中E1區及E4區之一或多個內源性核苷酸已缺失，且其包含SV40早期聚腺苷酸化序列、可操作地連接至人類GFAP啟動子之編碼Hath1之核酸序列及轉錄惰性間隔子(TIS)。
實例2
此實例描述經設計用以評估經由內迷路(IL)輸注遞送之CGF166(AdGFAP.HATH1.11D)之安全性、耐受性及用於改良人類聽覺及前庭功能之潛在能力的臨床研究。
臨床試驗將為三部分研究，其利用開放標籤、單一劑量、連續群組，在患有重度至極度兩側聽覺損失而在非手術耳中具有完好前庭 功能的患者中。患者在登記之前將需要證明患有非波動性重度至極度兩側聽覺損失。可在此三個部分、六個群組之試驗中登記最多45名患者。
試驗之部分A將分析單一IL劑量之20μL CGF166濃縮物(5.0×1011個病毒粒子(vp)/毫升)後之安全性及耐受性以及潛在功效。將使患者交錯登記以使得安全性資料審查可在各經治療之患者之後(約治療後4週)在給各後續患者給藥之前完成。
試驗之部分B將包括體積遞增設計以在四個患者群組(n=3/群組；共12名患者)中評估至多四份可能注射體積(介於20μL與90μL之間)之相同CGF166濃縮物(5.0×1011vp/mL)。將基於試驗安全性資料改變全部劑量體積。
僅在前一組中所遞送之體積如藉由安全審查委員會(Safety Review Committee；SRC)所確定視為安全且可耐受之後，才將對各後續組進行給藥。此外，將使各組中第一名患者的時間安排及給藥交錯以允許治療各組中其餘兩名患者之間存在至少四週時間間隔。
將使用部分B中所測定之最高的安全且可耐受體積進行部分C患者中之IL輸注。當前研究之部分C將需要總共20名患者。每當一批5名個體完成研究評定之前四週，將進行類似於部分A及部分B所述之安全性審查。
患者將在試驗之所有部分(A-C)中經歷相同的方案所需之評定及訪視安排。該研究之部分C將僅在已在部分A及部分B中建立針對CGF166及在患者中之相關遞送方法的基本安全性及耐受性之後開始。
試驗持續時間將由63天篩選期、隨後1-3天基線評定期及室內手術給藥/手術後評定期(大約6-14天)、隨後6個月給藥後評定期構成。此外，將建議給予部分A-C中所有給藥個體在另一5年安全性隨訪試 驗中登記的機會。
在篩選期期間，將在研究中心對潛在患者之合格性進行驗證。
將基於身體檢查、MRI、過往/當前病史及實驗室測試，針對進行方案所需之手術之前的健康狀況且針對計劃療法對潛在患者進行評估。在篩選期期間，亦將使潛在患者進行治療前生活品質、聽覺及前庭功能測試。
為完成所需驗證及評定，預期在篩選期期間進行至少兩次門診訪視。若全部篩選評定可在一次訪視中完成，則允許進行一次訪視。在待定患者及臨床安排且需要再驗證及潛在再測試之情況下，准許進行額外門診篩選訪視(亦即兩次以上訪視)。
基於篩選評定，將選擇一隻耳朵作為研究耳且其將進行研究所需之手術。選擇研究耳之準則包括：(1)如藉由純音測聽術及語音辨識評分所測定，聽覺損失較嚴重之耳，及(2)若兩隻耳朵均患有相同嚴重程度之聽覺損失，則將藉由研究者偏好選擇研究耳。
完成篩選訪視後，將為符合條件之患者安排基線訪視及手術。
基線(前3天至前1天)
符合條件之患者將在基線(前3天至前1天)返回至研究中心且進行手術前準備以及治療前功能性評定。
第1天訪視
在第1天，將使研究患者進行所需之方案評定及鐙骨足板造孔術(stapedotomy)以便將研究藥物遞送至內耳之前庭階外淋巴隙中。在手術及研究藥物輸注完成時，研究患者將在手術中心之術後機構進行恢復且進行手術後評估及評定。研究患者可轉移至手術中心之住院病房或接近手術中心之預先安排的臨時房屋。
第2天至第6天訪視
接下來的手術後5天(第2天至第6)天將對研究患者進行隨訪且使 其進行方案所需之安全性隨訪評估。若不存在需要延長監測之顯著不良事件，則研究患者將出院回家。患者將具有仍然停留於所提供之房屋中直至完成第14天訪視的選擇。將在研究患者出院前為其安排好後續訪視。
第14天訪視
研究患者將返回至研究中心以自其耳部移除手術填充物且將進行研究所需之評定。在全部研究所需之評估結束時，患者將出院回家或返回至其本地房屋。將提醒患者其下一次已安排之訪視。
研究訪視之追蹤及結束(每四週)
至研究中心進行每月訪視期間，將監測且評估研究耳之術後恢復。研究患者亦將在各訪視期間進行研究所需之安全性、生活品質、聽覺及前庭功能測試。亦將在各訪視期間收集生物分佈血液樣本。將根據血液記錄收集樣本進行免疫原性測試。在六個月手術後訪視完成(研究訪視結束)時，若不存在需要延長監測之顯著不良事件，則研究患者將視為已完成研究且將出院回家。
認為所有給藥患者均參與到獨立擴展/隨訪試驗中。
安全性資料審查
對部分A中之各患者給藥前(第1組)及對部分B中之兩名其餘患者給藥前(第2-5組)，將進行所有安全性及耐受性資料之審查以及所選擇之聽覺及前庭功能資料之審查。如SRC章程中所概述，審查所考慮之資料為直至給藥後四週可獲得之彼等資料。為使該組中之其餘患者繼續進行，安全性及耐受性必須評定為令人滿意的。關於第2-5組，將由SRC作出對其餘兩名患者給藥之決策。若在計劃劑量中之一者下發現顯著不良事件或安全性問題，則可改變下一個計劃劑量。
在一組完成之後且在進行至下一組之前，將對接受一定劑量之CGF166且已完成至少4週研究評定的全部患者進行所有安全性及耐受 性資料以及受限聽覺及前庭資料之審查。為繼續進行下一組，安全性及耐受性必須評定為令人滿意的。此決策將由SRC作出。若在計劃劑量中之一者下發現顯著不良事件或安全性問題，則可改變下一個計劃劑量。
關於部分C，當各5名個體完成其前四週研究評定時，將進行上文所述之安全性審查。
結果
歷經2-6個月隨訪，A組、B組及C組中用20μL至40μL本發明組合物治療之第一患者各報導介於0與3之間的不良事件，全部分類為輕度至中度。大多數不良事件，包括分類為中度之全部事件，疑似與該治療無關。此外，在用該組合物治療之後，不存在實驗室值在臨床上之顯著變化。此等結果指示，本發明組合物當向人類投與時為安全的。
此實例描述經設計用以評估本發明腺病毒載體用於治療人類聽覺損失之安全性及功效的臨床方案。
本文所引用之所有參考文獻，包括公開案、專利申請案及專利，均以引用的方式併入本文中，其引用程度就如同各參考文獻個別地且特定地指示為以引用的方式併入且全文闡述於本文中一般。
除非本文另外指明或與上下文明顯矛盾，否則在描述本發明之情況下(尤其在以下申請專利範圍之情況下)，使用術語「一(a/an)」及「該」及「至少一個」及類似指示物應解釋為涵蓋單數及複數兩者。除非本文另外指明或與上下文明顯矛盾，否則使用術語「至少一個」後接一或多個項目之清單(例如「A及B中之至少一者」)應解釋為意謂選自所列舉項目之一個項目(A或B)或所列舉項目之兩個或兩個以上的任何組合(A及B)。除非另外說明，否則術語「包含」、「具有」、「包括」及「含有」應解釋為開放式術語((亦即，意謂「包括(但 不限於)」)。除非本文另外指示，否則本文中之值範圍之列舉僅意欲充當單獨提及屬於該範圍之各獨立值之簡寫方法，且各獨立值併入本說明書中，如同在本文中單獨地敍述一般。除非本文中另外指明或明顯與上下文矛盾，否則本文中所描述之所有方法皆可以任何適合之順序進行。除非另外主張，否則本文所提供之任何及所有實例或例示性語言(例如，「諸如」)之使用僅意欲較佳地闡明本發明且並不對本發明之範疇形成限制。本說明書中之語言均不應理解為指明任何未主張之要素對於實踐本發明而言必不可少。
本文中描述本發明之較佳實施例，其包括本發明人已知之本發明的最佳實施方式。在閱讀前文描述後，彼等較佳實施例之變化對於一般熟習此項技術者可變得顯而易知。本發明人期望熟習此項技術者適當時採用該等變化，且本發明人意欲以不同於本文中特定描述之方式來實踐本發明。因此，若適用法律允許，則本發明包括隨附於本文之申請專利範圍中所列之標的物的所有修改及等效物。此外，除非本文中另外指明或者明顯與上下文矛盾，否則本發明涵蓋上述要素在其所有可能變化中之任何組合。
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<212> DNA
<213> 智人
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Figure 104133273-A0305-02-0032-30
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<211> 2209
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
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<210> 3
<211> 34168
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
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Claims (15)

  1. 一種腺病毒載體，其包含：(a)血清型5腺病毒基因組，其例外之處在於在VA RNA 1區中缺失兩個鹼基對，E1區之一或多個內源性核苷酸缺失而致使該E1區中之內源性基因功能性缺陷，E3區之一或多個內源性核苷酸缺失，且E4區之一或多個內源性核苷酸缺失而致使該E4區中之內源性基因功能性缺陷，其中右側反向末端重複序列(ITR)、E4區聚腺苷酸化序列及E4區啟動子保留，(b)SV40早期聚腺苷酸化序列，(c)編碼包含SEQ ID NO：1之人類無調同源物-1(Hath1)蛋白之核酸序列，(d)人類膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子，及(e)轉錄惰性間隔子(TIS)，其中要素(b)、(c)及(d)按相對於該腺病毒基因組自3'至5'之順序位於該腺病毒基因組之該E1區中，且其中要素(e)位於該腺病毒基因組之該E4區中介於該E4聚腺苷酸化序列與該E4啟動子之間。
  2. 如請求項1之腺病毒載體，其中該腺病毒基因組不包含該E1A基因及該E1B基因之該等內源性啟動子及編碼區。
  3. 如請求項2之腺病毒載體，其中該腺病毒基因組不包含該血清型5腺病毒基因組之該E1區之內源性核苷酸356至3510。
  4. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該腺病毒基因組不包含該血清型5腺病毒基因組之該E3區之內源性核苷酸28,593至30,471。
  5. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該腺病毒基因組不 包含該等E4區編碼序列中之任一者。
  6. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該腺病毒基因組不包含該血清型5腺病毒基因組之該E4區之內源性核苷酸32,827至35,563。
  7. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該VA RNA 1區中之該兩個鹼基對缺失為該血清型5腺病毒基因組之內源性核苷酸10,594及10,595之缺失。
  8. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該人類膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)啟動子包含SEQ ID NO：2。
  9. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其中該轉錄惰性間隔子(TIS)按相對於該腺病毒基因組自5'至3'之順序包含：(i)來自猴病毒40(SV40)之聚腺苷酸化(poly(A))序列及轉錄終止序列，(ii)編碼β-葡萄糖醛酸酶基因之核酸序列，及(iii)來自牛生長激素(BGH)基因之聚腺苷酸化(poly(A))序列及轉錄終止序列。
  10. 如請求項1至3中任一項之腺病毒載體，其包含核酸序列SEQ ID NO：3。
  11. 一種組合物，其包含如請求項1至10中任一項之腺病毒載體及醫藥學上可接受之載劑。
  12. 一種如請求項11之組合物之用途，其係用於製備在有需要之人類之內耳中產生感覺細胞的醫藥品，其中該醫藥品係用於向該人類之內耳投與，藉此表現編碼Hath1蛋白之該核酸序列且在該內耳中產生感覺細胞。
  13. 如請求項12之用途，其中該醫藥品係用於向患有聽覺損失之人類投與。
  14. 如請求項12之用途，其中該醫藥品係用於向患有平衡障礙之人類投與。
  15. 如請求項12至14中任一項之用途，其中該醫藥品係用於向該人類之內耳投與一次。
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